DE3017372A1

DE3017372A1 - Physiologisch aktive polysaccharide, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung

Info

Publication number: DE3017372A1
Application number: DE19803017372
Authority: DE
Inventors: Kumpei Kitamura; Shigeru Matsuki; Kozo Tanabe
Original assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Current assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Priority date: 1979-05-08
Filing date: 1980-05-07
Publication date: 1980-11-20
Also published as: FR2455893A1; FR2455893B1; US4313934A; GB2048918B; GB2048918A

Description

KIRIN BEER KABUSHIKI KAISHA, Tokyo, Japan

Physiologisch aktive Polysaccharide, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung.

Die Erfindung betrifft eine physiologisch aktive Substanz, die in V/asser löslich und von Hefezellenwänden abgeleitet ist, ferner ihre Herstellung sowie ein Chemotherapeutikum, wie beispielsweise ein Karzinostatikum oder Antitumormittel und ein Interferon induzierendes Mittel.

Zur Herstellung von karzinostatischen Substanzen aus Hefezellen ist schon eine Anzahl von Verfahren bekannt, von denen die meisten darin bestehen, daß man Hefezellen einer Behandlung mit heißem Wasser oder Alkali oder einer Autolysebehandlung _·. unterwirft und aus den Lösungsfraktionen wasserlösliche karzinostatische Substanzen gewinnt. Diese Verfahren nutzen jedoch die Hefezellen nur zu einem geringen Grad aus und sind von Schwierigkeiten begleitet, wie beispielsweise der Behandlung von Abwasser, die nicht zu vernachlässigen sind.

Die Verfahren zur Herstellung karzinostatischer Substanzen aus Hefezellwänden selbst sind beispielsweise aus der JA-AS 15 712/1972 und der JA-OS 44614/1978 bekannt. Aus der erstgenannten Literaturstelle ist es bekannt, eine bestimmte Hefe Behandlungen zu unterwerfen, die im wesentlichen aus Autolyse, enzymatischer Behandlung und Behandlung mit warmem, schwach alkalischem Medium, sowie der Gewinnung der erhaltenen Zellwandfraktion sowie der Behandlung der Fraktion mit starkem Alkali unter Erhitzung bestehen. Aus der zweiten Literaturstelle ist es

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bekannt, eine wasserunlösliche Fraktion als Antitumormittel zu verwenden, die durch Entfernen eines wasserlöslichen Extraktes von dem Autolyseprodukt aus Bier hefen erhalten worden ist. Die zuletzt genannte karzinostatische Substanz ist selbstverständlich wasserunlöslich. Die karzinostatische Substanz , die bei dem ersten Verfahren erhalten worden ist, wird als wasserlöslich und als karzinostatisches hochmolekulares Polysaccharid beschrieben, das lediglich aus Glukoseeinheiten besteht. Die Substanz geliert jedoch in neutralem oder saurem,wässrigen Medium, und die gelierte Substanz ist in wässrig-alkalischem Medium löslich (vergl. Spalte 3, Zeilen 33 bis 36 der oben genannten JA-AS 15 712/1972,1.

Die karzinostatischen Aktivitäten dieser karzinostatischen Substanzen, die sich von Hefezellen ableiten, sind lediglich für den Fall des festen Mäusetumors Sarkom 180 beschrieben, wofür die Substanzen intraperitoneal den Mäusen verabreicht worden sind. Die Einzelheiten der Y/irkungen gegenüber anderen Tumoren und / bzw.bei anderen Verabreichungsweisen der Substanzen sind nicht klar.

Aufgabe der Erfindung ist es, eine neue , wasserlösliche, physiologisch aktive Substanz herzustellen, die karzinostatische Wirkungen besitzt und sich von Hefezellwänden ableitet.

Gegenstand der Erfindung ist ein physiologisch aktives Polysaccharid, das sich von den Zellwänden von Bierhefe ableitet und folgende Eigenschaften besitzt:

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(1) Elementaranalyse

C 40.9% ^± 1.2%

H 6,0% - 0.2%

N 1.9% - 0.1%

0 50.7% - 1.5%

Asche o.5% - 0.05%

(2) Ein mittleres Molekulargewicht , bestimmt durch Ultrafiltration,von 140,000 bis 220,000 ;

(3) keinen Schmelzpunkt, da bei Polysacchariden im allgemeinen kein Schmelzpunkt beobachtet wird, aber ein Braunwerden des aktiven Polysaccharids bei etwa 265 C und ein Schwarzwerden bei etwa 270⁰C;

(4) eine spezifische Drehung von

_U3_D ²⁵ = +75.0° bis + 55.0° (C = 1.0)

(5) ein UV-Absorptionsspektrum gemäß Fig. 1, in dem keine spezifische Absorption zu beobachten ist;

(6) ein Infrarotabsorptionsspektrum gemäß Fig. 2;

(7) Löslichkeit in Wasser und Unlöslichkeit in Methanol, Äthanol, Äther und Aceton;

(8). eine positive Farbreaktion bei der Anthroil·· ,Molisch¹ sehen, Ninhydrin-, Biuret- und Xanthoprotein-Reaktion;

(9)einenpH-Wert der l%igen wässrigen Lösung von 5,5 bis 6,5;

(10) eine weiße Farbe;

(11) eine Zusammensetzung des Zuckeranteils von 75% bis 86% Mannose und 14% bis 25% Glukose, wobei eine geringe Menge Glukosamin festzustellen ist;

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(12) eine Bindungsstruktur der Zucker, bei der Mannose mit einer cC-Bindung verknüpft ist, da der Zucker durch eine < Mannanase abgespalten wird; und

(13) eine Zusammensetzung des Aminosäureanteils von 26% bis 32% Serin, 16% bis 20% Threonin, 13% bis 1796 Alanin, 1% bis 9% Prolin, 5% bis 7% Glutaminsäure, 3% bis 7% Asparaginsäure, 4% bis 6% Valin, 3& Ms 5% Lysin, 3% bis 4% Glyzin, 2,5% bis 3,5% Isoleucin, 1,5% bis 2,5% Leucin, o,5% bis 1,5% Tyrosin und o,3% bis o,7°o Phenylalanin.

Gegenstand der Erfindung ist weiter ein chemotherapeutisches Mittel in Form eines Karzinostatikums oder Induzierungsmittels für Interferon.

Schließlich ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von physiologisch aktiven Polysacchariden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die un löslichen Anteile der Autolyse von Saccharomyce · -Hefe mit einem Hefezellwände - auflösenden Enzym behandelt und in der erhaltenen lös&ichen Fraktion eine wasserlösliche, physiologisch aktive Substanz gewinnt.

Die durch Autolyse von Sacharomyce und durch enzymatische Behandlung der dabei erhaltenen unlöslichen Fraktion gewonnene wasserlösliche, physiologisch aktive Substanz ist im wesentlichen aus Mannose-Bausteinen zusammengesetzt.

Es wurde gefunden, daß das neue Polysaccharid gegen über dem festen Mäusetumorsarkom 180 nach intraperitonealer Verabreichung sowie gegenüber einigen anderen Tumoren eine karzinostatische Wirkung besitzt. Die Substanz übt ihre karzinostatische Wirkung , wie man annimmt, auf das Immun-

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system der Krebskranken Tiere aus, und diqfkarzinostatische Wirkung wird auch dann beobachtet, wenn das Mittel peroral verabreicht wird, was für seine, tatsächliche Verwendung von großem Vorteil ist. Es wurde weiter gefunden, daß die Substanz eine karzinostatische Wirkung gegenüber dem Asziteshepatom AH 130 von Ratten aufweist. Von diesem Tumor war jedoch allgemein bekannt, daß er nicht von einem Karzinostatikum bekämpft werden kann, dag das Immunsystem unterstützt. Daher wird angenommen, daß in der Wirkungsweise zwischen der vorliegenden Substanz und den herkömmlichen, bekannten karzinostatischen Polysacchariden ein signifikanter Unterschied besteht.

Erfindungsgemäß wird das neue Polysaccharid durch Ausnutzung eines Nebenproduktes bei der Herstellung von Hefeextrakten gewonnen, da die Rückstände nach der Extraktion der Hefeextrakte durch das AutoIyseverfahren als Ausgangsmaterial verwendet werden können; das erfin dungsgemäße Verfahren zur Herstellung der gewünschten Substanz ist außerdem einfach.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Zeichnungen näher erläutert, wobei

Fig. 1 und 2 ein UV- bzw. ein IR-Spektrum der physiologisch aktiven Substanz gemäß der Erfindung und

Fig. 3 (1), (2) und (3) Diagramme , die die Wirkung der physiologisch aktiven Aubstanz gemäß der Erfindung auf das Ascites-Hepatom von Ratten zeigen,

darstellen.

I₀ Herstellung der bei der Autolyse von Hefe erhaltenen unlöslichen Fraktion.

Das AutoIyseverfahren, die dabei erhaltenen un löslichen Materialien und das Verfahren zu ihrer Gewinnung

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- Io -

sind praktisch die gleichen wie bei der herkömmlichen Praxis mit der Abweichung, daß die Hefen Saccharomyce Hefen sind.

Die Saccharomyce -Hefen umfassen beispielsweise Bierhefe, japanische Sake- Hefen, Bäckerhefen und dgl.

Typische Hefen , die bei dem vorliegenden Verfahren verwendet werden, sind Bierhefen und Bäckerhefen. Die spezifischen Hefestämme sind beispielsweise Saccha- ' romycecerevisiae , Saccharomycecarlsbergensis u.dgl.

Die Autolyse der Hefen kann gemäß den Verfahren zur Herstellung herkömmlicher Hefeextrakte durchgeführt werden, Im einzelnen wird die Hefe beispielsweise in Wasser oder einem geeigneten wässrigen Lösungsmittel suspendiert, dem eine geringe Menge eines organischen Lösungsmittels, beispielsweise von Toluol, zugesetzt ist, wonach das Gemisch bei 30⁰C bis 50⁰C 30 bis 60 Stunden lang der Autolyse unterworfen wird. Das erhaltene Autolysereaktionsprodukt wird einem Abtrennungsverfahren unterworfen, wie beispielsweise der Zentrifugierung , um so die unlöslichen Materialien der Autolyse zu erhalten.

Die unlöslichen Materialien der Autolyse , die sich zur Verwendung bei dem Verfahren gemäß der Erfindung eignen, sind die Rückstände, die nach der Extraktion der Hefeextrakte, die als Nebenprodukt beim Verfahren zur autolytisehen Herstellung von Hefeextrakten aus Hefen und vorzugsweise von Bierhefen erhalten worden sind, zurückbleiben.

2. Enzymatische Behandlung.
(1) Hefezellwandauflösende Enzyme.

Die Hefezellwand-auflösenden Enzyme , die sich zur Verwendung bei dem vorliegenden Verfahren eignen, werden

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- li -

durch Enzyme repräsentiert, die durch Arthrobacter-Bakterien hergestellt werden, vorzugsweise durch A. luteus nov.spec.ATCC 21606 (vergl.JA-AS 32674/1972 und 2790/1973, US-PS 3,716,452, GB -PS 1,281,618 oder GB-PS 2,085,426), sowie durch Enzyme, die von Oerskovia-Bakterien erzeugt werden (vergl. J.Bacteriol, Vol. 111, Seite 821, 1972). Andere Hefezellwand-auflösende Enzyme, die Hefenenzymen ähnlich sind, können gewünschtenfalls ebenfalls verwendet werden. V_orzugsweise sind diese Enzyme mindestens teilweise gereinigt worden.

Ein spezifisches Beispiel für diese Enzyme ist die im Handel erhältliche "ZYMOLYASE" ( japanisches Warenzeichen) die ein von Arthrobacter erzeugtes Enzym darstellt, wie Zymolyase 60000.

(2) Enzymatisehe Reaktion.

Eine geeignete Menge (beispielsweise 15 bis 200 Einheiten und vorzugsweise 30 bis 80 Einheiten je Gramm unlösliches Material der Autolyse ) des Enzyms wird einer Suspension zugesetzt, die die unlöslichen Materialien der Autolyse in geeigneter Konzentration (beispielsweise 5% bis 3O?6) enthält. Das Gemisch wird unter Rühren während beispielsweise 0,5 bis 6 Stunden bei beispielsweise einem pH-Wert von 6,0 bis 9,0 und vorzugsweise 7jO bis 8,0 und einer Temperatur von beispielsweise 20⁰C bis 5O⁰C und vorzugsweise 35° bis 45°C reagieren gelassen. Die Ausbeute an karzinostatischer Substanz kann erhöht werden, indem man zuvor die als Ausgangsmaterial verwendeten unlöslichen Bestandteile der Autolyse bei Raumtemperatur 5 bis 60 Minuten lang in wässrig-alkalischer Lösung von einem pH-Wert von nicht unter etwa 12 rührt. Während dieser Behandlung kann ein Sulfit, wie beispielsweise Natriumsulfit oder Kaliumsulfit, oder eine SH-Gruppen enthaltende Verbindung, wie beispielsweise Mercaptoäthanol , die als Promotor

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- iz -

für die Einwirkung der Hefezellwände-lösenden Enzyme bekannt sind, vorhanden sein. Diese schwefelhaltigen Verbindungen können auch in dem Reaktionsgemisch der oben beschriebenen enzymatischen Behandlung vorhanden sein. Die oben erwähnte Enzymeinheit ist in der JA-AS 32674/1972 vollständig beschrieben und wie folgt definiert;

Eine Einheit auflösende Aktivität ist als diejenige Menge definiert, die 30% Abfall in der optischen Dichte bei 800 nm(ODg₀₀) des Reaktionsgemisches unter folgenden Bedingungen bewirkt :

Ein Gemisch aus 1 ml Enzymlösung, 3 ml Bierhefezellsuspension (2 mg Trockengewicht/ml) , 5 ml M/15 Phosphatpuffer vom pH 7,5 und 1 ml Wasser wird unter leichtem Schütteln 2 Stunden lang bei 25°C bebrütet, wonach die OD₃₀₀ des Gemisches bestimmt wird. Als Bezugsflüssigkeit dient 1 ml Wasser anstelle der Enzym lösung.

Prozentuale Abnahme der 0D_Q00 = (°^Dsoo ^^er ^Be~ Zugsflüssigkeit - ODg₀₀ des Reaktionsgemisches) χ 100/ anfängliche 0D_Q00 der Bezugsflüssigkeit.

Nach Ablaufenlassen der Umsetzung während der vorherbestimmten Zeit wird der pH-Wert des Umsetzungs gemisches auf etwa 3,0 bis 6,0 und vorzugsweise etwa 3,5 bis 4,5 eingestellt,, wonach die unlöslichen Materialien durch Zentrifugieren oder dergl. entfernt werden und man eine durchsichtige Lösung erhält. Vor der Gewinnung der karzinostatischen Substanz aus der Lösung wird diese normalerweise in herkömmlicher Weise einer Deproteinierungsbehandlung unterworfen. Die Deproteinierungsbehandlung umfaßt beispielsweise den Zusatz und das Lösen von Trichloressigsäure als einem geeigneten Protein-Ausfällungsmittel in einer derartigen Menge, daß seine Konzentration etwa 2 bis* 4 ?6'beträgt, in der oben erwähnten Lösung, wobei das Gemisch etwa 2 Stunden oder mehr bei niedriger • ' 030047/0778

Temperatur von beispielsweise nicht über 5 C stehen — gelassen und anschließend die erhaltene Ausfällung durch Zentrifugieren, Filtrieren oder dergl. entfernt wird.

Die erhaltene Lösung wird danach mit einen mit Wasser mischbaren, organischen Nichtlösungsmittel , wie beispielsweise Methanol oder Äthanol versetzt, un die anwesende physiologisch aktive Substanz auszufällen. Die erhaltene Ausfällung wird gesammelt und in Wasser ge löst,wonach das oben erwähnte, mit Wasser mischbare organische Nichtlösungsmittel erneut zugesetzt wird, um die Substanz erneut auszufällen. Diese Lösungs^usfällungs-Behandlung kann einmal oder mehrmals durchgeführi; werden, wobei es bevorzugt ist, daß mindestens eine Behandlung unter alkalischen Bedingungen bei einem pH-Viert von 11,0 oder darüber durchgeführt wird, wie in den Ausführungsbeispielen dargestellt. Die Substanz wird weiterhin einer Dialysebehandlung gegen Wasser unterzogen, um niedrigmolekulare Fraktionen zu entfernen. Auf diese Weise wird die physiologisch aktive Substanz in der Fora einer wäss-, rigen Lösung erhalten. Die Lösung wird gefriergetrocknet, um die physiologisch aktive Substanz in Form einer festen Präparation zu erhalten. Die Substanz kann gewünschtenfalls nach herkömmlichen Methoden , wie beispielsweise Gelfiltration oder Ionenaustauschverfahren, weiter gereinigt werden.

3. Physiologisch aktive Substanz. ~ I

Die physiologisch aktive Substanz , die auf diese Weise erhalten wird, wird als Protein-Polysaccharid angesehen, das als Hauptbaustein Mannose enthält und 70% bis 90% Kohlenhydrate sowie o,5 % bis 3,PSi Stickstoff enthält. Die Substanz ist in Wasser löslich, in organischen Lösungsmitteln ,wie Methanol, Äthanol oder Aceton , unlöslich und weist eine positive Farbreaktion bei der Anthron-, Molisch-'sehen,, Ninhydrin- oder Biuretreaktion auf.

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Selbstverständlich unterscheiden sich die genauen physikalischen und chemischen Eigenschaften der Substanz voneinander je nach der Art der Hefe, der Art des Hefezellwand- · lösenden Enzyms und den Verfahren und dem Ausmaß der Reinigung. In jedem Falle besitzt die Substanz eine deutliche karzinostatische Wirkung.

Ό "

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der aktiven Substanz sind eingangs beschrieben worden; die physiologischen Eigenschaften sind wie folgt:

(l) Karzinostatische ',virkung.

a) Wirkung gegenüber Mäusesarkom 180.

5 Wochen alte männliche ddY-Mäuse wurden subkutan mit 5,000,000 Zellen Sarkom 180 in der rechten Leiste beimpft. Vom darauffolgenden Tag an wurde die zu untersuchende Substanz einmal am Tag insgesamt 10 mal den beimpften Mäusen verabreicht, wobei die Verabreichungsweise und die Dosierungen in der folgenden Tabelle I dargestellt sind. 5 Wochen nach der Beimpfung wurden die Mäuse getötet und die Tumoren entfernt. Die entfernten Tumoren wurden gewogen und mit solchen verglichen ,die einer Kontrollgruppe entnommen worden waren, um die prozentuale Inhibierung zu berechnen. Die Ergebnisse sind ebenfalls in der folgenden Tabelle I zusammengefaßt. Zum Vergleich wurde unter denselben Bedingungen das im Handel erhältliche Karzinostatikum aus Coriolus versicolor mit untersucht.

Tabelle

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	Tabelle I	Dosierung (mg/kg)	Inhibierung (# )
		10	74
Karzinostati- sehe Substanz	Applikationsweise	250	52
Erfindungsge mäße Substanz	intraperitoneal	10 250	37 40
	oral
Handelsübliche Substanz	intraperitoneal oral

Die vorliegende Substanz wies bei intraperitonealer oder oraler Anwendung eine karzinostatische Wirkung auf, die derjenigen der im Handel erhältlichen Substanz überlegen war.

b) Wirkung gegen-über dem Ascites-Hepatom von Ratten

Als Tumorzellen wurden AH130, AH66 und AH44 verwendet. Männliche Donryu-Ratten ( etwa 150 g) wurden als Test tiere verwendet. In die Schwanzvenen der Ratten wurden etwa 10,000,000 Tumorzellen eingeimpft. Drei Tage nach der Beimpfung wurde die vorliegende Substanz, in physiologischer Kochsalzlösung gelöst, in einer täglichen Dosierung von 100 mg/kg zehn Tage lang einmal täglich verabreicht. Die prozentuale Uberlebensrate der Ratten wurde während 60 Tagen nach der Beimpfung beobachtet, und man erhielt die in den Figuren 3 (1) , (2) und (3) dargestellten Ergebnisse . Diese Figuren erläutern' in der angegebenen Reihenfolge die Antitumorwirkungen gegenüber Ascites'-Hepatom 130, Ascites-Hepatom 66 bzw. Ascites-Hepatom 44 . Die ausgezogenen Kurven repräsentieren die Fälle, in denen die Gruppen mit der vorliegenden Substanz behandelt worden sind,

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während sich die gestrichelten Kurven auf die Vergleichsgruppen beziehen, die mit physiologischer Kochsalzlösung allein behandelt worden waren. Keine der Vergleichs — gruppen erreichte eine Überlebensrate von 20 Tagen. Die mit der vorliegenden Substanz behandelten Gruppen überlebten 60 Tage nach der Beimpfung, und zwar im Falle von AH130 und AH44 zu 50 % und im Falle von AH66 sogar zu 83?6. Unter den gleichen Bedingungen wurde auch das im Handel erhältliche Karzinostatikum aus Coriolus versicolor untersucht. _ Unterschiede in der prozentualen Überlebensrate zwischen den Gruppen , die mit der Substanz behandelt worden waren, und den Vergleichsgruppen wurden hierbei nicht beobachtet.

c) Interferon-induzierende Wirkung.

Die vorliegende Substanz wurde intraperitoneal in einer Dosierung von 100 mg/kg männlichen , 7 Wochen alten C3H Mäusen verabreicht. 24 Stunden nach der Verabreichung wurde jeder Maus Blut entnommen, um in dem Blutserum den Interferongehalt festzustellen. Der Gehalt an induziertem Interferon in 1 ml. Serum betrug 800 internationale Einheiten. Das im Handel erhältliche Karzinostatikum aus Coriolus versicolor wurde unter denselben Bedingungen untersucht, um seine Interferon-induzierende Wirkung festzustellen. Der dabei erhaltene Interferongehalt in 1 ml Serum betrug 200 internationale Einheiten oder darunter.

Dosierungsform.

Ein Chemotherapeutikum, wie beispielsweise ein Karzinostatikum oder Induzierungsmittel für Interferon , das die oben erwähnte physiologisch aktive Substanz als Wirksubstanz enthält, kann in jeder Beliebigen,geeigneten Dosierungsform angewandt werden. Das Chemotherapeutikum enthält eine pharmakologisch wirksame Menge der aktiven Komponente sowie einen pharmakologisch annehmbaren Träger.

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Wenn die Substanz in Pulverform vorliegt,sind
Pulver, Tabletten mit geeigneten Exzipientien und
dgl. geeignet.

Da die Substanz wasserlöslich ist, kann sie auch
in Form einer flüssigen Arznei , die in Wasser gelöst
ist, verabfolgt werden.

Das chemotherapeutische Mittel kann je nach seiner Dosierungsform 'oral , durch Injektion, rektal oder auf andere geeignete Weise verabreicht werden.

Dosierung.

Die spezifische Dosierung muß von einem Arzt in
Anbetracht der Bedingungen und des Zustandes des Patienten u.dgl. bestimmt werden. Im allgemeinen liegt die Dosieimg bei et\^a 20 bis etwa 200 mg/kg pro Tag.

Toxizität.

Die akute Toxizität in Mäusen wurde wie folgt untersucht :

5 ,-Wochen alte dd-Mäuse mit Körpergewichten von 20g bis 27g wurden oral oder intraperitoneal mit der vorliegenden Substanz behandelt. Das Überleben oder der Tod und die Symptome der Mäuse wurden 7 Tage lang nach Verabreichung des Mittels beobachtet. Es wurde festgestellt, daß selbst bei der maximalen Dosis , die technisch verabfolgt werden kann, kein Tier eingegangen ist. Der LD₅₀" Wert für orale oder intraperitoneale Verabreichung wurde zu 5,000 mg/kg oder darüber ermittelt.

4„ Versuche .

In den folgenden Beispielen wurde als Hefezellwandlösendes Enzym Zymolyase 60000 verwendet. Als Ausgangsmaterial wurde der Rückstand verwendet, der als Neben produkt bei der Herstellung von Hefeextrakten durch Autolyse von Bierhefe der Kirin Brauerei Company Ltd. erhalten

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worden ist.

Beispiel 1

Aus 200 g Ausgangsmaterial wurden mit Wasser zwei Liter Suspension hergestellt, in der 25,6 g Natriumsulfit gelöst wurden. Das Gemisch wurde auf einen pH-Wert von 8,0 gebracht und mit 200 mg des Enzyms versetzt. Die Umsetzung wurde unter Rühren während drei Stunden bei 38⁰C durchgeführt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde das Umsetzungsgemisch mit Salzsäure auf pH 4,0 eingestellt und anschließend zentrifugiert. Der überstehenden Flüssigkeit wurden 2,5 % des erhaltenen Gemisches an Trichloreesigsäure zugesetzt und das ganze bei 2°C über Nacht stehen gelassen.

Die ausgefällten Niederschläge wurden durch Zentrifugieren abgetrennt. Der Flüssigkeit wurde die zweifache Menge Äthanol zugesetzt, um eine Ausfällung hervorzurufen. Die Ausfällungen wurden gesammelt und erneut in Wasser gelöst sowie mit der zweifachen Menge Äthanol versetzt, um erneut Niederschläge hervorzurufen. Die erhaltenen Niederschläge wurden gesammelt und in Wasser gelöst. Die Lösung wurde mit Natronlauge auf pH 12 eingestellt und diese Lösung abermals mit der zweifachen Menge Äthanol versetzt, um eine Ausfällung hervorzurufen. Die Niederschläge wurden gesammelt und erneut in Wasser gelöst.

Die erhaltene Lösung wurde auf neutralen pH-Wert gebracht und anschließend gegen Leitungswasser dialysiert, wonach sie einen Tag lang gegen reines Wasser dialysiert wurde. Unlösliche Materialien in der inneren Dialyseflüssigkeit wurden durch Zentrifugieren entfernt, und die Flüssigkeit wurde gefriergetrocknet. Die Ausbeute an erhaltener physiologisch aktiver Substanz betrug 21,6 g.

-19 Beispiel 2

Aus 200 g Ausgangsmaterial wurden mit Wasser zwei Liter Suepension hergestellt. Die Suspension wurde mit Natronlauge auf pH 13 eingestellt und anschließend", bei Raumtemperatur 30 Minuten lang gerührt. Danach wurde sie mit Salzsäure auf pH 8,0 eingestellt und mit 500 mg des Enzyms versetzt. Das erhaltene Gemisch wurde unter Rühren bei 38°C drei Stunden lang reagieren gelassen. Nach Beendigung der Reaktion erhielt man 17,3 g physiologisch aktiver Substanz aus dem Reaktionsgemisch in der in Beispiel 1 angegebenen Weise.

Beispiel 3

200 g Ausgangsmaterial wurden in Wasser suspendiert» Die Suspension wurde mit 25,6 g Natriumsulfit versetzt und anschließend mit Natronlauge auf pH 12,8 eingestellt, wonach sie 10 Minuten bei Raumtemperatur gerührt wurde. Danach wurde sie mit Salzsäure auf pH 8,0 eingestellt und mit 500 mg Enzym versetzt. Die Umsetzung wurde 3 Stunden lang bei 38°C ablaufen gelassen. Nach Beendigung der Umsetzung erhielt man aus dem Umsetzungsgemisch in der gleichen Weise,wie in Beispiel 1 beschrieben, 30,5 g physiologisch aktive Substanz.

Beispiel 4

Aus 40 g Ausgangsmaterial wurden mit Wasser 400 ml Suspension hergestellt, die mit Natronlauge auf pH 8,0 eingestellt und anschließend mit 27 mg des Enzyms ver setzt wurde. Das Gemisch wurde zwei Stunden lang unter Rühren bei 35° C reagieren gelassen. Nach Beendigung der Umsetzung erhielt man aus dem Reaktionsgemisch in der gleichen Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, 4,3g physiologisch aktive Substanz.

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Die Prozentangaben , Verhältnisse und dergl. in vorstehenden Ausführungen beziehen sich auf das Gewicht, sofern nicht anders angegeben.

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Claims

Patentanwä] ft: Reichel u. Reichel ? η 1 7 3 7 3 Parksiraße 13 O U 1 / O / Z 6000 Frankfurt a. M. 1 9645 KIRIN BEER KABUSHIKI AKISHA, Tokyo,Japan Patentansprüche

1. Physiologisch aktives Polysaccharid aus den Zellwänden von Bierhefe,
gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften :

(1) die folgende Elementaranalyse: C 40.9% - 1.2%

H 6.0% t 0.2% N 1.9% ± 0.1% O 50.7% ± 1.5% Asche 0.5% ± o.05.%

(2) ein mittleres Molekulargewicht,bestimmt durch Ultrafiltration,von 140,000 bis 220,000;

(3) das Nichtvorhandensein eines Schmelzpunktes, jedoch durch Braunwerden des Polysaccharids bei etwa 265⁰C und durch Schwarzwerden bei etwa 270°C;

(4) eine spezifische Drehung von

25
6<!d = + 75.0° bis + 55.0° (C = 1.0);

(5) das in Fig. 1 dargestellte UV-Spektrum, bei dem keine spezifische Absorption beobachtet wird;

(6) das in Fig. 2 dargestellte IR-Spektrum ;

ORIGINAL INSPECTED

(8) eine positive Farbreaktion bei der Anthron-, Molisch^!~. sehen, Ninhydrin-,Biuret- und Xanthoprotein-Reaktion;

(9)einaipH- Wert der 1%igen wässrigen Lösung von 5,5 bis 6,5 ;

(10) eine weiße Farbe;

(11) eine Zusammensetzung :des Zuckeranteils aus 75 % bis 86% Mannose und 14% bis 25% Glukose, wobei eine geringe Menge Glukosamin festgestellt wird;

(12) eine Bindungsstruktur des Zuckers, gemäß der Mannose durch eine c<l -Bindung gebunden ist, da der Zucker durch eine <*—Mannanase in Freiheit gesetzt wird; und

(13) eine Zusammensetzung des AmminoSäureanteils aus

26% bis 32% Serin, 16% bis 20% Threonin, 13% bis 17% Alanin, 7% bis 9% Prolin, 5% bis 7% Glutaminsäure, 5% bis 7% Asparaginsäure, 4% bis 6% Valin, 3% bis 5% Lysin, 3% bis 4% Glyzin, 2,5% bis 3,5 % Isoleucin, 1,5% bis 2,5% Leucin, 0,5% bis 1,5% Tyrosin und 0,3% bis o,7% Phenylalanin.

2. Chemotherapeutisches Mittel , enthaltend eine karzinostatisch wirksame Menge des Polysaccharids gemäß Anspruch 1, sowie einen pharmakologisch annehmbaren Träger.

3. Chemotherapeutisches Mittel, enthaltend eine zur Erhöhung des Interferon-Gehaltes wirksame Menge des Polysaccharids gemäß Anspruch 1 und einen pharmakologisch annehmbaren Träger.

4. Verfahren zur Herstellung eines physiologisch aktiven Polysaccharids,

dadurch gekennzeichn et, daß man ein Hefezellwand-lösendes Enzym auf'ein bei

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der Autolyse von Saccharomyces erhaltenes unlösliches Material einwirken läßt und ein wasserlöslxches , physiologisch aktives Polysac.charid in der erhaltenen Lösungsfraktion gewinnt.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hefe Bier- oder Bäckerhefen verwendet.

6. Verfahren gemäß Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hefezellwand -lösendes Enzym ein von den Bakterienarten Arthrobacter oder Oerskovia erzeugtes Enzym verwendet.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hefezellwand-lösendes Enzym ein vom Bakterium Arthrobacter ATCC 21606 erzeugtes Enzym verwendet.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4 bis 7» dadurch gekennzeichnet, daß man 15 bis 200 Einheiten des Enzyms je Gramm bei der Autolyse von Hefe erhaltenen unlöslichen Materials einer Suspension zusetzt, die 5% bis 30% des unlöslichen Materials enthält, und daß man die Umsetzung bei einem pH-Wert von 6,0 bis 9,0 und einer Temperatur von 20°C bis 50⁰C durchführt.

9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man ein durch Autolyse von Hefe erhaltenes unlösliches Material verwendet, das bei Raumtemperatur 5 bis Minuten mit einer alkalischen wässrigen Lösung von einem pH-Wert von 12 oder darüber in Berührung gebracht worden war.

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10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man nach Beendigung der enzymatischen Umsetzung den pH -Wert des Reaktionsgemisches auf 3,0 Ms 6,0 einstellt, unlösliches Material entfernt und eine Lösung des gewünschten physiologisch aktiven PoIysaccharids gewinnt.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10,
dadurch gekennzeichnet, daß man die Lösung des gewünschten physiologisch aktiven Polysaccharids mit einem mit Wasser mischbaren organischen Nichtlösungsmittel versetzt, um das physiologisch aktive Polysaccharid auszufällen.

12. Verfahren gemäß Anspruch 11,
dadurch gekennzeichnet, daß man das erhaltene physiologisch aktive Polysaccharid reinigt, indem man das Polysaccharid mindestens einmal in Wasser löst und die Lösung mit einem mit Wasser mischbaren , orgnischen Nichtlösungsmittel zur Ausfällung des Polysaccharids versetzt.

13. Verfahren gemäß Anspruch 12,
dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens eine der Reinigungsbehandlungen unter alkalischen Bedingungen eines pH-Wertes von 11 oder darüber durchführt.

14. Verfahren gemäß Anspruch 13,
dadurch gekennzeichnet, daß man das in Anspruch 1 gekennzeichnete physiologisch aktive Polysaccharid gewinnt.

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