DE3650477T2

DE3650477T2 - Produktion von Cystinreste enthaltenden aktiven Proteinen

Info

Publication number: DE3650477T2
Application number: DE3650477T
Authority: DE
Inventors: Robert T Garvin; Eric James
Original assignee: Cangene Corp
Current assignee: Cangene Corp
Priority date: 1985-11-01
Filing date: 1986-10-31
Publication date: 1996-10-31
Anticipated expiration: 2006-11-01
Also published as: ATE133711T1; EP0222279A2; EP0222279A3; EP0222279B1; CA1295563C; ES2083352T3; DE3650477D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen, die Cystinreste als integralen und notwendigen Teil ihrer aktiven Struktur aufweisen, durch Züchtung gentechnisch manipulierter Mikroorganismen. Die Fähigkeit, Gene in Mikroorganismen zu manipulieren, ist Alltäglichkeit geworden. Der Organismus, auf dem der größte Teil des Standes der Technik in der Gentechnik basiert, ist Escherichia coli (E. coli), ein gramnegatives, nicht-sporulierendes Bakterium der Familie Enterobacteriaceae, das in großer Zahl in den normalen Exkrementen von Menschen und Tieren gefunden wird. Unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken kann das Gen, das für die Synthese eines Proteins kodiert, in E. coli eingebracht werden, welches dann dieses Protein synthetisieren wird. Das verwendete genetische Material kann entweder ein natives Gen sein, in welchem Fall das hergestellte Protein natürlich sein wird; oder ein konstruiertes Gen, in welchem Fall das hergestellte Protein einzigartige oder ungewöhnliche Eigenschaften aufweisen kann, die in der Natur nicht gefunden werden.
Wiederholte erfolgreiche Anwendungen spezieller Techniken auf dem allgemeinen Gebiet rekombinanter DNA haben bestätigt, daß es möglich ist, die Expression eines heterologen genetischen Elements in E. coli zu erreichen, wobei die Expression in diesem Fall beschränkt ist auf die Translation der genetischen Information in eine lineare, kovalent gebundene Aminosäureanordnung (ein Polypeptid) mit einer Primärsequenz, die mit dem Strukturanteil des genetischen Ursprungselements kolinear ist, unter Beachtung der Beziehung, daß ein Codon des genetischen Strukturelements gleich einer Aminosäure des korrespondierenden Polypeptids ist. Eine solche Translation, im Anschluß an die Einführung von genetischem Material, wird als die Summe natürlicher zellulärer physiologischer Ereignisse oder Prozesse betrachtet, welche zusammen in der Gen-gesteuerten Herstellung eines Polypeptids mit "korrekter", d. h. dafür kodierter, linearer Struktur resultieren. Heterolog bezieht sich auf den Nicht-Wirt-Ursprung (entweder natürlich oder synthetisch) des genetischen Elements.
Der Stand der Technik konzentrierte sich auf Verfahren, um DNA zu isolieren, zu schneiden und auf neuen oder einmaligen Wegen wieder zusammenzufügen und auf Verfahren, um diese geschaffenen DNA- Moleküle in neue Organismen einzuführen. Solche rekombinanten DNA- Techniken (d. h. Extraktion von DNA aus Organismen, Verdauung von DNA mit Restriktionsenzymen, Entwicklung analytischer Verfahren zur Sequenzierung von DNA, Isolierung der Bestandteile von mit Restriktionsendonuklease(n) geschnittener DNA, Zusammenligierung von isolierten DNA-Restriktionsfragmenten oder der Restriktionsverdauungen selbst mit natürlichen oder geschaffenen DNA-Vektoren, die genetische Elemente enthalten, welche die Kompetenz besitzen, als Bezugspunkte zur Dekodierung der DNA zu dienen, Transformation von Wirtszellen mit den kompetenten Vektoren, die ligierte Restriktionsfragmente von DNA enthalten, und Einstellen von Wachstumsbedingungen, um diejenigen Zellen zu begünstigen, welche die rekombinanten genetischen Elemente enthalten) haben zu der Annahme geführt, daß die Herstellung eines funktionellen Proteins unter Verwendung der in der DNA enthaltenen Information nur ein Problem hinsichtlich der Dekodierung der DNA darstellt. Sobald die korrekte primäre Aminosäurestruktur aus dem genetischen Material erzeugt war, das in eine Wirtszelle eingeführt worden war, wurde angenommen, daß die aktive Form des Proteins sich automatisch aus der unvermeidlichen Wirkung natürlicher und allgemeiner zellulärer physiologischer Gesetze ergeben würde. Diese Lehre beruht auf dem seit langem etablierten Anfinsen-Prinzip, ein zentraler Satz der Molekularbiologie, welcher aussagt, daß die erforderliche Information, um die komplexe dreidimensionale Struktur eines Proteinmoleküls zu spezifizieren, in dessen primärer Aminosäuresequenz enthalten ist (Anfinsen, 1964; 1973).
Die Bedeutung der Funktionalität und der aktiven Form läßt sich richtig würdigen, wenn man sich vor Augen führt, daß Proteine essentielle Rollen bei praktisch allen biologischen Prozessen spielen: enzymatische Katalyse, Transport und Lagerung, koordinierte Bewegung, mechanische Unterstützung, Immunschutz, die Erzeugung und Übertragung von Nervenimpulsen, und die Kontrolle von Wachstum, Differenzierung und Reproduktion. Die Aktivität von Proteinmolekülen, die bei all diesen Prozessen beteiligt sind, ist eine Folge ihrer Konformation, d. h. ihrer dreidimensionalen Struktur. Die Einnahme der korrekten dreidimensionalen Struktur ist deshalb für ein Protein zur Ausübung seiner Funktion essentiell.
Aus den oben ausgeführten Gründen befaßte sich der Stand der Technik bisher weder mit Funktionalität noch aktiver Form als wesentlich für die gentechnische Praxis, sondern behandelte statt dessen die Erreichung der korrekten dreidimensionalen Struktur auf einer ad hoc- Basis. Die Praktiker der Gentechnik nahmen an, daß eine korrekte Genexpression die korrekte dreidimensionale Struktur in dem kodierten Protein sicherstellen würde, und haben diejenigen Fälle, bei denen dies nicht zutraf, als Abweichungen von dieser angenommenen allgemeinen Regel behandelt.
Viele Forscher haben die Expression eines eukaryotischen Gens, das für ein sekretorisches Protein kodiert, in E. coli und anderen Prokaryoten gesucht. In ihrem gewählten Wirtsorganismus exprimiert, wurden diese normalerweise löslichen eukaryotischen Proteine im allgemeinen als unlösliches intrazelluläres Produkt gefunden, das keine ihrer natürlichen enzymatischen, immunogenen, hormonellen oder strukturellen Eigenschaften aufwies. Unter den vielen Erklärungen für diese Fehlschläge wurde nirgends eine metabolische Tatsache der cytoplasmatischen Proteinexpression in E. coli erkannt, nämlich das Unvermögen von E. coli, die Bildung von Disulfidbrücken während der cytoplasmatischen Proteinexpression zu fördern.
Die Bedeutung dieser Beobachtung für die Praxis der Gentechnik ist klar, wenn man sich vor Augen führt, daß die native Struktur von eukaryotischen sekretorischen Proteinen - diejenigen Proteine, welche aufgrund ihres hohen potentiellen wirtschaftlichen Werts für Gentechniker am interessantesten sind - fast immer Disulfid-gebunden ist. Das Unvermögen, die Expression eukaryotischer Proteine aus Prokaryoten in ihren natürlichen aktiven Disulfid-gebundenen Form zu erreichen, hat die wirtschaftliche Auswertung ernsthaft beschränkt.
Dementsprechend strebten die Erfinder danach, ein Expressionssystem zu entwickeln, das für die Herstellung eukaryotischer sekretorischer Proteine in aktiver Disulfid-gebundener Form adäquat ist. Dies erforderte die Identifizierung von prokaryotischen Zellen, welche imstande sind, die wesentlichen Merkmale eukaryotischer sekretorischer Proteinexpression durchzuführen, insbesondere die Fähigkeit zur Förderung der Bildung von Disulfidbindungen während des Prozesses der Proteinsekretion einschließen. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung suchten auch nach effektiveren Mitteln als die üblichen Mittel für die Expression derjenigen Gene, welche für Disulfidbindung-enthaltende Proteine (DBCPs) kodieren.
Gray et al., Gene 32, Nr. 1-2 (Dezember 1984), Seiten 21-30, offenbaren die Expression von aktivem Rinderwachstumshormon durch Streptomyces lividans unter der Kontrolle des regulatorischen Bereichs des Streptomyces fradiae aph-Gens.
EP-A-0179449 offenbart ein Verfahren zur Sekretion von homologem nicht-Disulfid-gebundenem Protein aus Streptomyces.
EP-A-0161629 beschreibt die Verwendung einer Signalsequenz, die verantwortlich ist für den Transport eines homologen Disulfidgebundenen Translationsprodukts (Amylase-Inhibitor) zu dem zellulären System, das für die Sekretion Disulfid-gebundener Proteine in Streptomyces-Spezies verantwortlich ist, die eine Signalpeptidase enthalten.
Gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt eine DNA-Sequenz, die für ein eukaryotisches Protein mit mindestens einem Cystinrest kodiert:
(a) eine aus einem Streptomyces-Wirt ausgewählte regulatorische Nukleotid-Sequenz, wobei die regulatorische Sequenz eine Promotorsequenz und eine Signalsequenz einschließt, die dafür verantwortlich ist, daß ein homologes Translationsprodukt zu dem zellulären System geschickt wird, das für die Sekretion von Disulfid gebundenen Proteinen verantwortlich ist, funktionsfähig verknüpft mit
(b) einer zweiten Nukleotidsequenz, die für ein Disulfidbindung-enthaltendes heterologes eukaryotisches Protein kodiert; mit der Maßgabe, daß die regulatorische Sequenz nicht aus einem Streptomyces-endoH-Gen ausgewählt ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein replizierbares mikrobielles Expressionsvehikel bereit, welches imstande ist, ein eukaryotisches Protein mit mindestens einem Cystinrest zu exprimieren, und eine DNA-Sequenz wie oben definiert einschließt. Dieses Vehikel kann in einen Streptomyces-Wirt eingeführt werden. Der Wirt kann in Kultur gezüchtet werden, um ein aktives eukaryotisches Protein herzustellen, z. B. ein Protein mit biologischer hormoneller, immunologischer oder enzymatischer Aktivität.
Die vorliegende Erfindung erlaubt die erfolgreiche Expression von heterologen Genprodukten mit Cystinresten als integralen und notwendigen Teil ihrer aktiven Struktur in vollständig funktioneller Form.
Die als Wirt gewählte Zelle oder der gewählte Mikroorganismus sollte die natürliche Fähigkeit zur Herstellung von extrazellulären Proteinen, die Disulfidbrücken enthalten, aufweisen.
In der bevorzugten Ausführungsform sollte die Wirtszelle oder der Wirtsmikroorganismus vorzugsweise hohe Niveaus an Disulfidaustausch- Enzym (DIE) -Aktivität eines Typs aufweisen, der durch die Aktivität von Proteindisulfidisomerase-Enzym (EC 5.3.4.1) gekennzeichnet, aber nicht darauf beschränkt ist.
Das für die Expression des heterologen Gens, welches für das DBCP kodiert, in dem Wirt gewählte genetische Element sollte die Nukleotidsequenz enthalten, welche dem Teil eines nativen Wirtsgens entspricht, der dafür verantwortlich ist, daß das unmittelbare Translationsprodukt zu dem zellulären sekretorischen System geschickt wird, wo die Prozessierung für die Sekretion, einschließlich Bildung von Disulfidbindung(en), stattfindet. Dieser "Adressen"-Teil ist für die Expression heterologer Gene, die für DBCPs kodieren, in aktiver Form notwendig. Er kann bequem identifiziert werden durch eine Bestimmung der Struktur des genetischen Elements, welches für ein sekretiertes DBCP kodiert, das natürlicherweise im Wirtsorganismus vorhanden ist. Dieser Adressenteil kann entweder ein Teil des tatsächlichen Wirtsgens oder eine synthetische Sequenz sein. In jedem Fall kann die regulatorische Sequenz modifiziert werden, um die Expression des gewünschten DBCP zu optimieren.

Begleitzeichnungen:

Fig. 1 stellt verschiedene Molekularstrukturen dar, welche während der biologischen Prozessierung von Vorläuferproteinen, die zur Bildung von aktivem Human-Insulin führt, gebildet werden können. Nach der Translation des unmittelbaren Human- Insulin-Genprodukts, Preproinsulin-mRNA, durch Ribosomen werden alle diese Formen gefunden. Die Aminosäuren werden durch die gebräuchlichen Einbuchstaben-Abkürzungen dargestellt. Die eingekreisten Aminosäuren stellen enzymatische Spaltungsstellen dar, welche in der Entfernung des C-Peptids resultieren.
Fig. 2 ist eine Diagrammdarstellung eines Gens, das für die Synthese eines sekretierten Proteins kodiert, welches Disulfidbindungen als essentielle Strukturdeterminante seiner biologisch aktiven dreidimensionalen Konformation enthält.
Fig. 3 illustriert die Identifizierung und Isolierung von Klonen, die Sonden-positive Gene enthalten.
A - Sonden-positive Signale von den ursprünglichen Transformationsplatten
B - erneutes Screenen von Signal-positiven Zellen von A (oben) zur Isolierung von mutmaßlich Sonden-positiven Klonen.
Fig. 4 stellt eine Agarosegel-elektrophoretische Analyse von Restriktionsverdauungen eines bestimmten Plasmidsets dar, der aus mutmaßlich Proteasegen-enthaltenden Klonen, wie in Fig. 3 identifiziert, isoliert wurde.
Fig. 5 stellt die Nukleinsäuresequenz und deren abgeleitete Aminosäuresequenz dar, die für einen Teil der CG4019-Preproprotease (einschließlich der "Adresse" und den ersten 12 Aminosäuren des Strukturanteils) kodiert. Vertikale Buchstaben sind Restriktionsendonuklease-Stellen; zur Darstellung von Aminosäuren wurde die gebräuchliche Einbuchstaben-Abkürzung verwendet. Der Pfeil stellt die Leader-Peptidase-Prozessierungsstelle dar.
Fig. 6 stellt die Nukleinsäuresequenz und deren abgeleitete Aminosäuresequenz dar, die für die ersten 12 Aminosäuren von Prochymosin kodiert, welchen die Preproprotease-Leader-Sequenz vorangeht. Die Verbindung erfolgte über die NotI-Restriktionsstelle. Buchstaben-gebrauch wie in Fig. 5 angegeben.
Fig. 7 ist eine Diagrammdarstellung der DNA-Konstrukte und Verfahren, die zur Erzeugung einer Kompetenztestmischung verwendet wurden. Diese Mischung kann das interessierende native Gen enthalten, welches für die Produktion eines extrazellulären Disulfidbindungenthaltenden Proteins kodiert. Ihr Einsatz identifiziert eine kompetente Zelle unter Verwendung von CG1085 als Wirt.
Fig. 8 illustriert die Änderung im Phänotyp, welche mit der Transformation des Stammes CG1085 durch ein Gen verbunden ist, das für die Produktion einer extrazellulären Disulfidbindungenthaltenden Protease kodiert.
A - Der Phänotyp von CG1085 auf Magermilchagar vor der Transformation
B - Der Phänotyp von CG1085 auf Magermilchagar nach der Transformation durch pCG6, das Plasmid, welches das Gen für die extrazelluläre Protease enthält.
Fig. 9 illustriert den Phänotyp von transformiertem CG1085 auf CC-Agar. Der Halo demonstriert die Anwesenheit von Disulfidgebundener Protease.
Fig. 10 ist eine Darstellung des Plasmids pCG6, welches das Gen enthält, das für die Synthese der extrazellulären Disulfidbindung-enthaltenden Protease aus CG4019 kodiert.
Fig. 11 erläutert die charakteristische Restriktionskarte des 8,4 kbp BamHI-Inserts von pCG6, annähernd maßstabsgetreu, welche die Lokalisierung des Protease B-Strukturgens zeigt.
Fig. 12 ist eine Darstellung des Plasmids pCG63, welches das Genkonstrukt enthält, das für die Biosynthese von extrazellulärem Prochymosin kodiert.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform

Bisher haben Praktiker kein Verfahren beschrieben, dessen Durchführung die korrekte Bildung von Disulfidbindungen in einem Proteingenprodukt sicherstellt, das durch die Expression des Gens für ein eukaryotisches sekretorisches Protein in einem prokaryotischen Wirt hergestellt wird. Disulfidbindungen sind essentiell für die Aktivität vieler Proteingenprodukte, deren funktionelle dreidimensionale Struktur ihre Bildung und Aufrechterhaltung erfordert. Die Bedeutung von Disulfidbindungen läßt sich aus einer Betrachtung der Struktur des Insulinmoleküls verstehen.
Die Aminosäuresequenz von Human-Insulin ist in Fig. 1 dargestellt. Nach der Reduktion der gezeigten Disulfidbindungen verliert das Hormon seine Aktivität. In der Natur wird Insulin aus einem Vorläufermolekül gebildet, Proinsulin (ebenfalls in Fig. 1 gezeigt), das eine einzige Polypeptidkette mit allen erforderlichen Disulfidbindungen darstellt, aber eine Aminosäuresequenz enthält, die in Insulin nicht vorhanden ist. Wie in Fig. 1 angezeigt, führt die Entfernung des verbindenden Peptids (das C-Peptid) durch enzymatische Verdauung Proinsulin, das als Hormon nicht aktiv ist, in aktives Insulin über. Diese enzymatische Verdauung geschieht in den Lagergranula der β-Zellen des Pankreas. Die β-Zelle besitzt die essentiellen Mittel, um die korrekten Disulfidbrücken zu bilden, welche zur Faltung des Proinsulinmoleküls erforderlich sind.
Mit Hilfe gentechnischer Methoden ist das für Human-Proinsulin kodierende Gen in E. coli eingeführt worden. Die kommerzielle Produktion von Human-Insulin für die therapeutische Verwendung ist als erster Erfolg der Gentechnik auf dem Gebiet des Gesundheitswesens gefeiert worden (Johnson, 1983). Im Gegensatz zur Expression in seinem natürlichen Wirt sammelt sich in E. coli exprimiertes Proinsulin jedoch in großen Aggregaten an, die "Einschlußkörper" genannt werden, eine Situation, die für die heterologe Proteinexpression in E. coli (Williams et al., 1982) üblich ist. Dementsprechend müssen die im natürlichen Molekül vorhandenen Disulfidbindungen sorgfältig durch exakte chemische Verfahren an Ort und Stelle gebracht werden, bevor das in E. coli exprimierte Proinsulin zum aktiven Insulinhormon prozessiert werden kann.
In der Praxis mußten Verfahren zur "Wiederherstellung" von Disulfidbindungen für eine große Anzahl von gentechnisch manipulierten Proteinen entwickelt werden, deren Gene in E. coli eingeführt wurden. Dieses unerwartete Erfordernis hat die Entwicklung des Gebietes allgemein verzögert und es ist in erster Linie die Unfähigkeit von E. coli, Disulfidbindungen zu bilden, welche für den Mangel an kommerziellen Produkten ähnlich Human-Insulin verantwortlich ist, die sich aus der Anwendung rekombinanter DNA- Gentechnik ergeben konnten.
Die Erfinder brachten in Erfahrung, daß die enzymatische Aktivität von cytoplasmatischen Proteinen von Genen verschiedener prokaryotischer Gattungen oft erhalten bleibt, wenn die Gene in E. coli kloniert und exprimiert werden, mit der Folgerung, daß das "fremde" Protein ein vertrautes molekulares Milieu gefunden hat und deshalb eine aktive Struktur annahm.
Die Erfinder stellten auch fest, daß das Thioredoxin-System von E. coli, das bekanntermaßen bei der Reduktion von Proteindisulfiden durch NADPH [Holmgren, 1976; 1979; Holmgren et al., 1978] aktiv ist, ein ähnliches Gegenstück bei den prokaryotischen und eukaryotischen Gattungen aufweist, mit der Folgerung, daß die Reduktion von Disulfidbindungen die Norm im Cytoplasma aller Zellen wäre. Deshalb würde eine genetische Expression an dieser cytoplasmatischen "Adresse" für diejenigen Proteine ungeeignet sein, deren biologische Eigenschaften durch Disulfidbindungen bestimmt werden.
Eine umfassende Prüfung von Prokaryoten durch die Erfinder offenbarte, daß hohe Niveaus an DIE- oder DIE-ähnlicher Aktivität selten gefunden wurden. Wurde sie jedoch gefunden, so traf sie im allgemeinen mit einer auffallenden Fähigkeit der Wirtszelle zur Sekretion von Disulfid-gebundenem(n) Protein(en) zusammen.
Cytoplasmatische Proteine, die Disulfidbindungen enthalten, wurden von den Erfindern weder in E. coli gefunden noch in bestimmten Beispielen von Bacillus, demjenigen Expressionswirt, der in der Popularität bei Gentechnikern nur E. coli nachsteht. Darüber hinaus fanden die Erfinder, daß während bestimmte Mitglieder von Bacillus Proteine auf hohen Niveaus sekretieren, solche Stämme kein Protein sekretierten, dessen natürliche biologische Eigenschaften eine Disulfid-gebundene Struktur erforderte. Keiner der untersuchten E. coli- oder Bacillus-Stämme besaß signifikante Niveaus an DIE- oder DIE-ähnlicher Aktivität. Hauptsächlich aus diesem Grund haben die Erfinder E. coli und Bacillus als ungeeignete Expressionswirte für eukaryotische sekretorische Proteine eingestuft: keiner von ihnen besitzt das natürliche Vermögen, die Bildung von Disulfidbindungen zu fördern.
Von den eukaryotischen Proteinen, die in Prokaryoten unter Erhaltung ihrer gewünschten nativen Eigenschaften exprimiert werden, sind alle entweder ohne Disulfidbindung, erhielten ihre Disulfidbindungen in vitro durch chemische Mittel gezielt wiederhergestellt oder haben eine unbeabsichtigte Wiederherstellung der Disulfidbindung erfahren, im wesentlichen durch Oxidation, nachdem sie Luft ausgesetzt waren.
Die vorliegenden Erfinder haben die Bedeutung der zellulären "Adresse" für den Oxidationszustand von Proteinen bestätigt. Nachdem sie feststellten, daß der Oxidationszustand auch eine kritische Determinante der biologischen Aktivität von Proteinen war, wurde der Schluß gezogen, daß das Versäumnis, Expressionssysteme spezifisch zur Förderung der Bildung von Disulfidbindungen zu entwickeln, eine sehr ernste und vollständig übersehene Beschränkung für die Praxis der Gentechnik darstellt.
Als praktische Erläuterung dieser Erfindung wurde ein biosynthetisches Rinderprochymosin-Gen (das für ein eukaryotisches sekretorisches Protein mit Disulfidbindungen kodiert.) in einen kompetenten Mikroorganismus unter Verwendung eines Expressionsvektors kloniert, der speziell dazu konstruiert war, um heterologes Protein extrazellulär und in seiner natürlichen Disulfid-gebundenen Form zu exprimieren. Die Verfahren zur Identifizierung der zu verwendenden Wirtszelle und zur Konstruktion eines geeigneten Expressionsvektors sind angegeben. Die Ausführung dieser Erfindung resultiert in der Expression von sekretorischen Säugerproteinen in einem fermentierbaren prokaryotischen Wirt auf einem Produktionsniveau und bei Kosten, die sie zu attraktiven kommerziellen Produkten machen. Diese Erfindung fördert und erweitert daher den Einsatz rekombinanter DNA durch Praktiker der Gentechnik erheblich.
Die Entwicklung des Expressionssytems der vorliegenden Erfindung, welches imstande ist, ein heterologes DBCP extrazellulär zu exprimieren, begann mit der Überprüfung existierenden Sammlungen von Organismen und aus der Umwelt isolierter Stämme auf deren extrazelluläre Proteinproduktion. Dies beinhaltete die Züchtung von Isolaten in Schüttel- und Fermentationskulturen, Entfernung der Zellen und Analyse der Kulturüberstandsflüssigkeit auf sekretierte Disulfid-gebundene Proteine durch Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) und Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS- PAGE).
Für die HPLC-Trennung von extrazellulären Proteinen wurden diejenigen Verfahren eingesetzt, welche wenig oder keine Denaturierung zur Folge hatten. Beispielsweise wurde HPLC mit hydrophober Wechselwirkung (Kato, et al., 1984) für die Trennung von Proteinen im Bereich von 5-50 kDal als geeignet befunden, unabhängig vom Molekulargewicht und mit einem hohen Ertrag an Aktivität, während Größenausschluß- HPLC (Barden, 1983) als geeignet für die Trennung von Proteinen im Bereich von 20-100 kDal befunden wurde, entsprechend dem Molekulargewicht und mit einer hohen Retention der nativen Struktur. SDS-PAGE wurde nach Laemmli (1970) durchgeführt.
Proteine, die durch HPLC aus zellulären Überständen in nativer Form gereinigt waren, wurden der Analyse ihres Disulfid-Bindungsgehalts unterworfen. Es wurde festgestellt, daß von den vielen verfügbaren Methoden das für diese Analyse am allgemeinsten einsetzbare Verfahren dasjenige von Thannhauser et al. (1984) ist, in dem die Bildung von 2-Nitro-5-thiobenzoat aus der Umsetzung von 2-Nitro-5-thiosulfobenzoat mit Disulfiden in Gegenwart eines Überschusses von Natriumsulfid mengenmäßig bestimmt wird.
Auf diese Weise können diejenigen zellulären Isolate bestimmt werden, die natürlicherweise hohe Niveaus an extrazellulären, Disulfidgebundenen Proteinen erzeugen.
Diejenigen zellulären Isolate, bei denen die Produktion hoher Niveaus an Disulfid-gebundenem, extrazellulärem Protein gezeigt worden war, wurden auf ihre DIE- oder DIE-ähnliche Aktivität analysiert. Homogenate ganzer Zellen können durch eine Modifikation des Verfahrens von Ibbetson und Freedman (1976) untersucht werden. So wurden DBCP-ausscheidende Mikroorganismen, bei denen festgestellt wurde, daß sie hohe Niveaus an DIE-ähnlicher Aktivität enthalten, als Kandidaten für ideale Wirte für die wirtschaftliche Produktion von heterologen sekretorischen Proteinen mit Cystin als essentiellem Strukturmerkmal betrachtet.
Das Gen, welches für die Primärsequenz eines Polypeptids kodiert, dessen Expression in seinem Hoch-DIE-enthaltenden Wirt in der Produktion von hohen Niveaus an Disulfid-gebundenem extrazellulärem Protein resultiert, kann durch die Anwendung des folgenden üblichen Versuchsprotokolls isoliert werden:
i) Reinigung des identifizierten Disulfid-gebundenen Proteins durch HPLC, Elektrophorese oder andere Standardverfahren;
ii) partielle Aminosäuresequenzierung des Proteins, um Folgen ("runs") von 6 oder 7 Aminosäuren zu identifizieren, gefolgt von einer Analyse, um zu bestimmen, welche der Folgen die am wenigsten redundanten kodierenden Nukleinsäuresequenzen ergibt;
iii) Synthese des Sets von am wenigsten redundanten Nukleinsäureoligonukleotiden, entsprechend einer oder mehreren der bestimmten Aminosäurefolgen, um als Sonden für die Genisolierung aus einer geeigneten genomischen Bank zu dienen;
iv) Identifizierung des Gens für das Zielprotein aus einer Genbank, die aus dem gewählten Organismus unter Verwendung des Sets konstruierter Oligonukleotide konstruiert wurde;
v) Bestimmung der Struktur des isolierten Gens durch Restriktionsanalyse und Nukleinsäuresequenzierung.
Der wichtigste Teil des so isolierten und charakterisierten Gens ist unter dem Gesichtspunkt der Expression der regulatorische Bereich (siehe Fig. 2). Dieser Teil enthält alle die genetischen Kontrollsignale, die von dem Organismus zur Synthese, Adressierung und Prozessierung des resultierenden Genprodukts verwendet werden. Die meisten dieser Signale sind wirtspezifisch. Der Strukturanteil der Gensequenz ist jedoch nicht wirtspezifisch und ist nur der Beschränkung der Codonverwendung unterworfen. Ein heterologes Strukturgen kann in die DNA-Sequenz, sobald sie bekannt ist, so eingefügt werden, daß der regulatorische Bereich zur Steuerung der Synthese, der Adressierung und der Prozessierung des gewünschten Genprodukts wirksam ist. Das für die Expression gewählte genetische Element könnte beispielsweise ein eukaryotisches sekretorisches Protein sein. In diesem Fall würde das genetische Expressionselement umfassen den Strukturanteil des eukaryotischen Gens, verbunden mit demjenigen Teil eines Gens, das für ein Wirts-natives Disulfidgebundenes sekretorisches Protein kodiert, welcher die extrazelluläre Adresse festlegt. Der Wirt, gewählt, da er alle die für die Sekretion von Disulfid-gebundenen Proteinen erforderlichen Komponenten enthält und den korrekten "Adressierungs"-Anteil des Gens verwendet, würde so den Transport des gewünschten Genprodukts an die geeignete Stelle für die sekretorische Prozessierung sicherstellen.
Die inserierte Strukturgensequenz kann natürlichen Ursprungs sein oder synthetisiert, um die Expression und Sekretion durch den gewählten Wirt zu optimieren. Das synthetische Gen kann sogar für ein konstruiertes Protein kodieren, das in der Natur nicht bekannt ist. Diese Erfindung ist deshalb allgemein geeignet zur Herstellung eines sekretorischen Proteins mit Disulfidbindungen als ein Merkmal der Molekularstruktur, das für dessen Aktivität erforderlich ist.
Die besten Ergebnisse werden erhalten, wenn der regulatorische Teil der Gensequenz für die Expression des Strukturanteils optimiert wird, indem die Sequenz des Verbindungsbereichs um den Anfangscodon des Strukturgens variiert wird. Die präzise Sequenz in diesem Bereich ist wichtig für die effiziente Ausscheidung, Prozessierung und Cystinbildung.
Als konkretes Beispiel der allgemeinen Erfindung wurde ein Mikroorganismus, von dem die Erfinder annehmen, daß es sich um den Stamm [ATCC 23921] vom Typ Streptomyces griseus handelt, als im Besitz von DIE-ähnlicher Aktivität identifiziert und als imstande, eine extrazelluläre Proteasefamilie zu produzieren, wovon mindestens ein Mitglied als Disulfidbindungen-enthaltend befunden wurde. Ein Isolat, typisch für eine Anzahl ähnlicher derartiger Isolate und mit der Bezeichnung CG4019 wuchs auf CC-Agarmedium unter Bildung eines großen weißen Halos, der die Kolonie umgab. Die Erscheinung dieses Halos war auf die Sekretion einer Disulfid-gebundenen Protease zurückzuführen. Das Gen, welches für die Synthese und Adressierung dieser Disulfidbindung-enthaltenden extrazellulären Protease kodiert, wurde aus CG4019 wie folgt isoliert.
Gesamt-DNA, aus CG4019 hergestellt wie von Chater et al. (1982) beschrieben, wurde mit BamHI verdaut und dann in die BamHI-Stelle von pBR322 (Bolivar et al., 1977) ligiert, wodurch eine CG4019/BamHI- Genbank hergestellt wurde. [Soweit nicht anders angegeben, verwenden molekulare Klonierungsverfahren die Versuchsprotokolle von Maniatis et al. (1982)]. DNA aus der CG4019/BamHI-Genbank wurde dazu verwendet, um E. coli HB101 (Boyer und Roulland-Dussoir, 1969) zu transformieren, wobei auf Resistenz gegenüber Ampicillin selektiert wurde. Die Transformanten enthalten als Gruppe das gesamte Genom von CG4019 als BamHI-Inserts in pBR322.
Zur Feststellung, welche Transformantenklone das Gen für die Disulfidbindung-enthaltende extrazelluläre Protease enthalten, wurde aus jedem Transformanten isolierte DNA gegen eine spezielle Oligonukleotidsonde hybridisiert. Die Nukleinsäuresequenz der speziellen Hybridisierungssonde basierte auf Folgen ("runs") von Aminosäuren, die in dem extrazellulären Disulfidbindung-enthaltenden CG4019- Proteaseprotein vorhanden sind (siehe Fußnote 1, unten)
Ein Fachmann kann dem hier detailliert beschriebenen Verfahren folgen, um die DNA-Struktur eines jeden Transformanten zu sondieren. Filterpapier (Whatman 540) kann auf die Transformantenklone gelegt werden, nachdem sie sich nach ihrer Transformation mit DNA aus der CG4019/BamHI-Genbank auf Ampicillinplatten entwickelt haben. Zu diesem Zeitpunkt angebrachte Tintenmarkierungen erlauben die spätere Orientierung des Papiers bezüglich der Ursprungsplatte. Nach 5 Minuten kann das Papier abgehoben, mit der Kolonieseite nach oben auf Filterpapier, das mit 0,2 N Natriumhydroxid, 1,5 M Natriumchlorid vorgetränkt wurde, aufgebracht und 10 Minuten stehengelassen werden. Das Papier kann dann auf Filterpapier, das mit 1,0 M Tris, 3 M Natriumchlorid, pH 7, vorgetränkt wurde, überführt, weitere 10 Minuten stehengelassen, und dann durch Eintauchen in 2XSSC-Lösung [Anmerkung: 20XSSC ist 3 M Natriumchlorid, 0,3 M Natriumcitrat, pH 7], gewaschen werden, wonach es auch durch Eintauchen ins 95% Ethanol gewaschen, luftgetrocknet und 2 Stunden bei 85ºC getrocknet werden sollte.
Diese getrockneten Papiere enthalten mindestens eine Probe der in den ursprünglichen Transformantenklonen vorhandenen DNA, lokalisiert an einer Stelle, welche durch die Orientierungs-Tintenmarkierungen zur Ursprungsplatte zurückverfolgt werden kann, welche selbst über Nacht inkubiert werden sollte, nachdem die Transformantenkolonien auf das Papier überführt wurden.
Um auf dem Papier diejenige DNA-Probe zu identifizieren, welche Gensequenzen enthält, die der Gensequenz der Disulfidbindung-enthaltenden extrazellulären Protease aus CG4019 entsprechen, sollten die Bedingungen so eingestellt werden, daß, falls eine DNA-Probe mit einem synthetischen Oligonukleotid hybridisiert, das eine einzigartige Proteasesequenz aufweist, jene Probe dann sichtbar gemacht wird.
Um dies auszuführen, sollten die getrockneten Filter zuerst mit 6XSSC-enthaltender Denhardt's-Lösung (siehe Maniatis et al., 1982, Seite 327) und 0,5% Natriumdodecylsulfat (SDS) 45 Minuten bei 65ºC gewaschen werden und dann Polyriboadenylsäure (5 µg/ml), DNA (ultraschallbehandelte E. coli-DNA, 50 µg/ml) und radioaktive Sonde¹ (mindestens 160.000 cpm/ml) zugegeben werden. Nach mindestens 10- stündiger Hybridisierung sollte das Papier zweimal mindestens jeweils 30 Minuten mit 3XSSC mit 0,5% SDS gewaschen und lufttrocknen gelassen werden.
Diejenigen DNA-Proben auf dem Papier, die Klone repräsentieren, welche das Proteasegen enthalten, werden mit einer der Sonden hybridisieren und deshalb radioaktiv sein, während diejenigen DNA- Proben, welche keine Proteasegensequenzen enthalten, wahrscheinlich nicht an irgendeine der einmaligen Proteasesonden binden werden.
¹ Sechzehn 18-mer-Desoxyoligonukleotidsonden wurden synthetisiert und mit (32)-Phosphor unter Verwendung des Kinasierungsverfahrens von Maniatis et al. (1978) endmarkiert. Die resultierenden sechzehn Sequenzen machen alle der möglichen Oligonukleotidsequenzen aus, die für die Aminosäure-Folgen Leu-Thr-Ala-Ala-His-Cys und Leu-Thr-Ala-Gly-His-Cys kodieren, die in der Disulfidbindung-enthaltenden extrazellulären Protease anwesend sind, die als in CG4019 anwesend festgestellt wurde.
Um zu bestimmen, welche der DNA-Proben nach der Hybridisierung gegen die Sondenfamilie radioaktiv sind, kann mit den getrockneten Papieren ein Röntgenfilm nach den in Maniatis et al. (1982) beschriebenen Verfahren belichtet werden. Durch korrekte Orientierung eines jeden entwickelten Röntgenfilms, der positive Signale enthält, gegenüber seiner Ursprungsplatte, die lebende Zellen enthält, kann der Satz von Klonen, welche einzeln oder zusammen wahrscheinlich das Disulfidbindung-enthaltende extrazelluläre Proteasegen von CG4019 (oder dessen äquivalenten Stammes) enthalten, identifiziert werden (siehe Fig. 3A).
Ein Agarpfropfen, der Zellen aus demjenigen Plattenbereich enthält, der Sonden-positive Hybridisierungssignale ergibt, kann zur Animpfung von Medium verwendet werden und das Verfahren kann unter Verwendung von Platten, die nun gut isolierte einzelne Kolonien enthalten, wiederholt werden. Auf diese Weise kann derjenige Satz von Klonen, der wahrscheinlich das Sonden-spezifische Gen enthält, identifiziert werden (siehe Fig. 3B).
Das BamHI-Insert der in diesem so isolierten Satz von mutmaßlich Proteasegen-enthaltenden Klonen enthaltenen Plasmide kann einer Restriktionsanalyse unterworfen werden, um die Anzahl verschiedener Inserts, die in dem Satz vorhanden sind, zu bestimmen. Fig. 4 zeigt ein typisches Gelmuster, aus dem geschlossen werden kann, daß die aus diesem Satz von mutmaßlichen Klonen isolierten Plasmide alle dasselbe 8,4 kbp Bam/Bam-Insert enthielten. Aus einem "Southern Blot" des in Fig. 4 dargestellten Gelmusters wurde gefolgert, daß das Bam/Bam-Insert die Sonden-spezifische DNA enthält. Ein Fachmann kann die DNA eines jeden verschiedenen BamHI-Inserts sequenzieren, um eine lineare Basenanordnung zu erhalten, deren allgemeine kennzeichnende Strukturelemente, wie in Fig. 2 angezeigt, abgeleitet werden können.
Auf diese Weise kann der Signalanteil (Sg in Fig. 2) des Gens, welches für die extrazelluläre Disulfidbindung-enthaltende Protease von CG4019 kodiert, bestimmt werden. Die Nukleotidsequenz des Signalanteils eines solchen Gens ist in Fig. 5 gezeigt, welche offenbart die Nukleinsäuresequenz vom Translations-Start des Adressierungsanteils eines Proteasegens - entsprechend dem pre-Anteil des Moleküls in Begriffen der Proteinstruktur - bis einschließlich den ersten sechsunddreißig Basen seines Strukturgen-Anteils, entsprechend den ersten zwölf Aminosäuren seines pro-Protein-Anteils. Wie aus Fig. 5 ersichtlich, schließt dieser Teil der Gensequenz eine NotI- Restriktionsstelle ein.
Diese Sequenzinformation bezüglich der Adressierungs- und Strukturanteile des Gens, welches für eine extrazelluläre Disulfidbindungenthaltende Protease von CG4019 kodiert, kann dazu verwendet werden, um wie folgt ein Kalbsprochymosin-Gen zu konstruieren, das für die Expression und Sekretion von Kalbsprochymosin in aktiver Form aus Streptomyces geeignet ist.
Ein synthetisches Prochymosin-Gen kann konstruiert werden, das für die Expression in Streptomyces optimierte Codons besitzt und ein 5'- Ende, das in eine NotI-Restriktionsstelle ligiert werden kann und ein 3'-Ende, das in eine andere günstige Restriktionsstelle ligiert werden kann, enthält. Ein solches Konstrukt würde die natürliche Streptomyces-Protease-Signalsequenz konservieren, wenn sie in die NotI-Stelle, wie in Fig. 6 gezeigt, ligiert würde. Es ließe sich feststellen, daß nach der Translation eines solchen genetischen Konstrukts im geeigneten Kontext ein Preprochymosin-Molekül hergestellt wird, dessen zelluläre Adresse identisch mit derjenigen des authentischen Preproprotease-Moleküls ist.
Der korrekte Kontext für die Translation eines solchen genetischen Preprochymosin-Konstrukts kann sichergestellt werden, indem eine kompetente Wirtszelle eingesetzt wird, die: (1) imstande ist, ausgeschiedene(s) Disulfid-gebundene(s) Protein(e) unter Verwendung des Adressierungsanteils des genetischen Preproprotease-Elements zu produzieren; und (2) ein Wirtszell-kompatibles Plasmid beherbergt, welches das wie oben detailliert ausgeführt konstruierte genetische Preprochymosin-Element enthält. Als konkretes Beispiel wurde eine derartige kompetente Wirtszelle von den Erfindern unter Verwendung des folgenden Versuchsprotokolls ausgewählt.
Die BamHI-Inserts des Satzes von mutmaßlich CG4109-Proteasegenenthaltenden Klonen, vorher durch "Colony-blot"-Hybridisierung identifiziert, wurden in einen Streptomyces-kompatiblen Vektor durch Anwendung der in Fig. 7 ausgeführten rekombinanten DNA-Techniken eingeführt. Die "Shuttle"-Zwischenprodukte wurden in dem HB101- Stamm von E. coli hochgezüchtet und wie in Fig. 7 gezeigt behandelt, um eine Kompetenztestmischung herzustellen, die zwei Plasmide enthält: ein pIJ702/Proteasegen-enthaltendes mit nur Streptomyces- DNA, und E. coli-DNA enthaltendes pUC8. Beide Plasmide waren unmodifiziert, da sie aus HB101 stammten.
Die Kompetenztestmischung wurde dazu verwendet, um verschiedene ausgewählte Streptomyces-Stämme zu transformieren, die isoliert worden waren oder von denen anderweitig bekannt war, daß sie:
(1) DIE-ähnliche Aktivität aufweisen; (2) extrazelluläre Disulfidbindung-enthaltende Proteine (DBCP) produzieren; und
(3) für extrazelluläre Protease negativ sind.
Ein solcher Stamm, ein Mikrorganismus von dem die Erfinder annehmen, daß es sich um den Stamm [ATCC 23921] vom Typ Streptomyces lividans handelt, wurde von den Erfindern als somit potentiell kompetent identifiziert. Ein Isolat dieses Stammes, typisch für eine Anzahl ähnlicher derartiger Isolate und mit der Bezeichnung CG1085, besaß den Protease-negativen Phänotyp auf Milchplatten wie in Fig. 8A gezeigt.
Die Transformation dieses Stammes durch die Kompetenztestmischung (hergestellt wie in Fig. 7) führte zu Kolonien, die auf Magermilch- Agarmedium den in Fig. 8B dargestellten Phänotyp aufweisen.
Die Hydrolyse, welche die Kolonie umgibt, wird erzeugt durch die Wirkung von extrazellulärer Protease auf im Medium vorhandenes Kasein. In ähnlicher Weise erzeugen Kolonien von S. lividans, die durch das extrazelluläre Proteasegen transformiert wurden, "Halos" auf CC-Agar, wie in Fig. 9 gezeigt. Von dieser biologischen Aktivität bei den aus CG4019 isolierten Proteasegenen ist den Erfindern bekannt, daß sie von der Anwesenheit von Disulfidbindungen abhängig ist. Das Auftreten dieses Phänotyps nach der Transformation durch die Kompetenztestmischung identifiziert einen kompetenten Wirt: fähig in aktiver Form ein Genprodukt zu sekretieren, dessen Lokalisation extrazellulär ist und dessen biologische Funktion disulfidbindungsabhängig ist. Ferner identifiziert die Verwendung der Kompetenztestmischung diejenigen potentiellen Wirtszellen, welche in der Lage sind, eingeführte DNA zu akzeptieren, die wie in Fig. 7 ausgeführt hergestellt wurde, d. h., ihre Verwendung eliminiert DNA-Restriktionsprobleme, die häufig auftreten, wenn Wildtyp- Isolate als DNA-Wirte verwendet werden.
Plasmide, die aus so als kompetent identifizierten Klonen isoliert wurden, enthalten ein funktionelles genetisches Element, das für ein extrazelluläres Protein kodiert, welches Disulfidbindungen als essentielle Strukturdeterminante aufweist. Ein Teil dieses genetischen Elements muß deshalb eine extrazelluläre Adresse spezifizieren. Fig. 10 stellt die allgemeine Struktur eines solchen Plasmids, pCG6, dar, welches aus mit Proteasegen-enthaltender Kompetenztestmischung transformiertem CG1085 isoliert und als im Besitz der gezeigten Struktur charakterisiert wurde. Die charakteristische Restriktionskarte des BamHI-Inserts von cPG6 ist in Fig. 11 dargestellt. Der Adressenanteil von pCG6, dessen Sequenz in Fig. 5 dargestellt ist, kann dazu verwendet werden, ein Plasmid zu konstruieren, welches für die extrazelluläre Produktion von biologisch aktivem Prochymosin-Protein kodiert. Ein derartiges geeignetes Konstrukt, das imstande ist, CG1085 in einen extrazelluläres Prochymosin-produzierenden Stamm zu transformieren, ist allgemein in Fig. 12 dargestellt, wobei der spezielle Adressenanteil und die Verbindungssequenz wie in Fig. 6 gezeigt ist.
Nach der Transformation von CG1085 durch ein Preprochymosin-Genenthaltendes Plasmid mit einer Struktur wie in Fig. 12 gezeigt, wird ein Preprochymosin-Molekül mit einer zellulären Adresse, die mit der von Preproprotease identisch ist, gebildet werden. Das Protein- Prozessierungssystem des Wirts, das an dieser Adresse vorhanden ist, behandelt das Preprochymosin-Molekül als wäre es Preproprotease und prozessiert es somit korrekt, indem der Pre-Anteil des Moleküls entfernt und die erforderlichen Disulfidbindungen gebildet werden wenn das resultierende funktionelle Prochymosin-Molekül aus der Zelle sekretiert wird.
Die zentrale Aussage des gentechnischen Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist, daß das Disulfidbindung-enthaltende heterologe sekretorische Protein, dessen Expression in vollständig aktiver Form erstrebt wurde (Prochymosin in der bevorzugten Ausführungsform) nur durch Verwendung einer Wirtszelle und eines genetischen Konstrukts, erstere gewählt und letzteres erzeugt, gemäß der Lehre dieser Offenbarung erreicht wird, und daß ein solches Protein, dessen Sekretion durch die Anwendung dieser Lehre erreicht wurde, in seiner natürlichen Disulfid-gebundenen Konformation vorliegen wird.
Durch SDS-PAGE-Analyse (Laemmli, 1970) von konzentrierten zellfreien Kulturüberständen von CG1085/pCG63 läßt sich bestimmen, daß die Proteinbanden von Prochymosin-Größe einen Prochymosin-positiven "Western Blot" ergeben. Ferner kann die Anwendung der oben beschriebenen HPLC- und Disulfidnachweis-Verfahren zeigen, daß ein Protein, das aus dem zellfreien Kulturüberstand von CG1085/pCG63 durch HPLC isoliert wurde und eine Mobilität zeigte, die mit der von autheritischem Kalbsprochymosin identisch ist, Disulfidbindungen enthält. Es kann ferner festgestellt werden, daß ein genetisches Konstrukt, zusammengesetzt aus dem BamHI-Insert von pCG63, das in die BamHI-Stelle von pBR322 kloniert wurde, und dazu verwendet, um E. coli HB101 zu transformieren, zu keiner solchen Produktion von extrazellulärem Material bei Verwendung identischer Analyseverfahren führt.
Zur größeren Sicherheit, es wird für einen Fachmann ersichtlich sein, daß der Strukturanteil jeder natürlichen Gensequenz - oder vielleicht vorzugsweise jeder synthetischen Strukturgen-Sequenz (so daß die Codonverwendung optimiert werden kann) - in dem Expressionsvektor und Wirt, welche zusammen die Erfindung ausmachen, eingesetzt werden kann. Ein solcher Einsatz wird, wenn er nach der Lehre dieser Erfindung an den regulatorischen Bereich eines Gens gekoppelt wird, das für ein Cystin-enthaltendes sekretorisches Protein aus irgendeiner Mikroorganismenquelle,identifiziert und entwickelt wie hier offenbart, kodiert, in der Produktion eines beliebigen gewünschten natürlichen oder konstruierten Disulfid-gebundenen Proteins resultieren, wie z. B., aber nicht darauf beschränkt, eukaryotische sekretorische Enzyme wie Prochymosin, Trypsine, Amylasen, Ligninasen, Chymosin, Lipasen, Cellulasen; prokaryotische sekretorische Enzyme wie Glucoseisomerase, Amylasen, Lipasen, Pectinasen, Cellulasen, Proteinasen, Oxidasen, Ligninasen; Blutfaktoren wie Faktor VIII und Faktor VIII-verwandte biosynthetische Blutgerinnungsproteine, Faktor IX; Plasminogenaktivator vom Gewebetyp; Hormone wie Proinsulin; Lymphokine wie β- und Gamma- Interferon, Interleukin-2; Enzyminhibitoren wie extrazelluläre Disulfidbindungen-enthaltende Proteine, deren Wirkung darin besteht, Antibiotika entweder enzymatisch oder durch Bindung zu zerstören, z. B. β-Lactamase-Inhibitor, α-Trypsin-Inhibitor; Wachstumsfaktoren wie Nervenwachstumsfaktoren, Gewebe-Nekrosefaktoren, Kolonie-stimulierende Faktoren; Immunglobulin-verwandte Moleküle wie synthetische, konstruierte oder gentechnisch hergestellte Antikörper-Moleküle; Zellrezeptoren wie Cholesterin- Rezeptor; virale Antigene wie virale Hämagglutinine, AIDS-Antigen und -Immunogen, Hepatitis B-Antigen und -Immunogen, Antigen und Immunogen des Maul-und Klauenseuchevirus; bakterielle Oberflächeneffektoren wie Protein A; Toxine wie Protein-Insektizide, -Algizide, - -Fungizide, und -Biozide; systemische Proteine von medizinischer Bedeutung wie myocardiales Infarktprotein (MIP), Gewichtskontrollfaktor (WCF) oder Protein der Wärmerate (CRP).
Die oben angegebenen Beispiele sind auf diejenigen natürlichen sekretorischen Proteine beschränkt, welche biologische Eigenschaften aufweisen, deren Auftreten eine Folge der Beibehaltung ihrer Disulfid-gebundenen Struktur ist.
Ein Fachmann kann ohne weiteres bestimmen, ob die Verwendung eines beliebigen bekannten oder unbekannten Organismus vom Umfang dieser Erfindung umfaßt wird, indem er technischen Lehre dieser Offenbarung folgt.
Die folgenden Spezies aus der Gattung Streptomyces sind als besonders geeignet befunden worden: acidophillus, albus, amylolyticus, argentiolus, aureofaciens, aureus, candidus, cellostaticus, cellulolyticus, coelicolor, creamorus, diastaticus, farinosus, flaveolus, flavogriseus, fradiae, fulvoviridis, fungicidicus, gelaticus, glaucescens, globisporus, griseolus, griseus, hygroscopicus, ligninolyticus, lipolyticus, lividans, moderatus, olivochromogenus, parvus, phaeochromogenes, plicatus, proteolyticus, rectus, roseolus, roseoviolaceus, scabies, thermolyticus, tumorstaticus, venezuelae, violaceus, violaceus-ruber, violascens oder viridochromogenes.
Der in der bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung beschriebene gentechnisch manipulierte Organismus kann durch Züchtung in diskontinuierlichem oder kontinuierlichem Fermentationsmodus in einem Fermenter oder durch Immobilisierung mit Trägerperlen in einem Bioreaktor kultiviert werden. Als Folge der in dieser Anmeldung beschriebenen gentechnischen Prinzipien bei Anwendung auf Organismen von einzigartigen Metabolismus, die nach der hier gegebenen Lehre identifiziert werden, kann das erwünschte heterologe sekretorische Protein in seiner natürlichen Konformation aus dem Mikroorganismus in die Medien ausgeschieden werden. Die höchsten Niveaus an aktivem ausgeschiedenem Protein sind mit denjenigen Mikroorganismen verbunden, welche die höchsten Niveaus an Disulfidaustausch-Enzym oder Disulfidaustausch-Enzym-ähnlicher Aktivität aufweisen.
Die Ausführung dieser Erfindung vermeidet somit die schwierige und oft kostspielige Aufgabe der chemischen Renaturierung, die bisher für die Herstellung von natürlich-aktivem Cystin-enthaltendem Protein erforderlich war.
Die Veröffentlichungen und anderen Materialien, auf die hier Bezug genommen wird, um den Hintergrund der Erfindung zu erläutern und um in speziellen Fällen zusätzliche Details bezüglich ihrer Durchführung zu bieten, sind hier durch die Bezugnahme eingeschlossen und zur Bequemlichkeit in der angeführten Bibliographie numeriert und zusammengestellt.

REZEPTUREN

Magermilch-Agar
Bestandteile pro Liter:
Magermilchpulver (No Name) 8% 80 g
Bacto-Nähragar (Difco pg 619):
Bacto- Fleischextrakt 3,0 g
Bacto- Pepton 5,0 g
Bacto-Agar 15,0 g
pH-Endwert 6,8 ± 0,2 bei 25ºC
Magermilchpulver und Nähragar werden separat aufgelöst. 500 ml Medien in 2 Liter-Kolben werden 15 Minuten bei 121ºC autoklaviert. Überhitzung ist zu vermeiden, da sonst Karamelisierung auftritt.
Die Milchsuspension wird anschließend in die Agarmedien gegossen. Die Platten sind abzuflammen, um Blasen zu vermeiden.
Die Platten werden inkubiert und periodisch auf eine klare Hydrolysezone überprüft, die das Bakterienwachstum umgibt.
Magermilchpulver (No Name). Die Zusammensetzung dieses Magermilchpulvers ist: Magermilchpulver, Vitamin A Palmitak und Vitamin D, 2200 I.U. Vitamin A pro 100 g, 440 I.U. Vitamin D pro 100 g.
Eine angenäherte Nährwertanalyse eines Quarts Flüssigkeit (1,13 l) von No Name Sunfresh Ltd. Magermilchpulver ist wie folgt:
Protein 40,6 g (etwa 4%)
Kohlenhydrat 58,5 g Niacin (B3) 1,0 mg
Vitamin A 2600 I.U. Ascorbinsäure (C) 8,0 mg
Vitamin D 500 I.U. Calcium 1466 mg
Thiamin (B1) 0,4 mg Phosphor 1139 mg
Riboflavin (B2) 2,0 mg Kalium 1956 mg
Eisen 0,7 mg, Natrium 596 mg, Fett 0,8 g

CC-Agar

Bestandteile pro Liter:
Kasein-Natriumsalze (Sigma #8654) 10 g
K&sub2;HPO&sub4; 0,5 g
MgSO&sub4; · 7H&sub2;O 0,2 g
Spurenelementlösung* 2 ml
Agar (gereinigt) 15 g
pH 7,2, H&sub2;O auf 1 Liter
* Spurenelementlösung (11.)
Es werden separat autoklaviert
ZnCl&sub2; 40 mg
FeCl&sub3; · 6H&sub2;O 200 mg
CuCl&sub2; · 2H&sub2;O 10 mg
MnCl&sub2; · 4H&sub2;O 10 mg
Na&sub2;B&sub4;O&sub7; · 10H&sub2;O 10 mg
(NH&sub4;)&sub6;Mo&sub7;O&sub2;&sub4; · 4H&sub2;O 10 mg
H&sub2;O auf 1 Liter

REFERENZEN

1. Anfinsen, C.B., "On the possibility of predicting tertiary structure from primary sequence", in New Perspectives in Biology [Sela, M. (ed.), American Elsevier, 1964] p.p. 42-50.
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Claims

1. DNA-Sequenz, die für ein eukaryotisches Protein mit mindestens einem Cystinrest kodiert, umfassend:

(a) eine aus einem Streptomyces-Wirt ausgewählte regulatorische Nukleotidsequenz, wobei die regulatorische Sequenz eine Promotorsequenz und eine Signalsequenz einschließt, die dafür verantwortlich ist, daß ein homologes Translationsprodukt zu dem zellulären System geschickt wird, das für die Sekretion von Disulfid-gebundenen Proteinen verantwortlich ist, funktionsfähig verknüpft mit

(b) einer zweiten Nukleotidsequenz, die für ein Disulfidbindung-enthaltendes heterologes eukaryotisches Protein kodiert; mit der Maßgabe, daß die regulatorische Sequenz nicht aus einem Streptomyces-endoH-Gen ausgewählt ist.

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, worin der Streptomyces- Wirt ausgewählt ist aus der Spezies acidophillus, albus, amylolyticus, argentiolus, aureofaciens, aureus, candidus, cellostaticus, cellulolyticus, coelicolor, creamorus, diastaticus, farinosus, flaveolus, flavogriseus, fradiae, fulvoviridis, fungicidicus, gelaticus, glaucescens, globisporus, griseolus, griseus, hygroscopicus, ligninolyticus, lipolyticus, lividans, moderatus, olivochromogenus, parvus, phaeochromogenes, plicatus, proteolyticus, rectus, roseolus, roseoviolaceus, scabies, thermolyticus, tumorstaticus, venezuelae, violaceus, violaceus-ruber, violascens oder viridochromogenes.

3. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, worin das Disulfidbindungenthaltende heterologe eukaryotische Protein heterolog bezüglich des Streptomyces-Wirts ist und ein natürliches oder konstruiertes Protein ist, welches ausgewählt ist aus der Gruppe aus Prochymosin, Trypsinen, Amylasen, Ligninasen, Chymosin, Lipasen, Cellulasen; Glucoseisomerase, Pectinasen, Proteinasen, Oxidasen; Faktor VIII und Faktor VIII-verwandten biosynthetischen Blutgerinnungsproteinen, Faktor IX; Plasminogenaktivator vom Gewebetyp; Proinsulin; Gamma-Interferon, Interleukin-2; extrazellulären Disulfidbindungen-enthaltenden Proteinen, deren Wirkung darin besteht, Antibiotika entweder enzymatisch oder durch Bindung zu zerstören, β-Lactamase-Inhibitor, α-Trypsin-Inhibitor; Nervenwachstumsfaktoren, Nekrosefaktoren des Gewebes, Kolonie-stimulierenden Faktoren; synthetischen, konstruierten oder gentechnisch hergestellten Antikörper-Molekülen; Cholesterin-Rezeptor; viralen Hämaglutininen, AIDS-Antigen und -Immunogen, Hepatitis B- Antigen und -Immunogen, Antigen und Immunogen des Maul- und Klauenseuchevirus; Protein A, Protein-Insektiziden, -Algiciden, -Fungiziden, und Fungiziden; myocardialem Infarktprotein (MIP), Gewichtskontrollfaktor (WCF) oder Protein der Wärmerate (CRP).

4. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, worin die regulatorische Sequenz auch eine Operator-Sequenz, eine Transkriptions- Start-Sequenz und eine ribosomale Bindungsstellen-Sequenz einschließt.

5. Replizierbares mikrobielles Expressionsvehikel, welches imstande ist, ein eukaryotisches Protein zu exprimieren, worin das eukaryotische Protein mindestens einen Cystinrest aufweist und eine DNA-Sequenz nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche besitzt.

6. Streptomyces-Wirt, der ein replizierbares mikrobielles Expressionsvehikel nach Anspruch 5 beherbergt.

7. Streptomyces-Wirt nach Anspruch 6, der ein Disulfidaustausch-Enzym oder eine einem Disulfidaustausch-Enzym ähnliche Aktivität aufweist.

8. Verfahren zur Herstellung eines aktiven eukaryotischen Proteins, das mindestens einen Cystinrest aufweist, welches Verfahren die Züchtung des Streptomyces-Wirts nach Anspruch 6 umfaßt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin das aktive eukaryotische Protein biologische, hormonelle, immunologische oder enzymatische Aktivität aufweist.