DE68926919T2

DE68926919T2 - Vakzin gegen Nematoden

Info

Publication number: DE68926919T2
Application number: DE68926919T
Authority: DE
Inventors: Theodorus Antonius Al Dopheide; Maurice Joseph Frenkel Frenkel; Warwick Norman Grant War Grant; Keith William Savin Keit Savin; Barry Maxwell Wagland Wagland
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; Biotech Australia Pty Ltd
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; Biotech Australia Pty Ltd
Priority date: 1988-09-26
Filing date: 1989-09-26
Publication date: 1997-01-30
Anticipated expiration: 2009-09-27
Also published as: DE68926919D1; EP0540128A1; ATE141106T1; EP0540128B1

Description

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft die Identifizierung von Antigenen, die einem Wirt gegenüber einer Infektion durch parasitische Nematodenarten, wie solche Arten der Gattungen Trichinella, Ancyclostoma, Strongylus, Trichostrongylus, Haemonchus, Ostertagia, Ascaris, Toxascaris, Uncinaria, Trichuris, Dirofilaria, Toxocara, Necator, Enterobius, Strongyloides und Wuchereria, insbesondere der Gattungen Trichostrongylus und Haemonchus eine schützende Immunität verleihen. Beispiele solcher Arten schließen Trichinella spiralis, Ancylostoma caninum, Strongylus vulgaris, Trichostrongylus colubriformis, Haemonchus contortus, Ostertagia ostertagi, Ascaris suum, Toxascaris leonina, Uncinaria stenocephala, Trichuris vulpis, Dirofilaria immitis, die Larven von Toxocara spp., Necator americanus, Ancylostoma duodenale, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Enterobius vermicularus, Strongyloides stercoralis und Wuchereria bancrofti, insbesondere Trichostrongylus colubriformis und Haemonchus contortus ein.
Die Erfindung betrifft auch Nucleotidsequenzen, die diese Antigene kodieren, ebenso wie rekombinante DNA-Moleküle, die solche Nucleotidsequenzen enthalten und Wirtszellen, die diese Nucleotidsequenzen exprimieren.
Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Herstellung der Antigene, Nucleotidsequenzen, rekombinanten DNA-Moleküle und Wirte der Erfindung.
Die Erfindung betrifft Antikörper gegen die Antigene der Erfindung und Verbindungen, die in ähnlicher Weise, wie Antikörper, wirken.
Außerdem betrifft die Erfindung Impfstoffe, die eine schützende Immunität gegenüber einer Infektion mit parasitischen Nematoden verleihen, wie solchen Arten der Gattungen Trichinella, Ancyclostoma, Strongylus, Trichostrongylus, Haemonchus, Oszertagia, Ascaris, Toxascaris, Uncinaria, Trichuris, Dirofilaria, Toxocara, Necator, Enterobius, Strongyloides und Wuchereria, insbesondere der Gattungen Trichostrongylus und Haemonchus. Beispiele solcher Arten schließen Trichinella spiralis oder Angylostoma caninum bei Menschen, Strongylus vulgaris bei Pferden, Trichostrongylus colubriformis bei Schafen und Ziegen, Haemonchus contortus bei Schafen und Ziegen, Ostertagia ostertagi bei Vieh, Ascaris suum oder Trichinella spiralis bei Schweinen, Toxascaris leonina oder Uncinaria stenocephala bei Katzen, Ancylostoma caninum oder Trichuris vulpis bei Hunden, Dirofilaria immitis bei Hunden oder die Larven von Toxocara spp. bei Menschen oder eine Infektion mit Necator americanus, Ancylostoma duodenale, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Enterobius vermicularus, Strongyloides stercoralis oder Wuchereria bancrofti und insbesondere Trichostrongylus colubriformis oder Haemonchus contortus ein.

Stand der Technik

Nematoden (Nema - Faden; Oides - ähnlich), die unsegmentierte Rundwürmer mit länglichen, fusiformen oder sackartigen Körpern sind, die mit einer Cuticula bedeckt sind, sind in der Natur praktisch überall vorhanden, wobei sie Boden, Wasser und Pflanzen bewohnen, und sind an einer Vielzahl von Tier- und Pflanzenparasiten-Erkrankungen beteiligt.
Die Rundwurmparasiten von Säugetieren gehören zum Stamm der Nemathelminthes. Die Rundwürmer schließen den Hakenwurm (z.B. Necator americanus und Ancyclostoma duodenale), den Rundwurm (z.B. den gemeinen Rundwurm Ascaris lumbricoides), den Peitschenwurm (Trichuris trichiura) und den Madenwurm oder Fadenwurm (z.B. Enterobius vermicularus) ebenso ein wie Strongyloides stercoralis, Trichinella spiralis und den Filarienwurm Wuchereria bancrofti. Andere wichtige Rundwurm-Parasiten schließen Ancylostoma caninum (Infektionen bei Menschen), Strongylus vulgaris (Infektionen bei Pferden), Trichostrongylus colubriformis, Ostertagia circumcincta (Infektionen bei Schafen und Ziegen), Haemonchus contortus (Infektionen bei Schafen und Ziegen), Ostertagia ostertagi, Haemonchus placei (Infektionen bei Rindvieh), Ascaris suum (Infektionen bei Schweinen), Toxascaris leonia oder Uncinaria stenocephala (Infektionen bei Hunden), Toxocara spp (zirkulatorische Infektionen bei Menschen) und Dirofilaria immitis (zirkulatorische Infektionen bei Katzen und Hunden) ein.
Sogar wenn sie symptomfrei sind, sind parasitische Wurminfektionen für das Wirtstier aus einer Anzahl von Gründen schädlich; z.B. nehmen sie dem Wirt Nahrung, schädigen Organe oder verstopfen Durchgänge, können Substanzen ausscheiden, die für den Wirt toxisch sind und liefern eine Eintrittsöffnung für andere Organismen. In anderen Fällen kann der Wirt eine Art sein, die für die Nahrung gezüchtet wird und der Parasit kann beim Essen übertragen werden, indem er das Nahrung aufnehmende Tier infiziert. Es ist äußerst wünschenswert, solche Parasiten zu vernichten, sobald sie entdeckt werden.
Meistens sind solche Infektionen nicht symptomfrei. Helminthen-Infektionen bei Säugetieren, insbesondere mit parasitischen Nematoden, sind eine Quelle für große ökonomische Verluste, insbesondere bei Vieh und Haustieren, z.B. Schafen, Rindvieh, Pferden, Schweinen, Ziegen, Hunden, Katzen und Vögeln, insbesondere Geflügel (siehe CSIRO/BAE- Bericht:"Socio-economic Developments and Trends in the Agricultural Sector: Implications for Future Research"). Diese Tiere müssen regelmäßig mit anthelmintischen Chemikalien behandelt werden, um solche Infektionen unter Kontrolle zu halten, sonst kann diese Krankheit zu Anämie, Diarrhoe, Entwässerung, Appetitverlust und sogar dem Tod führen.
Das einzige derzeit verfügbare Mittel, um Helminthen-Infektionen zu kontrollieren, ist die Verwendung von anthelmintischen Chemikalien, aber diese sind nur gegenüber dem zur Zeit der Behandlung residenten Wurm wirksam. Daher muß die Behandlung kontinuierlich sein, da die Tiere ständig einer Infektion ausgesetzt sind; z.B. ist eine anthelmintische Behandlung mit Diethylcarbamazin jeden Tag oder jeden zweiten Tag die meiste Zeit des Jahres erforderlich, um Dirofilaria immitis oder den im Herzen von Hunden lebenden Fadenwurm zu kontrollieren. Dies ist ein teures und arbeitsintensives Verfahren. Wegen der weit verbreiteten Verwendung von anthelmintischen Chemikalien, können die Würmer eine Resistenz entwickeln und daher müssen neue und wirksamere Klassen von Chemikalien entwickelt werden. Eine alternative Lösung ist eindeutig wünschenswert.
Die Entwicklung eines Impfstoffs gegen parasitische Nematoden würde viele der Nachteile, die einer chemischen Behandlung zur Verhütung und Heilung von Helminthen-Infektionen inhärent sind, überwinden. Der Schutz würde sicher länger dauern, nur das geimpfte Tier wäre betroffen und die Probleme bezüglich Toxizität und Persistenz der Rückstände würden minimiert oder vermieden. Daher hat es verschiedene Versuche gegeben, über die berichtet wurde, solche Impfstoffe zu entwickeln unter Verwendung von parasitischen Nematoden; unglücklicherweise war der Erfolg nur begrenzt und Faktoren wie die Verfügbarkeit des Materials und die Impfstoffstabilität haben eine Verwendung in großem Maßstab ausgeschlossen.
Ein solcher Versuch, der von J.K. Dineen, (1977) beschrieben wird, betrifft die Verwendung von bestrahltem Larven als Impfstoff. Wie bei anderen Versuchen, ist der Nutzen dieser Methode beschränkt durch das Erfordernis, lebensfähige Nematoden über längere Zeiträume zu erhalten.
Es wurde angenommen, daß die Unfähigkeit abgetöteter Impfstoffpräparate, einen guten anthelmintischen Schutz zu verleihen, auf einer Anzahl von Faktoren beruht. Zum Beispiel wurde von J.T.M. Neilson (1975) angenommen, daß parasitische Nematoden Mechanismen entwickelt haben, durch die sie Produkte ausscheiden können, die das Immunsystem des Wirts unterdrücken oder modulieren, wodurch die Entwicklung einer wirksamen Immunantwort verhindert wird und der Wirt für andere Infektionen anfällig wird. Von Dineen und Wagland (1982) wird angenommen, daß Immunsuppressiva oder Immunmodulatoren in den rohen Präparaten von parasitischen Nematoden vorhanden sein könnten, die in den abgetöteten Impfstoffen verwendet werden. Ein zweites Problem, das in diesem Übersichtsartikel vorgeschlagen wird, besteht darin, daß parasitische Nematoden ihr Antigenprofil verändert haben könnten, so daß es dem des Wirts ähnelt, so daß bei einer natürlichen Infektion heftige immunologische Reaktionen durch schützende parasitische Antigene nicht hervorgerufen werden. Ein solches Phänomen würde auch auftreten nach einer Impfung mit unreinen Präparaten von abgetöteten Nematoden oder Extrakten davon.
Einige Forscher haben eine beschleunigte Austreibung von Würmern aus Wirtstieren gezeigt bei Verwendung von Gesamthomogenisaten von Würmern und unreinen Subfraktionen, siehe z.B. Rothwell und Mitarbeiter (1974, 1977, 1979), O'Donnell et al. (1985), Neilson und Van de Walle (1987), Silverman: US-PS 894603, Australisches Patent 247 354, Adams (1989), East et al. (1989), Munn und Greenwood (1987) (Australische Patentanmeldung Nr. 77590/87), Connan (1965), Savin et al. (1988) und McGillivery et al. (1988).
In all diesen Untersuchungen wurde rohe Extrakte von Nematoden verwendet, um Tiere zu impfen und es wurden keine definierten Antigene oder einzelne Komponenten der Extrakte identifiziert, die für den Schutz verantwortlich sind.
Es gab einige Berichte, in denen versucht wurde, gereinigte schützende Komponenten zu identifizieren, siehe z.B. Silberstein und Despommier (1985), Hoetz et al. (1985), Grandea et al. (1989), Lucius et al. (1988), Donelson et al. (1988), Nilsen et al. (1988). Jedoch wurde entweder kein Schutz gezeigt oder für die beschriebenen Komponenten nicht festgestellt.
Nur bei einem natürlichen Wirt/parasitischen Nematodensystem wurde gezeigt, daß eine gereinigte klonierte Untereinheit eine schützende Wirkung hat. In der Australischen Patentanmeldung Nr. 19998/88 wurde gezeigt, daß ein aus rekombinanter DNA stammendes Antigen, von dem gezeigt wurde, daß es Nematoden-Tropomyosin ist, einen 50%igen Schutz bei Schafen gegen einen Befall mit Haemonchus contortus ergab. Aus Gründen, die später in der Beschreibung offensichtlich werden, ist dieses Antigen verschieden von denen, die in der vorliegenden Beschreibung identifiziert wurden: die vorliegenden Antigene wurden in den exkretorischen/sekretorischen Flüssigkeiten von Nematoden nach einer in vitro Inkubation gefunden.
Das CSIRO/BAE-Arbeitspapier "Socio-economic Debelopments and Trends in the Agricultural Sector: Implications for Future Research" zitierte Darmparasiten als eines der drei dringendsten Gesundheitsprobleme in der Australischen Schafindustrie und zeigte, daß die Entwicklung von Impfstoffen sehr vielversprechend ist für eine bessere Kontrolle dieser Infektionen.
Es ist anerkannt, daß Tiere, die mit parasitischen Nematoden infiziert sind, eine Immunität entwickeln, die sie für eine nachfolgende Infektion weniger anfällig macht (siehe Rothwell 1989 als Überblick).
Obwohl gezeigt wurde (siehe z.B. O'Donnell et al. 1985), daß viele Parasitenproteine von dem Immunsystem infizierter Wirtstiere während der parasitischen Infektion erkannt werden, hat häufig die Immunantwort keine funktionelle Bedeutung in Bezug auf eine Resistenz gegenüber einer erneuten Infektion. Die Hauptstufe besteht darin, aus den vielen tausenden von Proteinen, die in dem parasitischen Organismus vorhanden sind, die einzelnen Proteine herauszufinden, die eine Immunantwort in dem Wirtstier induzieren können, die vor einer erneuten Infektion schützt.
Kürzliche Fortschritte in der Biotechnologie und insbesondere in der Gentechnik bieten realistisch die Möglichkeit, kommerziell lebensfähige Impfstoffe gegen eine Reihe von ökonomisch wichtigen Parasiten bei Menschen und Haustieren zu erzeugen. Diese Lösung würde viele der Probleme überwinden, von denen angenommen wurde, daß sie für die mangelnde Wirksamkeit abgetöteter Vakzinen unter Verwendung roher Parasiten-Präparate verantwortlich sind. Zum Beispiel würden die durch Gentechnik hergestellten Impfstoffe keine immunsupprimierenden oder immunmodulierenden Anteile enthalten, die sich in rohen Extrakten von parasitischen Nematodenarten finden. Es ist aber notwendig, zuerst die Antigene zu identifizieren. Sobald diese einmal identifiziert und charakterisiert sind, könnte die Gentechnik verwendet werden, um Mikroorganismen zu konstruieren, die solche Proteine oder Teile der Proteine, die schützende Epitope enthalten, zu synthetisieren und die von rekombinanten Organismen synthetisierten Produkte in Impfstoffen zu verwenden, um Tiere vor Infektionen mit den Parasiten zu schützen.
Die vorliegenden Erfinder haben im Detail die exkretorischen/sekretorischen Produkte ausgewachsener T. colubriformis untersucht und Komponenten aus der Mischung, die nach einer Impfung Tieren einen Schutz geben konnten, gereinigt und auf Molekülebene charakterisiert.

Beschreibung der Erfindung

Die vorliegenden Erfinder haben gefunden, daß eine schützende Immunität gegenüber einer Infektion durch parasitische Nematoden durch eine Immunisierung mit exkretorischen/sekretorischen Produkten einer parasitischen Nematodenart verliegen werden kann. Fünf Moleküle, die als Tc Ad ESA1, Tc Ad ESA2, Tc Ad ESA3, Tc Ad ESA4 und Tc Ad ESA5 bezeichnet werden, werden beschrieben, die aus den exkretorischen/sekretorischen Flüssigkeiten reifer, entwickelter Tiere von T. colubriformis gereinigt und gekennzeichnet wurden. Die vorliegenden Erfinder haben gefunden, daß bei einer Impfung diese Proteine bei Meerschweinchen eine schützende Reaktion gegenüber einer Infektion mit T. colubriformis induzieren.
Ausgewachsene Würmer wurden aus Schafen 21 Tage nach der Infektion gewonnen, gewaschen und 16 Stunden lang bei 37ºC in einem RPMI 1640-Kulturmedium, das Antibiotika enthielt, gehalten. Dieses Kulturmedium, das die exkretorischen/sekretorischen Flüssigkeiten von T. colubriformis enthält, wurde über Diaflo-Membranen eingeengt und durch Absorption an einer Linsenlectin-Sepharose-4B-Säule fraktioniert.
Die ungebundene Fraktion (LL&supmin;) und die gebundene Fraktion (LL&spplus;, eluierte mit Methylmannosid) enthielten jeweils nur wenige Proteinbanden und wurden weiter fraktioniert durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese und Elektroelution. Drei Proteine, die als Tc Ad ESA1, Tc Ad ESA2 und Tc Ad ESA5 bezeichnet werden, wurden aus der an Linsenlectin gebundenen Fraktion isoliert und weitere zwei Proteine, die als Tc Ad ES3 und Td Ad ES4 bezeichnet werden, wurden aus der ungebundenen Fraktion isoliert. Alle fünf Proteine verleihen eine Immunität gegen eine Infektion mit T. colubriformis nach einer intraperitonealen Injektion bei Meerschweinchen, einem Labormodell für Schafe.
Beispiele für die Antigene der Erfindung sind die gereinigten Proteine Tc Ad ESA1, Tc Ad ESA2, Tc Ad ESA3, Tc Ad ESA4 und Tc Ad ESA5 mit einem Molekulargewicht von 30, 37, 17, 11 bzw. 81 kD, bestimmt mit SDS-PAGE.
Gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung wird ein Antigen bereitgestellt, das umfaßt: ein exkretorisches/sekretorisches Protein, das aus einer ersten parasitischen Nematodenart stammt und einem Wirt eine schützende Immunität gegenüber einer Infektion durch eine zweite parasitische Nematodenart verleihen kann, die die gleiche wie oder eine andere als die erste Nematodenart sein kann; oder ein Proteinmolekül, das das gesamte exkretorische/sekretorische Protein, einen Teil, ein Analog, Homolog, Derivat oder eine Kombination davon umfaßt, wobei das Proteinmolekül bei einem Wirt eine schützende Immunität gegenüber einer Infektion durch einen parasitischen Nematoden induzieren kann.
Bevorzugt hat das exkretorische/sekretorische Protein ein ungefähres Molekulargewicht von 11, 17, 30, 37 oder 81 kD, geschätzt nach der SDS-PAGE.
Typischerweise wird die erste parasitische Nematodenart ausgewählt aus Arten der Gattungen Trichinella, Ancylostoma, Strongylus, Trichostrongylus, Haemonchus, Ostertagia, Ascaris, Toxascaris, Uncinaria, Trichuris, Dirofilaria, Toxocara, Necator, Enterobius, Strongyloides und Wuchereria. Beispiele für solche Arten schließen Trichinella spiralis, Ancylostoma caninum, Strongylus vulgaris, Trichostrongylus colubriformis, Haemonchus contortus, Ostertagia ostertagi, Ascaris suum, Toxascaris leonina, Uncinaria stenocephala, Trichuris vulpis, Dirofilaria immitis, Toxocara spp, Necator americanus, Ancylostoma duodenale, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Enterobius vermicularus, Strongyloides stercoralis und Wuchereria bancrofti ein.
Typischerweise wird die zweite parasitische Nematodenart ausgewählt aus Arten der Gattungen Trichinella, Ancylostoma, Strongylus, Trichostrongylus, Haemonchus, Ostertagia, Ascaris, Toxascaris, Uncinaria, Trichuris, Dirofilaria, Toxocara, Necator, Enterobius, Strongyloides und Wuchereria. Beispiele für solche Arten schließen Trichinella spiralis, Ancylostoma caninum, Strongylus vulgaris, Trichostrongylus calubriformis, Haemonchus contortus, Ostertagia ostertagi, Ascaris suum, Toxascaris leonina, Uncinaria stenocephala, Trichuris vulpis, Dirofilaria immitis, Toxacara spp., Necator americanus, Ancylostoma duodenale, Ascaris lumbricoides, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Enterobius vermicularus, Strongyloides stercoralis und Wuchereria bancrofti ein.
Bevorzugt ist die erste parasitische Nematodenart T. colubriformis.
Bevorzugt ist die zweite parasitische Nematodenart T. colubriformis oder H. contortus.
Gemäß einer zweiten Ausführungsform der Erfindung wird eine erste Nucleotidsequenz zur Verfügung gestellt, die die Aminosäuresequenz eines Antigens der ersten Ausführungsform kodiert; eine Nucleotidsequenz, die mit der ersten Nucleotidsequenz hybridisiert oder ein Nucleotid, das durch Mutation, einschließlich von einfachen oder mehrfachen Basensubstitutionen, Insertionen oder Deletionen mit der ersten Nucleotidsequenz verwandt ist.
Bevorzugte Nucleotidsequenzen der Erfindung sind die, die die exkretorischen/sekretorischen Proteine der ersten Ausführungsform kodieren mit einem ungefähren Molekulargewicht von 11, 17, 30, 37 bzw. 81 kD, bestimmt mit SDS-PAGE.
Bevorzugt ist die Nucleotidsequenz eine DNA-Sequenz. Die DNA- Sequenzen der vorliegenden Erfindung können z.B. hergestellt werden aus T. colubriformis-Zellen, indem die gesamte DNA daraus extrahiert wird und die Sequenzen mit Standardtechniken isoliert werden. Alternativ kann die DNA in vitro synthetisch oder biosynthetisch hergestellt werden, z.B. durch Verwendung einer mRNA-Matrize.
Gemäß einer dritten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, um eine DNA- oder RNA-Sequenz zu selektieren, die ein Antigen der ersten Ausführungsform kodiert, wobei das Verfahren umfaßt, daß eine oder mehrere DNA- oder RNA-Sequenzen bereitgestellt werden und bestimmt wird, welche der Sequenzen mit einer DNA- oder RNA-Sequenz hybridisiert, von der bekannt ist, daß sie ein Antigen der ersten Ausführungsform kodiert, oder daß ein Antiserum gegen das Antigen bereitgestellt wird und Wirt-Vektor-Kombinationen gefunden werden, die das Antigen exprimieren.
Die Sequenzen können aus natürlichen Quellen stammen, können RNA-Sequenzen, synthetische Sequenzen, DNA-Sequenzen aus rekombinanten DNA-Molekülen oder Kombinationen solcher Sequenzen sein.
Bevorzugt betrifft das Verfahren, das verwendet wird, um die DNA, die das Antigen kodiert, zu identifizieren und zu charakterisieren, die Extraktion einer mRNA-Art aus Zellen, die das Antigen produzieren, ihre Umwandlung in doppelsträngige DNA (cDNA) und deren Insertion in einen autonom replizierenden Faktor, z.B. ein Plasmid oder einen Phagenvektor. Daran schließt sich die Transformation einer Wirtszelle, z.B. eines Bakterienstamms, mit dem Faktor an und das Screenen der erzeugten Bibliothek mit synthetischen DNA-Sonden, die zu dem Antigen, das die mRNA- oder DNA-Sequenzen kodiert, komplementär ist, um die Klone nachzuweisen, die DNA enthalten, die das Antigen kodiert, im Gegensatz zu anderen proteinhaltigen Zellkomponenten.
Gemäß einer vierten Ausführungsform der Erfindung wird ein rekombinantes DNA-Molekül zur Verfügung gestellt, das eine DNA-Sequenz der dritten Ausführungsform und Vektor-DNA enthält.
Die DNA-Sequenz kann eine natürliche, synthetische oder biosynthetische DNA-Sequenz sein.
Bevorzugte rekombinante DNA-Moleküle der Erfindung schließen eine Expressions-Kontrollsequenz, die operativ mit der DNA- Sequenz verbunden ist, ein.
In einer bevorzugten Form der Erfindung ist die DNA-Sequenz operativ mit dem β-Galactosidasegen von E. coli verbunden. Andere bevorzugte Kontrollsysteme schließen die des Tryptophan-(Trp)-Operons, des Tra-T-Gens von E. coli, den linken Promotor des Bakteriophagen Lambda, den Cup 1-Promotor und Hybridpromotoren, wie Tac oder virale Promotoren, wie den frühen SV40-Promotor, ein.
Bevorzugt ist die Vektor-DNA Plasmid-DNA. Geeignete Plasmid- Vektoren schließen pUR290, pUC18, pYEUC114 und Derivate davon ein.
Alternativ kann die Vektor-DNA Bakteriophagen-DNA sein, z.B. vom Bakteriophagen Lambda und Derivaten davon, z.B. Lambda gt11 und Lambda gt10.
Gemäß einer fünften Ausführungsform der Erfindung wird ein fusioniertes Gen zur Verfügung gestellt, das einen Promotor, ein Translations-Startsignal und eine DNA-Sequenz der dritten Ausführungsform umfaßt.
Gemäß einer sechsten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zur Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls der vierten Ausführungsform, wobei das Verfahren umfaßt, daß man ein DNA-Insert bereitstellt, das eine DNA- Sequenz der dritten Ausführungsform umfaßt, und das DNA-Insert in einen Klonierungsvektor einsetzt.
Bevorzugt wird das DNA-Insert in den Klonierungsvektor in dem richtigen Abstand und korrekten Leserahmen im Hinblick auf die Expressions-Kontrollsequenz eingeführt.
Gemäß einer siebten Ausführungsform der Erfindung wird ein Wirt zur Verfügung gestellt, der mit mindestens einem rekombinanten DNA-Molekül der vierten Ausführungsform transformiert ist.
Bevorzugt kann der transformierte Wirt ein Antigen der ersten Ausführungsform exprimieren.
Geeignete Wirte schließen Bakterienzellen, Hefen, wie Saccharomyces cerevisiae Stamm CL13-ABSY86, andere Pilze, Wirbeltierzellen, Insektenzellen, Pflanzenzellen, menschliche Zellen, menschliche Gewebezellen, lebende Viren, wie Vaccinia und Baculovirus, und ganze eukaryotische Organismen ein.
Geeignete bakterielle Wirte schließen E. coli und andere enterische Organismen, Pseudomonas und Bacillusarten ein.
Bevorzugte Wirte sind E. coli K12-Derivate, insbesondere JM109 und Y1090.
Gemäß einer achten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, um einen Wirt zu transformieren, um einen transformierten Wirt der siebten Ausführungsform zu liefern, wobei das Verfahren umfaßt, daß man einen Wirt bereitstellt, den Wirt kompetent für die Transformation macht und in den Wirt ein rekombinantes DNA-Molekül der vierten Ausführungsform einführt.
Gemäß einer neunten Ausführungsform der Erfindung wird ein Expressionsprodukt eines transformierten Wirts der siebten Ausführungsform bereitgestellt, wobei das Produkt ein Antigen der ersten Ausführungsform umfaßt.
Bevorzugt wird das Expressionsprodukt im wesentlichen in reiner Form bereitgestellt.
Bevorzugt umfaßt das Expressionsprodukt eine erste Polypeptidsequenz, die zu dem Wirt homolog ist, und eine zweite Polypeptidsequenz, die eine Aminosäuresequenz ist, die ein Antigen der ersten Ausführungsform kodiert.
Bevorzugter ist die erste Aminosäuresequenz β-Galactosidase oder Tra-T oder jeweils ein Teil davon und die Wirtszelle ist E. coli.
Gemäß einer zehnten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren für die biologische Synthese eines proteinhaltigen Produktes bereitgestellt, das ein Antigen der ersten Ausführungsform umfaßt, wobei das Verfahren umfaßt, daß man: einen Wirt mit einem rekombinanten DNA-Molekül der vierten Ausführungsform transformiert, so daß der Wirt ein proteinhaltiges Produkt exprimieren kann, das ein Antigen der ersten Ausführungsform einschließt; den Wirt züchtet, um eine Expression zu erhalten und das proteinhaltige Produkt sammelt.
Gemäß einer elften Ausführungsform der Erfindung wird ein Epitop auf einem Antigen der ersten Ausführungsform zur Verfügung gestellt, das für die schützende Immunantwort verantwortlich ist. Das Epitop kann künstlich erzeugt werden durch die synthetische Herstellung von Oligopeptiden, die Sequenzen von Teilen des Antigens enthalten, die aus dem Ergebnis von immunochemischen Tests mit Fragmenten der in Bakterien erzeugten Proteine oder der als Ergebnis einer chemischen oder enzymatischen Spaltung von nativen oder rekombinanten Peptiden erzeugten Proteine vorhergesagt werden können.
Gemäß einer zwölften Ausführungsform der Erfindung wird ein Antikörper zur Verfügung gestellt, der gegen ein Epitop der elften Ausführungsform erzeugt wurde. Diese Antikörper oder Idiotypen können für den passiven Schutz von Tieren verwendet werden.
Gemäß einer dreizehnten Ausführungsform der Erfindung wird ein Antikörper bereitgestellt, der gegen die variable Region eines Antikörpers der zwölften Ausführungsform erzeugt wurde, ein sogenannter Anti-Idiotyp-Antikörper, der ein schützendes Epitop des Antigens nachahmt und als wirksamer Impfstoff für die aktive Immunisierung von Tieren verwendet werden kann.
Gemäß einer vierzehnten Ausführungsform der Erfindung wird ein Impfstoff bereitgestellt, der eine wirksame Menge eines oder mehrerer Antigene der ersten Ausführungsform, Expressionsprodukte der neunten Ausführungsform, Epitope der elften Ausführungsform und/oder Anti-Idiotyp-Antikörper der dreizehnten Ausführungsform zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff, Träger, Adjuvans und/oder Verdünnungsmittel umfaßt.
Bevorzugte Impfstoffe schließen solche ein, die für eine Verabreichung durch Injektion oder eine orale Verabreichung geeignet sind. Bevorzugte injizierbare Impfstoffe enthalten ein pharmazeutisch annehmbares Adjuvans.
Gemäß einer fünfzehnten Ausführungsform der Erfindung wird ein Antikörper bereitgestellt, der durch eine Impfung eines Wirts erzeugt wurde, indem ein oder mehrere Antigene, Expressionsprodukte, Epitope, Anti-Idiotyp-Antikörper und/oder Impfstoffe der vorliegenden Erfindung dem Wirt verabreicht wurden. Solche Antikörper schließen polyklonale und monoklonale Antikörper ein.
Es ist anerkannt, daß es Verbindungen gibt, die in ähnlicher Weise wie die Antikörper der fünfzehnten Ausführungsform wirken. Obwohl diese Verbindungen keine Antikörper sind, kann ihre Gegenwart in dem Wirt eine ähnliche schützende Wirkung wie Antikörper haben. In der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen soll sich die Bezugnahme auf Antikörper der fünfzehnten Ausführungsform auf diese Verbindungen erstrecken.
Gemäß einer sechzehnten Ausführungsform der Erfindung wird eine Antikörper-Zusammensetzung bereitgestellt, die mindestens einen Antikörper der zwölften und/oder fünfzehnten Ausführungsform zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel und/oder Hilfsstoff umfaßt.
Gemäß einer siebzehnten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Antigens der ersten Ausführungsform bereitgestellt, wobei das Verfahren umfaßt, daß man exkretorische/sekretorische Flüssigkeiten einer parasitischen Nematodenart sammelt; die Flüssigkeit durch Linsenlectin-Chromatographie mit Methylmannosid als Elutionsmittel fraktioniert; gebundene und ungebundene Fraktionen sammelt; weiter durch SDS-Gelelektrophorese fraktioniert und das Antigen elektroeluiert.
Gemäß einer achtzehnten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines fusionierten Gens der fünften Ausführungsform zur Verfügung gestellt, wobei das Verfahren umfaßt, daß man einen Promotor, ein Translations- Startsignal und eine DNA-Sequenz der dritten Ausführungsform bereitstellt und den Promotor, das Translations-Startsignal und die DNA-Sequenz operativ verbindet.
Gemäß einer neunzehnten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs der vierzehnten Ausführungsform bereitgestellt, wobei das Verfahren umfaßt, daß man eine wirksame Menge mindestens eines Antigens der ersten Ausführungsform und/oder ein Expressionsprodukt der neunten Ausführungsform und/oder ein Epitop der elften Ausführungsform und/oder einen Anti-Idiotyp-Antikörper der dreizehnten Ausführungsform mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel, Hilfsstoff und/oder Adjuvans vermischt.
Gemäß einer zwanzigsten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers der fünfzehnten Ausführungsform zur Verfügung gestellt, wobei das Verfahren umfaßt, daß man einen immunreaktiven Wirt mit einem Antigen der ersten Ausführungsform und/oder einem Expressionsprodukt der neunten Ausführungsform und/oder einem Epitop der elften Ausführungsform und/oder einem Anti-Idiotyp-Antikörper der dreizehnten Ausführungsform und/oder einem Impfstoff der vierzehnten Ausführungsform immunisiert.
Gemäß einer einundzwanzigsten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Anti-Idiotyp-Antikörpers der dreizehnten Ausführungsform bereitgestellt, wobei das Verfahren umfaßt, daß man einen immunreaktiven Wirt mit einem Antikörper der zwölften Ausführungsform immunisiert.
Gemäß einer zweiundzwanzigsten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Antikörper-Zusammensetzung der sechzehnten Ausführungsform bereitgestellt, wobei das Verfahren umfaßt, daß man eine wirksame Menge mindestens eines Antikörpers der zwölften und/oder fünfzehnten Ausführungsform mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel und/oder Hilfsstoff vermischt.
Gemäß einer dreiundzwanzigsten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, um einen Wirt, der eine solche Behandlung benötigt, vor einer Infektion mit einer parasitischen Nematodenart zu schützen, wobei das Verfahren umfaßt, daß man den Wirt mit einem Antigen, Expressionsprodukt, Impfstoff, Epitop und/oder Anti-Idiotyp-Antikörper der Erfindung impft.
Gemäß einer vierundzwanzigsten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, um einen Wirt, der eine solche Behandlung benötigt, gegen eine Infektion durch eine parasitische Nematodenart passiv zu schützen, wobei das Verfahren umfaßt, daß man den Wirt mit mindestens einem Antikörper der zwölften und/oder fünfzehnten Ausführungsform und/oder einer Antikörper-Zusammensetzung der sechzehnten Ausführungsform impft.
Die Menge an Antigen, Expressionsprodukt, Epitop und/oder Anti-Idiotyp-Antikörper, die mit dem Träger, Hilfsstoff, Verdünnungsmittel und/oder Adjuvans vereinigt werden kann, um eine einzige Impfdosierungsform herzustellen, variiert abhängig von der Infektion, die behandelt oder verhütet werden soll, dem zu behandelnden Wirt und der jeweiligen Verabreichungsart.
Es versteht sich auch, daß die spezifische Dosishöhe für jeden Wirt von einer Vielzahl von Faktoren abhängt einschließlich der Aktivität des spezifischen Antigens, Expressionsprodukts, Epitops, Anti-Idiotyp-Antikörpers und/oder angewendeten Impfstoffs, dem Alter, Körpergewicht, allgemeinen Gesundheitszustand, Geschlecht, der Nahrung, der Verabreichungszeit, dem Verabreichungsweg, der Ausscheidungsrate, der Arzneimittel-Kombination, der jeweiligen zu behandelnden oder zu verhütenden Infektion und der Schwere der jeweiligen Infektion, für die eine Behandlung oder Verhütung vorgesehen ist.
Der Impfstoff der vorliegenden Erfindung kann oral oder parenteral in Einheits-Dosierungs-Präparaten verabreicht werden, die, je nach Wunsch, übliche, nicht toxische, pharmazeutisch annehmbare Träger, Verdünnungsmittel, Adjuvantien und/oder Hilfsstoffe enthalten.
Injizierbare Präparate, z.B. sterile injizierbare wäßrige oder ölige Suspensionen können, wie es im Stand der Technik bekannt ist, formuliert werden unter Verwendung geeigneter Dispersions- oder Benetzungsmittel und Suspensionsmittel. Das steril injizierbare Präparat kann auch eine steril injizierbare Lösung oder Suspension in einem nicht toxischen parenteral annehmbaren Verdünnungsmittel oder Lösungsmittel sein, z.B. als Lösung in 1,3-Butandiol. Von den annehmbaren Trägern und Lösungsmitteln, die angewendet werden können, sind Wasser, Ringer-Lösung und isotonische Kochsalzlösung zu nennen. Außerdem werden sterile fette Öle üblicherweise als Lösungsmittel oder Suspensionsmedium angewendet. Für diese Zwecke kann jedes neutrale fette Öl angewendet werden, einschließlich von synthetischen Mono- oder Diglyceriden. Außerdem finden Fettsäuren, wie Ölsäure, Anwendung für die Herstellung von injizierbaren Lösungen.
Der Ausdruck "pharmazeutisch annehmbares Adjuvans" kann entweder Standard-Zusammensetzungen bedeuten, die geeignet sind für die menschliche Verabreichung oder typische Adjuvantien, die für Tier-Impfungen angewendet werden. Ein geeignetes Adjuvans kann aus denen ausgewählt werden, die der Fachmann üblicherweise verwendet.
Geeignete Adjuvantien für das Impfen von Tieren und Menschen schließen Aluminiumhydroxid und Ölemulsionen, wie Marcol 52: Montanide 888 (Marcol ist eine Marke von Esso. Montanide ist eine Marke von SEPPIC, Paris) ein, ohne darauf beschränkt zu sein. Andere Adjuvantien, die für die Verwendung für die vorliegende Erfindung geeignet sind, schließen Konjugate ein, die das Expressionsprodukt zusammen mit einem integralen Membranprotein prokaryotischen oder eukaryotischen Ursprungs umfassen, wie TraT.
Verabreichungswege, Dosierungen der zu verabreichenden Verbindungen ebenso wie die Häufigkeit der Injektionen sind alles Faktoren, die unter Anwendung von Fachwissen optimiert werden können. Typischerweise schließen sich an die Anfangsimpfung einige Wochen später eine oder mehrere "Booster"-Impfungen an, deren Nettowirkung die Erzeugung einer heftigen immunologischen Antwort ist, z.B. eines hohen Antikörpertiters gegen das Antigenepitop, den Anti-Idiotyp- Antikörper oder das Expressionsprodukt.
Feste Dosierungsformen für die orale Verabreichung können Kapseln, Tabletten, Pillen, Pulver und Körnchen einschließen. Bei solchen festen Dosierungsformen können Antigene, Epitope, Anti-Idiotyp-Antikörper und/oder Expressionsprodukte mit mindestens einem inerten Verdünnungsmittel, wie Saccharose, Lactose oder Stärke vermischt werden. Solche Dosierungsformen können auch, wie es üblich ist, andere Substanzen außer den inerten Verdünnungsmitteln enthalten, z.B. Gleitmittel, wie Magnesiumstearat. Im Fall von Kapseln, Tabletten und Pillen können Dosierungsformen auch Puffermittel enthalten. Tabletten und Pillen können zusätzlich mit enterischen Beschichtungen hergestellt werden.
Flüssige Dosierungsformen für die orale Verabreichung können Nanoteilchen, Mikrokapseln, LTB-Konjugate, Cholera oder die B-Untereinheit davon als Konjugat, in pharmazeutisch annehmbaren Emulsionen, Sirupen, Lösungen, Suspensionen und Elixieren, die inerte Verdünnungsmittel, die üblicherweise im Stand der Technik verwendet werden, wie Wasser, enthalten, einschließen. Solche Zusammensetzungen können auch Hilfsstoffe, wie Vernetzungsmittel, Emulsions- und Suspensionsmittel oder TraT als Konjugat und Süßstoffe, Aromastoffe und Duftstoffe einschließlich Zucker, wie Saccharose, Sorbit, Fructose, etc., Glykole, wie Polyethylenglykol, Propylenglykol etc., Öle, wie Sesamöl, Olivenöl, Sojaöl etc., Antiseptika, wie Alkylparahydroxybenzoat etc. und Aromastoffe wie Erdbeeraroma, Pfefferminzaroma etc. enthalten.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 zeigt eine SDS-PAGE-Analyse der LL&spplus;- und LL&supmin;-Fraktionen.
Figur 2 zeigt eine SDS-PAGE-Analyse von Tc Ad ESA 1,2,3,4 und 5.
Figur 3 zeigt eine SDS-PAGE-Analyse von Tc Ad ESA1 vor und nach der Deglycosylierung.
Figur 4 zeigt die Struktur einer TraT-Tc Ad ESA1-Fusion.
Figur 5 zeigt den Hefeexpressionsvektor pYEUC114, der verwendet wird, um Tc Ad ESA1 in Saccharomyces cerevisiae zu exprimieren.
Figur 6 zeigt die Detektion von ESA kodierenden Sequenzen in H. contortus und Dirofilaria immitis.

Beste Ausführungsform und andere Arten zur Durchführung der Erfindung

Die Nucleotidsequenzen, fusionierten Gene, rekombinanten DNA- Moleküle und transformierten Wirte der Erfindung werden hergestellt unter Verwendung von Standardtechniken der Molekularbiologie, wie denen, die bei Maniatis et al. (1982) beschrieben werden.
Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Nucleotidsequenzen ist zu bemerken, daß die interessierenden Gene und auch die cDNA-Kopien, die von diesen Genen gemacht werden, in geringer Ausbeute zur Verfügung gestellt werden können. PCR- (Polymerase-Kettenreaktion-) -Techniken können verwendet werden, um die relevante DNA zu amplifizieren, um den Nachweis und die Klonierung zu erleichtern.
Expressionsprodukte der Erfindung werden erhalten, indem die transformierten Wirte der Erfindung unter Standardbedingungen, die für den jeweiligen Wirt geeignet sind, gezüchtet werden und das Expressionsprodukt von der Kultur mit Standardtechniken getrennt wird. Das Expressionsprodukt kann in unreiner Form verwendet werden oder kann mit Standardtechniken, die für das herzustellende Expressionsprodukt und den jeweiligen Wirt geeignet sind, gereinigt werden.
Die Impfstoffe der Erfindung werden durch Vermischen hergestellt, indem Antigen, Expressionsprodukt, Anti-Idiotyp-Antikörper und/oder Epitop mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel, Hilfsstoff und/oder Adjuvans unter Verwendung von Standardmethoden der pharmazeutischen Herstellung vermischt, bevorzugt homogen vermischt werden.
Die Menge an Antigen, Expressionsprodukt, Anti-Idiotyp-Antikörper und/oder Epitop, die erforderlich ist, um eine Einzeldosierungsform herzustellen, variiert abhängig von der zu behandelnden oder zu verhütenden Infektion, dem zu behandelnden Wirt und der Art der Verabreichung. Die spezifische Dosishöhe für den jeweiligen Wirt hängt ab von einer Vielzahl von Faktoren einschließlich der Aktivität des Antigens, des Expressionsprodukts, des Anti-Idiotyp-Antikörpers und/oder des Epitops, die angewendet werden, dem Alter, dem Körpergewicht, dem allgemeinen Gesundheitszustand, dem Geschlecht und der Nahrung des Wirts, der Zeit der Verabreichung, dem Verabreichungsweg, der Ausscheidungsrate, der Arzneimittel-Kombination und der Schwere der Infektion, die behandelt wird.
Der Impfstoff kann oral oder parenteral in Einheits-Dosierungspräparaten verabreicht werden, die übliche, nicht toxische, pharmazeutisch annehmbare Träger, Verdünnungsmittel, Hilfsstoffe und/oder Adjuvantien, je nach Wunsch, enthalten.
Antikörper werden in geeigneten Wirten gezüchtet unter Verwendung von Standard-Impfplänen. Der Wirt wird mit einem Antigen, einem Expressionsprodukt, einem Epitop, einem Anti- Idiotyp-Antikörper und/oder einem Impfstoff der Erfindung geimpft.
Die Verbindungen, die in ähnlicher Weise wie Antikörper der Erfindung wirken, können gereinigte, natürlich vorkommende Verbindungen sein oder synthetisch hergestellt werden unter Verwendung von Standardtechniken einschließlich chemischen oder biosynthetischen Standardtechniken.
Die Antikörper-Zusammensetzung wird hergestellt, indem der Antikörper mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel und/oder Hilfsstoff unter Verwendung von Standardmethoden der pharmazeutischen Herstellung vermischt, bevorzugt homogen vermischt wird.
Die Menge an Antikörper, die erforderlich ist, um eine Einzeldosierungsform herzustellen, variiert abhängig von der zu behandelnden oder zu verhütenden Infektion, dem zu behandelnden Wirt und der jeweiligen Verabreichungsart. Die spezifische Dosishöhe für einen speziellen Wirt hängt ab von einer Vielzahl von Faktoren einschließlich der Aktivität des angewendeten Antikörpers, dem Alter, dem Körpergewicht, dem allgemeinen Gesundheitszustand, dem Geschlecht und der Nahrung des Wirtes, der Verabreichungszeit, dem Verabreichungsweg, der Ausscheidungsrate, der Arzneimittel-Kombination und der Schwere der Infektion, die behandelt wird.
Die Antikörper-Zusammensetzung kann oral oder parenteral in Einheits-Dosierungspräparaten verabreicht werden, die übliche, nicht toxische, pharmazeutisch annehmbare Träger, Verdünnungsmittel und/oder Hilfsstoffe, je nach Wunsch, enthalten.
Die Erfindung wird weiter beschrieben unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele.

Beispiel 1

Herstellung von exkretorischen/sekretorischen Antigenen (ESA) aus ausgewachsenen T. colubriformis

Junge gekreuzte Border Leicester-Merinolämmer, die 12 Monate alt sind und wurmfrei aufgezogen wurden, wurden mit 60.000 infektiösen Larven von T. colubriformis infiziert. 21 Tage nach der Infektion wurden die Schafe geschlachtet und die Nematoden aus dem Eingeweide durch Baermanisierung gewonnen. Die Würmer wurden in RPMI 1640 Kulturmedium, das Penicillin (100 Einheiten pro ml) und Streptomycin (100 µg/ml) enthielt, gewaschen und in dem gleichen Medium (ungefähr 1000 Würmer pro ml) 16 Stunden lang bei 37ºC in einem Inkubator mit 5 % CO&sub2; inkubiert. Die Lebensfähigkeit der Würmer wurde überwacht durch visuelle Untersuchung und routinemäßig waren mehr als 95 % am Leben und beweglich.
Die Würmer und große Bruchstücke wurden aus den Kulturmedien durch Filtration oder Zentrifugation entfernt. Der so erhaltene Überstand oder das so erhaltene Filtrat wird als ausgewachsenes ESA (Tc Ad ESA) bezeichnet.
Ähnliche Präparate, die als Tc L4 ESA bezeichnet werden, wurden aus Larven von T. colubriformis in der vierten Entwicklungsstufe hergestellt, die aus Schafen 7 bis 8 Tage nach der Infektion gewonnen wurden. Die anschließende Analyse der Komponenten der Extrakte mit Polyacrylamidgel-Elektrophorese in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS-PAGE) zeigte, daß L4 und Extrakte von ausgewachsenen Tieren ähnliche Antigene enthielten, wobei aber die Extrakte von den ausgewachsenen Tieren bevorzugt verwendet wurden, da sie mehr Material lieferten, als L4-Extrakte.

Beispiel 2

Impfung von Meerschweinchen mit L4 ESA und ESA von ausgewachsenen Tieren

Exkretorische/sekretorische Antigene wurden aus L4 und ausgewachsenen T. colubriformis hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Dieses Material wurde verwendet, um Meerschweinchen intraperitoneal zu impfen unter Verwendung des von O'Donnell et al. (1985) beschriebenen Verfahrens. Man kann sehen (Tabellen 1 und 2), daß das ESA von L4-Nematoden oder jungen ausgewachsenen Nematoden einen bedeutend höheren Schutz bei jedem Versuch ergab (62 bis 92 % Reduktion des Parasitismus). Tabelle 1 Schutz von Meerschweinchen mit L4 ESA und Fraktionen, die daraus mit Linsenlectin-Affinitäts-Chromatographie erhalten wurden
Den geimpften Tieren wurde intraperitonial das jeweilige Antigen injiziert (n bedeutet die Anzahl der Meerschweinchen in jeder Gruppe). Bei den Tieren wurde mit 2000 Larven 28 Tage später eine Immunreaktion ausgelöst und die Tiere getötet, um die Würmer 13 Tage nach der Exposition zu zählen. LL&spplus; ist Material, das von der Linsen-Lectin-Säule gebunden wurde und eluiert wurde. LL&supmin; ist das ungebundene durchlaufende Material. Tabelle 2 Schutz von Meerschweinchen mit ESA von ausgewachsenen Tieren und Fraktionen, die durch Linsen-Lectin-Affinitäts-Chromatographie daraus erhalten wurden
Den geimpften Tieren wurde intraperitoneal das jeweilige Antigen injiziert (n bedeutet die Anzahl der Meerschweinchen in jeder Gruppe). Bei den Tiere wurde mit 2000 Larven 28 Tage später eine Immunreaktion ausgelöst und die Tiere wurden getötet, um die Würmer 13 Tage nach der Exposition zu zählen. Das an die Linsen-Lectin-Säule gebundene Material ist LL&spplus;; das ungebundene ist LL&supmin;.

Beispiel 3

Fraktionierung von ESA von ausgewachsenen Tieren

Der Kulturüberstand wurde 40fach auf einer "Diaflo" (Amicon) YM10-Membran eingeengt. Die eingeengte Flüssigkeit wurde auf einer Linsen-Lectin-Sepharose-4B-(Pharmacia)-Säule (5 x 1 cm), die mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS; 10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,4) äquilibriert war, absorbiert. Die Säule wurde mit 100 ml TBS mit einer Durchflußrate von 1 ml/min gewaschen und die Fraktionen, die nicht absorbiertes Material enthielten (gemessen durch Absorbtion bei 280 nm) wurden gesammelt. Die spezifisch gebundenen Glykopeptide wurden von der Säule eluiert unter Verwendung einer Lösung von 2 % Methylmannosid in TBS. Die Fraktionen, die das Material enthielten, das bei 280 nm absorbierte, wurden gesammelt. Sowohl die an Linsenlectin gebundenen (LL&spplus;)- als auch ungebundenen (LL&supmin;)-Komponenten wurden aus der Lösung ausgefällt, indem 10 Volumina Methanol zugegeben wurden, die Mischung 16 Stunden lang auf -20ºC gekühlt und mit 12.000 x g 15 Minuten lang zentrifugiert wurde.
Als mit SDS-PAGE analysiert wurde (Figur 1) enthielt die LL&spplus;- Fraktion mit Coomassie gefärbte Banden mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 81, 37, 32 und 30 Kilodalton (kD) zusammen mit etwas Material mit geringem Molekulargewicht, verglichen mit den Molekulargewicht-Standards. Die LL&supmin;-Fraktion enthielt verschiedene Komponenten einschließlich von hervorgehobenen Banden bei etwa 28 bis 32, 17 und 10 bis 22 Kilodalton.

Beispiel 4

Impfung von Meerschweinchen mit L4 und ESA von ausgewachsenen Tieren, fraktioniert mit Linsenlectin

Das aus L4 oder ESA von ausgewachsenen Tieren durch Linsenlectin-Chromatographie hergestellte Material wurde verwendet, um Meerschweinchen intraperitoneal zu impfen (O'Donnell et al. 1985). Sowohl das gebundene Material als auch die nicht gebundene Fraktion ergaben bei Meerschweinchen einen bedeutend höheren Schutz, als sie anschließend mit T. colubriformis (Tabellen 1 und 2)ausgesetzt wurden. Es ist daher klar, daß es Komponenten sowohl in den gebundenen als auch den durchfließenden Fraktionen gibt, die eine schützende Immunantwort nach der Impfung hervorrufen können.

Beispiel 5

Weitere Fraktionierung von an Linsenlectin gebundenen und ungebundenen Komponenten von ESA von ausgewachsenen Tieren und Gewinnung einzelner Antigene auf präparativen SDS-Gelen

Proben der LL&spplus;- und LL&supmin;-Fraktionen von ausgewachsenen ESA (100 bis 500 mg Protein) wurden in Laemmli-Puffer (Laemmli, 1970) suspendiert und einer elektrophoretischen Trennung auf präparativen 12,5 % SDS-Polyacrylamidgelen unterzogen. Die Proteine wurden mit Coomassie R-250 sichtbar gemacht und elektroeluiert (Stearne et al., 1985).
Die hier beschriebenen Komponenten, die aus der LL&spplus;-Fraktion gewonnen wurden, waren Tc Ad ESA1, mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 30 kD; Tc Ad ESA2 mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 37 kD und Tc Ad ESA5 mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 81 kD (Figur 2). Die hier beschriebenen Komponenten, die aus der LL&supmin;-Fraktion gewonnen wurden, waren Tc Ad ESA3 mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 17 kD und Tc Ad ESA4 mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 11 kD (Figur 2).
Die LL&spplus;-Komponente mit 32 kD und die LL&supmin;-Komponenten mit 28 bis 30 kD (Figur 1) stehen wahrscheinlich in Beziehung zu dem LL&spplus;-Antigen mit 30 kD (Tc Ad ESA1), da Western-Transfers, die mit Antikörper gegen das gereinigte Tc Ad ESA1 aufgetrennt wurden, eine Kreuzreaktion mit diesen Komponenten zeigten. Wahrscheinlich beruhen diese Unterschiede zumindest teilweise auf verschiedenen Glykosylierungsgraden von Tc Ad ESA1, da eine Analyse der klonierten DNA-Sequenz darauf deutet, daß diese Komponente stark glykosyliert ist.

Beispiel 6

Impfung von Meerschweinchen mit gereinigten Antigenen

Die einzelnen Antigene, die von SDS-Gelen elektroeluiert wurden, wurden verwendet, um Meerschweinchen, wie in Beispiel 2 beschrieben, zu impfen. Bei den Meerschweinchen wurde mit T. colubriformis eine Immunreaktion ausgelöst und es wurde gezeigt, daß sie im wesentlichen vor Parasitismus geschützt waren (Tabellen 3 und 4). Tabelle 3 Schutz von Meerschweinchen durch Impfung mit gereinigten Antigenen, Tc Ad ESA1, Tc Ad ESA2 und Tc Ad ESA5 aus der an Linsenlectin gebundenen Fraktion (LL&spplus;)
Den Geimpften wurde intraperitoneal das jeweilige Antigen injiziert. Bei den Tieren wurde mit 2000 Larven 28 Tage später eine Immunreaktion ausgelöst und die Tiere dann getötet, um 13 Tage nach der Exposition die Würmer zu zählen (n bedeutet die Anzahl von Tieren in jeder Gruppe). Tabelle 4 Schutz von Meerschweinchen durch Impfung mit gereinigten Antigenen Tc Ad ESA3 und Tc Ad ESA4 aus der von Linsenlectin nicht gebundenen Fraktion (LL&supmin;)
Den Geimpften wurden intraperitoneal aus ausgewachsenen T. colubriformis ESA-Präparaten isolierte Antigene injiziert. Bei den Tieren wurde mit 2000 infektiösen Larven 28 Tage später eine Immunreaktion ausgelöst und die Tiere getötet, um 13 Tage nach der Exposition die Würmer zu zählen.
Aus den Ergebnissen in den Tabellen 3 und 4 ergibt sich eindeutig, daß Antigene, die von SDS-PAGE elektroeluiert wurden, sowohl in den LL&spplus;- als auch in den LL&supmin;-Fraktionen, Meerschweinchen einen beträchtlichen Schutz gegenüber einer Infektion durch T. colubriformis vermitteln konnten. Von besonderer Relevanz bei dieser Arbeit sind die Komponenten Tc Ad ESA1, Tc Ad ESA2 und Tc Ad ESA5 aus der LL&spplus;-Fraktion und die Komponenten Tc Ad ESA3 und Tc Ad ESA4 aus der LL&supmin;- Fraktion. Andere Tc Ad ESA-Komponenten hatten auch eine Wirkung und sind auch wichtig.
Die Impfung von Meerschweinchen mit Tc Ad ESA1 mit Alhydrogel als Adjuvans führte zu einem 63%igen Schutz. Eine Deglykosylierung von Tc Ad ESA1 führte nicht zu einer Verminderung des erhaltenen Schutzes (in Versuch 257 war die Anzahl der Würmer in den Kontrollen abnorm niedrig), was darauf hindeutet, daß der Proteinanteil des Moleküls den Schutz geben konnte: das Kohlenhydrat war offensichtlich nicht die schützende Komponente.

Beispiel 7

Analyse der Aminosäuresequenz der isolierten Peptide

Die Polypeptide, wie in Beispiel 5 beschrieben isoliert wurden, wurden analysiert auf ihre N-terminale Aminosäuresequenz an einem Gasphasen-Aminosäuresequenzer von Applied Biosystems. Um innere Sequenzen zu erhalten, wurde gereinigtes Protein mit Proteinase verdaut (37ºC, über Nacht, in 0,1 M NH&sub4;HCO&sub3;, pH 7,8 mit einem Verhältnis Enzym/Substrat von 5 % G/G). Die Peptide wurden mit HPLC aufgetrennt unter Verwendung einer 30 x 2,1 mm Aquapore RP-300-Säule mit einem Gradienten von 0,1 % TFA bis 0,1 % TFA/70 % Acetonitril. Einige der erhaltenen Aminosäuresequenzen sind in Tabelle 5 gezeigt: es wurde gefunden, daß die unterstrichenen Sequenzen besonders geeignet sind, um Informationen zu liefern, um Oligonucleotidsonden zu entwerfen, die für die Isolierung von cDNA-Klonen geeignet sind. Tabelle 5 Einige N-terminale und innere Aminosäuresequenzen von Tc Ad ESA1-5
Für Tc Ad ESA1 zeigte die Aminosäureanalyse nach Reduktion und Carboxymethylierung (O'Donnell et al., 1973) die Gegenwart von zwei Resten von Cystinhälften. Die Deglykosylierung von Tc Ad ESA1 mit N-Glycanase (Genzyme), die an Asparagin gebundene Kohlenhydrate entfernt, reduzierte das scheinbare Molekulargewicht von 30 kD auf 15 kD (Figur 3). Dies steht in Übereinstimmung mit der Information, die durch die cDNA-Sequenz geliefert wird (siehe unten).
Die Deglykosylierung von Tc Ad ESA2 durch die gleiche Behandlung verminderte das scheinbare Molekulargewicht, das mit SDS-PAGE analysiert wurde, von 37 kD auf ungefähr 30 kD.

Beispiel 8

Isolierung von rekombinanten Organismen, die die Gene enthalten, die die Tc Ad ESA-Komponenten kodieren

A. Konstruktion von cDNA-Bibliotheken

Messenger-RNA wurde aus den L4-Stadien von T. colubriformis isoliert, indem die Larven in einem Puffer, der Guanidinhydrochlorid (6 M), Natriumacetat (0,2 M, pH 5,2) und 2-Mercaptoethanol (50 mM) enthielt, vermahlen wurden, mit Ethanol ausgefällt wurden und auf einer Oligo(dT)-Cellulosesäule fraktioniert wurden. Die L4-PolyA&spplus;-mRNA wurde als Matrize für die Synthese von doppelsträngiger cDNA verwendet unter Verwendung des Amersham Ribonuclease H/DNA-Polymerase I-Kits (Amersham cDNA-Synthesesystem, #RPN.1256), wie vom Hersteller empfohlen. Nach der Zugabe von EcoRI- Linkern wurde die doppelsträngige cDNA in Lambda gt11 ligiert und in lebensfähige Bakteriophagen verpackt, die verwendet wurden, um E. coli Y1090-Zellen zu infizieren, im wesentlichen, wie von Huyn et al. (1985) beschrieben. Unter Verwendung der obigen Methoden wurde eine cDNA- Bibliothek erstellt, die aus 2 x 10&sup5; unabhängigen Rekombinanten bestand. Eine ähnliche Technik wurde verwendet, um eine cDNA-Bibliothek von ausgewachsenen Tieren in Lambda gt10 zu erstellen, die 1,5 x 10&sup5; unabhängige Rekombinanten enthielt.

B. Oligonucleotidsonden

i) Tc Ad ESA1

Die Aminosäuresequenz D I E Q L M P wurde verwendet, um eine degenerierte Oligonucleotidsonde zu entwerfen:

ii) Tc Ad ESA2

Die Aminosäuresequenz N P P I K D T P wurde verwendet, um eine degenerierte Oligonucleotidsonde zu verwenden, wobei Deoxyinosin an den Positionen mit 4facher Degeneration verwendet wurde

iii) Tc Ad ESA 3

Die Aminosäuresequenz D E E I I K D A wurde verwendet, um eine degenerierte Oligonucleotidsonde zu entwerfen

iv) Tc Ad ESA4

Die Aminosäuresequenz W M K G Q W Q N wurde verwendet, um eine Oligonucleotidsonde zu entwerfen v) Tc Ad ESA5
Alle Oligonucleotide sind das umgekehrte Komplement der DNA-Sequenz, die die ausgewählten Aminosäuresequenzen kodiert.

C. Selektion von Rekombinanten aus den cDNA-Bibliotheken

Die L4-cDNA-Bibliothek und die cDNA-Bibliothek der jungen ausgewachsenen Tiere in Lambda gt11 bzw. gt10 wurde amplifiziert und Aliquots wurden gescreent unter Verwendung der obigen synthetischen Oligonucleotide, um Duplikatfilterkopien zu sondieren, wie von Wallace et al. (1985) und Benton und Davis (1977) beschrieben.

D. Sequenz der cDNA-Klone

Eine Anzahl der selektierten Klone enthielt ein Insert, das wieder mit EcoRI geschnitten werden konnte und in M13mp18, der mit demselben Enzym verdaut worden war, subkloniert wurde. Die DNA-Sequenz der subklonierten Inserts wurde bestimmt unter Verwendung des Verfahrens von Sanger et al. (1980).
Die DNA-Sequenz verschiedener Klone der Tc Ad ESA1-cDNA wurde bestimmt und ist in Tabelle 6 zusammengefaßt. Die DNA-Sequenz enthält einen offenen Leserahmen, der ein Protein mit 130 Aminosäuren kodiert. Die N-terminale Aminosäuresequenz entspricht der Sequenz, die durch Gasphasen-Sequenzanalyse des aus Ad ESA1 isolierten Antigens erhalten wurde (in Tabelle 6 unterstrichen) und die zwei inneren Peptidsequenzen, die aus Armillaria mellea Verdaus von Tc Ad ESA1 erhalten wurden, konnten auch identifiziert werden. Ein E. coli Stamm TG1, der mit dem Plasmidvektor pTTQ18 transformiert war, der das Tc Ad ESA1-Gen enthielt, erhielt die intere Referenznummer BTA 1689.
Es wurde gezeigt, daß die Sequenz der DNA aus verschiedenen Isolaten eine gewisse Variation in der translatierten Aminosäuresequenz aufwies. Die Aminosäuren, die variiert waren, sind in Tabelle 6 doppelt unterstrichen. Die dem reifen Protein entsprechende Sequenz wurde bestimmt. Die Sequenz der angenommenen N-terminalen Leadersequenz muß noch bestimmt werden.
Die Aminosäuresequenz zeigt vier Stellen für eine potentielle N-gebundene Glykosylierung (Consensussequenz AsnXSer/Thr), die mit den Linsenlectin-Bindungseigenschaften dieses Antigens übereinstimmt und mit der veränderten Mobilität des Antigens in SDS-PAGE nach einer Behandlung mit N-Glycanase. Schließlich ist das Molekulargewicht, das aus der gezeigten Aminosäuresequenz berechnet wurde (15.300 Dalton) in enger Übereinstimmung mit dem, das für das mit N-Glycanase behandelte Antigen erhalten wurde (Figur 3). Tabelle 6 DNA-Sequenz der cDNA, die TcAdESA1 kodiert und die translatierte Aminosäuresequenz, die das ganze reife Protein kodiert
Die DNA-Sequenz des Klons, der Tc Ad ESA4 kodiert, ist in Tabelle 7 gezeigt. Die DNA-Sequenz enthält einen offenen Leserahmen, der ein Protein mit 92 Aminosäuren kodiert, und nur eine einzige potentielle Glykosylierungsstelle . Ein E. coli Stamm TG1, der mit einem hausinternen Vektor auf Basis pBR322 transformiert war, pBTA503, der das Tc Ad ESA4-Gen enthielt, erhielt die interne Referenznummer BTA1690. Die mangelnde Bindung an die Linsenlectinsäule und die enge Übereinstimmung zwischen dem geschätzten Molekulargewicht auf SDS-PAGE und dem vorhergesagten Molekulargewicht auf Basis der Sequenz deutet darauf hin, daß das Protein nicht glykosyliert ist. Tabelle 7 DNA-Sequenz der cDNA, die Tc Ad ESA4 kodiert und die translatierte Aminosäuresequenz
Die DNA-Sequenz des Teilklons, der Tc Ad ESA3 kodiert, ist in Tabelle 8 gezeigt. Die DNA enthält einen offenen Leserahmen, der ein Peptid mit 43 Aminosäuren kodiert. Die Sequenz, die der N-terminalen Aminosäuresequenz des natürlichen Proteins entspricht, ist unterstrichen. Ein E. coli Stamm DH5αF (BRL), der mit dem Plasmid pT&sub7;T&sub3; (Pharmacia) transformiert ist, das das Tc Ad ESA3-Genfragment, das in Tabelle 8 gezeigt ist, enthält, erhielt die interne Referenznummer BTA 1691. Tabelle 8 DNA-Sequenz der Teil-cDNA, die Tc Ad ESA3 kodiert und die translatierte Aminosäuresequenz

Beispiel 9

Expression von Tc Ad ESA1 als TraT-Fusion in E. coli

TraT ist ein äußeres Membran-Lipoprotein in bestimmten Stämmen von E. coli. Es wurde das Gen kloniert, das TraT kodiert, das erhalten wurde aus dem Plasmid R100 mit antibiotischer Resistenz (T.T. Ogata et al., 1982, J. Bact. 151 819-827) und dieses Gen wurde in ein Plasmid überführt, in dem die Expression von TraT unter der Kontrolle des linken Promotors (PL) des Bakteriophagen Lambda ist. Ein hoher Gehalt an TraT kann erhalten werden, wenn die Zellen, die den thermolabilen Repressor von PL, λcI857 beinhalten (E. Remaut et al., 1980, Gene 15, 81-93) bei 38 bis 42ºC inkubiert werden.
Das Gen, das Tc Ad ESA1 kodiert, wurde an Position 5' mit der kodierenden Region von TraT fusioniert auf solche Weise, daß das neue Gen die ersten 30 Aminosäuren von TraT (einschließlich der 20 Aminosäure langen Signalsequenz) kodiert und sich einige Aminosäuren, die durch Restriktionsstellen erzeugt werden, die für die DNA-Manipulierungen verwendet werden und das Gen, das Tc Ad ESA1 kodiert anschließen (Figur 4). Die Insertion an dieser Position des TraT-Gens wurde möglich durch die Erzeugung einer PvuII-Restriktionsstelle an den Codons 31 und 32 des TraT-Gens durch punktgerichtete Mutagenese. Das Tc Ad ESA1-Gen wurde erhalten als XmnI- (erzeugt durch Schneiden an der EcoRI-Stelle und Auffüllen mit DNA- PolymeraseI-Klenow-Fragment - und erneute Ligierung)-HindIII- Fragment mit 570 bp.
In einem geeigneten E. coli Wirt führt das Erhöhen der Temperatur einer Kultur zur Erzeugung des TraT-Tc Ad ESA1- Fusionsproteins mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 22 kD in einem Anteil von bis zu 50 mg/l/OD&sub6;&sub0;&sub0;.
Die Signalsequenz kann von dem Fusionsprodukt abgespalten werden (was normalerweise der Fall ist, wenn TraT in E. coli produziert wird), wenn der Expressionsgrad die Prozessierungsfähigkeit der Zelle nicht überschreitet und das endständige Cystein kann weiter modifiziert werden. Wenn dieses TraT-Immunogen-Fusionsprodukt erzeugt wird, kann diese Modifikation vorteilhaft sein, da sie das Protein selbst zu einem Adjuvans macht (Internationale Patentanmeldung PCT/AU87/00107, Titel: Immunopotentierung).

Expression von Tc Ad ESA4 als TraT-Fusion

Das Gen, das Tc Ad ESA4 kodiert, wurde mit dem 5'-Teil der kodierenden Region von TraT in identischer Weise wie das Tc Ad ESA1-TraT-Konstrukt fusioniert. Die gesamte kodierende Region von Tc Ad ESA4 (92 Aminosäuren) wird als TraT-Tc Ad ESA4-Fusion unter der Kontrolle des linken Lambda-Promotors exprimiert.

Klonierung in pYEUC114 und Expression in Hefe

Das cDNA-Fragment, das Tc Ad ESA1 kodiert, wurde in einen Hefe-Expressionsvektor, pYEUC114 (Figur 5) insertiert, der in der CSIRO-Abteilung der Biotechnologie entwickelt wurde. Für diesen Vektor wird das Cup 1-Gen (das Metallothionin kodiert) von Saccharomyces cerevisiae angewendet. Der begleitende Promotor ist durch Kupfer induzierbar, wenn dieses in Hefezellen enthalten ist. Die Cup 1-Genkasette, die den durch Kupfer induzierbaren Cup 1-Promotor und eine Multiklonierungsstelle enthält, wird in der Australischen Patentanmeldung Nr. 15845/88 und in Macreadie et al., Plasmid 2, 147-150 beschrieben. Das EcoRI-Fragment, das die (vorher beschriebene) Tc Ad ESA1-cDNA enthält, wurde in pYEUC114 insertiert, wobei es den größten Teil der Cup 1 kodierenden Sequenz ersetzt. Dieses führt zur Synthese eines Fusionsproteins, das aus vier Aminosäuren aus dem N-Ende von Metallothionin besteht, woran sich die in Tabelle 6 gezeigte Sequenz anschließt. Saccharomyces cerevisiae-Zellen (Stamm CL13-ABSY86 [α, ΔUra3 leu2 his pral pbrl prcl cpsl]), die das rekombinante Plasmid (pYEUC30B4E) tragen, wurden in Minimalmedium, das Histidin und Leucin enthielt, gezüchtet. Um die Expression von Tc Ad ESA1 zu induzieren, wurde Kupfersulfat dem Kulturmedium auf 0,5 mM zugegeben. Nach 2 Stunden in Gegenwart von Kupfer wurden die Zellen geerntet, mit Zymolyase versetzt, um die äußere Hefezellwand zu entfernen und dann mit SDS-PAGE und Westernblots untersucht. Das rekombinante Plasmid, das Tc Ad ESA1 kodierende DNA enthielt, wurde pYEUC30B4E genannt.

Beispiel 10

Reinigung von rekombinanten Antigenen aus Bakterien und Hefe

Die von den rekombinanten E. coli-Zellen exprimierten Antigene können für Impfversuche gereinigt werden. Im folgenden ist beispielhaft dargestellt, wie Tc Ad ESA1 isoliert wird.
Bakterienzellen, die das in Beispiel 9 beschriebene rekombinante Plasmid enthalten, werden in einem geeigneten Medium bei 28ºC gezüchtet und die Expression von Tc Ad ESA1 wird induziert, indem die Temperatur auf 42ºC erhöht wird und die Kulturen bei dieser Temperatur 4 bis 6 Stunden lang inkubiert werden. Die Zellen werden aus den Kulturen durch Zentrifugation mit 10.000 x g 10 Minuten lang bei 4ºC gewonnen. Das Pellet wird dann in einem geeigneten Puffer, z.B. 50 mM Tris- HCl, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl, pH 8,0 resuspendiert und die Zellen werden durch Zentrifugation, wie vorher, pelletisiert. Das gewaschene Pellet wird in einem Puffer, z.B. 50 mM Tris- HCl, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 0,1 mM PMSF, pH 8,0 resuspendiert und in einem Marton-Gaulin-Homogenisator homogenisiert mit 6 Durchläufen bei 9000 psi. Das Zell-Homogenisat wird dann mit 20.000 x g 20 Minuten lang bei 4ºC zentrifugiert, um die dichten Einschlußkörper zu sammeln, die das rekombinante Antigen enthalten. Der Überstand wird abdekantiert und verworfen und das Pellet wird in einer Lösung resuspendiert, die die Proteine in den Einschlußkörpern solubilisieren kann, z.B. 8 M Harnstoff, 100 mM NaPi, 1 mM EDTA, 40 mM DTT, pH 8,5 und 4 Stunden lang unter Rühren bei 37ºC inkubiert. Das solubilisierte Antigen kann gewonnen werden, indem die Lösung durch eine "Diaflo" Amicon YM30-Membran geleitet wird und anschließend das Eluens auf einer "Diaflo" Amicon YM10 Membran konzentriert wird. Das Retentat kann dann auf einen pH von 3,0 eingestellt werden durch Zugabe von Phosphorsäure, 1:1 mit 8 M Harnstoff verdünnt werden, um die Na&spplus;-Konzentration auf 50 mM zu reduzieren und über eine Säule mit S-Sepharose "Fast Flow", die mit 8 M Harnstoff, 50 mM NaPi, 5 mM EDTA, 5 mM DTT, pH 3,0 äquilibriert ist, geleitet werden. Das rekombinante Antigen wird von der Säule mit einem Gradienten von 50 bis 400 mM NaPi eluiert. Die Fraktionen, die das rekombinante Tc Ad ESA-Antigen mit 21 kD enthalten, werden gepoolt und auf einer "Diaflo" Amicon YM10-Membran konzentriert. Dieses Konzentrat wird dann auf 0,1 % SDS gebracht und dialysiert in einem Dialysesack mit einem Ausschluß bei 1.000 D gegen 8 M Harnstoff, 50 mM NaPi, 2 mM DTT, 0,1 % SDS, pH 8,5, um die Na&spplus;-Konzentration auf 50 mM zu reduzieren und den pH auf 8,5 zu erhöhen. Das Antigen kann dann bei Raumtemperatur 24 Stunden lang gegen eine Lösung dialysiert werden, die 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 0,006 mM oxidiertes Glutathion, 0,06 mM reduziertes Glutathion, 0,1 % SDS, pH 8,5 enthält, und schließlich bei Raumtemperatur 24 Stunden lang gegen eine Lösung, die 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 0,1 % SDS, pH 7,4 enthält, dialysiert werden. Das aus dem Dialysesack gewonnene Antigen kann durch Filtration durch ein 0,22 µm Filter sterilisiert werden, bevor es in einem geeigneten Adjuvans vor der Impfung von Wirtstieren formuliert wird.
Ein ähnlicher Versuch kann unternommen werden, um die anderen rekombinanten Antigene gemäß dieser Beschreibung zu reinigen, obwohl die Details der Reinigungsschritte sich bei jedem Antigen unterscheiden.

Herstellung von rekombinantem Tc Ad ESA1 aus Hefe

Hefezellen, die pYEUC30B4E tragen, wurden 2 Tage in Minimalmedium, das Histidin und Leucin enthielt, gezüchtet. Die Zellen wurden dann in frisches Medium gegeben, weitere 2 Stunden inkubiert und dann wurde Kupfersulfat auf 0,5 mM zugegeben. Die Inkubation wurde weitere 2 Stunden lang fortgesetzt, wonach die Zellen durch Zentrifugation geerntet wurden und unter Verwendung des Braun-Zellhomogenisators nach den Anweisungen des Herstellers lysiert wurden. Kurz gesagt wurden die Zellen aufgebrochen, indem sie mit Glaskugeln bei hoher Geschwindigkeit geschüttelt wurden. Die Glaskugeln wurden durch die Schwerkraft absetzen gelassen und das Zellysat gesammelt. Das rohe Lysat wurde mit 15.000 Upm zentrifugiert und der entstehende Überstand und das Pellet auf die Gegenwart von Tc Ad ESA1-Protein untersucht. Letzteres wurde ausschließlich in dem 15 kUpm-Pellet gefunden. Dieses Pellet wurde anschließend in 50 mM Ammoniumbicarbonatlösung, die 8 M Harnstoff, 2 % SDS, 10 mM EDTA und 2 % Mercaptoethanol enthielt, gelöst. Dieses rohe Material wurde dann unter Verwendung einer Sephadex G75-Säule, die mit 50 mM Ammoniumbicarbonat-Lösung, die 1 mM EDTA, 0,1 % SDS und 0,1 % Mercaptoethanol enthielt, betrieben wurde, aufgetrennt. Die Fraktionen, die Material mit dem für Tc Ad ESA1 (nicht glykosyliert) erwarteten Molekulargewicht enthielten und mit einem Antiserum (R45), das in Kaninchen gegen Tc Ad ESA1 aus ausgewachsenen Parasiten gezüchtet worden war, reagierten, wurden gepoolt und in nachfolgenden Impfversuchen verwendet.

Beispiel 11

Schutz für den Wirt unter Verwendung von in Hefe produziertem rekombinantem Tc Ad ESA1

Meerschweinchen wurden mit einem Präparat aus rekombinantem Tc Ad ESA1 geimpft und mit T. colubriformis eine Immunreaktion ausgelöst, wie oben beschrieben. Es ist anzumerken, daß die Anzahl der Würmer in den Kontrolltieren ungewöhnlich niedrig war und in diesem speziellen Versuch streute. In vorherigen Fällen, wo dies auftrat (siehe z.B. Tabelle 3, Versuch 257) führten wiederholte Versuche zu einem erhöhten Maß an Schutz (siehe z.B. Tabelle 3, Versuch 236).

Beispiel 12

Ausdehnung auf andere Parasiten

Die durch Gentechnologie erzeugten Tc Ad ESA-Antigene können eine schützende Immunreaktion gegen einen Befall mit T. colubriformis bei geimpften Tieren induzieren. Es ist möglich, daß diese Immunantwort auch einen Schutz gegen andere Arten von parasitischen Nematoden liefert, z.B. denen, die an anderer Stelle in der Beschreibung zitiert wurden, aber es ist wahrscheinlicher, daß die anderen Arten von parasitischen Nematoden Proteine exprimieren, die verwandt, aber nicht identisch mit den Tc Ad ESA-Antigenen sind. Für die meisten Arten von parasitischen Nematoden ist es nicht praktisch, um ausreichend parasitisches Material zu erhalten, diese Komponenten zu reinigen und ihre Struktur zu identifizieren zur Herstellung für die Klonierung des Gens aus diesen Parasiten und die Möglichkeit eines Schutzes durch diese Komponenten zu testen. In diesen Fällen ist das einzige Mittel, mit dem verwandte Antigene getestet werden können, rekombinante DNA- Methoden zu verwenden, um das Gen, das die verwandten Proteine kodiert, zu isolieren und die verwandten Proteine in rekombinanten Organismen zu exprimieren, die verwandten Proteine aus diesen rekombinanten Organismen zu reinigen und Tiere zu impfen und mit der anderen Art von parasitischen Nematoden eine Immunreaktion auszulösen. Sogar in den Fällen, wo es möglich ist, ausreichend Parasitenmaterial zu erhalten, um Antigene zu reinigen, ist der obige Ansatz unter Verwendung der Molekularbiologie, um Gene, die schützende Antigene kodieren, die mit dem Tc Ad ESA-Antigen verwandt sind, zu klonieren, ein bevorzugter Ansatz, um Impfstoffe zu entwickeln. Um zu zeigen, daß dieser Ansatz möglich ist, zeigt das folgende Beispiel, daß es Gene gibt, die mit Tc Ad ESA1 und 4 verwandt sind bei zwei Arten von parasitischen Nematoden außer T. colubriformis, nämlich Haemonchus contortus, der ein Labmagenparasit bei Schafen und Ziegen ist und Dirofilaria immitis, der ein Parasit bei Hunden und Katzen ist.
Genomische DNA wurde aus den drei Parasitenarten mit dem von Herrmann und Frischauf 1987 beschriebenen Verfahren gereinigt. 1 µg jedes DNA-Präparates wurde mit jedem der Restriktionsenzyme BamHI, PstI und HindIII (Promega) verdaut. Die verdaute DNA zusammen mit geeigneten Größenmarkern wurde in 0,4 % Agarosegelen elektrophoretisch aufgetrennt, um die DNA- Fragmente nach ihrer Größe zu trennen. Nach Anfärben der Gele mit Ethidiumbromid und Photografieren der DNA wurde die DNA in den Gelen auf positiv geladene Nylonmembranen überführt durch alkalischen Transfer und die Membranen für die Hybridisierung vorbereitet, wie vom Hersteller empfohlen (Amersham). Fragmente der DNA, die Tc Ad ESA1 und 4 kodierten, wurden mit ³²P markiert mit der Random-Labelling-Methode, die in dem Kit, der von Boehringer Mannheim verkauft wird, beschrieben wird. Die Filter wurden dann 20 Stunden bei 42ºC in einer Lösung mit 5 x SSPE, 5 x Denhardts-Lösung, 0,5 % SDS und 20 µg/ml denaturierter Herring-Sperma-DNA (siehe Maniatis et al. 1982), die 10&sup6; cpm/ml radioaktive Tc Ad ESA-DNA enthielt, inkubiert. Die Filter wurden dann gewaschen, um alle nicht spezifisch gebundene DNA zu entfernen und einem Röntgenfilm ausgesetzt. Figur 6 zeigt, daß es spezifische DNA-Sequenzen sowohl in H. contortus- als auch D. immitis-DNA gibt, die mit den Tc Ad ESA-DNA-Fragmenten hybridisieren. Dies zeigt, daß diese DNA-Sequenzen aus genomischen DNA-Bibliotheken oder aus cDNA-Bibliotheken kloniert werden könnten oder mit anderen rekombinanten DNA-Techniken, z.B. der Polymerase-Kettenreaktion, hergestellt werden könnten, aus diesen Arten von Parasiten und bei Extrapolation aus allen anderen Arten von parasitischen Nematoden und rekombinanten Organismen, die die verwandten Gene synthetisieren, konstruiert werden könnten, zur Verwendung als Impfstoffe gegen die anderen Arten von parasitischen Nematoden.

Beispiel 13

Übertragung in größeren Maßstab zur Herstellung von kommerziellen Impfstoffen

Die Herstellungs- und Reinigungstechniken, die bisher beschrieben wurden, wurden im Labormaßstab durchgeführt. Für die kommerzielle Produktion der erfindungsgemäßen Antigene ist eine Fermentation von transformierten Wirten in großem Maßstab erforderlich.
Fermentationen in großem Maßstab werden mit Standardtechniken durchgeführt, wobei die jeweils ausgewählten Techniken für den transformierten Wirt, der für die Herstellung des Antigens verwendet wird, geeignet sein müssen.

Industrielle Anwendung

Die Erfindung liefert Antigene, die als wirksamer Impfstoff für einen Schutz von Tieren vor Parasitismus durch parasitische Nematoden, insbesondere Trichostrongylus colubriformis und Haemonchus contortus, verwendet werden können.
Antikörper, die gegen die gereinigten Antigene gezüchtet wurden, die aus Trichostrongylus colubriformis isoliert wurden, und die DNA-Sequenzen, die diese Proteine kodieren, können verwendet werden, um verwandte Polypeptide und Gene, die die Antigene aus anderen Arten von parasitischen Nematoden als Trichostrongylus colubriformis kodieren, zu identifizieren. Die gleichen DNA-Sequenzen und Antikörper können verwendet werden, um verwandte Antigene und Gene, die diese Proteine bei einer Anzahl weiterer Nematoden kodieren, zu identifizieren, die für den Menschen und für Haustiere Parasiten sind und es ist davon auszugehen, daß diese Proteine einen wirksamen Impfstoff gegen Parasitismus durch diese Arten von Nematoden liefern, unabhängig davon, ob sie aus den Parasiten selbst isoliert wurden oder durch rekombinante DNA-Technik erzeugt wurden. Die Arten von Parasiten und Wirte, die sie infizieren können, schließen z.B. ein: Trichinella spiralis oder Ancylostoma caninum-Infektionen bei Menschen, Strongylus vulgaris-Infektionen bei Pferden, Trichostrongylus colubriformis-Infektionen bei Schafen, Haemonchus contortus-Infektionen bei Ziegen, Ostertagia ostertagi-Infektionen bei Vieh, Ascaris suum oder Trichinella spiralis-Infektionen bei Schweinen, Toxascaris leonina oder Uncinaria stenocephala- Infektionen bei Katzen und Ancylostoma caninum oder Trichuris vulpis-Infektionen bei Hunden ebenso wie Infektionen des Kreislaufsystems bei Menschen durch Larven von Toxocara spp und des Kreislaufsystems von Hunden durch Dirofilaria immitis, ebenso wie Jnfektionen des Kreislaufsystems, des Urogenitalsystems, des Respirationssystems, der Haut und der subcutanen Gewebe dieser und anderer Arten von Tieren. Es ist anzumerken, daß diese Liste in keiner Weise vollständig ist.

Claims

1. Antigen, enthaltend ein exkretorisches/sekretorisches Protein, das von einer parasitischen Stufe von Trichostrongylos colubriformis stammt und einem Wirt eine schützende passive Immunität gegen eine Infektion durch parasitische Nematoden verleihen kann, dadurch gekennzeichnet, daß es ein ungefähres Molekulargewicht von 11 kD gemäß SDS-PAGE hat und die folgende Aminosäuresequenz aufweist:

ein ungefähres Molekulargewicht von 17 kD gemäß SDS-PAGE hat und die folgende Aminosäuresequenz aufweist:

ein ungefähres Molekulargewicht von 30 kD gemäß SDS-PAGE hat und die folgende Aminosäuresequenz aufweist:

ein ungefähres Molekulargewicht von 37 kD gemäß SDS-PAGE hat und die folgenden Aminosäuresequenzen aufweist:

oder ein ungefähres Molekulargewicht von 81 kD, gemessen mit SDS-PAGE hat und die aminoterminale Aminosäuresequenz

Ser Xaa Ser Leu Lys Asp

hat oder ein Teil des exkretorischen/sekretorischen Proteins, ein analoges, homologes exkretorisches/sekretorisches Protein oder Kombinationen davon.

2. Antigen, umfassend ein exkretorisches/sekretorisches Protein nach Anspruch 1 mit einem ungefähren Molekulargewicht von 11 kD gemäß SDS-PAGE.

3. Antigen, umfassend ein exkretorisches/sekretorisches Protein nach Anspruch 1 mit einem ungefähren Molekulargewicht von 17 kD gemäß SDS-PAGE.

4. Antigen, umfassend ein exkretorisches/sekretorisches Protein nach Anspruch 1 mit einem ungefähren Molekulargewicht von 30 kD gemäß SDS-PAGE.

5. Antigen, umfassend ein exkretorisches/sekretorisches Protein nach Anspruch 1 mit einem ungefähren Molekulargewicht von 37 kD gemäß SDS-PAGE.

6. Antigen, umfassend ein exkretorisches/sekretorisches Protein nach Anspruch 1 mit einem ungefähren Molekulargewicht von 81 kD gemäß SDS-PAGE.

7. Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz eines Antigens nach einem der Ansprüche 1 bis 6 kodiert.

8. Nucleotidsequenz nach Anspruch 7, worin die Nucleotidsequenz eine DNA-Sequenz ist.

9. DNA-Sequenz nach Anspruch 8 umfassend:

10. DNA-Sequenz nach Anspruch 8, umfassend:

11. DNA-Sequenz nach Anspruch 8, umfassend:

12. Verfahren zum Selektieren einer DNA- oder RNA-Sequenz, die ein Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 6 kodiert, wobei das Verfahren umfaßt, daß man ein oder mehrere DNA- oder RNA-Sequenzen bereitstellt, feststellt, welche der Sequenzen mit einer DNA- oder RNA-Sequenz hybridisiert, von der bekannt ist, daß sie ein Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 6 kodiert, oder ein Antiserum gegen das Antigen bereitstellt und Wirt-Vektor-Kombinationen identifiziert, die das Antigen exprimieren.

13. Rekombinantes DNA-Molekül umfassend eine DNA-Sequenz nach einein der Ansprüche 8 bis 11 und Vektor-DNA.

14. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 13, das zusätzlich eine Expressions-Kontrollsequenz, die operativ mit der DNA-Sequenz verbunden ist, umfaßt.

15. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 14, worin die Expressions-Kontrollsequenz ausgewählt ist aus dem β-Galactosidase-Gen von E. coli, dem Tryptophan-Operon, dem Tra-T-Gen von E. coli, dem linken Promotor des Bacteriophagen Lambda, dem tac-Promotor, dem Cup 1-Promotor und dem frühen SV40-Promotor.

16. Rekombinantes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 13 bis 15, worin die Vektor-DNA Plasmid-DNA ist.

17. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 13 oder Anspruch 14, worin die Vektor-DNA Bakteriophagen-DNA ist.

18. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 17, worin die Bakteriophagen-DNA ausgewählt ist aus: Bakteriophagen Lambda und Derivaten davon, einschließlich lambda gt10 und lambda gt11.

19. Fusioniertes Gen, umfassend einen Promotor, ein Translations-Startsignal und eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 8 bis 11.

20. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 13 bis 18, wobei das Verfahren umfaßt, daß man ein DNA-Insert bereitstellt, das eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 8 bis 11 umfaßt und das DNA-Insert in Vektor-DNA einsetzt.

21. Verfahren nach Anspruch 20, worin die eingesetzte DNA in den Klonierungsvektor im richtigen Abstand und richtigen Leserahmen im Hinblick auf eine Expressions-Kontrollsequenz eingeführt wird.

22. Transformierter Wirt, transformiert mit mindestens einem rekombinanten DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 13 bis 18.

23. Transformierter Wirt nach Anspruch 22, worin der Wirt das Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 6 exprimieren kann.

24. Transformierter Wirt nach Anspruch 22 oder Anspruch 23, worin der Wirt eine Bakterienzelle, eine Hefe, einschließlich dem Saccharomyces cerevisiae-Stamm CL13-ABSY86, ein anderer Pilz, eine Wirbeltierzelle, eine Insektenzelle, eine Pflanzenzelle, eine menschliche Zelle, eine menschliche Gewebezelle, ein lebender Virus, wie z.B. Vaccinia oder Baculovirus, oder ein ganzer eukaryotischer Organismus ist.

25. Transformierter Wirt nach einem der Ansprüche 22 bis 24, worin der Wirt E. coli, ein anderer Darm-Organismus als E. coli, eine Pseudomonas- oder Bacillusart ist.

26. Transformierter Wirt nach Anspruch 25, worin der Wirt ein E. coli K12-Derivat ausgewählt aus JM109 und Y1090 ist.

27. Verfahren zur Transformation eines Wirts, um einen transformierten Wirt nach einem der Ansprüche 22 bis 26 zu liefern, wobei das Verfahren umfaßt, daß man einen Wirt bereitstellt, den Wirt kompetent für die Transformation macht und in den Wirt ein rekombinantes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 13 bis 18 einführt.

28. Expressionsprodukt eines transformierten Wirts nach einem der Ansprüche 22 bis 26, wobei das Produkt ein Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 6 umfaßt.

29. Expressionsprodukt nach Anspruch 28 in gereinigter Form.

30. Expressionsprodukt nach Anspruch 28 oder Anspruch 29, umfassend eine erste Polypeptidsequenz, die homolog mit dem Wirt ist und eine zweite Polypeptidsequenz, die eine Aminosäuresequenz ist, die ein Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 6 kodiert.

31. Expressionsprodukt nach Anspruch 30, worin die erste Polypeptidsequenz die gesamte β-Galactosidase oder das gesamte Tra-T oder ein Teil davon ist und der Wirt E. coli ist.

32. Verfahren zur Biosynthese eines proteinhaltigen Produktes umfassend ein Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Verfahren umfaßt, daß man einen Wirt mit einem rekombinanten DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 14 bis 18 so transformiert, daß der Wirt ein proteinhaltiges Produkt exprimieren kann, das ein Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 6 einschließt; den Wirt züchtet, um eine Expression zu erhalten und das proteinhaltige Produkt sammelt.

33. Impfstoff, umfassend eine wirksame Menge eines oder mehrerer Antigene nach einem der Ansprüche 1 bis 6, Expressionsprodukte nach einem der Ansprüche 28 bis 31 zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel, Hilfsstoff und/oder Adjuvans.

34. Impfstoff nach Anspruch 33, der für die orale Verabreichung geeignet ist oder in injizierbarer Form ist.

35. Antikörper, hergestellt als Ergebnis der Impfung eines Wirts durch Verabreichung von einem oder mehreren Antigenen nach einem der Ansprüche 1 bis 6, von Expressionsprodukten nach einem der Ansprüche 28 bis 31 und/oder von Impfstoffen nach einem der Ansprüche 33 und 34 an einen Wirt.

36. Verfahren zur Herstellung eines Antigens nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Verfahren umfaßt, daß man die exkretorische/sekretorische Flüssigkeit einer parasitischen Stufe einer parasitischen Nematodenart sammelt; die Flüssigkeit durch Linsenlektin-Chromatographie mit Methylmannosid als Elutionsmittel fraktioniert; gebundene und ungebundene Fraktionen sammelt; mit SDS-Gel-Elektrophorese weiter fraktioniert und das Antigen elektroeluiert.

37. Verfahren zur Herstellung eines fusionierten Gens nach Anspruch 24, wobei das Verfahren umfaßt, daß man einen Promotor, ein Translations-Startsignal und eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 8 bis 11 bereitstellt und den Promotor, das Translations-Startsignal und die DNA- Sequenz operativ verbindet.

38. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs nach einem der Ansprüche 33 und 34, wobei das Verfahren umfaßt, daß man eine wirksame Menge mindestens eines Antigens nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und/oder Expressionsprodukte nach einem der Ansprüche 28 bis 31 mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel, Hilfsstoff und/oder Adjuvans vermischt.

39. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers nach Anspruch 35, wobei das Verfahren umfaßt: daß man einen immunoreaktiven Wirt mit einer wirksamen Menge eines Antigens nach einem der Ansprüche 1 bis 6, einem Expressionsprodukt nach einem der Ansprüche 28 bis 31 oder einem Impfstoff nach einem der Ansprüche 33 und 34 immunisiert.

40. Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 6, Expressionsprodukt nach einem der Ansprüche 28 bis 31 und/oder Impfstoff nach einem der Ansprüche 33 oder 34 zur Verwendung für ein Verfahren zur Behandlung einer Infektion mit einem parasitischen Nematoden.

41. Antikörper nach Anspruch 35 zur Verwendung in einem Verfahren, um einen Wirt passiv gegen eine Infektion mit dem parasitischen Nematoden zu schützen.