DE68914138T2

DE68914138T2 - Substrat-gebundene oligonukleotide.

Info

Publication number: DE68914138T2
Application number: DE68914138T
Authority: DE
Inventors: Uwe Maskos; Edwin Southern
Original assignee: Oxford University Innovation Ltd
Current assignee: Oxford Gene Technology Ltd
Priority date: 1988-09-21
Filing date: 1989-09-21
Publication date: 1994-06-30
Anticipated expiration: 2009-09-22
Also published as: EP0386229A1; DE68914138D1; US5436327A; EP0386229B1; JP3129723B2; JPH04500671A; GB8822228D0; WO1990003382A1; EP0386229B2; DE68914138T3

Description

Es gibt verschiedene potentielle Anwendungsmöglichkeiten für an feste Träger gebundene Oligonukleotide. Sie könnten zu Untersuchungen hinsichtlich des Vorliegens von Mutationen in komplexen DNSn verwendet werden, beispielsweise von Krankheitsloci beim Menschen. Sie könnten verwendet werden, um spezifische Nukleinsäuren aus den komplexen Gemischen zu selektieren, zum Beispiel spezifische mRNS aus einer vollständigen Zellpopulation. Sie sind nützlich in der Erfindung, die in der internationalen Anmeldung PCT/GB89/00460, eingereicht am 2. Mai 1989, beschrieben wurde.
Einige Artikel beschreiben Verfahren zum Anwenden von Nukleinsäuren an feste Matrices (1-6). Diese Verfahren sind in zwei Aspekten problematisch: sie erfordern komplexe und häufig wenig effiziente Schritte; das Nukleotid ist über die Basen sowie über die Enden gebunden. Die Bindung über die Basen stört bei der nachfolgenden Verwendung des gebundenen Polynukleotids im Verlauf von Hybridisierungsreaktionen.
Methoden zum Synthetisieren von Oligonukleotiden an festen Trägern sind üblich (7-14). Die Bindung zwischen dem Oligonukleotid und dem Träger ist angesichts des zur Entfernung der Blockierungsgruppen in den Basen verwendeten Schlugreagenzes labil und so entfernt dieser Schritt in dem Verfahren das Oligonukleotid von dem festen Träger. Die Oligonukleotide würden an den Träger gebunden verbleiben, wenn eine stabile Verbindung gebildet würde. Sproat und Brown (1985) haben gezeigt, dar eine Urethanbindung stabiler ist als eine gewöhnliche Succinatbindung, jedoch ist dafür eine komplexe Synthese erforderlich und die Bindung ist nicht vollständig stabil hinsichtlich des letzten Schrittes zur Entfernung der Schutzgruppe.
Crea und Horn (1980) verwendeten zum Start der Oligonukleotidsynthese ein Ribonukleotid, das über die 5'-Hydroxylgruppe an Cellulose gebunden war. Die Bindung zwischen den ersten und zweiten Resten der sich ergebenen Kette ist beim Schlußschritt der Schutzgruppen-Entfernung labil.
Arnold und Berg (1985) beschreiben einen polymeren Träger mit einem kovalent gebundenen Primär für die Oligonukleotidsynthese, worin das Primär durch selektive Oxidation ohne Oxidieren anderer Oligonukleotid-Bindungen abgespalten wird.
Aufgabe dieser Erfindung ist es, eine neue Bindung bereitzustellen, die leicht zu synthetisieren ist und die hinsichtlich standardmäßig üblicher Schritte zur Entfernung von Schutzgruppen vollständig stabil ist.
In einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zur Herstellung eines zur Oligonukleotidsynthese geeigneten derivatisierten Trägers, wobei das Verfahren Binden eines Nukleosidreagenzes an einen Hydroxylgruppen-tragenden Träger über eine kovalente Phosphodiesterbindung umfaßt, die unter den zur Entfernung der Schutzgruppen für Oligonukleotidketten verwendeten Bedingungen stabil ist.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zur Herstellung eines Oligonukleotids, gebunden an einen Träger durch
a) Binden eines Nukleosidreagenzes an einen Träger,
b) Synthetisieren einer Oligonukleotidkette, die Schutzgruppen einschließt, an dem befestigten Nukleosid und
c) Entfernung der Schutzgruppen aus der Oligonukleotidkette, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger Hydroxylgruppen trägt, wodurch in Schritt a) das Nukleosid an den Träger über eine kovalente Phosphodiesterbindung gebunden wird, die unter den in Schritt c) angewendeten Bedingungen stabil ist.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein derivatisierter Träger bereitgestellt, geeignet zur Oligonukleotidsynthese, umfassend ein Nukleosid, gebunden an einen Träger mit Hilfe einer kovalenten Phosphodiesterbindung der Struktur -O-PY-O-, wobei Y ein geschütztes oder ungeschütztes Sauerstoffatom darstellt.
In einem zusätzlichen Aspekt der Erfindung wird ein trägergebundenes Oligonukleotid bereitgestellt, wobei das Oligonukleotid an den Träger über eine endständige Phosphatgruppe durch eine kovalente Phosphodiesterbindung der Struktur -O-PO&sub2;-O-(CnH2n)- gebunden ist, wobei n ≥ 3 ist.
Die Beschaffenheit des Trägers ist nicht ausschlaggebend für die Erfindung. Er kann massiv oder teilchenförmig sein und kann beispielsweise aus derivatisiertem Kieselgel oder Kieselgur-Polydimethylacrylamid oder kontrolliert porösem Glas oder einer ebenen Glasoberfläche bestehen. Ausschlaggebend ist, daß er aliphatische Hydroxylgruppen trägt und dar diese in einer Form vorliegen, die für eine Umsetzung mit einem Nukleosidreagenz zugänglich sind. Diese Hydroxylgruppen können einen Teil von Hydroxyalkylgruppen darstellen, wie sie durch Derivatisieren von kontrolliert porösem Glas oder anderem Trägermaterial mit einem langkettigen Alkylalkohol gebildet werden. Alternativ dazu kann der Träger mit einem langkettigen Alkylamin derivatisiert werden und die Amingruppen können zu Hydroxylgruppen in situ umgesetzt werden. Abweichend dazu können die Hydroxylgruppen Teil einer polymeren Struktur sein, die entweder den festen Träger ausmacht oder an einen festen Träger gebunden ist.
Die Beschaffenheit des Nukleosidreagenz ist für die Erfindung nicht ausschlaggebend. Übliche bei der Oligonukleotidsynthese verwendete Reagenzien können hier verwendet werden. Vorzugsweise ist das Reagenz ein Phosphoramidit (7 und 8). Die Reagenzien und gebildeten Produkte werden in dem nachstehenden Reaktionsschema dargestellt.
In diesem Schema gibt I das Nukleosid-3'-phosphitreagenz, II den derivatisierten Träger, III die kovalente Bindung wieder, anfänglich gebildet durch die Reaktion zwischen den zweien, und IV gibt das Endprodukt wieder.
B bezeichnet die für das betreffende Nukleosid geeignete Base.
x kann eine Blockierungsgruppe sein, wie eine Dimethoxytritylgruppe, deren Natur für die Erfindung nicht ausschlaggebend ist oder kann (insbesondere bei IV) eine Oligonukleotidkette darstellen. Y ist ein geschütztes Sauerstoffatom, im allgemeinen eine Alkoxygruppe, wie Methoxy oder βCyanoethoxy
Z kann ein Di-(C&sub1; bis C&sub4;-alkyl)amin darstellen oder abweichend davon Cl oder Tetrazolyl.
R ist aliphatischer Natur und kann eine Alkylgruppe sein.
S gibt einen festen Träger wieder. Alternativ dazu kann das Nukleosid-3'-reagenz ein Phosphonat oder Hydrogenphosphonat (12) darstellen. Das Reagenz und das gebildete Produkt werden in dem nachstehenden Reaktionsschema dargestellt.
In diesem Schema gibt V das Nukleosidphosphonat- oder Hydrogenphosphonatreagenz wieder, II stellt den derivatisierten Träger dar, VII gibt die kovalente Bindung wieder, die anfänglich zwischen den zweien gebildet wurde, und IV zeigt das Endprodukt.
B, X, R und S sind wie vorstehend definiert.
Q ist entweder ein Wasserstoffatom oder eine organische Gruppe, die nicht an der Bindung oder an den Syntheseschritten der Erfindung teilnimmt.
Wiederum abweichend davon kann das Nukleosid-3'-reagenz ein Phosphonamidit der Struktur VII sein, worin A Alkyl bedeutet und B, X und Z wie vorstehend definiert sind. In einem bevorzugten Beispiel ist A Methyl und z ist Diisopropylamin
Automatische Oligonukleosidsynthesevorrichtungen sind handelsüblich. Im Stand der Technik ist es erforderlich, in die Synthesevorrichtung einen festen Träger zu geben, der mit dem ersten Nukleotid der vorgesehenen Oligonukleotidkette vorderivatisiert wurde. Diese Erfindung macht es möglich, in die Synthesevorrichtung einen festen Träger zu geben, der aliphatische Hydroxylgruppen (z.B. Hydroxyalkylgruppen) trägt. Das Nukleosid-3-reagenz wird dann in der Synthesevorrichtung als erstes Nukleotid der vorgesehenen Oligonukleotidkette an den Träger gebunden.
In den vorstehenden Reaktionsschemata schließt die Umwandlung von III zu IV oder von VI zu IV einen Oxidationsschritt ein. Dieser kann beispielsweise unter Verwendung von Jod oder Schwefel unter Standardbedingungen entweder vor oder gewöhnlich nach der Oligonukleotidsynthese ausgeführt werden.
Nukleosid-3'-reagenzien sind für die Festphasen-Oligonukleosidsynthese weiterentwickelt als Nukleosid-5 -reagenzien. Ungeachtet dessen wird erwartet, daß Nukleosid-5'-reagenzien mit festen Trägern, die aliphatische Hydroxylgruppen tragen (z.B. Hydroxyalkylgruppen) kovalente 5'-Phosphodiesterbindungen bilden und in gleicher Weise wie ihre 3'-Gegenstücke als Basis für Festphasen-Oligonukleosidsynthesen dienen. Die Erfindung stellt die Verwendung von Nukleosid-5'- reagenzien als Alternativen zu Nukleosid-3'-reagenzien in Aussicht.
Der nächste Schritt des Verfahrens schließt das Synthetisieren einer Oligonukleotidkette an das befestigte Nukleosid ein. Verfahren dafür sind bekannt und es sind automatische mikroprozessorgesteuerte Vorrichtungen verfügbar, die dieses Verfahren durchführen. Diese Verfahren schließen zur Vermeidung unerwünschter Nebenreaktionen ausnahmslos die Bereitstellung von Schutzgruppen ein und ein Schlußschritt in der Synthese eines Oligonukleotids schließt die Entfernung von Schutzgruppen ein. Es ist dieser Schritt, der bislang zur Ablösung des Oligonukleotids führte. Dieser Schritt kann typischerweise einschließen - die Entfernung der Methylgruppe aus der Phosphotriestergruppe zum Beispiel unter Verwendung von Thiophenoxid; die Entfernung von Schutzgruppen aus N-Atomen der Nukleotidbasen, beispielsweise mit Hilfe von Ammoniak bei erhöhter Temperatur und die Entfernung der Schutzgruppe aus der 5'-Stellung des letzten Nukleotids, das zu der Oligonukleotidkette zugegeben werden mußte, beispielsweise mit Hilfe von Dichloressigsäure. Die beschriebene kovalente Bindung zwischen dem Anfangsnukleosid und dem Träger ist zu diesen und anderen üblichen Schutzgruppenentfernungsschritten stabil.
Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Ballotiniglaskugeln (20 g, 90-130 um Durchmesser, Jencons) wurden in einem Gemisch aus Xylol (40 ml), Glycidoxypropyltrimethoxysilan und einer Spur Diisopropylethylamin bei 90ºC über Nacht unter Rühren suspendiert, sorgfältig mit Methanol und Ether gewaschen und getrocknet. Diese derivatisierten Kugeln (6 g) wurden unter Rühren in eine katalytische Menge konzentrierte Schwefelsäure-enthaltendem Hexanethylenglycol über Nacht unter Argonatmosphäre bei 80ºC erhitzt unter Erhalt Alkylhydroxyl-derivatisierter Kugeln. Nach Waschen mit Methanol und Ether wurden die Kugeln unter Vakuum getrocknet und unter Argon bei -20ºC gelagert.
Eine kleine Menge der Hydroxyalkyl-derivatisierten Kugeln wurde in das Reaktionsgefäß einer automatischen Oligonukleotidsynthesevorrichtung (Applied Biosystems), programmiert für die Synthese der Sequenz des linken kohäsiven Endes des Bakteriophagen λ, gegeben. Das erste Nukleotid war 3'- Phosphoamidit (I), worin Y [3-Cyanoethoxy und Z Diisopropylamin war. Dieses wurde kovalent an die derivatisierten Kugeln gebunden.
Jeder Schritt bei der Synthese wurde durch Messen der abgelösten Tritylmengen mit einem Spektrometer verfolgt. Bei diesem Test betrug die schrittweise Ausbeute 96-99 %. Somit waren sowohl Ausbeute als auch Reinheit hoch und wir berechneten, daß 140 mg der Kugeln mehr als 4 nMol des Oligonukleotids festhalten.
Das Produkt wurde durch eine Standardbehandlung mit heißem Ammoniak von den Schutzgruppen befreit und sorgfältig mit destilliertem Wasser gewaschen. Es wurde dann bei der Hybridisierung mit dem komplementären Oligonukleotid cosL verwendet, das am 5'-Ende mit ³²P markiert wurde.
Zu 1 mg derivatisierter Kugeln mit dem linken Ende des Phagen λ (cosL) wurde das radioaktiv markierte (13 000 cpm, 3²P in 20 ul, 100 mMol NaCl, 1 mM EDTA), komplementäre Oligonukleotid gegeben. Das Gemisch wurde für 2 Stunden bei 30ºC inkubiert, die radioaktive Lösung entfernt und die Kugeln sorgfältig mit eiskaltem Puffer gewaschen. Das an die Kugeln gebundene Oligonukleotid (ca. 3000 cpm, 23 %) konnte quantitativ durch Elution mit destilliertem Wasser entfernt werden.
Eine Kontroll"hybridisierung" unter identischen Bedingungen mit einem nicht komplementären Oligonukleotid zeigt 0,02 % unspezifische Bindung zu den Kugeln.
Diese Versuche zeigen, daß die Synthese geradlinig verläuft und daß die Kugeln erfolgreich bei Hybridisierungsversuchen verwendet werden können.
Die Glaskugeln sind ideal zum Füllen von Säulen unter Bereitstellung einer Affinitätsmatrix mit vielen wünschenswerten Eigenschaften
Die nachstehende Tabelle 1 faßt physikalische Parameter der mit den in Beispiel 1 beschriebenen allgemeinen Verfahren derivatisierten Kugeln zusammen. Tabelle 1 Eigenschaften der derivatisierten Ballotini-Kugeln Kugelgröße (um) Oberfläche pro Kugel (mm²) Volumen pro Kugel (mm³) Dichte (g/cm³) Masse pro Kugel (mg) Zahl der Kugeln pro (mg) Oberfläche pro mg (mm²) Oligonukleotidbeladung pro mg (pMol) Oligonukleotidbeladung pro Kugel (fMol) Wertebereich, berechnet für Radius (um)

Beispiel 2

Zwei Glasplatten wurden mit einem schmalen Spalt dazwischen zusammengeklammert. Die Derivatisierung wurde mit Hilfe der gleichen Reagenzien, die in den schmalen Spalt injiziert wurden, und unter den gleichen Bedingungen, wie in Beispiel 1, durchgeführt.
Die Oligonukleotidsynthese wurde manuell unter Standardbedingungen und unter Verwendung der derivatisierten Glasplatte als festen Träger ausgeführt. Das erste Nukleotid war ein 3'-Hydrogenphosphat, das in Form des Triethylammoniumsalzes verwendet wurde. Die Ausbeute und Reinheit, sowohl der ersten, als auch der nachfolgenden Schritte der Oligonukleotidsynthese waren hoch.
Die nachstehenden Beispiele demonstrieren verschiedene Wege der Hybridisierung markierter DNS-Fragmente von Oligonukleotiden an den derivatisierten Kugeln.

Beispiel 3

Hybridisierung an stabgebundenen Glaskugeln.
Ein 2 cm langer Plastikstab wurde in geschmolzenes Polypropylen getaucht und dann mit einer Säule derivatisierter Glaskugeln in Kontakt gebracht und abkühlen lassen. Etwa 100 bis 200 Kugeln blieben an dem Stab haften. Dieses Kugelbefestigungsverfahren erleichtert in großem Maße die Hybridisierung, wie in einer Zahl typischer Versuche gezeigt wird:
Ein Stab mit etwa 100 Glaskugeln, derivatisiert mit der Sequenz 3' AGG TCG CCG CCC 5' wurde in 30 ul einer Lösung getaucht, die 0,1 M NaCl und 80 fMol des komplementären, am 5'-Ende zu einer Aktivität von 30 000 cpm markierten Oligonukleotids enthielt.
Nach 30 Minuten bei 30ºC wurde der Stab aus der Röhre entfernt, gespült und das gebundene Material durch Tauchen des Stabes in 0,1 M NaCl bei 50ºC eluiert. Die Menge an hybridisiertem Oligonukleotid wurde dann durch Szintillationszählung bestimmt.
Typischerweise konnten 4 % des eingegebenen Oligonukleotids auf diesem Weg aufgenommen werden; 0,1 % waren unspezifisch gebunden und konnten nicht entfernt werden. Somit ist die Bindungskapazität einer einzelnen Kugel etwa 0,03 fMol Oligonukleotid.
Größere Anteile des anfänglichen Nukleotids konnten durch Senkung der Temperatur und Erhöhung der Hybridisierung aufgenommen werden. Somit wurde in einem ähnlichen Versuch 5,3 % bei 30ºC nach 55 Minuten, mit 0,05 % unspezifisch Gebundenem, hybridisiert und 13 % nach 16 Stunden bei 30ºC, mit 0,2 % unspezifisch Gebundenem.
Als Kontrolle zeigte ein nicht komplementäres Oligonukleotid 5' GGG CGG CGA CCT 3' lediglich 0,2 % Bindung nach 14 Stunden.
Zusammengefaßt haben die Versuche mit den an Plastikstäben gebundenen derivatisierten Glaskugeln leichte Handhabbarkeit erwiesen und hohe Spezifität der Hybridisierung zu den Kugeln gezeigt.

Beispiel 4

Batchhybridisierung

Die Menge an radioaktivern Material, die zu den Kugeln hybridisiert, konnte weiter erhöht werden und die unspezifische Bindung durch Ausführen der Hybridisierung mit Kugeln, typischerweise 1 mg, in 0,5 ml Zentrifugenröhrchen, gesenkt werden. Nach der Hybridisierung wurden die Röhrchen zentrifugiert, der Überstand entfernt und die Kugeln gewaschen. Waschen bei einer Temperatur höher als Tm führte zum vollständigen Schmelzen der Hybride, so daß das gebundene Material durch Cerenkov-Zählung gemessen werden konnte. In dieser Weise wurde die Abhängigkeit der Hybridisierungsgeschwindigkeit und der Elution von der Salzkonzentration und der Temperatur wie nachstehend bestimmt:
Zu jedem der fünf Röhrchen wird eine etwa gleiche Zahl von Kugeln und komplementäres Oligonukleotid (30 000 cpm) in 50 ul 0,1 M NaCl gegeben. Hybridisierung wurde bei 30ºC über Nacht durchgeführt, um die Menge an Hybrid maximal zu steigern. Die Lösung wurde entfernt und die Kugeln wurden zweimal mit eiskalter 0,1 M NaCl-Lösung gewaschen. Eluiert wurde für wachsende Zeiträume bei unterschiedlicher Temperatur für jedes Röhrchen. Nach jedem Intervall wurde der Überstand entfernt, die Kugeln wurden zweimal mit eiskalter NaCl- Lösung (100 ul 0,1 M) und mit vorgewärmter NaCl-Lösung (100 ul 0,1 M) eluiert.
Tabelle 2 zeigt die Einzelheiten des prozentualen Anteils gebundenen Oligonukleotids, der im Laufe der Zeit eluiert wurde. Es gibt eine deutliche Abhängigkeit der Elutionsgeschwindigkeit von der Temperatur. Beispielsweise wird innerhalb von 5 Minuten dreimal mehr Material bei 65ºC eluiert als bei 30ºC. Es ist nicht überraschend, daß auch bei 30ºC, die deutlich unter Tm liegen, eine nicht vernachlässigbare Geschwindigkeit vorliegt.
In einem weiteren Verfahren wurde die Konzentration des eingegebenen Oligonukleotids auf das 50-fache abgewandelt. Der Hybridisierung für 2 Stunden bei 30ºC in 0,1 M NaCl, 1 mM EDTA in 1,5 ml Zentrifugenröhrchen folgte Entfernen des Überstands, 3mal Waschen mit 0,1 M NaCl bei 0ºC und die Radioaktivitätsmenge, die mit den Kugeln verbunden war, wurde durch Cerenkov-Zählen bestimmt. Es gibt eine fast lineare Beziehung zwischen Konzentration und Menge an Hybrid (d.h. Hybridisierungsgeschwindigkeit, Tabelle 3), was vermuten läßt, daß die Hybridisierung hinsichtlich der Reaktion pseudo-erster-Ordnung ist.
Die höchste Konzentration an Oligonukleotid betrug 160 fMol (entspricht 13 000 cpm) in 20 ul. Lediglich 0,03 % unspezifisch Gebundenes konnten nicht eluiert werden.
Des weiteren wurden bei einem ähnlichen Versuch nur 0,02 % (12 aus 65000 cpm) nicht komplementären Oligonukleotids an den Kugeln gebunden, ein weiterer Hinweis, daß dieses Verfahren zur Isolierung von DNS-Fragmenten sehr spezifisch und rein verläuft. Tabelle 2 Wirkung der Temperatur auf die Elutionsgeschwindigkeit Elutionszeit Temperatur % eluiert % verblieben Tabelle 3 Wirkung der Oligonukleotidkonzentration auf die Hybridisierungsgeschwindigkeit relative Konzentration % hybridisiert relative Geschwindigkeit

Beispiel 5

Isolierung längerer DNS-Fragmente:

Die Isolierung längerer DNS-Fragmente wurde in den nachstehenden Versuchen gezeigt:
Vollständige λ DNS (5 11g in 35 ul Restriktionsenzympuffer) wurde mit 15 Einheiten der Restriktionsendonuklease Hinf 1 gespalten und die 143 Restriktionsfragmente mit Kalbsdarmphosphatase (1 Einheit) desphosphorylisiert. Nach 1 Stunde bei 37ºC wurden 4 ml EGTA zugegeben, das Gemisch für weitere 45 Minuten bei 65ºC inkubiert, Phenol-extrahiert und Ethanol-gefällt.
Das Gemisch wurde in 50 ul Kinase-markiertem Puffer (8 ul 10 x PMK-Puffer, 1 ul 0,1 M DTT, 4 ul PNK-Enzym, 30 ul destilliertem Wasser, 15 uCi - ³²P ATP) gelöst, für 1 Stunde bei 37ºC inkubiert, auf 100 ul aufgefüllt und durch eine Sephadex G25-Säule geschleudert, um nicht festgehaltene Nukleotide zu entfernen.
Eine aliquote Menge Ballotini-Glaskugeln (100 um, Jencons) wurde mit der Sequenz des rechten kohäsiven Endes des Bakteriophagen λ, nämlich 3' - CCC GCC GCT GGA 5', derivatisiert, mit Ammoniak von der Schutzgruppe befreit, gewaschen und eine kleine Menge auf den Grund einer U-förmigen Kapillare gegeben. Dieser untere Teil wurde in einem Thermostatenblock auf 40ºC gehalten, der obere linke und der obere rechte Arme der Kapillare wurden durch Ummanteln mit einer Plastikspritze und Durchpumpen von Wasser auf 67ºC gehalten. Die Hybridisierungslösung wurde zugegeben (75 ul 0,1 M NaCl, enthaltend 10 pMol 5'-Enden, 33 fMol linke kohäsive λ-Enden komplementär zu dem Oligonukleotid an den Kugeln, Gesamtradioaktivität ca. 700 000 cpm).
Eine Pumpe wurde an einem Arm der Kapillare angebracht und die Hybridisierungslösung wurde im Kreislauf vor und zurück zwischen den Teilen der Kapillare geführt, die auf 40ºC bzw. 67ºC gehalten wurden. Die Hybridisierung des linken Endes an den Kugeln würde bei 40ºC erfolgen und bei 67ºC würden die zwei haftenden λ-Enden, die in Lösung erneut getempert wurden, denaturiert werden.
Nach 4 Stunden wurde die Hybridisierungslösung entfernt, die Kugeln ausgiebig gewaschen und anschließend in heißem TE eluiert. Eine aliquote Menge der Lösung wurde auf ein 5 %-iges Polyacrylamidgel geladen. Autoradiograf ie zeigte lediglich eine Bande der richtigen Form in den Waschlösungen und den Elutionsdurchgängen. Zusammen wurden 1000 cpm (ca. 1,5 fMol) des linken Endes durch die Kugeln gebunden, was 5 % der theoretischen Menge entsprach.
Zusammengefaßt zeigt dieser Versuch die hochspezifische Isolierung eines langen DNS-Fragments aus einem komplexen Gemisch.

Beispiel 6

Säulenchromatografie

Ein weiterer leichter und zweckmäßiger Weg zur Isolierung von Oligonukleotid und zur Prüfung des Hybridisierungsverhaltens des neuen Trägers ist die Säulenchromatografie.
Eine Glaskapillare (Durchmesser 1,0 mm) wurde an einem Ende ausgezogen, so daß sich eine sehr enge punktförmige Öffnung ergab. Diese wurde durch Füllen mit zerkleinerten Glasteilchen vom anderen Ende her verstopft und so in der Flamme eines Bunsenbrenners gesintert, daß sie an dem Glas hafteten. Die Innenseite der Kapillare wurde durch Durchleiten einer Lösung von Dichlordimethylsilan in Trichlorethan und Waschen mit Ethanol silanisiert. Etwa 40 mg der Glaskugeln wurden auf der Glasfritte aufgelegt und das obere Ende der Säule mit einer Spritze verbunden, die mit einer Infusionspumpe angetrieben werden konnte. In dieser Weise konnte radioaktive Hybridisierungslösung und Waschlösungen auf die Säule in unterschiedlichen Geschwindigkeiten aufgegeben werden, typischerweise im Bereich von 3 - 10 ul/min.
In einem typischen Versuch wurden 0,2 pMol markiertes Oligonukleotid (34 000 cpm) in 1 ml einer Lösung von 0,1 M NaCl, 0,1 % SDS in TE pH 7,5 auf die Säule mit einer Geschwindigkeit von 3 ul/min aufgegeben. Die ummantelte Säule wurde bei 35ºC gehalten. 90 ul-Fraktionen wurden in Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt und die Radioaktivitätsmenge wurde durch Cerenkov-Zählen bestimmt. Eine 0,1 M NaCl-Waschlösung wurde in gleicher Weise aufgetragen und gesammelt. Erhöhen der Temperatur in dem Mantel erlaubte uns, das Oligonukleotid zu gewinnen.
Somit wurde bestimmt, daß 70 % des Oligonukleotids an den Glaskugeln gebunden waren und bei einer höheren Temperatur nur 0,1 % auf dem Träger verbliebenes Material eluiert werden konnte.
Ein Kontrollversuch mit nicht komplementärem Oligonukleotid (nicht passend an Stelle 7) zeigte verbliebene 400 cpm von 80 000 angewendeten nach Waschen bei 35ºC. Bei 40ºC verblieben nur 140 cpm = 0,2 %.
Der Prozentsatz an zugänglichem Oligonukleotid auf dem Träger wurde bestimmt. 0,13 pMol Kinase-markiertes und 5 pMol nichtmarkiertes Oligonukleotid wurden auf 40 mg Kugeln aufgetragen. 10 % des Materials (ca. 500 fMol) hybridisierten an dem Träger, der, gemessen durch Enttritylierung während der Synthese, insgesamt ca. 3 nMol Oligonukleotid enthielt.
Aus diesem Ergebnis wurde errechnet, daß eines in 6000 Oligonukleotiden auf dem Träger unter den verwendeten Bedingungen (35ºC, geringer Salzgehalt) hybridisierte, wobei vernachlässigbares Binden nicht passender Oligonukleotide stattfindet. Der Schmelzpunkt war bei den meisten der Oligonukleotide, die in zwei 90 ul-Fraktionen bei 48ºC eluiert wurden, wiederum sehr scharf.
Diese Versuche lassen erkennen, daß die derivatisierten Kugeln bei der chromatografischen Trennung von Nukleinsäuren verwendbar sind.

LITERATUR

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15. Arnold L.J. und Berg R.P., Molecular Biosystems Inc., PCT-Anmeldung WO 85/01051.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines derivatisierten Trägers, geeignet zur Oligonukleotidsynthese, wobei das Verfahren umfaßt, Binden eines Nukleosidreagenz an einen Hydroxylgruppen-tragenden Träger durch eine kovalente Phosphodiesterbindung, die unter den zur Entfernung der Schutzgruppen für Oligonukleotidketten verwendeten Bedingungen stabil ist.

2. Verfahren zur Herstellung eines an einen Träger gebundenen Oligonukleotids durch

a) Binden eines Nukleosidreagenzes an einen Träger,

b) Synthetisieren einer Oligonukleotidkette, die Schutzgruppen einschließt, an dem befestigten Nukleosid und

c) Entfernen der Schutzgruppen aus der Oligonukleotidkette, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger Hydroxylgruppen trägt, wodurch in Schritt a) das Nukleosid an den Träger über eine kovalente Phosphodiesterbindung gebunden wird, die unter den in Schritt c) angewendeten Bedingungen stabil ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der Träger poröses Glas oder poröse Glaskugeln darstellt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Träger Hydroxyalkylgruppen trägt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Nukleosidreagenz ein Nukleosid-3'-phosphoramidit ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Nukleosidreagenz ein Nukleosid-3'-phosphit ist.

7 Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Nukleosidreagenz ein Nukleosid-3'-phosphonat oder -3'-hydrogenphosphonat ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Nukleosidreagenz ein Nukleosid-3'-methylphosphonamidit ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8, wobei Schritt c) die Entfernung von Schutzgruppen aus Phosphotriestergruppen und aus N-Atomen der Nukleotidbasen und aus der 5'-Stellung am letzten Nukleotid der Kette einschließt.

10. Derivatisierter Träger, geeignet zur Oligonukleotidsynthese, umfassend ein Nukleosid, gebunden an einen Träger mit Hilfe einer kovalenten Phosphodiesterbindung der Struktur -O-PY-O-, wobei Y ein geschütztes oder ungeschütztes Sauerstoffatom darstellt.

11. Derivatisierter Träger nach Anspruch 10, wobei der Träger poröses Glas oder Glaskugeln darstellt.

12. Trägergebundenes Oligonukleotid, wobei das Oligonukleotid an den Träger über eine endständige Phosphatgruppe durch eine kovalente Phosphodiesterbindung der Struktur -O-PO&sub2;-O-(CnH2n)- gebunden ist, wobei n > 3 ist.

13. Trägergebundenes Oligonukleotid nach Anspruch 12, wobei der Träger poröses Glas oder Glaskugeln darstellt.