DE69404018T2

DE69404018T2 - Verfahren zur Herstellung von Polynukleotiden auf einem Festträger und Apparat für dieses Verfahren

Info

Publication number: DE69404018T2
Application number: DE69404018T
Authority: DE
Inventors: Francois Mountain View Ca 94040 Chatelain; Viktor F-93250 Villemonble Kumarev
Original assignee: Genset SA
Current assignee: Sigma Aldrich Co LLC
Priority date: 1993-12-16
Filing date: 1994-12-14
Publication date: 1998-01-15
Anticipated expiration: 2014-12-15
Also published as: CA2138240A1; AU8043294A; ATE154936T1; GR3024829T3; KR100366862B1; HK1002330A1; DE69404018D1; FR2714061A1; CA2138240C; US6623703B1; FR2714061B1; KR950018035A; US5869643A; ES2106479T3; JPH08239397A; AU693487B2; US6825339B2; EP0658566B1; US20030176690A1; DK0658566T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden auf einem festen Träger. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Reaktionsgefäß, das einen festen Träger enthält, sowie eine Einrichtung, die dieses Reaktionsgefäß umfaßt, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden verwendbar sind.
Die Synthese von Polynucleotiden auf einem festen Träger wird insbesondere bei der automatisierten Synthese von DNA oder RNA-Oligonucleotiden angewendet. Erfindungsgemäß versteht man unter "Polynucleotiden" Desoxyribonucleinsäure- oder Ribonucleinsäure-Fragmente oder allgemeiner Polynucleotide oder Oligonucleotide, in denen die Basen, die Phosphat- Bindeglieder zwischen den Nucleotiden oder auch die Ribose-Zyklen der Basen auf bekannte Weise chemisch modifiziert werden können. Es kann sich dabei insbesondere handeln um Oligonucleotide mit α- oder β-Anomerien, um Oligonucleotide eines Internucleotid-Bindegliedes vom Phosphorothioat- oder Methylphosphonat-Typ oder auch um Oligothionucleotide.
Ziel der Erfindung ist es, das Leistungsvermögen der bereits existierenden Oligonucleotid-Synthese-Verfahren zu verbessern.
Das erfindungsgemäße Verfahren besteht in einer Modifikation der Apparaturen und Parameter der organischen Synthese, um dadurch die Produktivität zu verbessern.
Die Verbesserungen wirken sich insbesondere aus auf die Zeitdauer und den Verbrauch an Reagentien, die für die Durchführung einer Synthese erforderlich sind.
Das Prinzip der chemischen Synthese von Nucleinsäuren auf einem festen Träger ist heutzutage in der Spezial-Literatur ausführlich beschrieben und es stehen eine Reihe von Vorrichtungen (Apparaturen) auf dem Markt zur Verfügung, die alle oder einen Teil der Stufen der Synthese automatisch durchführen. Unter den beschriebenen Synthesewegen weist nur das sogenannte Phosphoramidit-Verfahren (Caruthers et al.: EP 0 035 719 B1) derzeit eine ausreichende Wirksamkeit auf, um die Herstellung von Nucleinsäuren im industriellen Maßstab durchführen zu können.
Die Herstellung von Oligonucleotiden oder Polynucleotiden erfolgt in einem Reaktionsgefäß, das einen festen Träger enthält und sie umfaßt die Behandlung des festen Trägers, beispielsweise eines anorganischen polymeren Trägers in einer Reihe von aufeinanderfolgenden Stufen, wobei jede der Reihen zur Addition eines neuen Nucleotids auf dem Träger führt. Die Reihen von aufeinanderfolgenden Stufen oder Synthesezyklen werden so häufig durchgeführt wie es die Herstellung eines Oligonucleotids oder eines Po- lynucleotids mit der gewünschten Länge erfordert.
In einem Verfahren zur Synthese von Polynucleotiden auf einem festen Träger besteht der feste Träger üblicherweise aus Glaskugeln mit kontrollierter Porosität (CPG) oder allgemeiner aus Teilchen aus einem mineralischen Polymer oder einem funktionalisierten organischen Polymer.
Bei den bisher angewendeten klassischen Verfahren werden acht verschiedene Reagentien als feste Träger verwendet, die bestehen aus dem genannten mineralischen Polymer oder funktionalisierten organischen Polymer, das an ein Nucleosid dA, dT, dC, dG, rA, rC, rG oder U gebunden ist, je nachdem, ob die herzustellende Sequenz als erstes ein Desoxyribo- oder Ribonucleotid dA, dT, dC, dG, rA, rC, rG oder U umfaßt. Die Hersteller liefern somit Reaktionsgefäße, in denen eines dieser Nucleoside vorher an den Träger gebunden worden ist. Je nachdem, ob die Sequenz mit A, T, C, G oder U beginnt, wählt man das geeignete Reaktionsgefäß aus. Die Verlängerung, ausgehend von diesem ersten Nucleosid, erfolgt anschließend in der Richtung 3' T 5', oder 5' T 3' als Folge der Kupplungs-Reagentien.
Es sind bereits zahlreiche Träger für die Synthese von Oligonucleotiden in fester Phase in der Literatur beschrieben worden.
Genannt seien organische Polymere, wie Polystyrol ("Nucleic Acids Res." (8), S. 5507 (1980)), das Acryloylmorpholid-polyacrylamid, das Polydimethylacrylamid, das auf natürlichem Kiesegel (Kieselguhr) polymerisiert worden ist ("Nucleic Ac. Res." 9(7), 1691 (1980)).
Andere beschriebene Träger sind anorganischer Natur, insbesondere auf der Basis von Siliciumdioxid, das durch einen Kohlenwasserstoff-Rest funktionalisiert worden ist, der eine NH&sub2;- und/oder COOH-Gruppe trägt ("J.Am. Chem." 105, 661 (1983)) oder ein Träger auf Basis von Siliciumdioxid, das durch eine 3-Aminopropyltriethoxysilan-Gruppe funktionalisiert worden ist, dessen Verwendung bei der Phosphit- und Phosphoarmidit-Synthese zur Herstellung von Oligonucleotiden zum erstenmal in dem europäischen Patent 0 035 719 beschrieben worden ist.
Aus FR 93-08498 und PCT/FR94/00842 ist ein Verfahren zur Synthese von Oligonucleotiden in fester Phase bekannt, bei dem man einen sogenannten "universellen" Träger, d.h. einen festen Träger verwendet, den man unabhängig davon verwenden kann, welches das erste Nucleotid der zu synthetisierenden RNA oder DNA ist und welches der Typ an Monomer-Reagens ist, das während der Synthese verwendet wird, d.h. welches der Typ der Substitution an der Phosphat-Gruppierung in 3'-Stellung oder in 5'-Stellung ist, mit der man die Synthese in der Richtung 5' T 3' oder 3' T 5' durchführt.
Insbesondere kann man die "Universalität" der Träger in fester Phase erhalten durch eine Funktionalisierung des mineralischen Polymers oder organischen Polymers mit einem Kohlenwasserstoffrest, der Gruppen vom Glycol-Typ trägt, in denen eine OH-Gruppe und eine nucleophile Gruppe sich in der vizinalen Position, d.h. an zwei benachbarten Kohlenstoffatomen am Ende des Kohlenwasserstoff-Restes befinden, wobei diese beiden Kohlenstoffatome gegebenenfalls durch inerte Gruppen substituiert sein können. Unter einer "inerten Gruppe" versteht man hier eine Gruppe, die unter den Bedingungen, wie sie in den verschiedenen Stufen der Synthese von Nucleinsäuren auf einem festen Träger gemäß der vorliegenden Erfindung auftreten, nicht reagiert.
Bei einer speziellen Ausführungsform umfaßt das Verfahren der Synthese von Polynucleotiden die folgenden Stufen:
1) die Kondensation der OH-Gruppe in der 5'- oder 3'-Stellung des ersten Nucleotids oder eines Nucleotids, das an seinem anderen 3'- oder 5'-Ende mit dem genannten festen Träger verbunden ist, mit Hilfe eines Kupplungsmittels mit der Phosphatgruppe, die gegebenenfalls jeweils in 3'- oder 5'-Stellung substituiert ist, eines in 3'- und 5'-Stellung geschützten monomeren Nucleotid- Reagens;
2) die Oxidation oder Sulfurierung der Internucleotid-Verbindungsgruppe vom Phosphit-Typ, wie sie in der Stufe (1) erhalten wird, zu jeweils einer Phosphat-Verbindungsgruppe;
3) die Schutzgruppenentfernung von dem 5'-O- oder 3'-O-Ende des in der Stufe (2) erhaltenen Produkts; und
4) die Wiederholung der Stufen (1) bis (3) ebenso oft wie Nucleotide addiert werden müssen, um die Nucleinsäure zu synthetisieren.
Die obengenannten Stufen führen zu einem Oligonucleotid, das mit dem festen Träger verbunden ist. Das Verfahren umfaßt eine Schlußstufe der Ablösung der Nucleinsäure von dem Träger und der Eliminierung der Schutzgruppen der Basen und gegebenenfalls der 2'-O-Positionen der Nucleinsäure.
Bei den Verfahren, bei denen der feste Träger bereits vor Beginn der Synthesezyklen mit einem ersten Nucleosid verbunden ist, das dem ersten Nucleotid der herzustellenden Sequenz entspricht, umfaßt der genannte Träger im allgemeinen eine Schutzgruppe in der 5'- oder 3'-Stellung des genannten Nucleosids. In diesem Fall beginnt der Synthesezyklus mit einer Schutzgruppenentfernungsstufe in einem sauren Medium, im allgemeinen mit einer Detrylylierung.
Bei den am häufigsten angewendeten Varianten entspricht das genannte Nucleotid-Monomer-Reagens der Formel:
worin bedeuten:
- A ein Wasserstoffatom oder eine gegebenenfalls geschützte Hydroxylgruppe,
- B eine Purin- oder Pyrimidin-Base, deren exocyclische Amin-Funktion gegebenenfalls geschützt ist,
- C eine konventionelle Schutzgruppe für die 5'-OH-Funktion und
- x = 0 oder 1,wobei
a) dann, wenn x = 1,
R&sub3; ein Wasserstoffatom und R&sub4; ein negativ geladenes Sauerstoffatom darstellen oder
R&sub3; ein Wasserstoffatom und R&sub4; entweder ein Sauerstoffatom oder ein eine Schutzgruppe tragendes Sauerstoffatom bedeuten und
b) dann, wenn x = 0,
R&sub3; ein eine Schutzgruppe tragendes Sauerstoffatom und R&sub4; entweder ein Halogen oder eine disubstituierte Amingruppe bedeuten, wobei
- wenn x = 1 und R&sub3; = ein Sauerstoffatom, dann, wenn R&sub4; = ein Sauerstoffatom, es sich um das sogenannte Phosphodiester-Verfahren handelt; oder dann, wenn R&sub4; ein eine Schutzgruppe tragendes Sauerstoffatom ist, es sich dabei um das sogenannte Phosphotriester-Verfahren handelt;
- wenn x = 1, R&sub3; = ein Sauerstoffatom und R&sub4; = ein negativ geladenes Sauerstoffatom, es sich dann um das sogenannte H-Phosphonat-Verfahren handelt;
- wenn x = 0 und R&sub3; = ein eine Schutzgruppe tragendes Sauerstoffatom, dann, wenn R&sub4; ein Halogenatom ist, es sich um das sogenannte Phosphit-Verfahren handelt; oder dann, wenn R&sub4; eine austretende Gruppe vom disubstituierten Amin-Typ ist, es sich um das sogenannte Phosphoramidit-Verfahren handelt.
Die Stufen eines Synthesezyklus nach dem Phosphoramidit-Verfahren sind üblicherweise die folgenden:
1) Kondensation der 5'-terminalen Hydroxygruppe eines Nucleosids oder eines Oligonucleotids, das kovalent an dem festen Träger fixiert ist, mit einer Verbindung vom Phosphit-Typ nach der Reaktion: Kupplungsmittel
2) Oxidation der erhaltenen Phosphit-Bindung zu einem Phosphat nach der Reaktion: Oxidationslösung
3) Blockierung der Hydroxyl-Gruppen der Nucleoside, die nicht reagiert haben und;
4) Freisetzung der 5'-terminalen Hydroxylgruppe des letzten Nucleosids unter Bildung einer aktiven Stelle für den nachfolgenden Synthesezyklus.
Jedes Nucleotid wird durch Wiederholung der Stufen 1 bis 4 nacheinander auf dem Träger hinzugefügt. Am Ende der Synthese wird das Oligonucleotid von dem Träger getrennt und von seinen Schutzgruppen befreit durch eine schonende Hydrolysereaktion.
Die im Handel erhältlichen Synthetisatoren, die spezialisiert sind auf die Synthese von Oligonucleotiden, sind so konzipiert, daß die vorstehend beschriebenen Synthesestufen automatisch durchgeführt werden. Diese Synthetisatoren bestehen im allgemeinen aus einem Reaktionsgefäß, das den festen Träger enthält, einem Reagens-Mischer, einem (oder mehreren) Blöcken für die Auswahl der Reagentien und Behälter, welche die genannten Reagentien enthalten. Die Synthesestufen werden durchgeführt durch aufeinanderfolgende Einführung der ausgewählten Reagentien in das Reaktionsgefäß. Meistens wird der feste Träger nach jeder Stufe mit Acetonitril gewaschen (gespült).
Der feste Träger ist nicht immobilisiert und er besetzt nicht das gesamte Volumen des Reaktionsgefäßes, sondern im allgemeinen nur die Hälfte des Volumens des Reaktionsgefäßes und in jedem Fall nicht mehr als drei Viertel desselben, um eine gute Durchrührung der festen Phase zu erlauben.
Das Reaktionsgefäß, wie es in den handelsüblichen Synthetisatoren verwendet wird, hat die Form eines Behälters, der von dem Strom der Reagentien durchströmt wird, der eine Rührung (oder Fluidisierung) des festen Trägers hervorruft. Das Rühren der festen Phase wird nämlich als wesentlich angesehen, weil es ein besseres Eindringen der Lösungsmittel und Reagentien in die Poren der festen Phase erlaubt, die im allgemeinen aus porösen Kugeln oder porösen Membranen besteht (vgl. "Methods in Molecular Biology: "Protocols for Oligonucleotides and Analogs - Synthesis and Properties", herausgegeben von Sudhir Agrawal, 1993, Humana Press, Totowa, New Jersey, Seiten 442-444 und 454).
Der Mischer ist stromaufwärts von dem Reaktionsgefäß angeordnet und durch eine Rohrleitung damit verbunden. Die Blöcke zur Auswahl der Reagentien bestehen im allgemeinen aus Elektroventilen und sie erlauben die selektive Öffnung des Eingangs (Ausgangs) in/aus dem hydraulischen Kreislauf sowie Strömungswege für die Reagentien. Der Zusammenhalt des hydraulischen Systems wird gewährleistet durch eine Reihe von Rohrleitungen oder Kapillaren, die auf geeignete Weise miteinander verbunden sind. Es wird empfohlen, die Apparatur an einem Ort zu installieren, der auf 20ºC, die Temperatur, bei der die Reaktionen durchgeführt werden, klimatisiert ist.
Wenn die Wirksamkeit der Reaktionen unter diesen Bedingungen ausreichend ist, sind die Dauer der Reaktionen und der erforderliche Überschuß an Reagentien, um ein gutes Waschen durch aufeinanderfolgende Verdünnungen zu bewirken, die Hauptnachteile der Synthetisatoren, wie sie oben beschrieben worden sind. Im vorliegenden Fall sind die Werte für den Verbrauch der Reagentien und die Dauer der Synthese den Werten weit überlegen, die auf der Basis der bekannten Zusätze der organischen Synthese errechnet werden. Diese Nachteile sind auf den begrenzenden Faktor zurückzuführen, den die Diffusionsgeschwindigkeit der Reagentien in die Poren darstellt.
Es wurde erfindungsgemäß gefunden, daß es hauptsächlich die Geometrie des Reaktionsgefäßes vom Behälter-Typ ist, in dem die freien Teilchen des festen Trägers nach dem Prinzip der Reaktion in einer "pseudoflüssigen" Phase gerührt werden, die zahlreiche Nachteile aufweist.
Es wurde gefunden, daß mehrere weitere Parameter die Ursache dafür sind, daß die Produktivität der Synthetisatoren beträchtlich herabgesetzt wird:
- die für die Stufe der Oxidation verwendeten Reagentien (Iod-Lösung, Tetrahydrofuran, Pyridinwasser) werden im Verlaufe der Zeit abgebaut und die daraus folgende Abnahme der Reaktionsfähigkeit leitet eine schnelle Abnahme der Wirksamkeit der Synthese ein;
- das Fehlen einer Thermostatisierung des Reaktionsgefäßes und der Reagentien führt zu einem Verlust an Reproduzierbarkeit der Synthesen.
Das hydraulische System selbst weist häufig nicht ausnutzbare Totvolumina auf. Die Zeit, die diese Reagentien in diesen Totvolumina und in der Mischkammer verbringen, insbesondere bei der Aktivierung des Phosphoramidits durch das Kupplungsmittel, begrenzt die Reaktionsfähigkeit der gebildeten Zwischenprodukt-Verbindungen.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung eine Gesamtheit von Modifikationen, die an dem vorstehend beschriebenen System vorgenommen werden, welche die Wirkung haben, die Produktivität zu verbessern durch Erzielung einer Abnahme des Verbrauchs an Reagentien und der Synthesedauer.
Das wesentliche Charakteristikum des erfindungsgemäßen Verfahrens bezieht sich auf die Immobilisierung der festen Phase oder auf die Art der Füllung des Reaktors mit der festen Phase.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist nämlich ein Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden auf einem festen Träger in einem Reaktionsgefäß in Form einer Kolonne, durch die man die Lösungen der Reagentien und/oder Lösungsmittel zirkulieren läßt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die feste Phase, die den genannten festen Träger darstellt, in dem genannten Reaktionsgefäß immobilisiert wird und daß die genannten Lösungen in der Kolonne und durch die feste Phase hindurch in Form einer fortschreitenden Frontlinie in der Weise wandern, daß die aufeinanderfolgenden Lösungen jeder Stufe eines Synthesezyklus sich nicht vermischen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist außerdem ein Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden auf einem festen Träger in einem Reaktionsgefäß in Form einer Kolonne, durch die man die Lösungen der Reagentien und/oder Lösungsmittel zirkulieren läßt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das Reaktionsgefäß eine Kolonne ist, die von Teilchen aus einem porösen Material vollständig angefüllt ist, die den genannten festen Träger darstellen.
Bei dieser Ausführungsform bei der der feste Träger aus freien Teilchen aus einem porösen Material besteht, die eine Kolonne ausfüllen, werden die Teilchen ebenfalls immobilisiert. Die Immobilisierung resultiert nämlich daraus, daß man hier unter einer "vollständig gefüllten Kolonne" versteht: der Grad der Füllung mit Teilchen und die Dichte der Verteilung der Teilchen in der Kolonne sind derart, daß die Teilchen ausreichend verdichtet sind, so daß sie sich nicht mehr bewegen können, wenn die Kolonne von einer Flüssigkeit durchströmt wird.
Es kann sich dabei auch nur um einen Teil der Kolonne handeln, der vollständig gefüllt ist, vorausgesetzt, daß die Teilchen des festen Trägers durch geeignete Einrichtungen in dem genannten Teil der Kolonne festgehalten werden.
Bei einer vorteilhaften Ausführungsform hat die Kolonne eine zylindrische Form.
Es wurde daher zum erstenmal vorgeschlagen, einen Reaktionsbehälter vom "Kolonnenchromatographie"-Typ, d.h. eine Kolonne, die aus einem zylindrischen Rohr besteht, das durch die feste Phase vollständig gefüllt ist, zu verwenden.
Dieser Kolonnen-Typ, der auf homogene Weise mit dem festen Träger gefüllt ist, bietet mehrere Vorteile: die verschiedenen Lösungen, die in dem Reaktionsgefäß aufeinanderfolgen, vermischen sich nicht oder nur wenig miteinander: es gibt daher kein Verdünnungsphänomen bei den Lösungen durch das vorhergehende Reagens und das nachfolgende Waschen (Spülen) in jeder Stufe des Synthesezyklus wird dadurch sehr erleichtert. Nach dem Prinzip der Kolonnen-Chromatographie wandern die an einem Ende der Kolonne eingeführten aufeinanderfolgenden Lösungen in Form einer fortschreitenden Frontlinie derart, daß eine Lösung die vorhergehende "vor sich herschiebt".
Es wurde nämlich festgestellt, daß die üblicherweise bei der Oligonucleotid-Synthese auf einer festen Phase verwendeten festen Phasen derart sind, daß die Affinität gegenüber den und die physikalisch-chemischen Wechselwirkungen mit den verwendeten verschiedenen Reagentien und Lösungsmitteln vernachlässigbar gering sind und keinen Einfluß auf ihre Diffusion durch die feste Phase hindurch ausüben außer durch die gewünschten chemischen Reaktionen.
Es sei darauf hingewiesen, daß selbstverständlich in der Grenzzone zwischen den Lösungen lokal eine geringe Vermischung zwischen den Lösungen auftreten kann, wenn die Durchflußmengen der Zirkulation der Lösungen groß sind. Dieses Vermischen, das auf die Grenzflächen beschränkt ist, ist jedoch nicht vergleichbar mit demjenigen, was bei den bekannten Verfahren zu beobachten war, bei denen die Waschvorgänge auf dem Prinzip der Verdünnung durch das Vermischen der aufeinanderfolgenden Lösungen basierte.
Im Gegensatz zu dem klassischen Modell erlauben diese Reaktionsgefäße somit eine beträchtliche Verminderung der erforderlichen Volumina an Reagentien. Die angewendeten Durchflußmengen werden als Funktion der Diffusionskonstanten und der Kinetik der durchgeführten Reaktionen eingestellt. Die Dauer der Synthesezyklen wird dadurch beträchtlich abgekürzt. Für jeden Teilchen-Typ darf die Durchflußmenge der Reagentien durch die Kolonne hindurch als Funktion von seiner Porosität einen bestimmten Wert nicht übersteigen, jenseits dessen die Reagentien nicht mehr in das Innere der Poren diffundieren. Es handelt sich dabei um ein in der Chromatographie allgemein bekanntes pHänomen.
Außerdem sind im Innern des Reaktionsgefäßes unabhängig von seiner Größe die Bedingungen lokal immer identisch. Dieses System kann somit auf alle Synthese-Maßstäbe angewendet werden.
Insbesondere sind zu nennen die Materialien, die aus anorganischen Polymeren bestehen, speziell Glas, Siliciumdioxid, Metalloxide, oder solche, die aus organischen Polymeren bestehen, speziell Cellulose oder gegebenenfalls substituiertes Polystyrol.
Vorzugsweise ist das Polymer ein mineralisches Polymer, das besteht aus Glas oder Siliciumdioxid, insbesondere einem Silicagel.
Die genannten Teilchen können aus Mikrokugeln oder agglomerierten Mikrofasern bestehen.
Vorzugsweise verwendet man in dem erfindungsgemäßen Reaktionsgefäß als Teilchen des festen Trägers poröse Mikrokugeln, wodurch die größte funktionalisierte Oberfläche erhalten wird, bezogen auf das Gewicht der Nucleoside, die pro Gewicht Polymer an das Polymer gebunden sind. Die Größe der Kugeln kann von 5 µm bis 500 µ gehen, allgemein beträgt sie 40 bis 70 µm. Die Poren können gegebenenfalls die Mikrokugeln teilweise durchziehen. Der Durchmesser der Poren kann zwischen 200 und 10 000 Å variieren. Man kann auf zwei Porengrößen zurückgreifen: große Poren (etwa 10 000 Å) und kleinere Poren (300 Å). Diese Kombination von variablen Porengrößen begünstigt die Diffusion der Lösungen durch die feste Phase hindurch.
Das erfindungsgemäße Reaktionsgefäß erlaubt die beste Ausnutzung der bekannten Diffusionsgesetze und der Kinetik der bimolekularen chemischen Reaktionen, nach denen die Reagentien in Lösung sehr schnell in die Poren des festen Trägers diffundieren und die Kinetik der Kondensation des freien Nucleosids an dem 5'OH-Ende des an dem Träger fixierten Oligonucleotids eine quasi-Augenblicks-Kinetik ist.
Die Kontrolle (Steuerung) der Temperatur des Reaktionsgefäßes und der Reagentien ist ein anderes wesentliches Charakteristikum der vorliegenden Erfindung, die bis zum heutigen Tage an keinem auf dem Markt befindlichen Synthetisator vorhanden ist.
Die Arbeitstemperatur ist einer der Parameter, welche die Kinetik der angewendeten chemischen Reaktionen direkt und sofort beeinflussen, aber auch die Stabilität der Reagentien und die Viskosität der Lösungen.
Entgegen allen Vorurteilen, die behaupten, daß die Synthese der Oligonucleotide oberhalb von 30ºC an Wirksamkeit (Wirkungsgrad) verliert, wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, das Reaktionsgefäß auf eine optimale Temperatur von 45ºC thermostatisch einzustellen. Die Beherrschung der Temperatur des Systems erlaubt es, auf die Kinetik der angewendeten chemischen Reaktionen sowie auf die Viskosität der verwendeten Lösungen einzuwirken.
In vorteilhafter Weise mischt man die Reagentien, d.h. die Kupplungsagentien wie Tetrazol und die Monomer-Reagentien einerseits und/oder die verschiedenen Reagentien der Oxidations-Lösung andererseits unmittelbar stromaufwärts von dem Reaktionsgefäß oder gegebenenfalls stromaufwärts eines Systems zur Verteilung der Reagentien in einem Multikolonnen-System. Auf diese Weise werden die nicht ausnutzbaren Totvolumina vermindert.
Insbesondere erwärmt man die Reagentien vor ihrer Einführung in das Reaktionsgefäß und gegebenenfalls vor dem Vermischen derselben.
Wenn man nämlich die Reagentien nur nach ihrem Vermischen erwärmt, stellt man eine wechselseitige Inaktivierung und einen Reaktivitätsverlust in der Kolonne fest. Insbesondere kann das vorzeitige Vermischen (zu weit entfernt von dem Reaktionsgefäß) der Reagentien zu störenden Nebenreaktionen führen. Speziell das Vermischen von Tetrazol (einer schwachen Säure) mit Phosphoramiditen kann eine Detritylierung eines Teils der Monomeren mit sich bringen. Die Phosphoramidite können anschließend miteinan der reagieren. Dieser Reaktions-Typ führt zur Bildung von Homopolymeren, die mit dem an dem Träger fixierten Oligonucleotid reagieren können oder nicht reagieren können. In diesem Fall kann man die Bildung von längeren Oligonucleotiden als erwünscht feststellen. Wie dem auch sei, die Syntheseausbeute ist stets vermindert. Ganz offensichtlich werden diese Phänomene durch das Erwärmen verstärkt. Es ist daher zweckmäßig, die Reagentien vor dem Vermischen derselben zu erwärmen.
In den vor der vorliegenden Erfindung bisher verwendeten Reaktionsgefäßen werden die Reagentien oberhalb von 30ºC schnell abgebaut. Dank des erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßes, das die Kinetik der Reaktionen begünstigt, ist es jedoch möglich, die Temperatur bis auf 90ºC (zwischen 20 und 90ºC) zu erhöhen; man stellt vorzugsweise die Temperatur des Reaktionsgefäßes auf einen Wert zwischen 30 und 60ºC, insbesondere auf 45ºC, ein.
Zweckmäßig wird die Stufe der Schutzgruppenentfernung in einem sauren Medium mit TFA (Trifluoressigsäure) in Dichlorethan durchgeführt. Man verwendet insbesondere eine 1 vol./vol.%ige Lösung von Triflouressigsäure in extratrockenem Dichlorethan in der Stufe der Freisetzung der terminalen Hydroxyl-Funktion in 5'-Stellung (Stufe 4), wobei man die Standard-Lösung einsetzt (2 %ige Lösung von Trichloressigsäure in Dichlormethan). Diese Empfehlung erlaubt es insbesondere, eventuelle Siede-Phänome von Dichlormethan zu vermeiden, wenn die Arbeitstemperatur 40ºC übersteigt.
In der Stufe der Oxidation führt das Vermischen der Essigsäure mit dem Pyridin zu einem Anstieg der Temperatur von 40 auf 60ºC, wodurch die Aufrechterhaltung der Temperatur auf dem empfohlenen Niveau erleichtert wird.
Wegen der sehr hohen Kupplungsausbeuten (wahrscheinlich über 99 %) des erfindungsgemäßen Verfahrens erweist sich die Stufe der Blockierung (oder des "capping") der 5'-OH-Funktionen, die nicht reagiert haben (Stufe 3) in der Mehrzahl der Fälle als wenig gerechtfertigt, ja sogar als vollkommen überflüssig und kann daher weggelassen werden. Es ist somit keine Anreicherung der Synthese-Fragmente mit einer Größe von n-1 festzustellen, wie dies zu erwarten gewesen wäre, wenn man die "capping"-Stufe nicht durchführt. Wahrscheinlich sind, wenn der Wirkungsgrad der Reaktionen optimal ist, die Moleküle, die nicht reagiert haben, tatsächlich nicht zugänglich.
Gemäß einer anderen Charakteristik der vorliegenden Erfindung wird die Oxidationsstufe mit Iod, gelöst in Essigsäure, und Pyridin durchgeführt. Auf diese Weise verwendet man anstelle der klassischen Oxidations-Lösung zwei getrennte Reagentien, von denen eines beispielsweise besteht aus einer gesättigten Iodlösung in Eisessig, während das andere ultrareines Pyridin ist. Diese Reagentien sind vorteilhaft insofern, als in der Oxidationsstufe (die obige Stufe 2) diese beiden Lösungen in stöchiometrischen Mengen beim Eintritt in das Reaktionsgefäß miteinander gemischt werden können. Die auf diese Weise gebildete Mischung wird in das Reaktionsgefäß injiziert und gewährleistet eine sofortige und quantitative Oxidation der neu gebildeten Bindung zwischen den Nucleotiden. Auf diese Weise nutzt man die Stabilität der beiden getrennten Lösungen aus zur unbegrenzten Garantierung der Reproduzierbarkeit der Oxidationsstufe.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist außerdem ein Reaktionsgefäß zur Herstellung von Polynucleotiden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, wobei das Reaktionsgefäß die Form einer Kolonne hat, die einen festen Träger enthält, durch den man die Lösungen der Reagentien und/oder Lösungsmittel zirkulieren läßt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die feste Phase, die den festen Träger darstellt, in dem genannten Reaktionsgefäß derart immobilisiert ist, daß die genannten Lösungen in der Kolonne und durch die genannte feste Phase hindurch in Form einer fortschreitenden Frontlinie wandern, wobei die aufeinanderfolgenden Lösungen jeder Stufe einen Synthesezyklus sich nicht oder nur wenig miteinander mischen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es schließlich, eine Vorrichtung für die Synthese von Polynucleotiden auf einem festen Träger bereitzustellen, die ein thermostatisch eingestelltes Reaktionsgefäß und einen thermostatisch eingestellten Sammler umfaßt, der die Mischung der Reagentien vor ihrer Einführung in das Reaktionsgefäß sammelt und dann auf die Temperatur des Reaktionsgefäßes erhitzt.
Weitere Vorteile und Charakteristika der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden detaillierten Beschreibung.
Es wurden zwei Synthetisatoren für Oligonucleotide oder Polynucleotide hergestellt, die konzipiert sind auf der Basis der vorstehend beschriebenen technischen Verbesserungen. Das Leistungsvermögen und die Produktivität dieser beiden Apparaturen war deutlich verbessert gegenüber denjenigen von handelsüblichen Apparaturen.
Der erste Synthetisator wurde konzipiert zur Synthese von Oligonucleotid-Mengen zwischen 50 µmol und 1 mmol. Dieses Leistungsvermögen kann somit verglichen werden mit demjenigen von handelsüblichen Synthetisatoren, die auf dem Markt erhältlich sind und in äquivalenten Synthesemaßstäben arbeiten können. Diese Apparatur wird als "Großmaßstab-Synthetisator" bezeichnet. Er ist in der Fig. 1 dargestellt.
Die Funktion der zweiten Apparatur besteht darin, parallel 24 verschiedene Oligonucleotide oder Polynucleotide zu synthetisieren. Der Maßstab jeder Synthese liegt zwischen 0,05 und 1 µmol. Derzeit gibt es kein Äquivalent zu dieser Apparatur. Ihre Produktivität kann an diejenige von sechs Synthetisatoren mit vier Kolonnen, wie sie auf dem Markt erhältlich sind, angenähert werden. Sie wird als " Multikolonnen-Synthetisator" bezeichnet. Sie ist in der Fig. 2 dargestellt.
Diese beiden Apparaturen umfassen:
- Behälter [(1) bis (10)), die Reagentien enthalten, die jeweils ein volumetrisches Pumpenmodul vom Spritzen-Typ [(11 bis 20)] umfassen;
- einen thermostatisch geregelten Sammler [21)], dessen Aufgaben sind das Sammeln, das Erwärmen und die Kontrolle der Temperatur und das Mischen der in Bewegung befindlichen Reagentien.
Der "Großmaßstab-Synthetisator" ist mit einem Reaktionsgefäß vom "gefüllten Kolonnen"-Typ ausgestattet, dessen Dimensionen auf den gewünschten Synthesemaßstab eingestellt werden [(22)].
Der "Multikolonnen-Synthetisator" ist mit 24 Mikrokolonnen [(22)] vom gleichen Typ wie diejenigen des "Großmaßstab-Synthetisators" ausgestattet, deren Dimensionen jedoch das Arbeiten in Maßstäben von 0,05 µmol, 0,1 µmol, 0,2 µmol und 1 µmol erlauben. Zwischen dem Sammler und den Reaktionsgefäßen befindet sich ein Verteiler [(23)], der die Aufgabe hat, ebenfalls die Reagentien auf die 24 Kolonnen zu verteilen.
Schließlich erlaubt ein Block, bestehend aus 24 Elektroventilen, die einzeln jeder Kolonne zugeordnet sind, das Auswählen der "in Betrieb befindlichen" Reaktoren in jeder Synthesestufe.
Die Volumenmengen, die Durchflußmengen und die Wartezeiten stehen unter der Kontrolle eines Computers. Das Programm unterstützt die gute Verknüpfung und die Durchführung der Zyklen entsprechend den zu synthetisierenden Sequenzen.
Um lokal stets identische Bedingungen zu garantieren, unabhängig von der Anzahl der im Betrieb befindlichen Reaktionsgefäße, funktioniert der "Multikolonnen-Synthetisator" nach einem interaktiven Modus. Die Volumenmengen und die Durchflußmengen jedes der Reagentien werden so in jedem Augenblick auf die Anzahl der gerade ablaufenden Synthesen eingestellt.

A - Ablauf einer Synthese mit Phosphoramidit in dem "Großmaßstab- Synthetisator"

Der Synthesemaßstab wird im Augenblick des Starts des Programms ausgewählt.
Jede Synthese beginnt mit einem Initiierungszyklus, der das Waschen (Spülen) und die thermostatische Einstellung des Reaktionsgefäßes auf die Arbeitstemperatur erlaubt.
Das Programm umfaßt 5 Synthesezyklen, die jeder der vier Basen und den gegebenenfalls modifizierten Basen entsprechen.
Die Synthesezyklen laufen in Stufen oder Syntheseschritten ab, die sich in der folgenden chronologischen Reihenfolge aneinanderreihen:
1) Detritylierung: Freisetzung der Hydroxylgruppe in der 5'-Position des Nucleosids oder des Oligonucleotids, das kovalent an den festen Träger gebunden ist;
2) erstes Spülen (Waschen);
3) Addition der Base: Kondensation des Monomers vom Phosphoramidit- Typ mit der freien terminalen 5'-Hydroxygruppe des Nucleosids oder des Oligonucleotids, das an den festen Träger gebunden ist; Bildung der Internucleotid-Verbindung;
4) zweites Spülen (Waschen);
5) Oxidation der Internucleotid-Bindung vom Phosphit-Typ, die vorher aus einem Phosphat gebildet worden ist; und
6) drittes Spülen (Waschen).
Diese Zyklen werden so oft wiederholt, wie es die Synthese eines Oligonucleotids oder eines Polynucleotids mit der gewünschten Länge erfordert.

B - Ablauf einer Synthese in dem "Multikolonnen-Synthetisator"

Der Maßstab der Synthese wird im Augenblick des Starts des Programms ausgewählt.
Jede Synthese beginnt mit einem Initiierungszyklus, der das Spülen (Waschen) und das thermostatische Einstellen der Reaktionsgefäße auf die Arbeitstemperatur erlaubt.
Es gibt nur einen einzigen Synthesezyklus, der so häufig wiederholt wird, wie es die Herstellung von 24 Oligo- oder Polynucleotiden erfordert.
Dieser Zyklus kann wie folgt aufgegliedert sein:
a) Auswahl der zu detritylierenden Kolonnen
1) Detritylierung: Freisetzung der Hydroxylgruppe in der 5'-Position des Nucleosids oder Oligonucleotids, das kovalent an den festen Träger gebunden ist;
2) erstes Spülen (Waschen).
b1) Auswahl der Kolonnen vor der Einführung der Base A.
3-1) Addition der Base A: Kondensation des Monomers A vom Phosphoramidit-Typ mit der freien terminalen 5'-Hydroxygruppe des Nucleosids oder Oligonucleotids, das an den festen Träger gebunden ist. Bildung der Internucleotid-Bindung.
b2) Auswahl der Kolonnen vor der Einführung der Base G.
3-2) Addition der Base G: Kondensation des Monomers G vom Phosphoramidit-Typ mit der freien terminalen 5'-Hydroxygruppe des Nucleosids oder Oligonucleotids, das an den fesen Träger gebunden ist; Bildung der Internucleotid-Bindung.
b3) Auswahl der Kolonnen vor der Einführung der Base T.
3-3) Addition der Base T:Kondensation des Monomers T vom Phosphoramidit-Typ mit der freien terminalen 5'-Hydroxygruppe des Nucleosids oder Oligonucleotids, das an den festen Träger gebunden ist; Bildung der Internucleotid-Bindung.
b4) Auswahl der Kolonnen vor der Einführung der Base C.
3-4) Addition der Base C: Kondensation des Monomers C vom Phosphoramidit-Typ mit der freien terminalen 5'-Hydroxygruppe des Nucleosids oder Oligonucleotids, das an den festen Träger gebunden ist; Bildung der Internucleotid-Bindung.
c) Auswahl der zu oxidierenden Kolonnen.
4) Zweites Spülen (Waschen);
5) Oxidation der Internucleotid-Bindung vom Phosphit-Typ, die vorher aus einem Phosphat gebildet worden ist; und
6) drittes Spülen (Waschen).

Beschreibung der obengenannten Stufen

Jede Stufe kann unter Bezugnahme auf die beiliegenden schematischen Darstellungen der Synthetisatoren (Fig. 1 und 2) beschrieben werden.
1) Detritylierung: Das Reagens Nr.10, vorzugsweise eine 1 vol./vol.%ige Lösung von Trifluoressigsäure in extratrockenem Dichlorethan wird mittels des Spritzen-Moduls Nr.10 durch das Reaktionsgefäß getrieben. Das erforderliche Volumen liegt zwischen dem 2-fachen und dem 10-fachen des Volumens des leeren Reaktionsgefäßes. Die Durchflußmenge in der Kolonne liegt unterhalb 500 cm/min. Diese Durchflußmengeneinheit in cm/min repräsentiert nämlich die lineare Geschwindigkeit der Lösungen im Innern der Kolonne und ist somit unabhängig von Durchmesser der Kolonne.
Die Volumen-Durchflußmengen müssen auf den Durchmesser des Reaktionsgefäßes eingestellt werden. Um die Größe des Reaktionsgefäßes zu verändern unter Beibehaltung der lokalen Synthese-Bedingungen genügt es, die Volumen-Durchflußmenge zu modifizieren, das man in der Weise durchführt, daß sich die lineare Geschwindigkeit im Innern des Reaktionsgefäßes, angegeben in cm/min, nicht ändert.
Die Durchflußmengen, die man anwendet, sind kompatibel mit den Diffusionskonstanten in den Poren, d.h., daß die lineare Geschwindigkeit der Lösungen im Innern der Kolonne nicht höher ist als die Diffusionsgeschwindigkeit durch die Poren hindurch. Wenn dies nicht der Fall wäre, würde eine geringe Wirksamkeit der Reagentien und der Spülvorgänge (Waschen) vorliegen, was zu einer Abnahme der Syntheseausbeuten führen würde. Die gesamte Reaktionszeit liegt zwischen 10 und 120 s.
2) Erstes Spülen (Waschen): Das Reagens Nr. 1, vorzugsweise extratrokkenes Acetonitril, wird mit dem Spritzen-Modul Nr.1 durch das Reaktionsgefäß getrieben. Das erforderliche Volumen liegt zwischen dem 2- und dem 10- fachen des Volumens des leeren Reaktionsgefäßes. Die Durchflußmenge in der Kolonne liegt unterhalb 500 cm/min.
3) Kupplung: Die Reagentien Nr. 3 oder Nr 4 oder Nr. 5 oder Nr. 6 oder Nr. 7 und Nr. 2, jeweils eine 0,1 M Lösung jedes Monomers, und eine 0,45 %ige Lösung von Tetrazol in Aceonitril, werden jeweils mit den Spritzen-Modulen Nr. 3 oder Nr. 4 oder Nr. 5 oder Nr. 6 oder Nr. 7 und Nr. 2 gemeinsam durch das Reaktionsgefäß getrieben. Die Volumenverhältnisse und die Durchflußmengen der Reagentien Nr. 3 oder Nr. 4 oder Nr. 5 oder Nr. 6 oder Nr. 7 und Nr. 2 können von 1 verschieden sein. Das erforderliche Gesamtvolumen liegt zwischen dem 2-fachen und dem 10-fachen des Volumens des leeren Reaktionsgefäßes. Die Gesamt-Durchflußmenge in der Kolonne liegt unter 500 cm/min. Die Reaktionszeit liegt unter 1 min.
4) Zweites Spülen (Waschen): Das Reagens Nr. 1, vorzugsweise extratrocknes Acetonitril, wird mit dem Spritzen-Modul Nr. 1 durch das Reaktionsgefäß getrieben. Das erforderliche Volumen liegt zwischen dem 0,5-fachen und dem 5-fachen des Volumens des leeren Reaktionsgefäßes. Die Durchflußmenge in der Kolonne liegt unter 500 cm/min.
5) Oxidation: Die Reagentien Nr. 8 und Nr. 9, jeweils eine gesättigte Iodlösung in Eisessig und ultrareines Pyridin, werden mit den Spritzen-Modulen Nr. 8 und Nr. 9 jeweils gemeinsam durch das Reaktionsgefäß getrieben. Die Volumenverhältnisse und die Durchflußmengen-Verhältnisse der Reagentien Nr. 8 und Nr. 9 betragen jeweils 1. Das erforderliche Gesamtvolumen liegt zwischen dem 1-fachen und dem 5-fachen des Volumens des leeren Reaktionsgefäßes. die Gesamt-Durchflußmenge in der Kolonne liegt unter 500 cm/min. Die Reaktionszeit liegt unter 30 s.
6) Drittes Spülen (Waschen): Das Reagens Nr. 1, vorzugsweise extratrokkenes Acetonitril, wird mit dem Spritzen-Modul Nr. 1 durch das Reaktionsgefäß getrieben. Das erforderliche Volumen liegt zwischen dem 1-fachen und dem 5- fachen des Volumens des leeren Reaktionsgefäßes. Die Durchflußmenge in der Kolonne liegt unter 500 cm/min.
Die folgenden Ausführungsbeispiele sollen das erfindungsgemäße Verfahren erläutern.

Beispiel 1

Synthese eines Oligonucleotids im Maßstab von 30 µmol mit Hilfe des "Großmaßstab-Synthetisators"

Die verwendete Apparatur ist die gleiche wie vorstehend beschrieben. Das verwendete Reaktionsgefäß ist eine zylindrische Glas-Kolonne mit einem Durchmesser von 10 mm und einer Höhe von 25 mm. Die Arbeits-Temperatur beträgt 45ºC. Die Synthesezyklen sind in der Tabelle 1 im Detail angegeben. Unter diesen Bedingungen wurde ein Oligodesoxynucleotid mit einer Länge von 18 Basen synthetisiert, dessen Sequenz die folgende ist: d(ACG TTC CTC CTG CGG GAA).
Das Reaktionsgefäß wird sorgfältig mit 0,66 g CPG 500 Å (CPG Inc., USA), "derivatisiert" durch das erste Nucleosid A, gefüllt. Die Kapazität des Trägers beträgt 45 µmol/g (Dichte 3 ml/g). Der Synthesemaßstab beträgt 30 µmol.
Nach einer Stufe des Spülens (Waschens) mit Acetonitril führt man 17 mal den Synthesezyklus durch, wie er in der Tabelle 1 beschrieben ist. Unter diesen Bedingungen behält das Oligonucleotid mit der gewünschten Länge die Dimethoxytrityl-Übergangsgruppe in der terminalen 5'-Position.
Das Oligonucleotid wird von dem CPG abgetrennt und die permanenten Schutzgruppen werden freigesetzt durch eine geeignete Behandlung des "derivatisierten" Trägers nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren mit 10 ml einer 30 %igen wäßrigen Ammoniak-Lösung während 16 h bei 55ºC.
Nach der Zugabe von 40 ml absolutem Ethanol und 1 ml einer wäßrigen 3M Natriumacetat-Lösung wird das Oligonucleotid innerhalb von 2 h bei 0ºC ausgefällt. Der Niederschlag wird anschließend über eine Laprodyn-Membran mit einer Porosität von 1,2 µm (PALL S.A. Frankreich) filtriert und in 10 ml Wasser wieder aufgelöst.
Nach dem Ablesen der optischen Dichte bei 260 nm erhält man 4000 U.D.O. entsprechend 120 mg rohem Synthese-Gemisch. Die Reinheit des Oligonucleotids der gewünschten Länge, bestimmt durch HPLC in einer Umkehrphasen-Kolonne beträgt 88 %.

Beispiel 2

Synthese eines Oligonucleotids im Maßstab von 77 µmol mit Hilfe des "Großmaßstab-Synthetisators"

Die verwendete Apparatur ist die gleiche wie in dem vorhergehenden Beispiel. Das verwendete Reaktionsgefäß ist eine zylindrische Glaskolonne mit einem Durchmesser von 10 mm und einer Höhe von 25 mm. Die Arbeitstemperatur beträgt 45ºC. Die Synthesezyklen sind in der Tabelle 2 detailliert angegeben.
Unter diesen Bedingungen wurde ein Oligodesoxynucleotid mit einer Länge von 18 Basen und der folgenden Sequenz synthetisiert: d(TTC CGC CAG GAG GAA CGT).
Das Reaktionsgefäß wird sorgfältig mit 0,66 g CPG 500 Å Forte Capacité ("hoch-beladen") (MILLIPORE S.A., Frankreich), welches durch das erste Nucleosid T "derivatisiert" worden ist, gefüllt. Die Kapazität des Trägers beträgt 110 µmol/g (Dichte 3 ml/g). Der Synthesemaßstab beträgt 77 µmol.
Nach einer ersten Stufe des Spülens (Waschens) mit Acetonitril wurde der Synthesezyklus 17 mal durchgeführt wie in der Tabelle 2 beschrieben. Unter diesen Bedingungen behält das Oligonucleotid mit der gewünschten Länge die Dimethoxytrityl-Übergangsgruppe in der terminalen 5'-Position.
Die Bedingungen der Schutzgruppen-Entfernung und der Gewinnung (Abtrennung) des Oligonucleotids sind die gleichen wie in dem vorhergehenden Beispiel beschrieben.
Nach dem Ablesen der optischen Dichte bei 260 nm erhält man 8500 U.D.O. entsprechend 255 mg rohem Synthese-Gemisch. Die Reinheit des Oligonucleotids mit der gewünschten Länge, bestimmt durch HPLC an einer Umkehrphasen-Kolonne, beträgt 84 %.

Beispiel 3

Synthese eines Oligonucleotids im Maßstab von 100 µmol mit Hilfe des "Großmaßstab-Synthetisators"

Die verwendete Apparatur ist die gleiche wie in dem vorhergehenden Beispiel. Das verwendete Reaktionsgefäß ist eine zylindrische Glaskolonne mit einem Durchmesser von 15 mm und einer Höhe von 34 mm. Die Arbeitstemperatur beträgt 45ºC. Die Synthesezyklen sind in der Tabelle 3 detailliert angegeben.
Unter diesen Bedingungen wird ein Oligodesoxynucleotid mit einer Länge von 56 Basen synthetisiert, dessen Sequenz die folgende ist: d(TAA CCA CAC TTT TTG TGT GGT TAA TGA TCT ACA GTT ATT TTT TAA CTG TAG ATC AT).
Das Reaktionsgefäß wird sorgfältig gefüllt mit 2 g CPG 500 Å (MILLIPORE S.A., Frankreich), das durch das erste Nucleosid T "derivatisiert" worden ist. Die Kapazität des Trägers beträgt 50 µmol/g (Dichte 3 ml/g). Der Synthesemaßstab beträgt 100 µmol.
Nach einer Stufe des Spülens (Waschens) mit Acetonitril wurde 55 mal der Synthesezyklus durchgeführt, wie in der Tabelle 3 beschrieben. Unter diesen Bedingungen behält das Oligonucleotid mit der gewünschten Länge die Dimethoxytrityl-Übergangsgruppe in der terminalen 5'-Position.
Die Bedingungen der Schutzgruppen-Entfernung und der Gewinnung (Abtrennung) der Oligonucleotids sind die gleichen wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben.
Nach dem Ablesen der optischen Dichte bei 260 nm erhält man 31 000 U.D.O. entsprechend 930 mg rohem Synthesegemisch.
Die Reinheit des Oligonucleotids mit der gewünschten Länge, bestimmt durch HPLC in einer Umkehrphasen-Kolonne, beträgt 61 %.

Beispiel 4

Gleichzeitige Synthese von 24 verschiedenen Oligonucleotiden mit Hilfe des "Multikolonnen-Synthetisators"

Die Reaktionsgefäße sind Metall-Mikrokolonnen mit einem Durchmesser von 1,5 mm und einer Höhe von 6 mm. Die Arbeitstemperatur beträgt 50ºC. Die Synthesezyklen sind in der Tabelle 4 im Detail angegeben.
Unter diesen Bedingungen wurden die Oligodesoxynucleotide synthetisiert, deren Sequenzen in der Tabelle 5 angegeben sind.
Die Reaktionsgefäße wurden regulär gefüllt mit 2 mg universellem CPG 500 Å, das eine Epoxid-Gruppe aufwies (hergestellt nach Beispiel 1 des französischen Patents FR 2707296) (GENSET S.A., Frankreich). Die Kapazität des Trägers beträgt 50 µmol/g (Dichte: 3 ml/g). Der Synthesemaßstab beträgt 0,1 µmol.
Nach einer Stufe des Spülens (Waschens) mit Acetonitril wurden die in der Tabelle 4 beschriebenen Arbeitsgänge so oft durchgeführt, wie es die Synthese der 24 Oligodisoxynucleotide der Tabelle 5 erforderte.
Die Bedingungen der Schutzgruppen-Entfernung und der Gewinnung (Abtrennung) des Oligonucleotids sind die gleichen wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben.
Nach dem Ablesen der optischen Dichte bei 260 nm erhält man im Durchschnitt 11 U.D.O. jedes der Oligonucleotide, entsprechend 0,33 mg. Die Reinheit der Oligonucleotide, bestimmt durch HPLC an einer Umkehrphasen- Kolonne für die 5'-O-Trityl-Oligodesoxynucleotide und an einer Anionenaustauscherkolonne für die 5'-OH-Oligonucleotide übersteigt den Wert von 84 %.

Vergleichsbeispiel 5:

Synthese von Oligonucleotiden mit Hilfe von Reaktionsgefäßen von APPLIED BIOSYSTEMS und MILLIPORE

In der nachstehen Tabelle 6 sind die Charakteristika von Synthesen dargestellt, die mit handelsüblichen Fluidisierungs-Reaktoren von der Firma APPLIED BIOSYSTEMS und MILLIPORE, so wie in der Literatur beschrieben, durchgeführt wurden.
Die verwendeten Synthetisatoren sind die folgenden:

Synthetisator von APPLIED BIOSYSTEMS. Modell 394

- Reaktionsgefäß in Form einer Kolonne: Durchmesser 5 mm Höhe 6mm Volumen 0,11 ml
- fester Träger CPG 500 Å (CPG Inc., USA) Kapazität: 30 µmol/g Dichte: 3 ml/g
Für eine Synthese im Maßstab von 0,2 µmol: 6,7 mg CPG entsprechend einem Volumen von 0,02 ml und einem Füllungsgrad von 20 %

Synthetisator von MILLIPORE, Modell 8800

Reaktionsgefäß in Form eines Behälters mit 225 ml, verwendbar mit 1 bis 15 g CPG.
Für die erfindungsgemäßen Beispiele:
- Standard-Verfahren für 100 µmol
- fester Träger: CPG 500 Å (MILLIPORE S.A., Frankreich) Kapazität: 30 µmol/g Dichte: 3 ml/g
entweder für 100 µmol: 3,33 g CPG entsprechend 10 ml Phase und einem Füllungsgrad von 4,5 %
- verbessertes Verfahren für 100 µmol
- fester Träger: CPG 500 Å Forte Capacité (High Load") MILLIPORE S.A.,
Frankreich
Kapazität: 100 µmol/g
Dichte: 3 ml/g
oder für 100 mol: 1 g CPG entsprechend 3 ml Phase und einem Füllungsgrad von 1,3 %
Im Vergleich zu den in den Beispielen 1 bis 4 angegebenen Ergebnissen ist die Verkürzung der Synthesedauer und die Verminderung der Reagensmenge beträchtlich (Tabelle 6).

Für die Synthese von 100 µmol:

- bei dem erfindungsgemäßen Verfahren (Beispiel 3 und Tabelle 3) verwendet man 118 ml Reagentien und Lösungsmittel und die Synthesedauer beträgt 3 min pro Synthesezyklus;
- mit einer MILLIPORE-Kolonne verwendet man 500 ml Reagentien und Lösungsmittel und die Synthesedauer beträgt 20 min pro Zyklus. Tabelle 1 Tabelle 2 Tabelle 3 Tabelle 4 Tabelle 5 Tabelle 6
* APPLIED BIOSYSTEMS, manuelle Verwendung des Synthetisators ABI 394
** N.D. SINHA, S. FRY: 3. COMBRIDGE SMPOSIUM
Oligonucleotide & Analogues", 5.-8. September 1993
POSTER COMMUNICATION

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden auf einem festen Träger in einem Reaktionsgefäß in Form einer Kolonne, durch die man die Lösungen der Reagentien und/oder Lösungsmittel zirkulieren läßt, dadurch gekennzeichnet, daß die feste Phase, die den genannten festen Träger darstellt, in dem genannten Reaktionsgefäß immobilisiert ist und daß die genannten Lösungen in der Kolonne und durch die feste Phase hindurch in Form einer fortschreitenden Frontlinie in der Weise wandern, daß die aufeinanderfolgenden Lösungen jeder Stufe eines Synthesezyklus sich nicht vermischen.

2. Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden auf einem festen Träger in einem Reaktionsgefäß in Form einer Kolonne, durch die man die Lösungen der Reagentien und/oder Lösungsmittel zirkulieren läßt, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsgefäß eine Kolonne ist, die von Teilchen aus einem porösen Material vollständig angefüllt ist, die den genannten festen Träger darstellen.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsgefäß die Form einer zylindrischen Kolonne hat.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die feste Phase aus Teilchen besteht, die ihrerseits aus porösen Mikrokugeln bestehen.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsgefäß bei einer Temperatur zwischen 30 und 60ºC, vorzugsweise in der Größenordnung von 45ºC, gehalten wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reagentien vor dem Einführen in das Reaktionsgefäß und gegebenenfalls vor dem Mischen derselben miteinander auf die Temperatur des Reaktionsgefäßes erwärmt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe der Schutzgruppenentfernung mit TFA in Dichlorethan durchgeführt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe der Oxidation mit Iod, gelöst in Essigsäure, und Pyridin durchgeführt wird.

9. Reaktionsgefäß zur Herstellung von Polynucleotiden nach dem Verfahren der Ansprüche 1 bis 8, das die Form einer Kolonne hat, die einen festen Träger enthält, durch den man die Lösungen der Reagentien und/oder Lösungsmittel zirkulieren läßt, dadurch gekennzeichnet, daß die feste Phase, die den festen Träger darstellt, in dem genannten Reaktionsgefäß in der Weise immobilisiert ist, daß die genannten Lösungen in der Kolonne und durch die genannte feste Phase hindurch in Form einer fortschreitenden Frontlinie so wandern, daß die aufeinanderfolgenden Lösungen jeder Stufe eines Synthesezyklus sich nicht oder nur wenig vermischen.

10. Reaktionsgefäß für die Verwendung in einem Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden auf einem festen Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer zylindrischen Kolonne besteht, die mit Teilchen aus einem porösen Material vollständig angefüllt ist, die den festen Träger darstellen.

11. Reaktionsgefäß nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen poröse Mikrokugeln sind.

12. Reaktionsgefäß nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß es thermostatisch bei einer Temperatur zwischen 30 und 60ºC, vorzugsweise bei 45ºC, gehalten werden kann.

13. Vorrichtung zur Synthese von Polynucleotiden auf einem festen Träger, die das thermostatisch geregelte Reaktionsgefäß nach einem der Ansprüche 9 bis 12 und einen thermostatisch geregelten Kollektor umfaßt, in dem die Reagentien vor ihrer Einführung in das Reaktionsgefäß gesammelt, auf die Temperatur des Reaktionsgefäßes erwärmt und dann miteinander gemischt werden.