DE69434807T2

DE69434807T2 - Methode und system zur erhöhten produktion von kommerziell wichtigen exoproteinen in gram-positiven bakterien

Info

Publication number: DE69434807T2
Application number: DE69434807T
Authority: DE
Inventors: Vesa Kontinen; Matti Sarvas
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1993-02-26
Filing date: 1994-02-25
Publication date: 2007-03-29
Anticipated expiration: 2014-02-26
Also published as: DK0686195T3; US5780261A; JPH08507207A; WO1994019471A1; JP4202985B2; DE69434807D1; JP2004350691A; ATE335083T1; CN1080307C; EP0686195A1; CN1120853A; EP0686195B1; AU6142694A

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren und Expressionssystem für die verstärkte Herstellung von industriell und medizinisch wichtigen Exoproteinen in gram-positiven Bakterien, besonders Arten der Gattung Bacillus.
Hintergrund
In gram-positiven Bakterien sekretierte Proteine werden durch eine Zellmembran und eine Zellwand exportiert und werden nachfolgend in das Außenmedium freigesetzt. Demgegenüber sind gram-negative Bakterien von zwei Zell- (oder Oberflächen-) -membranen umgeben; sie besitzen keine Zellwand. Bei gram-negativen Bakterien werden die meisten exportierten Proteine nicht aus der Zelle freigesetzt, sondern bleiben in dem periplasmatischen Raum zwischen den Membranen und in der äußeren Membran.
Es sind zwei Typen von Komponenten der Sekretionsmaschinerie in E. coli identifiziert worden: lösliche cytoplasmatische Proteine und Membran-assoziierte Proteine (siehe für einen Überblick Wickner et al., (1991) Annu. Rev. Biochem., 60: 101-124). Lösliche cytoplasmatische Proteine, einschließlich SecB und Hitzeschockproteine, verhindern alle die Faltung der Vorläufer von sekretierten Proteinen in eine Konformation, die mit einer Sekretion nicht kompatibel ist. Der Satz von Membran-assoziierten Proteinen schließt das periphere Membranprotein SecA, die integralen Membranproteine SecY, SecE, SecD, SecF und die Signalpeptidasen Lep und Lsp ein (Überblick in Hayashi, S. und Wu, H. C. (1990) J. Bioenerg. Biomembr., 22: 451-471; Dalbey, R. E. (1991) Mol. Microbiol., 5: 2855-2860). Diese Membran-assoziierten Proteine sind in die Bindung des Vorläufers und in seine Translokation durch die cytoplasmatische Membran, gefolgt von der Spaltung des Signalpeptids und der Freisetzung des Proteins, involviert.
Das Wissen über die Sekretionsmaschinerie von gram-positiven Bakterien ist begrenzter. Die verfügbaren Daten über B. subtilis, dem genetisch und physiologisch gut charakterisierten Modellorganismus der Gattung, legen eine insgesamte Ähnlichkeit mit der von E. coli nahe, jedoch ebenfalls Unterschiede in der Struktur und Spezifität von einzelnen Komponenten, welche möglicherweise die Anforderungen reflektieren, welche durch die sehr unterschiedliche Zusammensetzung und Architektur der jeweiligen Zellumhüllungen gestellt werden.
Gram-positive Bakterien, wie B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, weisen eine sehr hohe Kapazität für die Sekretion von Proteinen auf, und in der Tat werden zahlreiche bakterielle („bacillar") extrazelluläre Enzyme industriell genutzt. Da in grampositiven Bakterien sekretierte Proteine kommerziell so wichtig sind, und da die gram-positiv sekretierten Proteine eine Zellumhüllung mit einer Struktur durchqueren, die sehr unterschiedlich zu der von E. coli ist, ist der molekulare Mechanismus der Proteinsekretion bei gram-positiven Bakterien von beträchtlicher akademischer und industrieller Wichtigkeit.
In Hinsicht hierauf haben wir kürzlich eine neue Komponente, das PrsA-Protein, der Sekretionsmaschinerie von B. subtilis entdeckt (Kontinen, V. P. und Sarvas M., (1988) J. Gen. Microbiol. 134: 2333-2344; Kontinen, V. P. et al., (1991) Mol. Microbiol. 5:1273-1283). Das prsA-Gen, welches das PrsA-Protein kodiert, wurde am Anfang durch nicht-letale Mutationen definiert, welche die Sekretion von einigen Exoproteinen herabsetzten (Kontinen, V. P. und Sarvas M., (1988) J. Gen. Microbiol. 134: 2333-2344). Basierend auf der DNA-Sequenz des klonierten prsA-Gens und unserer nachfolgenden Arbeit mit diesem Gen und diesem Protein, stellen wir fest, dass prsA ein Protein (PrsA) kodiert, das als ein Chaperon wirkt und durch die cytoplasmatische Membran translokalisiert wird (für die anfängliche Arbeit siehe Kontinen, V. P., et al., (1991) Mol. Microbiol. 5: 1273-1283). Für das PrsA-Protein ist festgestellt worden, dass es einen limitierten Grad an Sequenzhomologie (ungefähr 30 %) mit dem PrtM-Protein von Lactococcus lactis aufweist, einem Protein, von dem angenommen wird, dass es die Reifung einer exportierten Serinprotease unterstützt (Haandrikman, A. J., et al., (1989) J. Bacteriol., 171: 2789-2794; Vos, P., et al., (1989) J. Bacteriol., 171: 2795-2802). Eine ähnliche Funktion ist nicht mit anderen bekannten Proteinen der Sekretionsmaschinerie von Bakterien in Verbindung gebracht worden, was nahelegt, dass das PrsA-Protein ein neuer Typ einer Komponente in dem Proteinsekretionsweg ist, welches die Feisetzung und vermutlich die Faltung von sekretierten Proteinen nach ihrer Tranlokation durch die cytoplasmatische Membran in gram-positiven Bakterien erleichtert.
Es ist vorteilhaft, interessierende Proteine in Bakterien in sekretierter Form herzustellen, da exportierte Proteine gewöhnlicherweise ihre native Konformation beibehalten, im Gegensatz zu einer intrazellulären Herstellung, welche in vielen Fällen in der Aggregation des hergestellten Proteins resultiert. Ein anderer Vorteil der Herstellung von industriell und medizinisch wichtigen Proteinen in Bakterien in sekretierter Form ist es, dass die Sekretion die Aufreinigung des Proteinprodukts erleichtert. Zusätzlich dazu enthalten gram-positive Bakterien, wie Bacillus sp., im Unterschied zu E. Coli, keine toxischen Verbindungen, wie Lipopolysacharid, was sie zu besonders geeigneten Wirten für die Herstellung von medizinischen und pharmazeutischen Proteinen macht.
Eine erhöhte Ausbeute an sekretierten Proteinen wäre von großer Bedeutung, um die grampositiven bakteriellen Stämme, die in der industriellen Herstellung einer Anzahl von Exoenzymen, wie alpha-Amylasen, Proteasen und Lipasen, verwendet werden, zu verbessern. Die bislang hierfür verwendete Strategie ist eine Überexpression des gewünschten Gens gewesen. Es sind bekannte und einfach verfügbare Verfahren vorhanden, um dies durchzuführen, wie ein Erhöhen der Genexpression durch Verwenden von Plasmiden mit mehrfacher Kopienzahl oder durch ein Verstärken der Aktivität des Gens durch Modifizieren seiner regulatorischen Elemente, z.B. durch Verwenden von starken Promotoren oder mehreren Promotoren. Auf diesem Weg sind dramatische Erhöhungen der Synthese von Exoproteinen erzielt worden, bis zu einem Level, bei dem die Erhöhung der Synthese nicht mehr von Vorteil ist, auf Grund von Engpässen in der Sekretionsmaschinerie. Es wäre wünschenswert, die Kapazität der Sekretion parallel zu einer erhöhten Synthese zu erhöhen. Bis heute ist dies jedoch nicht möglich gewesen.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, den Engpass des Sekretionsmechanismus in gram-positiven Bakterien zu verringern und ein Verfahren und ein System bereitzustellen, wodurch die Level von Proteinen, die normalerweise von gram-positiven Bakterien, wie Bacillus, sekretiert werden, verstärkt werden können, wenn die Expression eines gegebenen homologen oder heterologen interessierenden Proteins über die Menge, die normalerweise in nicht modifizierten oder Wildtyp-Organismen hergestellt wird, angehoben worden ist.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, bakterielle Wirte und Plasmide zu beschreiben, welche verwendet werden können, um die Herstellung einer Vielzahl von kommerziell wichtigen Exoproteinen zu verstärken.
Zusammenfassung
Die Erfindung stellt ein Verfahren und Bakterien zum Verstärken der Level von homologen oder heterologen Protein(en), die normalerweise von gram-positiven Bakterien (wie Bacillus sp.) sekretiert werden, wenn die Expression von homologen oder heterologen Protein(en) über nicht modifizierte oder Wildtyp-Mengen angehoben worden ist, die von nicht modifizierten oder Wildtyp-Organismen hergestellt werden, bereit.
Die Erfindung deckt ein gram-positives Bakterium ab, welches ein heterolges interessierendes Exoprotein sekretiert, und welches umfasst

(a) mehrere Kopien eines Gens, welches PrsA-Protein im Chromosom kodiert;
(b) ein Wildtyp-Gen, das PrsA-Protein im Chromosom kodiert und ein Gen, das PrsA-Protein auf einem Plasmid mit mehrfacher Kopienzahl kodiert; und/oder
(c) veränderte regulatorische Elemente, um die Expression eines Gens, das PrsA-Protein kodiert, zu erhöhen.

Die Erfindung deckt ebenfalls zahlreiche Ausführungsformen hiervon ab, die in der Beschreibung im Weiteren erwähnt werden. Die beanspruchte Erfindung deckt ebenfalls ein Verfahren zum Erzeugen eines solchen gram-positiven Bakteriums, das für die verstärkte Sekretion eines interessierenden Exoproteins verwendbar ist, ab, wobei das Verfahren das Verstärken der Expression des PrsA-Proteins umfasst, so dass das transformierte Bakterium größere Mengen an PrsA-Protein exprimiert, als das Bakterium sekretiert hat, bevor es transformiert worden ist, und größere Mengen eines interessierenden Exoproteins exprimiert, als das Bakterium sekretiert hat, bevor es transformiert worden ist. Das Verfahren umfasst geeigneterweise die Schritte; a) Identifizieren eines Gens von dem Wirtsmikroorganismus, der PrsA-Protein kodiert; b) Verstärken der Expression eines in Schritt a) identifizierten Gens, wobei das Bakterium (der Level an Bakterien) größere Mengen an PrsA-Protein und größere Mengen eines interessierenden Exoproteins exprimiert, als das nicht transformierte Bakterium. Diese Erfindung deckt ebenfalls die Verwendung von PrsA-Protein zum Verstärken der Sekretion eines Exoproteins durch Transformieren eines gram-positiven Bakteriums ab, wobei das transformierte Bakterium ein Bakterium gemäß der Erfindung ist, wie oben beschrieben.
Das Verfahren und die Bakterien unserer Erfindung umfassen die Überproduktion an PrsA-Protein in einem gram-positiven bakteriellen Wirt, der ebenfalls in der Lage ist, mindestens ein homologes oder heterologes interessierendes Exoprotein überzuproduzieren. Gemäß der Lehre der Erfindung bedeutet Überproduktion eine Menge, die größer ist als die des Wildtyps, d.h. größer ist als die Menge des Proteins (PrsA oder eines funktionellen Homologs hiervon oder eines interessierenden Exoproteins), die normalerweise von Wildtyp-Bakterien hergestellt wird. Ebenfalls gemäß der Erfindung wird eine Überproduktion durch Standardmittel, die im Stand der Technik bekannt sind, erreicht, z.B. durch die Verwendung von Plasmiden mit mehrfacher Kopienzahl, mehrere Kopien der Gene, die PrsA oder ein funktionelles Homolog hiervon, funktionelle Homologe hiervon und/oder das interessierende Exoprotein in dem Chromosom des Wirts kodieren, kombiniert mit einer Veränderung der regulatorischen Elemente, um die Expression zu erhöhen, z.B. Verwendung von einem starken Promoter, Verwendung von starken Promotoren, Verwendung von mehreren Promotoren, Verwendung von Enhancern usw. Die Verwendung der Verfahren und Bakterien der Erfindung resultiert in einer außerordentlich verstärkten Sekretion, z.B. soviel wie fünf- bis zehnfach gegenüber den Kontrollen, an synthetisierten Exoproteinen, in das Wachstumsmedium. Sobald diese sekretierten Exoproteine sich einmal in dem Wachstumsmedium befinden, können sie in direkter Weise gewonnen und aufgereinigt werden.
Die Bakterien der Erfindung umfassen gram-positive Wirtsbakterien, z.B. Arten von Bacillus, die in der Lage sind, größere Mengen an PrsA-Protein als der Wildtyp zu exprimieren und größere Mengen an einem interessierendem Exoprotein als der Wildtyp zu exprimieren, z.B. alpha-Amylase, Subtilisin, Pneumolysin, Lipasen oder andere Exoproteasen von kommerziellem Interesse. Das Verfahren der Erfindung umfasst das Verwenden dieses Bakteriums, um die Herstellung von kommerziell wichtigen Exoproteinen in gram-positiven Bakterien zu verstärken. Gemäß dem Verfahren wird mindestens ein interessierendes Exoprotein in einem gram-positiven Wirtsbakterium überexprimiert, welches ebenfalls PrsA-Protein überexprimiert (d.h. größere Mengen exprimiert, als die Mengen, die von den Wildtyp-Bakterien hergestellt werden).
Ein bevorzugtes Mittel zum Transformieren von gram-positiven Wirtsbakterien, wie Arten von Bacilli, so dass sie größere Mengen an PrsA-Protein als der Wildtyp herstellen, ist es, den Wirt mit dem Plasmid pKTH277 zu transformieren, welches das prsA-Gen von Bacillus subtilis trägt.
Die vorliegende Erfindung offenbart und schließt diese ein, Verfahren und Konstrukte, die mit unserer Entdeckung in Zusammenhang stehen, dass die Sekretion in gram-positiven Bakterien verstärkt werden kann, indem die Menge an zellulärem PrsA-Protein in grampositiven Wirten erhöht wird, die größere Mengen an interessierenden Exoproteinen exprimieren, als der Wildtyp.
In einem Aspekt schließt unsere Erfindung ein Bakterium gemäß der Erfindung zum Verstärken der Sekretion von Exoproteinen in gram-positiven Bakterien ein, das ebenfalls in der Lage ist, größere Mengen von mindestens einem interessierenden Exoprotein als der Wildtyp zu exprimieren, ein.
In einem anderen Aspekt schließt unsere Erfindung ein gram-positives Bakterium gemäß der Erfindung ein, welches weiterhin pKTH277 umfasst.
In noch einem anderen Aspekt schließt unsere Erfindung ein gram-positives Bakterium gemäß der Erfindung ein, welches weiterhin mindestens eines der Folgenden umfasst: mindestens zwei Kopien des prsA-Gens von Bacillus subtilis, das prsA-Gen von Bacillus sucbtilis, funktionsfähig verknüpft mit starken regulatorischen Sequenzen, was in einer Überexpression des prsA-Gens resultiert.
Ein DNA-Konstrukt, welches das prsA-Gen von Bacillus subtilis oder ein funktionelles Homolog hiervon unter der Kontrolle von Expressionssignalen umfasst, welche die Überexpression des prsA-Gens oder des funktionellen Homologs hiervon bewirken, sowie ein Vektor, welcher weiterhin das prsA-Gen von Bacillus subtilis oder ein funktionelles Homolog hiervon unter der Kontrolle von Expressionssignalen umfasst, welche die Überexpression des prsA-Gens bewirken, können in der Erfindung verwendet werden.
In noch einem anderen Aspekt schließt unsere Erfindung ein Verfahren zum Verstärken der Sekretion eines interessierenden Exoproteins in einem gram-positiven Bakterium gemäß der Erfindung ein, welches das Exprimieren von größeren Mengen an PrsA-Protein von Bacillus subtilis oder einem funktionellen Homolog hiervon als beim Wildtyp in dem gram-positiven Bakterium umfasst.
Diese und andere Merkmale, Aspekte und Vorteile der Erfindung werden besser verständlich werden unter Bezugnahme auf die folgende(n) Beschreibung, Beispiele, Verfahren und Materialien und angefügten Patentansprüche.
Beschreibung
Wenn der Expressionslevel (die Synthese) eines exportierten Proteins in gram-positiven Bakterien, wie Bacillus sp., hoch ist, ist die Kapazität des Sekretionsapparats ein beschränkender Faktor bei der Proteinsekretion und der Herstellung dieser Proteine in sekretierter Form. Unsere Erfindung stellt ein Bakterium und ein Verfahren zum Überwinden dieser Beschränkung oder dieses Engpasses bereit.
Unsere Erfindung basiert auf unserer anfänglichen überraschenden Entdeckung, dass die Sekretion in gram-positiven Bakterien, wie Arten von Bacillus, verstärkt werden kann, indem die Menge an lediglich einer Komponente der bakteriellen Exportmaschinerie erhöht wird, d.h. die Menge an zellulärem PrsA-Protein, in gram-positiven bakteriellen Wirten, welche größere Mengen an interessierenden Exoproteinen exprimieren als der Wildtyp. Das Verfahren und die Bakterien der Erfindung sind unabhängig davon verwendbar, wie die interessierenden Proteine in dem gram-positiven bakteriellen Wirt überproduziert werden. Demnach kann das Verfahren und können die Bakterien verwendet werden, um eine Vielzahl kommerzieller überproduzierender Stämme zu verbessern, die gegenwärtig bei industriellen Anwendungen verwendet werden.
Das Verfahren und die Bakterien der Erfindung können mit allen beliebigen grampositiven Bakterien verwendet werden. Bakterien der Gattung Bacillus sind bevorzugt. Besonders bevorzugt sind Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis und Bacillus thuringiensis.
Das Verfahren und System der Erfindung kann ebenfalls für jedes beliebige gewünschte interessierende Exoprotein verwendet werden. Beispiele von interessierenden Exoproteinen, die gemäß dem Verfahren und System der Erfindung hergestellt werden können, sind nachfolgend aufgelistet, wobei die exemplarischen Exoproteine durch allgemeine Kategorien dargestellt sind.
Antigene Proteine von Mikroben (Mikoroorganismen) und Protozoen: Kapselproteine, Proteine der äußeren Membran und Fimbriaproteine (Piliproteine) von allen beliebigen gram-negativen Bakterien, jedoch besonders solche von: Bacteroides fragilis, Fusobacterium spp., Bordetella pertussis, Haemophilus influenzae, Yersinia entercolitica, Yersinia pestis, Branhamelia catarrhalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, Vibrio cholerae, Proteus mirabilis, Pseudormonas aeruginosa, Serratia marcescens, Legionella pneumophila, Neisseria gonrrhoeae, Neisseria menengitidis, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Salmonella pararyphi B. Mycobacterium tuberculosis, Chlamydia trachomatis und Shigella spp.
Proteintoxine oder sekretierte Proeine von allen beliebigen Bakterien, jedoch besonders solche von: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium spp., Escherichia coli, Yersinia pestis, Vibrio cholerae, Bordetella pertussis, M-Protein von dem Bakterium Streptococcus pyogenes, exkretierte Enzyme von Mutanten von Streptococcus.
Oberflächenproteine von jedem beliebigen Mikroorganismus, jedoch besonders solche von den folgenden Mikroorganismen (in allen Entwicklungsphasen): Plasmodium spp., Toxoplasma spp., Leishmania spp., Schistosoma spp., Trypanosoma spp., Adhäsionsprotein von Streptococcus sp. und Adhäsionsprotein von Staphylococcus aureus.
Antigenproteine oder Viren: HA- und NA-Proteine von Myxoviren (Influenza A H1 bis H2, Influenza B, Influenza C): HN- und F-Proteine von Paramyxoviren (Parainfluenza 1 bis 4, Newcastle disease virus, Measles virus (Masernvirus), Respiratory Syncytial Virus, Parotitis Virus, Distemper Virus): G-Protein des Rabies Virus (Tollwutvirus); E1- und E2-Proteine von alpha-Viren (Chikungunya, Western, Easter, Venezuelan Equine Encephalitis Virus (Virus der venezulanischen Pferdeenzephalitis) O'nyong-nyong Virus, Semliki Forest Virus, Sindbis Virus); V1- und V3-Proteine von Flavinviren (Denque 1 bis 4, Japanese Encephalitis Virus, Mite Encephalitis Viruses, Murray Valley Encephalitis Virus, Kyasanur Forest Disease Virus, Looping I11 Virus, Omsk Hemorrhagic Fever Virus); Oberflächenproteine des German Measles Virus; Oberflächenproteine des Hog Cholera Virus; Oberflächenproteine des Equine Arthritisvirus; G1- und G2-Proteine von Bunyaviren (Rift Valley Fever Virus, Crimean Hemorrhagic Fever Virus, California Encephalitis Virus, Phlebotomus Fever Virus); G1- und G2-Protein von Arenaviren (Lassa Fever Virus, Lymphocytic Chorion Menengitis Virus); Proteine V 1 bis V4 von Picornaviren (Polio 1 bis 3, Coxsackie A-Viren 1 bis 24, Coxsackie B-Viren 1 bis 6, ECHO-Viren 1 bis 8, 11 bis 34, Hepatitis A-Virus, Hepatitis B-Virus, Hepatitis C-Virus, Human Rhino Virus 1 bis 113); Oberflächenproteine von Rotaviren; Oberflächenproteine von Herpesviren (HSV 1, 2, Cytomegalovirus, Eppstein-Barr-Virus, Equine Abortion Virus); VP1- bis VP3-Proteine von Papovaviren (BK Virus, Human Wart Virus); P-Proteine von Parvoviren (Mink Enteritis Virus, Bovine Parvo Virus, Feline Parvo Virus, Porcine Parvo Virus); Strukturproteine des humanen Hepatits B-Virus; Oberflächenproteine von Ebola- und Marburgviren; und Hexone-, Pentone- und Faserproteine von Adenoviren (Humane Adenoviren 1 bis 33).
Industrielle Enzyme: Hinsichtlich industriell wichtiger Enzyme können solche Enzyme ampholytische, lipolytische und proteolytische Enzyme, Carbohydrasen, Transferasen, Isomerasen, Peroxidasen, Oxidoreduktasen, Oxidasen usw. sein. Genauer kann das interessierende Enzym eine Protease, eine Lipase, eine Kutinase, eine Amylase, eine Galactosidase, eine Pullulanase, eine Cellulase, eine Glukoseisomerase, eine Proteindisulfidisomerase, eine CGTase (Cyclodextringluconotransferase), eine Phytase, eine Glucoseoxidase, eine Glycosyltransferase, Laccase, Bilirubinoxidase oder eine Xylanase sein. Beispiele schließen ein, sind jedoch nicht hierauf beschränkt: alpha-Amylase, Aminoacidacylase, Amyloglucosidase, Bromelain, Phisin, beta-Galactosidase, beta-Glucanase, Glucoseisomerase, Glucoseoxidase, Hemicellulase, Invertase, Catalase, Collagenase, Xylanase, Lactase, Lipase, Naringinase, Pancreatin, Papain, Pectinase, Penicillinamidase, Pepsin, Protease, Pullulanase, Isoamylase, Rennin, Ribonuclease, Cellulase, Streptokinase und Trypsin.
Exoproteine von medizinischem Interesse können ebenfalls hergestellt werden. Solche Proteine schließen diagnostische Antigene und Proteine, die als Impfstoffe und Pharmazeutika verwendet werden können, ein.
Gemäß der Lehre der Erfindung müssen die interessierenden Exoproteine keine nativen Exoproteine sein, sondern können statt dessen neue Proteine sein, die unter Verwendung von gentechnischen Techniken als Exoproteine gestaltet und erzeugt worden sind. Zum Beispiel kann ein nicht sekretiertes Protein von einer Art (oder ein technisch hergestelltes nicht natives Protein) technisch als ein „Exo"-Protein hergestellt werden, indem eine Signalsequenz zu der Sequenz hinzugefügt wird, welche das Strukturprotein kodiert. Dieses technisch hergestellte Exoprotein kann in einem gram-positiven Bakterium, wie einer Art von Bacillus, exprimiert werden, welches PrsA-Protein überexprimiert. Auf diese Weise kann das Verfahren der Erfindung verwendet werden, um die Sekretion von diesen nicht nativen oder technisch hergestellten interessierenden Proteinen zu verstärken.
Um nun auf die Aspekte unsere Erfindung zu kommen, illustrieren wir eine Ausführungsform unserer Erfindung und zeigen den Effekt, den die Überexpression des prsA-Gens von Bacillus subtilis auf die Sekretion der zwei wichtigen industriellen Exoenzymen von Bacilli, alpha-Amylase und Subtilisin, aufweist. Für diese Untersuchungen wurde ein Insert mit 5,3 kB, welches das vollständige prsA-Gen von Bacillus subtilis enthielt, in ein Shuttle-Plasmid mit geringer Kopienzahl (pKTH277) kloniert, welches dann verwendet wurde, um zusätzliche Kopien von prsA in Bacillus subtilis einzuführen. (Die DNA- und abgeleiteten Aminosäurensequenzen des prsA-Gens von Bacillus subtilis erscheinen in den EMBL/GenBank/DDBJ-Nukleotidsequenzdatenbanken unter der Zugriffsnummer X57271.) (pKTH277 wurde durch Ligieren des EcoRI-BamHI-Fragments mit 5,3 kB von pKTH268 mit dem Shuttle-Plasmid mit geringer Kopienzahl pHP13, linealisiert durch Verdauung mit den jeweiligen Restriktionsenzymen, und Transformieren in den Stamm E. coli TG1 erhalten. Die Größen von pKTH268 und pKTH277 sind 8,5 kB bzw. 10,2 kB. Siehe ebenfalls Kontinen, et al., (1991) Mol. Microbiol., 5: 1273-1283, hierin durch Bezugnahme aufgenommen). Die Gegenwart von pKTH277 in B. subtilis erhöhte die Menge an Protein, das dem PrsA-Protein entsprach, um ungefähr das 10-fache gegenüber dem Wildtyp. Wenn die Gene von verschiedenen sekretierten Proteinen in Stämmen von Bacillus, welche diese erhöhten Level an PrsA-Protein enthalten, exprimiert werden, wird der Level an in das Kulturmedium sekretiertem Protein wesentlich erhöht. Zum Beispiel wurde festgestellt, dass die Sekretion der alpha-Amylase von Bacillus amyloliquefaciens um das 2,5-fache in diesem System erhöht wurde, der sekretierte Level der thermoresistenten alpha-Amylase von Bacillus licheniformis wurde um das Sechsfache angehoben und Subtilisin (alkalische Protease) von Bacillus licheniformis wurde um das Zweifache gegenüber dem Kontrolllevel sekretiert.
In diesen Untersuchungen wurden die Exoenzyme in Wirtsstämmen in Mengen überexprimiert, die wahrscheinlich die Sekretionsmaschinerie auslasten, entweder indem das Gen, welches das Exoprotein kodiert, auf einem Plasmid mit mehrfacher Kopienzahl platziert wird oder in das Chromosom des Wirts eingefügt wird. (In diesen Untersuchungen waren alle Plasmide mit mehrfacher Kopienzahl, welche für die Exoenzyme kodiert, Derivate von pUB110, welches einer von dem Shuttle-Plasmid pKTH277 unterschiedlichen Inkompatibilitätsgruppe angehört, was ihre Replikation in derselben Wirtszelle erlaubte. Die Stabilität dieser Plasmide wurde weiterhin in den meisten Fällen durch die Verwendung eines recE4-Wirtsstammes erhöht, welcher eine effiziente Rekombination zwischen homologen Sequenzen verhindert (Dubnau et al., 1973; Keggins et al., 1978).
Das erste Exoenzym, welches untersucht wurde, um diesen Aspekt unserer Erfindung darzustellen, war die alpha-Amylase von B. amyloliquefaciens (AmyE), kodiert durch pKTH10 (Palva, I. (1982a) Gene, 19: 81-87; Palva, I. et al., (1982b) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 5582-5586). Wir haben herausgefunden, dass in dem Wildtyp-Stamm, welcher diese alpha-Amylase hyperproduziert, die Gegenwart von pKTH277 in der Tat die Sekretion der alpha-Amylase während der ganzen stationären Wachstumsphase ungefähr um das 2,5- bis 3-fache gegenüber dem Level des Kontrollstamms, welcher PrsA nicht überexprimiert, verstärkte. Die höchste Konzentration an alpha-Amylase in dem Kulturüberstand (ungefähr 3400 Mikrogramm/ml wurde nach dem Wachsen für 24 Stunden festgestellt. In der Abwesenheit von pKTH277 sekretierte der Stamm lediglich 1200 Mikrogramm/ml. Qualitativ ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn die alpha-Amylase von einer Kopie des amyE-Gens exprimiert wurde, welches in das Chromosom eingefügt wurde und durch modifizierte Regulation in hohem Level transkribiert wurde.
Das zweite Exoprotein, das wir testeten, war die thermoresistente alpha-Amylase von B. licheniformis (AmyL), die wichtigste verflüssigende alpha-Amylase von industrieller Wichtigkeit (Ortlepp et al., 1983; Diderichsen, B., et al., (1991) Res. Microbiol., 142, 793-796). Die Sekretion dieses Enzyms in B. subtilis in Mengen, die mit solchen der alpha-Amylase von B. amyloliquefaciens vergleichbar sind, wurde erzielt, indem das dazugehörige Gen von dem Sekretionsveketor, der auf der Promoter- und Signalfrequenz des Gens von dem letztgenannten Enzym basierte, exprimiert wurde (Palva, I. (1982) Gene, 19: 81-87; Palva, I., et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 5582-5586); Sibakov, M. (1986) Eur. J. Biochem., 1sS, 577-581). Die Einführung von pKTH277 in einen solchen Stamm (um IH6760 zu ergeben) erhöhte die Menge an alpha-Amylase in dem Kulturmedium um das Sechsfache, mit dem gleichen Unterschied; der von dem späten exponentiellen Zustand zu Kulturen von 45 Stunden gesehen wurde.
Die alkalische Protease, Subtilisin, ist ein anderer Typ Exoprotein, dessen Vorläufer zusätzlich zu der Signalsequenz eine weitere Verlängerung enthält, die Prosequenz (Wells, et al., (1983) Nucleic Acids Res., 11: 7911-7925; Wong, S.-L., et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1884-11188). Der Effekt einer erhöhten Menge an PrsA auf dessen Sekretion wurde durch Vergleichen von zwei Stämmen untersucht, einer mit einem erhöhten Level an PrsA (IH6789), ein anderer mit dem Level des Wildtyps. Beide sekretierten das heterologe Subtilisin von B. licheniformis (SubC, welches als Waschpulver verwendet wird und ein wichtiges industrielles Produkt darstellt), das kodiert wurde durch das Plasmid mit mehrfacher Kopienzahl pMJ57 (Hastrup, S. und Jacobs, M. F. (1990) in Zukowski, M. M., et al., (Hrsg.), Lethal phenotype conferred by xylose-induced overproduction of apr-lacZ fusion protein, Bd. 3. Academic Press, Inc. San Diego, Californien, S. 33-41). In diesem Plasmid steht das Gen subC unter der Kontrolle eines Xylose-induzierbaren Promoters. Ein Vergleich der Sekretion von Subtilisin von diesen zwei Stämmen zeigte bei voller Induzierung, dass seine Menge in dem Kulturüberstand von IH6789 (erhöhte Menge an PrsA) zu allen überprüften Zeitpunkten ungefähr um das Zweifache höher war als die von der Kontrolle IH6788.
Wir untersuchten ebenfalls den Effekt von pKTH277 auf die naturgemäß auf geringem Level erfolgende Expression auf geringem Level von endogenen Exoenzymen in einem Stamm ohne irgendeine Plasmid-verursachte Hypersekretion. Die Menge an sekretierter alpha-Amylase und den gesamten Proteasen in der späten exponentiellen Wachstumsphase oder in Über-Nacht-Kulturen war die gleiche in Stämmen, die pKTH277 oder den Klonierungsvektor pHP13 trugen. Basierend auf diesen Ergebnissen hat es den Anschein, dass die erhöhte Menge an PrsA-Protein die Sekretion lediglich von hyperproduzierten Exoenzymen verstärkt.
Um die Rolle von PrsA in der Verstärkung, die durch das Fragment mit 5,3 kB in den obigen Plasmiden bewirkt wurde, zu bestätigen, inaktivierten wir das prsA-Gen in dem Plasmid pKTH277 durch Insertionen in der EcoRV-Stelle dieses prsA-Gens (an dem Nukleotid 382). In pKTH3261 war das Insert ein Fragment mit 560 Bp des blaP-Gens von B. licheniformis, welches durch Translationsstop-Kodons flankiert wurde und in pKTH3262 war es ein EcoRV-Fragment mit 4,6 kB des Phagen Lambda. Eine SDS-PAGE-Analyse der gesamten Zellproteine von E. coli, welche diese Plasmide trugen, zeigte kein PrsA-Protein in voller Größe, exprimiert von beiden Plasmiden, und ein putativ verkürztes PrsA der erwarteten Größe (14 kDa), exprimiert von pKTH3261 (Daten nicht gezeigt). Als Kontrolle konstruierten wir pKTH3253, in welchem das Fragment mit 5,3 kBp um 1,9 kBp stromabwärts von prsA, verkürzt wurde, was dieses Gen intakt ließ. In B. subtilis (IH6624, welcher pKTH10 trug) verstärkten die zwei Plasmide mit einer Insertion in prsA die Sekretion von alpha-Amylase nicht, während pKTH3253 dies tat.
Eine verstärkte Sekretion, die durch die Überproduktion von prsA erhalten wird, ist von offensichtlichem Vorteil für die industrielle Herstellung von Exoenzymen in großem Maßstab. Für diese Anwendungen ist es manchmal wünschenswert, die Verwendung von möglicherweise nicht stabilen Plasmiden mit mehrfacher Kopienzahl zu vermeiden. Eine Strategie ist es, eine oder wenige Kopien des Strukturgens des Exoenzyms in das Chromosom einzufügen, kombiniert mit dem Verändern seiner regulatorischen Elemente, um die Expression zu erhöhen. Wir überprüften daher den Effekt einer Überproduktion von PrsA auf die Sekretion von alpha-Amylase in einem solchen System, in dem eine Kopie von amyE in das Chromosom eingefügt wurde, fusioniert mit der Zielsequenz des regulatorischen Proteins DegQ in einem Stamm, der DegQ überexprimiert (A. Palva, persönliche Kommunikation). In diesem Stamm wurde ebenfalls der hohe Sekretionslevel an alpha-Amylase ungefähr um das Dreifache verstärkt, indem die Menge an PrsA-Protein erhöht wurde (Tabelle 1, Stämme BRB764 und IH67703). Dies zeigt an, dass die Verstärkung der Sekretion erzielt wird, wenn der Ausgangslevel der Expression des Exoproteins hoch ist, unabhängig davon, wie die erhöhte Expression des Zielgens erhalten worden ist.
Um nun auf die Gegenwart von PrsA in gram-positiven Bakterien, die andere sind als Bacillus subtilis, zu kommen, haben wir die Gegenwart von PrsA oder PrsA-Homologen in anderen Arten bestätigt, z.B. Bacillus amyloliquefaciens und Bacillus licheniformis bestätigt. Die Menge an PrsA-Protein in Bacillus amyloliquefaciens ist ähnlich zu der Menge in Zellen von Bacillus subtilis, während die Menge von PrsA-Protein in Zellen von Bacillus licheniformis geringer zu sein scheint. Zusätzlich sind die Komponenten der Sekretionsmaschinerie in diesen gram-positiven bakteriellen Stämmen ähnlich zu denen von Bacillus subtilis. Bacillus amyloliquefaciens und Bacillus licheniformis sind zwei der am meisten verwendeten Arten von Bacilus in industriellen Verfahren für die Herstellung von sekretierten Proteasen und Amylasen in großem Maßstab. Das Verfahren der Erfindung, welches die Überproduktion von PrsA-Protein verwendet, um die Sekretion von homologen und heterologen Exoproteinen zu erhöhen, ist für diese Stämme besonders wertvoll.
Als ein Teil unserer Erfindung lehren wir ebenfalls, wie das prsA-Gen unter die Kontrolle von Expressionssignalen gebracht wird, die in den interessierenden Arten aktiv sind, um in dem hohen Expressionslevel (jedoch nicht letal) des prsA-Gens zu resultieren. Dies kann auf eine Vielzahl von Wegen erzielt werden, einschließlich:

(1) Dem Transfer des Plasmids pKTH277 in die interessierenden Arten. Der Transfer kann durch jedes beliebige Verfahren zur Transformation erfolgen, das für diese Arten anwendbar ist, wie Transformation, Transduktion, Protoplastentransformation, Elektroporation oder Konjugation. pKTH277 wird in zahlreichen anderen grampositiven Arten, andere als Bacillus, als Plasmid mit mehrfacher Kopienzahl beibehalten und die Expressionssignale des prsA-Gens in diesem Plasmid sind in zahlreichen gram-positiven Arten aktiv.
(2) Einfügen des SacI-Fragments mit 5,3 kB von pKTH277 in jedes beliebige andere Plasmid, welches mit den interessierenden Arten kompatibel ist, und dessen Beibehaltung in einer geeigneten Kopienzahl für einen hohen, jedoch nicht letalen Expressionslevel von prsA, relativ zu der Aktivität des prsA-Gens von B. subtilis in diesen Arten. Das Plasmid wird dann in diese Arten transferiert, unter Verwendung eines beliebigen Verfahrens zur Transformation, welches für diese Arten anwendbar ist.
(3) Einfügen des DNA-Fragments von pKTH277, welches die Signalsequenz und den reifen Teil des PrsA-Proteins kodiert, in einen Expressionsvektor, der für die interessierenden Arten geeignet ist, unter der Kontrolle von Expressionssignalen in diesem Plasmid, um einen hohen Expressionslevel an prsA zu erzielen.
(4) Die DNA-Konstruktionen der obigen Absätze (2) und (3) können anstelle eines Plasmids in das Chromosom der interessierenden Arten eingeführt werden. In diesem Fall müssen Expressionssignale gewählt werden, die aktiv genug sind, um einen hohen Expressionslevel an PrsA sicherzustellen, obwohl dort nur eine Kopie des Gens pro Genom vorhanden ist.

Als Erfinder, die ebenfalls ihre Basis als Naturwissenschaftler haben, wurde durch Konzeption und Notwendigkeit ein Großteil unserer Arbeit unter Laborbedingungen oder simulierten industriellen Bedingungen durchgeführt. Durch die Hilfe von industriellen Mitarbeitern ist jedoch gezeigt worden, dass das Verfahren und das Bakterium unserer Erfindung sehr gut mit kommerziell verwendbaren bakteriellen Stämmen unter industriellen Fermentationsbedingungen arbeiten.
Verfahren und Materialien, die in unseren Untersuchungen verwendet wurden, und Beispiele von unserer Erfindung sind nachfolgend eingeschlossen, um dem Fachmann eine weitere Hilfe beim Praktizieren des Verfahrens und beim Bakterium unserer Erfindung darzustellen.
Materialien und Methoden
Bakterienstämme und Plasmide
prs-Mutanten von Bacillus subtilis Marburg 168 und ihre Elternstämme sind in Tabelle 1 gezeigt. Aufgeführt sind ebenfalls Stämme von B. subtilis und E. coli, welche das PrsA-Protein überexprimieren, und Stämme von B. subtilis mit verstärkter Sekretion von Exoenzymen auf Grund einer erhöhten zellulären Menge an PrsA-Protein und ihre dazugehörigen Kontrollstämme. Stämme von E. coli, die als Klonierungswirte mit Plasmidvektoren verwendet wurden, waren HB101, TG1 und DHScc ( Sambrook J., et al., (1989) Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) und mit Lambda, Kw25 1 (Promega, Madison, Wisconsin).
pHP13 (Haima, P., et al., (1987) Mal. Gen. Genet., 209: 335-342), pJH101 (Ferrari, F. A., et al., (1983) J. Bacteriol., 154: 1513-1515), pGEM3sf(+) (Promega) und pDR540 (Pharmacia, Upsala, Schweden) wurden als Klonierungsvektoren für das prsA-Gen und seine Fragmente verwendet. Eigenschaften dieser Plasmidvektoren und konstruierten Plasmidderivate, welche das prsA-Gen mit 5,3 kB- (pKTH277 und pKTH268) oder 3,4 kB- (pKTH3253) Insert tragen, sind in Tabelle 2 gezeigt. Das prsA-Gen in pKTH3253 wurde durch Einfügen eines Fragments entweder vom blaP-Gen von B. licheniformis (0,5 kB) oder von dem Genom des Bakteriophagen Lambda (4,6 kB) in die einzige EcoRV-Stelle in dem ORF (offenem Leserahmen) von prsA unterbrochen (die resultierenden Plasmide waren pKTH3261 und pKTH3262). pKTH10 (Palva, I. (1982a) Gene, 19: 81-87; Palva, I., et al., (1982b) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 5582-5586) und pMJ57 (Hastrup, S. und Jacobs, M. F. (1990) in Zukowski, M. M., et al., (Hrsg.), Lethal phenotype conferred by xylose-induced overproduction of apr-lacZ fusion protein, Bd.3. Academic Press, Inc., San Diego, Californien, S.33-41) sind Plasmide mit mehrfacher Kopienzahl, die große Mengen der alpha-Amylase (AmyE) von B. amyloiquefaciens und Subtilisin (SubC) von B. licheniformis herstellen, welche jeweils in das externe Medium sekretiert werden. pKTH1582 ist durch Klonieren des amyL-Gens von B. licheniformis über ein Sekretionsvektorsystem von B. subtilis konstruiert worden (BRB360 in Sibakov, M. (1986) Eur. J. Biochem., 1sS, 577-581; Palva, I. (1982a) Gene, 19: 81-87; Palva, I., et a1., (1982b) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 5582-5586).
Wachstumsmedien und Kulturbedingungen
Die Bakterien wurden in modifizierter L-Brühe (1 % Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,5 % NaCl) unter Schütteln bei 37 °C oder auf L-Platten, welche 1,5 % Agar (Difco, Detroit, Michigan) mit geeigneten Antibiotika enthielten, bei + 37 °C wachsen gelassen (Kontinen, V. P., et al., (1991) Mol. Microbiol. 5: 1273 – 1283); die Platten wurden für die alpha-Amylase- (5 % Stärke und 2,5 % Agar) und Subtilisin-überexprimierenden Stämme (0,2 % Xylose und 1 % Milchpulver) modifiziert. Die L-Brühe wurde mit 2 % löslicher Stärke (Merck, Darmstadt, Deutschland) ergänzt oder als 2-fach konzentriertes Medium für die Herstellung von Exoenzymen verwendet. Stämme, die Subtilisin herstellen, wurden auf L-Platten, die 1 % Milchpulver enthielten, wachsen gelassen. Die Herstellung von Exoenzymen wurde in zweifach konzentrierter L-Brühe unter kräftigem Schütteln untersucht. Das Wachstum wurde durch eine Trübung der Kultur angezeigt, welche mit einem KlettSummerson Kolorimeter (Klett Manufacturing Co., Inc. N.Y.) unter Verwendung eines Filters Nr. 66 gemessen wurde.
Enzymassays
Die alpha-Amylase wurde anhand von Phadebas-Tabletten (Pharmacia) untersucht, wie beschrieben in Kontinen, V. P. und Sarvas, M., (1988) J. Gen. Microbiol., 134: 2333-2344. Für den Plattenassay wurden Bakterien auf einer L-Platte ausgestrichen, welche 5 % Stärke enthielt, und die Höfe rund um die Kolonien wurden nach einer Inkubation der Platten bei 4 °C gemessen. Typischerweise erschien keine Zone rund um die Kolonien des Wildtyps, der endogene alpha-Amylase produziert, während die von Stämmen, welche pKTH10 trugen, mehr als 2 mm betrug, abhängig von dem Alter der Platten. Subtilisin von B. licheniformis und chromosomal kodierte Proteasen wurden in 1 ml 0,1 M Tris-0,01 M CaCl₂ (pH 8,0) mit einem chromogenen Peptidsubstrat Succinyl-AlaAla-Pro-Phe-p-Nitroannilid untersucht (Del Mar, E. G., et al., (1979) Anal. Biocehm., 99:316-320). Der Hydrolysegrad wurde anhand eines Hewlett Packard-Spektrometers mit Diodenanordnung („Hewlett Packard diode array spectrophotometer") bei 410 nm gemessen. Um die spezifischen Aktivitäten von alpha-Amylasen und Subtilisin zu bestimmen, wurden ihre Mengen in einer Probe des Kulturüberstandes bewertet, entweder wie in Kontinen, V. P. und Sarvas, M., (1988) J. Gen. Microbiol., 134: 2333-2344 beschrieben oder durch SDS-PAGE, angefärbt mit Coommassie Blue. Die Enzymmengen wurden als Mikrogramm/ml ausgedrückt. Tabelle 1. Bakterienstämme

1) pKTH 1743 ist ein Derivat von pUB 110, welches ein Insert von 0,3 kBp mit einem ORF für das decQ-Gen von B. subtilis trägt
2) The Bacillus Genetic Stock Center, The Ohio State University, Ohio

Beispiele
Beispiel 1
Verstärkung der Sekretion von alpha-Amylase in B. subtilis, wenn eine erhöhte Menge an PrsA-Protein vorhanden ist
Die folgende Tabelle (Tabelle 3) stellt die Verstärkung der Sekretion von α-Amylase in Bacillus subtilis unter verschiedenen Bedingungen dar, wenn der gram-positive Bakterienwirt ebenfalls PrsA-Protein überexprimiert. Tabelle 3. Verstärkung der Sekretion von α-Amylase in B. subtilis durch Überexpression des PrsA-Proteins

a) pKTH10 mit amyE von B. amyloliquefaciens
b) Eine Kopie von amyE unter einem Promoter mit erhöhter Aktivität
c) Die Aktivität der α-Amylase des Kulturüberstandes wurde in der späten stationären Wachstumsphase untersucht

Beispiel 2
Verstärkung der Sekretion von alpha-Amylase in B. amyloliquefaciens, wenn eine Hyperexpression von PrsA-Protein erfolgt
Dieses Beispiel demonstriert den Effekt der Überproduktion des PrsA-Proteins von B. subtilis in B. amyloliquefaciens, wenn der gram-positive Bakterienwirt ebenfalls PrsA-Protein hyperexprimiert.
ALK02732 ist ein Derivat von ALK02100 und enthält das Plasmid mit mehrfacher Kopienanzahl pKTHIO, welches die α-Amylase von B. amyloliquefaciens kodiert. Der Stamm enthält somit zehn Kopien des α-Amylasegens und sekretiert ungefähr 20-fach mehr α-Amylase als der Wildtyp-Stamm ALK02100 (Vehmaanperä et al., J. Biotechnol. 1991, 19, 221-240). Ein Immunoblotting von Zellen von ALK02732 mit anti-PrsA-Antiserum zeigte, dass die Menge an PrsA-Protein ähnlich gering in ALK02732 wie in ALK02100 war, worauf nachfolgend Bezug genommen wird. Somit ist PrsA beschränkend für den Grad der Proteinsekretion in ALK02732.
Das Plasmid pKTH277 wurde durch Elektroporation in den Stamm ALK02732 von B. amyloliquefaciens transferiert, um ALK02732 (pKTH277) herzustellen. Die Menge an PrsA in ALK02732 (pKTH277) war um ein Vielfaches höher als in ALK02732, wie anhand von Immunoblotting bestimmt wurde. Dies ist in guter Übereinstimmung mit dem ähnlichen Anstieg an PrsA-Proteinen in Stämmen von B. subtilis, die mit pKTH277 transformiert wurden.
Der Stamm enthält somit zehn Kopien des α-Amylasegens und sekretiert ungefähr 20-fach mehr α-Amylase als der Wildtyp-Stamm ALK02100 (Vehmaanperä et al., J. Biotechnol. 1991, 19, 221-240). Ein Immunoblotting von Zellen von ALK02732 mit anti-PrsA-Antiserum zeigte, dass die Menge an PrsA-Protein ähnlich gering in ALK02732 wie in ALK02100 war, worauf nachfolgend Bezug genommen wird. Demnach ist PrsA beschränkend für den Grad der Protiensekretion in ALK02732.
Das Plasmid pKTH277 wurde durch Elektroporation in den Stamm ALK02732 von B. amyloliguefaciens transferiert, um ALK02732 (pKTH277) herzustellen. Die Menge an PrsA in ALK02732 (pKTH277) war um ein Vielfaches höher als in ALK02732, wie anhand von Immunoblotting bestimmt wurde. Dies ist in guter Übereinstimmung mit dem ähnlichen Anstieg von PrsA-Proteinen in Stämmen von B. subtilis, die mit pKTH277 transformiert wurden.
Die Menge an α-Amylase, das in das Wachstumsmedium (Luria-Brühe von doppelter Stärke mit 2 % löslicher Stärke) durch ALK02732 und ALK02732 (pKTH277) sekretiert wurde, wurde während der logarithmischen und der frühen stationären Wachstumsphasen (Schüttelflaschenkulturen) bestimmt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 4-1 (Exp. 1) und 4-2 (Exp. 2) gezeigt. Es ist zu sehen, dass in zwei separaten Experimenten die Menge an α-Amylase in dem Kulturmedium von ALK02732 (pKTH277) das 1,5- bis 2,5-fache Menge von der Menge in dem Wachstumsmedium von ALK02732 war. Tabellen 4-1 und 4-2. Der Effekt von pKTH277 auf die Sekretion von α-Amylase von B. amyloliquefaciens (ALK02732). Tabelle 4-1, Experiment 1.
Tabelle 4-2, Experiment 2.

* Die Dichte der Kultur, wie an Hand des Klett-Summerson-Kolorimeters unter Verwendung eines Filters Nr. 66, angezeigt in Klett-Einheiten.

Material und Methoden, die in diesem Beispiel verwendet wurden
Bakterienstämme und Plasmide: Stamm ALK02732 von B. amyloliquefaciens (beschrieben von Vehmaanperä et al., 1991) wurde für die Transformations- und Wachstumsexperimente verwendet. ALK02732 (pKTH277) wurde durch Transformieren des Plasmids pKTH277 in ALK02732 (diese Untersuchung) hergestellt und in den Wachstumsexperimenten verwendet. Das Plasmid pKTH277, welches das PrsA-Gen trägt, wird von Kontinen et al. (1991) beschrieben.
Transformation von pKTH277 in ALK02732 durch Elektroporation: Das Plasmid pKTH277 wurde unter Verwenden des alkalischen Lysisverfahrens isoliert und mit BamHI-Methylase (New England Biolabs) methyliert gemäß den Instruktionen der Hersteller. Ungefähr 0,5 μg der methylierten Plasmid-DNA wurde für die Elektroporation verwendet. Die Elektroporation wurde, wie von Vehmaanperä (1989) beschrieben, durchgeführt. Die Zellen wurden in 0,2 cm Probenküvetten (Bio-Rad Laboratories) mit einem Gene Pulser^TM -Apparat (Bio-Rad Laboratories), der auf 1,5 kV, 25 μF und 400 Ω eingestellt war, pulsiert. Die Transformanten wurden auf Chloramphenicolresistenz auf Luria-Kanamycin (10 μg/ml) – Chloramphenicol (5 μg/ml) – Platten hin gescreened. (Kanamycin befand sich ebenfalls auf den Platten, um einen Verlust von pKTH10 zu vermeiden, da ALK02732 pKTH10, das eine Kanamycinresistenz überträgt, enthält.
Wachstumsexperimente und Probensammlung: Zuerst wurden ALK02732 und ALK02732 (pKTH277) über Nacht auf Luria-Platten wachsen gelassen. Von den Platten wurden Bakterien zu 10 ml Luria hinzugefügt und sie wurden bis zur logarithmischen Phase (Klett 100) wachsen gelassen. Dann wurde ein 1 ml Glycerol (1/10 des Kultivierungsvolumens) hinzugefügt und die Zellsuspension wurde eingefroren und aufbewahrt bei – 70 °C. Wachstumsexperimente wurden gestartet, indem Klett 100-Zellen 1:100 oder 1:200 in 2 × Luria + 2 % Stärke verdünnt wurden. Das in den Wachstumsexperimenten verwendete Luria enthielt kein Salz. Das Kultivierungsvolumen betrug 20 ml und das Wachstum erfolgte in Flaschen bei 37 °C unter kräftigem Schütteln. Für beide Stämme wurde Kanamycin (10 μg/ml) und für ALK02732 (pKTH277) ebenfalls Chloramphenicol (5 μg/ml) dem Wachstumsmedium zugegeben. Das Wachstum wurde durch Messungen mit einem Klett-Summerson-Kolorimeter (Klett Manufacturing Co., Inc. N.Y.) unter Verwenden eines Filters Nr. 66 angezeigt. 0,5 ml Proben wurden während des Wachstums entnommen, die Proben wurden zentrifugiert und die Kulturüberstände wurden bei –20 °C für α-Amylase-Assays aufbewahrt.
α-Amylase-Assays: α-Amylasen in den Kulturüberständen wurden unter Verwendung von Phadebas-Tabletten (Pharmacia) bestimmt. Die Proben wurden für 1 Stunde bei 37 °C in 1 ml Puffer (50 mM MES pH 6,8, 50 mM NaCl, 100 μM CaCl₂), enthaltend 1/4 einer dispergierten Phadebas-Tablette, inkubiert, wonach 50 μl 5 M NaOH hinzugegeben wurde, um die Reaktion zu stoppen. Nach einer Filtration durch Whatman-Filterpapier Nr. 1 wurde die Absorbanz des Filtrats gemessen unter Verwendung von 616 bis 624 nm als analytischer Wellenlängenbereich und 800 bis 804 nm als ein Referenzwellenlängenbereich. Eine kommerziell erhältliche α-Amylase von B. amyloliquefaciens (Sigma) wurde als Standard verwendet und die Ergebnisse wurden als mg Enzym pro L ausgedrückt.
Referenzen: Kontinen V., Saris P. und Sarvas M. (1991): A gene (prsA) of Bacillus subtilis involved in a novel, late stage of protein export. Mol. Microbiol. 5: 1273-1283. Vehmaanperä, J. (1989): Transformation of Bacillus Amyloliquefaciens by electroporation. FEMS Microbiol. Lett. 61: 165-170. Vehmaanperä J., Steinborn G. und Hofemeister J. (1991): Genetic manipulation of Bacillus amyloliquefaciens. J. Biotechnol. 19: 221-240.
Beispiel 3
Verstärkung der Sekretion von Subtilisin von B. lentus, wenn eine Hyperexpression von PrsA-Protein erfolgt
Dieses Bespiel zeigt das Verfahren und Bakterium der Erfindung bei der Verstärkung der Sekretion von überexprimierten Exoproteinen in B. lentus, wenn der gram-positive Bakterienwirt ebenfalls PrsA-Protein hyperexprimiert.
Der Effekt der Hyperexpression von PrsA wurde in Bezug auf die Sekretion von Subtilisin von B. lentus, kommerziell erhältlich als Experase^TM, und beschrieben in WO 89/06279 (im Namen von Novo Nordisc A/S) untersucht. Das Subtilisin wird von dem Plasmid pPL1800, welches auf dem Expressionsvektor pPL1759 (Hansen, C., Thesis, 1992, Technische Universität Dänemark) basiert, mit einem pUB 110-Ursprung und dem Promoter und Signalpeptid von der alpha-Amylase von B. licheniformis (amyL) transkribiert. Das Plasmid pSX94 ist in WO 89/06279 beschrieben. Der Stamm SHa273 von B. subtilis, der für die Herstellung verwendet wurde, ist ein Protease-schwaches Derivat von DN1885 (Jorgensen, P. L. et al., (1991) FEMS Microbiol. Lett., 77: 271-276), in welchem zwei zusätzliche Proteasen, apr und npr, inaktiviert worden sind. Die Sekretion des Subtilisins von B. lentus wurde bei Stämmen, entweder mit (MOL253) oder ohne (MOL252) das prsA-Plasmid pKTH277, gemessen und das Wachstum wurde bei 30 °C in Soja-Brühe BPX, ergänzt mit Kanamycin und Chloramphenicol, durchgeführt.
Die Messungen der Level an Subtilisin von den zwei Stämmen nach fünf Tagen zeigen, dass der Stamm mit dem prsA-Plasmid eine vierfach höhere Sekretion an Subtilisin von B. lentus aufweist (160 Mikrogramm/ml) im Vergleich zu dem Stamm ohne dieses Plasmid (40 Mikrogramm/ml).
Das verwendete BPX-Medium wies die folgende Zusammensetzung auf:

Liste der Stämme:
Der Stamm RUB 200 wird von Yoneda et al., 1979, Biochem Biophys. Res. Common. Bd. 91, 1556-64 beschrieben.
Beispiel 4
Tabelle 5 stellt eine Zusammenfassung der grob geschätzten Menge an PrsA in den verschiedenen Stämmen dar.
Tabelle 5. Ungefähre Menge an PrsA-Protein, die in Zellen von Stämmen von Bacillus während der frühen stationären Wachstumsphase festgestellt wurden (bei einer Zelldichte von Klett 400). Die Schätzungen basieren auf Western Blots und sind vorläufig.

1) Die Zellen wurden aus der mittleren logarithmischen Wachstumsphase (bei einer Dichte von Klett 100) gesammelt und die PrsA-Werte geschätzt, die einer Dichte von Klett 400 entsprechen.
2) Dies ist ein Überproduzierer an PrsA, auf Grund des Gehalts an pKTH277.

Materialien und Methoden, die in diesem Beispiel verwendet wurden
Bacillus subtilis IH6074. Dieser ist metB5 sacA321. Ref. M. Sibakov et al. 1983. Bacillus subtilis IH6774. Dieser wird von IH6064 erhalten und enthält die Plasmide pKTH10 (welches das α-Amylasegen trägt) und pKTH277 (welches das für PrsA kodierende Gen trägt).
Wachstumsmedien: Luria-Agarplatten (L-Platten); Doppelt konzentrierte Luria-Brühe (2 × L).
Aufgereinigtes PrsA-Protein: PrsA wurde aufgereinigt von pKTH277 enthaltendem B. subtilis von M. Lauraeus.
Immunserum: Von E. Coli produziertes PrsA von B. subtilis, welches über ein SDS-Gel laufen gelassen wurde und aus diesem ausgeschnitten wurde.
Chemikalien: Phenylmethylsulfonylfluorid, Sigma P-7626. 100 mM in Ethanol bei –20 °C. EDTA, Titriplex-III p.a. Merck 8418. Als eine 0,5 M-Lösung, pH 8. Lysozym, Sigma L-6876. Dies wurde als 1 mg/ml in der folgenden Lösung verwendet: 20 mM Kaliumphosphat, pH 7, 15 mM MgCl₂, 20 % Saccharose. TCA 100 % BCA^†-Proteinassayreagens von Pierce.
SDS-PAGE- und Western Blot-Ausrüstung und Chemikalien gemäß BioRad. Die Blots wurden mit 4-Chlor-1-naphtol angefärbt.
Kulturbedingungen und Probenzubereitung für die Gelelektrophorese: Die Bakterien wurden über Nacht bei 37 °C auf L-Platten wachsen gelassen. Kolonien wurden mit einem Glasstab gepickt und in ein vorgewogenes Eppendorf-Röhrchen gebracht und gewogen. Probenpuffer wurde hinzugefügt, um entweder 10 oder 100 mg Zellen (ww)/ml zu erhalten. Die Proben wurden 10 Min. bei 100 °C erhitzt.
Die Bakterien wurden in 2 × L-Brühe unter Rühren bei 37 °C wachsen gelassen. Um die Proteasewirkung zu minimieren, wurden die Bakterien (von –20 °C) zunächst zu Klett 100 wachsen gelassen (dies entspricht ungefähr 1-2 mg Zellen ww/ml oder ungefähr 10⁹ Zellen/ml). Dies wurde als ein Inoculum bei einer 10^–2-Verdünnung verwendet. 20 ml der Bakterien wurden in Klettflaschen wachsen gelassen und 4 ml Proben wurden bei Klett 100, bei Klett 100 + 2 Std. (Klett ungefähr 400) und bei Klett 100 + 4 Std. (Klett ungefähr 550) entnommen.
Die Proben wurden unmittelbar in ein Eisbad transferiert, PMSF wurde bis 1 mM und EDTA bis 10 mM hinzugefügt. Die Zellen wurden von dem Kulturüberstand durch Zentrifugation bei 12.000 × g für 10 Min. separiert und mit Lysozym 15 Min. bei 37 °C in einem 1/20-Volumen behandelt. Ein gleiches Volumen Probenpuffer wurde hinzugefügt. Der Kulturüberstand wurde in 10 % TCA ei 4 °C präzipitiert und 20-fach in Probenpuffer konzentriert.
Die Proben wurden über 12-iges % SDS-PA-Gele laufen gelassen, mit Coomassie Brillant Blue R angefärbt oder gemäß BioRad auf PVDF-Filter geblotted.
PrsA wurde mit dem spezifischen anti-PrsA-Kaninchenantiserum KH 1283 detektiert.
Beispiel 5
Verstärkte Sekretion von Lipase von Pseudomonas mendocina in Bacillus subtilis, welcher PrsA-Protein überproduziert
Unter Verwendung des prsA-Gens in pKTH277 haben Wissenschaftler von Genencor International, Süd San Francisco, CA, USA, gezeigt, dass, wenn Bacillus subtilis sowohl PrsA-Protein als auch Lipase (von Pseudomonas mendocina, einem gram-negativen Bakterium) überexprimiert, die Menge an in das Medium sekretierter Lipase ungefähr 3,5- fach größer ist als in der Kontrolle, die das prsA-Gen nicht überexprimiert. Die Wissenschaftler von Genencor International verwendeten industrielle Stämme von Bacillus und industrielle Fermentationsbedingungen (Daten nicht gezeigt).
Zusammenfassung
Demnach kann festgestellt werden, dass die vorliegende Erfindung ein Verfahren und Bakterien zum Verstärken der Produktion von industriell und medizinisch wichtigen Exoproteinen in gram-positiven Bakterien offenbart. Ohne den Sinn und den Schutzbereich dieser Erfindung zu verlassen, kann der Fachmann zahlreiche Änderungen und Modifikationen der Erfindung vornehmen, um es an zahlreiche Nutzungen und Bedingungen anzupassen. Als solche sind diese Änderungen und Modifikationen regelrecht (genau), fair (gerecht) und dazu gedacht, in dem vollen Equivalenzbereich der nachfolgenden Patentansprüche zu liegen. Zahlreiche Merkmale der Erfindung sind ebenfalls offensichtlich aus den nachfolgenden Patentansprüchen.

Claims

Ein rekombinantes gram-positives Bakterium, welches ein interessierendes Exoprotein sekretiert und welches umfasst (a) mehrere Gene, die PrsA-Protein im Chromosom kodieren; (b) ein Wildtyp-Gen, das PrsA-Protein im Chromosom kodiert und ein Gen, das PrsA-Protein auf einem Plasmid mit mehrfacher Kopienzahl kodiert; und/oder (c) veränderte regulatorische Elemente, um Expression eines PrsA-Proteins zu erhöhen.
Bakterium nach Anspruch 1, welches eine Art der Gattung Bacillus ist.
Bakterium nach Anspruch 2, welches von einer Art ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis und Bacillus thuringiensis ist.
Bakterium nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 3, wobei das besagte Exoprotein eine Protease, eine Lipase, eine Cutinase, eine Amylase, eine Galactosidase, eine Pullulanase, eine Cellulase, eine Glucoseisomerase, eine Protein-Disulfid-Isomerase, eine Cyclodextrin-Gluconotransferase, eine Phytase, eine Glucoseoxidase, eine Glucosyltransferase, Lactase, Bilirubinoxidase, eine Xylanase, ein antigenes mikrobielles oder Protozoenprotein, ein bakterielles Proteintoxin, ein mikrobielles Oberflächenprotein oder ein virales Protein ist.
Bakterium nach Anspruch 4, wobei das besagte Exoprotein eine Amylase ist.
Bakterium nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 5, wobei das besagte Exoprotein heterolog, homolog, oder technisch verändert ist.
Verfahren zum Herstellen eines interessierenden Exoproteins, wobei das Verfahren das Exprimieren des besagten Exoproteins in einem gram-positiven Bakterium gemäß einem beliebigen der vorangehenden Ansprüche umfasst.
Verfahren zum Verbessern der Sekretion eines Exoproteins in einem grampositiven Bakterium, wobei das besagte Verfahren das Transformieren eines grampositiven Bakteriums, welches ein interessierendes Exoprotein sekretiert, mit einem geeigneten Polynukleotidkonstrukt umfasst, was ein transformiertes Bakterium ergibt, welches umfasst (a) mehrere Gene, die PrsA-Protein im Chromosom kodieren; (b) ein Wildtyp-Gen, das PrsA-Protein im Chromosom kodiert und ein Gen, das PrsA-Protein auf einem Plasmid kodiert; und/oder (c) veränderte regulatorische Elemente, um Expression eines PrsA-Proteins zu erhöhen.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Bakterium von einer Art der Gattung Bacillus ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Bacillus Bakterium von einer Art ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis und Bacillus thuringiensis ist.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 8 bis 10, wobei das besagte interessierende Exoprotein eine Protease, eine Lipase, eine Cutinase, eine Amylase, eine Galactosidase, eine Pullulanase, eine Cellulase, eine Glucoseisomerase, eine Protein-Disulfid-Isomerase, eine Cyclodextrin-Gluconotransferase, eine Phytase, eine Glucoseoxidase, eine Glucosyltransferase, Lactase, Bilirubinoxidase, eine Xylanase, ein antigenes mikrobielles oder Protozoenprotein, ein bakterielles Proteintoxin, ein mikrobielles Oberflächenprotein oder ein virales Protein ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das besagte interessierende Exoprotein eine Amylase ist.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 8 bis 12, wobei das besagte Exoprotein heterolog, homolog oder technisch verändert ist.