DE2146674C3 - Faktor und seine Verwendung als Arzneimittel - Google Patents

Description

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Bei vergleichenden Untersuchungen bezüglich der Fähigkeit zur Enzyminduktion von gewöhnlichen Tieren und keimfreien Tieren wurde festgestellt, daß die Fähigkeit zur Enzyminduktion bei keimfreien Tieren geringer ist als bei den entsprechenden gewöhnlichen Tieren. Eine weitere Untersuchung des dabei beteiligten Mechanismus ergab, daß bei der Züchtung eines aus den Fäzes einer gewöhnlichen Albinoratte isolierter Mikro-Organismus sowohl intrazellulär als auch extrazellulär ein neues Peptid angereichert wird, das die Induktion der Tyrosin-Transaminase verstärkt und auch andere durch Cortison bewirkte Enzyminduktionen beeinflußt. Ferner wurde festgestellt, daß dieser durch Züchtung b ..»timmter Mikroorganismen hergestellte Faktor neben seiner Fähigkeit zur Enzyminduktion auch ausgezeichnete blutdrucksenkende Eigenschaften aufweist und spezifisch von bestimmten Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae produziert wird.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, einen neuen Faktor zur Verfügung zu stellen, der die durch Cortison bewirkte Enzyminduktion verstärkt und blutdrucksenkende Eigenschaften hat. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man Proteus mirabilus ATCC 21718, Proteus morganii ATCC 21720 oder Proteus mirabilis Hauser ATCC 21721, in üblicher Weise in einem wäßrigen Nährmedium, das eine Kohlenstoff- und eine Stickstoffquelle und anorganische Salze enthält, züchtet, die Zellen abfiltriert oder abzentrifugiert, in Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung suspendiert, aufbricht und extrahiert, den wäßrigen Zellextrakt mit dem Filtrat oder dem bei der Zentrifugation erhaltenen Überstand vereinigt, mit Perchlorsäure oder Trichloressigsäure deproteinisiert und zentrifugiert, den deproteinisierten Extrakt bei pH-Wert 3 bis 7 mit Aktivkohle behandelt, die beladene Aktivkohle abtrennt und das Adsorbat mit einem Gemisch aus gleichen Volumteilen 0,2 η Kalilauge und Aceton eluiert, das Eluat neutralisiert und einengt, das erhaltene Konzentrat der Säulenehromatographie an Dextrangel unterwirft und die Fraktionen mit einer Tyrosin-Transaminase induzierenden Aktivität sammelt

Der erfindungsgemäße Faktor weist folgende Eigenschaften auf:

a) Er ist ein leicht gelbliches, stark hygroskopisches Pulver.

b) Er löst sich leicht in Wasser unter Bildung einer klaren gelben Lösung und zeigt eine positive Ninhydrin-, Folin-Ciocalteu- und Cystein-Schwefelsäure-Reaktion.

c) Er hat die in F i g. 1 und F i g. 2 dargestellten UV- und IR-Absorptionsspektren mit charakteristischen Absorptionen im ultravioletten Bereich in Wasser bei 263 nm und im infraroten Bereich im KBr-Preßling bei 3300, 1650, 1530, 1390, 1040 und 830 cm-'.

d) Er eignet sich nicht zur Durchführung einer Elementaranalyse, da er einer zweistufigen Zersetzung unterliegt.

e) Soin durch Gelfiltration an Dextrangel bestimmtes Molekulargewicht liegt im Bereich zwischen dem Molekulargewicht von Vitamin Bu (1357) und Cytoehrom C (13000).

Der erfindungsgemäße Faktor läßt sich chromatographisch weiter reinigen und lyophilisieren.

Wenn der erfindungsgemäße Faktor an einer Kationenaustauschersäule in der H+-Form mit 2,5 cm Durchmesser und 10 cm Länge bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 3 ml/10 Minuten Chromatographien wird, zeigt sich, daß der Faktor aus mindestens zwei Komponenten besteht, die sich in ihren physiologischen Eigenschaften in geringem Maße unterscheiden. Die mit 0,01 η Salzsäure eluierbare Komponente wird als Komponente N und die mit 2 η wäßriger Ammoniaklösung eluierbare Komponente als Komponente A bezeichnet. In Tabelle I sind verschiedene Eigenschaften der Komponenten A und N zusammengestellt.

Tabelle I

Komponente N

Komponente A

Ninhydrin + + + + +

Folin-Ciocalteu + + + + +

Orcin + + + +

Anthron + + + —

Elson-Morgan — —

Verhältnis der optischen 1,3 3,8
Dichte bei 260 und 280 nm

Fluoreszenz + + + + +

Bei der aufsteigenden Papierchromatographie mit n-Butanol : Essigsäure : Wasser im Volumverhältnis von 4:1:5 als Fließmittel zeigt die Komponente A drei Flecken, die mit Ninhydrin eine Färbung ergeben, und zwei Flecken, die bei Bestrahlung mit Manaslu-Licht von 3000 Ä fluoreszieren. Die Rf-Werte dieser Flecken sind in Fig. 10 dargestellt. Der physiologisch aktive Bestandteil der Komponente A, d. h. die gereinigte Komponente A, entspricht dem Ninhydrin-positiven Fleck mit einem Rr-Wert von 0,15 bis 0,20. Das durch Gelfiltration an Dextrangel bestimmte Molekularge-

wicht dieser Komponente liegt im Bereich zwischen dem Molekulargewicht von Vitamin B12 (1357) und dem Kallikrein-Trypsin-Inhibitor (6000). Das Molekulargewicht wird an mit Epichlorhydrin verneu:tem Dextrangel (Typ G-25) in einer Säule mit 1,8 cm Durchmesser und 65 cm Höhe bei einer DurchfluSgeschwindigkeit von 10 Tropfen/Minute mit Wasser als Elutionsmittel

Tabelle II

bestimmt Bei der Elementaranalyse werden ohne Berücksichtigung von Schwefel und Sauerstoff die Werte C 30,32 Prozent, H 5,23 Prozent und N 12,77 Prozent bestimmt Die chemischen Eigenschaften und die Ergebnisse der Aminosäureanalyse nach der Stein-Moore-Methode des gereinigten Faktors A sind in Tabelle II zusammengestellt

Gereinigter Faktor A	Aminosäuren-Verhältnis	3
Chemische Eigenschaften	Asparaginsäure	12-13
Ninhydrin*)-Reaktion + +	Glutaminsäure+Glutamin	7
Elson-Morgan-Reaktion —	Glycin	2
Orcin-Reaktion —	Alanin	3
Anthron-Reaktion —	Cystein	4
Organisch gebundener Phosphor —	Methionin
Fluoreszenz —

*) Das Ninhydrin-Reagenz wird durch Auflösen von 50 mg Ninhv-lrin ir. einem Gemisch aus 30 ml Äthanol, 10 ml Essigsäure und 4 ml Collidin hergestellt Die Färbung wird nach 5minütigem Erhitzen au? 8O⁰C bestimmt

Die gereinigte Komponente A weist die in F i g. 3 bzw. Fig.4 dargestellten UV- bzw. IR-Spektren mit charakteristischen Absorptionen im ultravioletten Bereich in Wasser bei 263 nm und im KBr-Preßling bei 3180, 1650, 1400, 1050, 785 und 520 cm-' auf.

Die bei der Herstellung des erfindungsgemäßen Faktors eingesetzten Stämme werden unter Bedingungen fermentiert, die üblicherweise bei der Fermentation gewöhnlicher Bakterienarten angewandt werden. Nach beendeter Fermentation werden die Bakterienzellen abfiltriert oder abzentrifugiert Die Zellen werden dann in Wasser oder einer physiologischen Kochsalzlösung suspendiert Die suspendierten Zellen werden nach üblichen Methoden, z. B. durch Ultraschallbehandlung, aufgebrochen und extrahiert. Der wäßrige Zellextrakt wird mit dem Filtrat oder dem bei der Zentrifugation erhaltenen Überstand vereinigt, durch Zusatz von Perchlorsäure oder Trichloressigsäure deproteinisiert und zentrifugiert Der Überstand wird dann auf einen pH-Wert von pH 3 bis 7 eingestellt und mit Aktivkohle behandelt, wobei der im Überstand enthaltene Faktor adsorbiert wird

Die mit dem Faktor beladene Aktivkohle wird mit einem Gemisch aus gleichen Volumteilen 0,2 η Kalilauge und Aceton eluiert. Nach dem Neutralisieren und Einengen des Eluats wird das erhaltene Konzenfat der Säulenchromatographie an Dextrangel unterworfen und die Fraktionen mit einer Tyrosin-Transaminase induzierenden Aktivität gesammelt.

Zur Bestimmung der aktiven Fraktionen wird jede von der Dextrangel-Säule eluierte Fraktion intraperitoneal an männliche Albinoratten vom Wistar-Imamichi-Stamm verabreicht. Die Ratten werden 5 Stunden später getötet, und die Tyrosin-Transaminase- eo Aktivität in der Leber wird gemäß dem im nachstehenden Versuch 1 beschriebenen Verfahren bestimmt Die aktiven Fraktionen, die eine Tyrosin-Transaminase induzierende Aktivität aufweisen, werden vereinigt

Der erfindungsgemäße Faktor verstärkt die durch Cortison bewirkte Enzyminduktion, insbesondere die Induktion der Tyrosin-Transaminase, und kann an Stelle von oder in Kombination mit Cortison zur Behandlung von beispielsweise Rheumatismus, Allergie oder Entzündungen verwendet werden. Dadurch wird die anzuwendende Cortisonmenge herabgesetzt Dies wirkt sich vorteilhaft aus, da Cortison trotz seiner guten pharmakologischen Wirkungen verschiedene Nebenwirkungen aufweist. Der Faktor hat ferner eine ausgezeichnete blutdrucksenkende Wirkung.

Der erfindungsgemäße Faktor ist daher ein wertvoller Arzneistoff. Er kann sowohl in Form der vorstehend erhaltenen Lösung oder in Form einer konzentrierten Lösung verwendet und oral oder intravenös gegeben werden.

In F i g. 1 und F i g. 2 sind die UV- bzw. IR-Absorptionsspektren des erfindungsgemäßen Faktors (Gemisch aus den Komponenten N+ A) in Wasser bzw. im KBr-Preßling dargestellt.

In Fig.3 und Fig.4 sind die UV- bzw. IR-Absorptionsspektren der gereinigten Komponente A in Wasser bzw. im KBr-Preßling dargestellt.

In F i g. 5, F i g. 6 und F i g. 7 sind die enzyminduzierenden Wirkungen des erfindungsgemäßen Faktors (Gemisch aus den Komponenten N +A) dargestellt.

In F i g. 8 ist ein Elutionsdiagramm der Komponenten N und A dargestellt. Die Absorption bei 260 nm ist durch eine —0—0— -Linie, die Absorptionsdifferenz bei 415 und 380 nm nach der Cystein-Schwefelsäure-Reaktion durch eine — Δ— - — Δ— -Linie und die Absorption bei 750 nm nach der Folin-Ciocalteu-Reaktion durch eine - - χ — χ - - -Linie angegeben.

In Fig.9a, 9b und 9c sind die blutdrucksenkenden Wirkungen der Komponenten N und A und der gereinigten Komponente A dargestellt.

In Fig. 10 ist ein Papierchromatogramm der Komponente A dargestellt.

Obwohl die genaue Zusammensetzung des erfindungsgemäßen Faktors noch nicht bestimmt ist, lassen die vorstehend beschriebenen physikochemischen Eigenschaften auf ein Peptid schließen. Der Faktor hat die nachstehend beschriebenen biologischen Eigenschaften.

In den folgenden 4 Versuchen wird ein Gemisch aus

den Komponenten N und A verwendet, der durch Züchtung von Proteus mirabilis Hauser ATCC 21721 gebildet worden ist.

Versuch 1

Induktion der Tyrosin-Transaminase bei Verabreichung eines Gemisches aus den Komponenten N und A

1 ml einer Lösung des erfindungsgemäßen Gemisches aus den Komponenten N und A, die soweit mit Wasser verdünnt wurde, daß die Absorption der Lösung bei 260 nm 2000 beträgt, wird an männliche Albinoratten vom Wistar-Imamichi-Stamm mit einem Körpergewicht von 100 bis 120 g intraperitoneal verabreicht. 3 Stunden später werden die Ratten getötet, die Lebern herausgenommen und mit einer lOprozentigen Rohrzuckerlösung homogenisiert. Kontrollversuche werden unter Verabfolgung von physiologischer Kochsalzlösung durchgeführt.

Die Transaminaseaktivität der erhaltenen Enzymlösungen wird nach dem von Rosen et al. angegebenen Verfahren (vgl. J. Biol. Chem., Bd. 238 (1963), S. 3725 bis 3729) bestimmt. Dazu werden 0,2 ml der Enzyinlösung mit 0,5 ml 0,2 m Kaliumphosphatpuffer (pH 8), 0,2 ml (5 μΜοΙ) Tyrosin in 0,2 η Natronlauge, 0,1 ml 0,4 η Salzsäure, 0,1 ml (50 μg) Pyridoxalphosphat und 0,8 ml Wasser versetzt. Das Gemisch wird 5 Minuten bei 37° C vorinkubiert und dann mit 0,1 ml (ΙΟμΜοΙ) «-Ketoglutarsäure versetzt und anschließend 10, 20 oder 30 Minuten inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,5 ml 25prozentiger Trichloressigsäure beendet, und das Gemisch wird 5 Minuten bei 3000 UpM zentrifugiert. Anschließend wird in der erhaltenen klaren Lösung die entstandene p-Hydroxyphenylbrenztraubensäure bestimmt. Dazu wird 1 ml der klaren Lösung mit 0,5 ml einer 3prozentigen Lösung von Ammoniummolybdat in 5 η Salzsäure, 0,5 ml lprozentiger Kaliumdihydrogenphosphatlösung und 1,5 ml Wasser versetzt. Nach 20minütiger Inkubation bei 37°C wird die Absorption bei 700 abgelesen. Die Ergebnisse sind in F i g. 5 dargestellt Aus diesem Versuch ergibt sich, daß durch Verabreichung eines Gemisches aus den Komponenten N und A die Tyrosin-Transaminase verstärkt induziert wird.

Versuch 3

Aktivität der Tyrosin-Transaminase in Abhängigkeit von der Dosis des Gemisches aus den Komponenten N und A

Zur Bestimmung der Beziehung zwischen der Dosis des Faktors und der Aktivität der Tyrosin-Transaminase wird jeweils 1 ml einer Lösung des Faktors mit verschiedenen Konzentrationen an männliche, 250 bis 300 g schwere Albinoratten vom Wistar-Imamichi-Stamm (vier Ratten pro Gruppe) intraperitoneal verabreicht. Die Aktivität der Tyrosin-Transaminase erreicht bei Verabreichung von 1 ml einer Lösung des erfindungsgemäßen Faktors mit einer Konzentration von 2000, ausgedrückt als Absorption bei 260 nm, ihr Maximum. Die Ergebnisse sind in Fi g. 7 dargestellt.

Versuch 4
Untersuchungen an adrenalektomierten Ratten

Wenn an Ratten, denen die Nebennieren entfernt wurden, nur der erfindungsgemäß hergestellte Faktor verabreicht wird, wird keine Induktion der Tyrosin-Transaminase beobachtet, während bei Verabreichung des Faktors in Kombination mit Cortison (Triamcinolon) eine starke Induktion der Tyrosin-Transaminase festgestellt wird. Bei diesem Versuch wird der Faktor in der im Versuch 2 verwendeten Menge und Triamcinolon in einer Menge von 1 mg/100 g Körpergewicht verabreicht. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt.

Tabelle III

Anzahl Tyrosin-Trans-

der aminase-Aktivität +

Albino- Standardabweichung,

ratten Einheiten/mg

Physiologische Koch- 3
salzlösung

Erfindungsgemäß her- 3
gestellter Faktor

Triamcinolon 4

Triamcinolon + erfin- 4
dungsgemäß hergestellter Faktor

0,31 ±0,02
0,49 ±0,06

5,07 ±0,85
7,13 ±0,86

Versuch 2

Wirkung des Gemisches aus den Komponenten N und A in Abhängigkeit von der Zeit

1 ml einer Lösung des Gemisches aus den Komponenten N und A, die soweit mit Wasser verdünnt wurde, daß die Absorption der Lösung bei 260 nm 2000 beträgt, wird an männliche, 200 bis 250 g schwere Albinoratten vom Wistar-Imamichi-Stamm (vier Ratten pro Gruppe) intraperitoneal verabreicht. Die Tyrosin-Transaminase-Aktivität in der Leber erreicht 5 Stunden nach der Verabreichung des Faktors ihr Maximum. Die Ergebnisse sind in F; g. 6 dargestellt Die Tyrosin-Transaminase-Aktivität wird dabei in Einheiten pro mg Leberprotein angegeben. Eine Einheit entspricht der Bildung von 1 uMol p-Hydroxyphenylpyrvvat/Std Das gebildete p-Hydroxyphenylpyruvat wird spektrophotometrisch bei 700 nm bestimmt Eine 1 nm Lösung von p-Hydroxyphenylpyruvat weist eine Extinktion von 1,36 auf. Die Komponenten A und N bewirken bei Albinoratten, denen die Nebennieren entfernt wurden, eine Verstärkung der Induktion der Tyrosin-Transaminase in der Leber und der Transaminase verzweigter Aminosäuren, während bei normalen Albinoratten nur die Komponente A eine Aktivität bezüglich der Induktion der Tyrosin-Transaminase in der Leber zeigt, und nur die Komponente N eine Hemmwirkung auf die durch Verabreichung von Glucagon bewirkte Induktion der Serin-Dehydrogenase in der Leber aufweist Die Komponente A beeinflußt die Induktion der Serin-Dehydrogenäse in der Leber nicht Die Komponenten N und A beeinflussen die Induktion der Tyrosin-Transaminase durch Verabreichung von Glucagon oder Insulin nicht Bei diesem Versuch werden männlichen Albinoratten (Wistar-Imamichi-Stamm, vier Ratten pro Gruppe) je 1 ml einer Lösung des Gemisches aus den Komponenten N und A mit einer Konzentration von 2000, ausgedrückt durch die Absorption bei 260 nm, und 100 μg Glucagon bzw. 1 Einheit Insulin pro 100 g Körperge-

wicht verabreicht. 5 Stunden später werden die Ratten getötet, und es wird die Enzyminduktion bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt.

Tabelle IV	Tyrosin-Transaminase-	Serin-Dehydrogenase-	Transaminase-Aktivität
Verabreichte Verbindungen	Aklivität	Aktivität*)	bei verzweigten
			Aminosäuren**)
Gewöhnliche Albinoratten	0,21 ±0,04	0,47 ±0,13	—
Physiologische Kochsalzlösung fKontrolle^	0,20 + 0,02
N	0,99 ±0,11	—	_
A	0,99 ±0,14	_	—
N + A	0.48 ± 0.04	0.72 ±0,03	—
Glucagon	0,56 ±0,09	0,33 ±0,04	—
Glucagon + N	0,45 + 0,07	1,02 ±0,04	_
Glucagon+ A	0,71 ±0,08	—	—
Insulin	0,67±C,06	—
Insulin+ N	0,55 ±0,11	—	—
Insulin + A
Albinoratten, denen die Nebennieren
entfernt wurden	0,27 ± 0,05
Physiologische Kochsalzlösung
(Kontrolle)	0,23 ±0,01	—	—
N	0,21 ±0,01	—	—
A	2,54 ±0,17	—	12,0 ±0,19
Triamcinolon	4,06 + 0,31	—	21,5±2,6
Triamcinolon + N	4,03 ±0.30	—	28,8 ±0,3
Triamcinolon+ A	3,94 ±0,28	—	—
Triamcinolon + N+A	*) VeI. I. Biol. Chem„ Bd. 240 Π965). S. 3002-3008.

**) Vgl. J. Biochem, Bd 59 (1966), S. 160-169.

Die Komponenten N und A zeigen bei parenteraler Verabreichung auch blutdrucksenkende Wirkungen, wobei die Wirkungsart jedoch deutlich verschieden ist. Die Komponente A zeigt eine kurzzeitige blutdrucksenkende Wirkung, die ähnlich ist der Wirkung von Bradykinin, während die Komponente A nach der kurzzeitigen blutdrucksenkenden Wirkung eine weitere anhaltende blutdrucksenkende Wirkung aufweist. Die blutdrucksenkende Wirkung der Komponente N bzw. A bei Verabreichung ist in Fig.9a bzw. 9b dargestellt.

Zur Bestimmung der blutdrucksenkenden Wirkung der Komponenten N und A werden männliche und weibliche Ratten (Wistar-lmamichi-Stamm) von etwa 400 g Gewicht verwendet. Die Tiere werden durch intraperitoneale Verabfolgung von 75 mg/kg Pentobarbiiainatriurn betäubt Anschließend werden sie auf den Rücken gelegt, und die rechte Carotisvene und die Jugularvene werden freigelegt- In die Carotisvene wird eine am unteren Teil mit Heparin gefüllte Kanüle eingeführt. Der Blutdruck wird mittels eines Quecksilbermanemeters gemessen und kontinuierlich aufgezeichnet Die Testlösungen werden in die rechte Carotisvene innerhalb von 10 Sekunden injiziert In den Fi g. 9a—c sind die blutdrucksenkenden Wirkungen der Komponente A, N und A (gereinigt) mit der von Bradykinin verglichen.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Ein Fözesstück wird dem Anus einer männlichen Alhinoratte (Wistar-lmamichi-Stamm) entnommen und in 20 ml physiologischer Kochsalzlösung homogenisiert. Das Homogenat wird dann in einem Trypto-Soya-Agar-Medium 12 Stunden bei 37°C schüttelnd inkubiert. Das so erhaltene Inoculum wird anschließend zum Beimpfen von Agar-Schrägröhrchen verwendet. Der erhaltene Mikroorganismus wurde als Proteus mirabifis Hauser (N-3) ATCC 21721 nach den in »Laboratory Methods in Microbiology« und »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology« identifiziert Die mit einer Impföse aufnehmbare Menge dieses Mikroorganismus wird zum Beimpfen von insgesamt 3000 ml eines in gleichen Portionen in 15 sterilisierten Sakaguchi-Kol-

5» ben enthaltenen Mediums verwendet das aus 1,5 Prozent Trypticase, 0,5 Prozent Hefeextrakt 0,5 Prozent Natriumchlorid, 0,25 Prozent Glucose und 0,25 Prozent Lyiicsnürruiyurogen}?jiG5pii5t ucsteiit und ϊϊϊϊΐ Natronlauge auf pH 7,3 eingestellt wird. Dieses Medium wird 10 Minuten bei 1 atü sterilisiert Das beimpfte Medium wird 24 Stunden bei 27° C unter Schütteln inkubiert Die so erhaltene Vorkultur wird zum Beimpfen von 60 Liter eines in einem 100-Liter-Fermenter befindlichen Mediums der vorstehenden Zusammensetzung verwendet Das Medium wird glejchzeitg mit einer geringen Menge Soyabohnenöl als Entschäumungsmittel versetzt

Die Fermentation wird bei 27° C und einem Innendruck im Bereich vom 0,5 bis 0,8 atü 18 Stunden unter Durchleiten von Luft mit einer Geschwindigkeit von 30 Liter/Minute und unter Rühren mit einer Rührgeschwindigkeit von 200 UpM durchgeführt Die Trübung der Kulturbrühe beträgt nach der vorgenannten Zeit

0,825, gemessen als Absorption bei 660 nm in 5facher Verdünnung bei einer Schichtdicke von 1 cm.

Nach beendeter Fermentation wird die Kulturbrühe in einer Durchlaufzentrifuge bei 10 000 UpM zur Abtrennung der Zellen des Mikroorganismus zentrifugiert. Die Zellen werden zum Waschen in 10 Liter physiologischer Kochsalzlösung suspendiert, anschließend 20 Minuten bei 10 000 UpM zentrifugiert und dann in physiologischer Kochsalzlösung bis zu einem Gesamtvolumen von 5 Liter suspendiert. Diese Suspension wird in 50 ml Portionen zum Aufbrechen der Zellen einer Ultraschallbehandlung bei 20 kHz unterworfen. Die so erhaltene Suspension wird 10 Minuten bei 10 000 UpM zentrifugiert, und der Überstand wird mit lOprozentiger Perchlorsäure versetzt, bis er 2 Prozent Perchlorsäure enthält. Das Gemisch wird abgekühlt und durch Zentrifugieren deproteinisiert. Die deproteinisierte Lösung wird mit 5 η Kalilauge auf pH 5 bis 5,5 eingestellt und dann zur Entfernung des ausgefallenen Kaliumperchlorats zentrifugiert. Der Überstand wird mit 1 g Aktivkohle je 200 ml Überstand versetzt und anschließend 30 Minuten gerührt, wobei der Faktor an der Aktivkohle adsorbiert wird. Das Gemisch wird sodann zur Abtrennung der Aktivkohle 10 Minuten bei 3000 UpM zentrifugiert. Die Aktivkohle wird mit Wasser gewaschen und dann zweimal mit 400 ml eines Gemisches aus gleichen Volumteilen 0,2 η Kalilauge und Aceton eluiert. Das Eluat wird zur Entfernung des Acetons unter vermindertem Druck eingeengt, mit 2prozentiger Perchlorsäure neutralisiert und dann unter vermindertem Druck auf 100 ml eingeengt. Das Konzentrat wird filtriert, wobei eine klare gelbe Lösung

Tabelle V

erhalten wird.

Dieses Filtrat wird der Säulenchromatographie an mit Epichlorhydrin vernetztem Dextrangel (Typ G-10) in einer Säule von 5 cm Durchmesser und 70 cm Länge bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 20 ml/Stunde unter Verwendung von destilliertem Wasser als EIutionsmittel unterworfen. Es werden Fraktionen mit einem Volumen von 20 ml gesammelt. Jede von der Dextrangel-Säule eluierte Fraktion wird intraperitoneal männlichen Albinoratten (Wistar-Imamichi-Stamm) verabreicht. 5 Stunden später werden die Ratten getötet, und die Aktivität der Tyrosin-Transaminase wird gemäß dem in Versuch 1 beschriebenen Verfahren bestimmt Die Fraktionen Nr. 26 bis 34, die eine induzierende Wirkung auf die Tyrosin-Transaminase aufweisen, werden vereinigt. Die vereinigten Fraktionen, die den Faktor enthalten, werden unter vermindertem Druck eingeengt und lyophilisiert, wobei 800 mg des Faktors in Form eines stark hygroskopischen Pulvers erhalten werden.

Beispiel 2

Jeweils 500 m! eines aus 1,5 Prozent Pepton, 0,5 Prozent Hefeextrakt, 0,5 Prozent Natriumchlorid, 0,25 Prozent Glucose und 0,25 Prozent Dikaliumhydrogenphosphat bestehenden Mediums (pH 7,3) werden mit einem der in Tabelle V aufgeführten Mikroorganismen beimpft und 20 Stunden bei 27°C schüttelnd inkubiert. Die Kulturbrühen werden anschließend gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet. Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengestellt:

Organismus

Ausbeute des erfindungs	Induktion
gemäßen Faktors*)	der Tyro
	sin-Trans
ml Lösung Extinktion	aminase**)
der Lösung
bei 260 nm
15 (5,40)	3,0
15 (4,90)	3,45

Proteus mirabilis, ATCC 21718
Proteus morganii, ATCC 21720

*) Menge des erfindungsgemäßen Faktors in der Lösung, bestimmt durch die Absorption bei 260 nm. **) Mittelwert von drei Versuchen; der bei der Verabreichung einer physiologischen Kochsalzlösung erhaltene Wert wird = 1 gesetzt.

Hierzu 9 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

1. Patentansprüche:

   1; Faktor, erhältlich dadurch, daß man Proteus mirabilis ATCC 21718, Proteus morganii ATCC 21720 oder Proteus mirabilis Hauser ATCC 21721 in üblicher Weise in einem wäßrigen Nährmedium, das eine Kohlenstoff- und eine Stickstoffquelle und anorganische Salze enthält, züchtet, die Zellen abfiltriert oder abzentrifugiert, in Wasser oder einer physiologischen Kochsalzlösung suspendiert, aufbricht und extrahiert, den wäßrigen Zellextrakt mit dem Filtrat oder dem bei der Zentrifugation erhaltenen Überstand vereinigt, mit Perchlorsäure oder Trichloressigsäure deproteinisiert und zentrifugiert, den deproteinisierten Extrakt bei pH 3 bis 7 mit Aktivkohle behandelt, die beladene Ak.'ivkohle abtrennt und das Adsorbat mit einem Gemisch aus gleichen Volumteilen 0,2 η Kalilauge und Aceton eluiert, das Eluat neutralisiert und einengt, das erhaltene Konzentrat der Säulenchromatographie an Dextrangel unterwirft, und die Fraktionen mit einer Tyrosin-Transaminase induzierenden Aktivität sammelt.
2. 2. Arzneipräparate, enthaltend als Wirkstoff den nach Anspruch 1 hergestellten Faktor und übliche Trägerstoffe und/oder Verdünnungsmittel und/oder Hilfsstoffe.