ES2401425T3

ES2401425T3 - Moléculas

Info

Publication number: ES2401425T3
Application number: ES02772550T
Authority: ES
Inventors: Howard Clark; Palaniyar Nadesalingam; Kenneth Bannerman Reid; Peter Strong
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 2001-10-25
Filing date: 2002-10-25
Publication date: 2013-04-19
Anticipated expiration: 2022-10-25
Also published as: WO2003035679A2; US8865643B2; JP5536427B2; US20040259201A1; AU2002337312A1; US20120010126A1; EP1440083B1; JP2005522988A; JP2014074049A; WO2003035679A3; JP2010090134A; DK1440083T3; EP1440083A2

Abstract

Uso de proteína tensioactiva D (SP-D) que tiene una secuencia mostrada en SEQ ID NO: 4, o un fragmento que comprende al menos 100 aminoácidos de la misma que tiene actividad de unión a hidratos de carbono, en la fabricación de una composición para el tratamiento de una infección microbiana del pulmón.

Description

Moleculas.

Se dan a conocer en el presente documento metodos de tratamiento y diagnostico de una enfermedad, y moleculas y composiciones para su uso en tales metodos.

Se da a conocer un fragmento recombinante de protefna tensioactiva D, asf como un acido nucleico que codifica para esta protefna. Se demuestra que este fragmento conserva las propiedades beneficiosas de la protefna tensioactiva D, y se muestra que puede usarse para tratar diversas enfermedades. Estas enfermedades incluyen enfermedades inflamatorias, incluyendo enfermedad pulmonar cronica, enfermedad pulmonar cronica neonatal, asma, incluyendo asma alergica, particularmente provocada por acaros del polvo domestico, asf como otras enfermedades. El fragmento de protefna tensioactiva D recombinante que se da a conocer tambien puede usarse para tratar alergias de diversas clases.

Sumario

La materia de la presente invencion se define en las reivindicaciones adjuntas.

Los presentes inventores han determinado que SPD se une a acido nucleico libre, particularmente ADN, mediante su actividad de union a hidratos de carbono. Se cree que el reconocimiento de ADN libre es responsable de al menos algunos de los efectos beneficiosos de SPD. Ademas, los inventores han determinado que las propiedades de union a ADN de SPD, asf como otras propiedades de esta molecula, se conservan en un fragmento recombinante denominado rSPD(n/CRD). Por tanto, segun un primer aspecto, se da a conocer en el presente documento un polipeptido de rSPD(n/CRD), fragmento, homologo, variante o derivado del mismo para su uso en un metodo de tratamiento o profilaxis de una enfermedad.

Se da a conocer en el presente documento, segun un segundo aspecto, un metodo de tratamiento de un individuo que padece una enfermedad o de prevencion de la aparicion de una enfermedad en un individuo, comprendiendo el metodo administrar al individuo una cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de un polipeptido de rSPD(n/CRD), fragmento, homologo, variante o derivado del mismo.

La enfermedad comprende preferiblemente una enfermedad inflamatoria, preferiblemente eccema.

La enfermedad puede comprender una enfermedad inflamatoria, preferiblemente una enfermedad pulmonar inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en: enfermedad pulmonar cronica neonatal, sfndrome de dificultad respiratoria neonatal (SDR), sfndrome de dificultad respiratoria del adulto, enfermedad obstructiva cronica de las vfas respiratorias (EPOC), asma, fibrosis qufstica, fibrosis pulmonar, enfisema, enfermedad pulmonar inflamatoria intersticial, sarcoidosis, neumonfa, enfermedad pulmonar inflamatoria cronica, enfermedad pulmonar inflamatoria cronica neonatal.

Preferiblemente, la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en: enfermedad pulmonar cronica neonatal, enfisema pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva cronica, fibrosis qufstica y asma.

La enfermedad puede comprender una alergia. La alergia es preferiblemente una alergia a acaros del polvo domestico (Dermatophagoides spp), preferiblemente Dermatophagoides pteronyssinus o Dermatophagoides farinae, o a hongos o esporas fungicas, preferiblemente Aspergillus fumigatus. La alergia se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en: una alergia respiratoria estacional, rinitis alergica, fiebre del heno, rinitis no alergica, rinitis vasomotora, rinitis irritante, una alergia contra polenes de hierbas, polenes de arboles o caspa de animales, una alergia asociada a asma alergica, una alergia alimentaria y enfermedades oculares alergicas.

La enfermedad puede ser una que esta asociada a infeccion microbiana, incluyendo infeccion bacteriana e infeccion viral, preferiblemente una infeccion microbiana del pulmon.

Se da a conocer en el presente documento, segun un tercer aspecto, un metodo de reduccion de la hiperreactividad de las vfas respiratorias, los niveles de 1gE sericos o la eosinofilia en un individuo, comprendiendo el metodo administrar al individuo un polipeptido de rSPD(n/CRD), fragmento, homologo, variante o derivado del mismo.

Como cuarto aspecto, se da a conocer en el presente documento un metodo de reduccion del numero de macrofagos alveolares en un individuo, preferiblemente potenciando el aclaramiento de macrofagos alveolares apoptoticos, o potenciando el aclaramiento de macrofagos alveolares necroticos, o ambos, comprendiendo el metodo administrar al individuo un polipeptido de rSPD(n/CRD), fragmento, homologo, variante o derivado del mismo.

En realizaciones preferidas, el polipeptido de rSPD(n/CRD) comprende, preferiblementeconsiste en,una secuencia mostrada en SEQ 1D NO: 1.

Preferiblemente, se administra al individuo un acido nucleico que codifica para un polipeptido de rSPD(n/CRD), o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo, preferiblemente un acido nucleico que comprende una secuencia mostrada en SEQ 1D NO: 2.

Se da a conocer en el presente documento, segun un quinto aspecto, el uso de un polipeptido de rSPD(n/CRD), acido nucleico, fragmento, homologo, variante o derivado del mismo en un metodo de tratamiento o profilaxis de una enfermedad.

Se da a conocer en el presente documento, en un sexto aspecto, un polipeptido recombinante que comprende un fragmento de SPD que tiene una secuencia mostrada en SEQ 1D NO: 1, o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo.

En un septimo aspecto, se a conocer en el presente documento un acido nucleico que comprende una secuencia que codifica para un polipeptido recombinante segun el sexto aspecto de la invencion. Preferiblemente, el acido nucleico comprende la secuencia mostrada en SEQ 1D NO: 2.

Segun un octavo aspecto, se da a conocer en el presente documento un vector, preferiblemente un vector de expresion, que comprende una secuencia de acido nucleico segun el septimo aspecto.

Se da a conocer en el presente documento, segun un noveno aspecto, una celula huesped transformada con un vector segun el octavo aspecto.

Se da a conocer en el presente documento, segun un decimo aspecto, una composicion farmaceutica que comprende un polipeptido recombinante segun el sexto aspecto, un acido nucleico segun el septimo aspecto, un vector que comprende un acido nucleico segun el octavo aspecto, o una celula huesped segun el noveno aspecto, junto con un portador o diluyente farmaceuticamente aceptable.

Como decimoprimer aspecto, se da a conocer en el presente documento un metodo de identificacion de una molecula que se une a un polipeptido de rSPD(n/CRD), comprendiendo el metodo exponer un polipeptido de rSPD(n/CRD), fragmento, homologo, variante o derivado del mismo a una molecula candidata y detectar si la molecula candidata se une al polipeptido de rSPD(n/CRD), etc.

Segun un decimosegundo aspecto, se da a conocer en el presente documento un metodo de identificacion de un agonista o antagonista de un polipeptido de rSPD (n/CRD), comprendiendo el metodo: (a) proporcionar una celula u organismo; (b) exponer la celula u organismo a un polipeptido de rSPD(n/CRD), acido nucleico, o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo; (c) exponer la celula a una molecula candidata; y (d) detectar un efecto mediado por rSPD(n/CRD).

El efecto mediado por rSPD(n/CRD) se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en: reduccion de la eosinofilia de sangre periferica, reduccion de los niveles de 1gE sericos, reduccion de los niveles de 1gG1 sericos, reduccion de la hiperreactividad de las vfas respiratorias, reduccion del numero de macrofagos alveolares, reduccion de los niveles de fosfolfpidos en lavado, regulacion por disminucion de la expresion de eotaxina, reduccion en la expresion de MCP1, regulacion por disminucion de la expresion de M1P1 y regulacion por disminucion de la expresion de M1P2. El metodo comprende ademas preferiblemente aislar o sintetizar una molecula seleccionada o identificada.

Se da a conocer en el presente documento, segun un decimotercer aspecto, una molecula identificada o seleccionada segun el decimosegundo aspecto.

Se da a conocer en el presente documento, segun un decimocuarto aspecto, una composicion que comprende un polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD) o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo, junto con uno o mas de los siguientes componentes: un extracto de pulmon, preferiblemente un extracto bovino, preferiblemente, de pulmon de ternero, o un componente del mismo, un fosfolfpido, preferiblemente una fosfatidilcolina o una fosfatidilcolina disaturada, un acido graso, una protefna asociada a tensioactivo, preferiblemente una protefna B asociada a tensioactivo o una protefna C asociada a tensioactivo, un alcohol cetflico, un alcohol de repeticion de cadena larga, tiloxapol, palmitato de colfoscerilo (dipalmitoilfosfatidilcolina), acido palmftico, tripalmitina, poractant alfa y cloruro de sodio.

Como decimoquinto aspecto, se da a conocer en el presente documento el uso de un polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD), o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo en una terapia de sustitucion con tensioactivo.

Se da a conocer en el presente documento, segun un decimosexto aspecto, un polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD), o un fragmento, homologo, variante

o derivado del mismo en terapia de sustitucion con tensioactivo para su uso en terapia de sustitucion con tensioactivo.

Segun un decimoseptimo aspecto, se da a conocer en el presente documento el uso de SPD o un fragmento de la misma en la fabricacion de una composicion para el tratamiento de un estado que implica la produccion de ADN libre sobre la superficie de celulas. SPD y fragmentos de la misma, incluyendo rSPD(n/CRD), se unen al ADN mediante su capacidad de union a hidratos de carbono. Los fragmentos de SPd, por consiguiente, conservan ventajosamente la capacidad de union a hidratos de carbono de SPD nativa. Se da a conocer en el presente documento un metodo para tratar a un paciente que padece un estado que implica la produccion de ADN libre sobre la superficie de celulas que comprende administrar a un paciente que necesita tal tratamiento una cantidad farmaceuticamente eficaz de SPD o un fragmento de la misma.

Se da a conocer en el presente documento el uso de SPD o un fragmento de la misma en la fabricacion de una composicion para el tratamiento de una infeccion cronica que da como resultado la acumulacion de acido nucleico libre en el pulmon. Por ejemplo, la infeccion puede ser bacteriana, viral o fungica.

Se da a conocer en el presente documento el uso de SPD o un fragmento de la misma en la fabricacion de una composicion para el tratamiento de fibrosis qufstica. En fibrosis qufstica, se produce acido nucleico libre por celulas bacterianas en el pulmon, lo que conduce a formacion de biopelfcula bacteriana e infeccion pulmonar bacteriana persistente. SPD y fragmentos de la misma tambien actuan opsonizando muchos patogenos pulmonares, aumentando la eficacia del tratamiento de la fibrosis qufstica.

En un aspecto adicional, se da a conocer en el presente documento el uso de SPD o un fragmento de la misma en la fabricacion de una composicion para el aclaramiento de celulas necroticas y apoptoticas. Tales celulas tienen ADN en sus superficies, al que se unen SPD y fragmentos de la misma para el aclaramiento mediado por fagocitos. Por tanto, se dan a conocer en el presente documento composiciones para el tratamiento de estados y enfermedades pulmonares tales como EPOC, inflamacion cronica y asma cronica usando SPD o fragmentos de la misma y metodos para tratar a un paciente que padece una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en fibrosis qufstica, enfermedades pulmonares, EPOC, inflamacion cronica, infeccion bacteriana cronica, infeccion viral cronica, infeccion fungica cronica y asma cronica que comprende administrar a un paciente que necesita tal tratamiento una cantidad farmaceuticamente eficaz de SPD o un fragmento de la misma.

Todavfa en un aspecto adicional, se da a conocer en el presente documento el uso de SPD o un fragmento de la misma en la fabricacion de una composicion para el tratamiento de la produccion de autoanticuerpos en enfermedades autoinmunitarias; asf como un metodo para tratar a un paciente que padece una enfermedad autoinmunitaria que comprende administrar a un paciente que necesita tal tratamiento una cantidad farmaceuticamente eficaz de SPD o un fragmento de la misma.

ADN libre o residuos de ADN de celulas necroticas o apoptoticas pueden actuar como autoantfgeno, dando como resultado la produccion de autoanticuerpos. El aclaramiento de tal ADN libre por SPD y fragmentos de la misma reduce la produccion de autoanticuerpos.

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1A representa la estructura de un fragmento recombinante de SPDhumana (rSPD(n/CRD)). Este esta compuesto por trfmeros de la region de cuello y el dominio de reconocimiento de hidratos de carbono (CRD) y se ha expresado, purificado y caracterizado en la Unidad de inmunoqufmica MRC en la Universidad de Oxford.

Figura 1B. SDSPAGE de filtrado de cultivo de 1 semana de Aspergillus fumigatus que muestra una banda de 18 kDa dominante (Asp f 1).

Figura 2A. 1gE serica en modelo de raton con Afu medida 3 dfas tras el tratamien to con 5 dosis diarias de 10 g de rSPD (n/CRD) o PBS administradas por vfa intranasal tras la exposicion intranasal con Afu 1 wcf y tras la reexposicion 1 semana mas tarde con Afu solo. P=ratones no sensibilizados tratados con PBS, AP=ratones sensibilizados tratados con PBS, AR=ratones sensibilizados tratados con rSPD(n/CRD), APrc=ratones reexpuestos a Afu tratados con PBS, ARrc=ratones reexpuestos a Afu tratados con rSPD(n/CRD).

Figura 2B. 1gE especffica de Afu en modelo de raton con Afu. Como la figura 2A anterior, pero se mide 1gG1 especffica de Afu.

Figura 3. Eosinofilia de sangre periferica en modelo de raton con Afu medida 1 dfa tras el tratamiento con 4 dosis diarias de 10 g de rSPD(n/CRD) o PBS administradas por vfa intranasal tras la exposicion intranasal con Afu 1 wcf y tras la reexposicion 1 semana mas tarde con Afu solo. P=ratones no sensibilizados tratados con PBS, AP=ratones sensibilizados tratados con PBS, AR=ratones sensibilizados tratados con rSPD(n/CRD), APrc=ratones reexpuestos a Afu tratados con PBS, ARrc=ratones reexpuestos a Afu tratados con rSPD(n/CRD).

Figuras 4A, 4B y 4C. Citocinas en modelo de raton con Afu medidas 1 dfa tras el tratamiento con 2 dosis diarias de 10 g de rSPD(n/CRD) administradas por vfa intranasal tras la exposicion intranasal con Afu 1wcf. Figura 4A, 1L12 medida en el bazo, figura 4B, 1FNmedido en el bazo y figura 4C, 1L4 medida en el bazo. P=ratones no sensibilizados tratados con PBS, AP=ratones sensibilizados tratados con PBS, AR=ratones sensibilizados tratados con rSPD(n/CRD), AA=ratones sensibilizados tratados con rhSPA.

Figuras 5A y 5B. Hiperreactividad de las vfas respiratorias en modelo de raton con Afu. Se tratan los ratones con 4 dosis diarias de 10 g de rSPD(n/CRD) administradas por vfa intranasal tras la exposicion intranasal con Afu 1wcf. Se mide la pletismograffa 2 horas tras una reexposicion intranasal con Afu 1wcf solo administrada 3 dfas tras la finalizacion del tratamiento. Figura 5A, respuesta a la dosis a dosis crecientes de metacolina. Figura 5B, respuesta a metacolina 30 mg/ml tras el tratamiento con 4 dosis diarias de 10 g de rSPD(n/CRD) o rhSPA administradas por vfa intranasal tras la exposicion intranasal con Afu 1wcf. P=ratones no sensibilizados tratados con PBS, AP=ratones sensibilizados tratados con PBS, AR=ratones sensibilizados tratados con rSPD(n/CRD), AA=ratones sensibilizados tratados con rfhSPA.

Figuras 6A y 6B. Secciones de pulmon tefidas con H&E de modelo de raton con Afu de ratones sensibilizados tras el tratamiento, figura 6A con PBS, figura 6B con rSPD(n/CRD) o G ratones no sensibilizados tratados con PBS.

Figura 7A. Un analisis de 1L12 en los homogeinizados de pulmon de ratones sensibilizados con Der p tras el tratamiento medido mediante tincion de citocinas intracelulares seguido por analisis de FACS para el porcentaje de celulas altamente tefidas (PEgt;1000) positivas para 1L12. PBS= ratones no sensibilizados tratados con PBS. HP= ratones sensibilizados tratados con PBS. HR= ratones sensibilizados tratados con 10 g de rSPD (N/CRD).

Figura 7B. Un analisis de 1L12 en los homogeinizados de bazo de ratones sensibilizados con Der p tras el tratamiento medido mediante tincion de citocinas intracelulares seguido por analisis de FACS para el porcentaje de celulas altamente tefidas (PEgt;1000) positivas para 1L12. PBS= ratones no sensibilizados tratados con PBS. HP= ratones sensibilizados tratados con PBS. HR= ratones sensibilizados tratados con 10 g de rSPD (N/CRD). HB= ratones sensibilizados tratados con 10 g de BSA.

Figura 7C. Un analisis de 1FNen los homogeneizados de bazo de ratones sensibilizados con Der p tras el tratamiento medido mediante tincion de citocinas intracelulares seguido por analisis de FACS para el porcentaje de celulas altamente tefidas (PEgt;1000) positivas para 1FN. PBS= ratones no sensibilizados tratados con PBS. HP= ratones sensibilizados tratados con PBS. HR= ratones sensibilizados tratados con 10 g de rSPD (N/CRD).

Figura 7D. Un analisis de TNFen los homogeneizados de bazo de ratones sensibilizados con Der p tras el tratamiento medido mediante tincion de citocinas intracelulares seguido por analisis de FACS para el porcentaje de celulas altamente tefidas (PEgt;1000) positivas para TNF. PBS= ratones no sensibilizados tratados con PBS. HP= ratones sensibilizados tratados con PBS. HR= ratones sensibilizados tratados con 10 g de rSPD (N/CRD).

La figura 8A (titulada quot;respuesta de Penh promedio a una exposicion de 1 min. con metacolina 20 mg/ml en el 4° dfa de tratamientoquot;) es un grafico que muestra el efecto del tratamiento con rSPD(n/CRD) sobre la hiperreactividad de las vfas respiratorias (AHR) de ratones alergicos, medida en el ultimo dfa de los 4 dfas de tratamiento. Los ratones alergicos se sensibilizan a Dermatophagoides pteronyssinus. El control de PBS representa ratones no sensibilizados tratados con PBS. Se muestra la respuesta de Penh promedio a una exposicion de 1 minuto con metacolina 20 mg/ml en el 4° dfa de tratamiento. Eje X: izquierda: control de PBS, medio: Der pPBS, derecha: Der prSPD; eje Y: % de Penh por encima del fondo.

La figura 8B (titulada quot;Hiperreactividad de las vfas respiratorias en ratones alergicos inducida por exposicion con metacolinaquot;) es un grafico que muestra la respuesta a la dosis de metacolina, tras la reexposicion con alergeno 4 dfas tras el tratamiento con PBS o rSPD(n/CRD). Los ratones alergicos se sensibilizan a Dermatophagoides pteronyssinus. El PBScontrol de PBS representa ratones no sensibilizados tratados con PBS. Se mide la hiperreactividad de las vfas respiratorias (AHR) en ratones alergicos inducida mediante exposicion a metacolina. Eje X: metacolina (mg/ml); rombos: PBSPBS, cuadrados: Der pPBS, triangulos: Der prSPD.

La figura 9 es un grafico que muestra el efecto del tratamiento con rSPD (N/CRD) sobre el numero de macrofagos alveolares, tras lavado. Eje X: edad en semanas; eje Y: numero de macrofagos alveolares x 104 por lavado de raton.

La figura 10A muestra una citocentrifugacion de celulas en lavado broncoalveolar. Se tifen macrofagos alveolares con verde malaquita (paneles superiores) o cristal violeta (paneles inferiores) tras la citocentrifugacion. Se muestra la morfologfa para sin tratamiento (paneles superior izquierdo), tratadas con BSA (paneles superior derecho) y tratadas con rSPD (paneles inferiores).

La figura 10B muestra una citocentrifugacion de celulas en lavado broncoalveolar. Parte superior izquierda: celulas no tratadas de ratones deficientes en SPD; parte superior derecha: celulas de ratones de tipo natural; parte inferior izquierda: celulas de ratones deficientes en SPD tratadas con BSA; parte inferior derecha: celulas de ratones deficientes en SPD tratadas con rSPD.

La figura 11 (titulada quot;Fosfolfpido en sobrenadante de lavado libre de celulas por ratonquot;) es un grafico que muestra el efecto del tratamiento con rSPD (N/CRD) sobre los niveles de fosfolfpido en LBA totales. Se muestra el fosfolfpido en sobrenadante de lavado libre de celulas por raton. Eje X: edad en semanas; eje Y: fos folfpido en g por raton.

La figura 12 (titulada quot;Niveles de ARNm de quimiocinas en ratones deficientes en SPD en comparacion con TN y el efecto del tratamiento con rSPDquot;) son graficos que muestran los niveles de ARNm de quimiocinas en ratones deficientes en SPD en comparacion con el tipo natural y el efecto del tratamiento con rSPD (N/CRD).

La figura 13A muestra un resultado representativo de la citometrfa de flujo de dispersion frontal (tamafo celular) y dispersion lateral (granularidad) en ratones deficientes en SPD en comparacion con ratones de tipo natural.

La figura 13B muestra los patrones tfpicos de tincion de anexina V y P1 de macrofagos de ratones deficientes en SPD en comparacion con ratones de tipo natural.

La figura 13C muestra el grado de marcaje conjunto de rSPD marcada con F1TC con celulas positivas para V y/o P1.

La figura 13D es un grafico que muestra el porcentaje de celulas apoptoticas (panel superior) y celulas necroticas (panel inferior) en lavado broncoalveolar de ratones deficientes en SPD no tratados, ratones de tipo natural, ratones tratados con rSPD(n/CRD), ratones tratados con PBS, ratones tratados con SPA y ratones tratados con BSA.

La figura 14 es un grafico que muestra las concentraciones de GMCSF en lavado broncoalveolar de ratones de tipo natural, ratones deficientes en SPD y ratones deficientes en SPD tratados con rSPD(n/CRD).

La figura 15 muestra la microscopfa confocal de macrofagos de tipo natural (paneles A y B) y ratones deficientes (paneles C y D), tefidos con F1TCdUTP (color verde). Las celulas en apoptosis avanzada se tifen de color verde y las celulas en apoptosis temprana se identifican por una tincion punteada caracterfstica de fragmentos de ADN marcados en los extremos.

La figura 16 muestra la fagocitosis potenciada de macrofagos apoptoticos (marcados de color naranja) por macrofagos de color verde recien aislados.

La figura 17 muestra los niveles de colesterol plasmaticos en mM en ratones de tipo natural y ratones deficientes en SPD.

La figura 18 muestra imagenes de microscopfa electronica de transmision tefidas negativamente de ADN genomico y complejos entre SPD y ADN. A. ADN genomico. B y C, ADN genomico complejado con rSPD(n/CRD); D, ADN genomico complejado con SPD nativa.

La figura 19 demuestra que la union entre rSPD(n/CRD) y manano sufre competencia por desoxirribonucleotidos. Se dejo que una concentracion fijada de rSPD(n/CRD) (100 g/ml) se uniese a manano biotinilado que estaba inmovilizado sobre un chip SA B1Acore en presencia de concentraciones indicadas de hexosas (A) o dNTP (B) en tampon salino que contiene CaCl2 5 mM.

La figura 20 muestra la inhibicion de la union a yoduro de propidio por rSPD(n/CRD).

La figura 21 muestra que macrofagos alveolares aislados de ratones deficientes en SPD son defectuosos en el aclaramiento del ADN. Se aislaron macrofagos alveolares del lavado de pulmon de ratones de tipo natural (A, D) o ratones deficientes en SPA (SPA(/)) (B, E) o ratones deficientes en SPD (SPD(/)) (C, F), se lavaron y se incubaron con o bien tampon (A, B, C) o bien ADN de pulmon marcado con Cy3 (color rojo) (D, E, F). Se monitorizo la captacion de ADN mediante FACS a FL2H y se represento graficamente frente a FL1H no especffico. Se indico en la figura la proporcion de macrofagos alveolares que captaban el ADN (D, E, F).

Descripcion detallada

Se da a conocer la secuencia y el metodo de produccion de un fragmento de SPD recombinante, denominado en el presente documento quot;polipeptido de rSPD(n/CRD)quot;. Hasta donde saben los inventores, la secuencia y produccion del polipeptido rSPD(n/CRD) no se ha dado a conocer anteriormente. Se muestra que los polipeptidos de rSPD(n/CRD) pueden asociarse entre sf y formar trfmeros en disolucion.

En una realizacion altamente preferida, se describe el uso de polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD), o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo para su uso como terapia de sustitucion con tensioactivo, particularmente para recien nacidos. El polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD), o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo puede emplearse adecuadamente para el tratamiento de enfermedades pulmonares neonatales, particularmente, enfermedades pulmonares cronicas neonatales.

Se demuestra que el polipeptido de rSPD(n/CRD) reduce la eosinofilia de sangre periferica y los niveles de 1gE sericos totales, asf como los niveles de 1gG1, cuando se administra a ratones deficientes que carecen de protefna tensioactiva D y expuestos a alergeno. Por tanto, el polipeptido de rSPD(n/CRD) es adecuado para su uso como modulador de reacciones de hipersensibilidad alergicas en individuos. El polipeptido de rSPD(n/CRD) tambien es adecuado para su uso en el tratamiento de cualquier enfermedad o sfndrome caracterizado por eosinofilia de sangre periferica, niveles de 1gE sericos elevados, niveles de 1gG1 elevados o cualquier combinacion de estos.

El polipeptido de rSPD(n/CRD) tambien puede usarse para la regulacion de la inflamacion mediada por macrofagos en el pulmon, asf como en la defensa frente a la invasion por patogenos y en la modulacion de respuestas inflamatorias a la infeccion y estfmulos alergenicos.

Ratones, por ejemplo ratones de tipo natural C57B116, sensibilizados con y expuestos a alergeno de acaros del polvo domestico muestran hiperreactividad de las vfas respiratorias caracterfstica del asma alergica. La administracion del polipeptido de rSPD(n/CRD) a tales ratones reduce la hiperreactividad de las vfas respiratorias. Por consiguiente, el polipeptido de rSPD(n/CRD) puede administrarse a individuos para tratar cualquier enfermedad o sfndrome en el que se produzca hiperreactividad de las vfas respiratorias, incluyendo asma alergica.

Otras enfermedades para las que puede emplearse el tratamiento de polipeptido de rSPD(n/CRD) incluyen estados cutaneos, por ejemplo, eccema (que es una enfermedad mediada por Th2), asf como alergias en general. Tales alergias incluyen alergias alimentarias, por ejemplo contra alergenos tales como huevo, frutos de cascara, cacahuete y leche. Otros alergenos comunes incluyen polenes, polvo, moho y mildiu, asf como alergenos de insectos, animales domesticos (perros, gatos, aves) y plantas. Tambien se incluyen alergias respiratorias estacionales, denominadas comunmente fiebre del heno, aeroalergenos, que incluyen acaros del polvo domestico, esporas fungicas, polenes de hierbas, polenes de arboles y caspa de animales.

Otras categorfas de alergias, que pueden tratarse con rSPD(n/CRD), son las que podrfan beneficiarse de la reduccion en la hiperreactividad de las vfas respiratorias, 1gE serica y eosinofilia que son factores importantes en la produccion de los sfntomas de alergia. Esto incluye el tratamiento de asma alergica. Tambien puede usarse rSPD(n/CRD) como tratamiento eficaz para estados que se beneficiarfan de la regulacion por incremento del sistema inmunitario mediado por celulas. Esto incluye accion antimicrobiana y el tratamiento de infecciones del pulmon.

Puede usarse rSPD(n/CRD) como tratamiento eficaz para estados que se beneficiarfan de la regulacion por incremento de la actividad de celulas citotoxicas natu rales y la secrecion de citocina 1FN por celulas del sistema inmunitario. Esto incluye el tratamiento de cancer de pulmon y otros canceres y neoplasias. Tambien puede usarse rSPD(n/CRD) como tratamiento eficaz para estados que se beneficiarfan de la complementacion de SPD natural endogena con rSPD(n/CRD). Esto incluye el tratamiento de estados en los que el nivel de SPD natural endogena es anomalamente bajo. Esto incluye el tratamiento de recien nacidos con trastornos del sistema tensioactivo del pulmon en los que el nivel de SPD natural endogena es anomalamente bajo. Esto tambien incluye el tratamien

to de pacientes con fibrosis qufstica en los que el nivel de SPD del pulmon natural endogena es anomalamente bajo. Esto tambien incluye el tratamiento de pacientes con otras infecciones del pulmon en los que el nivel de SPD natural endogena es anomalamente bajo.

En una realizacion adicional, pueden utilizarse las propiedades antialergicas de SPD para combatir enfermedades oculares alergicas. Se da a conocer en el presente documento SPD, o un fragmento de la misma tal como rSPD(n/CRD), para el tratamiento de estados oculares alergicos.

Se ha medido los niveles de protefna tensioactiva D en lagrimas humanas y se ha encontrado que es de 132 ng/ml. El hecho de que SPD tenga propiedades antialergicas tal como se expone en el presente documento y este presente en fluido lacrimal humano sugiere que la protefna esta implicada en el efecto antialergico natural de las lagrimas. Puede afadirse SPD o rSPD(n/CRD) a, por ejemplo, disolucion de lentes de contacto para ayudar a compensar la irritacion/inflamacion por las lentes de contacto. Ademas, es una adicion valiosa en el tratamiento de por ejemplo el sfndrome de Sjogren, una enfermedad autoinmunitaria caracterizada por ojos secos y boca seca (provocada por autoanticuerpos frente a componentes de glandulas lacrimales y salivales humanas). Se trata actualmente con complementacion de lagrimas artificiales (tales como gotas oculares de hipermelosa) y la adicion de SPD o fragmentos de la misma a tales formulaciones potencia el efecto protector de las lagrimas artificiales frente a infecciones oculares e inflamacion de la cornea.

Cuando se hace referencia a rSPD(n/CRD) anteriormente, debe considerarse que se hace referencia al propio polipeptido o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo.

Cuando se hace referencia a un tratamiento de una enfermedad, debe considerarse que incluye la referencia al alivio de un sfntoma de esa enfermedad. De manera preferible, sustancialmente todos los sfntomas de un individuo que tiene tal enfermedad se alivian o eliminan. Debe considerarse que quot;enfermedadquot; incluye cualquier sfndrome, asf como cualquier estado que afecte a la salud o el bienestar de un individuo. Preferiblemente, se alivia en el individuo al que se le administra un polipeptido de rSPD(n/CRD), fragmento, homologo, variante o derivado del mismo, al menos un sfntoma de la enfermedad o estado, es decir, revierte sustancialmente al estado de un individuo no afectado normal. Esto puede evaluarse por un medico usando un parametro clfnico relevante. Por ejemplo, la hiperreactividad de las vfas respiratorias puede medirse usando los metodos expuestos en los ejemplos.

La practica de la presente invencion empleara, a menos que se indique otra cosa, tecnicas convencionales de qufmica, biologfa molecular, microbiologfa, ADN recombinante e inmunologfa, que estan dentro de las capacidades de una persona de experiencia habitual en la tecnica. Tales tecnicas se explican en la bibliograffa. Vease, por ejemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edicion, libros 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 y suplementos periodicos; Current Protocols in Molecular Biology, cap. 9, 13 y 16, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, y A. Kahn, 1996, ADN 1solation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak y James O'D. McGee, 1990, 1n Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, 1rl Press; y D. M.

J. Lilley y J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: ADN Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press.

Protefna tensioactiva D RSPD(N/CRD)

Se ha identificado y caracterizado la protefna tensioactiva D anteriormente, en por ejemplo Rust, et al (1991), Human surfactant protein D: SPD contains a Ctype lectin carbohydrate recognition domain. Archives of biochemistry and biophysics. 290 (1), 116126; Lu, et al (1992) Purification, Characterization and cDNA Cloning of Human Lung Surfactant Protein D. Biochem. J. 284, 785802; Crouch, et al (1993) Genomic organization of human surfactant protein D (SPD). SPD is encoded on chromosome 10q22.223.1. The Journal of biological chemistry. 268 (4), 29762983; Kolble, et al (1993) Assignment of the human pulmonary surfactant protein D gene (SFTP4) to 10q22q23 close to the surfactant protein A gene cluster. Genomics. 17 (2), 294298 (1993).

Cuando se usan los terminos quot;protefna tensioactiva Dquot;, quot;SPDquot;, quot;hSPDquot; y quot;SPD naturalquot;, se considerara que se refieren a cualquier polipeptido o acido nucleico de protefna tensioactiva D (tal como requiera el contexto). Preferiblemente, sin embargo, debe considerarse que estos terminos se refieren a protefna tensioactiva D humana, por ejemplo, las secuencias dadas a conocer en las referencias anteriores, o en los numeros de registro de GenBank NM 003019.1, XM 005776.2, X65018.1 y L05485.1. Lo mas preferiblemente, la protefna tensioactiva D es una protefna tensioactiva D humana que tiene los numeros de registro de GenBank NM 003019.1. Las secuencias de acido nucleico y aminoacidos de SPD humana se muestran en SEQ 1D NO: 3 y SEQ 1D NO: 4 respectivamente.

Polipeptidos de protefna tensioactiva D recombinante RSPD(N/CRD)

Se proporciona un fragmento de polipeptido de protefna tensioactiva D (SPD), al que se hace referencia como rSPD(n/CRD). La secuencia de un polipeptido de rSPD(n/CRD) de este tipo se muestra en SEQ 1D NO: 1. rSPD(N/CRD) tambien se denomina en este documento quot;rhSPDquot;, y los dos terminos deben considerarse sinonimos.

Cuando se emplea el termino rSPD, debe considerarse que se refiere generalmente a SPD recombinante, ya corresponda a SPD de longitud completa, preferiblemente SPD humana (expresada de una manera recombinante), o un fragmento de esta. Preferiblemente, debe considerarse que el termino rSPD se refiere a un fragmento recombinante de SPD, preferiblemente SPD humana. Preferiblemente, y cuando el contexto lo requiera, debe considerarse que quot;rSPDquot; se refiere al fragmento de SPD recombinante rSPD(n/CRD) descrito anteriormente.

Se entendera que los polipeptidos dados a conocer en el presente documento no se limitan a la secuencia de rSPD(n/CRD) particular mostrada en SEQ 1D NO: 1, sino que tambien incluye fragmentos de la misma. Los fragmentos particularmente preferidos incluyen los que tienen una o mas actividades biologicas de rSPD(n/CRD).

Ademas, los polipeptidos de rSPD(n/CRD) tambien incluyen generalmente cualquier fragmento recombinante de SPD, preferiblemente SPD humana, que carece del dominio Nterminal y/o el dominio de colageno, preferiblemente ambos. Por tanto, en una realizacion preferida, el polipeptido de rSPD(n/CRD) es un fragmen

5 to recombinante de SPD, preferiblemente SPD humana representada en SEQ 1D NO: 4, que carece sustancialmente de los residuos 1178. En una realizacion adicional preferida, el polipeptido de rSPD(n/CRD) es un fragmento recombinante de SPD, preferiblemente la secuencia de SPD humana mostrada en SEQ 1D NO: 4, que comprende sustancialmente los residuos 179355.

10 En una realizacion preferida, el residuo de prolina correspondiente a la posicion 200 de la secuencia de SPD humana (SEQ 1D NO: 4) se reemplaza por otro residuo. Preferiblemente, el residuo de prolina se reemplaza por un residuo polar no cargado, por ejemplo, un residuo de cistefna, serina, treonina o metionina. En una realizacion altamente preferida, el residuo de prolina se reemplaza por un residuo

15 de serina. Por tanto, el polipeptido de rSPD(n/CRD) puede comprender una secuencia mostrada en SEQ 1D NO: 1.

Tambien se incluyen fragmentos, homologos, variantes y derivados de cada una de las secuencias anteriores.

En realizaciones preferidas, el polipeptido de rSPD(n/CRD) comprende una region

20 de quot;cabezaquot; o dominio de reconocimiento de hidratos de carbono (CRD), que comprende sustancialmente los siguientes residuos:

Preferiblemente, el polipeptido de rSPD(n/CRD) comprende medios para la multimerizacion, preferiblemente trimerizacion, con otro polipeptido de rSPD(n/CRD).

25 Tales medios pueden incluir, por ejemplo, un resto de biotina que interacciona con y se une a un resto de avidina o estreptavidina sobre otro polipeptido de rSPD(n/CRD).

En realizaciones adicionales preferidas, el polipeptido de rSPD(n/CRD) comprende ademas una region de quot;cuelloquot; que comprende sustancialmente los siguientes

30 residuos:

DVASLRQQVEALQGQVQHLQAAFSQYKK

Preferiblemente, una region de cuello de este tipo esta en posicion Nterminal con respecto al dominio de reconocimiento de hidratos de carbono (CRD).

En una realizacion preferida, el polipeptido de rSPD(n/CRD) comprende ademas

35 al menos un tramo de GlyXaaYaa, preferiblemente una secuencia que comprende una pluralidad de repeticiones de GlyXaaYaa, lo mas preferiblemente una secuencia que comprende 8 repeticiones de GlyXaaYaa. En una realizacion preferida, el polipeptido de rSPD(n/CRD) comprende ademas una secuencia Nterminal que comprende sustancialmente GSPGLKGDKGIPGDKGAKGESGLP.

40 En una realizacion altamente preferida, el polipeptido de rSPD(n/CRD) comprende, preferiblemente consiste en, una secuencia mostrada en SEQ 1D NO: 1. Por tanto, tal como se usa en este documento, debe considerarse preferiblemente que el termino quot;polipeptido de rSPD(n/CRD)quot; se refiere a la secuencia a continuacion

(SEQ 1D NO: 1) asf como un fragmento, homologo, variante o derivado de la mis5 ma.

Los polipeptidos dados a conocer tambien incluyen secuencias homologas obtenidas de cualquier fuente, por ejemplo protefnas virales/bacterianas relacionadas, homologos celulares y peptidos sinteticos, asf como variantes o derivados de los mismos. Por tanto, los polipeptidos tambien incluyen los que codifican para homo

10 logos de rSPD(n/CRD) de otras especies incluyendo animales tales como mamfferos (por ejemplo ratones, ratas o conejos), especialmente primates, mas especialmente seres humanos. Mas especfficamente, los homologos incluyen homologos humanos.

Por tanto, se dan a conocer variantes, homologos o derivados de la secuencia de

15 aminoacidos de la secuencia de rSPD(n/CRD) mostrada en SEQ 1D NO: 1, asf como variantes, homologos o derivados de una secuencia de nucleotidos que codifica para tales secuencias de aminoacidos.

Preferiblemente, los polipeptidos de rSPD(n/CRD), variantes, homologos, fragmentos y derivados dados a conocer en el presente documento comprenden una 20 o mas propiedades de rSPD(n/CRD), preferiblemente una o mas actividades biologicas de rSPD(n/CRD). Por tanto, las variantes, etc. comprenden preferiblemente una o mas actividades incluyendo pero sin limitarse a, actividad de union a hidratos de carbono, actividad de multimerizacion, incluyendo actividad de trimerizacion, regulacion por disminucion de quimiocinas, reduccion de la hiperreactivi25 dad de las vfas respiratorias, reduccion del numero de macrofagos alveolares, reduccion del nivel de fosfolfpidos, cuando se administran a un animal que carece de SPD, aumento del aclaramiento de macrofagos apoptoticos y/o necroticos, reduccion de la eosinofilia de sangre periferica, reduccion de 1gE serica, reduccion de 1gG1 serica, asf como cualquiera de las propiedades o actividades biologicas

30 dadas a conocer en los ejemplos.

En el contexto de este documento, se considera que una secuencia homologa incluye una secuencia de aminoacidos que es al menos el 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o el 90% identica, preferiblemente al menos el 95 o el 98% identica al nivel de aminoacidos con respecto a al menos 50 o 100, preferiblemente 200, 35 300, 400 o 500 aminoacidos con la secuencia de rSPD(n/CRD) mostrada en SEQ 1D NO: 1. En particular, debe considerarse normalmente la homologfa con respecto a las regiones de la secuencia que se sabe que son esenciales para la funcion de la protefna en vez de secuencias vecinas no esenciales. Esto es especialmente importante cuando se consideran secuencias homologas de organismos rela

40 cionados de manera distante.

Aunque puede considerarse tambien la homologfa en cuanto a similitud (es decir, residuos de aminoacido que tienen funciones/propiedades qufmicas similares), en el contexto de la presente invencion se prefiere expresar la homologfa en cuanto a identidad de secuencia.

Pueden realizarse comparaciones de homologfa a simple vista, o mas habitualmente, con la ayuda de programas de comparacion de secuencias facilmente disponibles. Estos programas informaticos publica y comercialmente disponibles pueden calcular el % de homologfa entre dos o mas secuencias.

Puede calcularse el % de homologfa con respecto a secuencias contiguas, es decir, se alinea una secuencia con la otra secuencia y se compara cada aminoacido en una secuencia directamente con el aminoacido correspondiente en la otra secuencia, un residuo cada vez. Esto se denomina alineacion quot;sin huecosquot;. Normalmente, tales alineaciones sin huecos se realizan solo a lo largo de un numero de residuos relativamente corto (por ejemplo, menos de 50 aminoacidos contiguos).

Aunque este es un metodo muy sencillo y constante, falla al tener en consideracion que, por ejemplo, en un par de secuencias por lo demas identicas, una insercion o delecion provocara que los siguientes residuos de aminoacido se salgan de la alineacion, dando como resultado posiblemente por tanto una gran reduccion en el % de homologfa cuando se realiza una alineacion global. En consecuencia, la mayorfa de los metodos de comparacion de secuencias estan disefados para producir alineaciones optimas que tienen en consideracion posibles inserciones y deleciones sin penalizar excesivamente la puntuacion de homologfa global. Esto se logra insertando quot;huecosquot; en la alineacion de secuencias para intentar maximizar la homologfa local.

Sin embargo, estos metodos mas complejos asignan quot;penalizaciones por huecosquot; a cada hueco que se produce en la alineacion de modo que, para el mismo numero de aminoacidos identicos, una alineacion de secuencias con tan pocos huecos como sea posible (lo que refleja una relacion superior entre las dos secuencias comparadas) lograra una puntuacion superior que una con muchos huecos. Se usan normalmente quot;costes de huecos afinesquot; que cargan un coste relativamente alto para la existencia de un hueco y una penalizacion mas pequefa para cada residuo posterior en el hueco. Este es el sistema de puntuacion de huecos mas comunmente usado. Altas penalizaciones por huecos produciran por supuesto alineaciones optimizadas con menores huecos. La mayorfa de los programas de alineacion permiten que se modifiquen las penalizaciones por huecos. Sin embargo, se prefiere usar los valores por defecto cuando se usa tal software para comparaciones de secuencias. Por ejemplo, cuando se usa el paquete GCG Wisconsin Bestfit (vease a continuacion) la penalizacion por huecos por defecto para secuencias de aminoacidos es de 12 para un hueco y de 4 para cada extension.

Por tanto, el calculo del % de homologfa maxima requiere en primer lugar la produccion de una alineacion optima, teniendo en consideracion las penalizaciones por huecos. Un programa informatico adecuado para llevar a cabo una alineacion de este tipo es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (Universidad de Wisconsin, EE.UU.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). Los ejemplos de otro software que puede realizar comparaciones de secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete BLAST (vease Ausubel et al., 1999 fdem. - capftulo 18), FASTA (Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403410) y el juego GENEWORKS de herramientas de comparacion. Tanto BLAST como FASTA estan disponibles para busqueda fuera de lfnea y en lfnea (vease Ausubel et al., 1999 fdem., paginas 758 a 760). Sin embargo, se prefiere usar el programa GCG Bestfit.

Aunque el % de homologfa final puede medirse en cuanto a identidad, el propio proceso de alineacion no se basa normalmente en una comparacion por parejas de todo o nada. En su lugar, se usa generalmente una matriz de puntuacion de similitud escalada que asigna puntuaciones a cada comparacion por parejas basandose en la similitud qufmica o la distancia evolutiva. Un ejemplo de una matriz de este tipo comunmente usada es la matriz BLOSUM62, la matriz por defecto para el juego BLAST de programas. Los programas de GCG Wisconsin usan generalmente o bien los valores por defecto publicos o bien una tabla de comparacion de sfmbolos a medida si se suministra (vease el manual de usuario para detalles adicionales). Se prefiere usar los valores por defecto publicos para el paquete GCG, o en el caso de otro software, la matriz por defecto, tal como BLOSUM62.

Una vez que el software ha producido una alineacion optima, es posible calcular el % de homologfa, preferiblemente el % de identidad de secuencia. El software realiza esto normalmente como parte de la comparacion de secuencias y genera un resultado numerico.

Los terminos quot;variantequot; o quot;derivadoquot; en relacion con las secuencias de aminoacidos de la presente invencion incluye cualquier sustitucion de, variacion de, modificacion de, reemplazo de, delecion de o adicion de uno (o mas) aminoacidos de o en la secuencia siempre que la secuencia de aminoacidos resultante conserve sustancialmente la misma actividad que la secuencia no modificada, que tiene preferiblemente al menos la misma actividad que el polipeptido de rSPD(n/CRD) mostrado en SEQ 1D NO: 1.

Pueden modificarse polipeptidos que tienen la secuencia de aminoacidos mostrada en los ejemplos, o fragmentos u homologos de los mismos para su uso en los metodos y composiciones descritos en el presente documento. Normalmente, se hacen modificaciones que mantienen la actividad biologica de la secuencia. Pueden hacerse sustituciones de aminoacidos, por ejemplo desde 1, 2 o 3 hasta 10, 20 o 30 sustituciones siempre que la secuencia modificada conserve la actividad biologica de la secuencia no modificada. Alternativamente, pueden hacerse modificaciones para inactivar deliberadamente uno o mas dominios funcionales de los polipeptidos descritos en el presente documento. Los dominios funcionales de rSPD(n/CRD) incluyen el dominio de colageno, la region de cuello y el dominio de reconocimiento de hidratos de carbono. Las sustituciones de aminoacidos pueden incluir el uso de analogos que no se producen de manera natural, por ejemplo para aumentar la semivida en plasma sangufneo de un polipeptido administrado terapeuticamente.

Pueden hacerse sustituciones conservativas, por ejemplo segun la tabla a continuacion. Pueden sustituirse entre sf aminoacidos en el mismo bloque en la segunda columna y preferiblemente en la misma lfnea en la tercera columna:

AL1FAT1CO: No polar G A P

1 L V

Polar - no cargado: C S T M

N Q

Polar cargado: D E

K R

AROMAT1CO: H F W Y

Los polipeptidos tambien incluyen fragmentos de la secuencia de longitud completa de protefna tensioactiva D. Preferiblemente, los fragmentos comprenden al menos un epftopo. Se conocen bien en la tecnica metodos de identificacion de epfto

5 pos. Los fragmentos comprenderan normalmente al menos 6 aminoacidos, mas preferiblemente al menos 10, 20, 30, 50 o 100 aminoacidos.

SPD recombinante, incluyendo rSPD(N/CRD) y sus fragmentos, homologos, variantes y derivados, se preparan normalmente por medios recombinantes, por ejemplo tal como se describe a continuacion en los ejemplos. Sin embargo, tam10 bien pueden prepararse por medios sinteticos usando tecnicas bien conocidas por personas expertas tales como sfntesis en fase solida. Las protefnas tambien pueden producirse como protefnas de fusion, por ejemplo para ayudar en la extraccion y purificacion. Los ejemplos de parejas de protefnas de fusion incluyen glutationStransferasa (GST), 6xHis, GAL4 (dominios de union al ADN y/o activacion 15 transcripcional) y galactosidasa. Tambien puede ser conveniente incluir un sitio de escision proteolftica entre la pareja de protefna de fusion y la secuencia de protefna de interes para permitir la eliminacion de las secuencias de protefnas de fusion. Preferiblemente, la protefna de fusion no dificultara la funcion de la secuencia de protefna de interes. Tambien pueden obtenerse protefnas mediante purifi

20 cacion de extractos celulares a partir de celulas animales.

Los polipeptidos de rSPD(n/CRD), variantes, homologos, fragmentos y derivados dados a conocer en el presente documento pueden estar en una forma sustancialmente aislada. Se entendera que tales polipeptidos pueden mezclarse con portadores o diluyentes que no interferiran con el fin previsto de la protefna y to

25 davfa se consideraran sustancialmente aislados. Una variante, homologo, fragmento o derivado de rSPD(n/CRD) tambien puede estar en una forma sustancialmente purificada, en cuyo caso comprendera generalmente la protefna en una preparacion en la que mas del 90%, por ejemplo el 95%, 98% o el 99% de la protefna en la preparacion es una protefna.

30 Los polipeptidos de rSPD(n/CRD), variantes, homologos, fragmentos y derivados dados a conocer en el presente documento pueden marcarse con un marcador de revelado. El marcador de revelado puede ser cualquier marcador adecuado que permita que el polipeptido, etc. se detecte. Los marcadores adecuados incluyen radioisotopos, por ejemplo 1251, enzimas, anticuerpos, polinucleotidos y ligadores

35 tales como biotina. Pueden usarse polipeptidos marcados en procedimientos de diagnostico tales como inmunoensayos para determinar la cantidad de un polipep

tido en una muestra. Tambien pueden usarse polipeptidos o polipeptidos marcados en inmunoensayos serologicos o mediados por celulas para la deteccion de reactividad inmunitaria frente a dichos polipeptidos en animales y seres humanos usando protocolos convencionales.

Polipeptidos de rSPD(n/CRD), variantes, homologos, fragmentos y derivados dados a conocer en el presente documento, opcionalmente marcados, tambien pueden fijarse a una fase solida, por ejemplo la superficie de un pocillo de inmunoensayo o tira reactiva. Tales polipeptidos marcados y/o inmovilizados pueden envasarse en kits en un recipiente adecuado junto con reactivos, controles, instrucciones adecuados y similares. Tales polipeptidos y kits pueden usarse en metodos para la deteccion de anticuerpos frente a los polipeptidos o sus variantes alelicas

o de especie mediante inmunoensayo.

Se conocen bien en la tecnica metodos de inmunoensayo y comprenderan generalmente: (a) proporcionar un polipeptido que comprende un epftopo al que puede unirse un anticuerpo contra dicha protefna; (b) incubar una muestra biologica con dicho polipeptido en condiciones que permiten la formacion de un complejo antfgenoanticuerpo; y (c) determinar si se forma el complejo antfgenoanticuerpo que comprende dicho polipeptido.

Los polipeptidos de rSPD(n/CRD), variantes, homologos, fragmentos y derivados dados a conocer en el presente documento pueden usarse en sistemas de cultivo celular in vitro o in vivo para estudiar el papel de sus correspondientes genes y homologos de los mismos en la funcion celular, incluyendo su funcion en la enfermedad. Por ejemplo, pueden introducirse polipeptidos truncados o modificados en una celula para alterar las funciones normales que se producen en la celula. Los polipeptidos pueden introducirse en la celula mediante expresion in situ del polipeptido a partir de un vector de expresion recombinante (vease a continuacion). El vector de expresion porta opcionalmente un promotor inducible para controlar la expresion del polipeptido.

Se espera que el uso de celulas huesped apropiadas, tales como celulas de insecto o celulas de mamffero, proporcione modificaciones postraduccionales (por ejemplo miristoilacion, glicosilacion, truncamiento, lapidacion y fosforilacion de tirosinas, serinas o treoninas) tal como pueden necesitarse para conferir una actividad biologica optima sobre productos de expresion recombinante. Tales sistemas de cultivo celular en los que se expresan los polipeptidos de rSPD(n/CRD), variantes, homologos, fragmentos y derivados dados a conocer en el presente documento pueden usarse en sistemas de ensayo para identificar sustancias candidatas que interfieren con o potencian las funciones de los polipeptidos en la celula.

Acidos nucleicos de protefna tensioactiva D recombinante RSPD(N/CRD)

Se da a conocer en el presente documento un acido nucleico que codifica para un polipeptido de rSPD(n/CRD), que se denomina quot;acido nucleico de rSPD(n/CRD)quot;. Se dan a conocer en el presente documento acidos nucleicos que codifican para variantes, homologos, derivados y fragmentos de rSPD (n/CRD), asf como fragmentos, homologos, derivados y variantes de acidos nucleicos de rSPD(n/CRD).

Preferiblemente, el acido nucleico de rSPD(n/CRD) se deriva de una secuencia de SPD natural, por ejemplo, la secuencia de SPD humana mostrada en SEQ 1D NO: 3. Mas preferiblemente, el acido nucleico de rSPD(n/CRD) carece de una secuencia que codifica para el dominio Nterminal y/o el dominio de colageno, preferiblemente ambos. En una realizacion preferida, el acido nucleico de rSPD(n/CRD) es un fragmento recombinante de SPD, preferiblemente SPD humana representada en SEQ 1D NO: 3, que carece sustancialmente de los residuos 1594, o cualquier fragmento, homologo, variante o derivado de la misma. En una realizacion preferida adicional, el acido nucleico de rSPD(n/CRD) es un fragmento recombinante de SPD, preferiblemente la secuencia de SPD humana mostrada en SEQ 1D NO: 3, que comprende sustancialmente los residuos 5951128. Tambien se incluyen fragmentos, homologos, variantes y derivados de cada una de las secuencias anteriores.

En una realizacion preferida, se reemplaza un triplete que codifica para el residuo de prolina correspondiente a la posicion 200 de la secuencia de SPD humana (SEQ 1D NO: 4) por un codon que codifica para otro residuo. Preferiblemente, el residuo de prolina se reemplaza por un residuo polar no cargado, por ejemplo, un residuo de cistefna, serina, treonina o metionina. En una realizacion altamente preferida, el residuo de prolina se reemplaza por un residuo de serina. Por tanto, preferiblemente, el acido nucleico de rSPD(n/CRD) puede comprender un codon que codifica para una serina en la posicion 598 a 560 de la secuencia de SPD humana mostrada en SEQ 1D NO: 3. Por tanto, un codon de reemplazo de este tipo puede incluir AGC, AGT, TCA, TCC, TCG y TCT. Lo mas preferiblemente, el codon de reemplazo comprende AGC.

Preferiblemente, un acido nucleico de rSPD(n/CRD) de este tipo codifica para el polipeptido de rSPD(n/CRD) que tiene la secuencia mostrada en SEQ 1D NO: 1. Un acido nucleico de rSPD(n/CRD) comprende preferiblemente, mas preferiblemente consiste en, una secuencia tal como se expone en SEQ 1D NO: 2.

Tal como se usa en este caso en este documento, los terminos quot;polinucleotidoquot;, quot;nucleotidoquot; y acido nucleico pretenden ser sinonimos entre sf. quot;Polinucleotidoquot; se refiere generalmente a cualquier polirribonucleotido o polidesoxirribonucleotido, que puede ser ADN o ARN no modificado o ADN o ARN modificado. Los quot;polinucleotidosquot; incluyen, sin limitacion, ADN mono y bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones mono y bicatenarias, ARN mono y bicatenario y ARN que es una mezcla de regiones mono y bicatenarias, moleculas hfbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarios o, mas normalmente bicatenarios o una mezcla de regiones mono y bicatenarias. Ademas, quot;polinucleotidoquot; se refiere a regiones tricatenarias que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. El termino polinucleotido tambien incluye ADN o ARN que contienen una o mas bases modificadas y ADN o ARN con estructuras principales modificadas por motivos de estabilidad u otros. Las bases quot;modificadasquot; incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases poco comunes tales como inosina. Se han hecho una variedad de modificaciones al ADN y ARN; por tanto, quot;polinucleotidoquot; abarca formas qufmica, enzimatica o metabolicamente modificadas de polinucleotidos tal como se encuentran normalmente en la naturaleza, asf como las formas qufmicas de ADN y ARN caracterfsticas de virus y celulas. quot;Polinucleotidoquot; tambien abarca polinucleotidos relativamente cortos, a menudo denominados oligonucleotidos.

Un experto entendera que numerosos polinucleotidos y acidos nucleicos diferentes pueden codificar para el mismo polipeptido como resultado de la degeneracion del codigo genetico. Ademas, debe entenderse que los expertos, usando tecnicas de rutina, pueden realizar sustituciones de nucleotidos que no afectan a la secuencia polipeptfdica codificada por los polinucleotidos descritos en el presente documento reflejando el uso de codones de cualquier organismo huesped particular en el que van a expresarse los polipeptidos.

Acidos nucleicos de rSPD(n/CRD), variantes, fragmentos, derivados y homologos pueden comprender ADN o ARN. Pueden ser mono o bicatenarios. Tambien pueden ser polinucleotidos que incluyen dentro de los mismos nucleotidos sinteticos o modificados. Se conocen en la tecnica varios tipos diferentes de modificacion en oligonucleotidos. Estos incluyen estructuras principales de fosfonato de metilo y fosforotioato, ademas de cadenas de acridina o polilisina en los extremos 3' y/o 5' de la molecula. Para los fines de este documento, debe entenderse que los polinucleotidos pueden modificarse mediante cualquier metodo disponible en la tecnica. Tales modificaciones pueden llevarse a cabo con el fin de potenciar la actividad in vivo o vida util de polinucleotidos de interes.

Los terminos quot;variantequot;, quot;homologoquot; o quot;derivadoquot; en relacion a una secuencia de nucleotidos incluyen cualquier sustitucion de, variacion de, modificacion de, reemplazo de, delecion de o adicion de un (o mas) acido nucleico de o a la secuencia. Preferiblemente, dicha variante, homologos o derivados codifican para un polipeptido que tiene actividad biologica.

Tal como se indico anteriormente, con respecto a la homologfa de secuencia, preferiblemente hay al menos el 50 o el 75%, mas preferiblemente al menos el 85%, mas preferiblemente al menos el 90% de homologfa con las secuencias mostradas en la lista de secuencias en el presente documento. Mas preferiblemente, hay al menos el 95%, mas preferiblemente al menos el 98% de homologfa. Pueden realizarse comparaciones de homologfa de nucleotidos tal como se describio anteriormente. Un programa de comparacion de secuencias preferido es el programa GCG Wisconsin Bestfit descrito anteriormente. La matriz de puntuacion por defecto tiene un valor de coincidencia de 10 para cada nucleotido identico y de 9 para cada apareamiento erroneo. La penalizacion por creacion de huecos por defecto es de 50 y la penalizacion por extension de huecos por defecto es de 3 para cada nucleotido.

Se describen ademas secuencias de nucleotidos que pueden hibridarse selectivamente con las secuencias presentadas en el presente documento, o cualquier variante, fragmento o derivado de las mismas, o con el complemento de cualquiera de las anteriores. Las secuencias de nucleotidos tienen preferiblemente al menos 15 nucleotidos de longitud, mas preferiblemente al menos 20, 30, 40 o 50 nucleotidos de longitud.

El termino quot;hibridacionquot; tal como se usa en el presente documento incluira quot;el proceso mediante el cual una hebra de acido nucleico se une con una hebra complementaria a traves de apareamiento de basesquot; asf como el proceso de amplificacion tal como se lleva a cabo en tecnologfas de reaccion en cadena de la polimerasa.

Los polinucleotidos que pueden hibridarse selectivamente con las secuencias de nucleotidos presentadas en el presente documento, o con su complemento, seran

generalmente al menos el 70%, preferiblemente al menos el 80 o el 90% y mas preferiblemente al menos el 95% o el 98% homologas a las secuencias de nucleotidos correspondientes presentadas en el presente documento a lo largo de una region de al menos 20, preferiblemente al menos 25 o 30, por ejemplo al menos 40, 60 o 100 o mas nucleotidos contiguos.

La expresion quot;que puede hibridarse selectivamentequot; significa que el polinucleotido usado como sonda se usa en condiciones en las que se encuentra que un polinucleotido diana se hibrida con la sonda a un nivel significativamente por encima del fondo. La hibridacion de fondo puede producirse debido a otros polinucleotidos presentes, por ejemplo, en la biblioteca de ADNc o ADN genomico que esta examinandose. En este caso, el fondo implica un nivel de sefal generada por la interaccion entre la sonda y un miembro de ADN no especffico de la biblioteca que es menos de 10 veces, preferiblemente menos de 100 veces tan intensa como la interaccion especffica observada con el ADN diana. La intensidad de la interaccion puede medirse, por ejemplo, mediante radiomarcaje de la sonda, por ejemplo, con32P.

Las condiciones de hibridacion se basan en la temperatura de fusion (Tm) del complejo de union a acido nucleico, tal como se ensefa en Berger y Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, vol. 152, Academic Press, San Diego CA), y confieren una quot;rigurosidadquot; definida tal como se explica a continuacion.

La rigurosidad maxima se produce normalmente a aproximadamente Tm5°C (5°C por debajo de la Tm de la sonda); alta rigurosidad a de aproximadamente 5°C a 10°C por debajo de Tm; rigurosidad intermedia a de aproximadamente 10°C a 20°C por debajo de Tm; y baja rigurosidad a de aproximadamente 20°C a 25°C por debajo de Tm. Tal como entenderan los expertos en la tecnica, puede usarse una hibridacion de rigurosidad maxima para identificar o detectar secuencias polinucleotfdicas identicas mientras que puede usarse una hibridacion de rigurosidad intermedia (o baja) para identificar o detectar secuencias polinucleotfdicas similares o relacionadas.

En un aspecto preferido, se dan a conocer en el presente documento secuencias de nucleotidos que pueden hibridarse con los acidos nucleicos de rSPD(n/CRD), fragmentos, variantes, homologos o derivados en condiciones rigurosas (por ejemplo 65°C y 0,1xSSC {1xSSC = NaCl 0,15 M, citrato de Na3 0,015 M pH 7,0).

Cuando el polinucleotido es bicatenario, ambas hebras del duplex, o bien individualmente o bien en combinacion, se abarcan por los metodos y las composiciones descritos en el presente documento. Cuando el polinucleotido es monocatenario, debe entenderse que tambien se incluye la secuencia complementaria de ese polinucleotido.

Pueden obtenerse de varios modos polinucleotidos que no son el 100% homologos a las secuencias dadas a conocer en el presente documento pero que tambien se incluyen. Pueden obtenerse otras variantes de las secuencias por ejemplo estudiando con sonda bibliotecas de ADN preparadas a partir de una gama de individuos, por ejemplo individuos de diferentes poblaciones. Por ejemplo, pueden identificarse homologos de SPD a partir de otros individuos, u otras especies. Pueden producirse acidos nucleicos y polipeptidos de SPD recombinantes adicionales identificando posiciones correspondientes en los homologos, y sinteti

zando o produciendo la molecula tal como se describe en otra parte en este documento. Ademas, puede identificarse la region de colageno, la region de cuello y el dominio de union a hidratos de carbono en tales homologos por ejemplo mediante observacion de secuencias o comparaciones asistidas por ordenador, y seleccionarse para su combinacion en o produccion de una SPD recombinante que no es humana, pero que tiene una o mas actividades biologicas de rSPD(n/CRD)

Ademas, pueden obtenerse otros homologos virales/bacterianos o celulares de SPD, particularmente homologos celulares encontrados en celulas de mamffero (por ejemplo celulas de rata, raton, bovinas y de primate), y tales homologos y fragmentos de los mismos podran en general hibridarse selectivamente con SPD humana. Tales homologos pueden usarse para disefar acidos nucleicos de rSPD(n/CRD) no humanos, fragmentos, variantes y homologos. Puede llevarse a cabo mutagenesis por medios conocidos en la tecnica para producir variedad adicional.

Pueden obtenerse secuencias de homologos de SPD estudiando con sonda bibliotecas de ADNc preparadas a partir de bibliotecas de ADN genomico de otras especies animales, y estudiando con sonda tales bibliotecas con sondas que comprenden todo o parte de cualquiera de los acidos nucleicos de rSPD(n/CRD), fragmentos, variantes y homologos, u otros fragmentos de SPD en condiciones de rigurosidad de media a alta.

Se aplican consideraciones similares a la obtencion de homologos de especie y variantes alelicas de las secuencias de nucleotidos o polipeptfdicas dadas a conocer en el presente documento.

Tambien pueden obtenerse variantes y homologos de cepa/especie usando PCR degenerada que usara cebadores disefados para seleccionar como diana secuencias dentro de las variantes y los homologos que codifican para secuencias de aminoacidos conservadas dentro de las secuencias de los acidos nucleicos de rSPD(n/CRD). Pueden pronosticarse secuencias conservadas, por ejemplo, alineando las secuencias de aminoacidos de varias variantes/homologos. Pueden realizarse alineaciones de secuencias usando software informatico conocido en la tecnica. Por ejemplo, se usa ampliamente el programa GCG Wisconsin PileUp.

Los cebadores usados en la PCR degenerada contendran una o mas posiciones degeneradas y se usaran en condiciones de rigurosidad inferiores a las usadas para clonar secuencias con cebadores de secuencia unica contra secuencias conocidas. Se apreciara por el experto que la homologfa de nucleotidos global entre secuencias de organismos relacionados de manera distante es probable que sea muy baja y por tanto en estas situaciones la PCR degenerada puede ser el metodo de eleccion en vez de examinar bibliotecas con fragmentos marcados de las secuencias de rSPD(n/CRD).

Ademas, pueden identificarse secuencias homologas buscando en bases de datos de nucleotidos y/o protefnas usando algoritmos de busqueda tales como el juego BLAST de programas.

Alternativamente, tales polinucleotidos pueden obtenerse mediante mutagenesis dirigida al sitio de secuencias caracterizadas, por ejemplo, acidos nucleicos de rSPD(n/CRD), o variantes, homologos, derivados o fragmentos de los mismos. Esto puede ser util cuando por ejemplo se requieren cambios de codones silen

ciosos en secuencias para optimizar las preferencias de codones para una celula huesped particular en las que las secuencias polinucleotfdicas estan expresandose. Pueden desearse otros cambios de secuencias con el fin de introducir sitios de reconocimiento de enzimas de restriccion o para alterar la propiedad o funcion de los polipeptidos codificados por los polinucleotidos.

Los polinucleotidos descritos en el presente documento pueden usarse para producir un cebador, por ejemplo, un cebador de PCR, un cebador para una reaccion de amplificacion alternativa, una sonda por ejemplo marcada con un marcador de revelado por medios convencionales usando marcadores radiactivos o no radiactivos, o los polinucleotidos pueden clonarse en vectores. Tales cebadores, sondas y otros fragmentos tendran al menos 8, 9, 10 o 15, preferiblemente al menos 20, por ejemplo al menos 25, 30 o 40 nucleotidos de longitud, y tambien se abarcan por el termino quot;polinucleotidosquot; tal como se usa en el presente documento.

Pueden producirse polinucleotidos tales como sondas y polinucleotidos de ADN de manera recombinante, sintetica, o por cualquier medio disponible para los expertos en la tecnica. Tambien pueden clonarse mediante tecnicas convencionales.

En general, se produciran cebadores por medios sinteticos, que implican una fabricacion por etapas de la secuencia de acido nucleico deseada un nucleotido cada vez. Estan facilmente disponibles en la tecnica tecnicas para lograr esto usando tecnicas automatizadas.

Se produciran generalmente polinucleotidos mas largos usando medios recombinantes, por ejemplo usando tecnicas de clonacion de PCR (reaccion en cadena de la polimerasa). Esto implicara preparar un par de cebadores (por ejemplo de aproximadamente 15 a 30 nucleotidos) que flanquean una region de la secuencia objetivo de lfpido que se desea clonar, poner los cebadores en contacto con ARNm o ADNc obtenido de una celula animal o humana, realizar una reaccion en cadena de la polimerasa en condiciones que ocasionan la amplificacion de la region deseada, aislar el fragmento amplificado (por ejemplo purificando la mezcla de reaccion en un gel de agarosa) y recuperar el ADN amplificado. Los cebadores pueden disefarse para que contengan sitios de reconocimiento de enzimas de restriccion adecuados de modo que el ADN amplificado pueda clonarse en un vector de clonacion adecuado.

Los polinucleotidos o cebadores pueden llevar un marcador de revelado. Los marcadores adecuados incluyen radioisotopos tales como 32P o 35S, marcadores enzimaticos u otros marcadores proteicos tales como biotina. Tales marcadores pueden afadirse a polinucleotidos o cebadores y pueden detectarse usando tecnicas conocidas per se. Pueden usarse polinucleotidos o cebadores o fragmentos de los mismos marcados o no marcados por un experto en la tecnica en pruebas basadas en acidos nucleicos para detectar o secuenciar polinucleotidos en el cuerpo humano o animal.

Tales pruebas para detectar comprenden generalmente poner en contacto una muestra biologica que contiene ADN o ARN con una sonda que comprende un polinucleotido o cebador en condiciones de hibridacion y detectar cualquier duplex formado entre la sonda y el acido nucleico en la muestra. Tal deteccion puede lograrse usando tecnicas tales como PCR o inmovilizando la sonda sobre un soporte solido, eliminando el acido nucleico en la muestra que no se hibrida con la sonda y luego detectando el acido nucleico que se ha hibridado con la sonda. Alterna

tivamente, el acido nucleico de muestra puede inmovilizarse sobre un soporte solido, y puede detectarse la cantidad de sonda unida a un soporte de este tipo. Pueden encontrarse metodos de ensayo adecuados de este y otros formatos en por ejemplo los documentos WO89/03891 y WO90/13667.

Las pruebas para secuenciar nucleotidos, por ejemplo, los acidos nucleicos de rSPD(n/CRD), implican poner en contacto una muestra biologica que contiene ARN o ADN diana con una sonda que comprende un polinucleotido o cebador en condiciones de hibridacion y determinar la secuencia mediante, por ejemplo, el metodo de terminacion de la cadena de didesoxi de Sanger (vease Sambrook et al.).

Un metodo de este tipo comprende generalmente alargar, en presencia de reactivos adecuados, el cebador mediante sfntesis de una hebra complementaria al ARN o ADN diana y terminar selectivamente la reaccion de alargamiento en uno o mas de un residuo de A, C, G o T/U; dejar que se produzca la reaccion de alargamiento de la hebra y de terminacion; separar segun el tamafo los productos alargados y determinar la secuencia de los nucleotidos en los que se ha producido terminacion selectiva. Los reactivos adecuados incluyen una enzima ADN polimerasa, los desoxinucleotidos dATP, dCTP, dGTP y dTTP, un tampon y ATP. Se usan didesoxinucleotidos para la terminacion selectiva.

Vectores de acido nucleico

Pueden incorporarse polinucleotidos, por ejemplo los descritos en el presente documento, en un vector replicable recombinante. El vector puede usarse para replicar el acido nucleico en una celula huesped compatible. Por tanto, en una realizacion adicional, se proporciona un metodo de preparacion de polinucleotidos introduciendo un polinucleotido en un vector replicable, introduciendo el vector en una celula huesped compatible y haciendo crecer la celula huesped en condiciones que ocasionan la replicacion del vector. El vector puede recuperarse de la celula huesped. Las celulas huesped adecuadas incluyen bacterias tales como E. coli, levaduras, lfneas celulares de mamfferos y otras lfneas celulares eucariotas, por ejemplo celulas de insecto Sf9.

Preferiblemente, un polinucleotido en un vector esta operativamente unido a una secuencia de control que puede proporcionar la expresion de la secuencia codificante por la celula huesped, es decir, el vector es un vector de expresion. La expresion quot;operativamente unidoquot; significa que los componentes descritos estan en una relacion que les permite funcionar de su manera prevista. Una secuencia reguladora quot;operativamente unidaquot; a una secuencia codificante esta ligada de tal forma que se logra la expresion de la secuencia codificante en una condicion compatible con las secuencias de control.

Las secuencias de control pueden modificarse, por ejemplo, mediante la adicion de elementos reguladores de la transcripcion adicionales para hacer que el nivel de transcripcion dirigido por las secuencias de control sea mas sensible a los moduladores de la transcripcion.

Pueden transformarse o transfectarse vectores en una celula huesped adecuada tal como se describe a continuacion para proporcionar la expresion de una protefna. Este proceso puede comprender cultivar una celula huesped transformada

con un vector de expresion tal como se describio anteriormente en condiciones para proporcionar la expresion por el vector de una secuencia codificante que codifica para la protefna, y recuperar opcionalmente la protefna expresada. Se elegiran vectores que son compatibles con la celula huesped usada.

Los vectores pueden ser por ejemplo vectores de plasmidos o virus dotados de un origen de replicacion, opcionalmente un promotor para la expresion de dicho polinucleotido y opcionalmente un regulador del promotor. Los vectores pueden contener uno o mas genes marcadores seleccionables, por ejemplo un gen de resistencia a ampicilina en el caso de un plasmido bacteriano o un gen de resistencia a neomicina para un vector de mamffero. Pueden usarse vectores, por ejemplo, para transfectar o transformar una celula huesped.

Las secuencias de control operativamente unidas a secuencias que codifican para el polipeptido incluyen promotores/potenciadores y otras sefales de regulacion de la expresion. Estas secuencias de control pueden seleccionarse para que sean compatibles con la celula huesped para la que esta disefado el vector de expresion que va a usarse en la misma. El termino promotor se conoce bien en la tecnica y abarca regiones de acido nucleico que oscilan en tamafo y complejidad desde promotores mfnimos hasta promotores que incluyen potenciadores y elementos en el sentido de 5'.

El promotor se selecciona normalmente de promotores que son funcionales en celulas de mamffero, aunque pueden usarse promotores procarioticos y promotores funcionales en otras celulas eucariotas, tales como celulas de insecto. El promotor se deriva normalmente de secuencias promotoras de genes virales o eucariotas. Por ejemplo, puede ser un promotor derivado del genoma de una celula en la que va a producirse expresion. Con respecto a promotores eucariotas, pueden ser promotores que funcionan de una manera ubicua (tales como promotores de actina , actina , tubulina) o, alternativamente, de una manera especffica de tejido (tales como promotores de los genes para piruvato cinasa). Tambien pueden ser promotores que responden a estfmulos especfficos, por ejemplo promotores que se unen a receptores de hormonas esteroideas. Tambien pueden usarse promotores virales, por ejemplo el promotor de repeticion terminal larga del virus de la leucemia murina de Moloney (LTR de MMLV), el promotor de LTR del virus del sarcoma de Rous (VSR) o el promotor 1E de citomegalovirus humano (CMV).

Tambien puede ser ventajoso que los promotores sean inducibles de modo que los niveles de expresion de los genes heterologos puedan regularse durante el tiempo de vida de la celula. 1nducible significa que los niveles de expresion obtenidos usando el promotor pueden regularse.

Ademas, cualquiera de estos promotores puede modificarse mediante la adicion de secuencias reguladoras adicionales, por ejemplo secuencias potenciadoras. Tambien pueden usarse promotores quimericos que comprenden elementos de secuencia de dos o mas promotores diferentes descritos anteriormente.

Tambien pueden insertarse polinucleotidos en los vectores descritos anteriormente en una orientacion antisentido para proporcionar la produccion de ARN antisentido. Tambien pueden producirse ARN antisentido u otros polinucleotidos antisentido por medios sinteticos. Tales polinucleotidos antisentido pueden usarse en un metodo de control de los niveles de ARN transcritos a partir de genes que com

prenden uno cualquiera de los polinucleotidos descritos en el presente documento.

Celulas huesped

Pueden introducirse vectores y polinucleotidos que comprenden o que codifican para acidos nucleicos de rSPD(n/CRD), fragmentos, homologos, variantes o derivados de los mismos en celulas huesped para el fin de replicar los vectores/polinucleotidos y/o expresar los polipeptidos codificados por los polinucleotidos. Aunque los polipeptidos pueden producirse usando celulas procariotas como celulas huesped, se prefiere usar celulas eucariotas, por ejemplo celulas de levadura, insecto o mamffero, en particular celulas de mamffero.

Pueden introducirse vectores/polinucleotidos en celulas huesped adecuadas usando una variedad de tecnicas conocidas en la tecnica, tales como transfeccion, transformacion y electroporacion. Cuando van a administrarse vectores/polinucleotidos a animales, se conocen en la tecnica varias tecnicas, por ejemplo infeccion con vectores virales recombinantes tales como retrovirus, virus del herpes simple y adenovirus, inyeccion directa de acidos nucleicos y transformacion biolfstica.

Expresion y purificacion de protefnas

Pueden usarse celulas huesped que comprenden polinucleotidos para expresar polipeptidos, tales como polipeptidos de rSPD(n/CRD), fragmentos, homologos, variantes o derivados de los mismos. Pueden cultivarse celulas huesped en condiciones adecuadas que permiten la expresion de las protefnas. La expresion de los polipeptidos puede ser constitutiva de manera que se produzcan de manera continua, o inducible, requiriendo un estfmulo para iniciar la expresion. En el caso de expresion inducible, la produccion de protefna puede iniciarse cuando se requiera mediante, por ejemplo, la adicion de una sustancia inductora al medio de cultivo, por ejemplo dexametasona o 1PTG.

Pueden extraerse los polipeptidos de las celulas huesped mediante una variedad de tecnicas conocidas en la tecnica, incluyendo lisis enzimatica, qufmica y/o osmotica y alteracion ffsica.

Tambien pueden producirse los polipeptidos de manera recombinante en un sistema libre de celulas in vitro, tal como el sistema de reticulocitos de conejo TnT™ (Promega).

Anticuerpos

Se dan a conocer en el presente documento anticuerpos monoclonales o policlonales frente a polipeptidos o fragmentos de los mismos. Por tanto, se da a conocer en el presente documento un procedimiento para la produccion de anticuerpos monoclonales o policlonales frente a un polipeptido de rSPD(n/CRD), fragmento, homologo, variante o derivado del mismo.

Si se desean anticuerpos policlonales, se inmuniza un mamffero seleccionado (por ejemplo, raton, conejo, cabra, caballo, etc.) con un polipeptido inmunogenico que lleva un(os) epftopo(s) de un polipeptido. Se recoge suero del animal inmunizado y se trata segun procedimientos conocidos. Si el suero que contiene anticuerpos policlonales frente a un epftopo de un polinucleotido contiene anticuerpos frente a otros antfgenos, los anticuerpos policlonales pueden purificarse mediante cromatograffa de inmunoafinidad. Se conocen en la tecnica tecnicas para producir y procesar antisueros policlonales. Con el fin de que puedan prepararse tales anticuerpos, se dan a conocer en el presente documento polipeptidos o fragmentos de los mismos haptenizados con otro polipeptido para su uso como inmunogenos en animales o seres humanos.

Un experto en la tecnica puede producir tambien facilmente anticuerpos monoclonales dirigidos contra epftopos en los polipeptidos. La metodologfa general para preparar anticuerpos monoclonales mediante hibridomas se conoce bien. Pueden crearse celulas inmortales que producen anticuerpos mediante fusion celular, y tambien mediante otras tecnicas tales como transformacion directa de linfocitos B con ADN oncogenico, o transfeccion con virus de EpsteinBarr. Pueden examinarse paneles de anticuerpos monoclonales producidos contra epftopos en los polipeptidos para determinar diversas propiedades; es decir, para determinar la afinidad de isotipo y epftopo.

Una tecnica alternativa implica examinar bibliotecas de presentacion en fago en las que, por ejemplo, el fago expresa fragmentos scFv en la superficie de su cubierta con una gran variedad de regiones determinantes de complementariedad (CDR). Esta tecnica se conoce bien en la tecnica.

Anticuerpos, tanto monoclonales como policlonales, que se dirigen contra epftopos de polipeptidos son particularmente utiles en diagnostico, y los que son neutralizantes son utiles en inmunoterapia pasiva. Pueden usarse anticuerpos monoclonales, en particular, para generar anticuerpos antiidiotipo. Los anticuerpos antiidiotipo son inmunoglobulinas que portan una quot;imagen internaquot; del antfgeno del agente contra el que se desea proteccion.

Se conocen en la tecnica tecnicas para generar anticuerpos antiidiotipo. Estos anticuerpos antiidiotipo tambien pueden ser utiles en terapia.

Para los fines de esta invencion, el termino quot;anticuerpoquot;, a menos que se especifique lo contrario, incluye fragmentos de anticuerpos completos que conservan su actividad de union para un antfgeno diana. Tales fragmentos incluyen fragmentos Fv, F(ab') y F(ab')2, asf como anticuerpos de cadena sencilla (scFv). Ademas, los anticuerpos y fragmentos de los mismos pueden ser anticuerpos humanizados, por ejemplo tal como se describe en el documento EPA239400.

Pueden usarse anticuerpos en un metodo de deteccion de polipeptidos presentes en muestras biologicas mediante un metodo que comprende: (a) proporcionar un anticuerpo; (b) incubar una muestra biologica con dicho anticuerpo en condiciones que permiten la formacion de un complejo antfgenoanticuerpo; y (c) determinar si se forma el complejo antfgenoanticuerpo que comprende dicho anticuerpo.

Las muestras adecuadas incluyen extractos de tejidos tales como tejidos de cerebro, mama, ovario, pulmon, colon, pancreas, testfculos, hfgado, musculo y hueso

o de crecimientos neoplasicos derivados de tales tejidos.

Pueden unirse anticuerpos a un soporte solido y/o envasarse en kits en un recipiente adecuado junto con reactivos, controles, instrucciones adecuados y similares.

Ensayos

Se dan a conocer ensayos que son adecuados para identificar sustancias que se unen a polipeptidos de rSPD(n/CRD), o fragmentos, homologos, variantes o derivados de los mismos.

En general, tales ensayos de union implican exponer un polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD) o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo a una molecula candidata y detectar una interaccion o union entre el polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD) o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo y la molecula candidata. El ensayo de union puede realizarse in vitro o in vivo.

Se dan a conocer ensayos para identificar sustancias que pueden potenciar las actividades del polipeptido de rSPD(n/CRD). Tales compuestos pueden emplearse como agonistas del polipeptido de rSPD(n/CRD), y por ejemplo pueden administrarse conjuntamente a un individuo para potenciar cualquier efecto deseado.

En general, un ensayo para identificar tales sustancias o compuestos implica proporcionar una celula u organismo, exponer la celula u organismo a un polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD) o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo, exponer la celula a una molecula candidata y detectar un efecto asociado con rSPD(n/CRD). Puede detectarse cualquier efecto mediado por polipeptidos de rSPD(n/CRD), tal como se da a conocer en este documento, particularmente los ejemplos.

En particular, el efecto mediado por polipeptidos de rSPD(n/CRD) se elige preferiblemente del grupo que consiste en: reduccion de la eosinofilia de sangre periferica, reduccion de los niveles de 1gE sericos, reduccion de los niveles de 1gG1 sericos, reduccion de la hiperreactividad de las vfas respiratorias, reduccion del numero de macrofagos alveolares, reduccion de los niveles de fosfolfpidos en lavado, regulacion por disminucion de la expresion de eotaxina, reduccion de la ex presion de MCP1, regulacion por disminucion de la expresion de M1P1 y regulacion por disminucion de la expresion de M1P2. Con el fin de identificar agonistas, se detecta un efecto aditivo o preferiblemente sinergico. Por tanto, aunque el polipeptido de rSPD(n/CRD) solo, por ejemplo, puede reducir el nivel o numero, o regular por disminucion la expresion de una molecula, los ensayos identifican moleculas que reducen adicionalmente el nivel, numero o regulan por disminucion adicionalmente la expresion de una molecula. Por tanto, preferiblemente, la molecula candidata conjuntamente con el polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD) o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo, regula por disminucion la expresion de, o reduce el nivel o numero, en mas del 10%, mas del 20%, mas del 30%, mas del 40%, mas del 50%, mas del 60%, mas del 70%, mas del 80%, mas del 90% o mas en comparacion con el polipeptido de rSPD(n/CRD) solo. Por tanto, por ejemplo, una molecula candidata adecuada para su uso como agonista es una que puede potenciar en un 10% mas la reduccion del numero de macrofagos alveolares lograda por el polipeptido de rSPD(n/CRD) solo.

A la inversa, los ensayos para identificar antagonistas implican la deteccion de una reduccion en el efecto mediado por polipeptidos de rSPD(n/CRD). Preferiblemente, la regulacion por disminucion de la expresion o la reduccion del numero o nivel logrado por el polipeptido de rSPD(n/CRD) se reduce en presencia de una molecula candidata adecuada. Preferiblemente, la reduccion es de al menos el 10%, preferiblemente al menos el 20%, preferiblemente al menos el 30%, preferiblemente al menos el 40%, preferiblemente al menos el 50%, preferiblemente al menos el 60%, preferiblemente al menos el 70%, preferiblemente al menos el 80%, preferiblemente al menos el 90% o mas en comparacion con un polipeptido de rSPD(n/CRD) solo. Por tanto, por ejemplo, una molecula candidata adecuada para su uso como antagonista es una que puede reducir en un 10% mas la reduccion del numero de macrofagos alveolares lograda por el polipeptido de rSPD(n/CRD) solo.

Como ilustracion, si N1 es el numero de macrofagos alveolares en un organismo no tratado, y N2 el numero en un organismo expuesto a polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD) o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo, el numero de macrofagos alveolares disminuye en R = (N1N2)/N1 x 100%. Los agonistas aumentan R, en un factor x, en el que x es mayor de 1 (por ejemplo, x = 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100 etc.); mientras que los antagonistas disminuyen R, en un factor x, en el que x es menor de 1 (por ejemplo, x = 0,9, 0,9, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1 etc.).

Por ejemplo, un organismo puede exponerse a un polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD) o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo y una molecula candidata, y detectarse el nivel de eosinofilos perifericos, o 1gE serica o 1gG1 serica, o cualquier combinacion. Tambien puede detectarse la deteccion de la hiperreactividad de las vfas respiratorias, o numeros de macrofagos alveolares, de un organismo expuesto a un polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD), o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo, junto con una molecula candidata.

Moleculas candidatas preferidas son las que proporcionan un efecto aditivo o sinergico en combinacion con rSPD(n/CRD).

Tambien se dan a conocer ensayos para identificar antagonistas del polipeptido de rSPD(n/CRD). Tales ensayos implican detectar un efecto reducido sobre la exposicion de una celula u organismo a un polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD) o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo conjuntamente con una molecula candidata.

En una realizacion preferida, los ensayos se realizan sobre organismos completos en vez de celulas. Preferiblemente, el organismo es uno que padece una enfermedad tal como se da a conocer en este documento, o presenta uno o mas sfntomas de tal enfermedad. En una realizacion altamente preferida, el organismo es uno que no expresa protefna tensioactiva D. Preferiblemente, un organismo de este tipo comprende un gen de SPD alterado o delecionado. Mas preferiblemente, el organismo es un raton (Mus musculus), preferiblemente un raton deficiente en SPD, preparado tal como se describe en Botas, C., et al., Altered surfactant homeostasis and alveolar type 11 cell morphology in mice lacking surfactant protein

D. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998. 95(20): pags. 1186974.

Moleculas candidatas

Las moleculas candidatas adecuadas para su uso en los ensayos anteriores incluyen peptidos, especialmente de desde aproximadamente 5 hasta 30 o de 10 a 25 aminoacidos de tamafo. Pueden usarse peptidos de paneles de peptidos que comprenden secuencias al azar o secuencias que se han variado de manera sistematica para proporcionar un panel de peptidos diversos de manera maxima.

Las moleculas candidatas adecuadas tambien incluyen productos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales y policlonales, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos quimericos y anticuerpos con injerto de CDR). Ademas, pueden examinarse bibliotecas combinatorias, peptidos y peptidomimeticos, entidades qufmicas definidas, oligonucleotidos y bibliotecas de productos naturales para determinar la actividad. Las moleculas candidatas pueden usarse en un examen inicial en lotes de, por ejemplo, 10 tipos de moleculas por reaccion, y las moleculas de los lotes que muestran potenciacion o reduccion de un efecto mediado por polipeptidos de rSPD(n/CRD) se someten a prueba individualmente.

Bibliotecas

Pueden emplearse bibliotecas de moleculas candidatas, tales como bibliotecas de polipeptidos o acidos nucleicos, en los metodos y composiciones descritos en el presente documento. Tales bibliotecas se exponen a una celula u organismo en presencia de un polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD) o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo, y se detecta un efecto mediado por polipeptidos de rSPD(n/CRD).

Se conocen en la tecnica protocolos de seleccion para aislar miembros deseados de bibliotecas grandes, tal como se tipifica mediante tecnicas de presentacion en fago. Tales sistemas, en los que se presentan diversas secuencias peptfdicas sobre la superficie de bacteriofagos filamentosos (Scott y Smith (1990 citado anteriormente), han demostrado ser utiles para crear bibliotecas de fragmentos de anticuerpo (y las secuencias de nucleotidos que codifican para los mismos) para la seleccion y amplificacion in vitro de fragmentos de anticuerpo especfficos que se unen a un antfgeno diana. Las secuencias de nucleotidos que codifican para las regiones VH y VL se unen a fragmentos genicos que codifican para sefales lfder que las dirigen al espacio periplasmico de E. coli y como resultado se presentan los fragmentos de anticuerpo resultantes sobre la superficie del bacteriofago, normalmente como fusiones con protefnas de la cubierta de bacteriofagos (por ejemplo, p111 o pV111). Alternativamente, se presentan fragmentos de anticuerpo de manera externa sobre capsidas de fago lambda (fagocuerpos). Una ventaja de los sistemas de presentacion basados en fagos es que, debido a que son sistemas biologicos, pueden amplificarse miembros seleccionados de la biblioteca simplemente haciendo crecer el fago que contiene el miembro seleccionado de la biblioteca en celulas bacterianas. Ademas, puesto que la secuencia de nucleotidos que codifica para el miembro de la biblioteca de polipeptidos esta contenido en un vector de fago o fagemido, la secuenciacion, expresion y posterior manipulacion genetica es relativamente sencilla.

Se conocen bien en la tecnica metodos para la construccion de bibliotecas de presentacion de anticuerpos en bacteriofagos y bibliotecas de expresion en fago lambda (McCafferty et al. (1990) citado anteriormente; Kang et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88: 4363; Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624; Lowman et al. (1991) Biochemistry, 30: 10832; Burton et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 88: 10134; Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133; Chang et al. (1991) J. 1mmunol., 147: 3610; Breitling et al. (1991) Gene, 104: 147; Marks et al. (1991) citado anteriormente; Barbas et al. (1992) citado anteriormente; Hawkins y Winter (1992) J. 1mmunol., 22: 867; Marks et al., 1992, J. Biol. Chem., 267: 16007; Lerner et al. (1992) Science, 258: 1313). Tales tecnicas pueden modificarse si es necesario para la expresion generalmente de bibliotecas de polipeptidos.

Un enfoque particularmente ventajoso ha sido el uso de bibliotecas de fagos de scFv (Bird, R.E., et al. (1988) Science 242: 4236, Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 85: 58795883; Chaudhary et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 87: 10661070; McCafferty et al. (1990) citado anteriormente; Clackson et al. (1991) citado anteriormente; Marks et al. (1991) citado anteriormente; Chiswell et al. (1992) Trends Biotech., 10: 80; Marks et al. (1992) citado anteriormente). Se han descrito diversas realizaciones de bibliotecas de scFv presentados sobre protefnas de la cubierta de bacteriofagos. Tambien se conocen refinamientos de los enfoques de presentacion en fago, por ejemplo tal como se describe en los documentos WO96/06213 y WO92/01047 (Medical Research Council et al.) y el documento WO97/08320 (Morphosys, citado anteriormente).

Las tecnologfas alternativas de seleccion de bibliotecas incluyen sistemas de expresion en bacteriofago lambda, que pueden examinarse directamente como placas de bacteriofagos o como colonias de lisogenos, ambos tal como se describio anteriormente (Huse et al. (1989) Science, 246: 1275; Caton y Koprowski (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87; Mullinax et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87: 8095; Persson et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88: 2432) y son de uso en la invencion. Estos sistemas de expresion pueden usarse para examinar un gran numero de diferentes miembros de una biblioteca, del orden de 106 o incluso mas. Otros sistemas de examen se basan, por ejemplo, en la sfntesis qufmica directa de miembros de la biblioteca. Un metodo implica claramente la sfntesis de peptidos sobre un conjunto de clavijas o varillas, tal como se describe en el documento WO84/03564. Se describe un metodo similar que implica sfntesis de peptidos sobre perlas, que forma una biblioteca de peptidos en la que cada perla es un miembro individual de la biblioteca, en la patente estadounidense n.°

4.631.211 y se describe un metodo relacionado en el documento WO92/00091. Una mejora significativa de los metodos basados en perlas implica etiquetar cada perla con una etiqueta identificadora unica, tal como un oligonucleotido, para facilitar la identificacion de la secuencia de aminoacidos de cada miembro de la biblioteca. Estos metodos basados en perlas mejorados se describen en el documento WO93/06121.

Otro metodo de sfntesis qufmica implica la sfntesis de matrices de peptidos (o peptidomimeticos) sobre una superficie de una manera que coloca cada miembro de la biblioteca distinto (por ejemplo, secuencia peptfdica unica) en una ubicacion diferenciada, predefinida en la matriz. La identidad de cada miembro de la biblioteca se determina mediante su ubicacion espacial en la matriz. Se determinan las ubicaciones en la matriz en las que se producen interacciones de union entre una molecula predeterminada (por ejemplo, un receptor) y miembros reactivos de la biblioteca, identificando de ese modo las secuencias de los miembros reactivos de la biblioteca basandose en la ubicacion espacial. Estos metodos se describen en la patente estadounidense n.° 5.143.854; documentos WO90/15070 y WO92/10092; Fodor et al. (1991) Science, 251: 767; Dower y Fodor (1991) Ann. Rep. Med. Chem., 26: 271.

Otros sistemas para generar bibliotecas de polipeptidos o nucleotidos implican el uso de maquinaria enzimatica libre de celulas para la sfntesis in vitro de los miembros de la biblioteca. En un metodo, se seleccionan moleculas de ARN mediante rondas alternas de seleccion frente a un ligando diana y amplificacion por PCR (Tuerk y Gold (1990) Science, 249: 505; Ellington y Szostak (1990) Nature,

346: 818). Puede usarse una tecnica similar para identificar secuencias de ADN que se unen a un factor de transcripcion humano predeterminado (Thiesen y Bach (1990) Nucleic Acids Res., 18: 3203; Beaudry y Joyce (1992) Science, 257: 635; documentos WO92/05258 y WO92/14843). De un modo similar, puede usarse traduccion in vitro para sintetizar polipeptidos como metodo para generar bibliotecas grandes. Estos metodos que comprenden generalmente complejos de polisomas estabilizados se describen adicionalmente en los documentos WO88/08453, WO90/05785, WO90/07003, WO91/02076, WO91/05058, y WO92/02536. Sistemas de presentacion alternativos que no estan basados en fagos, tales como los dados a conocer en el documento WO95/22625 y WO95/11922 (Affymax) usan los polisomas para presentar polipeptidos para su seleccion.

Bibliotecas combinatorias

Las bibliotecas, en particular, bibliotecas de moleculas candidatas, pueden estar adecuadamente en forma de bibliotecas combinatorias (tambien conocidas como bibliotecas qufmicas combinatorias).

Una quot;biblioteca combinatoriaquot;, tal como se usa el termino en este documento, es una coleccion de multiples especies de compuestos qufmicos que consisten en subunidades seleccionadas al azar. Pueden examinarse bibliotecas combinatorias para detectar moleculas que pueden potenciar, aumentar, reducir o minimizar el efecto mediado por polipeptidos de rSPD(n/CRD) cuando se exponen a una celula u organismo.

Actualmente estan disponibles diversas bibliotecas combinatorias de compuestos qufmicos, incluyendo bibliotecas contra enzimas proteolfticas y no proteolfticas, bibliotecas de agonistas y antagonistas de receptores acoplados a protefna G (GPCR), bibliotecas activas contra dianas distintas de GPCR (por ejemplo, integrinas, canales ionicos, interacciones de dominios, receptores nucleares y factores de transcripcion) y bibliotecas de oncologfa de celulas completas y dianas antiinfecciosas, entre otras. Se proporciona una revision exhaustiva de bibliotecas combinatorias, en particular su construccion y usos en Dolle y Nelson (1999), Journal of Combinatorial Chemistry, vol. 1 n.° 4, 235282. Se hace referencia tambien a Combinatorial peptide library protocols (editado por Shmuel Cabilly, Totowa, N.J.: Humana Press, c1998. Methods in Molecular Biology; v. 87).

Las referencias adicionales que describen bibliotecas combinatorias qufmicas, su produccion y uso incluyen las disponibles de la URL http://www.netsci.org/Science/Combichem/, incluyendo The Chemical Generation of Molecular Diversity. Michael R. Pavia, Sphinx Pharmaceuticals, una division de Eli Lilly (publicado en julio de 1995); Combinatorial Chemistry: A Strategy for the Future MDL 1nformation Systems discusses the role its Project Library plays in managing diversity libraries (publicado en julio de 1995); Solid Support Combinatorial Chemistry in Lead Discovery and SAR Optimization, Adnan M. M. Mjalli y Barry E. Toyonaga, Ontogen Corporation (publicado en julio de 1995); NonPeptidic Bradykinin Receptor Antagonists From a Structurally Directed NonPeptide Library. Sarvajit Chakravarty, Babu J. Mavunkel, Robin Andy, Donald J. Kyle*, Scios Nova 1nc. (publicado en julio de 1995); Combinatorial Chemistry Library Design using Pharmacophore Diversity Keith Davies y Clive Briant, Chemical Design Ltd. (publicado en julio de 1995); A Database System for Combinatorial Synthesis Experiments Craig James y David Weininger, Daylight Chemical 1nformation Systems, 1nc. (publicado en julio de 1995); An 1nformation Management Architecture for Combinatorial Chemistry, Keith Davies y Catherine White, Chemical Design Ltd. (publicado en julio de 1995); Novel Software Tools for Addressing Chemical Diversity, R. S. Pearlman, Laboratory for Molecular Graphics and Theoretical Modeling, College of Pharmacy, Universidad de Texas (publicado en junio/julio de 1996); Opportunities for Computational Chemists Afforded by the New Strategies in Drug Discovery: An Opinion, Yvonne Connolly Martin, Computer Assisted Molecular Design Project, Abbott Laboratories (publicado en junio/julio de 1996); Combinatorial Chemistry and Molecular Diversity Course at the University of Louisville: A Description, Arno F. Spatola, Department of Chemistry, Universidad de Louisville (publicado en junio/julio de 1996); Chemically Generated Screening Libraries: Present and Future. Michael R. Pavia, Sphinx Pharmaceuticals, una division de Eli Lilly (publicado en junio/julio de 1996); Chemical Strategies For 1ntroducing Carbohydrate Molecular Diversity 1nto The Drug Discovery Process. Michael J. Sofia, Transcell Technologies 1nc. (publicado en junio/julio de 1996); Data Management for Combinatorial Chemistry. Maryjo Zaborowski, Chiron Corporation y Sheila H. DeWitt, ParkeDavis Pharmaceutical Research, division de WarnerLambert Company (publicado en noviembre de 1995); y The 1mpact of High Throughput Organic Synthesis on R&D in BioBased 1ndustries, John P. Devlin (publicado en marzo de 1996).

Las tecnicas de qufmica combinatoria estan obteniendo una gran aceptacion entre los metodos modernos para la generacion de nuevos compuestos de partida farmaceuticos (Gallop, M. A. et al., 1994, J. Med. Chem. 37:12331251; Gordon, E.

M. et al., 1994, J. Med. Chem. 37:1385401.). Un enfoque combinatorio en uso se basa en una estrategia que implica la sfntesis de bibliotecas que contienen una estructura diferente en cada partfcula del soporte de fase solida, la interaccion de la biblioteca con un receptor soluble, la identificacion de la quot;perlaquot; que interacciona con la diana macromolecular y la determinacion de la estructura portada por la quot;perlaquot; identificada (Lam, K. S. et al., 1991, Nature 354:8284). Una alternativa a este enfoque es la liberacion secuencial de alfcuotas definidas de los compuestos a partir del soporte solido, con posterior determinacion de su actividad en disolucion, identificacion de la partfcula de la que se libero el compuesto activo y dilucidacion de su estructura mediante secuenciacion directa (Salmon, S. E. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1170811712), o leyendo su codigo (Kerr, J.

M. et al., 1993, J. Am. Chem. Soc. 115:25292531; Nikolaiev, V. et al., 1993, Pept.

Res. 6:161170; Ohlmeyer, M. H. J. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1092210926).

Pueden sintetizarse bibliotecas combinatorias aleatorias solubles usando un principio sencillo para la generacion de mezclas equimolares de peptidos que se describio por primera vez por Furka (Furka, A. et al., 1988, Xth 1nternational Symposium on Medicinal Chemistry, Budapest 1988; Furka, A. et al., 1988, 14th 1nternational Congress of Biochemistry, Praga 1988; Furka, A. et al., 1991, 1nt. J. Peptide Protein Res. 37:487493). Tambien se ha descrito la construccion de bibliotecas solubles para el examen iterativo (Houghten, R. A. et al. 1991, Nature 354:8486).

K. S. Lam dio a conocer la tecnica novedosa e inesperadamente poderosa de uso de bibliotecas combinatorias aleatorias insolubles. Lam sintetizo bibliotecas combinatorias aleatorias sobre soportes de fase solida, de modo que cada soporte tenfa un compuesto de prueba de estructura molecular uniforme, y examino las bibliotecas sin eliminacion previa de los compuestos de prueba del soporte mediante protocolos de union de fase solida (Lam, K. S. et al., 1991, Nature 354:8284).

Por tanto, una biblioteca de moleculas candidatas puede ser una biblioteca combinatoria sintetica (por ejemplo, una biblioteca qufmica combinatoria), un extracto celular, un fluido corporal (por ejemplo, orina, sangre, lagrimas, sudor o saliva) u otra mezcla de productos naturales o sinteticos (por ejemplo, una biblioteca de moleculas pequefas o una mezcla de fermentacion).

Una biblioteca de moleculas puede incluir, por ejemplo, aminoacidos, oligopeptidos, polipeptidos, protefnas o fragmentos de peptidos o protefnas; acidos nucleicos (por ejemplo, antisentido; ADN; ARN; o acidos nucleicos peptfdicos, PNA); aptameros; o hidratos de carbono o polisacaridos. Cada miembro de la biblioteca puede ser singular o puede ser una parte de una mezcla (por ejemplo, una biblioteca comprimida). La biblioteca puede contener compuestos purificados o puede ser quot;suciaquot; (es decir, que contiene una cantidad significativa de impurezas). Pueden usarse tambien bibliotecas disponibles comercialmente (por ejemplo, de Affymetrix, ArQule, Neose Technologies, Sarco, Ciddco, Oxford Asymmetry, Maybridge, Aldrich, Panlabs, Pharmacopoeia, Sigma o Tripose) con los metodos descritos en el presente documento.

Ademas de bibliotecas tal como se describieron anteriormente, pueden usarse bibliotecas especiales denominadas archivos de diversidad para evaluar la especificidad, fiabilidad o reproducibilidad de los nuevos metodos. Los archivos de diversidad contienen un gran numero de compuestos (por ejemplo, 1000 o mas moleculas pequefas) representativos de muchas clases de compuestos que podrfan dar como resultado posiblemente deteccion no especffica en un ensayo. Estan disponibles comercialmente archivos de diversidad o pueden ensamblarse tambien a partir de compuestos individuales disponibles comercialmente de los proveedores enumerados anteriormente.

Sustancias candidatas

Las sustancias candidatas adecuadas incluyen peptidos, especialmente de desde aproximadamente 5 hasta 30 o de 10 a 25 aminoacidos de tamafo, basados en la secuencia de los polipeptidos descritos en los ejemplos, o variantes de tales peptidos en los que se han sustituido uno o mas residuos. Pueden usarse pepti

dos de paneles de peptidos que comprenden secuencias al azar o secuencias que se han variado de manera sistematica para proporcionar un panel de peptidos diversos de manera maxima.

Las sustancias candidatas adecuadas tambien incluyen productos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales y policlonales, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos quimericos y anticuerpos con injerto de CDR) que son especfficos para un polipeptido. Ademas, pueden examinarse bibliotecas combinatorias, peptidos y peptidomimeticos, entidades qufmicas definidas, oligonucleotidos y bibliotecas de productos naturales para examinar su actividad como inhibidores de la union de un polipeptido a la maquinaria del ciclo de division celular, por ejemplo el aparato mitotico/meiotico (tales como microtubulos). Pueden usarse las sustancias candidatas en un examen inicial en lotes de, por ejemplo, 10 sustancias por reaccion, y las sustancias de los lotes que muestran inhibicion se someten a prueba individualmente. Entonces, pueden someterse a prueba sustancias candidatas que muestran actividad en examenes in vivo tales como los descritos a continuacion en sistemas de celulas completas, tales como celulas de mamffero que se expondran al inhibidor y se someteran a prueba para detectar la inhibicion de cualquiera de los estadios del ciclo celular.

Ensayos de union a polipeptidos

Un tipo de ensayo para identificar sustancias que se unen a un polipeptido implica poner en contacto un polipeptido, que esta inmovilizado sobre un soporte solido, con una sustancia candidata no inmovilizada determinando si y/o en que grado el polipeptido y la sustancia candidata se unen entre sf. Alternativamente, la sustancia candidata puede estar inmovilizada y el polipeptido no inmovilizado. Esto puede usarse para detectar sustancias que pueden unirse a polipeptidos de rSPD(n/CRD), o fragmentos, homologos, variantes o derivados de los mismos.

En un metodo de ensayo preferido, el polipeptido esta inmovilizado sobre perlas tales como perlas de agarosa. Normalmente, esto se logra expresando el polipeptido de rSPD(n/CRD), o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo como una protefna de fusion con GST en bacterias, levaduras o lfneas celulares eucariotas superiores y purificando la protefna de fusion con GST de extractos celulares brutos usando perlas de glutationagarosa (Smith y Johnson, 1988). Como control, la union de la sustancia candidata, que no es una protefna de fusion con GST, al polipeptido inmovilizado se determina en ausencia del polipeptido. Se determina entonces la union de la sustancia candidata al polipeptido inmovilizado. Este tipo de ensayo se conoce en la tecnica como ensayo de precipitacion de GST. De nuevo, la sustancia candidata puede estar inmovilizada y el polipeptido no inmovilizado.

Tambien es posible realizar este tipo de ensayo usando sistemas de purificacion por afinidad diferentes para inmovilizar uno de los componentes, por ejemplo NiNTA agarosa y componentes etiquetados con histidina.

La union del polipeptido de rSPD(n/CRD), o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo a la sustancia candidata puede determinarse mediante una variedad de metodos bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, el componente no inmovilizado puede estar marcado (con, por ejemplo, un marcador radiactivo, una etiqueta de epftopo o un conjugado de enzimaanticuerpo). Alternativamente, la union puede determinarse mediante tecnicas de deteccion inmunologicas. Por ejemplo, la mezcla de reaccion puede someterse a inmunotransferencia de tipo Western y la inmunotransferencia estudiarse con sonda con un anticuerpo que detecta el componente no inmovilizado. Tambien pueden usarse tecnicas de EL1SA.

Normalmente, se afaden sustancias candidatas a una concentracion final de desde 1 hasta 1000 nmol/ml, mas preferiblemente desde 1 hasta 100 nmol/ml. En el caso de anticuerpos, la concentracion final usada es normalmente de desde 100 hasta 500 g/ml, mas preferiblemente desde 200 hasta 300 g/ml.

Union a ADN

Cuando se libera del entorno nuclear, el acido nucleico tal como ADN puede provocar inflamacion en los tejidos circundantes. Aunque se conocen varias protefnas de union a ADN, las protefnas o los receptores que estan implicados en el aclaramiento del ADN del pulmon y otros tejidos no estan claramente establecidos. Los presentes inventores han descubierto que SPD se une eficazmente a ADN (y ARN total) de origen bacteriano, de bacteriofagos y cromosomico.

La microscopfa electronica muestra que el fragmento recombinante de rSPD(n/CRD) (rSPD(n/CRD)) puede unirse eficazmente al ADN. Aunque sin querer restringirse a la teorfa, los inventores han determinado que los nucleotidos, los bloques de construccion del ADN, pueden competir con el manano por la union a rSPD(n/CRD), lo que sugiere que esta protefna puede unirse al ADN mediante su actividad de union a hidratos de carbono. Ademas, la presencia de un fragmento similar a colageno corto en este fragmento recombinante puede proporcionar tambien una capacidad afadida para que se una al ADN, eficazmente. Ademas, rSPD(n/CRD) compite con el yoduro de propidio por la union del ADN sobre celulas apoptoticas, lo que indica que la protefna se une al ADN que se encuentra sobre la superficie de estas celulas. El reconocimiento del ADN sobre la superficie es probable que sea uno de los modos importantes de aclaramiento de las celulas apoptoticas del pulmon.

Varias aplicaciones para SPD y fragmentos de la misma, especialmente rSPD(n/CRD); estan mediadas por las propiedades de union a ADN de estas moleculas. Por ejemplo:

1) Varias enfermedades, muchas de las cuales implican infeccion bacteriana cronica, fungica y viral dan como resultado la acumulacion de acido nucleico libre en el pulmon. La fibrosis qufstica es una de tales enfermedades, y se produce infeccion persistente en el pulmon solo tras la formacion de biopelfcula bacteriana, que requiere ADN libre extracelular. Puesto que SPD nativa y rSPD(n/CRD) se unen a ADN libre, estas protefnas potencian el aclaramiento de ADN y minimizan la formacion de biopelfcula. La rSPD(n/CRD) tambien opsoniza muchos microbios pulmonares, y actua posiblemente reduciendo o eliminando la colonizacion por patogenos en pacientes con fibrosis qufstica.

2) SPD y rSPD(n/CRD) pueden unirse al ADN. Por tanto, celulas que contienen ADN en sus superficies, tales como celulas apoptoticas y necroticas, tambien se reconocen por SPD y rSPD(n/CRD). Estos hechos proporcionan una explicacion mecanfstica por la que las celulas que provocan inflamacion se reconocen por la rSPD(n/CRD) para el aclaramiento mediado por fagocitos, in vivo. Pueden usarse SPD y fragmentos de la misma para tratar estados y enfermedades pulmonares tales como EPOC, inflamacion cronica y asma cronica.

3) ADN libre o residuos de ADN de celulas necroticas y apoptoticas pueden actuar como autoantfgeno. Por tanto, rSPD(n/CRD), al producir el aclaramiento de ADN libre (o ARN), ayuda en la reduccion de la produccion de autoanticuerpos en enfermedades autoinmunitarias.

Enfermedades inflamatorias

El termino quot;inflamacionquot; se usa en el presente documento para referirse a la respuesta del tejido vivo al dafo. Puede usarse un polipeptido de rSPD(n/CRD), fragmento, homologo, variante o derivado del mismo para tratar la inflamacion, incluyendo una enfermedad inflamatoria, administrando a un individuo que padece tal enfermedad el polipeptido de rSPD(n/CRD), fragmento, homologo, variante o derivado del mismo.

Las causas de la inflamacion incluyen dafo ffsico, sustancias qufmicas, microorganismos u otros agentes. En una realizacion preferida, el polipeptido de rSPD(n/CRD), fragmento, homologo, variante o derivado del mismo se usa para tratar una enfermedad inflamatoria, aunque puede usarse para tratar cualquier inflamacion que resulte de cualquier causa.

La respuesta inflamatoria consiste en cambios en el flujo sangufneo, aumento de la permeabilidad de los vasos sangufneos y escape de las celulas de la sangre a los tejidos. La inflamacion aguda es de corta duracion, durando solo unos pocos dfas. Sin embargo, si dura mas tiempo, se denomina entonces inflamacion cronica. Diversos ejemplos de inflamacion aguda que pueden conocerse son dolor de garganta, reacciones en la piel a un arafazo o una quemadura o picadura de insecto, y hepatitis aguda y asf sucesivamente. Sin embargo, hay excepciones historicas ocasionales tales como neumonfa, inflamacion del pulmon en vez de neumonitis y pleuresfa, inflamacion de la pleura en vez de pleuritis.

1nfecciones microbianas

Los virus conducen a muerte de celulas individuales por multiplicacion intracelular. Las bacterias liberan exotoxinas especfficas (compuestos qufmicos sintetizados por las mismas que inician especfficamente la inflamacion o endotoxinas, que estan asociadas con sus paredes celulares). Adicionalmente, algunos organismos provocan inflamacion mediada inmunologicamente a traves de reacciones de hipersensibilidad. 1nfecciones parasitarias e inflamacion tuberculosa son casos en los que la hipersensibilidad es importante.

Reacciones de hipersensibilidad

Se produce una reaccion de hipersensibilidad cuando un estado alterado de receptividad inmunologica provoca una reaccion inmunitaria inapropiada o excesiva que dafa los tejidos. Todas tienen mediadores celulares o qufmicos similares a los implicados en inflamacion.

Agentes ffsicos

El dafo tisular que conduce a la inflamacion puede producirse a traves de traumatismo ffsico, radiacion ultravioleta u otra radiacion ionizante, quemaduras o enfriamiento excesivo (quot;quemadura por congelacionquot;).

Productos qufmicos irritantes y corrosivos

Los productos qufmicos corrosivos (acidos, alcalis, agentes oxidantes) provocan inflamacion a traves de dafo macroscopico en los tejidos. Sin embargo, agentes infecciosos pueden liberar irritantes qufmicos especfficos que conducen directamente a inflamacion.

La inflamacion implica normalmente al menos una de las siguientes caracterfsticas:

Necrosis de tejidos: La muerte de tejidos por la falta de oxfgeno o nutrientes que resulta del flujo de sangre inadecuado (infarto) es un potente estfmulo inflamatorio. El borde de un infarto reciente muestra a menudo una respuesta inflamatoria aguda. Enrojecimiento (rubor): Un tejido inflamado de manera aguda aparece de color rojo, por ejemplo piel afectada por quemaduras solares, celulitis debida a infeccion bacteriana o conjuntivitis aguda. Esto se debe a la dilatacion de pequefos vasos sangufneos dentro de la zona dafada. Acaloramiento (calor): Se observa aumento de temperatura solo en partes perifericas del cuerpo, tales como la piel. Se debe a un aumento del flujo de sangre (hiperemia) a traves de la region, dando como resultado dilatacion vascular y el suministro de sangre caliente a la zona. La fiebre sistemica, que resulta de algunos de los mediadores qufmicos de la inflamacion, tambien contribuye a la temperatura local. Hinchazon (tumor): La hinchazon resulta del edema, la acumulacion de lfquido en el espacio extravascular como parte del exudado de fluido, y en un grado mucho menor, de la masa ffsica de las celulas inflamatorias que migran a la zona. Dolor: Para el paciente, el dolor es una de las caracterfsticas mejor conocidas de la inflamacion aguda. Resulta parcialmente del estiramiento y la distorsion de tejidos debido al edema inflamatorio y, en particular, del pus bajo presion en una cavidad de absceso. Algunos de los mediadores qufmicos de la inflamacion aguda, incluyendo bradicinina, las prostaglandinas y serotonina, se sabe que inducen dolor. Perdida de funcion: El movimiento de una zona inflamada se inhibe de manera consciente y refleja por el dolor, mientras que la hinchazon grave puede inmovilizar ffsicamente los tejidos.

Por tanto, se proporciona el alivio de un sfntoma de inflamacion, incluyendo un sfntoma enumerado anteriormente, mediante la administracion de un polipeptido de rSPD(n/CRD), fragmento, homologo, variante o derivado del mismo a un individuo que padece inflamacion o una enfermedad inflamatoria.

Enfermedad pulmonar inflamatoria

En una realizacion altamente preferida, se usa un polipeptido de rSPD(n/CRD), fragmento, homologo, variante o derivado del mismo para tratar una enfermedad pulmonar inflamatoria.

Tal como se usa el termino en el presente documento, debe considerarse que quot;enfermedad pulmonar inflamatoriaquot; significa cualquier enfermedad o estado que implica inflamacion del pulmon, o cualquier parte del pulmon o sistemas asociados tales como las vfas respiratorias, traquea, etc. La enfermedad pulmonar inflamatoria puede ser aguda o cronica, y puede resultar de o ir acompafada de alguna otra enfermedad o sfndrome. En una realizacion preferida, la enfermedad pulmonar inflamatoria comprende una enfermedad pulmonar inflamatoria cronica.

Los ejemplos de enfermedades pulmonares inflamatorias incluyen enfermedad pulmonar cronica neonatal, sfndrome de dificultad respiratoria neonatal (SDR), sfndrome de dificultad respiratoria del adulto, enfermedad obstructiva cronica de las vfas respiratorias (EPOC), asma, fibrosis qufstica, fibrosis pulmonar, enfisema, enfermedad pulmonar inflamatoria intersticial, sarcoidosis, neumonfa, enfermedad pulmonar inflamatoria cronica, enfermedad pulmonar inflamatoria cronica neonatal.

Pueden tratarse individuos que padecen tales enfermedades, o aliviarse sus sfntomas, mediante la administracion de un polipeptido de rSPD(n/CRD), fragmento, homologo, variante o derivado del mismo al individuo. Preferiblemente, tal tratamiento da como resultado el aclaramiento de macrofagos alveolares, preferiblemente macrofagos alveolares apoptoticos. El tratamiento tambien puede dar como resultado adicionalmente o como alternativa el aclaramiento de macrofagos necroticos. Pueden detectarse celulas necroticas y apoptoticas y distinguirse mediante los ensayos expuestos a continuacion.

Enfermedad pulmonar cronica neonatal

La enfermedad pulmonar cronica neonatal es un estado multifactorial asociado con inflamacion recurrente e infeccion tras parto prematuro. Hay varios factores que suponen un aumento del riesgo de desarrollar enfermedad pulmonar cronica incluyendo parto prematuro, ventilacion prolongada, infeccion recurrente en el periodo neonatal, deficiencia de tensioactivo y aumento de marcadores inflamatorios en el periodo neonatal, incluyendo el numero de macrofagos alveolares en muestras de succion traqueal. Se sabe que los lactantes prematuros son deficientes en protefnas tensioactivas incluyendo SPD.

La enfermedad pulmonar cronica neonatal humana surge del dafo inflamatorio y estres oxidativo tras ventilacion asistida prolongada, normalmente tras parto prematuro. La supervivencia tras el parto prematuro ha aumentado drasticamente desde la irrupcion de la terapia de sustitucion con tensioactivo artificial para el tratamiento del sfndrome de dificultad respiratoria neonatal, aunque hasta el 40% de los lactantes que sobreviven tras el nacimiento a menos de 28 semanas de gestacion desarrollan enfermedad pulmonar inflamatoria cronica. Las estrategias de sustitucion con tensioactivo actuales no incluyen protefna tensioactiva D. El dafo pulmonar en este entorno esta mediado por macrofagos alveolares activados. Ratones deficientes en SPD proporcionan un modelo para la inflamacion mediada por macrofagos en el pulmon caracterizada por la presencia de grandes numeros de macrofagos alveolares activados.

Se demuestra en los ejemplos que la administracion intranasal de rSPD (N/CRD) a ratones deficientes en SPD modula el proceso inflamatorio en los pulmones disminuyendo el numero de macrofagos activados y alterando su fenotipo. Los re

sultados demuestran una potente propiedad antiinflamatoria de rSPD (N/CRD) e indican una aplicacion clfnica directa de rSPD (N/CRD) en la prevencion de la enfermedad pulmonar inflamatoria cronica en recien nacidos mediante administracion directa o incluyendo rSPD (N/CRD) en la formulacion de terapias de tensioactivo actuales. Pueden emplearse tambien acidos nucleicos que codifican para rSPD(n/CRD), asf como fragmentos, homologos, variantes y derivados. Tambien puede tratarse la inflamacion pulmonar cronica que provoca enfisema (por ejemplo en fumadores, deficientes en niveles naturales de SPD) mediante la administracion de rSPD (N/CRD).

Por tanto, se proporciona el tratamiento de enfermedad pulmonar cronica neonatal, o cualquier sfntoma de una enfermedad de este tipo, mediante la administracion de un polipeptido de rSPD(n/CRD), fragmento, homologo, variante o derivado del mismo.

Terapia de sustitucion con tensioactivo

Esta seccion describe la terapia de sustitucion con tensioactivo, para la que se usa adecuadamente el polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD) o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo dado a conocer en el presente documento. En particular, el polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD) o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo puede emplearse para la terapia de sustitucion con tensioactivo en el recien nacido.

La terapia de sustitucion con tensioactivo se describe en detalle en Respir Care 1994:39(8):824829, de la que se deriva esta seccion. Se han publicado directrices para la terapia de sustitucion con tensioactivo, por ejemplo, las directrices de practica clfnica de la AARC. Un medico, siguiendo tales directrices, podra administrar polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD) o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo como parte de un programa de terapia de sustitucion con tensioactivo.

El tensioactivo endogeno, natural, es un compuesto compuesto por fosfolfpidos, lfpidos neutros y protefnas (15) que forma una capa entre la superficie alveolar y el gas alveolar y reduce el colapso alveolar disminuyendo la tension superficial dentro de los alveolos. (35) La deficiencia de tensioactivo esta asociada casi siempre con la formacion de membranas hialinas en el pulmon inmaduro y la aparicion de sfndrome de dificultad respiratoria (SDR), una causa principal de morbimortalidad en lactantes prematuros. (3) Sin tensioactivo, los alveolos pueden no inflarse nunca o pueden colapsarse al espirar y se requiere una fuerza desmesurada para reexpandirlos al inspirar, lo que conduce al desarrollo de SDR. (3,5) La incidencia de SDR esta relacionada mas con la inmadurez de los pulmones que con la edad de gestacion. (6) Sin embargo, en general, cuanto mas prematuro sea el lactante, menor sera la produccion de tensioactivo y mas alta sera la probabilidad de SDR. (4,6) Se ha mostrado que la instilacion traqueal directa de tensioactivo reduce la morbimortalidad en lactantes con SDR. (725)

Puede extraerse tensioactivo de lavado de pulmon animal y de lfquido amniotico humano o producirse a partir de materiales sinteticos. Segun los metodos y composiciones descritos en el presente documento, puede usarse polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD) o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo para la terapia de sustitucion con tensioactivo, particularmente en el recien

nacido. Puede usarse polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD) o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo solo, o en combinacion con terapias de sustitucion con tensioactivo conocidas.

Han surgido dos estrategias basicas para la sustitucion con tensioactivo: (1) tratamiento profilactico o preventivo en el que se administra tensioactivo en el momento del nacimiento o poco despues del mismo a lactantes que corren un alto riesgo de desarrollar SDR y (2) tratamiento de rescate o terapeutico en el que se administra tensioactivo tras el inicio de la ventilacion mecanica en lactantes con SDR confirmado clfnicamente. (2,1012,26,27).

La terapia de sustitucion con tensioactivo se administra normalmente por personal entrenado en la sala de administracion o en una unidad de cuidados intensivos neonatal.

1ndicaciones para la terapia de sustitucion con tensioactivo

4.1 La administracion profilactica puede indicarse en 4.1.1 lactantes con alto riesgo de desarrollar SDR debido a una corta gestacion (� 32 semanas) (8,1012,21,2529) o bajo peso al nacer (� 1,300 g), (2125,28) lo que sugiere fuertemente inmadurez de los pulmones. 4.1.2 Lactantes en los que hay pruebas de laboratorio de deficiencia de tensioactivo tales como razon de lecitina/esfingomielina inferior a 2:1, (11,14,28,30,31) prueba de estabilidad de burbujas que indica inmadurez de los pulmones, (15,32) o la ausencia de fosfatidilglicerol. (11,14,2224,28,30) 4.2 Se indica administracion de rescate o terapeutica en lactantes prematuros o a termino 4.2.1 que requieren intubacion endotraqueal y ventilacion mecanica debido a 4.2.1.1 aumento del trabajo de respiracion tal como se indica por un aumento en la tasa respiratoria, retracciones subesternales y supraesternales, grufidos y aleteo nasal, (8,11,1416,29,3335) 4.2.1.2 requisitos de oxfgeno crecientes tal como se indica por el color de la piel palido o cianotico, agitacion y disminuciones en PaO2, SaO2 o SpO2 que exigen un aumento de F1O2 por encima de 0 (4011,12,15,26,33,3638) y 4.2.2 tienen pruebas clfnicas de SDR (13,39) incluyendo 4.2.2.1 radiograffa toracica caracterfstica de SDR, (8,1116,33,34,36,37,4042) 4.2.2.2 presion media en las vfas respiratorias superior a 7 cm de H2O para mantener una adecuada PaO2, SaO2 o SpO2. (11,14,15,26,43)

Contraindicaciones

La terapia de sustitucion con tensioactivo esta contraindicada para los siguientes estados: 5.1 la presencia de anomalfas congenitas incompatibles con la vida mas alla del periodo neonatal, (8,14,15,26,28,29,31,33,36,41,44) 5.2 dificultad respiratoria en lactantes con pruebas de laboratorio de madurez de los pulmones. (9,14,2729,33,36,41)

Los peligros y complicaciones que surgen de la terapia de sustitucion con tensioactivo incluyen: 6.1 las complicaciones del procedimiento que resultan de la administracion del tensioactivo incluyen 6.1.1 obstruccion del tubo endotraqueal (ETT) por tensioactivo; (2); 6.1.2 desaturacion de hemoglobina y aumento de la necesidad de O2 complementario; (11,33,41); 6.1.3 bradicardia debida a hipoxia; (9,33,41,45); 6.1.4 taquicardia debida a agitacion, con reflujo del tensioactivo hacia el ETT; (34,41); 6.1.5 deposicion en la faringe de tensioactivo; 6.1.6 admi

nistracion de tensioactivo a solo un pulmon; 6.1.7 administracion de una dosis suboptima tras calculo erroneo o error en la reconstitucion. 6.2 Las complicaciones fisiologicas de la terapia de sustitucion con tensioactivo incluyen 6.2.1 apnea, (7,13,15); 6.2.2 hemorragia pulmonar, (12,15,18,32,34,38,46,47); 6.2.3 tapones de moco, (48); 6.2.4 aumento de la necesidad de tratamiento para PDA, (18,29,30); 6.2.5 aumento marginal en la retinopatfa de la prematuridad, (11);

6.2.6 barotraumatismo que resulta del aumento en la distensibilidad de los pulmones tras la sustitucion con tensioactivo y no cambiar los parametros del ventilador en consecuencia. (30,49)

El tensioactivo administrado profilacticamente puede administrarse a algunos lactantes en los que no se habfa desarrollado SDR. (10,12,26,33). Cuando se administra profilacticamente tensioactivo en la sala de administracion, la colocacion del ETT puede no haberse verificado mediante radiograffa toracica dando como resultado la administracion involuntaria a solo un pulmon o al estomago. (26) La administracion profilactica de tensioactivo puede retrasar la estabilizacion del paciente. (26). Pueden producirse atelectasia y lesion pulmonar antes de la administracion terapeutica. (26,33). Debe evitarse el aspirado traqueal tras la administracion del tensioactivo. (9,11,13,14,27,33, 38,44,50). No todos los lactantes que se han tratado con una unica dosis de tensioactivo experimentan una respuesta positiva 39

o la respuesta puede ser transitoria. La posicion recomendada para la administracion del tensioactivo puede comprometer ademas al lactante inestable. (9,11,12,14,16,28,33,3840)

Un medico puede emprender una evaluacion de la necesidad de determinar que estan presentes indicaciones validas. Lo siguiente se realiza normalmente para esto: 8.1 Evaluacion de la inmadurez de los pulmones antes de la administracion profilactica de tensioactivo mediante la edad de gestacion y el peso al nacer y/o mediante evaluacion de laboratorio del aspirado traqueal o gastrico. 8.2 Establecimiento del diagnostico de SDR mediante criterios de radiograffa toracica y el requisito de ventilacion mecanica en presencia de corta gestacion y/o bajo peso al nacer.

Se realiza la evaluacion del desenlace segun lo siguiente: 9.1 Requisito de reduccion en F1O2 (12,33,34,3639,41,44) 9.2 Reduccion en el trabajo de respiracion

(51) 9.3 Mejora en los volumenes pulmonares y campos pulmonares tal como se indica mediante radiograffa toracica (13,16,33,40) 9.4 Mejora en la mecanica pulmonar (por ejemplo, distensibilidad, resistencia de las vfas respiratorias, VT, VE, presion transpulmonar) y volumen pulmonar (es decir, FRC) (42,43,50,5259) 9.5 Reduccion en los requisitos de ventilador (P1P, PEEP, Paw) (2,8,9,12,13,27,30,33,3639,41,44,50,52) 9.6 Mejora en la razon de PO2 arterial con respecto a alveolar (PO2 a/A), fndice de oxfgeno (13,16,28,30,33,34,3741,44).

Recursos

Deben observarse procedimientos de administracion recomendados para preparaciones especfficas de tensioactivo. 10.1 Equipo (1014,16,2628,33,34,39,40,50,60) 10.1.1 Equipo de administracion 10.1.1.1 Jeringuilla que contiene la dosis ordenada de tensioactivo, calentada hasta temperatura ambiente (11,12,16,38,40) 10.1.1.2 Cateter o tubo de alimentacion 5Fr, o conector de tubo

endotraqueal con orificio de administracion 10.1.1.3 Ventilador mecanico o ventilador manual (bolsa de resucitacion) (8,16,33,36,3840,44,50,52) 10.1.2 Equipo de resucitacion 10.1.2.1 Laringoscopio y tubo endotraqueal (1012,14,16,26,38)

10.1.2.2 Bolsa de resucitacion manual (912,16,2628,36,39,40,50) y manometro de las vfas respiratorias 10.1.2.3 Fuente de oxfgeno combinado (9,16,28,44)

10.1.2.4 Equipo de aspiracion (es decir, cateteres, guantes esteriles, tubos y frasco de recogida, y generador de vacfo) (9,33,50,60) 10.1.2.5 Calentador radiante listo para usar 10.1.3 Equipo de monitorizacion 10.1.3.1 Monitor de volumen tidal neonatal si esta disponible (50) 10.1.3.2 Monitor de presion de las vfas respiratorias 10.1.3.3 Oxfmetro de pulso o monitor de PCO2 transcutanea (11,26,34,3941,52) 10.1.3.4 Monitor cardiorrespiratorio 10.2 Personal. La terapia de sustitucion con tensioactivo debe realizarse bajo la direccion de un medico por personal acreditado (por ejemplo, CRTT, RRT, RN) que demuestran competentemente

10.2.1 uso apropiado, comprension y dominio del equipo y los aspectos tecnicos de la terapia de sustitucion con tensioactivo; 10.2.2 conocimiento y comprension exhaustivos del manejo del ventilador neonatal y la anatomfa y fisiopatologfa pulmonar; 10.2.3 experiencia en la evaluacion de pacientes neonatales, incluyendo la capacidad para reconocer y responder a reacciones adversas y/o complicaciones del procedimiento; 10.2.4 conocimiento y comprension de la historia del paciente y del estado clfnico; 10.2.5 conocimiento y comprension del manejo de las vfas respiratorias; 10.2.6 capacidad para interpretar signos vitales y variables de gases sangufneos medidos y monitorizados; 10.2.7 uso apropiado, comprension y dominio de los procedimientos y el equipo de resucitacion de emergencia; 10.2.8 capacidad para evaluar y documentar el desenlace (seccion 9.0); 10.2.9 comprension y aplicacion apropiada de precauciones universales.

Monitorizacion

Lo siguiente debe monitorizarse como parte de la terapia de sustitucion con tensioactivo. 11.1 Variables que van a monitorizarse durante la administracion del tensioactivo 11.1.1 Posicion y colocacion apropiadas del dispositivo de administracion 11.1.2 Parametros del ventilador y F1O2 (8,9,11,1315,2729,33,36,38,44)

11.1.3 Reflujo del tensioactivo hacia el ETT (34,41) 11.1.4 Posicion del paciente (es decir, direccion de la cabeza) (9,11,33) 11.1.5 Movimiento de la pared toracica

(61) 11.1.6 Saturacion de oxfgeno por oximetrfa de pulso (11,26,34,3941,52)

11.1.7 Frecuencia cardiaca, respiraciones, expansion toracica, color de la piel y vigor (16,26,27,34,41,45,52) 11.2 Variables que van a monitorizarse tras la administracion del tensioactivo 11.2.1 Mediciones invasivas y no invasivas de gases de sangre arterial (8,9,11,1216,2629,33,36,38,39,41,44) 11.2.2 Radiograffa toracica (1116,28,36,3840,44) 11.2.3 Parametros del ventilador (P1P, PEEP, Paw) y F1O2 (8,9,11,1316,28,29,33,36,38) 11.2.4 Volumenes y mecanica pulmonares 11.2.5 Frecuencia cardiaca, respiraciones, expansion toracica, color de la piel y vigor (16,26,27,34,41,45,52) 11.2.6 Sonidos de la respiracion (11,38) 11.2.7 Tension arterial (3,16,33,40,44,45).

Frecuencia

Las dosis repetidas de tensioactivo estan supeditadas al diagnostico continuado de SDR. La frecuencia con la que se realiza la sustitucion con tensioactivo debe depender del estado clfnico del paciente y de la indicacion para realizar el proce

dimiento. Dosis adicionales de tensioactivo, administradas a intervalos de 6 a 24 horas, pueden estar indicadas en lactantes que experimentan requisitos de ventilador crecientes o cuyos estados no mejoran tras la dosis inicial. (7,9,11,12,14,15,26,30, 34,37,39,52)

Control de infecciones

13.1 Deben implementarse precauciones universales (62). 13.2 Debe ponerse en practica una tecnica aseptica. 13.3 Deben anotarse y seguirse directrices de control de infecciones apropiadas para el paciente.

Fibrosis qufstica

Se muestra en los ejemplos que el polipeptido de rSPD(n/CRD) puede reducir el numero de macrofagos alveolares. Por consiguiente, puede administrarse polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD) o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo en enfermedades pulmonares en las que los macrofagos alveolares desempefan un papel en el proceso inflamatorio, por ejemplo, fibrosis qufstica, asma y enfisema. rSPD (N/CRD) tiene tambien propiedades terapeuticas en procesos inflamatorios mediados por macrofagos en otros sitios, por ejemplo en aterosclerosis.

La fibrosis qufstica es una enfermedad genetica que afecta aproximadamente tanto a nifos como a adultos.

La fibrosis qufstica provoca que el cuerpo produzca un moco anomalamente espeso, pegajoso debido al transporte defectuoso de sodio y cloruro (sal) dentro de las celulas que revisten organos tales como los pulmones y el pancreas, o sus superficies externas. El moco espeso de la fibrosis qufstica tambien obstruye el pancreas, impidiendo que las enzimas alcancen los intestinos para ayudar a descomponer y digerir el alimento.

La fibrosis qufstica tiene una variedad de sfntomas. Los mas comunes son: piel con sabor muy salino; tos persistente, respiracion sibilante o neumonfa; apetito excesivo pero escaso aumento de peso; y deposiciones voluminosas. La prueba de sudor es la prueba de diagnostico convencional para la fibrosis qufstica, que mide la cantidad de sal en el sudor. Un alto nivel de sal indica que una persona tiene fibrosis qufstica.

El tratamiento de la fibrosis qufstica depende del estadio de la enfermedad y de que organos estan implicados. Un medio de tratamiento, la terapia ffsica toracica, requiere percusion vigorosa (usando el cuenco de la mano) sobre la espalda y el torax para desplazar el modo espeso de los pulmones. Tambien se usan antibioticos para tratar infecciones pulmonares y se administran por vfa intravenosa, mediante pfldoras y/o vapores medicados que se inhalan para abrir las vfas respiratorias obstruidas. Cuando la fibrosis qufstica afecta al sistema digestivo, el cuerpo no absorbe suficientes nutrientes. Por tanto, la gente con fibrosis qufstica puede necesitar alimentarse con una dieta enriquecida y necesita tomar tanto enzimas como vitaminas de sustitucion.

Segun los metodos y las composiciones descritos en el presente documento, se alivia un sfntoma de un paciente que padece fibrosis qufstica mediante la administracion de polipeptido de rSPD(n/CRD), fragmento, homologo, variante o derivado del mismo. El sfntoma de fibrosis qufstica incluye preferiblemente cualquiera de los sfntomas enumerados anteriormente. Preferiblemente, un paciente que padece fibrosis qufstica se trata mediante la administracion de un polipeptido de este tipo, homologo, fragmento o derivado.

Alergias

Los tratamientos existentes para las alergias implican normalmente el uso a largo plazo de esteroides para deprimir el sistema inmunitario. Hay efectos secundarios no deseados con la terapia con esteroides a largo plazo. Se demuestra que puede usarse polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD) o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo para aliviar los sfntomas de la alergia, o para tratar la alergia.

El tratamiento con rSPD(n/CRD) parece no tener efectos adversos en ratones y no es probable que genere efectos secundarios no deseados en seres humanos. Un ciclo de tratamiento corto con rSPD(n/CRD) puede revertir la sensibilizacion alergica subyacente conduciendo a una inmunoterapia eficaz. Esto es una mejora significativa sobre los protocolos de inmunoterapia de desensibilizacion existentes que implican normalmente una serie de inyecciones de alergeno a lo largo de un periodo de afos.

Las alergias adecuadas para el tratamiento con polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD) o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo incluyen una alergia respiratoria estacional, rinitis alergica, fiebre del heno, rinitis no alergica, rinitis vasomotora, rinitis irritante, una alergia contra polenes de hierbas, polenes de arboles o caspa de animales, una alergia asociada a asma alergica y alergias alimentarias. En particular, y tal como se describe en otra parte, puede usarse polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD) o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo para tratar alergias a acaros del polvo domestico (Dermatophagoides spp), preferiblemente Dermatophagoides pteronyssinus o Dermatophagoides farinae, o a hongos o esporas fungicas, preferiblemente Aspergillus fumigatus. Preferiblemente, los alergenos estan comprendidos en heces de Dermatophagoides spp.

Asma

El asma es un estado respiratorio caracterizado por obstruccion del flujo de aire en los tubos bronquiales. Los sfntomas provocados por esta obstruccion incluyen tos, opresion en el torax, respiracion sibilante y disnea. Aunque los problemas estan separados a menudo por periodos libres de sfntomas, el asma es una enfermedad cronica.

Una amplia variedad de quot;desencadenantesquot; pueden iniciar un episodio de asma. El desencadenante mas comun son alergenos, aspirina y tartrazina, irritantes, conservantes y aditivos alimentarios, infecciones respiratorias virales y ejercicio ffsico.

Los alergenos son sustancias a los que individuos susceptibles pueden llegar a ser alergicos. Son una fuente principal de problemas en nifos y adultos. Los alergenos comunes incluyen polen de plantas (arboles, hierbas y cesped), caspa de animales, acaros del polvo domestico, mohos y determinados alimentos. Cuando un individuo alergico entra en contacto con uno de estos alergenos, una serie de acontecimientos provocan que el cuerpo libere determinados compuestos qufmicos (mediadores) que desencadenan entonces el asma.

Del diez al veinte por ciento de los asmaticos experimentan una disminucion significativa en su funcion pulmonar tras tomar aspirina; pueden producirse reacciones similares con un grupo relacionado de medicamentos denominados agentes antiinflamatorios no esteroideos y con tartrazina (colorante alimentario amarillo n.° 5). Aire frfo, humo, productos qufmicos industriales, perfume, pintura y humos de gasolina son todos ejemplos de irritantes que pueden provocar asma, probablemente estimulando receptores de irritantes en las vfas respiratorias. Estos receptores, a su vez, provocan que los musculos que rodean las vfas respiratorias se constrifan, dando como resultado un ataque asmatico. Rara vez, aditivos alimentarios tales como sulfitos pueden desencadenar asma. 1nfecciones respiratorias virales son la causa principal de ataques de asma agudos.

Durante un ataque de asma, los tubos bronquiales hiperactivos de un asmatico se estrechan en respuesta a determinados desencadenantes. Durante un ataque, los musculos que rodean los tubos bronquiales se contraen, estrechando los conductos de aire. Tambien se produce inflamacion a lo largo del revestimiento de las vfas respiratorias, que produce hinchazon y reduccion adicional del tamafo de las vfas respiratorias. Ademas, las glandulas mucosas a lo largo del interior de los conductos de aire producen moco en exceso que se acumula en los conductos de aire ya estrechados. El resultado final es que la respiracion, especialmente la exhalacion, se hace extremadamente diffcil. El aire queda atrapado detras de los conductos bronquiales estrechados y hay una disminucion en el oxfgeno disponible para el cuerpo.

Los broncodilatadores son los farmacos mas comunmente prescritos para tratar el asma. Relajan los musculos que rodean las vfas respiratorias, dando como resultado dilatacion de los tubos bronquiales. Los broncodilatadores pueden inhalarse, tomarse por vfa oral o inyectarse. El aire frfo, seco, por ejemplo, inhalado durante el ejercicio a traves de la boca tambien puede desencadenar asma.

Los farmacos actuales usados para tratar los sfntomas del asma incluyen teofilinas de accion prolongada, agonistas beta inhalados u orales, cromolina y esteroides inhalados u orales. Para asmaticos alergicos, la inmunoterapia (vacuna contra la alergia) puede ofrecer alivio frente a alergenos que no pueden evitarse. La inmunoterapia aumenta la tolerancia de un paciente a alergenos que promueven sfntomas del asma.

Asma alergica

El asma tambien puede desencadenarse por la exposicion a alergenos (quot;asma alergicaquot;).

El asma alergica se caracteriza por periodos de hiperreactividad de las vfas respiratorias (AHR) que se producen en reacciones de hipersensibilidad de fase temprana y de fase tardfa en respuesta a provocacion por alergenos. La respuesta de fase temprana esta mediada por la desgranulacion de mastocitos de las vfas respiratorias con la liberacion de histamina y otros broncoconstrictores. La respuesta de fase tardfa comienza tras el flujo de entrada de celulas inflamatorias tales como eosinofilos y linfocitos y la liberacion posterior de mediadores inflamatorios y citocinas, que conducen a AHR cronica.

Los acaros del polvo domestico son una de las causas principales de asma alergica (PlattsMills, T. A., y M. D. Chapman. 1987. Dust mites: immunology, allergic disease, and environmental control. J Allergy Clin 1mmunol. 80:75575; PlattsMills, T. A., E. B. Mitchell, M. D. Chapman, y P. W. Heymann. 1987. Dust mite allergy: its clinical significance. Hosp Pract (Off Ed). 22:913, 97100; Pollart, S. M.,

M. D. Chapman, y T. A. PlattsMills. 1987. House dust sensitivity and environmental control. Prim Care. 14:591603.).

Puede usarse un polipeptido de rSPD(n/CRD), fragmento, homologo, variante o derivado del mismo, por ejemplo tal como se describe en el presente documento, para tratar el asma alergica. Preferiblemente, el polipeptido de rSPD(n/CRD), fragmento, homologo, variante o derivado del mismo se emplea para tratar la alergia, o asma alergica, provocada por acaros del polvo domestico.

Acaros del polvo domestico se refiere a cualquier organismo de Dermatophagoides spp. Preferiblemente, el organismo de Dermatophagoides es Dermatophagoides pteronyssinus o Dermatophagoides farinae. El asma alergica tambien puede desarrollarse como resultado de la exposicion de un individuo a hongos o esporas fungicas, y los metodos y las composiciones descritos en el presente documento incluyen el tratamiento de tal asma o alergia, incluyendo cualquier alergia contra antfgenos de Aspergillus fumigatus.

Enfisema pulmonar y enfermedad pulmonar obstructiva cronica

En una realizacion particular, se usa un polipeptido de rSPD(n/CRD), fragmento, homologo, variante o derivado del mismo, por ejemplo tal como se describe en el presente documento, para tratar el enfisema pulmonar o la enfermedad pulmonar obstructiva cronica.

El enfisema es un problema de salud publica masivo para el que no hay tratamientos satisfactorios. El humo de los cigarrillos induce apoptosis de macrofagos alveolares in vitro (Aoshiba, K., Tamaoki, J., y Nagai, A. 2001. Acute cigarette smoke exposure induces apoptosis of alveolar macrophages. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 281: L1392) e in vivo (Aoshiba et al, citado anteriormente) y Majo et al han notificado recientemente que la apoptosis en muestras de tejido pulmonar de fumadores mostraba una relacion bilineal con la cantidad de humo, aumentando bruscamente en fumadores con enfisema y concluyen que la apoptosis podrfa ser uno de los mecanismos de destruccion del pulmon que conducen al desarrollo de enfisema Majo, J., Ghezzo, H., y Cosio, M. G. 2001. Lymphocyte population and apoptosis in the lungs of smokers and their relation to emphysema. Eur Respir J 17: 946. Se propone que SPD es deficiente en fumadores, y que esto promueve la apoptosis y contribuye al enfisema en este grupo de pacientes. Se demuestra que la administracion de rSPD (N/CRD) a ratones deficientes en SPD reduce los numeros de celulas apoptoticas; por consiguiente, la terapia con rSPD (N/CRD) en seres humanos puede inhibir un mecanismo que contribuye al enfisema provocado por fumar cigarrillos.

Citocinas

En una realizacion adicional, se usa el polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD), fragmento, homologo, variante o derivado del mismo para modular los niveles de citocinas en un individuo. Preferiblemente, el nivel de citocinas inflamatorias se regula por disminucion. Los ejemplos de citocinas inflamatorias incluyen factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos (GMCSF), asf como cualquier citocina que medie en la migracion de macrofagos alveolares al pulmon y actue aumentando la proliferacion celular.

Se demuestra la modulacion de los niveles de GMCSF mediante la administracion de polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD) o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo en el ejemplo 9 (figura 14).

El termino quot;citocinaquot; puede usarse para referirse a cualquiera de varias moleculas solubles (por ejemplo, glicoprotefnas) liberadas por celulas del sistema inmunitario, que actuan no enzimaticamente a traves de receptores especfficos regulando respuestas inmunitarias. Las citocinas se asemejan a hormonas porque actuan a bajas concentraciones unidas con alta afinidad a un receptor especffico. Preferiblemente, el termino quot;citocinaquot; se refiere a un grupo diverso de peptidos y protefnas solubles que actuan como reguladores humorales a concentraciones de nano a picomolares y que, en condiciones no bien normales o bien patologicas, modulan las actividades funcionales de tejidos y celulas individuales.

Los ejemplos particulares de citocinas que son adecuadas para su uso en los metodos y las composiciones descritos en el presente documento incluyen interleucinas, linfocina, interferon, factores estimulantes de colonias (CSF) tales como factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos (GCSF), factor estimulante de colonias de macrofagos (MCSF) y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos (GMCSF), GSF, factores de activacion de plaquetas (PAF), factor de necrosis tumoral (TNF).

Por tanto, se incluyen interleucinas tales como 1L1, 1L2 e 1L4, asf como interfero nes tales como 1FN, 1FNe 1FN. Tambien pueden emplearse adecuadamente factores de necrosis tumoral TNF (caquetina), TNF (linfotoxina). Citocinas preferidas son las que pueden reclutar respuestas inmunitarias, por ejemplo, estimulacion de celulas dendrfticas o actividad de celulas T citotoxicas, o que pueden reclutar macrofagos al sitio diana. En una realizacion altamente preferida, la citocina comprende 1L2, GMCSF o GSF.

Apoptosis

Segun los metodos y las composiciones descritos en el presente documento, la administracion de un polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD) o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo a un individuo puede reducir el numero de macrofagos alveolares, en particular el numero de macrofagos alveolares apoptoticos, o macrofagos alveolares necroticos o ambos. Sin querer restringirse a una teorfa particular, se preve que el polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD) o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo logre esto

potenciando el aclaramiento de macrofagos apoptoticos y/o necroticos del cuerpo del individuo.

Preferiblemente, el tratamiento con polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD) o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo da como resultado al menos un 10% mas de aclaramiento de macrofagos apoptoticos y/o necroticos, preferiblemente al menos un 20% mas de aclaramiento. Lo mas preferiblemente, el tratamiento con polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD) o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo da como resultado al menos un 40%, 60%, 80% o mas de aclaramiento de macrofagos apoptoticos y/o necroticos.

La muerte celular puede producirse por cualquiera de dos mecanismos distintos, necrosis o apoptosis. Ademas, determinados compuestos qufmicos y celulas se dice que son citotoxicos para la celula, es decir, provocan su muerte.

quot;Necrosisquot; (tambien denominada muerte celular quot;accidentalquot;) se refiere al proceso patologico que se produce cuando se exponen celulas a un ataque ffsico o qufmico grave. Se produce necrosis cuando se exponen celulas a una variacion extrema con respecto a las condiciones fisiologicas (por ejemplo, hipotermia, hipoxia) que puede dar como resultado dafo a la membrana plasmatica. En condiciones fisiologicas, se provoca dafo directo a la membrana plasmatica por agentes como el complemento y virus lfticos. La necrosis comienza con una alteracion de la capacidad de la celula para mantener la homeostasis, que conduce a un flujo de entrada de agua e iones extracelulares. Los organulos intracelulares, lo mas particularmente las mitocondrias, y toda la celula se hinchan y se rompen (lisis celular). Debido a la descomposicion final de la membrana plasmatica, el contenido citoplasmatico incluyendo las enzimas lisosomicas se liberan al lfquido extracelular. Por tanto, in vivo, la muerte celular necrotica esta asociada a menudo con dafo tisular extenso que da como resultado una respuesta inflamatoria intensa.

quot;Apoptosisquot; (muerte celular quot;normalquot; o quot;programadaquot;) se refiere al proceso fisiologico mediante el que se eliminan celulas no deseadas o sin utilidad durante el desarrollo y otros procesos biologicos normales. La apoptosis es un modo de muerte celular que se produce en condiciones fisiologicas normales y la celula es un participante activo en su propio fallecimiento (quot;suicidio celularquot;). Se encuentra lo mas a menudo durante el recambio celular normal y la homeostasis tisular, la embriogenesis, la induccion y el mantenimiento de la tolerancia inmunitaria, el desarrollo del sistema nervioso y la atrofia del tejido dependiente del sistema endocrino. Las celulas que experimentan apoptosis muestran rasgos bioqufmicos y morfologicos caracterfsticos. Estos rasgos incluyen agregacion de la cromatina, condensacion nuclear y citoplasmatica, particion del citoplasma y nucleo en vesfculas unidas a la membrana (cuerpos apoptoticos) que contienen ribosomas, mitocondrias morfologicamente intactas y material nuclear. In vivo, estos cuerpos apoptoticos se reconocen y fagocitan rapidamente por o bien macrofagos o bien celulas epiteliales adyacentes. Debido a este eficaz mecanismo para la eliminacion de celulas apoptoticas in vivo, no se generan respuestas inflamatorias. In vitro, los cuerpos apoptoticos asf como los fragmentos celulares restantes se hinchan en ultima instancia y finalmente se lisan. Esta fase terminal de muerte celular in vitro se ha denominado quot;necrosis secundariaquot;.

La tabla 1 resume las diversas diferencias observables entre necrosis y apoptosis. Cualquiera de estas diferencias, solas o en combinacion, pueden someterse a en

sayo con el fin de determinar si esta produciendose muerte celular por apoptosis o por necrosis.

Necrosis: Apoptosis

Rasgos mor-: Perdida de integridad de Formacion de ampollas en la

fol6gicos: la membrana Comienza con el hinchamiento del citoplasma y las mitocondrias Finaliza con lisis celular total Sin formacion de vesfculas, lisis completa Disgregacion (hinchamiento) de organulos membrana, pero no perdida de integridad Agregacion de la cromatina en la membrana nuclear Comienza con la retraccion del citoplasma y la condensacion del nucleo Finaliza con la fragmentacion de la celula en cuerpos mas pequefos

Formacion de vesfculas unidas a la membrana (cuerpos apoptoticos) Las mitocondrias padecen fugas debido a la formacion de poros que implican a protefnas de la familia bcl2.

Rasgos bio-: Perdida de regulacion Proceso rigurosamente regulado

quimicos: de la homeostasis del hierro Sin requisitos de energfa (proceso pasivo, se produce tambien a 4°C) Digestion al azar de ADN (frotis de ADN tras electroforesis en gel de agarosa) Fragmentacion del ADN tras la lisis (= acontecimiento tardfo de muerte) que implica etapas de activacion y enzimaticas Dependiente de energfa (ATP) (proceso activo, no se produce a 4°C) Fragmentacion de ADN de longitud mono y oligonucleosomica no al azar (patron de marcador de tamafo molecular tras electroforesis en gel de agarosa Fragmentacion del ADN antes de la lisis Liberacion de diversos factores (citocromo C, A1F) al citoplasma por las mitocondrias Activacion de la cascada de caspasas Alteraciones en la asimetrfa de la

membrana (es decir, translocacion de fosfatidilserina desde el citoplasma hasta el lado extracelular de la membrana)

Sig�ificaci6�: Afecta a grupos de celu Afecta a celulas individuales

fisiol6gica: las contiguas Provocada por alteraciones no fisiologicas (ataque del complemento, virus lfticos, hipotermia, hipoxia, isquemia, venenos metabolicos) 1nducida por estfmulos fisiologicos (falta de factores de crecimiento, cambios en el entorno hormonal) Fagocitosis por celulas adyacentes o macrofagos

Fagocitosis por macrofagos Respuesta inflamatoria significativa: Sin respuesta inflamatoria

Tabla 1: Rasgos diferenciales y significancia de necrosis y apoptosis

Se hace referencia a los siguientes documentos, que describen la apoptosis en detalle, asf como diversos ensayos para medir la muerte celular por apoptosis: Schwartzman, R. A. y Cidlowski, J. A. (1993). Endocrine Rev. 14, 133; Vermes, 1. 5 y Haanan, C. (1994). Adv. Clin. Chem. 31, 177; Berke, G. (1991). 1mmunol. Today 12, 396; Kr�henb�hl, O. y Tschopp, J. (1991). 1mmunol. Today 12, 399; Van Furth,

R. y Van Zwet, T. L. (1988). J. 1mmunol; Methods 108,45. Cohen, J. J. (1993) Apoptosis. 1mmunol. Today14, 126; Savill, J. S. et al. (1989). J. Clin. 1nvest. 83, 865; Wyllie, A. H. (1980). Nature 284, 555; Leist, M. et al. (1994) Biochemica n.° 3, 10 1820; Fraser, A. y Evan, G. (1996) Cell 85, 781784; Duke, R C. (1983). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80,6361; Duke, R. C. y Cohen, J. J. (1986). Lymphokine Res. 5, 289; Trauth, B. C. et al. (1994) Eur. J. Cell. Biol. 63, 32, supl. 40; Matzinger, P. (1991). J. 1mmunol; Methods 145, 185; Kaeck, M. R. (1993); Anal. Biochem. 208, 393; Prigent, P. et al. (1993). J. 1mmunol; Methods 160, 139;

15 Huang, P. y Plunkett, W. (1992); Anal. Biochem. 207, 163 Bortner, C. D. et al. (1995) Trends Cell Biol. 5, 21; Gold, R. et al. (1994); Lab. 1nvest. 71, 219.

La apoptosis y la citotoxicidad mediada por celulas se caracteriza por escision del ADN genomico en fragmentos diferenciados antes de la disgregacion de la membrana. Por consiguiente, la apoptosis puede someterse a ensayo midiendo la 20 fragmentacion del ADN, por ejemplo, observando la presencia de marcadores de tamafo molecular del ADN. Los fragmentos de ADN pueden someterse a ensayo, por ejemplo, como quot;marcadores de tamafo molecularquot; (con los multiplos de 180 pb como quot;peldafosquot; del marcador de tamafo molecular) derivados de poblaciones de celulas, o mediante cuantificacion de fragmentos de ADN complejados 25 con histonas mediante, por ejemplo, EL1SA. Un ensayo de este tipo se basa en un inmunoensayo de tipo quot;sandwichquot; de una etapa para detectar nucleosomas. El procedimiento implica sedimentar celulas mediante centrifugacion y desechar el sobrenadante (que contiene ADN de celulas necroticas que se escapo a traves de la membrana durante la incubacion). Se resuspenden las celulas y se incuban en 30 tampon de lisis. Tras la lisis, se sedimentan nucleos intactos mediante centrifuga

cion. Se transfiere una alfcuota del sobrenadante a un pocillo recubierto con estreptavidina de una placa de microtitulacion, y se unen los nucleosomas en el sobrenadante con dos anticuerpos monoclonales, antihistona (marcado con biotina) y antiADN (conjugado con peroxidasa). Los complejos anticuerponucleosoma se unen a la placa de microtitulacion mediante la estreptavidina. Los complejos anticuerpohistona inmovilizados se lavan tres veces para eliminar componentes celulares que no son inmunorreactivos, y se incuba la muestra con sustrato de peroxidasa (ABTS�). Se determina entonces la cantidad de producto coloreado (y por tanto, de complejos anticuerpohistona inmovilizados) espectrofotometricamente.

Varias proteasas estan implicadas en los estadios tempranos de la apoptosis. Por tanto, la apoptosis puede someterse a ensayo detectando la presencia de, ademas de, o en lugar de, sometiendo a ensayo la actividad de, proteasas inducidas por apoptosis tales como caspasas, por ejemplo, caspasa 3. La activacion de caspasas puede analizarse de diferentes modos, por ejemplo, mediante un ensayo enzimatico in vitro de, por ejemplo, lisados celulares capturando la caspasa y midiendo la escision proteolftica de un sustrato adecuado. Ademas, pueden someterse a ensayo caspasas mediante la deteccion de la escision de un sustrato de caspasas in vivo tal como PARP (poliADPribosapolimerasa). Pueden detectarse fragmentos escindidos de PARP con un anticuerpo adecuado tal como un anticuerpo antiPARP. Ensayos de proteasas y ensayos de fragmentacion del ADN son especialmente adecuados para someter a ensayo la apoptosis en poblaciones celulares.

Tambien estan disponibles metodos para estudiar la apoptosis en celulas individuales, tales como ensayos de marcaje enzimatico 1SNT y TUNEL. Tal como se indico anteriormente, la degradacion extensa del ADN es un acontecimiento caracterfstico que se produce a menudo en los estadios tempranos de la apoptosis. La escision del ADN produce fragmentos de ADN bicatenarios, de bajo peso molecular (mono y oligonucleosomas) asf como roturas monocatenarias (quot;mellasquot;) en ADN de alto peso molecular. En TUNEL, se detectan tales roturas de la hebra de ADN mediante marcaje enzimatico de los extremos terminales 3'OH libres con nucleotidos modificados adecuados (tales como XdUTP, X = biotina, D1G o fluorescefna). Las enzimas de marcaje adecuadas incluyen ADN polimerasa (traslado de mellas) en 1SNT (quot;traslado de mellas in situquot;) y desoxinucleotidil transferasa terminal (marcaje de extremos) en TUNEL (quot;marcaje de extremos cortados por XdUTP mediado por TdTquot;; Huang, P. y Plunkett, W., 1992, Anal. Biochem. 207, 163; Bortner, C. D. et al., 1995, Trends Cell Biol. 5, 21).

La apoptosis tambien puede someterse a ensayo midiendo alteraciones de la membrana, incluyendo: perdida de residuos de acido sialico terminales de las cadenas laterales de glicoprotefnas de la superficie celular, exponiendo nuevos residuos de azucar; surgimiento de glicoprotefnas de superficie que pueden servir como receptores para moleculas adhesivas secretadas por macrofagos tales como trombospondina; y perdida de asimetrfa en fosfolfpidos de la membrana celular, alterando tanto la hidrofobicidad como la carga de la superficie de la membrana. En particular, la anexina V anticoagulante humana es una protefna de union a fosfolfpidos dependiente de Ca2�, de 3536 kilodalton que tiene una alta afinidad por fosfatidilserina (PS). En celulas viables normales, PS esta ubicada en la superficie citoplasmatica de la membrana celular. Sin embargo, en celulas apoptoticas, PS se transloca desde la cara interna hasta la externa de la membrana plasmatica, exponiendose por tanto PS al entorno celular externo. Por tanto, puede usarse anexina V para detectar fosfatidilserina expuesta de manera asimetrica en la superficie de celulas apoptoticas (Homburg, C. H. E. et al. 1995, Blood 85, 532; Verhoven, B. et al., 1995, J. Exp. Med. 182, 1597). Ademas, pueden usarse tintes de ADN tales como DAP1, bromuro de etidio y yoduro de propidio, etc. para la tincion diferencial para distinguir celulas viables y no viables. Tambien pueden usarse perfiles del contenido en ADN; por tanto, celulas apoptoticas permeabilizadas dejan escapar ADN de bajo peso molecular, y la deteccion de quot;picos subG 1quot;, o celulas quot;A 0quot; (celulas con tincion de ADN inferior que la de celulas de G 1) puede detectarse mediante, por ejemplo, citometrfa de flujo. Tambien pueden detectarse cambios morfologicos caracterfsticos de apoptosis de esta manera.

Tambien puede usarse para someter a ensayo la apoptosis la deteccion de protefnas relacionadas con apoptosis tales como ced3, ced4, ced9 (Ellis, H. M. y Horvitz, H. R, 1986, Cell 44, 817829; Yuan, J. Y. y Horvitz, H. R., 1990, Dev. Biol. 138, 3341; Hentgartner, M. O., Ellis, R E. y Horvitz, H. R, 1992, Nature 356, 494499.), Fas (CD95/Apo1; Enari et al., 1996, Nature 380, 723726), Bcl2 (Baffy, G. et al., 1993, J. Biol. Chem. 268, 65116519; Miyashita, T. y Reed, J. C., 1993, Blood 81, 151157; Oltvai, Z. N., Milliman, C. L. y Korsmeyer, S. J., 1993, Cell 74, 609619), p53 (YonishRouach, E. et al., 1991, Nature 352, 345347), etc. mediante el uso de anticuerpos.

Otras indicaciones

Los hallazgos mostrados en los ejemplos apoyan un papel terapeutico de rSPD (N/CRD) en enfermedades en las que la regulacion o el aclaramiento defectuoso de macrofagos alveolares apoptoticos y necroticos contribuye a la inflamacion pulmonar cronica. Los ejemplos de tales indicaciones se comentaron anteriormente, en particular, el entorno de deficiencia de SPD relativa tal como enfermedad pulmonar cronica del recien nacido prematuro y en fumadores (que tienen niveles de SPD disminuidos) que corren el riesgo de desarrollar enfisema debido a inflamacion pulmonar cronica.

Los datos presentados en los ejemplos muestran que SPD esta implicada en la regulacion y el aclaramiento de celulas apoptoticas, y que puede usarse polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD) o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo para potenciar el aclaramiento de celulas apoptoticas tales como macrofagos alveolares apoptoticos. Por consiguiente, puede usarse polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD) o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo para tratar aterosclerosis, anomalfas del desarrollo, por ejemplo, desarrollo pulmonar posnatal anomalo en enfermedad pulmonar neonatal tras parto prematuro, una enfermedad asociada a remodelacion defectuosa de tejidos inflamados, proliferacion celular y cancer.

Aterosclerosis

La aterosclerosis es una enfermedad multifactorial basada en la accion de diversos factores de riesgo que se hacen efectivos con antecedentes geneticos apropiados. La aterosclerosis se caracteriza por la formacion de celulas espumosas (es decir, macrofagos y celulas de musculo liso que han captado lipoprotefnas de baja densidad modificadas qufmicamente, por ejemplo, oxidadas (oxLDL). Se ha demostrado el fenotipo pulmonar de ratones deficientes en SPD, tal como se muestra en los ejemplos, en particular que los macrofagos son altamente anomalos y espumosos y hay alteraciones del recambio de fosfolfpidos en el pulmon. Se sabe que SPD esta presente en cantidades apreciables en el suero, especialmente en determinados estados patologicos.

Por tanto, se proporciona que la alteracion del recambio de lfpidos en el suero confiere un aumento del riesgo de aterosclerosis. Por consiguiente, puede usarse rSPD (N/CRD) para tratar la aterosclerosis.

Se han medido los niveles de colesterol en el suero de ratones deficientes y de tipo natural y muestran que los niveles de colesterol son superiores en ratones deficientes (vease la figura 17). Se sabe que altos niveles de colesterol confieren un aumento del riesgo de aterosclerosis. Por tanto, se da a conocer que la complementacion con SPD recombinante, por ejemplo, rSPD (N/CRD) por vfa intravenosa, corrige esta anomalfa.

Ademas, se ha mostrado recientemente que la apoptosis desempefa un papel principal en la modulacion de la generacion de lesiones ateroscleroticas en celulas vasculares (Martinet W, Kockx MM. Apoptosis in atherosclerosis: focus on oxidized lipids and inflammation. Curr Opin Lipidol. Octubre de 2001; 12(5):53541; Kockx MM, Herman AG. Apoptosis in atherosclerosis: beneficial or detrimental� Cardiovasc Res. Febrero de 2000; 45(3):73646). La apoptosis de macrofagos podrfa ser beneficiosa para la estabilidad de las placas siempre que se eliminen los cuerpos apoptoticos. Sin embargo, las celulas apoptoticas que no se eliminan en la placa activan la trombina, lo que podrfa inducir adicionalmente trombosis dentro de las placas. Puede concluirse que la apoptosis en aterosclerosis primaria es perjudicial puesto que podrfa conducir a rotura de placas y trombosis. Se muestra en los ejemplos que el tratamiento con SPD recombinante reduce los numeros de macrofagos apoptoticos en los pulmones de ratones deficientes en SPD.

Por tanto, una posible aplicacion de SPD recombinante administrada por vfa intravenosa es la reduccion de celulas apoptoticas perjudiciales (por ejemplo macrofagos) en la vasculatura, que puede reducir el riesgo de desarrollo de aterosclerosis. Por tanto, puede usarse rSPD (N/CRD) para tratar o prevenir uno cualquiera o mas de los sfntomas de aterosclerosis.

Composiciones farmaceuticas

Se observa que pueden producirse polipeptidos de rSPD(n/CRD) en grandes cantidades a bajo coste en una forma bioactiva, permitiendo por primera vez el desarrollo de formulaciones de tensioactivo que contienen rSPD (N/CRD) o de la administracion conjunta de rSPD (N/CRD) por separado mediante aerosolizacion, nebulizacion, administracion intranasal o intratraqueal. La preparacion es estable y mantiene su bioactividad tras el secado por congelacion y la resuspension, facilitando su almacenamiento. A diferencia de la terapia actual con corticosteroides que tienen efectos secundarios sistemicos no deseados, rSPD (N/CRD) parece no tener efectos adversos en ratones y no es probable que genere efectos secundarios en seres humanos.

Aunque es posible que la composicion que comprende el polipeptido o acido nucleico de rSPD(n/CRD) se administre sola, es preferible formular el principio activo como una formulacion farmaceutica. Por tanto, se dan a conocer composiciones farmaceuticas que comprenden polipeptido o acido nucleico de rSPD(n/CRD) o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo. Tales composiciones farmaceuticas son utiles para la administracion de polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD), fragmento, homologo, variante o derivado del mismo a un individuo para el tratamiento o alivio de sfntomas tal como se describe.

La composicion puede incluir el polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD), fragmento, homologo, variante o derivado del mismo, un compuesto estructuralmente relacionado o una sal acida del mismo. Las formulaciones farmaceuticas comprenden una cantidad eficaz de polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD), fragmento, homologo, variante o derivado del mismo, junto con uno o mas portadores farmaceuticamente aceptables. Una quot;cantidad eficazquot; de un polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD), homologo, variante o derivado del mismo es la cantidad suficiente para aliviar al menos un sfntoma de una enfermedad tal como se describe, por ejemplo, una enfermedad inflamatoria, preferiblemente eccema, una enfermedad pulmonar inflamatoria, enfermedad pulmonar cronica neonatal, sfndrome de dificultad respiratoria neonatal (SDR), sfndrome de dificultad respiratoria del adulto, enfermedad obstructiva cronica de las vfas respiratorias (EPOC), asma, fibrosis qufstica, fibrosis pulmonar, enfisema, enfermedad pulmonar inflamatoria intersticial, sarcoidosis, neumonfa, enfermedad pulmonar inflamatoria cronica, enfermedad pulmonar inflamatoria cronica neonatal, una alergia, alergia a acaros del polvo domestico (Dermatophagoides spp), preferiblemente Dermatophagoides pteronyssinus o Dermatophagoides farinae, o a hongos o esporas fungicas, preferiblemente Aspergillus fumigatus, una alergia respiratoria estacional, rinitis alergica, fiebre del heno, rinitis no alergica, rinitis vasomotora, rinitis irritante, una alergia contra polenes de hierbas, polenes de arboles o caspa de animales, una alergia asociada a asma alergica, una alergia alimentaria, infeccion microbiana, incluyendo infeccion bacteriana e infeccion viral, preferiblemente una infeccion microbiana del pulmon.

La cantidad eficaz variara dependiendo del sfndrome o enfermedad particular que va a tratarse o aliviarse, asf como otros factores incluyendo la edad y el peso del paciente, como de avanzado este el estado patologico, la salud general del paciente, la gravedad de los sfntomas y si el polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD), fragmento, homologo, variante o derivado del mismo esta administrandose solo o en combinacion con otras terapias.

Se conocen bien en la tecnica portadores farmaceuticamente aceptables y varfan con la forma y el modo deseados de administracion de la formulacion farmaceutica. Por ejemplo, pueden incluir diluyentes o excipientes tales como cargas, aglutinantes, agentes humectantes, disgregantes, agentes tensioactivos, lubricantes y similares. Normalmente, el portador es un solido, un lfquido o un portador vaporizable, o una combinacion de los mismos. Cada portador debe ser quot;aceptablequot; en el sentido de ser compatible con los otros componentes en la formulacion y no perjudicial para el paciente. El portador debe ser biologicamente aceptable sin provocar una reaccion adversa (por ejemplo respuesta inmunitaria) cuando se administra al huesped.

Las composiciones farmaceuticas dadas a conocer en el presente documento incluyen las adecuadas para administracion topica y oral, prefiriendose formulaciones topicas en las que el tejido afectado es principalmente la piel o epidermis (por ejemplo, psoriasis, eccema y otras enfermedades epidermicas). Las formulaciones topicas incluyen aquellas formas farmaceuticas en la que la composicion se aplica externamente mediante contacto directo con la superficie de la piel que va a tratarse. Una forma farmaceutica convencional para aplicacion topica incluye una impregnacion, una pomada, una crema, una locion, una pasta, un gel, una barra, un pulverizador, un aerosol, un bafo de aceite, una disolucion y similares. La terapia topica se administra mediante diversos vehfculos, la eleccion del vehfculo puede ser importante y generalmente esta relacionada con si va a tratarse una enfermedad aguda o cronica. Como ejemplo, una enfermedad de proliferacion de la piel aguda se trata generalmente con preparaciones secantes acuosas, mientras que una enfermedad de proliferacion de la piel cronica se trata con preparaciones hidratantes. Las impregnaciones son el metodo mas facil de secar erupciones humedas agudas. Las lociones (polvo en suspension acuosa) y disoluciones (medicamentos disueltos en un disolvente) son ideales para zonas vellosas e intertriginosas. Las pomadas son emulsiones de agua en aceite, son las mas eficaces para agentes hidratantes, apropiadas para erupciones escamosas secas, pero son grasientas y dependiendo del sitio de la lesion algunas veces no se desean. Segun sea apropiado, pueden aplicarse en combinacion con un vendaje, particularmente cuando se desea aumentar la penetracion de la composicion de agente al interior de la lesion. Las cremas o emulsiones de aceite en agua y los geles son absorbibles y son los mas cosmeticamente aceptables para el paciente. (Guzzo et al, en Goodman & Gilman's Pharmacological Basis of Therapeutics, 9� ed., pags. 159315950 (1996)). Las formulaciones de crema incluyen generalmente componentes tales como vaselina, lanolina, polietilenglicoles, aceite mineral, glicerina, palmitato de isopropilo, estearato de glicerilo, alcohol cetearflico, acetato de tocoferilo, miristato de isopropilo, alcohol de lanolina, simeticona, carbomen, metilclorisotiazolinona, metilisotiazolinona, ciclometicona e hidroxipropilmetilcelulosa, asf como mezclas de los mismos.

Otras formulaciones para aplicacion topica incluyen champus, jabones, lociones para agitar, y similares, particularmente las formuladas para dejar un residuo sobre la piel subyacente, tal como el cuero cabelludo (Arndt et al, en Dermatology 1n General Medicine 2:2838 (1993)).

En general, la concentracion de la composicion de polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD), fragmento, homologo, variante o derivado del mismo en la formulacion topica esta en una cantidad de aproximadamente el 0,5 al 50% en peso de la composicion, preferiblemente de aproximadamente el 1 al 30%, mas preferiblemente de aproximadamente el 220%, y lo mas preferiblemente de aproximadamente el 510%. La concentracion usada puede ser la parte superior del intervalo inicialmente, a medida que el tratamiento continua, la concentracion puede disminuirse o la aplicacion de la formulacion puede ser menos frecuente. Las aplicaciones topicas se aplican a menudo dos veces al dfa. Sin embargo; puede ser eficaz la aplicacion una vez al dfa de una dosis mayor o aplicaciones mas frecuentes de una dosis mas pequefa. El estrato corneo puede actuar como reservorio y permitir una penetracion gradual de un farmaco en las capas de la piel viable a lo largo de un periodo de tiempo prolongado.

En una aplicacion topica, debe penetrar una cantidad suficiente de principio activo en la piel de un paciente con el fin de obtener un efecto farmacologico deseado. Se entiende generalmente que la absorcion del farmaco en la piel es una funcion de la naturaleza del farmaco, el comportamiento del vehfculo y la piel. Tres variables principales explican las diferencias en la tasa de absorcion o flujo de diferentes farmacos topicos o el mismo farmaco en diferentes vehfculos; la concentracion de farmaco en el vehfculo, el coeficiente de reparto del farmaco entre el estrato corneo y el vehfculo y el coeficiente de difusion del farmaco en el estrato corneo. Para que el tratamiento sea eficaz, un farmaco debe cruzar el estrato corneo que es responsable de la funcion de barrera de la piel. En general, una formulacion topica que ejerce una alta penetracion en la piel in vitro es eficaz in vivo. Ostrenga et al (J. Pharm. Sci., 60:11751179 (1971) demostraron que la eficacia in vivo de esteroides aplicados por vfa topica era proporcional a la tasa de penetracion de esteroides en piel humana dermatomizada in vitro.

Puede incorporarse en la formulacion un potenciador de la penetracion en la piel que es dermatologicamente aceptable y compatible con el agente para aumentar la penetracion del/de los compuesto(s) activo(s) desde la superficie de la piel a los queratinocitos epidermicos. Un potenciador de la piel que aumenta la absorcion del/de los compuesto(s) activo(s) en la piel reduce la cantidad de agente necesaria para un tratamiento eficaz y proporciona un efecto de mas larga duracion de la formulacion. Se conocen bien en la tecnica potenciadores de la penetracion en la piel. Por ejemplo, dimetilsulfoxido (patente estadounidense n.° 3.711.602); acido oleico, tensioactivo de 1,2butanodiol (Cooper, J. Pharm. Sci., 73:11531156 (1984)); una combinacion de etanol y acido oleico o alcohol oleflico (documento EP 267,617), 2etil1,3hexanodiol (documento WO 87/03490); decilmetilsulfoxido y Azone.RTM. (Hadgraft, Eur. J. Drug. Metab. Pharmacokinet, 21:165173 (1996)); alcoholes, sulfoxidos, acidos grasos, esteres, Azone.RTM., pirrolidonas, urea y polioles (Kalbitz et al, Pharmazie, 51:619637 (1996)).

Se sabe que terpenos tales como 1,8cineol, mentona, limoneno y nerolidol (Yamane, J. Pharmacy & Pharmocology, 47: 978989 (1995)); Azone.RTM. y Transcutol (Harrison et al, Pharmaceutical Res. 13:542546 (1996)); y acido oleico, polietilenglicol y propilenglicol (Singh et al, Pharmazie, 51:741744 (1996)) mejoran la penetracion en la piel de un principio activo.

Los niveles de penetracion de un agente o composicion pueden determinarse mediante tecnicas conocidas por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, el radiomarcaje del compuesto activo seguido por la medicion de la cantidad de compuesto radiomarcado absorbida por la piel permite a un experto en la tecnica determinar los niveles de la composicion absorbidos usando cualquiera de varios metodos de determinacion de la penetracion en la piel del compuesto de prueba. Las publicaciones que se refieren a estudios de penetracion en la piel incluyen Reinfenrath, W G y G S Hawkins. The Weaning Yorkshire Pig as an Animal Model for Measuring Percutaneous Penetration. En: Swine in Biomedical Research (M.

E. Tumbleson, Ed.) Plenum, Nueva York, 1986, y Hawkins, G. S. Methodology for the Execution of 1n Vitro Skin Penetration Determinations. En: Methods for Skin Absorption, B W Kemppainen y W G Reifenrath, Eds., CRC Press, Boca Raton, 1990, pags. 6780; y W. G. Reifenrath, Cosmetics & Toiletries, 110:39 (1995).

Para algunas aplicaciones, es preferible administrar una forma de agente o composicion de accion prolongada usando formulaciones conocidas en la tecnica, ta

les como polfmeros. El agente puede incorporarse en un parche dermico (Junginger, H. E., en Acta Pharmaceutica Nordica 4:117 (1992); Thacharodi et al, en Biomaterials 16:145148 (1995); Niedner R, en Hautarzt 39: 761766 (1988)) o un vendaje segun metodos conocidos en la tecnica, para aumentar la eficacia de administracion del farmaco a las zonas que van a tratarse.

Opcionalmente, las formulaciones topicas dadas a conocer en el presente documento pueden tener excipientes adicionales por ejemplo; conservantes tales como metilparabeno, alcohol bencflico, acido sorbico o compuesto de amonio cuaternario; estabilizadores tales como EDTA, antioxidantes tales como hidroxitolueno butilado o hidroxianisol butilado y tampones tales como citrato y fosfato.

La composicion farmaceutica puede administrarse en una formulacion oral en forma de comprimidos, capsulas o disoluciones. Se administra una cantidad eficaz de la formulacion oral a pacientes de 1 a 3 veces al dfa hasta que los sfntomas de la enfermedad se alivian. La cantidad eficaz de agente depende de la edad, el peso y el estado de un paciente. En general, la dosis oral diaria de agente es inferior a 1200 mg, y superior a 100 mg. La dosis oral diaria preferida es de aproximadamente 300600 mg. Se presentan convenientemente formulaciones orales en una forma farmaceutica unitaria y pueden prepararse mediante cualquier metodo conocido en la tecnica de farmacia. La composicion puede formularse junto con un portador farmaceuticamente aceptable para dar cualquier forma farmaceutica deseada. Las formas farmaceuticas unitarias tfpicas incluyen comprimidos, pfldoras, polvos, disoluciones, suspensiones, emulsiones, granulos, capsulas, supositorios. En general, las formulaciones se preparan poniendo en asociacion de manera uniforma e fntima la composicion de agente con portadores lfquidos o portadores solidos finamente divididos o ambos, y cuando sea necesario, conformando el producto. El principio activo puede incorporarse en una variedad de materiales basicos en forma de un lfquido, polvo, comprimidos o capsulas para proporcionar una cantidad eficaz de principio activo para tratar la enfermedad.

Otros agentes terapeuticos adecuados para su uso en el presente documento son cualquier farmaco compatible que sea eficaz para el fin previsto, o farmacos que son complementarios a la formulacion de agente. La formulacion utilizada en una terapia de combinacion puede administrarse simultaneamente, o secuencialmente con otro tratamiento, de manera que se logra un efecto combinado.

Composiciones de terapia con tensioactivo

El desarrollo de terapias con tensioactivo que contienen rSPD (N/CRD) puede aplicarse al tratamiento de sfndrome de dificultad respiratoria neonatal, en lugar de formulaciones actuales o conjuntamente con formulaciones actuales.

La terapia con tensioactivo actual para el sfndrome de dificultad respiratoria del recien nacido incluye las siguientes:

Beractant (Survanta)

Beractant (Survanta) es un extracto de pulmon bovino semisintetico que contiene fosfolfpidos, acidos grasos y protefnas B (7 mcg/ml) y C (203 mcg/ml) asociadas a tensioactivo. Beractant se administra a una dosis pediatrica de 100 mg (es decir, 4 ml)/kg dividida en 4 alfcuotas administradas con una separacion de al menos 6 h (intratraqueal).

Calfactant (1nfasurf)

Calfactant (1nfasurf) es un extracto de pulmon de ternero natural que contiene fosfolfpidos, acidos grasos y protefnas B asociadas a tensioactivo. Se fabrica por Ross, y se administra a (260 mcg/ml) y C (390 mcg/ml).

SURVANTA� (beractant) suspension intratraqueal

SURVANTA� (beractant) es un tensioactivo pulmonar no pirogenico, esteril destinado a uso intratraqueal. Es un extracto de pulmon bovino natural que contiene fosfolfpidos, lfpidos neutros, acidos grasos y protefnas asociadas a tensioactivo al que se afaden palmitato de colfoscerilo (dipalmitoilfosfatidilcolina), acido palmftico y tripalmitina para normalizar la composicion e imitar las propiedades de reduccion de la tension superficial de tensioactivo de pulmon natural. La composicion resultante proporciona fosfolfpidos 25 mg/ml (incluyendo fosfatidilcolina disaturada 11,015,5 mg/ml), trigliceridos 0,51,75 mg/ml, acidos grasos libres 1,43,5 mg/ml y menos de 1,0 mg/ml de protefna. Se suspende en disolucion de cloruro de sodio al 0,9%, y se esteriliza por calor. SURVANTA no contiene conservantes. Su contenido en protefna consiste en dos protefnas asociadas a tensioactivo hidrofobas, de bajo peso molecular conocidas comunmente como SPB y SPC. No contiene la protefna asociada a tensioactivo hidrofila, de gran peso molecular conocida como SPA.

1NFRASURF suspension intratraqueal (Forest)

1nfasurf� (calfactant) suspension intratraqueal es un tensioactivo de pulmon no pirogenico, esteril destinado a instilacion intratraqueal solo. Es un extracto de tensioactivo natural de pulmones de ternero que incluye fosfolfpidos, lfpidos neutros y protefnas B y C asociadas a tensioactivo (SPB y SPC). No contiene conservantes.

1nfasurf es una suspension de color blanquecino de calfactant en disolucion de cloruro de sodio acuosa al 0,9%. Tiene un pH de 5,0 6,0. Cada mililitro de 1nfasurf contiene 35 mg de fosfolfpidos totales (incluyendo 26 mg de fosfatidilcolina de los que 16 mg son fosfatidilcolina disaturada) y 0,65 mg de protefnas incluyendo 0,26 mg de SPB.

EXOSURF Neonatal para suspension intratraqueal (Glaxo Wellcome)

EXOSURF NEONATAL (palmitato de colfoscerilo, alcohol cetflico, tiloxapol) para suspension intratraqueal es un tensioactivo de pulmon sintetico libre de protefnas almacenado a vacfo como un polvo liofilizado esteril. EXOSURF NEONATAL se reconstituye con agua esteril para inyeccion libre de conservantes antes de su administracion mediante instilacion intratraqueal. Cada vial de 10 ml contiene 108 mg de palmitato de colfoscerilo, comunmente conocido como dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), 12 mg de alcohol cetflico, 8 mg de tiloxapol y 47 mg de cloruro de sodio. Pueden haberse afadido hidroxido de sodio o acido clorhfdrico para ajustar el pH. Cuando se reconstituye con 8 ml de agua esteril para inyeccion, la suspension de EXOSURF NEONATAL contiene palmitato de colfoscerilo 13,5 mg/ml, alcohol cetflico 1,5 mg/ml y tiloxapol 1 mg/ml en NaCl 0,1 N. La suspension aparece de color blanco lechoso con un pH de 5 a 7 y una osmolalidad de 185 mOsm/kg.

Los nombres qufmicos de los compuestos de EXOSURF NEONATAL son los siguientes: palmitato de colfoscerilo: sal interna de hidroxido de (R)4hidroxiN,N,N trimetil10oxo7�(1oxohexadecil)oxi�3,5,9trioxa4fosfapentacosan1aminio, 4oxido; alcohol cetflico: (1hexadecanol); y tiloxapol: polfmero de 4(1,1,3,3tetrametilbutil)fenol con formaldehfdo y oxirano.

En EXOSURF NEONATAL, que esta libre de protefnas, el alcohol cetflico actua como agente de extension para el DPPC en la superficie de contacto airelfquido. Tiloxapol, un alcohol de repeticion de cadena larga polimerico, es un tensioactivo no ionico que actua dispersando tanto DPPC como alcohol cetflico. Se afade cloruro de sodio para ajustar la osmolalidad.

CUROSURF�

Nombre comercial: Curosurf. Principio activo: poractant alfa. Concentracion/concentraciones: 120 mg de fosfolfpido/1,5 ml o 240 mg de fosfolfpido/viales de 3 ml. Forma(s) farmaceutica(s): Suspension intratecal. Nombre de la compaffa: Dey, LP. Disponibilidad: Solo con receta, para uso profesional solo. *Fecha de aprobacion por la FDA: 18 de noviembre de 1999.

Por consiguiente, se da a conocer el uso de composiciones que incluyen cualquiera de los componentes de las terapias dados a conocer anteriormente, preferiblemente un principio activo, conjuntamente con polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD) o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo, como terapia con tensioactivo. Por tanto, se da a conocer una composicion que comprende un extracto de pulmon junto con un polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD) o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo. El extracto de pulmon puede comprender un extracto de pulmon bovino, preferiblemente, de ternero junto con fosfolfpidos (tales como fosfatidilcolina y fosfatidilcolina disaturada) y/o acidos grasos. La composicion puede incluir ademas una protefna asociada a tensioactivo, por ejemplo una protefna B asociada a tensioactivo o una protefna C asociada a tensioactivo. Tambien pueden afadirse otros componentes tales como alcohol cetflico, alcoholes de repeticion de cadena larga, tiloxapol, palmitato de colfoscerilo (dipalmitoilfosfatidilcolina), acido palmftico y tripalmitina, poractant alfa y cloruro de sodio.

En particular, se dan a conocer composiciones correspondientes a cada uno de Beractant (Survanta); Calfactant (1nfasurf); SURVANTA� (beractant); 1NFRASURF; EXOSURF Neonatal; y CUROSURF; en las que cada composicion comprende ademas una cantidad terapeuticamente eficaz de un polipeptido, acido nucleico de rSPD(n/CRD) o un fragmento, homologo, variante o derivado del mismo.

Aspectos adicionales

Los aspectos adicionales incluyen los siguientes: Un metodo de potenciacion de los niveles de MCP1 o los niveles de M1P1 , o ambos, en un individuo, comprendiendo el metodo administrar al individuo un polipeptido de rSPD(n/CRD), fragmento, homologo, variante o derivado del mismo.

Un metodo de potenciacion de los niveles de citocinas, preferiblemente los niveles 5 de 1FN , en un individuo, comprendiendo el metodo administrar al individuo un polipeptido de rSPD(n/CRD), fragmento, homologo, variante o derivado del mismo.

Tambien se da a conocer un metodo de regulacion por incremento de un componente del sistema inmunitario mediado por celulas, o de regulacion por incremento de la actividad de celulas citotoxicas naturales, o ambos, en un individuo mediante

10 la administracion de un polipeptido de rSPD(n/CRD), fragmento, homologo, variante o derivado del mismo.

Ejemplos

15 Ejemplo 1. Materiales y Metodos

Fragmento de protefna tensioactiva D recombinante (rSPD (N/CRD))

El fragmento de protefna tensioactiva D recombinante (rSPD (N/CRD)) usado en

20 estos experimentos es una forma truncada de SPD humana. Se expresa el fragmento en E. coli a partir de un plasmido que contiene ADNc para el fragmento de SPD humana (el constructo) insertado en un vector pET y transformado en E. coli para su expresion usando procedimientos de fermentacion convencionales.

El constructo esta compuesto por un tramo corto de 8 tripletes GlyXaaYaa N

25 terminales (mostrado en cursiva) con una sustitucion de prolina por serina en la posicion 2 seguido por la region de cuello de 28 residuos (mostrada en negrita) y el dominio de reconocimiento de hidratos de carbono (CRD) de 125 residuos de SPD humana.

30 Se muestra en la figura 1A un diagrama esquematico que muestra la estructura de rSPD (N/CRD). (A): Dodecamero de protefna tensioactiva D; (B): Trfmero de SPD; (C): Diagrama de cintas de la estructura global de la region de cabezacuello de SPD.

Una secuencia de acido nucleico que codifica para un polipeptido de 35 rSPD(n/CRD) tiene la secuencia mostrada en SEQ 1D NO: 2.

Generacion de constructo de expresion de rSPD (N/CRD) en vector pET pET21d

Se corto una secuencia que codifica para la SPD humana (cuello/CRD) y que inclufa un tramo corto que codifica para 8 tripletes GlyXaaYaa Nterminales de un clon de SPD humana previamente generado pBCSK1 (Kishore, U., et al., The alphahelical neck region of human lung surfactant protein D is essential for the binding of the carbohydrate recognition domains to lipopolysaccharides and phospholipids. Biochem J, 1996. 318(Pt 2): pags. 50511) mediante digestion con Xba 1 y Hind3. Se purifica entonces el fragmento resultante mediante electroforesis en agarosa y se liga en un vector pET21d (Novagen) que se digiere con Nhe1 y Hind 3. El vector pET21d esta disponible de Novagen con el numero de catalogo 697433. Su secuencia se conoce en la tecnica, y se describe en, por ejemplo, bibliograffa de Novagen (por ejemplo, tal como se encuentra en http://www.novagen.com/).

Preparacion de rSPD (N/CRD)

Se uso entonces el nuevo constructo asf generado para transformar celulas com petentes (DH5 ). Se purifica ADN de plasmido que comprende este constructo rSPD(cuello/CRD) tras crecimiento de celulas a partir de una colonia transformada mediante metodos convencionales.

Se transforma el plasmido que contiene ADNc para rSPD(n/CRD) (cuello/CRD) en un vector pET en BL21( DE3) pLysS y se selecciona una unica colonia y se diluye en 1 ml de LB complementado con ampicilina 100 g/ml y cloranfenicol 25 g/ml (LB�). Esto se diluye adicionalmente 1000 veces y se extienden 100 sobre una placa de agar y se incuban durante la noche. Se recoge el cultivo resultante de colonias mediante raspado con una espatula con cuchilla plana y se resuspenden en 50 ml de LB�. Se usa una alfcuota de 5 ml de esto para inocular frascos de 2 l que contienen 500 ml de LB�. Se encuentra que este procedimiento es superior a la practica mas comun de hacer crecer un cultivo durante la noche en medio de crecimiento. El crecimiento de colonias en una fase estacionaria reduce el contacto entre celulas y reduce la proporcion de mutantes en el inoculo que no portan el plasmido de expresion.

Tambien se encuentra que es importante no superar 500 ml de LB/2 l de frasco con el fin de lograr niveles de expresion optimos.

Se hacen crecer los cultivos a A600 de 0,60,8 seguido por induccion con 1PTG 0,4 mM durante 23 h.

Purificacion del fragmento de protefna tensioactiva D recombinante rSPD (N/CRD)

Se recogen celulas mediante centrifugacion y se lisan en TrisHCl 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, Triton X100 0,1% v/v, PMSF 0,1 mM, pH 7,5 y se sonican durante 3 minutos. Se expresa el rSPD(n/CRD) en cuerpos de inclusion insolubles y se recoge mediante centrifugacion a 10000 x g. Se repite esta etapa tres veces y se solubilizo el sedimento de cuerpos de inclusion purificados, que contenfan el rSPD(n/CRD), en 100 ml de urea 8 M, 2mercaptoetanol 100 mM, pH 7,5 y se clarifico mediante centrifugacion a alta velocidad.

Se diluye la disolucion de urea en 1 l de TrisHCl 20 mM, pH 7,5 y se afaden 50 ml de resina de intercambio anionico QSepherose (Pharmacia) y se mezcla a 20°C durante 30 min. Se adsorbio la resina en una columna FPLC, se lavo extensamente con TrisHCl 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5, y se eluye el rSPD(n/CRD) con TrisHCl 50 mM, NaCl 500 mM, pH 7,5.

Se precipita la protefna de las fracciones pico mediante una dilucion 10:1 en acetona a 4°C durante 30 min. Se recoge el precipitado mediante centrifugacion a alta velocidad y se disuelve en 100 ml de urea 8 M y se dializa frente a 10 l de TrisHCl 20 mM, NaCl 130 mM, CaCl2 2 mM, pH 7,4, durante la noche a 4°C.

Se mezcla entonces el dializado con 20 ml de maltosaagarosa durante varias horas hasta durante la noche en TrisHCl 20 mM, CaCl2 10 mM, pH 7,4. Esta etapa de incubacion larga facilita probablemente las fases finales de replegamiento para dar la protefna activa.

Se empaqueta la maltosaagarosa en una columna FPLC y se lava con el mismo tampon que contiene NaCl 1 M para eliminar protefnas no especfficas. El lavado con alta concentracion de sal eluye aproximadamente el 2550% del material absorbente a DO280 total unido a la columna. SDSPAGE muestra trazas de rSPD(n/CRD) (aproximadamente el 10%), que es presumiblemente rSPD(n/CRD) de baja afinidad que no puede plegarse completamente para dar la estructura tridimensional correcta. Puesto que estas preparaciones de rSPD(n/CRD) van a usarse en estudios estructurales y en experimentos en ratones, se considera aconsejable no incluir esta fraccion. Ademas, el material absorbente a DO280 total en la alta concentracion de sal es bastante mas de lo que podrfa atribuirse a este rSPD(n/CRD) y se debe probablemente a ADN bacteriano y otras sustancias que se consideran no deseables en una preparacion para administrar a animales.

Se eluyo entonces el rSPD(n/CRD) unido con TrisHCl 20 mM, NaCl 150 mM, azida de sodio al 0,02% (p/v) pH 7,4, que contenfa EDTA 5 mM para eliminar el Ca requerido para la union mediada por CRD de rSPD(n/CRD).

Se concentran las fracciones pico usando una celula con agitacion Amicon con una membrana de MWCO 10000 hasta 5 ml y se cargan sobre una columna de filtracion en gel Superose 12 de 100 ml (Pharmacia) en un tampon de ejecucion de TrisHCl 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, azida de sodio al 0,02% (p/v) pH 7,4. El rSPD(n/CRD) eluyo como un unico pico correspondiente a un peso molecular de 60 kDa.

Esta etapa permite la disociacion final de cualquier impureza que podrfa haberse purificado conjuntamente hasta esta fase y en presencia de EDTA cualquier hidrato de carbono se disociara del rSPD(n/CRD) y se esperarfa que se eluyese en el volumen de inclusion total de la columna (100 ml) puesto que deben tener un peso molecular inferior.

Esta etapa tambien permite una evaluacion de la homogeneidad de la preparacion de protefna mediante la asimetrfa del pico de protefna y la ausencia de hombros. Se desechan las fracciones fuera del pico principal. Se recogen las fracciones agrupadas y se concentran hasta 2 mg/ml antes de proceder a la siguiente etapa.

La recuperacion de rSPD(n/CRD) tras la filtracion en gel es normalmente del 80% del material absorbente a DO280 total cargado. Esto indica que al menos el 20% de este no se debe a rSPD (n/CRD) y refuerza la necesidad de incluir la filtracion en gel como etapa final.

Se reducen los niveles de endotoxina haciendo pasar el rSPD(n/CRD) purificado en TrisHCl 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, azida de sodio al 0,02% (p/v) pH 7,4 a traves de una columna de polimixina B de 10 ml (DetoxiGel, Pierce).

Modificacion de rSPD mediante marcaje con F1TC

Para evaluar la union in vitro a macrofagos aislados mediante BAL de ratones, se marca rSPD con la sonda reactiva con amina F1TC (Sigma) segun las instruccio nes del fabricante. En resumen, se incuban 50 g de F1TC con 1 mg de rSPD en 200 ml de tampon bicarbonato de sodio 0,1 M pH 9,0 a temperatura ambiente durante 2 horas.

Se separa entonces la protefna marcada de F1TC libre usando una columna G25. Se incuba F1TCrSPD (20 g/ml) con macrofagos alveolares recien aislados de ratones deficientes en SPD y de tipo natural en tampon de union (Hepes 10 mM, NaCl 140 mM, CaCl2 2,5 mM) y se evalua para determinar el comarcaje con anexina V marcada con PE o yoduro de propidio tal como se explica resumidamente a continuacion mediante citometrfa de flujo en un sistema de FACS Consort 32.

Preparacion de antfgeno de Aspergillus fumigatus (Afu 1wcf)

Se hace crecer Aspergillus fumigatus (Afu) en un medio sintetico (M199, Sigma Chemicals) como un cultivo estacionario durante 1 semana a 37°C. Arrunda, et al., (Arruda, L. K., B. J. Mann, y M. D. Chapman. 1992. Selective expression of a major allergen and cytotoxin, Asp f 1, in Aspergillus fumigatus. 1mplications for the immunopathogenesis of Aspergillusrelated enfermedades. J 1mmunol. 149:33549) demuestran que la expresion de Asp f1, un alergeno principal, es maxima tras 1 semana y tiende a disminuir durante periodos de incubacion mas largos.

Se destruye el cultivo de 1 semana afadiendo timerosal al 0,1% durante 12 horas. Se filtra el cultivo a traves de lana de vidrio y finalmente a traves de una membra na de 0,45 m para eliminar todos los materiales particulados y posibles esporas y entonces se dializa con 3 cambios de tampon frente a agua. Se liofiliza el dializado para dar un polvo marron.

Hay una banda principal a 18 kDa, que corresponde a Asp f 1. Tambien es evidente una banda correspondiente a Asp f 2 (37 kDa). Se secuencia el extremo Nterminal de la banda de 18 kDa dando la secuencia ATWTC1NQQLNP, correspondiente a la secuencia Nterminal para Asp f 1.

Se demuestra tambien mediante EL1SA que el filtrado de cultivo de 1 semana (1wcf) se reconoce por suero humano de pacientes alergicos a Afu obtenido del National 1nstitute of Biological Standards and Control.

Cepas transgenicas

Se ha notificado previamente la generacion de ratones deficientes en SPD con direccionamiento genico (Botas, C., Poulain, F., Akiyama, J., Brown, C., Allen, L., Goerke, J., Clements, J., Carlson, E., Gillespie, A. M., Epstein, C. y Hawgood, S. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95, 1186974.).

Se alimentan a voluntad ratones deficientes en SPD retrocruzados 10 generaciones en un antecedente de C57B16 y se albergan en aisladores en un entorno libre de patogenos en la Biomedical Services Unit, Universidad de Oxford. Se obtienen ratones de tipo natural C57B16 libres de patogenos para experimentos de control de HarlanOLAC, Shaw's farm, Bicester, Oxfordshire. Se aprueban todos los protocolos experimentales por la autoridad en materia de licencias de la U.K. Home Office y por el Comite de Etica de la Universidad de Oxford.

Administracion de rSPD, rSPA y albumina serica bovina (BSA)

Se sometieron ratones deficientes en SPD de 6 semanas de edad a multiples administraciones intranasales de protefna o PBS solo a lo largo de un periodo de 36 semanas usando uno de tres protocolos.

ta esteril. Se sujetan los ratones erguidos tras cada dosis hasta que se inhala todo el fluido. En el primer protocolo de tratamiento, doce ratones recibieron dosis de 30 g de rSPD cada tres dfas desde la edad de seis semanas. Se sacrifican seis ratones tras tres semanas para el ensayo del numero de macrofagos alveolares y el contenido en fosfolfpido alveolar. Los seis ratones restantes en el grupo de tratamiento completaron seis semanas de tratamiento antes del sacrificio y ensayo. En el segundo protocolo de tratamiento, se tratan los ratones desde la edad de 12 semanas con dosis de 10 g de rSPD, rSPA, BSA cinco veces a la semana durante tres semanas antes del sacrificio y ensayo. Controles adicionales son ratones no tratados y ratones tratados con PBS. Para evaluar el efecto del tratamiento desde la edad de cuatro semanas, antes de que se produzca un aumento significativo en los numeros de macrofagos alveolares, se tratan seis ratones en un ter cer protocolo durante dos semanas con dosis de 30 g de rSPD. Se sacrifican estos ratones a la edad de seis semanas para el ensayo de fosfolfpidos y numeros de macrofagos alveolares, y se comparan con controles de edad coincidente no tratados.

Lavado broncoalveolar (BAL)

Para el aislamiento de macrofagos alveolares (por ejemplo para un ensayo de apoptosis), se sacrifican 46 ratones en cada grupo de tratamiento mediante asfixia con dioxido de carbono y se someten a lavado broncoalveolar (BAL) con RPM1 esteril.

Se inserta una canula esteril en la traquea y se ata en su posicion con hilo. Usando una jeringuilla de 2 ml, se lavan los pulmones con volumenes de 1 ml de tampon de lavado, cuatro veces para producir un volumen de lavado total de aproximadamente 3 ml. Se centrifuga entonces el lfquido de BAL a 250 g durante 5 minutos a temperatura ambiente para sedimentar los macrofagos alveolares. Se lavan las celulas mediante resuspension en 1 ml de PBS y se sedimentan de nuevo mediante centrifugacion en una centrffuga de mesa a 1000 rpm durante 2 minutos. Se resuspenden entonces las celulas y se incuban con anexina V marcada con F1TC y yoduro de propidio durante 10 minutos. Se analizan entonces las muestras para detectar la tincion mediante citometrfa de flujo de FACS.

Preparaciones de citocentrifugacion de macrofagos alveolares

Se resuspenden macrofagos alveolares aislados mediante lavado broncoalveolar usando PBS con EDTA 0,25 mM y centrifugacion a 250 g en 1 ml de PBS. Se toman alfcuotas para el recuento de celulas totales mediante hemocitometro tras la tincion con verde malaquita o cristal violeta y preparacion de portaobjetos de citocentrifugacion usando procedimientos convencionales. Los recuentos de celulas diferenciales en preparaciones de citocentrifugacion tras la tincion con DiffQuik (Scientific Products, McGaw Park, 1L) confirman que el 98% de las celulas aisladas de este modo son macrofagos alveolares.

Marcaje in vitro de macrofagos alveolares de raton

Se marcan in vitro macrofagos alveolares aislados de BAL de ratones deficientes y de tipo natural con colorantes de rastreo celular de color naranja y verde fluorescentes. Cell Tracker™ Orange que consiste en CMTMR (isomeros mezclados de 5(y6)(((4clorometil)benzoil)amino)tetrametilrodamina y Cell Tracker™ Green (Molecular probes, Eugene, Oregon) que consiste en CMFDA (diacetato de 5clorometilfluorescefna) contienen un grupo clorometilo ligeramente reactivo con tiol. Una vez dentro de la celula, el grupo clorometilo reacciona con tioles intracelulares, transformando la sonda en un aducto de eter de colorante fluorescente impermeante en la celula. El reactivo no conjugado en exceso se difunde de manera pasiva al medio extracelular. Cell Tracker Orange no necesita actividad esterasa para ser fluorescente, mientras que Cell Tracker Green es incoloro hasta que se escinde por esterasas intracelulares.

Mediciones de protefnas y fosfolfpidos totales en lfquido de lavado broncoalveolar

A los puntos de tiempo indicados en experimentos individuales, se sacrifican 46 ratones en cada grupo de tratamiento mediante asfixia con dioxido de carbono y se someten a lavado broncoalveolar (BAL) con PBS esteril que contiene EDTA 0,25 mM. Se lavan los pulmones con 1 ml cuatro veces para producir un volumen de lavado total de aproximadamente 3 ml. Se centrifuga el lfquido de BAL a 250 g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se determina la concentracion de protefna total en el sobrenadante libre de celulas usando acido bicinconfnico como sustrato. Se extrae lfquido de BAL libre de celulas en cloroformometanol y se deduce el fosfolfpido total de la concentracion de fosforo.

Niveles de rSPD en lfquido de BAL de raton

Se analizan diluciones en serie de BALF libre de celulas de ratones tratados con rSPD para determinar el contenido en rSPD mediante metodologfa de EL1SA de tipo quot;sandwichquot; usando anticuerpos policlonales monoespecfficos biotinilados y no biotinilados generados contra SPD humana recombinante. Este anticuerpo no mostro reactividad cruzada con SPA de raton o SPD de raton. Se usan curvas patron que usan SPD humana recombinante para calcular las cantidades absolutas de rSPD alveolar recuperadas a puntos de tiempo especfficos tras la administracion.

Citometrfa de flujo y deteccion de celulas apoptoticas y necroticas

Se afslan celulas de BAL de ratones deficientes en SPD con RPM1 en PBS y se analizan en un sistema de FACS Consort 32 (Becton Dickinson 1mmunocytometry Systems, San Jose, CA) para caracterizar la poblacion de macrofagos por tamafo y granularidad. Se desechan preparaciones de celulas con tincion de sangre obvia. Se detectan celulas apoptoticas y celulas necroticas mediante tincion con anexina V y yoduro de propidio (P1) usando un kit de tincion AnnexinVFLUOS (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). Las celulas apoptoticas y necroticas exponen fosfatidilserina (PS), que esta presente normalmente en la cara interna de la membrana celular, en la cara externa, lo que permite que la anexina V se una a PS en la superficie de la celula (Vermes, 1., Haanen, C., SteffensNakken,

H. y Reutelingsperger, C. (1995) J 1mmunol Methods 184, 3951). Se tifen alfcuotas de celulas con anexina V marcada de manera fluorescente y se someten a contratincion con P1 para detectar celulas necroticas primarias o secundarias. En experimentos de comarcaje, tambien se evalua la union de rSPD marcada con F1TC a celulas que se tifen con anexina V marcada con PE o P1 (Pharmingen, San Diego, CA) tras compensacion para el solapamiento de sefales fluorescentes.

Analisis de datos

Se facilitan los resultados como medias � errores estandares de la media (x�EE). Se realizan comparaciones entre grupos de animales a puntos de tiempo individuales con pruebas de la t bilaterales suponiendo una varianza desigual. Se acepta significacion a P � 0,05.

Ejemplo 2. Modulacion de la hipersensibilidad alergica en un modelo murino de hipersensibilidad alergica a Aspergillus fumigatus

La forma truncada de SPD humana compuesta por trfmeros del cuello y dominios CRD, expresada y purificada en E. coli y denominada rSPD(n/CRD), es activa funcionalmente como modulador de reacciones de hipersensibilidad alergica en ratones. En este presente estudio, se han reproducido la modulacion de la eosinofilia, la 1gE e 1gG1 sericas, en C57BL/6, demostrando por tanto que los efectos no son exclusivos para ratones BALB/c.

Los parametros medidos en el presente estudio son 1gE e 1gG1 sericas y eosinofilia de sangre periferica que estan todas significativamente elevadas en el modelo de raton de alergia a alergenos de Aspergillus fumigatus se reducen todas significativamente mediante tratamiento intranasal con rSPD(n/CRD).

Sin querer restringirse a ninguna teorfa particular, se propone que rSPD(n/CRD) promueve un cambio de las poblaciones de linfocitos T de Th2 a Th1. Esto culmina en la reduccion observada de 1gE serica y eosinofilia, que son componentes principales en la alergia.

Preparacion de rSPD(n/CRD)

Se clona el ADNc para el cuello/CRD, que incluye una region corta del tallo de colageno (8 GlyXY) y que representa los residuos 179355 de la secuencia de protefna madura a partir de ADN de biblioteca de pulmon humano y se inserta en un vector pET21d (Novagen, Nottingham). Se transforma el plasmido en BL21( DE3) pLysS y se selecciona una unica colonia y vuelve a sembrarse en placa para dar 100400 colonias / placa. Se raspan estas y se usan para inocular frascos de agitacion que contienen 500 ml de medio LB complementado con ampicilina 100 mg/ml y cloranfenicol 25 mg/ml y se hacen crecer hasta una DO600 de 0,60,8 seguido por induccion con 1PTG 0,4 mM durante 23 h. Se recogen las celulas mediante centrifugacion y se lisan en TrisHCl 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, Triton X100 al 0,1% v/v, PMSF 0,1 mM, pH 7,5 y se sonican durante 3 minutos. Se expresa el rSPD(n/CRD) en cuerpos de inclusion insolubles y se recoge mediante centrifugacion y se lava 4 veces a 10000 x g. Se solubiliza el sedimento en 100 ml de urea 8 M, 2mercaptoetanol 100 mM, pH 7,5 y se clarifica mediante centrifugacion y se repliega mediante dialisis durante la noche frente a 10 l de TrisHCl 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM (TCB). Se separa rSPD(n/CRD) replegado de rSPD(n/CRD) desnaturalizado mediante absorcion sobre maltosaagarosa (SigmaAldrich, Poole, RU) y se eluye con TrisHCl 20 mM, NaCl 150 mM, que contiene EDTA 5 mM tras lavar en primer lugar la columna con TCB que contiene NaCl 1 M para eliminar impurezas. La purificacion final es mediante columna de filtracion en gel (Superose 12, Amersham Pharmacia, RU)) en un tampon de ejecucion de TrisHCl 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, azida de sodio al 0,02% (p/v) pH 7,4 (TSE). El rSPD(n/CRD) eluyo como un unico pico correspondiente a un peso molecular de 60 kDa. Se reducen los niveles de endotoxina haciendo pasar el rSPD(n/CRD) purificado a traves de una columna de polimixina B de 10 ml (DetoxiGel, Pierce & Warriner, RU) y solo se usan preparaciones que contienen menos de 5 pg/mg de rSPD(n/CRD).

Antfgeno de Aspergillus fumigatus (Afu 1wcf)

Se hace crecer Aspergillus fumigatus (Afu) en un medio sintetico (M199, Sigma Chemicals) como un cultivo estacionario durante 1 semanas a 37°C. Arruda, et al,

�Arruda LK, Mann BJ, Chapman MD. Selective expression of a major allergen and cytotoxin, Asp f1, in Aspergillus fumigatus. 1mplications for the immunopathogenesis of Aspergillusrelated enfermedades. J 1mmunol 1992; 149:33549� demostraron que la expresion de Asp f1, un alergeno principal, es maxima tras 1 semana y tiende a disminuir durante periodos de incubacion mas largos. Se destruye el cultivo de 1 semana afadiendo timerosal al 0,1% (p/v) durante 12 horas a 4°C. Se filtra el cultivo a traves de lana de vidrio y finalmente a traves de una membrana de 0,45 m para eliminar todos los materiales particulados y posibles esporas y entonces se dializa con 3 cambios de tampon frente a agua. Se liofiliza el dializado para dar un polvo marron. La SDS PAGE (figura 1B) de 1wcf revelo una banda principal a 18 kDa, que corresponde a Asp f 1. Tambien es evidente una banda correspondiente a Asp f 2 (37 kDa). Se secuencia el extremo Nterminal de la banda de 18 kDa dando la secuencia ATWTC1NQQLNP, correspondiente a la secuencia Nterminal para Asp f 1. Se demuestra tambien mediante EL1SA que el filtrado de cultivo de 1 semana (1wcf) se reconoce por suero humano de pacientes alergicos a Afu obtenido del National 1nstitute of Biological Standards and Control.

Sensibilizacion

rante 4 semanas.

Exposicion a alergeno y tratamiento

Se exponen ratones sensibilizados con 50 l que contienen 10 g de Afu 1wcf administrados por vfa intranasal (i.n.). A esto le sigue el tratamiento con PBS o 10 g de rSPD(n/CRD) en 50 l de PBS administrados i.n. La exposicion y el tratamiento se realizan en una base diaria tal como se describe en los resultados. En algunos experimentos, se usa una protefna control de SPA humana recombinan

tra rSPD(n/CRD) que no reconoce SPA o SPD de raton. Estos resultados muestran que podfa contabilizarse al menos un 50% de rSPD(n/CRD) en el BAL tomado 30 minutos tras la administracion y no podfa medirse nada tras 24 h.

Eosinofilos de sangre periferica

Se recoge sangre de la vena de la cola de los ratones (n=48 / grupo) para la estimacion de los eosinofilos. Se mide el recuento de leucocitos totales con un contador de celulas automatico y se determina la proporcion de eosinofilos mediante recuento diferencial de frotis de sangre tefidos con MayGrunwaldGiemsa. Se expresan los resultados como 106 celulas / ml.

1gE serica e 1gG1 especffica de Afu

Se mide 1gE serica total mediante EL1SA de tipo quot;sandwichquot; (BD PharMingen, Cowley, RU) en sangre diluida en serie a partir de una dilucion maxima de 1:20 para proporcionar valores, que son lineales con respecto a una curva patron de 1gE de raton. Se expresan los resultados en mg/ml. Se mide 1gG1 especffica de Afu mediante EL1SA usando placas de 96 pocillos recubiertas con extracto de alergeno de Afu. Se detecta el anticuerpo con anticuerpos anti1gG1 de raton marcado con HRP. Se expresan los resultados como unidades de absorbancia relativa (DO450).

SPD y SPA de raton endogenas en el pulmon

1nmediatamente despues del sacrificio inmunitario mediante asfixia con CO2, se realiza lavado broncoalveolar con 3x1ml de PBS, que se agrupan y se ajustan los volumenes mediante la adicion de PBS a 4 ml para todas las muestras y se centrifugan para eliminar las celulas. Se miden SPD y SPA mediante EL1SA usando anticuerpos policlonales generados contra SPD y SPA de raton recombinantes (proporcionados amablemente por el Dr. P. Lawson). Se muestra que estos anticuerpos no reaccionan de manera cruzada con SPD o SPA humana y son especfficos para SPD o SPA de raton, respectivamente. Se expresan los resulta dos como g/ml de BAL.

Tincion de citocinas intracelulares.

Tras el tratamiento, se sacrifican los ratones de manera humanitaria mediante asfixia con CO2 y se extirpan sus bazos y se homogeneizan en PBS. Se filtra el homogeneizado y se lisan los globulos rojos con reactivo de lisis de cloruro de amonio (BD Pharmingen) y se fijan con paraformaldehfdo al 4% (v/v) durante 20 min. Se lavan las celulas con PBS complementado con suero de ternero inactivado con calor al 3% (v/v) con azida de sodio al 0,1%(p/v) (FSB), se resuspenden en DMSO al 10% (v/v) en FSB y se almacenan a 80°C. Se permeabilizan las celulas con tampon de lavado Cytoperm (CPB, BD Biosciences, Cowley, RU) durante 15 min. a 4°C y se bloquean alfcuotas de 106 celulas mediante incubacion

de raton conjugado con PE (BD Biosciences) incubado durante 60 min. a 4°C. Se lavan las celulas con CPB seguido por FSB y se resuspenden en 500 1 FSB. Se realiza citometrfa de flujo con un citometro de flujo FACScan (Beckton Dickinson, Mountain View, California) usando el software CellQuest. Se recogen datos para 20000 celulas. El FSC promedio de celulas de bazo es de 100 en todos los casos. Se activan las celulas tefidas (FSCgt;100, FL2gt;100) y se calcula la proporcion de estas celulas que se tifen intensamente para PE (PEgt;1000). Se expresan los resultados como el % de celulas intensamente tefidas tras la resta de la fluorescencia de fondo para celulas no tefidas incubadas con 1gG de rata (% de PEgt;1000).

Histologfa del pulmon

1nmediatamente tras el tratamiento, se fijan los pulmones de 24 ratones de cada grupo de tratamiento en formalina tamponada neutra al 10% (v/v) y se envfan para un analisis independiente. Se incrustan los pulmones en parafina, se cortan y se tifen con hematoxilina y eosina. Se evaluan los cortes para determinar la inflamacion peribronquial y se asignan puntuaciones en una escala de 04, correspondiente a una puntuacion de normal a grave, respectivamente �Sur S, Wild JS, Choudhury BK et al. Long term prevention of allergic lung inflammation in a mouse model of asthma by CpG oligodeoxynucleotides. J 1mmunol 1999; 162:628493�.

Pletismograffa de cuerpo entero.

En este estudio, se mide la hiperreactividad de las vfas respiratorias usando pletismograffa de cuerpo entero no restringida �Hamelmann E, Schwarze J, Takeda K et al. Noninvasive measurement of airway responsiveness in allergic mice using barometric plethysmography. Am J Respir Crit Care Med 1997; 156:76675� con un sistema de cuatro camaras (Buxco, Sharon, Connecticut). En primer lugar, se exponen los ratones con antfgeno intranasal y se dejan recuperar durante 2 horas antes de colocarse en las camaras y monitorizarse su respiracion durante 10 min. Cuando se aclimatan, se mide su respuesta de nivel inicial durante 5 min. Se someten entonces los ratones a 1 min. de PBS aerosolizado, seguido por dosis progresivamente crecientes de metacolina (5, 10, 20, 30, 40 mg/ml de PBS). Se registran las respuestas durante 5 min. en cada caso con un intervalo corto entremedias para permitir que regresen a la Penh de nivel inicial.

Cada grupo contenfa 48 ratones. Se presentan los resultados como el % de elevacion de Penh con respecto al nivel inicial tras una exposicion de metacolina.

Estadfstica

Los resultados son el promedio de 48 ratones / grupos y las barras de error son � EEM. Se determina la significacion mediante una prueba de la t de Student bilateral. Se acepta significacion para P � 0,05.

Resultados del ejemplo 2

Se muestran los resultados del tratamiento de ratones sensibilizados con SPD recombinante en las figuras 2, 3, 4 y 5.

Se reducen 1gE serica, 1gG1 especffica de Afu y eosinofilia de sangre periferica mediante rSPD(n/CRD) en un antecedente genetico diferente

Para determinar si el tratamiento con rSPD(n/CRD) es eficaz en un antecedente genetico diferente, se establece un modelo de ABPA en ratones C57BL/6 y para determinar si rSPD(n/CRD) podfa modular la hipersensibilidad alergica durante la exposicion con alergeno, se exponen en primer lugar los ratones sensibilizados con 10 g de Afu 1wcf y se tratan 1 hora despues. 1gE serica medida 3 dfas tras el tratamiento con 5 dosis diarias de 10 g de rSPD(n/CRD), administradas por vfa intranasal a ratones expuestos con alergeno, esta significativamente reducida (P�0,001) y esta reduccion se mantiene tras la reexposicion con 3 dosis diarias de 10 g de Afu 1wcf administradas la siguiente semana (figura 2A). Tambien se mide una reduccion significativa en 1gG1 especffica de Afu (figura 2B) y eosinofilia de sangre periferica medidas tras el tratamiento de ratones expuestos con alergeno y reexpuestos con alergeno solo la siguiente semana (figura 3).

El tratamiento con rSPD(n/CRD) da como resultado una elevacion en 1L12 e 1FN y una reduccion en 1L4

La reduccion en 1gE y eosinofilia de sangre periferica sugiere una modulacion sistemica del nivel de citocinas, y estas citocinas se miden mediante tincion intracelular. 1L12 (figura 4A) medida en el bazo, 1 dfa tras el tratamiento durante 2

El tratamiento con rSPD(n/CRD) da como resultado una reduccion de la hiperreactividad de las vfas respiratorias. Ratones tratados con 4 dosis diarias de 10 g de rSPD

(n/CRD) administradas 12 horas tras la exposicion con alergeno mostraron una reduccion significativa (P�0,05) en la hiperreactividad de las vfas respiratorias al reexponerse con alergeno 3 dfas tras la finalizacion del tratamiento (dfa 7) en todas las dosis de metacolina sometidas a prueba (figura 5A). Ratones tra tados con 10 g de rhSPA (protefna tensioactiva A humana recombinante) del mismo modo no mostraron una reduccion significativa en AHR (figura 5B).

El tratamiento con rSPD(n/CRD) da como resultado una reduccion de la inflamacion pulmonar

De los ratones sensibilizados en este estudio, 4 de los 6 ratones tratados con PBS tenfan una puntuacion de 2� y de los 5 en el grupo de tratamiento con rSPD (n/CRD) 4 tenfan una puntuacion de 1. La puntuacion para ratones no sensibilizados es 0. Las secciones de pulmon ilustran la reduccion en la infiltracion celular en los pulmones (figura 6).

SPD y SPA de raton endogenas.

Los niveles endogenos de SPD medidos en el BAL de ratones alergicos estan elevados 6 veces desde un nivel de 0,25 � 0,015 g/ml en BAL de ratones normales hasta 1,4 � 0,15 g/ml, mientras que no se encuentran diferencias para el nivel de SPA endogena que se mide a 1,3 � 0,1 mg/ml en BAL de ratones normales, sensibilizados y tratados. El tratamiento con 5 dosis diarias de 10 g de rSPD(n/CRD) no produjo ningun cambio en el nivel de SPD o SPA endogenas.

Ejemplo 3. Modulacion de la hipersensibilidad alergica en un modelo murino de hipersensibilidad alergica a acaros del polvo domestico (Dermatophagoides pteronyssinus)

Derp/1L2/Pulmon

La figura 7A muestra que el tratamiento intranasal con rSPD (N/CRD) da como resultado una potenciacion en la respuesta a 1L12 a la exposicion con alergeno en los pulmones de ratones alergicos a Der p.

Un analisis de 1L12 en los homogeneizados de pulmon de ratones sensibilizados con Der p tras el tratamiento medida mediante tincion de citocinas intracelulares seguido por analisis de FACS para el porcentaje de celulas altamente tefidas (PEgt;1000) positivas para 1L12. PBS= ratones no sensibilizados tratados con PBS. HP= ratones sensibilizados tratados con PBS. HR= ratones sensibilizados tratados con 10 g de rSPD (N/CRD). Se expusieron en primer lugar los ratones sensibilizados con 50 UA de extracto de alergeno Der p administrado por vfa in tranasal. El tratamiento fue mediante instilacion intranasal de 10 g de rSPD(N/CRD) administrados poco despues de la exposicion. Se repitieron la exposicion y el tratamiento en 4 dfas consecutivos. Se reexpusieron los ratones con Der p solo 4 dfas tras el tratamiento y se sacrificaron el siguiente dfa.

Derp/1L2/Bazo

La figura 7B muestra pruebas de que el tratamiento intranasal con rSPD (N/CRD) da como resultado una potenciacion en la respuesta de 1L12 a la exposicion con alergeno en el bazo de ratones alergicos a Der p.

Un analisis de 1L12 en los homogeneizados de bazo de ratones sensibilizados con Der p tras el tratamiento medida mediante tincion de citocinas intracelulares seguido por analisis de FACS para el porcentaje de celulas altamente tefidas (PEgt;1000) positivas para 1L12. PBS= ratones no sensibilizados tratados con PBS. HP= ratones sensibilizados tratados con PBS. HR= ratones sensibilizados tratados con 10 g de rSPD (N/CRD). HB= ratones sensibilizados tratados con 10 g de BSA. Se expusieron en primer lugar los ratones sensibilizados con 50 UA de extracto de alergeno Der p administrado por vfa intranasal. El tratamien to fue mediante instilacion intranasal de 10 g de rSPD (N/CRD) administrados poco despues de la exposicion. Se repitieron la exposicion y el tratamiento en 4 dfas consecutivos. Se reexpusieron los ratones con Der p solo 4 dfas tras el tratamiento y se sacrificaron el siguiente dfa. (n=48/grupo. Elevacion de 1,7x).

alergeno en los bazos de ratones alergicos a Der p.

Un analisis de 1FN en los homogeneizados de bazo de ratones sensibilizados con Der p tras el tratamiento medido mediante tincion de citocinas intracelulares seguido por analisis de FACS para el porcentaje de celulas altamente tefidas (PEgt;1000) positivas para 1FN. PBS= ratones no sensibilizados tratados con PBS. HP= ratones sensibilizados tratados con PBS. HR= ratones sensibilizados tratados con 10 g de rSPD (N/CRD). Se expusieron en primer lugar los ratones sensibilizados con 50 UA de extracto de alergeno Der p administrado por vfa in tranasal. El tratamiento fue mediante instilacion intranasal de 10 g de rSPD (N/CRD) administrados poco despues de la exposicion. Se repitieron la exposicion y el tratamiento en 4 dfas consecutivos. Se reexpusieron los ratones con Der p solo 4 dfas tras el tratamiento y se sacrificaron el siguiente dfa. (n=48/grupo. P�0,05. Elevacion de 2,7x).

Derp/TNP /Bazo

La figura 7D muestra pruebas de que el tratamiento intranasal con rSPD (N/CRD) da como resultado una potenciacion de la respuesta de TNF a la exposicion con alergeno en los bazos de ratones alergicos a Der p.

Un analisis de TNF en los homogeneizados de bazo de ratones sensibilizados con Der p tras el tratamiento medido mediante tincion de citocinas intracelulares seguido por analisis de FACS para el porcentaje de celulas altamente tefidas (PEgt;1000) positivas para TNF. PBS= ratones no sensibilizados tratados con PBS. HP= ratones sensibilizados tratados con PBS. HR= ratones sensibilizados tratados con 10 g de rSPD (N/CRD). Se expusieron en primer lugar los ratones sensibilizados con 50 UA de extracto de alergeno Der p administrado por vfa in tranasal. El tratamiento fue mediante instilacion intranasal de 10 g de rSPD (N/CRD) administrados poco despues de la exposicion. Se repitieron la exposicion y el tratamiento en 4 dfas consecutivos. Se reexpusieron los ratones con Der p solo 4 dfas tras el tratamiento y se sacrificaron el siguiente dfa. (n=48/grupo. Elevacion de 1,5x).

Ejemplo 4. Efecto del tratamiento con rSPD(n/CRD) sobre la hiperreactividad de las vfas respiratorias en un modelo murino de hipersensibilidad alergica a acaros del polvo domestico (Dermatophagoides pteronyssinus) El asma alergica se caracteriza por periodos de hiperreactividad de las vfas respiratorias (AHR). Se sabe que la AHR altera los patrones de respiracion incluyendo una prolongacion del tiempo de espiracion. Este cambio puede cuantificarse mediante la medicion de la pausa espiratoria potenciada (Penh).

En este estudio, se mide la hiperreactividad de las vfas respiratorias usando pletismograffa de cuerpo entero no restringida con un sistema de 4 camaras (Buxco, Sharon, CT, EE.UU.). Se extrae un flujo de aire de desviacion constante a traves del sistema con el fin de evitar la acumulacion de CO2. A medida que los ratones respiran en la camara de ratones, se miden las fluctuaciones de la presion mediante transductores y se comparan con una camara de referencia. Estas fluctuaciones se producen por cambios en el volumen toracico durante el ciclo de respiracion. La broncoconstriccion produce diferencias en la forma de las excursiones de presion y es lo mas pronunciada durante la espiracion. Estos cambios de forma pueden cuantificarse mediante el algoritmo para la pausa potenciada (Penh), que representa la dificultad en la espiracion y es una caracterfstica de la respiracion en asmaticos.

PEP

Penh

x

Tr PIP

Te es el tiempo espiratorio, Tr es el tiempo de relajacion, PEP es la presion espiratoria pico y P1P es la presion inspiratoria pico.

Se provoca AHR exponiendo los ratones a metacolina nebulizada, in situ. La metacolina (cloruro de acetilmetilcolina) es un analogo metabolicamente estable del neurotransmisor acetilcolina y provoca contraccion del musculo liso dando como resultado broncoconstriccion provocada. La AHR provocada de ratones asmaticos se mide mediante un aumento en Penh relativa con respecto a ratones normales.

Metodos

Sensibili�aci�n. Se sensibilizan ratones C57BL/6 hembra mediante 4 inyecciones

i.p. a la semana de extracto de Der p normalizado (Greer Labs., EE.UU.) con alumbre.

Inducci�n de inflamaci�n de las v�as respiratorias y tratamiento. Se administran a ratones sensibilizados 50 unidades de alergia de extracto de Der p en PBS, por vfa intranasal (i.n.), precedido por la administracion i.n. de PBS o 10 rSPD(n/CRD), denominada administracion conjunta secuencial, en 4 dfas sucesivos. Se deja que los animales se recuperen durante al menos 30 min. antes de la segunda administracion i.n.

Pletismograf�a de cuerpo entero. Vuelven a colocarse los ratones en las cuatro camaras y se monitoriza su respiracion durante 10 min. Cuando se aclimatan, se mide su respuesta de nivel inicial durante 5 min. A continuacion, se someten a 1 min. de PBS aerosolizado, seguido por dosis progresivamente crecientes de metacolina. Se registran las respuestas durante 5 min. cada caso con un intervalo corto entremedias para permitir que regresen al nivel inicial.

Estad�stica. Cada grupo contiene 48 ratones. Se expresa Penh como el % de aumento promedio con respecto al valor de nivel inicial para los ratones en cada grupo. Las barras de error son � EEM. Se determina la significacion mediante pruebas de la t apareadas.

Resultados del ejemplo 4

El tratamiento con rSPD(n/CRD) produce una reduccion significativa (p� 0,001) en AHR tal como se mide mediante la respuesta de Penh en pletismograffa de cuerpo entero, al final del periodo de tratamiento (figura 8A; metacolina 20 mg/ml). Se mantuvo esta disminucion significativa cuando se reexponen los ratones con alergeno 4 dfas tras el tratamiento (p�0,002) tal como se muestra en la figura 8B (respuesta a la dosis de metacolina con reexposicion).

Este estudio en un modelo de raton de alergia a acaros del polvo domestico muestra por primera vez que la administracion intranasal de rSPD(n/CRD) reduce significativamente la hiperreactividad de las vfas respiratorias, que es una caracterfstica principal del asma. Esto proporciona pruebas de la utilidad de rSPD(n/CRD) en el tratamiento de los sfntomas de las reacciones de hipersensibilidad alergica respiratoria incluyendo asma alergica.

Es de importancia que rSPD(n/CRD) puede reducir la AHR incluso en presencia de exposicion a alergeno sostenida tal como se demuestra por su eficacia durante la administracion conjunta secuencial con alergeno Der p. Esto refleja la situacion con la que se encuentran sujetos alergicos estacionales o aquellos expuestos constantemente a aeroalergenos, que es un problema principal en la alergia a acaros del polvo domestico.

El hallazgo mas notable es que el tratamiento con rSPD(n/CRD) tiene un efecto a largo plazo sobre los mecanismos subyacentes tal como se muestra mediante la AHR significativamente reducida con la reexposicion con alergeno solo. Por tanto, el tratamiento con rSPD (n/CRD) proporciona una estrategia de desensibilizacion eficaz para personas que padecen alergia y asma alergica.

Ejemplo 5. Efecto de SPD recombinante sobre ratones deficientes

Los siguientes tres ejemplos describen experimentos en los que se reemplaza la funcion de SPD en ratones deficientes en SPD usando SPD humana recombinante.

Los ratones deficientes en SPD que no expresan SPD tienen un numero aumentado de macrofagos, muchos de los cuales son de aspecto anomalo. Hay un exceso de fosfolfpido tensioactivo en el espacio alveolar, lo que indica un proceso inflamatorio de grado bajo cronico en ausencia de SPD. Estos ratones desarrollan posteriormente lesion pulmonar y fibrosis y enfisema y proporcionan un modelo para la contribucion hecha a la lesion pulmonar y la inflamacion de la deficiencia de SPD (tal como se observa en el lactante prematuro y en fumadores, grupos de pacientes con deficiencia de SPD congenita y adquirida, respectivamente). El efecto sobre este proceso inflamatorio del tratamiento con rSPD (N/CRD) humano, fragmento truncado expresado de manera recombinante, se evalua en ratones deficientes en SPD.

Se producen ratones deficientes en SPD tal como se describe en Botas, C., et al., Altered surfactant homeostasis and alveolar type 11 cell morphology in mice lacking surfactant protein D. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998. 95(20): pags. 11869

74. Se produce SPD humana recombinante tal como se describio anteriormente.

Se administra por vfa intranasal SPD recombinante o control de BSA a ratones desde la edad de 6 semanas. Se administran un total de 7 dosis de 30 microgramos a lo largo de 6 semanas, hasta que los animales tienen 12 semanas de edad. Se sacrifican cuatro ratones tras 3 semanas de tratamiento y se someten a lavado broncoalveolar para los recuentos celulares del numero de macrofagos alveolares y la estimacion del fosfolfpido. Se repiten los experimentos descritos tres veces.

Estos ejemplos demuestran que puede usarse rSPD(n/CRD) como tratamiento eficaz para la enfermedad pulmonar inflamatoria.

Ejemplo 6. Efecto de SPD recombinante sobre ratones deficientes tal como se evalua mediante los numeros de macrofagos alveolares

Se cuenta el numero de macrofagos tefidos con verde malaquita o cristal violeta en un hemocitometro y se evalua la morfologfa de los macrofagos tras la citocentrifugacion.

La figura 9 muestra el numero de macrofagos alveolares contados en ratones no tratados y demuestra que el numero de celulas es aproximadamente tres veces las contadas en ratones de tipo natural a las 6 semanas y a las 9 semanas y 12 semanas es casi cuatro veces el tipo natural. Se mantiene el numero de macrofagos en ratones deficientes no tratados, de modo que hay numeros comparables de celulas recogidas a partir del lavado a las 16 semanas. Sin embargo, tras el tratamiento con rSPD (N/CRD), el numero de macrofagos alveolares en BAL de ratones deficientes en SPD se reduce en aproximadamente un 50%, hasta niveles aproximadamente dos veces los observados en ratones de tipo natural de edad comparable. La figura 9 tambien muestra que los numeros de macrofagos alveolares aumentan en ratones deficientes en SPD en comparacion con ratones de tipo natural a las 15 semanas.

Se muestra el efecto del tratamiento con rSPD sobre el numero de macrofagos alveolares aislados a partir de lfquido de BAL. En contraposicion al tratamiento con rhSPA, BSA o PBS, el numero de macrofagos disminuye significativamente en ratones deficientes en SPD tratados con rSPD a las 9, 12 y 15 semanas. Los numeros de macrofagos en animales tratados con rSPD siguen siendo superiores que en ratones de tipo natural en todas las edades.

La figura 10A muestra una citocentrifugacion de celulas en lavado broncoalveolar. Se tifen las celulas con verde malaquita (paneles superiores) o cristal violeta (paneles inferiores). Queda claro que hay menos macrofagos alveolares en ratones tratados con rSPD (N/CRD) y tienen un aspecto mas normal con muy pocos macrofagos espumosos agrandados visibles por campo de gran aumento, en comparacion con ratones no tratados o tratados con BSA.

La figura 10B muestra una citocentrifugacion de celulas en lavado broncoalveolar. Las celulas de ratones deficientes en SPD son grandes, espumosas y a menudo multinucleadas. En contraposicion a ratones tratados con BSA o SPA, los macrofagos alveolares de ratones tratados con rSPD tienen un aspecto normal mas frecuentemente, con menos celulas agrandadas y espumosas. Este efecto se cuantifica mediante citometrfa de flujo de dispersion frontal y lateral.

Ejemplo 7. Efecto de SPD recombinante sobre ratones deficientes tal como se somete a ensayo mediante analisis de fosfolfpido tensioactivo

Se lleva a cabo la extraccion de fosfolfpido a partir de BAL y se cuantifica el fosfolfpido mediante el ensayo de fosforo de Bartlett, tal como se describe en Bartlett, G.R, Phosphorus assay in column chromatography. J. Biol. Chem., 1959. 234: pags. 466468.

Se muestran los resultados en la figura 11. No hay diferencias detectables en los fosfolfpidos sometidos a ensayo tras 3 semanas de tratamiento en ratones que habfan alcanzado 9 semanas de edad, mientras que la cantidad de fosfolfpido recuperable en el lavado tras 6 semanas de tratamiento esta muy reducida.

Se muestran resultados adicionales referentes a las mediciones de protefnas y fosfolfpidos totales en BAL libre de celulas en la figura 11B. Hay un marcado aumento en los niveles de fosfolfpido de BAL en ratones deficientes en SPD a las 6 semanas de edad. No hay diferencias en los niveles de fosfolfpido en ratones que recibieron dos semanas de tratamiento rSPD desde la edad de cuatro semanas en comparacion con ratones de seis semanas de edad no tratados.

Los mismos ratones usados en el experimento de recuento de macrofagos alveolares (figura 9) que se trataron desde la edad de seis semanas durante tres o seis semanas tambien se someten a ensayo para determinar el fosfolfpido en BAL libre de celulas. No hay diferencias en fosfolfpidos de BAL tras tres semanas de tratamiento (edad de sacrificio nueve semanas) en comparacion con controles de nueve semanas de edad no tratados. Sin embargo, ratones tratados durante seis semanas (sacrificados para el ensayo a la edad de 12 semanas) muestran una reduccion del 50% en el fosfolfpido en exceso en comparacion con controles de doce semanas de edad no tratados (P�0,05). No hay ningun efecto de tratamiento significativo sobre los niveles de protefnas totales del lavado a ninguna edad.

Se determinan los niveles de colesterol plasmatico en ratones deficientes en SPD, tal como se muestra en la figura 17. Esta figura compara el colesterol plasmatico en mM entre ratones de tipo natural y ratones deficientes en SPD. Se realizo una prueba apareada, con una diferencia hipotetica de 0. La diferencia media es 0,988, el DF es 8, el valor de T es 2,885 y el valor de P es 0,0204.

Ejemplo 8. Efecto de SPD recombinante sobre ratones deficientes tal como se somete a ensayo mediante los niveles de quimiocinas

Para evaluar posibles mecanismos que explican los hallazgos de numero de macrofagos alveolares reducido, un efecto aparentemente especffico de rSPD, se afsla el ARN total de pulmones de ratones deficientes tratados con rSPD (N/CRD) y controles no tratados y se someten a ensayo los niveles de ARNm para varios factores quimiotacticos mediante ensayo de proteccion de ribonucleasa usando el conjunto de moldes de multiples sondas mCK5 de Pharminogen segun las instrucciones del fabricante. Se realizan ensayos de proteccion de ribonucleasa sobre ARN de pulmon total.

Los resultados se normalizan a traves de las muestras para comprobar la carga igualitaria de ARN de pulmon total usando la sefal de ARNm para L32 y GAPDH. Se carga cada muestra por duplicado en 2 concentraciones, usando 3 ratones para cada grupo.

Se muestran los resultados en la figura 12. Puede observarse que hay diferencias significativas en los niveles de ARNm iniciales entre ratones deficientes en SPD y ratones de tipo natural. Especfficamente, los niveles de eotaxina, el factor quimiotactico especffico de esosinofilos, aumentan en un 100% en ratones deficientes en comparacion con ratones de tipo natural. Ademas, esto disminuye mediante el tratamiento con rSPD (N/CRD). Estas observaciones son estadfsticamente significativas al nivel del 5% usando la prueba de la t para datos independientes. Los niveles de ARNm de MCP1 aumentan 6 veces en ratones deficientes en comparacion con ratones de tipo natural, y esto tambien disminuye mediante el tratamiento con rSPD (N/CRD). Se observa un efecto similar sobre los niveles de M1P1 alfa y sobre M1P 2 excepto porque no hay ningun efecto significativo del tratamiento con rSPD (N/CRD) sobre los niveles de ARNm de M1P2. Una observacion final es que los niveles de TCA3 aumentan 4 veces en ratones deficientes frente a ratones de tipo natural, pero el tratamiento con rSPD (N/CRD) no tiene ningun efecto sobre el aumento de la expresion de TCA3.

Ejemplo 9. rSPD (N/CRD) promueve el aclaramiento de macrofagos alveolares apoptoticos

El proceso de muerte celular regulada por apoptosis evita la necrosis celular y la liberacion consiguiente del contenido intracelular proinflamatorio. Dado el exceso de numeros de macrofagos alveolares en ratones deficientes en SPD, se mide el numero de celulas que experimentan apoptosis en ratones deficientes y se compara con ratones de tipo natural.

Se plantea la hipotesis de que la lesion pulmonar mediada por la presencia de grandes numeros de macrofagos alveolares se debe en parte al aclaramiento alterado de macrofagos alveolares apoptoticos con desencadenamiento posterior de una respuesta inflamatoria debido al aumento de necrosis de macrofagos alveolares.

Citometrfa de flujo y deteccion de celulas apoptoticas y necroticas

Se afslan macrofagos alveolares de ratones mediante lavado broncoalveolar tal como se describio anteriormente.

La figura 13A muestra un resultado representativo de la citometrfa de flujo de dispersion frontal (tamafo celular) y dispersion lateral (granularidad) en ratones deficientes en SPD en comparacion con ratones de tipo natural. Se cuentan diez mil celulas en cada raton a partir de cada grupo (n=6 por grupo). Los histogramas muestran una poblacion de celulas mas grandes y mas granulares en ratones deficientes en SPD consecuente con los aspectos de la citocentrifugacion de macrofagos espumosos agrandados en ratones deficientes en SPD en comparacion con los aislados de ratones de tipo natural.

Se muestra el efecto del tratamiento con rSPD sobre la dispersion frontal y lateral de la poblacion de celulas usando superposiciones de histogramas representativos, e indica una poblacion de celulas con menos macrofagos alveolares anomalamente grandes y granulares, consecuente con los aspectos de la citocentrifugacion. El tratamiento con rhSPA, PBS o BSA no tuvo ningun efecto sobre los histogramas de dispersion frontal y lateral.

Apoptosis y necrosis en macrofagos alveolares

Se afslan macrofagos alveolares de ratones mediante lavado broncoalveolar tal como se describio anteriormente y se someten a ensayo para detectar apoptosis y necrosis midiendo la union de anexina V marcada con F1TC (que se une a fosfatidilserina de superficie expuesta en celulas apoptoticas) y yoduro de propidio (que se une a celulas necroticas) mediante analisis de FACS.

Tal como se muestra en las figuras 13B, 13C y 13D, hay una gran diferencia en el numero de macrofagos apoptoticos y necroticos en lavado de ratones deficientes en SPD en comparacion con ratones de tipo natural.

Tincion con anexina V y P1 de macrofagos alveolares recien aislados

La figura 13B muestra los patrones tfpicos de tincion con anexina V y P1 de macrofagos de ratones deficientes en SPD en comparacion con ratones de tipo natural. De manera consecuente, el numero de macrofagos, que se tifen con anexina V, es significativamente superior en ratones deficientes en SPD en comparacion con ratones de tipo natural, y hay un aumento de tres a cuatro veces en el numero de celulas que se teffan con tanto anexina V como P1 en ratones deficientes en SPD. El punto de corte arbitrario mostrado en la figura, que divide la poblacion de celulas en cuadrantes, permite el calculo de los porcentajes de celulas que se tifen con P1 o anexina V solo en cada caso.

Comarcaje de celulas positivas para anexina V y/o P1 con rSPD marcado con F1TC.

La figura 13C muestra el grado de comarcaje de rSPD marcado con F1TC con celulas positivas para anexina V y/o P1. Los resultados son representativos de tres experimentos. Los graficos de puntos muestran la union preferente de F1TCrSPD a celulas necroticas (positivas para P1) y apoptoticas (positivas para anexina V) tempranas. Globalmente, F1TCrSPD se une a una proporcion superior de celulas aisladas de ratones deficientes, en comparacion con ratones de tipo natural (45�/ 6% frente a 15 �/ 1,8%). Del pequefo numero de celulas positivas para anexina V en ratones de tipo natural, F1TCrSPD se une a un 80 �/ 6%, en comparacion con solo un 1 �/ 0,5% de celulas negativas para anexina V. En ratones deficientes, un 55 �/ 4% de AM positivas para anexina V se unfan a F1TCrSPD, en comparacion con solo un 3,5 �/ 1,7% de celulas negativas para anexina V. F1TCrSPD se unfa a todas las celulas que se teffan con P1 de ratones de tipo natural

o deficientes. Por tanto, hay un bajo nivel de union de F1TCrSPD a celulas sanas (negativas para P1, negativas para anexina V) de ratones de tipo natural y ratones deficientes en comparacion con la union a celulas positivas para anexina V o P1. La incubacion conjunta de celulas recien aisladas con F1TCanexina V y rSPD no marcado no afecto de manera significativa a la union de anexina V (no mostrado), lo que indica que no hay interacciones directas entre anexina V y rSPD, ni ninguna competicion por rSPD de la union de anexina V a su ligando fosfatidilserina.

Analisis y tratamiento con rSPD

La figura 13D muestra que ratones deficientes en SPD tienen un aumento de diez veces en la proporcion de macrofagos alveolares apoptoticos en lavado broncoalveolar en comparacion con ratones de tipo natural (deficientes 74% �/ 8% frente a 6% �/ 2% en tipo natural) y un aumento de seis veces en macrofagos alveolares necroticos (25% �/ 8% en deficientes frente a 4 �/ 2% en tipo natural). La terapia sustitutiva intranasal durante 36 semanas con rSPD (N/CRD) aumenta el aclaramiento de macrofagos alveolares apoptoticos y necroticos del espacio alveolar en animales deficientes en SPD, mientras que un tratamiento similar con albumina serica bovina o protefna tensioactiva A (SPA) no tiene ningun efecto.

Tambien se muestra en la figura el efecto del tratamiento con rSPD sobre los porcentajes de celulas que se tifen con o bien P1 o bien anexina V.

Los porcentajes de macrofagos apoptoticos son del 25% �/ 4% en ratones tratados con rSPD (N/CRD) frente al 76% �/ 10% en controles. El tratamiento con rSPD (N/CRD) reduce el porcentaje de macrofagos necroticos en lavado de ratones deficientes en SPD (aproximadamente del 25%) hasta niveles comparables con el tipo natural (el 5% frente al 4%). El efecto global del tratamiento con rSPD (N/CRD) es disminuir el numero absoluto de macrofagos alveolares en el pulmon, junto con los niveles de citocinas proinflamatorias y los fosfolfpidos tensioactivos en exceso en un 50%.

No hay ningun efecto significativo del tratamiento con rhSPA, BSA o PBS sobre el porcentaje de celulas que se tifen con anexina V y/o P1. En contraposicion, el tratamiento con rSPD dio como resultado una reduccion significativa en el numero de celulas positivas para anexina V y/o P1 en el BAL de ratones deficientes en SPD, aunque el numero de celulas positivas para anexina V y/o P1 es todavfa significativamente superior que en el tipo natural.

Modulacion de los niveles de GMCSF en lavado broncoalveolar

Se muestra la modulacion de los niveles de GMCSF en lavado broncoalveolar en la figura 14. Tal como puede observarse, la concentracion de GMCSF en lavado broncoalveolar de ratones de tipo natural es de aproximadamente 50 pg/ml, en comparacion con aproximadamente 185 pg/ml en ratones deficientes en SPD. El tratamiento de tales ratones deficientes con rSPD (N/CRD) reduce los niveles de GMCSF hasta aproximadamente 120 pg/ml.

Los resultados de analisis bioqufmicos y de citometrfa de flujo son consecuentes con el examen de citocentrifugacion e histologfa del pulmon de macrofagos alveolares recogidos del lavado broncoalveolar.

Microscopfa confocal

La figura 15 muestra la microscopfa confocal de macrofagos de ratones de tipo natural (paneles A y B) y deficientes (paneles C y D), tefidos con F1TCdUTP (verde). Las celulas en apoptosis avanzada se tifen de verde y las celulas en apoptosis temprana se identifican mediante la tincion punteada caracterfstica de fragmentos de ADN marcados en los extremos.

Deteccion de fagocitosis de macrofagos necroticos y apoptoticos tefidos de naranja mediante macrofagos recien aislados tefidos de verde

Se afslan celulas de ratones deficientes tal como se describio anteriormente y se incuban con colorante Orange Cell Tracker durante la noche a temperatura ambiente. El comarcaje con anexina VF1TC confirma que el 8090% de estas celulas estan doblemente marcadas con colorante naranja y son positivas para anexina

V. Se incuban celulas recien aisladas con Cell Tracker Green segun las instrucciones del fabricante. Muchas celulas no se tifen con Cell Tracker Green que depende de celulas vivas (figura 16, cuadrante inferior izquierdo, panel A), y se marcaron satisfactoriamente una proporcion de celulas (figura 16, cuadrante inferior derecho, panel A)

El panel A muestra el resultado del mezclado inmediato de poblaciones de celulas naranjas y verdes. Usando la compuerta indicada para excluir celulas no tefidas y fluorescencia doble de fondo (indicada en el panel B), los paneles C y D muestran doble marcaje tras la incubacion conjunta de celulas durante 15 minutos a 37 grados sin SPD (panel C) y con SPD (panel D) a 4 mcg/ml. El numero de celulas doblemente marcadas se potencia en presencia de SPD en un 80%.

Estos resultados en ratones deficientes en SPD revelan un papel crftico para SPD en la regulacion del aclaramiento de macrofagos apoptoticos y necroticos e indican que la terapia a base de rSPD (N/CRD) proporciona un enfoque novedoso en un espectro de enfermedad pulmonar que implica procesos inflamatorios mediados por macrofagos alveolares y otras enfermedades.

Sin embargo, los datos mostrados referentes a la implicancia de SPD en la regulacion y el aclaramiento de celulas apoptoticas tambien tienen implicaciones para anomalfas del desarrollo (por ejemplo, desarrollo pulmonar posnatal anomalo en enfermedad pulmonar neonatal tras parto prematuro), remodelacion de tejidos inflamados, proliferacion celular y cancer.

Ejemplo 10

Se somete a prueba la union de SPD y rSPD(n/CRD) (denominado fragmento recombinante de SPD, rSPD(n/CRD)) a ADN de una variedad de modos. En un primer ensayo, se usa microscopfa electronica para demostrar complejos entre ADN y SPD, y ADN y rfSPD. Vease la figura 18. Las imagenes obtenidas mediante microscopfa electronica demuestran que SPD y rSPD (n/CRD) se unen a ADN eficazmente.

En un segundo ensayo, mostrado en la figura 19, la union entre rSPD(n/CRD) y el hidrato de carbono manano se ve sometida a competicion por desoxirribonucleotidos, lo que sugiere que SPD se une a ADN mediante su capacidad de union a hidratos de carbono. Los desoxirribonucleotidos compiten eficazmente por la union a SPD con manano inmovilizado, mostrando que los nucleotidos se unen en disolucion.

En un tercer ensayo, mostrado en la figura 20, se incubaron macrofagos alveolares aislados de los ratones deficientes en SPD (principalmente apoptoticos), con concentraciones indicadas de rSPD(n/CRD) seguido por yoduro de propidio, y se determino el yoduro de propidio de color rojo que se unfa a la celula mediante analisis de FACS. En presencia de rSPD(n/CRD) 4 y 20 g/ml, el 11,4 y el 2,1% de las celulas contenfan yoduro de propidio, respectivamente, en comparacion con el 16,8% en ausencia de la protefna. Estos resultados muestran que rSPD(n/CRD) se une a ADN en las celulas apoptoticas.

Para obtener pruebas del defecto en el aclaramiento de ADN in vivo, se aislaron macrofagos alveolares de ratones deficientes en SPd (SPD(/)) y se comparo su capacidad para captar ADN con el de ratones de tipo natural y deficientes en SPA (SPA(/)). Los datos (figura 21) muestran que los macrofagos alveolares aislados de ratones deficientes en SPD producfan poco (4,0%) aclaramiento de ADN en comparacion con el de ratones de tipo natural (10,5%) o deficientes en SPA (13,2). Estos resultados sugieren que SPD desempefa un papel importante en la ruta de aclaramiento de ADN en el pulmon.

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Lista de secuencias

SEQ 1D NO: 1

Secuencia de aminoacidos de rSPD(n/CRD)

SEQ 1D NO: 2 25 Secuencia de nucleotidos de rSPD(n/GRD)

SEQ 1D NO: 3

Secuencia de nucleotidos del clon de ADNc de SPD humana (numero de registro NM 003019.1)

SEQ 1D NO: 4 Secuencia de aminoacidos de SPD humana (traducida de SEQ 1D NO: 3)

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Uso de protefna tensioactiva D (SPD) que tiene una secuencia mostrada en SEQ 1D NO: 4, o un fragmento que comprende al menos 100 aminoacidos de la misma que tiene actividad de union a hidratos de carbono, en la fabricacion de una composicion para el tratamiento de una infeccion microbiana del pulmon.
2.

Uso de protefna tensioactiva D (SPD) que tiene una secuencia mostrada en SEQ 1D NO: 4, o un fragmento que comprende al menos 100 aminoacidos de la misma que tiene actividad de union a hidratos de carbono, en la fabricacion de una composicion para el tratamiento de fibrosis qufstica.
3.

Uso segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2 de un polipeptido recombinante que comprende, que consiste preferiblemente en, un fragmento de SPD que tiene una secuencia mostrada en SEQ 1D NO: 1.
4.

Uso de un fragmento recombinante de polipeptido de protefna tensioactiva D (rSPD(N/CRD)) que tiene una secuencia mostrada en SEQ 1D NO: 1, o un fragmento o variante de la misma que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con SEQ 1D NO: 1 y que tiene actividad de union a hidratos de carbono, en la preparacion de un medicamento para el tratamiento de enfermedad pulmonar cronica neonatal, sfndrome de dificultad respiratoria neonatal, sfndrome de dificultad respiratoria del adulto, enfermedad obstructiva cronica de las vfas respiratorias, fibrosis pulmonar, enfisema, enfermedad pulmonar inflamatoria intersticial, sarcoidosis, neumonfa, enfermedad pulmonar inflamatoria cronica o enfermedad pulmonar inflamatoria cronica neonatal.
5.

Uso segun la reivindicacion 4, que usa un polipeptido de rSPD(N/CRD) que comprende, consiste preferiblemente en, la secuencia mostrada en SEQ 1D NO: 1.