DE2919545B2 - L-Leucin-4-hydroxyanilid-derivate, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung zur Bestimmung der Aktivität von Leucinaminopeptidase - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft L-Leucin-4-hydroxyanilid-derivate, ein Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung zur Bestimmung der Leucin-aminopeptidase-Aktivität gemäß den vorstehenden Ansprüchen.

Leucin-aminopeptidase (im folgenden als LAP bezeichnet) ist ein Enzym, welches in der Lage ist, aus L-Peptiden Leucin freizustehen bzw. abzuspalten, und zwar insbesondere von solchen Peptidverbindungen, welche am Aminoende Leucingruppen aufweisen. Dieses Enzym ist in Geweben vom Lebewesen weit verbreitet und kommt ebenfalls in Seren vor. Es ist bekannt, daß sich der LAP-Gehalt eines Serums in Abhängigkeit vom Zustand des jeweiligen Lebewesens, stark ändert. Die LAP-Aktivität im Serum eines Patienten, welcher an akuter Hepatitis, einem Häpatom, einem metastatischen Häpatom, einer Leberzirrhose oder an Cholangie leidet, nimmt zu. Aus diesem Grunde wird die LAP-Aktivität als eine Indikation der vorstehend genannten Krankheiten gewertet und der Nachweis der LAP-Aktivität wurde zu einem unentbehrlichen Test zur Diagnose dieser Krankheiten.

Zum Nachweis der LAP-Aktivität sind mehrere Methoden bekannt, wobei meistens die aus synthetischen Substraten durch Einwirkung von LAP freigesetzten Verbindungen colorimetisch bestimmt werden.

Da jedoch alle diese Methoden Nachteile aufwiesen, war es erforderlich, neue synthetische Substrate zu entwickeln. Zum Beispiel erfordert die L-Leucyl-j3-naphthylamid-Methode (Cancer, Band 11, 283 (1958)) j3-Naphtylamin als Standardsubstanz. Aufgrund der Carcinogenität ist die technische Herstellung von /?-Naphthylamin verboten und bei der Verwendung von /?-Naphthylamin ist es erforderlich, eine entsprechende Schutzausrüstung zu tragen und die größte Sorgfalt anzuwenden. Der Einfluß von Serumbestandteilen ist bei einer Methode, bei welcher L-Leucin-p-nitroanilid als Substrat verwendet wird, und das gebildete gelbe p-Nitroanilin.colorimetrisch bestimmt wird, unvermeidbar (Klin. Wochenschr., Band 45, 474 (1967)). Die colorimetrische Bestimmung von p-Nitroanilin nach der Kondensation mit Dimethylaminozimtaldehyd läßt in ihrer Reproduzierbarkeit zu wünschen übrig, da die Farbentwicklung gegenüber Temperaturveränderungen zu empfindlich ist Kürzlich wurde ein Versuch unternommen, die LAP-Aktivität unter Verwendung "on einem L-Leucyl-p-aminoanilid-derivat als Substrat zu bestimmen und das gebildete p-Aminoanilid-derivat nach oxidativer Kondensation mit. einem geeigneten Kuppler colorimetrisch zu bestimmen (DE-OS 26 46 033). Dieses Verfahren weist insofern Nachteile auf, als die Substratreaktivität mit der von L-Leucyl-j3-naphthylamid vergleichbar oder etwas geringer ist und die Methode zu hohe Aktivitätswerte ergibt, wenn sie beim Serum einer Schwangeren angewandt wird.

Aufgabe der Erfindung ist ez, ein Substrat zum Nachweis bzw. zur Bestimmung der LAP-Aktivität zur Verfugung zu stellen, welches in Wasser in ausreichendem Maße löslich ist und mit welchem die Nachteile der

2(1 bekannten Methoden in bezug auf Sicherheit, Reproduzierbarkeit, Stabilität Reaktivität und Selektivität vermieden werden.

Diese Aufgabe wird durch die L-Leucin-4-hydroxyanilid-derivate gemäß Patentanspruch 1 gelöst.

2i Die erPndungsgemäßen Verbindungen in freier Form sind in Wasser in ausreichendem Maße löslich und weisen gegenüber LAP eine Substratreaktivitäi auf, die zweimal so hc.?h oder höher ist als die eines der üblichen Substrate. Dies wird in der Tabelle gezeigt.

Tabelle

Substratreaktivität*)

Substrat

KeUilivc SuhslratreakliviUil

Bekanntes Substrat:

L-Lcucin-Zi-nuphlhylamid KX)

L-Leucin-4-N,N-diäthylaminoanilid 81

L-Leucin-pnitroanilid 95

erfindungsgcma'ßes Substrat:
L-Lcucin-3-earboxy-4-hydroxyanilid 223

L-Leucin-3-sull'o-4-hydroxyanilid 263

*) gemessen an Serum von gesunden Menschen.

Die vorstehend genannten Eigenschaften bewirken die Vorteile der erfindungsgemäßen Substrate, wie die einfache Herstellung der Reagentien, die Verminderung der zum Nachweis erforderlichen Zeil: oder die Verminderung der für die Bestimmung erforderlichen Probenmenge.

Bei der Durchführung der Bestimmung der LAP-Aktivität läßt man ein erfindungsgemäßes Substrat mit LAP eines Serums in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6,5 bis 7,5 reagieren und unterwirft das bei der Reaktion gebildete 4-Hydroxyanilin-derivat einer oxidativen Kondensation mit einem geeigneten Kuppler unter Bildung einer gefärbten Substanz, welche dann zur Bestimmung der LAP-Aktivität im Serum colometrisch bestimmt wird.

Geeignete Kuppler für die Farbentwicklung ;in sauren Milieu sind Anilinverbindungen, wie N.N-Di;iih\ lanilin, wahrend Kuppler für die Färbern« icUung im

Alkalischen zu den Phenol- und Naphtolverbindungen gehören, z. B.m-Kresol.

Das bei der vorstehend genannten oxidativen Kondensation am besten geeignete Oxidationsmittel ist Natriummetaperjodat, obwohl verschiedene andere, wie Wasserstoffperoxid oder Persulfate ebenfalls verwendet werden können.

Die durch oxidative Kondensation eines Kupplers und dem Reaktionsprodukt von LAP und der erfindungsgemäßen Verbindung gebildete gefärbte Substanz weist in Abhängigkeit von der Art des Kupplers einen weiten Weüenlängenbereich von 560 bis 770 nm auf. Die Farbentwicklung wird durch eine Veränderung der Reaktionstemperatur und der Reaktionszeit nur sehr wenig beeinflußt und ist in ausreichendem Maße stetig, um den wichtigsten Anforderungen an ein Reagenz, welches zu einem derartigen Nachweis verwendet wird, zu entsprechen.

Nach den üblichen Methoden wird die Colorometrie bei einer unterhalb 560 nm liegenden Wellenlänge durchgeführt, wohingegen die colorimetrische Bestimmung der erfindungsgemäßen Methode bei einer über 560 nm liegenden Wellenlänge erfolgt. Aus diesem Grunde wird die colorimetrische Bestimmurg der erfindungsgemäßen Methode kaum durch die Anwesenheit von Verunreinigungen im Serum beeinflußt, weshalb es nicht erforderlich ist, für jede Probe eine Blindprobe durchzuführen, wodurch sich eine E isparung an Arbeit und Zeit ergibt.

Darüber hinaus war es bei den konventionellen Methoden schwierig, die nachteiligen Effekte von reduzierenden Substanzen im Serum, wie z. B. Harnsäure und Ascorbinsäure, zu eliminieren, wohingegen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren der Effekt derartiger reduzierender Substanzen die Genauigkeit der Messung nur sehr wenig beeinflußt, da diese reduzierenden Substanzen durch die im Überschuß vorliegenden oxidierenden Mittel zersetzt werden.

Wie die voranstehenden Ausführungen zeigen, sind zum Nachweis bzw. zur Bestimmung der LAP-Aktivität die erfindungsgemäßen Verbindungen als Substrat den bisher bekannten Substraten gegenüber weit überlegen.

Die neuen Verbindungen gemäß der Erfindung können in an sich bekannter Weise hergestellt werden, indem man ein aktiviertes L-Leucin, dessen Aminogruppe geschützt ist, mit einem p-Hydroxyanilin-derivat umsetzt und dann die Schutzgruppe von dem bei dieser Reaktion gebildeten Leucyl-4-hydroxyanilid-derivat entfernt.

Beispiele von aktiviertem L-Leucin, welche als Ausgangsmaterial verwendet werden, sind aktivierte Ester der Formel

C)

X—Nil—CMC —Y

CU,

de Gruppe darstellt, wie

CM

CU-

CU.

worin X eine N-Schutzgruppe darstellt, wie cn tert-Rutyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl. Bcnzyloxycarbonyl oder Phthalyi und Y eine aktivieren

CH₃

CH,

C-,

— Q-

-N

C^J
\

CL

— O

(/)= 3 oder 5)

— C) —<

— NC),

Die freigesetzte Verbindung (HY) ist vorzugsweise

CH,

S—('

CH,

C-i

IK) — N

c J

C)

welche in Wasser oder einer sauren wäßrigen Lösung löslich sind.

Die Entfernung der Schutzgruppe kann nach bekannten Verfahren durchgeführt werden.

Die Reaktion wird in einem organischem Lösungsmittel und im allgemeinen in Gegenwart eines Amins durchgeführt. Geeignete organische Lösungsmittel sind Tetrahydrofuran, Dimenthylformamid, Dioxin und Äthylacetal; geeignete Amine sind tertiäre Amine, wie Triäthylamin, N-Methylmorpholiii und N-Äthylmorpholin. Benzyltrimethyl-ammonium-hydroxid kann ebenfalls vei wendet werden.

Das präparaiive Verfahren und die erfindungsgemiiße Verwendung werden im einzelnen in den nachstehend gegebenen Beispielen erläutert.

Beispiel 1

Herstellung von
L-Leucin-S-carboxy-'i-hydroxNanilid-hydrochlond

In 100 ml Dimethylformamid wurden 7,7 g (0,05 Mol) 5-Aminosalicylsäure und 14 ml (0,10 Mol) Triäthylamin aufgelöst. Zu der Lösung wurden tropfenweise innerhalb einer Stunde bei —5° C bis 0° C eine Lösung aus 17,3 g (0,05 Mol) tert-Bütyl-oxycarbonyl-L-leucyl-^b-dimethylpyrimidin-2-yl-thioester in 150 ml Tetrahydrofuran gegeben. Unter Rühren wurde bei Raumtemperatur das Gemisch weitere 18 Stunden lang umgesetzt. Daraufhin wurde das Reaktionsgemisch destilliert und das Lösungsmittel entfernt. Der Rückstand wurde mit 300 ml Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wurde sukzessive mit kalter 5%-iger Salzsäure, Wasser und gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen, dann über einem Gemisch aus Magnesiumsulfat und Aktivkohle entfärbt und getrocknet. Die auf diese Weise behandelte Äthylacetatschicht wurde destilliert und Äthylacetat entfernt, wobei eine kristalline Substanz zurückblieb. Diese Substanz wurde weiter aus einem Äthylacetat-Petroleumäther-Gemisch umkristallisiert, wobei 12,4 g (68%) weiße Kristalle erhalten wurden.

Schmelzpunkt 168 bis 170° C;

spezifische Drehung:
[λ] -16,4(C=LDMF).

Elementaranalyse:

Ci₈H₂₆N ₂O₈ (Molekulargewicht 366,4)

Gefunden %: C 58,98, H 7.28. N 7,88;

Berechnet %: C 59,01, H 7,15, N 7,65.

Dünnschichtchromatografie:
Rf = 0,39 (CHClj : MeOH : AcOH : H₂O
= 80:20:2,5:5)

In 30 ml eines Gemisches aus 2,4 N Salzsäure und Essigsäure wurden 10 g (0,027 Mol) tert-Butyloxycarbonyl-L-leucin-3-carboxy-4-hydroxyaniIid aufgelöst. Die Lösung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt, um die tert-Butyloxycarbonylgruppe zu entfernen. Das Reaktionsgemisch wurde zu 500 ml getrocknetem Äther gegeben. Der gebildete weiße Niederschlag wurden durch Filtrieren gesammelt und getrocknet, wobei quantitativ 8,3 g des gewünschten L-Leucin-3-carboxy-4-hydroxyanilid-hydrochlorid erhalten· wurden. Schmelzpunkt: 217° C (Zersetzung);

spezifische Drehung:
[«] +363(C = LMeOH);

Rf = 0J0(n-BuOH:AcOH:H₂O = 4:1 :1).

Elementaranalyse:

Ci₃H₁₉N₂O₄Cl · - H₂O(Molekulargewicht 311,783)

Gefunden % ^C 50,15, H 637, N 8,82;
Berechnet %: C 50,04, H 6,47, M838.

Beispiel 2
Herstellung von

L-Leucm-S-sulfo-A-hydroxyanilid · — HBr

Zu 200 ml Methanol wurden 7,6 g (40 mMol) 3-Sulfo-4-hydroxyaniIin und 18,4 ml (40%-ige Lösung in Methanol) Triton B gegeben. Das Gemisch wurde erwärmt unter Bildung einer homogenen Lösung und dann eingedampft- um das Methanol zu entfernen. Der Rückstand wurde in 50 ml Dimethylformamid, welchem

■"

15,5 g (4OmMoI) Benzyloxycarbonyl-L-leucin-4,6-dimethyl-pyrimidin-2-yl-thioester zugemischt waren, aufgelöst und bei Raumtemperatur 48 Stunden umgesetzt. Nach Zugabe von 300 ml Äthylacetat wurde das Reaktionsgemisch sukzessive jeweils 2 mal mit 60 ml kalter 5 N Salzsäure, 60 ml 2 N Salzsäure und 60 ml 5%-iger Salzsäure, welche mit Natriumchlorid gesättigt war, gewaschen. Die auf diese Weise behandelte Äthylacetatlösung wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und Äthylacetat durch Destillation entfernt, wobei Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-3-sulfo-4-hydroxyanilid als öliger Rückstand erhalten wurde. Der ölige Rückstand wurde mit 47 ml eines Gemisches aus 25%-iger Bromwasserstoffsäure und Essigsäure gemischt, bei Raumtemperatur 1 Stunde lang umgesetzt und dann in 470 ml Äther gegossen. Der gebildete Niederschlag wurden durch Filtrieren gesammelt, mit Äthyläther gewaschen und aus einem Äthylalkohol-Äthyläther-Gemisch umkristallisiert, wobei 5,8 g (41%)

L-Leucin-3-sulfo-4-hydroxyanilid · -^- HBr erhalten

wurden.

Schmelzpunkt: 214 bis 217° C;
spezifische Drehung:

[«] +57,6(C = LH₂O);
Rf = 0.52 (n-BuOH: AcOH: H₂O = 4:1 :1).

Elementaranalyse:

C_I2H,«N₂O₅S · - HBr · H₂O(Molekulargewicht 355.417)

Gefunden %:

C 40,41, H 5,68, N 7,86, S 9,11, Br 9,42:

Berechnet %:

C 40,55, H 5,79, N 7,88, S 9,02. Br 9,42.

F i g. 1 bis 3 stellen Infrarotabsorptionsspektren von jeweils tert-Butyloxycarbonyl-L-leucin-S-carboxy^-hydroxyanilid, L-Leucin-S-carboxy-i-hydroxyanilid-hydrochlorid und L-Leucin-3-sulfo-4-hydroxyanilid dar.

Beispiel 3

Reagens

(1) Substratpufferlösung

4-, 1/15 M Phosphorsäurepufferlösung mit dem pH 7,0. enthaltend 1,75 mMol L-Leucin-S-carboxy^-hydroxyanilid.

(2) Oxidationsmittel

α,4 Ν wäßrige Kaliumhydroxidlösung, enthaltend 0,05% Natrhimmetaperiodat end 7 mMol m-KresoI.

Bestimmungsmethode

Zu t-,0 ml der Substratpufferlösung werden 0,02 ml der zu untersuchenden-Probe eingemischt und gründlich vermischt. Das Gemisch" wird 20- Minuten bei 37° C in einem Thermostaten gehaltea Dann gibt man 3 ml der

bo Lösung des Oxidationsmittels hinzu, wobei die Farbbildung erfolgt Als Kontrolle wurde ein Blindtest verwendet, den man in gleicher Weise ausführt, wobei jedoch anstelle der Probe 0,02 ml Wasser verwendet werden. Die Absorption der Probelösung bei 650 nm

b5 wird-genressen. Ein Kontrollserum, dessen- LAP-Aktivität bekannt ist wird in gleicher Weise gemessen. Durch proportionale Berechnung der Absorptionszahl wird die LAP-Aktivitätder Probe erhalten.

Beispiel 4

Reagens

(1) Substraipufferlösung

1/15 M Phosphorsäurepufferlösung mit dem pH 7,0 enthaltend 1,75 mMol L-Leucin-S-carboxy^-hydroxyanilid-hydrochlorid.

(2) Oxidationsmittel

1,OM Essigsäure-Natriumacetat-Pufferlösung mit dem pH 4,2, enthaltend 0,05% Natriummetaperiodat und 40 mMol Diäthylanilin-hydrochlorid.

Bestimmungsmethode
Zu 1,0 ml der Substratpufferlösung werden 0,02 ml

\λ\*ι ί-w uiiivi JUViIVItUCIi ι ixjuQ i,ugvgtuvii UiIU gi uiiuiivii vermischt Das Gemisch wird 30 Minuten in einem Thermostat gehalten. Dann gibt man 4,0 ml des Oxidationsmittels hinzu, wobei sich eine Farbe bildet. Als Kontrollösung wurde ein Blindtest in gleicher Weise wie vorher durchgeführt und die Absorption der Probelösung wurde bei 575 nm gemessen. Ein Kontrollserum, dessen LAP-Aktivität bekannt war, wurde in gleicher Weise wie vorher gemessen. Dutch proportionale Berechnung der Absorptionszahl wurde die LAP-Aktivität der Probe erhalten.

Beispiel 5

Reagens
(1) Substratpufferlösung

1/15 M Phosphorsäurepufferlösung mit dem pH 6,8, enthaltend 3,0 mMol L-Leucin-S-sulfo^-hydroxyanilidhydrobromid und 15 mMol m-Hydroxybenzoesäure.

(2) Oxidationsmittel

0,2 M Kaliumkarbonat-Kaliumhydrogen-Karbonat-Lösung mit dem pH 10,6, enthaltend 0,05% Natriummetaperiodat.

Bestimmungsmethode

Zu 2 Ri! der Substratpuffcriösung gibt man 0,02 rnl der zu messenden Probe und mischt gut. Das Gemisch wird 15 Minuten in einem Thermostaten bei 37° C gehalten. Dann gibt man 2,0 ml der Oxidationsmittellösung hinzu unter Ausbildung einer Farbe. Als Kontrolle wurde ein Blindtest, der in gleicher Weise wie vorher durchgeführt worden war, durchgeführt und die Absorption der Probe bei 645 nm wurde bemessen. Ein Kontrollserum, dessen LAP-Aktivität bekannt war, wurde in gleicher Weise gemessen. Durch proportionales Berechnen der Absorption erhielt man die LAP-Aktivität der Probe.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (3)

1. Patentansprüche:

   l.L-Leucin-4-hydroxyanilid-deriva te entsprechend der allgemeinen Formel

   CH₃ NH₂

   CH-CH₁-CH-CO-NH-^

   CH₃

   worin R eine Carboxylgruppe oder eine Sulfogruppe darstellt oder ein Säureadditionssalz derselben.
2. 2. Verfahren zur Herstellung von L-Leucin-4-hydroxy-anilid-derivaten gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich bekannter Weise ein aktiviertes L-Leucin, dessen Aminogruppe geschützt ist, mit einem p-Hydroxyanilidderivat umsetzt und darauf die Schutzgruppe von dem gebildeten Leucin-4-hydroxyaniIid-derivat abspaltet.
3. 3. Verwendung von L-Leucin-4-hydroxyanilid-derivaten gemäß Anspruch 1 zur Bestimmung der Aktivität von Leucinaminopeptidase.