DE3881198T2

DE3881198T2 - Antiviraler wirkstoff.

Info

Publication number: DE3881198T2
Application number: DE8888301602T
Authority: DE
Inventors: Junji Kakuchi; Shigeaki Muto; Minoru Ohhara; Masaaki Takahashi; Chikao Yoshikumi
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1988-02-03
Filing date: 1988-02-25
Publication date: 1993-09-02
Anticipated expiration: 2008-02-26
Also published as: JPH01199593A; JPH0816118B2; EP0331821B1; EP0331821A1; CA1339111C; DE3881198D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein spezifisches, proteingebundenes Polysaccharid, das aus Pilzen der Bezeichnung Coriolus der Basidiomycetes gewonnen wird, ein Verfahren zur Herstellung des proteingebundenen Polysaccharids und pharmazeutische Zusammensetzungen, die das proteingebundene Polysaccharid enthalten.
Azido-3'-desoxythymidin (AZT) wird bereits klinisch als Arzneimittel gegen AIDS verwendet. Bei diesem Arzneimittel besteht eine Nebenwirkung in der Hemmung der Mitose normaler Zellen. Obwohl bisher Vakzine als antivirale Mittel verwendet worden sind, sind sie als Arzneimittel gegen AIDS nicht wirksam.
Im Hinblick auf proteingebundene Polysaccharide, die aus Pilzen der Bezeichnung Basidiomycetes gewonnen werden, und Verfahren zur Herstellung derartiger Polysaccharide sind die folgenden Vorschläge gemacht worden.
JP-A-55-23 271 (1980) beschreibt ein proteingebundenes Polysaccharid, das ein mittels eines Ultrazentrifugenverfahrens gemessenes Molekulargewicht im Bereich von 5000 bis 300 000 aufweist; das positive Farbreaktionen, die charakteristisch für Saccharide sind, in der α-Naphthol-Schwefelsäure-Reaktion, in der Indol- Schwefelsäure-Reaktion, in der Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, in der Phenol-Schwefelsäure-Reaktion und in der Tryptophan-Schwefelsäure-Reaktion zeigt; das positive Farbreaktionen, die charakteristisch für die Peptidbindung und für Aminosäuren sind, bei der Lowry-Folin-Methode und in der Ninhydrin-Reaktion nach Hydrolyse mit Salzsäure zeigt; das mittels ¹H-NMR-Spektroskopie gemessene Absorptionen in den Bereichen von 0,9 ± 0,1 ppm, 1,2 ± 0,1 ppm, 2,0 ± 0,1 ppm, 4,5 ± 0,1 ppm und 4,7 ± 0,1 ppm und eine breite Absorption im Bereich von 3,0 bis 4,4 ppm aufweist; das ein Verhältnis von Saccharidanteil zu Proteinanteil im Bereich von 55/45 bis 95/5 aufweist, wobei die ¹H-NMR-Absorption des Proteinanteils in den Bereich von 0,5 bis 2,5 ppm und die ¹H- NMR-Absorption des Saccharidanteils in den Bereich von 2,5 bis 6,0 ppm fällt; dessen Saccharidanteil aus β-Glucan zusammengesetzt ist; das keine auf ein α-Glucan zurückzuführende Absorption im Bereich von 4,9 bis 6,0 ppm aufweist; und das einen Proteinanteil aufweist, der aus Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Prolin, Glycin, Alanin, Cystein, Valin, Methionin, Isoleucin, Leucin, Tyrosin, Tryptophan, Phenylalanin, Lysin, Histidin und Arginin zusammengesetzt ist. In dieser Druckschrift wird auch ein Verfahren zur Herstellung des zuvor erwähnten proteingebundenen Polysaccharids beschrieben, das das Vorkultivieren einer Vorkultur von Basidiomycetes-Pilzen, wobei das Wachstum des pilzlichen Lichen an der Oberfläche des Kulturmediums induziert wird, die Homogenisierung des pilzlichen Lichen mit physiologischer Kochsalzlösung, wobei eine Vorkultur für eine Produktionskultur hergestellt wird, das Kultivieren der Vorkultur bei stationärer Kultur oder Submerskultur, wobei ein Myzel erhalten wird, das Extrahieren des Myzels mit heißem Wasser oder einem wäßrigen Lösungsmittel, wie verdünnter alkalischer Lösung, das Einengen des Extraktes nach Entfernung des Rückstandes, das Aussalzen des Konzentrats mit Ammoniumsulfat oder das Unterwerfen unter eine Ultrafiltration, wobei Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht daraus entfernt werden und ein gereinigtes Konzentrat erhalten wird, die Zugabe einer Menge an Ammoniumsulfat, die einem Sättigungsgrad von 25 % äquivalent ist, zu dem erhaltenen Konzentrat, wobei eine Ausfällung induziert wird, die Entfernung des Niederschlages aus der erhaltenen Lösung, die Zugabe einer Menge an Ammoniumsulfat, die einem Sättigungsgrad von 40 % äquivalent ist, zu der erhaltenen Lösung, das Auffangen des daraufhin in der Lösung gebildeten Niederschlages, das Entsalzen einer Lösung des Niederschlages durch Dialyse, das Aufbringen der erhaltenen, entsalzten Lösung auf eine DEAE-Cellulosesäule, das Eluieren des Adsorbats mit einer wäßrigen, 1 m Natriumchloridlösung, die Zugabe einer Menge an Ammoniumsulfat, die einem Sättigungsgrad von 40 % äquivalent ist, zu dem Eluat, das Auffangen des Niederschlages, der daraufhin in der erhaltenen Reaktionslösung gebildet wird, und das Entsalzen der Lösung des Niederschlages durch Dialyse umfaßt.
US-A-4 271 151 beschreibt ein Antitumormittel, das einem an Krebs erkrankten Säugetier oral verabreicht werden kann, wobei das Antitumormittel fähig ist, das Wachstum des Krebses zu verlangsamen. Das Mittel umfaßt eine wirksame Menge eines proteingebundenen Polysaccharids, das durch Extraktion eines Myzels oder eines Fruchtkörpers von Coriolus Polyporaceae Basidiomycetes erhalten wird. Das proteingebundene Polysaccharid weist ein mittels Ultrazentrifugation bestimmtes Molekulargewicht im Bereich von 5000 bis 300 000 auf; es ergibt positive Farbreaktionen, die charakteristisch für Saccharide sind, mit α-Naphthol-Schwefelsäure, Indol- Schwefelsäure, Anthron-Schwefelsäure, Phenol-Schwefelsäure und Tryptophan-Schwefelsäure; es ergibt nach Hydrolyse mit Salzsäure eine positive Ninhydrin-Farbreaktion, die charakteristisch für Aminosäuren ist, und eine positive Farbreaktion in dem Lowry-Folin-Test, der charakteristisch für eine Peptidbindung ist; das proteingebundene Polysaccharid weist mittels ¹H-NMR-Spektroskopie bestimmte Absorptionen in Bereichen von 0,9 ± 0,1 ppm, 1,2 ± 0,1 ppm, 2,0 ± 0,1 ppm, 4,5 ± 0,1 ppm und 4,7 ± 0,1 ppm und eine breite Absorption im Bereich von 3,0 bis 4,4 ppm auf; das proteingebundene Polysaccharid weist ein Verhältnis von Polysaccharidanteil zu Proteinanteil im Bereich von 55/45 zu 95/5 auf, wobei die ¹H-NMR-Absorption des Proteinanteils bei 0,5 bis 2,5 ppm liegt und die des Polysaccharidanteils bei 2,5 bis 6,0 ppm liegt; der Polysaccharidanteil ist aus β-Glucan zusammengesetzt und zeigt keine Absorption im Bereich von 4,9 bis 6,0 ppm, die auf α-Glucan zurückzuführen ist; der Proteinanteil ist aus Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Prolin, Glycin, Alanin, Cystein, Valin, Methionin, Isoleucin, Leucin, Tyrosin, Tryptophan, Phenylalanin, Lysin, Histidin und Arginin zusammengesetzt.
JP-A-56-46 481 (1981) beschreibt ein Polysaccharid, das ein mittels eines Ultrazentrifugenverfahrens bestimmtes Molekulargewicht im Bereich von 5000 bis 300 000 aufweist; das positive Farbreaktionen, die charakteristisch für Saccharide sind, in der α-Naphthol-Schwefelsäure-Reaktion, in der Indol-Schwefelsäure-Reaktion, in der Anthron- Schwefelsäure-Reaktion, in der Phenol-Schwefelsäure-Reaktion und in der Tryptophan-Schwefelsäure-Reaktion ergibt; das eine Elementaranalyse von 43,5 bis 45,3 % Kohlenstoff, 5,7 bis 6,7 % Wasserstoff und den Rest Sauerstoff aufweist; das eine spezifische Drehung [α]D²&sup5; im Bereich von 70º bis 180º aufweist; das im Infrarotabsorptionsspektrum eine charakteristische Absorption bei 840 cm&supmin;¹ aufweist; das Absorptionsbereiche von 3,7 ± 0,1 ppm, 3,8 ± 0,1 ppm, 5,0 ± 0,1 ppm und 5,4 ± 0,1 ppm aufweist; das in Wasser löslich und in Chloroform und Hexan unlöslich ist; und das D-Glucose als Hauptbestandteil des Saccharids aufweist.
US-A-4 614 733 beschreibt ein Polysaccharid, das ein mittels Ultrazentrifugation bestimmtes Molekulargewicht von 5000 bis 300 000 aufweist; das Farbreaktionen, die charakteristisch für Saccharide sind, in der α-Naphthol-Schwefelsäure- Reaktion, in der Indol-Schwefelsäure-Reaktion, in der Phenol- Schwefelsäure-Reaktion und in der Tryptophan-Schwefelsäure- Reaktion ergibt; das 43,5 bis 45,3 Gew.-% Kohlenstoff enthält; das 5,7 bis 6,7 Gew.-% Wasserstoff und den Rest Sauerstoff enthält und frei von Stickstoff ist; wobei die Saccharideinheiten des Polysaccharids prinzipiell aus D- Glucose zusammengesetzt sind, die vollständig durch α-Verknüpfungen aneinander gebunden sind und eine Struktur aufweisen, in der T&sup4;G¹T im Bereich von 3,5 bis 8,5 liegt, T³G¹T weniger als 2 beträgt,
im Bereich von 0,5 bis 2,0 liegt,
im Bereich von 0,1 bis 2,5 liegt und
weniger als 0,8 beträgt, wenn die nicht-reduzierende Endgruppe (G¹T) des Monosaccharids, wie sie gemäß dem Methylierungs-Hydrolyse-Test nach Haworth bestimmt wird, mit dem Index 1 versehen wird; wobei die spezifische Drehung [α]D²&sup5; des Polysaccharids im Bereich von + 70º bis + 180º liegt; wobei das Polysaccharid im Infrarotabsorptionsspektrum eine spezifische Absorption von 840 cm&supmin;¹ aufweist; wobei das Polysaccharid in seinem ¹H-NMR-Spektrum Absorptionen bei 3,7 ± 0,1, 3,8 ± 0,1, 5,0 ± 0,1 und 5,4 ± 0,1 ppm aufweist, jedoch keine Absorptionen im Bereich von 4,4 bis 4,9 ppm aufweist; und wobei das Polysaccharid in Wasser löslich, aber in Pyridin, Chloroform und Hexan unlöslich ist. Dieses Polysaccharid wird gemäß einem Verfahren hergestellt, das die folgenden Stufen umfaßt: Extraktion von Myzelien und Fruchtkörpern eines Basidiomycetes-Pilzes, der aus Coriolus versicolor (Fr.) Quél., Coriolus consors (Berk.) Imaz., Coriolus hirsutus (Fr.) Quél. und Coriolus pargamenus (Fr.) Pat. oder Gemischen davon ausgewählt ist, mit einem wäßrigen Lösungsmittel, das aus Wasser, einer verdünnten wäßrigen Säurelösung, einer wäßrigen 0,005 bis 2 n-Lösung von Kalium- oder Natriumhydroxid und einer verdünnten wäßrigen Lösung eines organischen Lösungsmittels ausgewählt ist,
Sättigen der so erhaltenen Extraktlösung mit Ammoniumsulfat nach Entfernung von Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht, d.h. mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000, die darin enthalten sind, durch Ultrafiltration,
Umkehrosmose oder einer Kombination davon,
Auffangen des erhaltenen Niederschlages,
Auflösen des Niederschlages in Wasser,
Entsalzen der so erhaltenen Lösung des Niederschlages,
Passieren der so entsalzten Lösung über eine Säule, die mit einem Ionenaustauscher gepackt ist, wobei darin enthaltene stickstoffhaltige Substanzen absorbiert und entfernt werden, Einengen der so erhaltenen Lösung und
Trocknen des so erhaltenen Konzentrats, wobei man das Polysaccharid erhält.
JP-A-57-40 159 (1982) offenbart ein proteingebundenes Polysaccharid, das ein mittels eines Ultrazentrifugenverfahrens bestimmtes Molekulargewicht im Bereich von 5000 bis 300 000 aufweist; das positive Farbreaktionen, die charakteristisch für Saccharide sind, in der α-Naphthol-Schwefelsäure-Reaktion, in der Indol- Schwefelsäure-Reaktion und in der Tryptophan-Schwefelsäure- Reaktion ergibt; das positive Farbreaktionen, die charakteristisch für Peptidbindungen und Aminosäuren sind, bei der Lowry-Folin-Methode und nach Hydrolyse mit Salzsäure in der Ninhydrin-Reaktion, ergibt; das in seinem ¹H-NMR- Spektrum Absorptionsbereiche von 0,9 ± 0,1 ppm, 1,2 ± 0,1 ppm, 2,0 ± 0,1 ppm, 4,5 ± 0,1 ppm, 4,7 ± 0,1 ppm, 5,0 ± 0,1 ppm und 5,4 ± 0,1 ppm und einen breiten Absorptionsbereich von 3,0 bis 4,4 ppm aufweist; das ein Verhältnis von Saccharidanteil zu Proteinanteil im Bereich von 55/45 bis 95/5 aufweist, wobei die ¹H-NMR-Absorption des Proteinanteils in den Bereich von 0,5 bis 2,5 ppm fällt und die ¹H-NMR- Absorption des Saccharidanteils in den Bereich von 2,5 bis 6,0 ppm fällt; das einen saccharidanteil aufweist, der β-D- Glucan und α-D-Glucan umfaßt, wobei das Verhältnis der Absorptionsintensitäten (α/β) der Absorption im Bereich von 4,9 bis 6,0 ppm, die auf α-Glucan zurückgeführt wird, und der Absorption im Bereich von 4,4 bis 4,9 ppm, die auf β-Glucan zurückgeführt wird, im Bereich von 50/50 bis 10/90 liegt; und das einen Proteinanteil aufweist, der aus Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Prolin, Glycin, Alanin, Cystein, Valin, Methionin, Isoleucin, Leucin, Tyrosin, Tryptophan, Phenylalanin, Lysin, Histidin und Arginin zusammengesetzt ist. Es wird ein Verfahren zur Herstellung des vor stehend erwähnten proteingebundenen Polysaccharids beschrieben, das das Vorkultivieren einer Vorkultur eines Basidiomycetes-Pilzes, wobei das Wachstum des pilzlichen Lichen an der Oberfläche des Kulturmediums induziert wird, das Homogenisieren des pilzlichen Lichens mit physiologischer Kochsalzlösung, wobei eine Vorkultur für eine Produktionskultur hergestellt wird, das Kultivieren der Vorkultur bei stationärer Kultur oder Submerskultur, wobei ein Myzel erhalten wird, das Extrahieren des Myzels mit heißem Wasser oder einem wäßrigen Lösungsmittel, wie verdünnter alkalischer Lösung, das Einengen des Extraktes nach Entfernung des Rückstandes, das Aussalzen des konzentrierten Extraktes mit Ammoniumsulfat oder das Unterwerfen unter Ultrafiltration zur Entfernung von Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht und zur Herstellung eines gereinigten Konzentrats, das Sättigen des erhaltenen Konzentrats bis 40 % mit Ammoniumsulfat, das Entfernen des Niederschlages von dem Konzentrat, anschließend das Sättigen der erhaltenen Lösung zu 60 % mit Ammoniumsulfat, das Auffangen des so gebildeten Niederschlages aus der Lösung, das Entsalzen der Lösung des abgetrennten Niederschlages durch Dialyse, das Auftragen der entsalzten Lösung auf eine DEAE-Cellulose-Säule und das anschließende Eluieren des Adsorbats mit einer wäßrigen 1 m Lösung von Natriumchlorid umfaßt.
US-A-4 663 438 beschreibt ein nucleinsäurehaltiges Glycoprotein, das ein mittels eines Ultrazentrifugenverfahrens bestimmtes Molekulargewicht von 5000 bis 300 000 aufweist; das ein Verhältnis des Gewichts seines Proteinanteils, das nach der Lowry-Folin-Methode bestimmt wurde, zum Gewicht seines Saccharidanteils, das nach der Phenol-Schwefelsäure-Methode bestimmt wurde, im Bereich von 50:50 bis 80:20 aufweist; wobei der Saccharidanteil Fucose, Ribose, Arabinose, Xylose, Mannose, Galactose, Glucose und Glucosamin enthält, wobei das Gesamtgewicht an Xylose, Mannose und Glucose mehr als 85 Gew.-% des Gesamtgewichts des Saccharids ausmacht; wobei der Proteinanteil die Aminosäuren Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Prolin, Glycin, Alanin, Cystein, Valin, Methionin, Cystathionin, Isoleucin, Leucin, Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Ornithin, Lysin, Histidin und Arginin enthält, wobei das Gesamtgewicht an Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Glycin, Alanin, Phenylalanin, Valin, Leucin und Isoleucin mehr als 75 Gew.-% des Gesamtgewichts aller Aminosäuren ausmacht; wobei die Aminosäure an seinem N-Terminus Tyrosin, Leucin oder Alanin ist, wobei die Aminosäuresequenz an seinem C-Terminus Valin- Phenylalanin-Leucin ist, wobei die endständige Aminosäure Leucin ist; wobei seine Elementzusammensetzung im Bereich von 35,2 bis 49,3 % C, im Bereich von 4,8 bis 8,0 % H, im Bereich von 4,3 bis 12,3 % N, im Bereich von Spuren bis 2,5 % S und im Bereich von Spuren bis 1,2 % P liegt und der Rest O ist; wobei der isoelektrische Punkt bei einem pH-Wert von 2,5 bis 5,0 liegt; wobei die Nucleinsäure 0,01 bis 0,50 Gew.-% an Uracil als Base der Nucleinsäure enthält; und wobei es Infrarotabsorptionsmaxima bei 3600 bis 3200 cm&supmin;¹, 1530 cm&supmin;¹ und 1200 bis 1000 cm&supmin;¹ aufweist. Das nucleinsäurehaltige Glycoprotein wird durch Extraktion von Fruchtkörpern, Myzelien oder kultivierten Myzelien eines Pilzes der Bezeichnung Coriolus der Basidiomycetes mit heißem Wasser oder einer wäßrigen, 0,01 bis 2,0 n Alkalilösung bei einer Temperatur von 80 bis 100ºC für 1 bis 8 Stunden, Neutralisieren des erhaltenen Extraktes, Unterwerfen des neutralisierten Extraktes einer Dialyse und/oder Ultrafiltration, wobei Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht, die ein Molekulargewicht von unter 5000 aufweisen, entfernt werden, und fraktionsweises Auffangen der Fraktionen, die bei einem pH-Wert von 2,5 bis 5,0 und einer Ionenstärke von 0,1 bis 3,1 uM bei einer Temperatur von 5 bis 25ºC ausfallen.
JP-A-51-36 322 (1976) beschreibt ein Polysaccharid, das, in Form eines Hydrolysates, positive Farbreaktionen in der Molisch-Reaktion, in der Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, in der Tryptophan-Schwefelsäure-Reaktion, in der Cystein- Schwefelsäure-Reaktion, in der Aminoguanidin-Schwefelsäure- Reaktion, in der Chromotropsäure-Schwefelsäure-Reaktion, in der Carbazol-Cystein-Schwefelsäure-Reaktion, in der Seliwanoff-Reaktion, im Bial-Test, in der Anilin-Salzsäure- Reaktion, in der Tollens-Reaktion und in der Thioglykolsäure- Schwefelsäure-Reaktion und eine schwach positive Farbreaktion in der Ninhydrin-Reaktion zeigt. Das Polysaccharid besitzt eine Aktivität gegen Krebs. Das Verfahren zur Herstellung des Polysaccharids umfaßt das künstliche Kultivieren eines Pilzes der Gattung Coriolus, wobei ein Myzel hergestellt wird, und das Extrahieren des Myzels mit Wasser oder einem wäßrigen Lösungsmittel mit einer kleinen Menge an Säure, Base oder organischem Lösungsmittel.
US-A-4 051 314 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids, das die Bildung eines Kulturmediums oder eines flüssigen Extrakts aus dem Myzel einer Spezies eines Pilzes, der zur Klasse der Basidiomycetes gehört und aus Coriolus versicolor, Coriolus conchifer, Coriolus pargamenus, Coriolus hirsutus, Coriolus biformis, Coriolus consors und Coriolus pubescens ausgewählt ist, die Abtrennung des Polysaccharids von freien Proteinen und anderen, in dem Kulturmedium oder flüssigen Extrakt enthaltenen Verunreinigungen und das Reinigen des Polysaccharids umfaßt, um ein gereinigtes Polysaccharid mit einer akuten Toxizität (LD&sup5;&sup0;) bei Mäusen von mehr als 20 g/kg bei oraler Verabreichung und von mehr als 100 mg/kg bei subkutaner Injektion aufweist; und
ein Polysaccharid das ein mittels Gelfiltration bestimmtes Molekulargewicht im Bereich von 1,0 bis 1,9 x 100 000 aufweist; das, in Form eines Hydrolysates, eine positive Ninhydrin-, Anisaldehyd-, Molisch-, Anthron-, Tryptophan- Schwefelsäure-, Chromotropsäure-Schwefelsäure-, Carbazol- Cystein-Schwefelsäure-, Anilin-Salzsäure-, Resorcin- Salzsäure-, Tollens- und Thioglykol-Schwefelsäure-Reaktion ergibt, das aber eine negative Eisen(III)-chlorid- und Fehling-Reaktion ergibt. Das Polysaccharid wird durch ein Verfahren hergestellt, das die Bildung eines Kulturmediums oder eines flüssigen Extrakts aus dem Myzel einer Spezies eines Pilzes, der zur Klasse der Basidiomycetes gehört und aus Coriolus versicolor, Coriolus conchifer, Coriolus pargamenus, Coriolus hirsutus, Coriolus biformis, Coriolus consors und Coriolus pubescens ausgewählt ist, und das Abtrennen des Polysaccharids vom Kulturmedium oder flüssigen Extrakt umfaßt.
JIP-A-56-14274 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines stickstoffhaltigen Polysaccharids, das das Extrahieren eines Pilzes der Bezeichnung Coriolus der Basidiomycetes mit einer wäßrigen 0,1 n bis 2 n Alkalilösung und das unterwerfen des erhaltenen Extraktes unter eine Ultrafiltration oder eine Umkehrosmose umfaßt, wobei aus dem Extrakt Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht, d.h. mit einem Molekulargewicht von nicht mehr als 5000, abgetrennt werden.
In den letzten Jahren sind verschiedene Viruserkrankungen, wie Hepatitis B, T-Zellen-Leukämie bei Erwachsenen und AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome) Gegenstand wissenschaftlicher Forschung gewesen.
Insbesondere haben eine Reihe von erworbenen Immunschwächen, die volkstümlich als AIDS bezeichnet werden, das Interesse als ernsthafte Erkrankungen, die für die Patienten tödlich sind, gefunden. Durch Forschungen ist bereits festgestellt worden, daß eine Übertragung dieser Krankheit auftritt, wenn menschliche T&sub4;-Lymphozyten HIV (menschliches Immunschwächevirus, "human immunodeficiency virus"), eine Spezies eines Retrovirus, adsorbieren. Ein Fortschreiten der Erkrankung erfolgt, wenn andere lymphatische Zellen durch das Virus infiziert werden. Im allgemeinen sind Viruserkrankungen bisher durch eine vorbeugende Impfung mit einem entsprechenden Vakzin bekämpft worden. Als Folge davon sind die Pocken ausgerottet und Gelbfieber und Polimyelitis (Kinderlähmung) bekämpft worden.
Die Impfung ist jedoch bei zur Heilung von Erkrankungen, wie AIDS, nicht wirksam, was das Problem einer persistenten Infektion oder einer latenten Infektion aufwirft. Im Hinblick auf die Beschaffenheit der Hülle des HIV wird es als schwierig angesehen, ein Vakzin zu entwickeln, das wirksam zur Bekämpfung von HIV ist. Unter diesen Umständen ist die Entwicklung eines sicheren Arzneimittels gegen AIDS, das eine herausragende Wirkung bei der Heilung der Krankheit zeigt, wünschenswert.
Einer der Erfinder der vorliegenden Anmeldung hat bereits festgestellt, daß eine Reihe von proteingebundenen Polysacchariden eine Aktivität als biologische Modifikationsmittel (BRM) des Ansprechverhaltens des Immunsystems aufweisen. Insbesondere eine Art eines proteingebundenen Polysaccharids, das aus einem Pilz der Bezeichnung Coriolus der Basidiomycetes extrahiert wird, wird bereits als ein Mittel gegen Tumoren unter dem Warenzeichen "Krestin" vertrieben. Dieses Arzneimittel zeigt eine sehr geringe Toxizität und kann über eine lange Zeit hinweg verabreicht werden, ohne daß die Gefahr einer Störung der Darmbakterien besteht. Ferner ist es eine überaus sichere Substanz, da sie keine nachteilige Wirkung auf die Art der Variation oder der Reaktion einer Allergie aufweist, und daher keine Möglichkeit besteht, eine Deformierung oder Allergie bei einem gesunden Menschen zu induzieren. Die aktiven, proteingebundenen Polysaccharide, die aus Pilzen der Bezeichnung Coriolus der Basidomycetes extrahiert werden, sind natürliche Substanzen, und sie sind komplizierte Verbindungen, die mit zahlreichen anderen proteingebundenen Polysacchariden gebildet werden. Daher sind die aktiven Polysaccharide, die bei der Heilung von AIDS wirksam sind [Verhinderung der Adsorption von HIV an menschliche lymphatische Zellen und Hemmung der Aktivität von RTxase (reverse Transkriptase), wobei es sich um ein für die Ausbreitung von HIV essentielles Enzym handelt], bis jetzt noch nicht vollständig ermittelt worden.
Dementsprechend wird mit der Erfindung ein proteingebundenes Polysaccharid bereitgestellt,
(i) das ein mittels Gelpermeationschromatographie bestimmtes Molekulargewicht von 50 000 bis 3 000 000 besitzt;
(ii) das eine charakteristische positive Farbreaktion in der α-Naphthol-Schwefelsäure-Reaktion, in der Indol- Schwefelsäure-Reaktion, in der Anthron-Schwefelsäure- Reaktion, in der Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, in der Tryptophan-Schwefelsäure-Reaktion, bei der Lowry-Folin- Methode und, nach Hydrolyse mit Salzsäure, in der Ninhydrin- Reaktion zeigt;
(iii) bei dem das Verhältnis des Gewichts des Proteinanteils, das nach der Lowry-Folin-Methode bestimmt wurde, zum Gewicht des Polysaccharidanteils, das nach der Phenol-Schwefelsäure- Methode bestimmt wurde, von 40:60 bis 70:30 beträgt;
(iv) das eine Löslichkeit in Wasser zeigt und unlöslich in Pyridin, Chloroform, Benzol, Hexan und Methanol ist;
(v) das eine spezifische Drehung [α]D²&sup5; von -10º bis +30º zeigt;
(vi) das im Infrarotabsorptionsspektrum eine charakteristische Absorption bei 890 cm&supmin;¹ zeigt;
(vii) das die Aminosäuren Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Glycin, Alanin, Valin und Leucin in einer Menge von nicht weniger als 70 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Aminosäuren im Proteinanteil, aufweist;
(viii) das als Saccharide Glucose und Mannose in einer Menge von nicht weniger als 75 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Saccharide in dem Saccharidanteil, aufweist, wobei das Verhältnis von Glucose zu Mannose von 2:1 bis 4:1 beträgt;
(ix) das keine Nucleinsäuren enthält, wobei die Messung mittels Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie unter Verwendung von ultraviolettem Licht bei 245 nm erfolgt; und
(x) wobei der Saccharidanteil durch die folgende Strukturformel (I) dargestellt wird:
wobei G ein Monosaccharid darstellt, p einen Wert von 0 bis 10, q einen Wert von 0 bis 5, m einen Wert von 0 bis 2, n einen Wert von 3 oder 4 und 1 einen Wert von 0 oder 1 annimmt.
Das vorstehend genannte proteingebundene Polysaccharid weist im allgemeinen ein mittels Gelpermeationschromatographie gemessenes mittleres Molekulargewicht von 110 000 bis 300 000 auf.
Der Saccharidanteil und der Proteinanteil sind hauptsächlich über einen Glucosaminrest aneinander gebunden.
Das vorstehend genannte proteingebundene Polysaccharid wird nach einem Verfahren erhalten, das das Kultivieren eines Pilzes der Bezeichnung Coriolus der Basidiomycetes, das Extrahieren des Myzels oder der Fruchtkörper mit Wasser oder einer wäßrigen alkalischen Lösung und das Isolieren des Polysaccharids aus dem Extrakt durch Aussalzen des Extrakts mit Ammoniumsulfat und Unterwerfen der erhaltenen Lösung einer Reinigung über eine Ionenaustausch-Cellulose-Säule, umfaßt. Geeignete Stämme des Pilzes sind CM 101, CM 102 oder CM 103 von Coriolus versicolor (Fr.) Quél.
Bei dem vorstehend genannten Verfahren handelt es sich vorzugsweise um ein Verfahren, bei dem eine Lösung des Niederschlags, der durch Aussalzen des Extrakts mit gesättigtem Ammoniumsulfat erhalten wurde, entsalzt wird, und bei dem das Polysaccharid durch folgende Stufen erhalten wird: (1) Aussalzen der erhaltenen Lösung mit Ammoniumsulfat bei einem Sättigungsgrad von 25 %, Entsalzen einer Lösung des erhaltenen Niederschlages, Aufbringen der entsalzten Lösung auf eine DEAE-Ionenaustausch-Cellulose-Säule, Eluieren des Adsorbats mit einer wäßrigen Natriumchloridlösung und Entsalzen des Eluats oder (2) Aufbringen der auf diese Weise entsalzten Lösung auf eine DEAE-Ionenaustausch-Cellulose- Säule, Eluieren des Adsorbats mit einer wäßrigen Natriumchloridlösung, Entsalzen des Eluats, Aussalzen der erhaltenen Lösung mit Ammoniumsulfat bei einem Sättigungsgrad von 25 % und Entsalzen einer Lösung des erhaltenen Niederschlages.
Das proteingebundene Polysaccharid ist nützlich als Mittel gegen Viren, und insbesondere ist es nützlich als Mittel gegen Retroviren. So kann das Polysaccharid bei der Behandlung von AIDS verwendet werden.
Die Erfindung umfaßt daher eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als aktiven Bestandteil ein proteingebundenes Polysaccharid, wie es vorstehend definiert ist, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger, umfaßt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist ein Infrarotabsorptionsspektrum der Substanz, die in Beispiel 1 erhalten wurde, und Fig. 2 ist ein NMR-Spektrum der gleichen Substanz.
Das proteingebundene Polysaccharid der vorliegenden Anmeldung wird nachstehend als vorliegende Substanz bezeichnet.

(1) Herstellung der vorliegenden Substanz

Die vorliegende Substanz wird durch Kultivieren eines Pilzes der Bezeichnung Coriolus der Basidiomycetes, z.B. Coriolus versicolor (Fr.) Quél., Coriolus hirsutus (Fr.) Quél., Coriolus pargamenus (Fr.) Pat. und Coriolus consors (Berk.) Imaz., erhalten, wobei das Wachstum des Myzels oder Fruchtkörpers induziert wird, das Myzel oder der Fruchtkörper mit heißem Wasser oder einer wäßrigen alkalischen Lösung extrahiert wird, der erhaltene Extrakt mit gesättigtem Ammoniumsulfat ausgesalzt wird, nach Wiederauflösen des erhaltenen Niederschlages die auf diese Weise erhaltene Lösung durch Dialyse entsalzt wird, (i) die erhaltene Lösung mit einer Menge an Ammoniumsulfat, die einem Sättigungsgrad von 25 % äquivalent ist, ausgesalzt wird, eine Lösung des erhaltenen Niederschlags durch Dialyse entsalzt wird, die erhaltene Lösung auf eine DEAE-Ionenaustausch-Cellulose-Säule aufgebracht wird, wobei eine Fraktion darauf adsorbiert wird, anschließend die adsorbierte Fraktion mit einer wäßrigen Natriumchloridlösung eluiert und das Eluat durch Dialyse entsalzt wird, oder (ii) die erhaltene Lösung auf eine DEAE- Ionenaustausch-Cellulose-Säule aufgebracht wird, die adsorbierte Fraktion mit einer wäßrigen Natriumchloridlösung eluiert wird, das Eluat durch Dialyse entsalzt wird, die erhaltene Lösung mit einer Menge an Ammoniumsulfat, die einem Sättigungsgrad von 25 % äquivalent ist, ausgesalzt wird, der erhaltene Niederschlag wieder aufgelöst und anschließend die auf diese Weise erhaltene Lösung durch Dialyse entsalzt wird.

(2) Physikalische und chemische Eigenschaften

1. Molekulargewicht

Das Molekulargewicht der vorliegenden Substanz liegt im Bereich von 50 000 bis 3 000 000 und das mittlere Molekulargewicht davon liegt im Bereich von 110 000 bis 300 000, wobei es mittels Gelpermeationschromatographie bestimmt wurde.

2. Farbreaktion

Wenn die vorliegende Substanz für eine Farbreaktion in Wasser gelöst wird, werden die folgenden Ergebnisse erzielt. Tabelle 1 Farbreaktion Farbe Ergebnis α-Naphthol-Schwefelsäure-Reaktion (Molisch-Reaktion) Indol Anthron Phenol Tryptophan Lowry-Folin-Methode Ninhydrin-Reaktion nach Hydrolyse mit Salzsäure (6 n HCl, 110ºC, 20 Stunden) purpur braun grün blau purpur-blau Glycid Peptidbindung, Tyrosin, und Cystein α-Aminosäure
Aus den vorstehenden Ergebnissen der Farbreaktionen wird deutlich, daß die vorliegende Substanz Saccharide und Proteine enthält.

3. Löslichkeit

Die vorliegende Substanz ist in Wasser löslich und in Methanol, Pyridin, Chloroform, Benzol und Hexan weitgehend unlöslich.

4. pH-Wert

Eine Lösung von 1 g der vorliegenden Substanz in 100 ml Wasser zeigt einen pH-Wert von 6,0 bis 7,5, was anzeigt, daß die Substanz nahezu neutral ist.

5. Spezifische Drehung

Die spezifische Drehung (%), [α]D²&sup5;, die aus den optischen Eigenschaften einer wäßrigen Lösung mit einer Konzentration von 0,10 % der vorliegenden Substanz berechnet wurde, liegt im Bereich von -10º bis +30º, was bedeutet, daß die vorliegende Substanz β-Glycan als Hauptbestandteil aufweist.

6. Elementaranalyse

Durch Elementaranalyse wurde festgestellt, daß die vorliegende Substanz zu 5 bis 10 % aus Stickstoff, zu 35 bis 50 % aus Kohlenstoff und zu 5 bis 7 % aus Wasserstoff besteht.
7. Das Gewichtsverhältnis des mit der Phenol-Schwefelsäure- Methode bestimmten Gehalts des Saccharidanteils der vorliegenden Substanz zum mit der Lowry-Folin-Methode bestimmten Gehalt des Proteinanteils der vorliegenden Substanz fällt in den Bereich 60:40 bis 30:70 und vorzugsweise 54:46 bis 35:65.

(3) Strukturmerkmale

Die Merkmale des Proteinanteils und die Merkmale des Saccharidanteils der vorliegenden Substanz sind die folgenden.

1. Merkmale des Proteinanteils

Der Proteinanteil der vorliegenden Substanz wird hydrolysiert und anschließend mit einem Aminosäureanalysator gemäß einem herkömmlichen Verfahren analysiert. Die Aminosäurezusammensetzung ist in der nachstehenden Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Aminosäure Gew.-% Asparaginsäure Threonin Serin Glutaminsäure Glycin Alanin Valin Leucin Prolin Cystein Methionin Isoleucin Tyrosin Phenylalanin Tryptophan Lysin Histidin Arginin (Ammoniak) Spuren
Aus der vorstehend angegebenen Tabelle wird deutlich, daß der Proteinanteil als aktiver Bestandteil der vorliegenden Substanz 18 Aminosäuren enthält, daß er saure Aminosäuren und neutrale Aminosäuren als Hauptbestandteile und basische Aminosäuren als Nebenbestandteile enthält. Es wird ferner deutlich, daß nicht weniger als 70 % der Gesamtmenge an Aminosäuren aus Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Glycin, Alanin, Valin und Leucin bestehen.

2. Struktur des Saccharidanteils

Der Test des Saccharidanteils der vorliegenden Substanz auf die Saccharidzusammensetzung wird durchgeführt, indem 10 mg einer Probe 16 Stunden einer Methanolyse bei 100ºC mit 3 % Methanol-Salzsäure unterworfen werden, das Produkt nach der Methanolyse einer Trimethylsilylbehandlung nach einem herkömmlichen Verfahren unterworfen wird, und das auf diese Weise erhaltene Produkt mittels Gaschromatographie analysiert wird. Die Ergebnisse dieses Tests zeigen, daß das Gewichtsverhältnis von Glucose zu Mannose im Bereich von 2: 1 bis 4 : 1 liegt, und daß die hauptsächlichen Saccharidbestandteile des Saccharidanteils Glucose und Mannose sind, und daß nicht weniger als 75 % des Saccharidanteils aus Glucose und Mannose bestehen. Saccharide, wie Galactose, Xylose, Fucose und Glucosamin sind ebenfalls enthalten.
Um die D-L-Unterscheidung von Glucose, die ein hauptsächlicher Saccharidbestandteil der vorliegenden Substanz ist, durchzuführen, wird der Saccharidanteil hydrolysiert, und die aus dem Hydrolysat isolierten Glucosekristalle werden untersucht, und als Ergebnis wird festgestellt, daß Glucosekristalle einen Schmelzpunkt von 143 bis 145ºC aufweisen, daß sie also keinen Abfall des Schmelzpunktes zeigen und sich als D-Glucose erwiesen.

3. Bindungseigenschaften der Saccharidbestandteile des Saccharidanteils

Die Bindungsposition des Glycosids wird wie folgt bestimmt. Die aus dem Saccharidanteil durch Oxidation mit Perjodsäure und Smith-Abbau isolierten Monosaccharide werden auf die Bindungen G¹-, -&sup4;G¹-,
-³G¹-,
und -&sup6;G¹- untersucht. Der prozentuale Anteil dieser Bindungen wird durch methylierende Hydrolyse gemäß der Haworth-Methode bestimmt. Die Identifikation wird wie folgt durchgeführt. Die durch Hydrolyse des Methylierungsproduktes gebildeten Saccharide werden als Alditacetat und Methylglycosid mittels Gaschromatographie identifiziert. Ferner werden die einzelnen Hydrolysate identifiziert, indem sie mittels Säulen- Flüssigkeitschromatographie isoliert und anschließend direkt kristallisiert oder in kristalline Derivate überführt werden. Die molaren Verhältnisse werden aus den Verhältnissen der Flächen, die im Gaschromatogramm von Alditacetat gebildet werden, bestimmt und zwar basierend auf Tabelle 3 Hydrolysat von methyliertem Saccharid Bindung Molverhältnis
Aus der vorstehend angegebenen Tabelle ist klar ersichtlich, daß der Saccharidanteil der vorliegenden Substanz hauptsächlich mit β-1,4-Bindungen gebildet wird. Der Saccharidanteil enthält jedoch auch β-1,3-Bindungen. Sie weist also eine stark verzweigte Struktur auf.
Es wird daher gefolgert, daß der Saccharidanteil eine durch die folgende allgemeine Formel (I) dargestellte Struktur aufweist:
worin G ein Monosaccharid darstellt, p im Bereich von 0 bis 10 liegt, q im Bereich von 0 bis 5 liegt, m im Bereich von 0 bis 2 liegt, n den Wert 3 oder 4 hat und 1 im Bereich von 0 bis 1 liegt.
Die Bindungen zwischen dem Saccharidanteil und dem Proteinanteil der vorliegenden Substanz enthalten hauptsächlich Bindungen, die über Glucosamin gebildet werden. Die vorliegende Substanz weist speziell eine Struktur auf, bei der eine der Hydroxylgruppen, die an die Kohlenstoffatome in den Positionen C3, C4 und C6 von Glucosamin gebunden sind, an den Saccharidanteil gebunden ist, und die Hydroxylgruppe in der C1-Position und der Proteinanteil aneinander über eine N-glucosidische Bindung gebunden sind.

4. Infrarotspektrum

Das Infrarotabsorptionsspektrum der vorliegenden Substanz wurde mit einem KBr-Preßling erhalten. Es ist in Fig. 1 gezeigt. Man nimmt an, daß die breite Absorption im Bereich von 3600 bis 3200 cm&supmin;¹ in Fig. 1 auf ny(OH) zurückzuführen ist, wobei unterschiedlich starke Wasserstoffbrücken vorhanden sind. Diese Annahme stützt sich auf die Beobachtung, daß diese Absorption verringert wird oder verschwindet, wenn die Hydroxylgruppen des Saccharidanteils der Probe O-methyliert werden. Man nimmt an, daß die Absorption von 1700 bis 1600 cm&supmin;¹ auf die Deformationsschwingung von -NH&sub2; zurückzuführen ist, bzw. daß die Absorption bei 1530 cm&supmin;¹ auf die Deformationsschwingung von -NH zurückzuführen ist, und man nimmt weiter an, daß sie auf den Proteinanteil der Probe zurückzuführen sind. Man nimmt an, daß die breite Absorption bei 1200 bis 1000 cm&supmin;¹ auf die asymmetrische Streckschwingung der C-O-C-Bindung des Pyranoserings im Saccharidanteil zurückzuführen ist. Während die spezifische Absorption, die der β-Konfiguration von Glucose in dem Saccharidanteil zuzuordnen ist, bei 890 cm&supmin;¹ beobachtet wird, wird praktisch keine spezifische Absorption, die der α-Konfiguration zugeordnet wird, bei 840 cm&supmin;¹ beobachtet. In dem vorstehend erwähnten Infrarotabsorptionsspektrum wird kein wesentlicher Fehler im Hinblick auf die vorliegende Substanz festgestellt.

5. Kernmagnetisches Resonanzspektrum (¹H-NMR)

Das NMR-Spektrum der vorliegenden Substanz wurde bei 100 MHz unter Verwendung von schwerem Wasser als Lösungsmittel und Natrium-2,2-dimethyl-2-silanopentan-3-sulfonat (D.S.S.) als internem Standard erhalten. Fig. 2 zeigt das auf diese Weise erhaltene Spektrum. Da bekannt ist, daß die Absorption bei 4,5 ppm dem Methinproton in der Position 1 von β-(1-4) und β-(1-6) und die Absorption bei 4,7 ppm dem Methinproton in der Position 1 von β-(1-4) und β-(1-6) zuzuordnen ist, kann das Verhältnis von β-(1-4) und β-(1-6) zu β-(1-3) bestimmt werden. Da die Struktur der vorliegenden Substanz Verzweigungen enthält, muß eine genaue Klärung der Struktur unausweichlich auf der Methylierungsmethode beruhen. Die Absorption bei 5,0 ppm wird α-(1T6) und die Absorption bei 5,4 ppm α-(1T4) und α-(1T3) zugeordnet.
Bezogen auf D.S.S. besitzt die vorliegende Substanz Absorptionen bei 0,9 ± 0,1 ppm, 1,2 ± 0,1 ppm, 2,0 ± 0,1 ppm, 4,5 ± 0,1 ppm und 4,7 ± 0,1 ppm, keine Absorption im Bereich von 4,9 bis 6,0 ppm und eine breite Absorption im Bereich von 3,0 bis 4,4 ppm. Die Absorptionen im Bereich von 0,5 bis 2,5 ppm werden Seitenkettenprotonen des Proteinanteils zugeordnet, und die im Bereich von 2,5 bis 4,7 ppm werden Protonen des Saccharidanteils zugeordnet.
Wie vorstehend beschrieben ist, handelt es sich bei der vorliegenden Substanz um ein neuartiges β-Glycopeptid, das aus einem proteingebundenen Polysaccharid erhalten wird, das aus Pilzen der Bezeichnung Coriolus der Basidiomycetes abgeleitet ist, und das nach einer NMR-Bestimmung kein α-Glycan enthält, und das nach einer Bestimmung mit Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie unter Verwendung von ultraviolettem Licht bei 254 nm keine Nucleinsäure enthält.

(4) Akute Toxizität

Die vorliegende Substanz ist hochgradig sicher für lebende Organismen, da sie eine sehr geringe Toxizität zeigt und praktisch keine Nebenwirkungen induziert.
Die vorliegende Substanz wurde nach dem folgenden Verfahren auf ihre akute Toxizität getestet.
Es werden 4 bis 5 Wochen alte Mäuse des Stammes ICR-JCL mit einem Gewicht von 21 bis 24 g und 4 bis 5 Wochen alte Ratten des Stammes Donryu mit einem Gewicht von 100 bis 150 g verwendet. Die vorliegende Substanz wird den Tieren intravenös, subkutan, intraperitoneal und oral verabreicht. Die Tiere, denen die vorliegende Substanz verdünnt mit physiologischer Kochsalzlösung verabreicht wird, werden im Hinblick auf allgemeine Symptome, Sterblichkeit und Körpergewicht beobachtet. Am Ende der Beobachtungszeit werden die Tiere für eine anatomische Untersuchung getötet.
Wie in Tabelle 4 gezeigt ist, tötet die vorliegende Substanz, wenn sie in der höchsten erlaubten Dosierung verabreicht wurde, keines der Tiere. In der Tat ist die vorliegende Substanz für lebende Organismen überaus sicher, so daß die Berechnung von LD&sub5;&sub0;-Werten praktisch unmöglich ist.
Die Testergebnisse zeigen, daß die vorliegende Substanz eine sehr geringe akute Toxizität aufweist, und daß sie ein sicheres Arzneimittel darstellt. Tabelle 4 Art des Tieres Art der Verabreichung weiblich männlich Maus Ratte Intravenös Subkutan Intraperitoneal Oral

(5) Test auf antivirale Aktivität

Es ist bekannt, daß ein Virus im allgemeinen über einen Weg reproduziert wird, der die Ablagerung des Virus aus der Zielzelle, die Injektion der Nucleinsäure des Virus in die Zelle und die nachfolgende Integration der Nucleinsäure in das Genom der Zelle umfaßt. Im Fall eines Retrovirus umfaßt der Weg der Reproduktion eine Stufe, in der RNA, die aus dem Virus abgeleitete Nucleinsäure, in DNA übergeführt wird, und zwar unter Wirkung von RTxase, bevor die Nucleinsäure in das Genom der Zelle integriert wird.
Die Erfinder haben festgestellt, daß die vorliegende Substanz die Ablagerung von HIV auf menschlichen lymphatischen Zellen und die nachfolgende Infektion mit der Krankheit verhindert, und daß sie ferner die Aktivität von RTxase hemmt. Wenn die vorliegende Substanz auf ihre Wirkung auf HIV nach einem Verfahren, das die Behandlung von HIV mit der vorliegenden Substanz in einer Konzentration von 50 ug/ml (die in den Beispielen 1 bis 4 verwendete vorliegende Substanz) bei 0ºC für 2 Stunden, das Waschen der behandelten HIV, die Zugabe der gewaschenen HIV zu MT-4-Zellen, das 3-tägige Inkubieren des erhaltenen Gemisches und anschließend das Zählen der HIV- Antigen-positiven Zellen umfaßt, getestet wird, dann wird festgestellt, daß praktisch alle der HIV-Antigen-positiven Zellen nicht mehr vorhanden sind, was anzeigt, daß die vorliegende Substanz hochgradig wirksam bei einer Verhinderung der Ablagerung von HIV auf menschlichen lymphatischen Zellen ist. Wenn die vorliegende Substanz auf eine mögliche Wirkung auf die Aktivität von RTxase unter Verwendung der gesamten Messenger-RNA aus Rattenleber als Matrize getestet wird, dann zeigt sich, daß die vorliegende Substanz die Aktivität von RTxase stark hemmt, und zwar selbst bei einer Konzentration von 5 ug/ml.
Wenn die vorliegende Substanz als antivirales Arzneimittel verwendet wird, dann kann sie in jeder gewünschten Form formuliert werden. Die Verabreichung der vorliegenden Substanz kann in jeder gewünschten Weise erfolgen.
Wenn die vorliegende Substanz in Form von Tabletten, Pellets, Pulver oder Kapseln zur oralen Verabreichung zubereitet wird, dann können in die darin enthaltene Zusammensetzung in geeigneter Weise Additive, wie Bindemittel, Umhüllungsstoffe, Arzneimittelträger, Gleitmittel, Mittel zur Verbesserung der Rieselfähigkeit und Benetzungsmittel einverleibt werden, wie sie allgemein pharmazeutisch verwendet werden. Wenn die vorliegende Substanz in Form einer Lösung zur oralen Verabreichung verwendet wird, dann kann sie als Lotion zur inneren Anwendung, als Schüttelmixtur, als Suspension, Emulsion oder Sirup zubereitet werden. Sie kann auch als trockenes Produkt, das unmittelbar vor der Anwendung wieder aufgelöst wird, zubereitet werden. In eine derartige flüssige Arzneimittelzubereitung können beliebige Additive und Konservierungsmittel, die allgemein im Gebrauch sind, einverleibt werden. Wenn die vorliegende Substanz in Form einer Lösung zur Verabreichung durch Injektion zubereitet wird, dann können in die Zusammensetzung dieser Lösung beliebige verschiedene Additive, wie Stabilisatoren, Pufferlösungen, Konservierungsmittel und isotonische Mittel, einverleibt werden. Sie kann als Ampulle mit einer Einheitsdosis oder in Arzneimittelfläschchen dargereicht werden. Die zuvor erwähnte Zusammensetzung kann in Form einer wäßrigen Lösung, Suspension, Lösung oder Emulsion in öligen oder wäßrigen Trägern vorliegen. Der aktive Bestandteil kann in Form eines Pulvers vorliegen, das, vor der tatsächlichen Anwendung, in einem geeigneten Träger, wie sterilisiertem Wasser ohne Gehalt an pyrogenen Substanzen, wieder aufgelöst wird.
Die vorliegende Substanz wird oral oder parenteral an Menschen und Tiere verabreicht. Die orale Verabreichung umf aßt eine Form der Verabreichung, bei der die Arzneimittelzubereitung unter der Zunge des Patienten angeordnet wird. Die parenterale Verabreichung umfaßt eine Form der Verabreichung, die durch subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion oder durch Instillation bewirkt wird. Die Dosierung des erfindungsgemäßen antiviralen Mittels wird durch die Unterscheidung zwischen Tieren und Menschen als Behandlungssubjekten, das Alter und die Individualität des besonderen Subjekts für die Behandlung und den Zustand der Krankheit beeinflußt. Gelegentlich muß die Dosierung von dem nachstehend anzugebenden Bereich abweichen. Im allgemeinen liegt die tägliche Dosis bei oraler Verabreichung an einen Menschen im Bereich von 0,1 bis 1000 mg und vorzugsweise 1 bis 100 mg pro kg Körpergewicht, wobei die Dosis ungeteilt oder in zwei oder drei Portionen unterteilt einzunehmen ist.
Die vorliegende Substanz ist wirksam bei der Hemmung einer viralen Ansteckung und insbesondere zur Verhinderung einer Ansteckung mit einem Retrovirus, der reverse Transkriptase enthält, und bei der Unterdrückung von AIDS, das durch HIV- Infektion verursacht wird.
Ferner hat die vorliegende Substanz die doppelte Wirkung einer Verhinderung der Ablagerung von HIV auf menschlichen lymphatischen Zellen und der nachfolgenden Infektion und einer Hemmung der RTxase-Aktivität.
AZT, das bereits als Arzneimittel gegen AIDS eingesetzt wird, zeigt als Nebenwirkung eine Hemmung der Mitose auch von normalen Zellen. Im Gegensatz dazu weist die vorliegende Substanz eine überaus geringe akute Toxizität auf, zeigt praktisch keine Nebenwirkungen auf normale Zellen und stellt ein sicheres Arzneimittel dar. Sie ist nützlich als antivirales Mittel, da sie eine Hemmwirkung im Hinblick auf eine Infektion mit einem Virus und insbesondere mit einem Retrovirus zeigt. Genauer gesagt ist die vorliegende Substanz wirksam bei der Verhinderung der Infektion mit einem Virus und insbesondere der Infektion mit einem Retrovirus, und zwar speziell bei der Unterdrückung von AIDS. Selbst wenn die vorliegende Substanz in Kombination mit anderen Mitteln, wie AZT, als antivirales Mittel verwendet wird, dann wird die von der vorliegenden Substanz gezeigte Wirkung nicht gestört. Auf diese Weise ist die kombinierte Verwendung der vorliegenden Substanz zusammen mit anderen Medikamenten eine wirksame Maßnahme.
Die Erfindung wird nun mit Bezug auf Beispiele ausführlicher erläutert. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß die Erfindung durch diese Beispiele nicht beschränkt wird.

Beispiele 1 bis 4

Die Stämme CM 101 von Coriolus versicolor (Fr.) Quèl [Fermentation Research Institute Deposit (FERM) P Nr. 2412 (entsprechend ATCC 20547); Beispiele 1 und 2), CM 102 von Coriolus versicolor (Fr.) Quèl [FERM-P 2413 (entsprechend ATCC 20548); Beispiel 3] und CM 103 von Coriolus versicolor (Fr.) Quèl [FERM-P 2414 (entsprechend ATCC 20549); Beispiel 4] wurden in einen 200 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben mit 30 ml eines Kulturmediums mit 5 % Glucose, 0,2 % Pepton, 0,3 % Hefeextrakt, 0,1 % KH&sub2;PO&sub4; und 0,01 % MgSO&sub4; 7H&sub2;O überimpft und 10 Tage einer stationären Kultur bei einer Temperatur im Bereich von 25 bis 27ºC unterworfen. Das auf diese Weise an der Oberfläche des Kulturmediums gewachsene pilzliche Lichen wurde mit physiologischer Kochsalzlösung homogenisiert, um eine Vorkultur herzustellen. Anschließend wurde die vorstehend erwähnte Vorkultur in einen 1 Liter fassenden Kulturbehälter mit 200 ml des vorstehend beschriebenen Kulturmediums überimpft und 25 Tage bei 25 bis 27ºC darin kultiviert, um ein Myzel des entsprechenden Stammes herzustellen. Die Menge des auf diese Weise erhaltenen Myzels betrug 4 bis 4,3 g pro Behälter im Fall von CM 101, 2,0 bis 2,5 g pro Behälter im Fall von CM 102 und 2,7 bis 3,2 g pro Behälter im Fall von CM 103.
Anschließend wurden 100 g Myzel jedes Stammes 3 Stunden unter Rühren mit 3 Liter destilliertem Wasser bei 98ºC extrahiert. Am Ende der Extraktion wurden der Extrakt und der Rückstand mit einer Separatorzentrifuge voneinander getrennt. Diese Behandlung zur Extraktion wurde mit dem auf diese Weise abgetrennten Rückstand wiederholt. Die Extrakte der aufeinanderfolgenden Behandlungen wurden gesammelt und zur Abtrennung des Rückstandes zentrifugiert. Anschließend wurde das erhaltene Filtrat eingeengt.
Das Filtrat wurde mit einer wäßrigen Lösung von Ammoniumsulfat, die zu 100 % gesättigt war, behandelt, um einen Niederschlag zu bilden. Anschließend wurde der Niederschlag in Wasser wieder aufgelöst, und die erhaltene Lösung wurde durch Dialyse unter Verwendung einer Cellulosemembran entsalzt. Die entsalzte Lösung wurde mit einer 25 %-igen wäßrigen Ammoniumsulfatlösung behandelt. Der dadurch erhaltene Niederschlag wurde wieder aufgelöst und durch Dialyse entsalzt. Die entsalzte Lösung wurde unter Verwendung einer DEAE-Ionenaustausch-Cellulose-Säule adsorbiert. Die adsorbierten Substanzen wurden mit wäßriger Natriumchloridlösung (1 Mol) eluiert. Das Eluat wurde durch Ultrafiltration entsalzt, dann eingeengt und sprühgetrocknet. Man erhielt die gewünschte, erfindungsgemäße Substanz. Das in den Beispielen 2 bis 4 verwendete Extraktionsverfahren wurde in der gleichen Weise wie das vorstehend beschriebene Verfahren durchgeführt, mit der Ausnahme, daß eine wäßrige 1/10 n Natriumhydroxidlösung anstelle von Wasser bei der Reextraktion des Rückstandes verwendet wurde, und daß der pH- Wert der Extrakte nach Abschluß der Extraktion eingestellt wurde.
Das Infrarotabsorptionsspektrum der Substanz, das mit einem KBr-Preßling erhalten wurde, ist in Tabelle 5 angegeben und in Fig. 1 gezeigt. In diesem Spektrum sind die Absorption für ny(OH) bei 2600 bis 3200 cm&supmin;¹, die Deformationsschwingung für NH&sub2; bei 1700 bis 1600 cm&supmin;¹, die Deformationsschwingung für NH bei 1530 cm&supmin;¹, der breite Absorptionsbereich bei 1200 bis 1000 cm&supmin;¹, der der Schwingung der C-O-C-Gruppe im Pyranosering des Saccharidanteils zuzuordnen ist, und die spezifische Absorption bei 890 cm&supmin;¹, die der β-Verknüpfung des Saccharidanteils zuzuordnen ist, sichtbar, aber die Absorption bei 840 cm&supmin;¹, die der α-Verknüpfung zuzuordnen ist, ist nicht deutlich sichtbar.
Da die Infrarotabsorptionsspektren, die für die vier Proben (Beispiele 1 bis 4) erhalten wurden, sich nur wenig unterscheiden, ist das Spektrum der Probe von Beispiel 1 als repräsentatives Spektrum abgebildet.
Die NMR-Untersuchung wurde unter Verwendung von D.S.S. als internem Standard und schwerem Wasser als Lösungsmittel durchgeführt.
Da sich die für die vier Proben (Beispiele 1 bis 4) erhaltenen NMR-Spektren sehr wenig unterschieden, ist das Spektrum der Probe aus Beispiel 1 als repräsentatives Spektrum abgebildet.
Durch Gelpermeationschromatographie unter Verwendung einer Sepharose-Säule wurde festgestellt, daß das Molekulargewicht in den Bereich von 50 000 bis 3 000 000 und das mittlere Molekulargewicht in den Bereich von 110 000 bis 300 000 fällt.
Zur Analyse der Aminosäuren wurden folgende Stufen durchgeführt: Mischen von 10 mg einer Probe mit 4 ml einer wäßrigen 6 n Salzsäurelösung, Einfrieren des erhaltenen Gemisches mit Trockeneis-Aceton, anschließendes dichtes Verschließen eines das gefrorene Gemisch enthaltenden Röhrchens unter Vakuum, Erwärmen des Inhalts des dicht verschlossenen Röhrchens auf 110ºC für 24 Stunden, um eine Hydrolyse zu bewirken, Trocknen des erhaltenen Hydrolysats, Auflösen des getrockneten Hydrolysats in 30 bis 40 ml Citratpuffer bei einem pH-Wert von 2,2 und Analyse der erhaltenen Lösung mit einem Aminosäureanalysator.
Die spezifische Drehung wurde durch Messung der optischen Drehung (α) einer wäßrigen Lösung mit einer Konzentration von 0,10 % einer Probe unter Verwendung der D-Linie (589 nm) von Natrium in einer Zelle von 5 cm und Berechnung der spezifischen Drehung [α]D²&sup5; aus dem Wert der optischen Drehung (α) durchgeführt.
Die Analyse des Saccharids auf Monosaccharide wurde durch Einfüllen einer Probe von 3 mg in eine Glasampulle mit einem Durchmesser von 5 mm, Unterwerfen der Probe einer Methanolyse mit 1,0 ml einer 3 %-igen methanolischen Chlorwasserstofflösung bei 100ºC für 16 Stunden, Neutralisieren der dabei gebildeten Salzsäure mit Silbercarbonat bei Raumtemperatur, Abtrennen des Produkts der Neutralisation durch Filtration, Einengen des Filtrats zur Trockene, Auflösen des eingeengten Filtrats in 0,5 ml trockenem Pyridin, Zugabe von 0,2 ml Hexamethyldisilazan und 0,3 ml Trimethylchlorsilan zu der gebildeten Lösung und Belassen des erhaltenen Gemisches bei Raumtemperatur für 30 Minuten, um die Trimethylsilylierung zu bewirken, anschließendes Auflösen des erhaltenen Produkts in Chloroform, Waschen der erhaltenen Lösung mit kaltem Wasser zur Entfernung überschüssiger Reagenzien, Dehydratisierung der gewaschenen Lösung, Einengen des Filtrats zur Trockene, Auflösen des Rückstandes der Destillation in Tetrachlorkohlenstoff und Analyse der erhaltenen Lösung mittels Gaschromatographie durchgeführt.
Die Art der Verknüpfung der Saccharide wurde nach der Haworth-Methode bestimmt. Genauer gesagt, wurde diese Bestimmung durch Auflösen einer Probe von 2 g in 10 ml einer wäßrigen, 1 n NaOH-Lösung, kräftiges Rühren der erhaltenen Lösung unter einem Stickstoffstrom bei 40 bis 50ºC und gleichzeitige tropfenweise Zugabe über einen Zeitraum von mehreren Stunden von 20 ml Dimethylschwefelsäure und 40 ml einer wäßrigen, 30 %-igen Natriumhydroxidlösung, Belassen des erhaltenen Gemisches über Nacht, Behandlung der erhaltenen Lösung mit der gleichen Menge an Methylierungsmittel, Neutralisieren der erhaltenen Reaktionslösung, Dialyse des Produktes der Neutralisation mit laufendem Wasser, Einengen des Dialysats im Vakuum, anschließende dreifache Wiederholung der zuvor beschriebenen Methylierung, erneute Neutralisierung und Dialyse des Produktes der Methylierung mit laufendem Wasser, anschließendes Einengen des Dialysats unter Vakuum bis zur Trockene, Auflösen des Rückstandes der Destillation in 20 ml eines Gemisches aus Chloroform und Methanol (10 : 1), Zugabe eines Gemisches aus Petrolether und Ether (1 : 1) zu der erhaltenen Lösung, um das Methylierungsprodukt auszufällen, anschließende Hydrolyse von etwa 20 mg des Methylierungsproduktes mit einer wäßrigen 1 n Schwefelsäurelösung bei 100ºC für 16 Stunden und Einführen des Hydrolysates in Alditacetat durch ein herkömmliches Verfahren, um ein Gaschromatogramm zu erhalten, durchgeführt. Die molaren Verhältnisse der Monosaccharide wurden aus den Peakflächen des Gaschromatogramms bestimmt.
Die vorstehend erwähnten Abbauprodukte wurden in den entsprechenden Gaschromatogrammen unter Verwendung von Standardprodukten identifiziert. Dann wurden die Hydrolysate durch Säulen-Flüssigkeitschromatographie isoliert und zur Identifikation direkt kristallisiert oder in kristalline Derivate übergeführt.
Ferner wurden die Farbreaktionen, die Elementaranalyse, die akute Toxizität (LD&sub5;&sub0;), der pH-Wert und die Löslichkeit in jeweils gleicher Weise nach herkömmlichen Methoden gemessen. Die Messungen, für die die Verfahrensweisen vorstehend ausführlich beschrieben worden sind, wurden gemäß diesen Verfahren durchgeführt.
Nucleinsäuren wurden in den vier Proben (Beispiele 1 bis 4) durch Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie unter Verwendung von ultraviolettem Licht bei 254 nm nicht gefunden.
Die auf die vorstehend beschriebene Weise bestimmten Eigenschaften und strukturellen Merkmale der vorliegenden Substanz sind in den nachstehenden Tabellen zusammengestellt.
Das Ausmaß, mit dem die vorliegende Substanz die Aktivität der reversen Transkriptase im Fall des Retrovirus spezifisch hemmt, wurde nach der folgenden Methode bestimmt.
In 10 ml sterilisiertem, destilliertem Wasser wurden 100 ug einer gefriergetrockneten Probe der vorliegenden Substanz aufgelöst (Konzentration 10 ug/ml).
In einem Eppendorf-Röhrchen mit einem Innenvolumen von 1,5 ml wurden 1 ul 20 millimolar D.T.T. (Dithiothreit; Firma Sigma Co.), 5 ul einer Enzymreaktionslösung mit 5-facher Konzentration (250 millimolar Tris-HCl (pH-Wert 8,3), 250 millimolar KCl, 40 millimolar MgCl&sub2;), 1 ul einer 3d-NTP- Lösung (1 millimolar dATP, 1 millimolar dGTP, 1 millimolar dTTP; Firma Sigma Co.), 1 ul Messenger-RNA (entnommen aus normaler Rattenleber; 1 ug/ul), 0,5 ul RNase-Hemmstoff (16 Einheiten/ul; Fa. Takara Shuzo K.K.) und 1 ul von [α-³²P] dCTP (etwa 800 ci/mMol, 10 uCi/ul; Fa. Amersham Japan K.K.) vorgelegt. Das Röhrchen wurde in einem Wasserbad bei 37ºC angeordnet.
Nach 5-minütigem Stehenlassen des Reaktionsröhrchens in dem Bad wurden 12,5 ul der vorliegenden Substanz, die zuvor in einer Konzentration von 10 ug/ml hergestellt wurde, zu dem Reaktionsröhrchen gegeben, und 1 ul RTxase (abgeleitet aus dem Rous-Virus, 7 Einheiten/ul; Fa. Takara Shuzo K.K.) wurde ferner zugegeben. Die Reaktionslösung wurde auf ein Endvolumen von 25 ul verdünnt und bei 37ºC gehalten, um die Reaktion zu induzieren.
Nachdem die Reaktion 1 Stunde abgelaufen war, wurde ein DEAE- Papier von 2 cm x 2 cm (Fa. Toyo Roshi K.K.) mit 5 ul der Reaktionslösung getränkt. Das nasse Papier wurde an der Luft getrocknet. Das getrocknete Filterpapier wurde unter Schütteln in 10 ml pro Blatt einer wäßrigen, 0,5 m Na&sub2;HPO&sub4;- Lösung getaucht, um den bei der DNA-Synthese nicht verbrauchten Anteil von [α-³²P] dCTP zu entfernen. Dieses Verfahren wurde in Intervallen von 5 Minuten 5 mal wiederholt.
Anschließend wurde das zuvor erwähnte DEAE-Filterpapier in ein Glasfläschchen mit 10 ml einer Szintillationsflüssigkeit (Fa. Amersham Japan K.K.) gegeben, und die Radioaktivität wurde 1 Minute mit einem Szintillationszähler (Fa. Aroka K.K.) gezählt.
Das Verhältnis der Hemmung der Aktivität von RTxase (%) wurde gemäß folgender Formel berechnet.
Verhältnis der Hemmung der RTxase-Aktivität (%) = CO - CS/CO x 100
worin CO die Radioaktivität in Abwesenheit der vorliegenden Substanz und CS die Radioaktivität in Gegenwart der vorliegenden Substanz bedeutet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.
Die Hemmung der Ablagerung von HIV (AIDS-Virus) auf menschlichen Lymphozyten, die durch die vorliegende Substanz bewirkt wird, wurde gemäß dem folgenden Verfahren getestet. (Das gesamte Verfahren wurde unter sterilen Bedingungen durchgeführt.)
Ein Teströhrchen mit 1 ml einer HIV-Suspension und 1 ml einer Lösung der Substanz (100 ug/ml) wurde in Ruhe auf Eis belassen. Nachdem das Teströhrchen 2 Stunden in dem Eis stand, wurde 1 ml der Virussuspension auf Zellen eines Stammes, der von menschlichen Lymphozyten abgeleitet war, mit der Bezeichnung MT-4 [Jpn. J. Cancer Res. (Gann)., Bd. 28, S.219-229 (1982)] bei einem Infektionsgrad (M.O.I.) = 2 gegeben. Das erhaltene Gemisch wurde zentrifugiert (2000 U/min für 10 Minuten). Der Überstand wurde verworfen, und die sedimentierten MT-4-Zellen wurden in RPMI 1640 (Gibco Laboratories, NY) mit einem Gehalt an 20 % FCS in einer Zellkonzentration von 2 x 10&sup5;/ml aufgeschlämmt.
Auf einer Platte mit 96 Löchern wurde die zuvor erwähnte MT- 4-Zellsuspension in einem Einheitsvolumen von 100 ul verteilt und unter Bedingungen von 5 % CO&sub2; und 37ºC inkubiert. Am dritten Tag der Inkubation wurden die Probesuspensionen nach der indirekten Fluoreszenz-Antikörper-Methode analysiert, um Zellen mit einer infektiösen HIV-Ablagerung und Zellen ohne Ablagerung zu bestimmen.
Genauer gesagt wurden die MT-4-Zellen durch Behandlung mit Methanol verfestigt und man ließ sie mit Antiserum eines HIV- infizierten Patienten bei 37ºC reagieren. Nach 30-minütiger Reaktion wurden die Zellen mit PPS gewaschen, und anschließend ließ man sie bei 37ºC mit Fluorescein- Isothiocyanat-assoziiertem Kaninchen-anti-Mensch-IgG (Immunglobulin) reagieren.
Unter einem Fluoreszenzmikroskop wurden 500 MT-4-Zellen beobachtet, um Fluoreszenz-positive Zellen mit adsorbiertem HIV und Fluoreszenz-negative Zellen ohne adsorbiertes HIV zu zählen. Das Verhältnis der Hemmung der HIV-Ablagerung (%) wurde gemäß der folgenden Formel unter Verwendung der Ergebnisse der mikroskopischen Beobachtung berechnet.
Hemmung der HIV-Ablagerung (%) = Zahl der Zellen ohne HIV-Adsorption x 100 / Zahl der Zellen mit HIV-Adsorption + Zahl der Zellen ohne HIV-Adsorption
Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.

Vergleichsbeispiel 1

Das Verhältnis der Hemmung der RTxase-Aktivität und das Verhältnis der Hemmung der HIV-Ablagerung für Krestin wurde unter den gleichen Bedingungen wie in den Beispielen 1 bis 4 untersucht. Die dabei gefundenen Verhältnisse lagen jeweils unter 10 %.

Beispiel 5

Kapseln wurden durch Füllen harter Kapseln Nr. 0 mit 330 mg der in Beispiel 1 erhaltenen Substanz unter Druck mit Hilfe einer automatischen Füllmaschine hergestellt. Tabelle 5 Beispiel Nr. Extraktionsverfahren Molekulargewicht (x 10&sup4;) Mittleres Molekulargewicht Farbreaktion (Saccharid) α-Naphthol-Schwefelsäure-Reaktion Indol-Schwefelsäure-Reaktion Anthron-Schwefelsäure-Reaktion Phenol-Schwefelsäure-Reaktion Tryptophan-Schwefelsäure-Reaktion Farbreaktion (Protein) Lowry-Folin-Methode Nihydrin-Reaktion nach Hydrolyse mit Salzsäure (6 n HCl, 20 Std. heißes Wasser purpur braun grün blau purpurstichig blau wäßrige alkalische Lösung Beispiel Nr. Spezifische Drehung pH-Wert ¹H-NMR-Spektrum Infrarotabsorptionsspektrum ja nein Beispiel Nr. Saccharid Protein Analyse der Saccharide (Art der Verknüpfung) Glucose Mannose Galactose Xylose Fucose Glucosamin Spuren Verhältnis der Monosaccharide Glucose/Mannose Stickstoffgehalt Kohlenstoffgehalt Wasserstoffgehalt Aminosäure Threonin Serin Glutaminsäure Asparaginsäure Prolin Glycin Alanin Cystein Valin Methionin Isoleucin Leucin Tyrosin Phenylalanin Tryptophan Lysin Histidin Arginin (Ammoniak) Gesamtgehalt an Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Glycin, Alanin, Valin und Leucin Akute Toxizität für Mäuse Intravenös Subkutan Intraperitoneal Oral männlich weiblich Akute Toxizität für Ratten Intravenös Subkutan Intraperitoneal Oral Verhältnis der Hemmung der Aktivität von RTxase* Verhältnis der Hemmung der Aktivität der Ablagerung von HIV

Claims

1. Proteingebundenes Polysaccharid,

(i) das ein mittels Gelpermeationschromatographie bestimmtes Molekulargewicht von 50 000 bis 3 000 000 besitzt;

(ii) das eine charakteristische positive Farbreaktion in der α-Naphthol-Schwefelsäure-Reaktion, in der Indol- Schwefelsäure-Reaktion, in der Anthron-Schwefelsäure- Reaktion, in der Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, in der Tryptophan-Schwefelsäure-Reaktion, bei der Lowry-Folin- Methode und, nach Hydrolyse mit Salzsäure, in der Ninhydrin-Reaktion zeigt;

(iii) bei dem das Verhältnis des Gewichts des Proteinanteils, das nach der Lowry-Folin-Methode bestimmt wurde, zum Gewicht des Polysaccharidanteils, das nach der Phenol-Schwefelsäure-Methode bestimmt wurde, von 40:60 bis 70:30 beträgt;

(iv) das eine Löslichkeit in Wasser zeigt und unlöslich in Pyridin, Chloroform, Benzol, Hexan und Methanol ist;

(v) das eine spezifische Drehung [α]D²&sup5; von -10º bis +30º zeigt;

(vi) das im Infrarotabsorptionsspektrum eine charakteristische Absorption bei 890 cm&supmin;¹ zeigt;

(vii) das die Aminosäuren Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Glycin, Alanin, Valin und Leucin in einer Menge von nicht weniger als 70 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Aminosäuren im Proteinanteil, aufweist;

(viii) das als Saccharide Glucose und Mannose in einer Menge von nicht weniger als 75 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Saccharide in dem Saccharidanteil, aufweist, wobei das Verhältnis von Glucose zu Mannose 2:1 bis 4:1 beträgt;

(ix) das keine Nucleinsäuren enthält, wobei die Messung mittels Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie unter Verwendung von ultraviolettem Licht bei 245 nm erfolgt; und

(x) wobei der Saccharidanteil durch die folgende Strukturformel (I) dargestellt wird:

wobei G ein Monosaccharid darstellt, p einen Wert von 0 bis 10, q einen Wert von 0 bis 5, m einen Wert von 0 bis 2, n einen Wert von 3 oder 4 und 1 einen Wert von 0 oder 1 besitzt.

2. Polysaccharid nach Anspruch 1, das ein mittels Gelpermeationschromatographie gemessenes mittleres Molekulargewicht von 110 000 bis 300 000 besitzt.

3. Polysaccharid nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Saccharidanteil über einen Glucosaminrest an den Proteinanteil gebunden ist.

4. Polysaccharid nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Verwendung als antiretrovirales Mittel.

5. Polysaccharid nach Anspruch 4 zur Verwendung bei der Behandlung von AIDS.

6. Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids, wie es in Anspruch 1 definiert ist, wobei das Verfahren das Kultivieren eines Pilzes der Bezeichnung Coriolus der Basidiomycetes, das Extrahieren des Myzels und/oder der Fruchtkörper mit Wasser oder einer wäßrigen alkalischen Lösung und das Isolieren des Polysaccharids aus dem Extrakt durch Aussalzen des Extrakts mit Ammoniumsulfat und Unterwerfen der erhaltenen Lösung einer Reinigung über eine Ionenaustausch-Cellulose-Säule, umfaßt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei es sich bei dem Pilz um den Stamm CM 101, CM 102 oder CM 103 von Coriolus versicolor (Fr.) Quél. handelt.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, bei dem eine Lösung des Niederschlags, der durch Aussalzen des Extrakts mit gesättigtem Ammoniumsulfat erhalten wurde, entsalzt wird, und bei dem das Polysaccharid durch folgende Stufen erhalten wird: (1) Aussalzen der erhaltenen Lösung mit Ammoniumsulfat bei einem Sättigungsgrad von 25 %, Entsalzen einer Lösung des erhaltenen Niederschlages, Aufbringen der entsalzten Lösung auf eine DEAE-Ionenaustausch-Cellulose-Säule, Eluieren des Adsorbats mit einer wäßrigen Natriumchloridlösung und Entsalzen des Eluats oder (2) Aufbringen der auf diese Weise entsalzten Lösung auf eine DEAE-Ionenaustausch- Cellulose-Säule, Eluieren des Adsorbats mit einer wäßrigen Natriumchloridlösung, Entsalzen des Eluats, Aussalzen der erhaltenen Lösung mit Ammoniumsulfat bei einem Sättigungsgrad von 25 % und Entsalzen einer Lösung des erhaltenen Niederschlages.

9. Pharmazeutische Zusammensetzung, die als aktiven Bestandteil ein proteingebundenes Polysaccharid, wie es in Anspruch 1 definiert ist, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.