DE68915204T2

DE68915204T2 - Biosynthetisches Verfahren zur Herstellung von chemischen Verbindungen.

Info

Publication number: DE68915204T2
Application number: DE68915204T
Authority: DE
Inventors: Hermann Dr Allgaier; Karl-Dieter Prof Dr Entain; Friedrich Prof Dr Goetz; Guenther Prof Dr Jung; Cortina Kaletta; Roland Kellner; Norbert Schnell; Rolf G Dr Werner
Original assignee: Dr Karl Thomae GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co KG
Priority date: 1988-05-18
Filing date: 1989-05-18
Publication date: 1994-10-27
Anticipated expiration: 2009-05-19
Also published as: JP3350533B2; ATE105584T1; JPH02107191A; JP3267965B2; GB8811761D0; JP2002176978A; EP0342658A1; ES2055759T3; EP0342658B1; DE68915204D1

Description

Diese Erfindung beschäftigt sich mit der Biosynthese chemischer Verbindungen und insbesondere mit der Biosynthese chemischer Verbindungen, die Dehydroaminosäurereste und/oder Thioetherbrücken enthalten. Manche Polypeptid-Antibiotika, wie Nisin, Subtilin, Duramycin, Cinnamycin, Ancovenin, Ro 09-0198 und Epidermin, enthalten Dehydroaminosäuren und Lanthioninbrücken.
Diese Polypeptide werden jeweils durch verschiedene Mikroorganismenstämme produziert. Beispielsweise können Nisin durch Züchtung von Stämmen von Streptococcus lactin und Subtilin durch Züchtung von Bacillus subtilis produziert werden.
Die US-PS 4'716'115 beschreibt die Produktion von Nisin in Streptokokken-Stämmen durch Übertragung von Plasmiden aus anderen Nisin-produzierenden Streptokokken-Stämmen in Aufnahmestämme.
Die genetische Basis für die Biosynthese dieser Antibiotika konnte bisher noch nicht geklärt werden. Daher war es beispielsweise bisher nicht bekannt, ob die Biosynthese solcher Antibiotika und insbesondere die Bildung der darin gefundenen unüblichen Aminosäuren über eine ribosomale Synthese oder über Multi-Enzym-Komplexe erfolgt.
Außerdem war es nicht bekannt, ob die Precursor-Proteine solcher Antibiotika von eigenen Strukturgenen codiert werden oder ob sie Abbauprodukte größerer Proteine darstellen.
Im Laufe von Arbeiten, die zur Erstellung des Strukturgens von Epidermin durchgeführt worden waren, waren wir imstande festzustellen, daß die oben erwähnten Antibiotika, insbesondere das Epidermin, überraschenderweise jeweils von einem eigenen Strukturgen codiert werden und daß das Processing eines Pre-Sequenz-Polypeptids von einem enzymatischen Komplex durchgeführt wird, der die Bildung von Dehydroaminoresten und/oder Thioetherbrücken bewirkt.
Weiters kann der Multi-Enzym-Komplex an der Ausscheidung des Proteins durch die Zellmembran in den Kulturüberstand ebenso wie am Processing eines Pre-Polypeptids beteiligt sein. In diesem Zusammenhang sei erwähnt, daß eine derartige Aktivität mit einer Pre-Sequenz, die dem Pre-Polypeptid angehörig ist, verbunden sein kann, wie z.B. im Fall der -30 bis -1 Sequenz von Pre-Epidermin, wie im folgenden beschrieben wird.
Allgemein gesagt, stellt die vorliegende Erfindung in einem Aspekt einen ein Plasmid enthaltenden bakteriellen Wirt zur Verfügung, wobei dieses Plasmid für ein Polypeptid codiert, das normalerweise von diesem Wirt nicht produziert wird, dieser Wirt während der Züchtung einen Multi-Enzym-Komplex bildet und ein Polypeptid produziert wird, das zumindest eine Dehydroaminosäure und/oder zumindest eine Lanthioninbrücke enthält und für den genannten Wirt fremd ist.
Ein geeigneter Multi-Enzym-Komplex ist einer, der dazu befähigt ist, zumindest eine der folgenden Operationen, nämlich Wassereliminierung und Sulfidbrückenbildung, zu bewirken; der Komplex kann auch eine Decarboxylierung und und die Bildung von Doppelbindungen bewirken.
Geeignete Wirte zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind solche, die ohne Veränderung ihres genetischen Materials imstande sind, Polypeptide zu produzieren, die einen Dehydroaminosäurerest und/oder eine Lanthioninbrücke und/oder eine Methyllanthioninbrücke enthalten. Beispiele solcher Wirte sind Streptococcus lactis, Bacillus subtilis, Streptomyces cinnamoneus, Streptomyces sp. Streptoverticullum ariseoverticillum, Staphylococcus epidermis, der Staphylococgriseoverticillum, Staphylococcus epidermis, der Staphylococcus epidermin Stamm 5 und Staphylococcus gallinarum.
Besonders interessante Stämme sind Staphylococcus gallinarum (F16/P57) Tü 3928, der bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter den Bestimmungen des Budapester Vertrages am 18. Mai 1988 hinterlegt wurde und die Hinterlegungsnummer DSM 4616 erhalten hat, sowie Straphylococcus epidermis DSM 3095, der von den Anmeldern der vorliegenden Anmeldung bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter den Bestimmungen des Budapester Vertrags am 26. Oktober?1984 hinterlegt wurde, sowie mutante Stämme derselben, z.B. ein mutanter Stamm von S.Epidermis DSM 3095, der nicht zur Produktion von Epidermin befähigt ist.
Zur Transformation eines geeigneten Wirts kann ein geeignetes Plasmid durch bekannte Verfahren der Gentechnik modifiziert werden.
Günstig ist es, ein Plasmid aus einem Wirt, der ein zumindest einen Dehydroaminosäurerest und/oder zumindest eine Sulfidbrücke enthaltendes Polypeptid produziert, derart zu behandeln, daß das für ein Pre-Polypeptid codierende Gen modifiziert oder ersetzt wird, um ein Plasmid zu erhalten, das für ein Polypeptid codiert, welches für den genannten Wirt fremd ist, worauf dieser Wirt mit dem veränderten Plasmid transformiert wird.
Aus einer Vielzahl von Methoden kann jedes Verfahren zur Ersetzung oder Modifizierung eines für das Pre-Polypeptid codierenden Gens verwendet werden.
Die DNA, die für die Pre-Polypeptid-Sequenz der gewünschten Verbindung codiert, kann durch chemische Synthese hergestellt werden. Geeignete chemische Syntheseverfahren wurden beschrieben in [Anal. Biochem. 121, 365 (1982)]. Die bekannten Verfahren erlauben die Herstellung von Polynucleotiden von bis zu 60 und beispielsweise bis zu 100 Basen.
Geeignet geschützte Nucleotide können durch die Phosphodiester-Methode von Agarwal et al., [Angew. Chem. 84, 489 (1972)], die Phosphotriester-Methode von Reesem [Tetrahedron 39, 3, (1983)], die Phosphittriester-Methode von Letsinger et al., [J. Am. Chem. Soc. 98, 3655 (1976)] oder die Phosphoramidit-Methode miteinander verknüpft werden. Das Festphasenverfahren erlaubt eine Vereinfachung der Synthese der Polynucleotide.
Die doppelstrangige DNA kann enzymatisch aus chemisch hergestellten kurzen, jedoch überlappenden Segmenten aufgebaut werden.
Beispielsweise können die überlappenden Polynucleotidsequenzen von beiden DNA-Strängen verwendet werden, die durch Basenpaarung in der korrekten Konfiguration aneinander gehalten und dann durch das Enzym DNA-Ligase chemisch aneinander gebunden werden [Khorana et al., J. Biol. Chem. 251, 565 (1976)].
Eine andere Möglichkeit umfaßt in jedem Fall die Inkubation einer Polynucleotidsequenz aus den beiden DNA-Strängen mit einem kurzen überlappenden Segment in Gegenwart der 4 erforderlichen Deoxynucleosid-Triphosphate mit einer DNA-Polymerase, beispielsweise der DNA-Polymerase I, dem Klenow-Fragment von Polymerase I oder T4 DNA-Polymerase, oder mit reverser Transkriptase. Die beiden Polynucleotidsequenzen werden dabei durch Basenpaarung in der korrekten Anordnung aneinander gehalten und werden durch das Enzym mit den erforderlichen Nucleotiden ergänzt, um eine komplette doppelstrangige DNA zu ergeben [Narany et al., Anal. Biochem. 121, 365 (1982)].
Ein anderes geeignetes Verfahren zur Gewinnung einer für ein Polypeptid codierenden DNA umfaßt die Isolierung dieser DNA aus der genomischen DNA eines Gewebes oder einer Zellkultur von Mikroorganismen, die Lyse der Zellen, z.B. mit SDS oder Proteinase K, oder gewünschtenfalls auf mechanische Weise, und die Deproteinisierung der DNA durch wiederholte Extraktion mit Phenol.
Vorzugsweise kann die RNA mit RNase abgebaut werden. Die gewonnene rohe DNA wird teilweise mit geeigneten Restriktionsenzymen, z.B. HaeIII und AluI, abgebaut und es können Fragmente isoliert und in einem geeigneten Phagen oder einem Cosmid, z.B. in dem Phagen Charon 4A oder in EMBL-3, vervielfältigt werden, worauf im Hinblick auf die gewünschten Sequenzen, z.B. mit einer radioaktiv markierten DNA-Sonde, untersucht wird.
Die für ein gewünschtes Polypeptid codierende DNA kann auch durch reverse Transkription von isolierter mRNA in cDNA gewonnen werden. Das kann die bevorzugte Methode darstellen, wenn die DNA-Struktur unbekannt ist. Bei diesem Verfahren wird die DNA aus genomischer DNA in einer cDNA-Bibliothek über die mRNA gewonnen. Die cDNA-Bibliothek umfaßt die genetische Information, die der aus den Zellen isolierten mRNA komplementär ist.
Zur Gewinnung einer cDNA-Bibliothek wird die mRNA aus den Zellen isoliert, die das gewünschte (möglicherweise unmodfizierte) Grund-Protein exprimieren. Diese mRNA wird dann in doppelstrangige cDNA umgewandelt.
Für die Herstellung von mRNA werden Standardverfahren verwendet, die in der Fachwelt bekannt sind. Die Zellmembran wird aufgebrochen und der Zellinhalt, aus dem die mRNA isoliert wird, wird freigesetzt. Vorzugsweise wird die Zellmembran durch physikalische Verfahren oder durch Lyse mit Detergentien, wie SDS, Guanidin-Thiocyanat, durch bestimmte Salzbedingungen oder durch Homogenisierung, vorzugsweise durch Mixen, aufgebrochen. Die mRNA wird durch Standardverfahren der Phenolextraktion, Ethanolfällung, Zentrifugierung und Chromatographie, vorzugsweise in einer Kombination von mehreren Verfahren, isoliert. Das Zentrifugieren erfolgt vorzugsweise mit Gradienten, beispielsweise einem CsCl-Gradient. Zur Chromatographie werden vorzugsweise Säulen verwendet, insbesondere Oligo-dT-Säulen. Die gesamte mRNA kann direkt in ds-cDNA umgewandelt werden, wobei Methoden des Standes der Technik zum Einsatz kommen. Vorzugsweise wird die für ein gewünschtes Polypeptid codierende mRNA unter Anwendung mehrerer Verfahren, wie Elektrophorese, Chromatographie und Zentrifugieren, vorzugsweise durch Zentrifugieren mit einem Saccharose-Gradienten, angereichert.
Jene Fraktionen, die die für ein gewünschtes Polypeptid codierende mRNA enthalten, können durch verschiedene Verfahren festgestellt werden, wie in vivo oder in vitro Translationen, worauf anschließend eine Bestimmung einer relevanten Aktivität oder, wenn die Nucleotidsequenz bekannt ist, Hybridisierung mit einer Oligonucleotid-Sonde, erfolgt.
Systeme der in vivo Translation können prokaryotische oder eukaryotische Systeme sein. Ein bevorzugtes System der in vivo Translation ist das System von Xenopus laevis Oozyten [Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)]. In vitro Systeme sind beispielsweise Weizenkeime und Lysate von Kaninchen-Reticulozyten, die beide im Handel erhältlich sind. Aus einem Pool von mRNA, der aus unfraktionierter oder fraktionierter mRNA stammt, kann ds-cDNA auf an sich bekannte Art und Weise erhalten werden (bevorzugte allgemeine Verfahren sind beschrieben von [Maniatis et al. (l.c.), Okayam und Berg, Molecular and Cell Biology 2, 161-170 (1982) und Heidecker, Nucleic Acid Research 11, 4891-4906 (1983)].
Im allgemeinen wird die mRNA zuerst in ss-cDNA umgewandelt, wobei reverse Transkriptase oder DNA-Polymerase I (Klenow- Fragment) verwendet wird. Zur Primierung der Synthese von ds-cDNA werden alternativ zwei Verfahren angewendet. Das erste Verfahren ist die natürliche Schleifenbildung der ss-cDNA. Das zweite Verfahren ist das Tailing der ss-cDNA mit einem homopolymeren Tail, wie Poly-dC oder Poly-DT.
Die mRNA-Fraktion, in der das entsprechende Polypeptid die höchste Aktivität bei dem Analysesystem zeigt, wird durch an sich bekannte Verfahren in die komplementäre cDNA transkribiert. Es werden die mRNA und Oligo-dT als Primer miteinander gemischt, dann werden dNTPs als Ausgangsmaterial zugesetzt und die Synthese des cDNA-mRNA-Hybridmoleküls erfolgt durch das Enzym reverse Transkriptase. Die RNA-Moleküle werden durch Zusatz von NaOH abgebaut. DNA-Polymerase, vorzugsweise das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, wird zugesetzt und die Mischung bei einer geeigneten Temperatur, vorzugsweise 12-15ºC, inkubiert. Die Mischung wird mit Nuclease S1 inkubiert und es wird die ds-cDNA gewonnen, die der für ein gewünschtes Poiypeptid codierenden mRNA entspricht.
Zur Amplifizierung kann die gewonnene ds-cDNA in einen geeigneten Vektor, z.B. das Plasmid pUC-KO, gespleißt werden und der gewonnene Hybridvektor kann durch Einsatz eines geeigneten Wirts, z.B. E.coli HB101, vervielfältigt werden. Neuerliche Isolierung des Hybridvektors und Gewinnung der isolierten cDNA daraus gestatten die Feststellung der Struktur der für ein gewünschtes Polypeptid codierenden DNA.

Herstellung eines Hybridvektors

Erfindungsgemäß kann ein Hybridvektor durch Spleißen einer für ein Polypeptid der gewünschten Sequenz codierenden DNA in einen geeigneten Vektor hergestellt werden.
Geeignete Vektoren sind Träger einer integrierten Passagier-DNA, die zur Transformation eines Mikroorganismenwirtes verwendet werden kann.
Als Vektoren geeignet sind Plasmide, die aus Mikroorganismen stammen, die in untransformiertem Zustand Polypeptide produzieren, die Dehydroamino- und/oder Sulfidgruppen enthalten. Geeignete Vektoren tragen die Insert-DNA an einer definierten Stelle.
Im allgemeinen können solche Vektoren ein Replicon und eine Steuerungsequenz, d.h. einen Promotor, enthalten, die aus der Wirtszelle oder aus einer Spezies stammen, die mit der Wirtszelle, in welcher sie verwendet werden, kompatibel ist. In der Regel trägt der Vektor eine Replicon-Stelle und kann Sequenzen (Marker-Gene) enthalten, die imstande sind, Phänotyp-Selektion in den transformierten Zellen zu ermöglichen. Geeignete Marker-Gene können antibiotische Resistenz oder Resistenz gegenüber Schwermetallen liefern oder sie können einen genetischen Defekt des Wirts komplementieren. Weitere brauchbare Sequenzen in derartigen Vektoren sind Verstärker- und Aktivator-Sequenzen.
Ein geeigneter Ausgangsvektor ist ein 54 Kbp Plasmid pEpi32 aus dem Stamm Staphylococcus Epidermis DSM 3095. Dieses Plasmid, das im folgenden charakterisiert wird, enthält das epiA-Gen, das für ein 52-Prepeptid codiert, das zu einem tetrazyklischen 21-Peptidamid-Antibiotikum prozessiert wird.
Ein Vektor, der eine Passagier-DNA trägt, wird als Hybridvektor bezeichnet. Die gewünschte DNA wird durch übliche Verfahren in den Ausgangsvektor gespleißt.
Beispielsweise kann ein Ausgangsvektor zuerst durch ein geeignetes Restriktionsenzym linearisiert werden, z. B. das Plasmid pEpi32 durch HindIII, BamHI und EcoRI, und kann dann in Gegenwart von dGTP und der terminalen Deoxynucleotidyl-Transferase d/G-getailt werden. Das doppelstrangige cDNA-Insert wird in Gegenwart von dCTP und terminaler Deoxynucleotidyl-Transferase dc-getailt. Die Verbindung von cDNA und Vektor führt zu dem Hybridvektor. Zur Konstruktion genomischer Bibliotheken werden bevorzugt Bakteriophagen, wie Lamda, verwendet. Die Klonierungssysteme von Lamda werden von Maniatis (l.c.) beschrieben. Die geeignete Vektor-DNA wird mit dem entsprechenden Restriktionsenzym vollständig abgebaut und die linken und rechten Arme werden durch Zentrifugieren mit Geschwindigkeitsgradienten oder durch Gel-Elektrophorese von den Mittelfragmenten getrennt. Ein anderes Verfahren besteht im Abbau von Teilen der Füllfragmente mit Restriktionsenzymen, denen die Erkennungsstellen in den rechten und den linken Armen fehlen. Die isolierte genomische DNA kann teilweise zu Fragmenten einer Länge von 13 bis 20 kb abgebaut werden. Anschließend werden die Arme mit den Fragmenten der Fremd-DNA, die Termini aufweist, die mit jenen der Arme kompatibel sind, ligiert.
Das geeingete DNA-Insert wird aus dem Originalvektor, der für die ursprüngliche Klonierung verwendet wird, neuerlich in einen geeigneten Expressionsvektor geklont. Zu diesem Zweck werden geeignete Restriktionsenzyme, möglicherweise in Kombination mit Oxonucleonen, verwendet, um die gewünschten DNA-Fragmente zu bilden.
Das DNA-Insert kann in eine multiple Stelle eines geeigneten bekannten Plasmidvektors, z.B. Derivate von pC194, pT181 und pUB110, an den Restriktionsstellen HindIII/BamHI/EcoRI subgeklont werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann somit zur Herstellung von Derivaten bekannter Peptide und Hormone angewendet werden, wobei ein Cystein-Rest in dem unmodifizierten Peptid durch Aminosäuren mit Schwefelbrücken ersetzt ist, und Serin und Thiamin werden durch die entsprechenden Dehydroaminosäurereste ersetzt.
Durch direkte Verwendung der cohäsiven Enden oder durch Zusatz geeigneter chemisch synthetisierter Oligonucleotid-Brücken werden diese Fragmente in einen geeigneten Expressionsvektor integriert. Zur Modifizierung der Enden kann beispielsweise HindIII oder BglII verwendet werden. Das Verfahren ist nicht auf irgendwelche spezielle Restriktionsenzyme beschränkt. Es kann jede gewünschte Verbindung zwischen dem Expressionsvektor und dem DNA-Insert unter Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme in Kombination mit chemisch synthetisierten Oligonucleotiden hergestellt werden.
Es können auch geeignete DNA-Inserte gewonnen werden, die für Polypeptide mit stellungsgelenkter Mutagenese codieren. Es kann eine Vielzahl von Verfahren zur Hervorrufung von Mutationen der unterlegten DNA ebenso wie zur Herstellung der gewünschten Mutanten angewendet werden.
Ein Verfahren kann als ersten Schritt den folgenden umfassen: Einsetzen eines Fragments eines nativen Gens oder Grundgens, das Sequenzen für die Codierung der zu mutierenden Region enthält, in die replikative Form eines Phagen, z.B. Phage MI3mp8, zur Bildung von MI3mp8PA. Anschließend wird ein synthetisches Oligonucleotid, das komplementär zu den eingesetzten Sequenzen ist, jedoch ein oder mehrere Nucleotidtripletts enthält, die für die zu ersetzende Aminosäure codieren, an die einzelstrangige Form von MI3mp8A zur Bildung eines doppelstrangigen Bereichs reassoziiert. Diese Region dient als Primer für die DNA-Polymerase I-Synthese des verbleibenden komplementären Stranges. Nach der Replikation und Identifizierung kann die mutante Sequenz weiter modifiziert werden oder sie kann zur Konstruktion eines geeigneten Vektors für die Expression des mutierten Polypeptids eingesetzt werden.
Bei der an Epidermin durchgeführten Arbeit wurde eine Wobble-DNA-Sonde 5'-GTG(A)CAT(G/A)ATG(A)AAT(C)TT-3' von einem geeigneten Pentapeptid-Segment der vorgeschlagenen Pre-Sequenz von Epidermin, LysPheIleCylThr, hergestellt. Diese DNA-Sonde wurde gegen Plasmid-DNA von S. Epidermin DSM 3095 hybridisiert.
Die Restriktionsanalyse des isolierten Plasmids liefert sieben DNA-Fragmente mit EcoRI (16, 11, 10, 6,5, 5,5, 3,5 und 2,5 kbp), neun DNA-Fragmente mit HindIII (17, 14, 10, 5,3, 2,8, 1,8, 0,8, 0,6 und 0,5 kbp) und fünf DNA-Fragmente mit BamHI (20, 19, 10, 3 und 1 kbp).
Es wurde ein 5,4 kbp HindIII-Fragment subgeklont und einer Rehybridisierung unterworfen, wobei das Strukturgen epiA innerhalb eines 2.2 kbp EcoRI/BgIII-Fragmentes lokalisiert wurde.
Eine Mischung von 24 verschiedenen 14-Meren wurde als Hybridiserungssonde eingesetzt. Die Sonde wurde in Übereinstimmung mit den von Novick et al. [Ann. N.Y. Acad. Sci. 182, 279-294 (1971)], Southern [J. Molec. Biol. 98, 503-517 (1975)] und Heinrich et al. [Molecul. gen. Genet. 209, 563-569 (1987)] beschriebenen Verfahren in 30-fachem Überschuß als Sequenzierungsprimer verwendet. Die Peptidsequenz von Epidermin erlaubte die Identifizierung des offenen Leserahmens. Ein einziges Methionincodon liegt in geeignetem Abstand zu einer Shine-Dalgarno-Sequenz. In Fig. 1 ist die Nucleotidsequenz des Strukturgens von Epidermin (epi A) und die abgeleitete Aminosäuresequenz von Pre-Epidermin dargestellt. Die Shine- Dalgarno-Sequenz von 2 Basenpaaren in Form des ATG-Codons wird boxiert und die proteolytische Spaltungsstelle, an welcher das Pro-Peptid prozessiert wird, ist durch einen Pfeil angedeutet. Umgekehrte Wiederholungen sind unterstrichen und mögliche Stop-Codone sind angegeben (am amber (Bernstein); oc ochre (Ocker)).
Das Strukturgen von Pre-Epidermin endet an dem TAA-Stopcodon, somit besteht das Pre-Epidermin aus 52 Aminosäuren und wird zwischen Arg&supmin;¹ und Ile&spplus;¹ zu Epidermin prozessiert. Wie somit eindeutig ersichtlich, ist das Pre-Epidermin kein Abbauprodukt eines größeren Proteins, sondern wird von einem eigenen Strukturgen codiert.
Es ist somit ersichtlich, daß in unerwarteter Weise das Precursor-Protein der Antibiotika von jeweils eigenen Strukturgenen codiert wird.
Eine Kombination von Vorhersageprofilen für Sekundärstruktur (alpha, beta, Umkehrungen), Flexibilität, Hydropathie, Hydrophilität und Angabe der Schraubenwindung erfolgte unter Verwendung eines Hycon-Programms und ist in Fig. 2 dargestellt (oberes und unteres Bild). Fig. 2 (oberes Bild) ist eine Vorhersage für Pre-Epidermin, wobei die jeweiligen Balkendiagramme a) Flexibilität, b) Hydropathy, d) Neigung zur Umkehr, e) beta-Lage und f) alpha-Helix-Konfiguration zeigen.
Fig. 2 (unteres Bild) ist die Angabe der Schraubenwindung, die zeigt, daß der N-Terminus in einer geeigneten Umgebung zum Teil eine amphiphilische, alpha-helicale Konfiguration annehmen kann, was möglicherweise durch Wechselwirkung mit dem C-terminalen Pro-Epidermin-Teil erfolgt, der während der Sulfidringbildung stark lipophil wird. Die Modifikationsschritte finden an den Ser- und Thr-Resten in exponierten Umkehrstrukturen statt.
Eine hohe Wahrscheinlichkeit der alpha-Helix wird für Pre- Epidermin -30 bis -8 vorhergesagt, wogegen der C-terminale Teile 1-22, der dem Pre-Epidermin entspricht, eine sehr hohe Umkehrwahrscheinlichkeit aufweist. Außerdem zeigt die Aufzeichnung der Vorhersage eindeutig, daß der N-Terminus -30 bis -1 in hohem Ausmaß hydrophil ist, während der C-terminale Teil stärker lipophil ist. Der N-terminale Teil -30 bis -8 scheint sich zum Teil in eine amphiphilische alpha-Helix zu falten.
Das N-terminale Segment von Pre-Epidermin -30 bis -1 enthält keinerlei Cystein-Reste, wogegen das C-terminale Segment 1-22 die vier Cystein-Reste aufweist, die an der Sulfidbrückenbildung beteiligt sind. Die Sequenz -30 bis -1 enthielt viele Spaltungstellen für Endoproteasen, wogegen selbst im Pre-Epidermin-Zustand die Sequenz 1-22 gegen proteolytischen Abbau in hohem Maße widerstandsfähig ist.
Das reife Antibiotikum kann nur durch Trypsin bei Lys in Position 13 angegriffen werden. Die Processingsstelle Arg&supmin;¹ -Ile&spplus;¹ ist hydrophil und ist erreichbar wegen des umkehrbildenden Pro&supmin;²-Restes.
Die verschiedenen enzymatischen Reaktionen, die bei der Herstellung der Antibiotika, wie von Epidermin, stattfinden, umfassen Modifikationen des Pro-Polypeptid-Teils 1-22; Spaltung des N-terminalen Prepeptid-Fragmentes -30 bis -1 und Ausscheidung des reifen Antibiotikums.
Fig. 3 illustriert das postulierte Reifungsverfahren von Epidermin. Das translatierte Polypeptid (Pre-Epidermin) besteht aus 52 Aminosäureresten. Die Strukturvorhersagen deuten auf einen teilweise alpha-helicalen N-Terminus, von welchem die Reste -30 bis -10 eine amphiphilische alpha-helicale Konfiguration bilden können.
Eine Pro&supmin;²-Umkehr und ein daran anschließender Arginin-Rest entsprechen der Processingstelle (a). Wassereliminierung erfolgt an den Ser- und Thr-Resten. Mit der Ausnahme von Thr&spplus;¹&sup4; schließt an die Wassereliminierung (b) Sulfidringbildung an, (c) beschreibt die Decarboxylierungsreaktion und (d) die Doppelbindungsbildung am C-Terminus. Nach diesen Modifikationen wird das Pro-Epidermin als Bildung einer Zwischenverbindung vorgeschlagen, aus welcher das Lanthibiotikum prozessiert wird (Abu, Aminobuttersäure; Dhb, Dehydrobutyrin).
Fig. 4 zeigt das reife antibiotische Epidermin. Die verschiedenen Ringstrukturen sind mit A, B, C, D und E bezeichnet. Die Aminosäuren meso-Lanthionin und threo-Methyllanthionin, von denen angenommen werden kann, daß die verschiedenen Ringstrukturen daraus abgeleitet sind, sind dargestellt.
Die enzymatischen Veränderungen treten vor der Spaltung des Prepeptid-Fragmentes auf. Die enzymatische Veränderung umfaßt die Eliminierung von Wasser aus den Ser- und Thr-Resten in Position 5, 16, 19 bzw. 8, 14 zur Bildung der Dehydroalanin- und Dehydrobutyrin-Reste. Addition von Thiolgruppen aus Cys-Resten in Position 2, 11, 21 und 22 an die C= C-Doppelbindungen tritt ebenfalls auf und führt zu meso-Lanthionin- oder zu (2S, 3S, 6R)-3-Methyllanthionin-Brücken. Zusätzlich dazu führt eine Decarboxylierung von Rest 22 und eine Doppelbindungsbildung zu dem C-terminalen S-(2-Aminovinyl)-D-Cystein. Die Reaktion der C-terminal gelegenen Cystein- Thiolgruppen mit N-terminal angeordneten Dehydroaminosäuren findet in Epidermin, Nisin und Subtilin mit vollständiger Stereospezifität statt. Dementsprechend beinhalten diese Eliminierungs-Additions-Reaktionen während der Modifizierung eine Umkehr der Konfiguration der Calpha-Kohlenstoffatome in den Pre-Epidermin-Resten. L-Ser und L-Thr ergeben D-konfigurierte Calpha-Atome Andererseits wird die L-Konfiguration der Cystein-Hälften weiter aufrechterhalten.
Es werden auch die vier Sulfidringe im Anschluß an die gleiche katalytische Stelle gebildet, was durch die Wechselwirkung mit der N-terminalen amphiphilischen alpha-Helix unterstützt wird. Nur das Thr&spplus;¹&sup4; dehydratisiert, ohne ein Cystein zu finden. Diese Position (Lys&spplus;¹³-Dhb&spplus;¹&sup4;) stellt die enzymatische Spaltungsstelle dar, an welcher Trypsin das antibiotische Epidermin inaktiviert. Während der Sulfidringbildung steigen die C-terminale Steifheit und die Hydrophobität und diese können die Wechselwirkung von Pro-Epidermin mit der Lipid-Doppelschicht begünstigen und Translozierung veranlassen. Schließlich wird der hydrophile alpha-helicale N-Terminus -30 bis -1 durch eine spezifische Protease an der oben beschriebenen charakteristischen Spaltungsstelle gespalten.
Unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren können Plasmide, die für Lantibiotika codieren, modifiziert werden, indem entweder das für das entsprechende Polypeptid codierende Gen verändert oder durch ein Gen ersetzt wird, das für ein anderes Polypeptid codiert und zur Transformierung des ursprünglichen Wirts oder eines unterschiedlichen Wirts verwendet wird, wobei ein solcher Wirt auch in seiner nativen Form zur Expression eines Lantibiotikums befähigt ist.
Allgemein gesagt, kann, wenn das ursprüngliche funktionelle Gen für eine Pre-Sequenz codiert, wie oben am Beispiel des Falles von Epidermin besprochen wurde, die DNA-Sequenz, die für eine solche Pre-Sequenz codiert, in dem modifiziertem Plasmid beibehalten werden; in diesem Fall wird die DNA-Sequenz für das neue oder mutierte Pro-Polypeptid direkt stromaufwärts der Pre-Sequenz-DNA in ähnlicher Weise wie die ursprüngliche Pro-Polypeptid-Sequenz angeordnet sein.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Züchtung eines bakteriellen Wirts unter üblicherweise verwendeten Züchtungsbedingungen durchgeführt werden, wie sie beispielsweise in unserer schwebenden Europäischen Patentanmeldung Nr. 89 108 350.3 und in der Europäischen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungungs-Nr. 0 181 578 beschrieben sind. Die Reinigung und Isolierung des gewünschten Proteins kann auch unter Verwendung von Verfahren oder geeigneten Veränderungen derselben durchgeführt werden, wie sie in den oben genannten Patentanmeldungen für Epidermin und Gallidermin beschrieben wurden, wobei auch die Verwendung von Adsorbentien, Ionentauscherharzen und gewünschtenfalls HPLC vorgesehen ist.
Das erfindungßgemäße Verfahren kann zur Herstellung neuer Verbindungen für experimentelle Zwecke oder zur Herstellung von bekannten Verbindungen oder Derivaten bekannter Verbindungen in neuen Wirten eingesetzt werden. Beispielsweise kann ein Plasmid, das das für Epidermin codierende Gen enthält, zur Tranformation der Spezies Streptococcus lactis verwendet werden, um Epidermin aus diesem Wirt zu produzieren, oder es kann das für Gallidermin codierende Gen (vgl. unsere schwebende europäische Patentanmeldung, auf die oben Bezug genommen wurde) zum Ersatz des für das Pro-Polypeptid von Epidermin codierenden Gens, z.B. in dem Plasmid pEpi32, verwendet werden und kann zur Transformation von Staphylococcus epidermis DSM 3095 Verwendung finden, um aus diesem Wirt Gallidermin zu produzieren. In ähnlicher Weise können auch andere biologisch aktive Peptid-Derivate, die Dehydroaminosäurereste und/oder Lanthioninbrücken und/oder Methyllanthioninbrücken enthalten, produziert werden, wie etwa Derivate von Hormonen, wie humanes Insulin, Oxytosin, Vasopresin, Peptid-Antibiotika, Hormon-Inhibitoren, wie Elastase-Inhibitor, und fibrinolytisch aktive Substanzen, wie humaner Gewebeplasminogenaktivator. Solche Derivate, ebenso wie jene, die die biologische Aktivität der Stammverbindung beibehalten, können eine erhöhte Stabilität und verbesserte Halbwertszeiten aufweisen.
In idealer Weise sollte die cDNA, die für das gewünschte Pro-Polypeptid codiert, Codone für Cystein und Serin und/oder für Cystein und Threonin zur Bildung von Thioetherbrücken enthalten.
Für relativ kurzkettige Polypeptide sollten diese jeweiligen Codone normalerweise nicht länger als inklusive 8 und vorzugsweise nicht länger als inklusive 6 Codone voneinander entfernt sein, obwohl auch ins Auge gefaßt wird, daß in Abhängigkeit der sterischen Konfiguration des endgültigen Polypeptidmoleküls auch wesentlich größere Abstände möglich sein können.
Was die Bildung von Dehydroaminosäuren betrifft, so werden diese in der Regel von Serin und Threonin abgeleitet und dementsprechend wird die für das gewünschte Pro-Polypeptid codierende DNA Codone für derartige Aminosäuren enthalten.
Unter den unüblichen Aminosäuren, die in einem erfindungsgemäß hergestellten Polypeptid vorhanden sein können, sind Dehydroalanin, 2,3-Dehydro-2-aminobuttersäure, meso-Lanthionin, (2S, 3S, 6R)-3-Methyllanthionin, S-(2-(Z)-Aminovinyl)-D- cystein, Lysinalanin und β-Hydroxyasparaginsäure, wobei die Struktur dieser Reste in Fig. 5 dargestellt ist, in welcher verschiedene unübliche Aminosäuren erläutert sind, die in Lanthionin-Antibiotika gefunden werden und die in Peptidprodukten gemäß der Praxis der vorliegenden Erfindung gebildet werden können.

Beispiel 1

1. Überproduktion von Gallidermin

Ein den offenen Leserahmen von Gallidermin enthaltendes DNA-Fragment kann in Staphylococcus epidermidis DSM 3095, den Epidermin-produzierenden Stamm, geklont werden, wobei ein mittleres Kopie-Plasmid, wie pC194, pE194, pUB110, pT181 oder pMK148 Gallidermin verwendet wird. Eine Steigerung der Gendosis steht normalerweise im Zusammenhang mit einer Steigerung von Produktbildung; dieser Zusammenhang ist nicht notwendigerweise linear. Plasmidderivate mit hoher Kopienzahl von pC194 oder pT181 können ebenfalls als Klonierungsvehikel verwendet werden.

2. Austausch der Führungssequenz

Die Führungssequenz von Epidermin, die den Aminosäuren -1 bis -30 entspricht, ist an der Ausscheidung von Epidermin beteiligt. Die Sequenz kann zur Ausscheidung anderer Peptide in S. epidermidis, wie von Gallidermin, verwendet werden.
Die Führungssequenz-DNA kann durch Einsetzen jeweiliger Linker am Anfang und am Ende ihrer Sequenz transportierbar gemacht werden. Somit kann die Führungssequenz-DNA in großen Mengen aus dem Plasmid isoliert und an den jeweiligen Stellen anderer Peptide und Proteine eingesetzt werden. Es kann die Führungssequenz-DNA auch durch chemische Synthese hergestellt werden.

Beispiel 2

Herstellung von Gallidermin unter Verwendung von S. Epidermis als Wirt

1. Herstellung des Plasmids (vgl. Fig. 6)

a) Das Plasmid pCUI wurde durch Ligation von mit Pst1 abgebautem pCLP100 und mit Ndel abgebautem pUC18 unter Verwendung von Klenow nach der Beschreibung in der Doktorarbeit "Molekulargenetische Untersuchungen zur plasmidcodierten Arsenit- und Arsenatrestistenz bei Staphylococcen" von Ralf Rosenstein, die in der Bibliothek der Technischen Universität München 1988 zur Verfügung stand, hergestellt.
Das entstehende Plasmid wurde dann mit EcoRI abgebaut.
b) Chromosomale DNA wurde aus S. gallinarum (DMS 4616) isoliert und mit EcoRI abgebaut. Ein 4,7 kb-Fragment, das das Gallidermin-Strukturgen in einer 2,4 kb langen Sequenz zwischen den HindIII- und EcoRI-Restriktionsstellen enthielt, wurde unter Verwendung der Sequenz
5' CAC ATC CAG GAG TAC 3'
als Primer isoliert.
c) Das 4,7 kb-Fragment wurde dann in die EcoRI-Stelle des abgebauten pCUI-Plasmids aus Stufe a) ligiert, um ein Plas mid mit der Bezeichnung pCUgdml zu ergeben.

2. Herstellung eines S. Epidermis-Wirts

In diesem Beispiel wurde ein mutanter Stamm von S. epidermis DSM 3095 isoliert, der zur Produktion von Epidermin nicht befähigt war.
Die Mutagenese wurde an einem Stamm durchgeführt, der durch chromosomal codierte Rifampicin-Resistenz gekennzeichnet war (20 ug/ml).
S. epidermis DSM 3095, der auf Agar-Platten gezüchtet war, wurde zur Inokulierung von 30 ml Medium aus Basisbrühe verwendet, die über Nacht kultiviert wurden. 0,5 ml des über Nacht gezüchteten Produktes wurden dann verwendet, um 50 ml Produktionsmedium zu inokulieren, die dann während 3 Stunden bei 37ºC einer Schüttelkultur unterworfen wurden.
Die Zellen wurden aus dem Kulturmedium entfernt und neuerlich in 4,5?ml vorgewärmtem TM-Puffer (30 mM Tris-Maleat pH 6,5) suspendiert (die entstehende Lösung wird als Lösung A bezeichnet).
Die Lösung A wurde auf spontane Mutationen untersucht und einer Zellzählung unterworfen (1,25 x 10¹&sup0; Zellen/ml).
4 ml der Lösung A wurden sorgfältig mit 1 ml Ethylmethylsulfonat (Endkonzentration 47 g/ml) geschüttelt und dann eine Stunde lang bei 37ºC unter Schütteln gehalten.
Die Zellen wurden dann aus der Kulturbrühe extrahiert, zweimal in TM-Puffer gewaschen und neuerlich in 5 ml TM-Puffer suspendiert (die entstehende Lösung wurde als Lösung?B bezeichnet und enthielt mutierte Zellen). Es zeigte sich, dass die Lösung B 2 x10&sup8; Zellen pro ml enthielt, was einer Überlebensrate von 1,6% entspricht.
50 ml der Lösung B wurden zu 5 ml Produktionsmedium zugesetzt und über Nacht bei 37ºC (phänotypische Expression) gezüchtet. Die entstehende Lösung wurde als Lösung C bezeichnet. Eine Zellzählung ergab 7,3 x 10&sup8; Zellen/ml.
Die Lösung wurde auf BM-Agar-Platten aufgetragen, worauf die Einzelkolonien wurden entnommen. Diese wurden zur Inokulierung von Testplatten verwendet (bestehend aus BM-Agar, welchem Micrococcus luteus auf der Oberfläche überlagert war). Jene Kolonien, die keinen inhibierenden Effekt auf M. luteus zeigten, wurden als Nichtproduzenten von Epidermin selektiert.
BM-Agar enthält pro Liter
10 g Pepton Nr. 140
5 g Hefeextrakt
1 mg Glucose
5 mg NaCl
1 mg K&sub2;HPO&sub4;
pH 7,5
Es wurde eine Mutationsrate von etwa 3% festgestellt.
Die gefundenen 45 Nichtproduzenten wurden 20-mal subgeklont, um 16 stabile Nichtproduzenten zu ergeben. Es zeigte sich, daß alle stabilen Nichtproduzenten das Wildtyp-Plasmid pEpi32 enthielten. Aus dem Restriktionsmuster wird dieses als identisch mit dem Plasmid im Wildtyp-Stamm identifiziert.

Tranformation von nichtproduzierendem S. epidermis

750 ml BM-Medium wurden mit 5 ml des Mediums inokuliert, das bei Züchtung über Nacht von einem stabilen nichtproduzierenden Stamm gewonnen wurde; das inokulierte Medium wurde in einem 2 Liter-Kolben bei 37ºC mit einer Schüttelgeschwindigkeit von 120 Upm einer Schüttelkultur unterworfen.
Die anfängliche optische Dichte des inokulierten BM-Mediums betrug 0,03 bis 0,04. Sobald die optische Dichte einen Wert von 0,45 bis 0,55 erreicht hatte, wurden die Zellen durch Zentrifugieren in einem GS.-3-Rotor bei 8500 Upm während 15 Minuten bei 4ºC abgetrennt. Die isolierten Zellen wurden dann nacheinander in 750, 350, 40 und 10 ml 10%-igem Glycerin gewaschen, in 2 bis 3 ml 10%-igem Glycerin suspendiert und in Portionen von 110 Liter in ERGs bei -70ºC eingefroren. Die Zellzählung ergab 1 bis 5 x 10¹&sup0;/ml.
Die gefrorenen Zellen wurden während 5 Minuten bei Raumtemperatur aufgetaut; anschließend wurden 50 Liter der Zellsuspension in einein ERG mit 2 Liter Plasmid pCUgdml in TE-Puffer während 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Dann wurde die Mischung in eine Elektroporations-Küvette mit einem Elektrodenspalt von 0,2 cm übertragen und unmittelbar anschließend elektroporiert. Daraufhin wurden die Zellen rasch in 950 Liter SMMP5-Medium resuspendiert, in einen 2,5 ml ERG übertragen und während 90 Minuten bei 37ºC geschüttelt, wobei die ERGs um 45º geneigt wurden, um eine gute Belüftung des Mediums zu gewährleisten.
SMMP50-Medium enthält pro 100 ml 55 ml 2SMM, 40 ml 4 PAB und 5 Mol 5%-ige BSA. Das 2SMM ehthält 1 Mol Saccharose, 0,04 Mol Maleinsäure, 0,04Mol MgCl&sub2; und NaOH bis zu einem pH-Wert von 6,5. 4 PAB ist eine Lösung von 7 g pro 100 ml antibiotisches Medium Gibco 3.
Die Zellsuspension wird verdünnt und auf einem Gallidermin enthaltenden BM-Agar ausgebreitet, wo sie während 20 Stunden bei 37ºC inkubiert wird.
Die Untersuchung der wachsenden Stämme, die Gallidermin produzieren, wurde durch Selektion von Kolonien auf einer Testplatte mit M. luteus und durch Züchtung der jeweiligen selektierten Kolonien sowie Bestimmung der Anwesenheit von Gallidermin durch HPLC vorgenommen.
Es konnten drei mit pCUgdml transformierte Mutanten festgestellt werden, die zur Produktion von Gallidermin befähigt waren.
Bestimmung der Anwesenheit von Gallidermin, produziert von S. epidermin, der mit pCUgdml transformiert worden war.

a) Bio-Assay

FP-Agar wurde mit M. luteus ATCC 9341 inokuliert und während 18 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Hälfte der produzierten Kultur wurde mittels einer Oese entnommen, in 100 ml FP-Medium suspendiert und anschließend 8 Stunden bei 36ºC gezüchtet. Die Züchtung wurde bei der optischen Dichte von 1,0 abgebrochen. FP-Agar wurde mit 0,5% dieser Suspension inokuliert, wobei jeweils 10 ml in eine Petri-Schale gegossen und einer Lagerung während 3 Wochen bei 4ºC unterworfen wurden.
Der Plattendiffusionstest wurde nach der Beschreibung von Zähner und Maas, "Biology of Antibiotics" Springer Verlag, Berlin 1972, durchgeführt. 10 ul des Kulturfiltrats aus der Züchtung des transformierten S. epidermin wurden auf Filterpapier aufgetragen und getrocknet. Das Papier wurde auf die Testplatte aufgebracht, die anschließend während 24 Stunden bei 37ºC inkubiert wurde.

b) HPLC

Der ausgewählte transformierte Stamm wurde während 26 Stunden in dem Produktionsmedium gezüchtet. Die Kulturbrühe wurde 10 Minuten lang bei 13'000 Upm zentrifugiert.
Die isolierte Kulturflüssigkeit wurde dann einer HPLC in einem Flüssigchromatographen SP 8.700 (Spectra Physics, Darmstadt, BRD) unter Verwendung von A) H&sub2;O mit 0,5% 70%- iger Perchlorsäure und B) Acetonitril als mobiler Phase unterworfen. Die Säulenpackungen waren Nucleosil -100 C-18 mit einer Korngröße von 7 um, wobei die Säulengrößen 125 mm x 4,6 mm i.D. und 20 mm x 4,6 mm i.D. für die Vorsäule betrugen.
Die Gradienten waren die folgenden: Zeit [Minuten] Fortsetzung der Tabelle Zeit [Minuten]
Das entstehende Chromatogramm ist in Fig. 7A dargestellt.
Eine Standardkurve ist in Fig. 7B gezeigt und gibt an, daß Gallidermin nach 7,54 Minuten eluiert.
Die folgenden Medien wurden als Kulturmedium verwendet:

1. FP-Agar

Fleischextrakt 4 g
Pepton 10 g
NaCl 3 g
Na&sub2;PO&sub4; 5 g
Glucose 10 g
komplexer Agar 15 g
Wasser 1 Liter
pH 6,5

2. FP-Medium

Fleischextrakt 4 g
Pepton 10 g
NaCl 3 g
Na&sub2;PO&sub4; 5 g
Glucose 10 g
Wasser 1 Liter
pH 7,2

3. Produktionsmedium

Fleischextrakt 33 g
Malzextrakt 30 g
NaCl 40 g
Calciumhydroxid 3,8 g
Wasser 1 Liter
pH 6,5

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Plasmids, bei welchem Verfahren zusammenligiert werden: i) ein erstes DNA- Molekül, das eine Sequenz enthält, die für einen Multi- Enzym-Komplex codiert, der Wassereliminierung und Sulfidbrückenbildung sowie gegebenenfalls Decarboxylierung und Doppelbindungsbildung eines Precursor-Polypeptids bewirken kann, und ii) ein zweites DNA-Molekül, das ein Gen enthält, das für ein genanntes Precursor-Polypeptid codiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem das erste DNA- Molekül ein Plasmid umfaßt, aus welchem ein für ein Precursor-Polypeptid codierendes Gen heraus geschnitten wurde, und das in dem zweiten DNA-Molekül enthaltene Gen für ein Precursor-Polypeptid codiert, das sich von jenem unterscheidet, für das das aus dem Plasmid herausgeschnittene Gen codiert.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei welchem das erste DNA-Molekül von dem Plasmid pEpi32 (DSM 3095) stammt und das zweite DNA-Molekül ein Gen umfaßt, das für ein von Epidermin unterschiedliches Antibiotikum oder ein Hormon oder ein fibrinolytisches Agens codiert.

4. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, bei welchem das resultierende Plasmid eine Nucleotidsequenz enthält, die für die Pre-Peptid-Sequenz -30 bis -1 von Pre-Epidermin und für eine Pro-Peptid-Sequenz, die sich von Epidermin unterscheidet, codiert.

5. Verfahren nach Anspruch 5, bei welchem die Pro-Peptid- Sequenz für Gallidermin codiert.

6. Verfahren nach Anspruch 4, bei welchem die zweite DNA- Sequenz ein für Gallidermin codierendes Gen enthält.

7. Rekombinantes DNA-Molekül, umfassend ein Plasmid, das enthält: i) eine erste DNA-Sequenz, die für einen Multi- Enzym-Komplex codiert, der Wassereliminierung und Sulfidbrückenbildung sowie gegebenenfalls Decarboxylierung und Doppelbindungsbildung eines Precursor-Polypeptids bewirken kann, und die in einem Plasmid in dessen natürlichem Wirt zur Expression dieses Multi-Enzym-Komplexes befähigt ist, sowie ii) eine zweite DNA-Sequenz, die ein für ein Precursor-Polypeptid codierendes Gen enthält; wobei die zweite DNA-Sequenz für das Plasmid fremd ist.

8. Rekombinantes DNA-Molekül, in welchem das in der zweiten DNA-Sequenz enthaltene Gen für ein Antibiotikum, ein Hormon oder ein fibrinolytisches Agens codiert.

9. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 7 oder 8, in welchem die erste DNA-Sequenz von dem Plasmid pEpi32 (DSM 3095) stammt und das zweite DNA-Molekül ein Gen enthält, das für ein anderes Antibiotikum als Epidermin, für ein Hormon oder ein fibrinolytisches Agens codiert.

10. Rekombinantes DNA-Molekül nach irgendeinem der Ansprüche 7 bis 9, das eine Nucleotidsequenz enthält, die für die Pre-Petid-Sequenz -30 bis -1 von Pre-Epidermin und für eine Pro-Peptid-Sequenz, die sich von Epidermin unterscheidet, codiert.

11. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 10, in welchem die Pro-Peptid-Sequenz für Gallidermin codiert.

12. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 9, in welchem die zweite DNA-Sequenz ein Gen enthält, das für Gallidermin codiert.

13. Bakterieller Wirt, der ein Plasmid enthält, welches für ein Polypeptid codiert, das normalerweise von diesem Wirt nicht produziert wird, wobei dieser Wirt während der Züchtung einen Multi-Enzym-Komplex bildet, der zur Wassereliminierung und Sulfidbrückenbildung sowie gegebenenfalls zur Decarboxylierung und Doppelbindungsbildung befähigt ist, wobei weiters ein Peptid produziert wird, das zumindest eine Dehydroaminosäure und/oder zumindest eine Lanthioninbrücke enthält, und das produzierte Polypeptid für den genannten Wirt fremd ist; wobei jedoch ein bakterieller Wirt ausgeschlossen ist, der ein Bakterium der Gattung Streptococcus ist, das ein für Nisin-Produktion codierendes Plasmid enthält.

14. Bakterieller Wirt nach Anspruch 13, der Streptococcus lactis, Bacillus subtilis, Streptomyces cinnamoneus, Streptomyces sp. Streptoverticullum griseoverticillum, Staphylococcus epidermis, Staphylococcus epidermin Stamm 5 oder Staphylococcus gallinarum ist.

15. Bakterieller Wirt nach Anspruch 1 oder 2, in welchem das Plasmid für ein Antibiotikum, ein Hormon oder ein fibrinolytisches Agens codiert.

16. Bakterieller Wirt nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, in welchem der Wirt Staphylococcus epidermis DSM 3095 oder eine funktionell äquivalente Mutante davon ist und das Plasmid ein für Gallidermin codierendes Gen enthält.

17. Bakterieller Wirt, der ein Plasmid nach der Definition von irgendeinem der Ansprüche 7 bis 12 enthält.

18. Verfahren, umfassend die Züchtung eines bakteriellen Wirts nach irgendeinem der Ansprüche 13 bis 17 und die Isolierung eines entstehenden Peptidprodukts, das zumindest einen Dehydroaminosäurerest und/oder eine Lanthioninbrücke enthält.