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DE3342109A1 - Enzymatische pruefmethode - Google Patents

Enzymatische pruefmethode

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Publication number
DE3342109A1
DE3342109A1 DE19833342109 DE3342109A DE3342109A1 DE 3342109 A1 DE3342109 A1 DE 3342109A1 DE 19833342109 DE19833342109 DE 19833342109 DE 3342109 A DE3342109 A DE 3342109A DE 3342109 A1 DE3342109 A1 DE 3342109A1
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DE
Germany
Prior art keywords
compound
asod
group
aminophenol
amino
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE19833342109
Other languages
English (en)
Inventor
Tsutomu Shizuoka Hirata
Kunio Mishima Shizuoka Matsumoto
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Asahi Kasei Corp
Original Assignee
Toyo Jozo KK
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toyo Jozo KK filed Critical Toyo Jozo KK
Priority to DE19833342109 priority Critical patent/DE3342109A1/de
Priority to FR8319134A priority patent/FR2555608B1/fr
Publication of DE3342109A1 publication Critical patent/DE3342109A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • G—PHYSICS
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Description

  • Enzymatische Prüfmethode
  • Die Erfindung betrifft eine Methode zur Untersuchung einer Verbindung der Formel worin R1 eine Hydroxyl- oder Aminogruppe, oder, sofern wenigstens einer der Reste R2, R3, R4, R5 oder R6 eine Hydroxyl- oder Amino-Gruppe bedeuten, ein Wasserstoffatom ist, und R2, R3, R4, R5, und R6 für Wasserstoff, Halogen, eine niedrige Alkyl-, eine niedrige Alkoxy-, eine Amino-, eine substituierte Amino-Gruppe, einen Hydroxyl-, Carboxyl- oder Sulfo-Rest stehen, oder R5 und R6 gemeinsam einen Ring bilden. Die erfindungsgemïße Prüfmethode ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung der Formel (I) mit einer Oxidase zur Reaktion bringt, die bei der Reaktion Sauerstoff verbraucht und ein Pigment bildet, und daß man wenigstens eine der erkennbaren Änderungen in dem ReaktionssyStem meßtechnisch ermittelt.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren stellt erfindungsgemäß auch eine Methode zur Prüfung auf Hydrolase dar, wozu man durch die Wirkung der zu untersuchenden Hydrolase die Verbindung der Formel (I) aus einem synthetischen Substrat, das eine Komponente der Struktur der Verbindung der Formel (I) enthalt, freisetzt, dann die so gebildete Verbindung der Formel (I) in Anwesenheit einer Kupplungssubstanz durch eine Oxidase oxidiert, und erkennbare Änderungen im Reaktionssystem meßtechnisch ermittelt.
  • Die enzymatische Analyse einer Verbindung in einer Probe unter Verbindung eines Enzyms, wobei ein Pigment gabildet wird, ist bekannt. Die meisten dieser bekannten Methoden arbeiten unter Verwindung von Peroxidase, wobei Wasserstoffperoxid oder Phenol oder eine Verbindung, die diese bildet oder freisetzt, meßtechnisch ermittelt werden.
  • Baispielweise wirkt bei einer Prüfung auf Wasserstoffperoxid Peroxidase in Anwesenheit von Phenol und einem Chromogen, wie beispielsweise 4-Aminoantipyrin, so, daß die Reaktion H202 ? H20 + (0) begünstigt ist, und dabei werden das Phenol und das Chromogen durch die oxidative Wirkung des (0) oxidativ kondensiert und bilden ein Pigment. Die Menge an Wasserstoffperoxid kann man dadurch bestimmen, daß man die Absorption für die spezifische Absorptions-Wellenlünge des Pigmentes bestimmt. Beispielsweise läßt sich aus ß-D-Glucose durch die Einwirkung von Glucose-Oxidase Wasserstoffperoxid wie folgt bilden: ß-D-Glucose + H20 + °2 1 D-Gluconat + H202 202.
  • Das gebildete Wasserstoffperoxid wird gemessen, und so kann man die Menge an ß-D-Glucose feststellen.
  • Diese Methode ist die bevorzugte Untersuchungsmethode für ein Reaktionssystem, das Wasserstoffperoxid enthält, oder in dem Wasserstoffperoxid freigesetzt oder gebildet wird, und sie wird in der klinischen Biochemie benutzt.
  • Für die Untersuchung einer Verbindung der Phenol-Reihe sollte Wasserstoffperoxid als Reagens benutzt werden.
  • Da jedoch Wasserstoffperoxid eine instabile Verbindung ist, sind solche Untersuchungsmethoden für Verbindungen der Phenol-Roihe nicht zweckmässig und tatsächlich meist unbrauchbar.
  • Eine von Peroxidase verschiedene enzymatische Reaktion zur Bildung eines Pigments ist diejenige, bei der Nicotin-Adenindinucleotid oder Nicotin-Adenindinucleotidphosphat L NAD(P) J durch ein Dehydrogenase-System zu NAD(P>H reduziert wird, und das gebildete NAD(P) wird mit Diaphorase und einem Elektron-Transfer-Pigment gekoppelt, so daß sich Formazan bildet, das dann colorimetrisch gemessen werden kann. Diese Methode hat jedoch Nachteile, weil das gebildete Formazan in Wasser unlöslich ist und das Pigment an den Behälterwandungen anhaftet.
  • Die Anmelderin hat bereits früher festgestellt, daß sich p-Phenylendiamin oder eines seiner Derivate durch die Einwirkung von Ascorbat-Oxidase oder Laccase zu einem Pigment oxidieren läßt, und daß man mittels dieser Methode IR Leucin-Aminopeptidase untersuchen kann.
  • Siehe ungeprüfte Japanische Patentveröffentlichung No. 57-115345.
  • Diese frühere Untersuchungsmethode hat eine Reihe von Vorteilen. Verglichen mit chemischen Methoden handelt es sich um eine milde enzymatische Prüfung, und man hat die Möglichkeit des automatischen Ablaufs der Untersuchung. Bei dieser früheren Prüfmethode ändert sich die Phenolverbindung, wenn man sie mittels Oxidase oxidiert, zu einer Verbindung, die bei 350-500 nm ein Absorptionsmaximum hat.
  • Überraschend wurde nun gefunden, daß man eine Verbindung der Formel (I) und eine Kupplungs-Komponente mittels einer Oxidase, wie beispielsweise Ascorbat-Oxidase oder Laccase, oxidativ kondensieren kann und sich ein bisher unbekanntes Pigment bilden läßt, das unterschiedlich ein Absorptionsmaximum bei 500-750 nm aufweist.
  • Ein Verbindung der Formel (1), wie beispielswzise 3 ,5-Dibrom-4-hydroxyanilin, gibt, wenn man sie ohne Kupplungskomponente mit Oxidase zur Reaktion bringt, keine Färbung. Jedoch bildet sich in Anwesenheit einer Kupplungskomponenten durch oxidative Kondensation ein Pigment, das ein Absorptionsmaximum bei 600-700 nm besitzt. Diese Reaktion stellt demzufolge ein bisher unbekanntes, neues Reaktions-Schema dar.
  • Es wurde für das erfindungsgemäße Verfahren ein synthetisches Substrat für Hydrolase synthetisiert, das als eine Komponente eine Verbindung der Formel (I) enthielt, und es wurde gefunden, daß sich dieses Substrat durch eine entsprechende Hydrolase hydrolysieren läßt, wobei eine Verbindung der Formel (I) freigesetzt wird, die in Anwesenheit einer Kuppelungskomponente zu einem Pigment umgebildet wird. Es wurde weiterhin gefunden, daß man diese erfindungsgemäße Reaktion zur Prüfung auf Hydrolase benutzen kann.
  • Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend eine neue Untersuchungsmethode auf eine Verbindung der Formel (I), die dadurch gekennzeichnet ist, daß man die erkennbaren Änderungen in einem Reaktions-System meßtechnisch erfaßt, in dem die Verbindung, auf die geprüft werden soll, in Anwesenheit einer Kupplungskomponente mit einer Sauerstoff verbrauchenden Oxidase umgesetzt wird, wobei ein Pigment gebildet wird.
  • Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung eine Methode zur Prüfung auf Hydrolase, die dadurch gekennzeichnet ist, daß.aus einem synthetischen Substrat, das in seiner Struktur als eine Komponente eine Verbindung der Formel (I) enthält, durch die Einwirkung von Hydrolase die Verbindung der Formel (I) freigesetzt wird, dann die so gebildete Verbindung in Anwesenheit einer Kupplungskomponente mit einer Sauerstoff verbrauchenden Oxidase behandelt wird, wobei ein Pigment gebildet wird, und daß map die erkennbaren Veränderungen in dem Reaktionssystem meßtechnisch erfaßt.
  • Für das erfindungsgemäße Verfahren brauchbare Oxidasen sind solche, die Sauerstoff verbrauchen und ein Pigment bilden. Beispiele für solche Oxidase.n sind Ascorbat-Oxidase, Laccase, Aminophenol-Oxidase, Polyphenol-Oxidase und Tyrosinase. Bevorzugt verwendet man aus Kürbis, Gurke oder Chayote (Sechium edule) erhalte Ascorbat-Oxidase, aus schwarzen Lacken (Urushi, Milchsaft aus Japanischem Lackbaum), Bacidiomycetes (Coriolus versicolor, Rhizopus oder Polyporus versicolor) gewonnene Laccase und Tyrosinase. (J.Biochem., 50, 264 (1961), Biochim. Biophys. Acta, 73, 204 (1963), Acta Chem. Scand., 21, 2367 (1967)). Es können auch im Handel erhältliche Enzyme benutzt werden. Diese Enzyme kann man gewünschtenfalls in Form von immobilisierten Enzymen einsetzen. Das immobilisierte Enzym kann man in einem automatischen Analysenapparat mit einer Sauerstoff-Elektrode in Kontakt bringen und dann die elektrochemischen Änderungen messen. Man kann, wenn man solche Elektroden einsetzt, aufwendiges Enzym sparen. Dementsprechend kann der Sensor, der eine Enzym-Elektrode mit immobilisiertem Enzym und Sauerstoff-Elektrode aufweist, für eine Untersuchungsmethode benutzt werden, die rasch durchführbar ist, wenig Reagens benötigt und für wiederholte Messungen brauchbar ist. Man kann auch farbige Proben meßtechnisch auswerten.
  • Die beim erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzende Kupplungskomponente ist eine Substanz, die unter Bildung eines Pigments mit einer Verbindung der Formel (I) oxidativ zu kondensieren vermag. Wenn es sich bei der Verbindung der Formel (I) um eine solche handelt, die als R1 einen Aminorest aufweist, oder, sofern wenigstens eine der Gruppen R2, R3, R4, R5 oder R6 ein Aminorest ist, als R1 ein Wasserstoff-atom hat, und worin R2, R3, R4, R5 und R6 die zuvor angegebene Bedeutung haben (eine solche Verbindung wird nachstehend als Aminoverbindung (I) bezeichnet), wird als bevorzugte Kupplungskomponente eine Verbindung der Formel eingesetzt, worin R7 einen Hydroxylrest, einen Aminorest oder einen substituierten Aminorest bedeuten, und R8, Rg, Rlo, R11 und R12 für Wasserstoff, Halogen, einen niedrigen Alkyl-Rest, einen niedrigen Alkoxy-Re St, einen Aminorest, einen substituierten Aminorest, eine Hydroxyl-, Carboxyl-oder Sulfo-Gruppe stehen oder R11 und R12 gemeinsam einen Ring bilden.
  • Beispiele für solche Kupplungskomponenten für eine Aminoverbindung (I) sind Phenol, Salicylsäure, m-Hydroxybenzoesäure, 2 ,6-Dihydroxybenzoesäure, 2-Amino-3-hydroxybenzoesäure, 2-Hydroxy-5-aminobenzoesaure, p-Hydroxybenzoesïure, Methylsalicylat, o-Methylphenol, m-Methylphenol, p-Methylphenol, o-Methoxyphenol, m-Methoxyphenol, p-Methoxyphenol, o-Chlorphe nol, m-Chlorphenol, p-Chlorphenol, 2 , 3-Dimethylphenol, 2,4-Dimethylphenol, 2,5-Dimethylphenol, 2,6-Dimethylphenol, 3,5-Dimethylphenol, 2,6-Dichlorphenol, o-Amiphenol, m-Aminophenol, p-Bromphenol, o-Ethylphenol, m-Ethylphenol, 2,4-Dichlorphenol, 2,4-Dibromphenol, 2,6-Dibromphenol, 2,6-Dibrom-4-aminophenol, 2,6-Dichlor-4-aminophenol, 2,6-Dimethoxyphenol, 2-Methyl-6-chlorphenol, 2-Chlor-5-methylphenol, 2-Amino-4-chlorphenol, N,N-Diethyl-m-aminophenol, 2-Amino-4-methylphenol, o-Carboxymethylphenol, 2-Carboxy-4-aminophenol, 3,4-Dihydroxyphenethylamin, i -Naphthol, ß-Naphthol, 4-Chlor-l-naphthol, 2-Carboxyl-naphthol, l-Hydroxy-2-naphtoe säure, l-Naphthol- 2-sul fonat, l-Naphthol-3-sulfonat, l-Naphthol-4-sulfonat, l-Naphthol-8-sulfonat, 2-Naphthol-6-sulfonat, 2-Naphthol-7-sulfonat, 2-Naphthol-8-sulfonat, 2-Naphthol-3,6-disulfonat, 2-Naphthol-6,8-disulfonat, N,N-Diethyl-m-aminoanilin, N,N-Dimethyl-maminoanilin, o-Carboxyanilin, m-Carboxyanilin, o-Chloranilin, m-Chloranilin, m-Bromanilin, o-Methylanilin, m-Methylanilin, N,N-Dimethylanilin, N ,N-Diethylanilin, N,N-Ethylethylhydroxyanilin, N,N-Ethylethylhydroxy-m-toluidin, 3-Amino-4-chloranilin und 2-Methyl-3-chloranilin.
  • Für eine Verbindung der Formel (I), in der R1 eine Hydroxylgruppe, oder, sofern einer der Reste R2, R3, R4, R5 oder R6 eine Hydroxylgruppe bedeutet, ein Wasserstoffatom ist, und worin R2, R3, R4, R5 und R6 die zuvor angegebene Bedeutung haben (diese Verbindung wird nachstehend als Phenolverbindung (I) bezeichnet), wird als Kupplungskomponente bevorzugt eine Verbindung der Formel eingesetzt, worin R13 einen Aminorest oder einen substituierten Aminorest bedeuten und R14, R15, R16, R17 und R18 für Wasserstoff, Halogen, eine niedrige Alkylgrupoe, eine niedrige Alkoxygruppe, eine Aminogruppe, eine substituierte Aminogruppe, eine Hydroxylgruppe, eine Carboxylgruppe oder eine Sulfogruppe stehen, oder R17 und R18 gemeinsam einen Ring bilden. Beispiele für Kupplungskomponenten für eine Phenolverbindung (I) sind N-Ethylanilin, N,N-Dimethylanilin, N,N-Diethylanilin, N,N-Dime-thyl-o-toluidin, N,N-Dimethylp-toluidin, N,N-Diethyl-o-toluidin, N,N-Diethyl-m-toluidin, N,N-Diethyl-p-toluidin, Anthranilsäure, p-Dimethylaminobenzoesiure, p-Chlor-o-toluidin, m-Phenylendiamin, p-Phenylendiamin, Anilin, o-Methylanilin, m-Methylanilin, o-Carboxyanilin, o-Chloranilin, m-Chloranilin, m-Bromanilin, 2-Methyl-5-carboxyanilin, N,N-Ethylhydroxyethylanilin, N,N-Dimethyl-m-phenylendiamin, N,N-Dimethyl-p-phenylendiamin, N,-Diethyl-p-phenylendiamin, 2-Methyl-m-phenylendiamin, 4-Methyl-o-phenylendiamin, 4-Methyl-m-phenylendiamin, 2-Methoxy-5-chloranilin, 2-Ethylanilin, N,N-Dimethyl-m-toluidin, 2-Chlor-m-phenylendiamin, 2-Methyl-3-chloranilin, 2,5-Dimethoxyanilin, l-Amino-5-naphthalinsulfonat, N,N-Ethylethylhydroxy-m-toluidin, 3,5-Dibrom-4-hydroxyanilin, 3,5-Dichlor-4-hydroxyanilin, o-Hydroxyanilin, m-Hydroxyanilin, 2-Amino-N,N-dimethylanilin, p-N,N-Diethylaminoanilin, 2-Methyl-3-aminoanilin, 2-Methyl-5-aminoanilin, 3-Carboxyanilin, 3-Carboxy-4-hydroxyanilin und 2-Methyl-5-carboxyanilin.
  • Beispiele für Aminoverbindungen (I) sind 4-Hydroxy-3,5-dichloranilin, 4-Hydroxy-3,5-dibromanilin, p-N,N-Diethylaminoanilin, p-N ,N-Dimethylaminoanilin, m-Phenylendiamin, p-Phenylendiamin, o-Aminophenol, m-Aminophenol, Anilin, o-Toluidin, m-Toluidin, o-Carboxyanilin, o-Chloranilin, m-Chloranilin, m-Bromanilin, m-N,N-Dimethylaminoanilin, 2-Chlor-5-aminoanilin, 2-Methyl-3-chloranilin, 2 ,5-Dimethoxyanilin, 2-Methyl-3-aminoanilin, 2-Methyl-5-aminoanilin, 2-Methyl-5-carboxyanilin, 2-Hydroxy-6-carboxyanilin, 2-Hydroxy-5-methylanilin, 3-Carboxyanilin, 2-Carboxy-4-hydroxyanilin, 2-Hydroxy-5-chloranilin, o-Ethylanilin, 2-Methyl-5-carboxyanilin, 1-Amino-6-naphtholsulfonat und 3-Amino-4-chloranilin.
  • Beispiele für Phenolverbindungen (I) sind 4-Amino-2,6-dichlorphenol, 4-Amino-2,6-dibromphenol, o-Aminophenol, m-Aminophenol, p-Aminophenol, m-Carboxyphenol, p-Carboxyphenol Phenol, o-Chlorphenol, m-Chlorphenol, p-Chlorphenol, p-Bromphenol, o-Ethylphenol, m-Ethylphenol, o-Methylphenol, m-Methylphenol, p-Methylphenol, o-Methoxyphenol, Salicylsäure, Methylsalicylat, o-Carboxymethylphenol, m-N,N-Diethylaminophenol, 2,4-Dichlorphenol, 2,4-Dibromphenol, 2, 6-Dibromphenol, 2,6-Dimethoxyphenol, 3,5-Dimethylphenol, 2,5-Dimethylphenol, 2 ,4-Dimethylphenol, 2,3-Dimethylphenol, 2 ,6-Dimethylphenol, 2-Methyl-5-chlorphenol, 2-Chlor-5-methylphenol, 2-Amino-3-carboxyphenol, 2-Amino-4-methylphenol, 2-Carboxy-4-aminophenol, 2-Amino-4-methylphenol, 2-Carboxy-4-aminophenol, 2-Amino-4-chlorphenol, .< -Naphthol, ß-Naphthol, 4-Chlor-l-naphthol, 2-Carboxy-l-naphthol, l-Naphthol-2-sulfonat, l-Naphthol- 3-sulfonat, l-Naphthol-4-sulfonat, l-Naphthol-8-sulfonat, 2-Naphthol-6-sulfonat, 2-Naphthol-8-sulfonat, 2-Naphthol-3,6-disulfonat und 8-Hydroxychinolin-5-sulfonat. Beispiele für Aminoverbindungen (I) oder Phenolverbindungen (I), die sowohl Aminoals auch Hydroxyl-Gruppen haben, sind o-, m- und p-Aminophenol, 2-Chlor-4-aminophenol, 2-Amino-4-carboxyphenol, 2-Amino-4-methylphenol, 2-Carboxy-4-aminophenol, 2-Amino-4-chlorphenol, 2,6-Dichlor-4-aminophenol und 2,6-Dibrom-4-aminophenol.
  • Jede der Kupplungskomponenten für Aminoverbindungen (I) oder Phenolverbindungen (I) können als die zuvor angegebenen Verbindungen der Aminophenol-Reihe benutzt werden.
  • Dabei sollte jedoch vermieden werden, daß es zu Kombinationen von Kupplungskomponente und Aminophenolvarbindung kommt, bei denen die Kupplungskomponente und die Aminophenolverbindung gleich sind.
  • Bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Untersuchung einer Verbindung der Formel (I) (die nachstehend als Verbindung (I) bezeichnet wird) behandelt man eine Probe, die die Verbindung (I) enthält, mit einer Oxidase, die Sauerstoff verbraucht und ein Pigment bildet in Anwesenheit einer Kupplungskomponente der Formel (IV). Man setzt die Kupplungskomponente in äquimolarer Menge oder im Überschuss, bezogen auf die Verbindung (I) ein, und eine solche Menge hat keine inhibierende Wirkung gegenüber dem Enzym. Die Kupplungskomponenten bereitet man für den Einsatz zweckmäßig in einer Pufferlösung von neutralem pH-Wert, wie beispielsweise Tris-HCl, Phosphat, Dimethylglutarat-NaOH, Acetat, Imidazol-HCl oder Citratpuffer in konstanter Konzentration vor. Die Mengen an verwendetem Enzym betragen im allgemeinen (für 0,1 - 5 ml an 0,1 mM/Lit. Verbindung (I) ) für Ascorbat-Oxidase 10 - 1000 Einheiten, vorzugsweise 50 - 200 Einheiten, und für Laccase oder Tyrosinase 10 - 1000 Einheiten, vorzugweise 50 - 500 Einheiten. Die Reaktionstemperatur beträgt etwa 25 - 400C, vorteilhaft etwa 370C. Die'Reaktionszeit variiert je nach Menge an verwendetem Enzym, je nach Temperatur und sonstigen Versuchsbedingungen und beträgt im allgemeinen mehr als eine Minute. Die Prüfgeschwindigkeit kann vorzugsweise auf 1 Minute eingestellt werden, und die weitere colorimetrische Untersuchung wird vorteilhaft in 5 Minuten vorgenommen.
  • Nachdem die Reaktion vollständig abgelaufen ist, wird wenigstens eine der erkennbaren Änderungen meßtechnisch erfaßt; dies kann beispielsweise durch Bestimmung der Menge an verbrauchtem Sauerstoff oder an gebildetem Pigment erfolgen. Den Sauerstoff kann man elektrochemisch, b-eispielswoise an einer Sauerstoffelektrode messen. Die Menge an Pigment läßt sich colorimetrisch bei der Wellenlänge des Absorptionsmaximums bei 500-750 nm bestimmen.
  • Die Menge an Verbindung (I) in der Probe kann durch Berechnung aus einer Standardkurve bestimmt werden.
  • Für die Untersuchung einer Verbindung (I) kann auch ein synthetisches Substrat geprüft werden, das in seiner Struktur als eine Komponente diese Verbindung (I) enthält.
  • Bei dem synthetischen Substrat sollte es sich zweckmäßig um ein Substrat für eine Hydrolase handeln, beispielsweise Peptidase, Protease, Amylase, Glycosidase, Phosphatase, Esterase oder Lipase. Weitere vorteilhaft verwendbare Hydrolasen sind im Handel erhältliche Enzyme, Enzyme enthaltende Kulturbrühen und Materialien, wie Cellmasse, Gewebemasse, Urin, Speichel und Serum. Zur Durchführung des erfindungsgemißen Verfahrens mischt man eine Hydolase enthaltende Probe mit einem entsprechenden synthetischen Substrat und bebrütet das Gemisch bei 370C, wobei die Verbindung (I) freigesetzt wird. Diese Verbindung (I) wird mit einer Oxidase behandelt, die Sauerstoff verbraucht und ein Pigment bildet in Anwesenheit einer Kupplungskomponente, wie zuvor angegeben, und auf diese Weise läßt sich die Aktivität des Enzyms in der Probe nachweisen.
  • Beispiele für beim erfindungsgemäßen Verfahren benutzte Enzyme, synthetische Substrate und deren Herstellung lassen sich wie folgt veranschaulichen: 1) Peptidase und Protease: Unter den Peptidasen sind Aminopeptidasen ganz allgemein bekannt als Enzyme, die auf Peptidketten einwirken und die Amino-Endgruppe abspalten und Aminosäuren oder Peptide freisetzen. Beispiele für Aminopeptidasen sind Cystein-Aminopeptidase (EC: 3. 4. 11. 3), Prolin-Aminopeptidase (EC: 3. 4. 11. 5), Arginin-Aminopeptidase (EC: 3. 4. 11. 6), Tripeptide-Aminopeptidase (EC: 3. 4. 11. 4), X-Prolyl-Dipeptidylaminopeptidase (worin X ein saurer, neutraler oder basischer Aminosäurerest ist) und Dipeptidase (EC: 3. 4. 13.
  • 11) Cystein-Aminopeptidase (nachstehend als CAP bezeichnet) findet sich in verstärkter Menge im Blut, wenn eine SChwangerschaft regelwidrig verläuft, und eine Prüfung der CAP ist zweckmäßig zur Diagnose der placentalen Funktion und wird benutzt für klinische diagnostische Untersuchungen während der Schwangerschaftsperiode.
  • Für eine solche Untersuchung wurde als synthetisches Substrat S-Benzyl-L-cysteinyl-p-nitroanilid oder S-Benzyl-L-cysteinyl-N,N-dimethylaminoanilid eingesetzt. Die CAP-Aktivität wird dadurch bestimmt, daß man den Wert für die Gelbfärbung ermittelt, die durch das p-Nitroanilin entsteht, das aus dem Substrat S-Benzyl-L-cysteinyl-p-nitroanilid freigesetzt wird. Die Bestimmung dieser Gelbfärbung wird beeinträchtigt durch Bilirubin-Serum oder Hemolytisches Serum. Weiterhin kann man freigesetztes p-Nitroanilin mit p-Dimethylaminozimtaldehyd chemisch umsetzen, so daß sich ein rotes Pigment bildet, das bei 565 nm gemessen wird. Diese Methode ist nicht brauchbar für laufelde Betriebsuntersuchungen. Man kann die enzymatische Aktivität auch dadurch bestimmen, daß man die Blau-Grün-Färbung ausmisst, die sich während der Reaktion von p-Dimethylaminoanilin mit einem Eisen-Komplex-Reagens bildet.
  • Das p-Dimethylaminoanilin wird durch die Wirkung der CAP aus S-Benzyl-L-cystenyl-p-dimethylaminoanilid freigesetzt.
  • Auch diese Methode ist aus chemischen Gründen nicht brauchbar für Geschwindigkeitsprüfungen.
  • Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird ein synthetisches Substrat verwendet, bei dem es sich um eine Verbindung handelt, die in ihrer Struktur als einen Bestandteil eine Aminoverbindung (I) enthält, und die erhalten wurde durch Reaktion ihrer Aminogruppe mit einer Carboxylgruppe einer Aminosäure oder eines Peptids.
  • Dieses synthetische Substrat hat die Formel worin eine der Gruppen R'1 oder R'2 den Rest R19CO-NH-und die andere ein Wasserstoffatom bedeuten, wobei R19CO-ein Aminosäurerest oder ein Peptidrest ist, und worin R3, R4, R5 und R6 die zuvor angegebene Bedeutung haben.
  • Beispiele für die R19CO-Gruppe sind S-Benzyl-L-cystenyl-, L-Alanyl- und X-Prolyl-, worin X für einen sauren, neutralen oder basischen Aminosäure rest steht.
  • Eine Peptidase enthaltende Probe wird mit einem synthetischen Substrat der Formel (V) umgesetzt, und dabei wird eine Aminoverbindung (I) frei, die durch Oxidase einer oxidativen Kondensation mit einer entsprechenden Kupplungskomponente unterworfen wird. Das resultierende Gemisch wird colorimetrisch bei 500-750 nm ausgemessen. Diese zuvor beschriebene methode ist das vorteilhafte Verfahren für automatische Betriebs-Untersuchungen.
  • Man kann ein synthetisches Substrat der Formel (V) mittels konventioneller Peptid-Synthese herstellen, beispielsweise durch Kondensation von S-Benzyl-L-cystein und einer Aminoverbindung (I). S-Benzyl-L-cystein kann man dadurch gewinnen, daß man die Thiolgruppe von L-Cystein benzyliert. Bei dieser Synthese wird erforderlichenfalls die funktionelle Gruppe geschützt. Die Schutzgruppe führt man in für Peptid-Synthesen üblicher Weise ein. So läßt sich beispielsweise die g -Aminogruppe im L-Cystein mit einer üblichen Schutzgruppe, wie beispielsweise t-Butoxycarbonyl, t-Amyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, Adamantanyloxycarbonyl oder o-Nitrophenyl-thionitro-substituiertes Benzyloxycarbonyl, schützen.
  • Die tL -Carboxylgruppe des S-Benzyl-L-cysteins, dessen & -Aminogruppe geschützt ist,-wird aktiviert beispielsweise durch Umsetzung mit einem Säureamid, Säureanhydrid, Säurehalogenid, Säureimidazolid oder einem aktivierten Ester, oder durch Behandlung mit Carbodiimid, N,N-Carbonyldiimidazol oder einem Isoxazoliumsalz, wie beispielsweise Woodward-Reagens.
  • Die aktivierte Verbindung wird mit einer Aminoverbindung (I) umgesetzt, vorteilhaft mittels der Carbodiimid-, Azid-, Säurehalogenid-, aktivierter Ester- oder Säureanhydrid-Methode. Die Reaktion wird in einem inerten Lösungsmittel ausgeführt, wie beispielsweise Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Dimethylsulfoxid, Tetrahydrofuran, Benzol, Xylol, Toluol oder Diethyläther bei -30°C bis Zimmertemperatur, im allgemeinen während 30 Minuten bis zu 50 Stunden, und man verwendet dabei die beiden Verbindungen in äquimolarem Verhältnis. Nachdem die Reaktion vollständig abgelaufen ist, wird die Schutzgruppe für die a-Aminogruppe entfernt.
  • Beispielsweise entfernt man t-Butoxycarbonyl mit 2 n Salzsäure in Essigsäure oder Trifluoressigsäure, und Benzyloxycarbonyl wird durch katalytische Hydrierung unter Verwendung von Palladium-Kohlenstoff oder Bromwasserstoff in Essigsäure entfernt.
  • Die Aminoverbindung ist eine Flüssigkeit; sie kann als reaktives flüssiges Medium benutzt werden; oder man benutzt als flüssiges Medium Benzol. Die Reaktion lauft bei 50-1000C während einer Zeitspanne von 20 Minuten bis 5 Stunden ab.
  • Das so erhaltene synthetische Substrat kann in üblicher Weise durch Extraktion, Waschen, Chromatographie oder einer sonstigen bekannten Methode gereinigt werden. Das Produkt kann auch als Salz gewonnen werden; dazu setzt man mit einer anorganischen Ssure, wie beispielsweise Salzsäure, Bromwasserstoffsäure oder Phosphorsäure, oder mit einer organischen Säure, beispielsweise Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure oder Oxalsäure um.
  • Die enzymatische Aktivität in einem Material, wie beispielsweise Serum, kann man prüfen, wenn man ein synthetisches Substrat in einer Pufferlösung zugibt und die freigesetzte Aminoverbindung (I) mit einer Kupplungskomponente in Anwesenheit von Oxidase reagieren läßt.
  • X-Prolyldipeptidylaminopeptidase (nachstehend als X-PDAP bezeichnet), worin X einen Aminosäurerest bedeutet, und speziell Glycylprolyldipeptidylaminopeptidase (nachstehend als GPDAP bezeichnet) ist eine Dipeptidylaminopeptidase, die das endständige N von Peptiden hydrolysiert, wobei Glycylprolin freigesetzt wird.
  • Bei akuter oder chronischer Hepatitis, Hepatocirrhose oder Tumor am Gallengang nimmt die Aktivität von Serum-X-PDAP zu, und sie nimmt ab bei gastritischem Tumor, wie beispielsweise Magenkrebs oder Pankreas-Tumor. Untersuchungen der X-PDAP sind für die Diagnose von Magentumor bruachbar.
  • Bisher wurden synthetische Substrate verwendet, worin X Glycin bedeutet, beispielsweisz (1) Gly-L-Pro-t-naphthylamid, (2) Gly-L-Pro-p-nitroanilid, (3) Gly-L-Pro-p-phenylazoanilid oder (4) 7- (Gly-L-Pro) -4-methylcoumarinamid.
  • So ist beispielsweise eine Untersuchungsmethode, bei der (1) benutzt wird, eine Methode, in der enzymatisch freigesetztes &-Naphthylamin chemisch gefärbt wird durch 3-Methyl-2-benzothiazol-yonehydrozon (MBTH)-FeC13, und dann wird colorimetrisch gemessen. Jedoch ist i-Naphthylamin eine karzinogene Substanz und daher nicht gesundheitlich einwandfrei. Die Methode, bei der (2) benutzt wird, ist eine colorimetrische Methode, bei der das freigesetzte gelbfarbene p-Nitroanilin gemessen wird, und diese Methode wird beeinträchtigt durch Bilirubin-Serum oder hemolytisches Serum. Auch die Methoden, bei denen (3) und (4) eingesetzt werden, haben Nachteile.
  • Das beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendete synthetische Substrat ist eine Verbindung, bei der die Aminogruppe der Aminoverbindung (I) mit einer X-L-Prolyl-Gruppe kombiniert ist. Beispiele für den Rest X sind Aminosäurereste, beispielsweise neutrale Aminosäuren, wie Glycin oder Alanin, saure Aminosäuren, wie Asparginsäure oder Glutaminsiure, oder basische Aminosäuren, wie Lysin oder Arginin. Es kann dabei in jeder Art an L-, D- oder Dl-Aminosruren Verwendung finden. Ein synthetisches Substrat, das ein Dipeptid-Derivat ist, kann in Form der freien Base oder in Form von Salzen, wie beispielsweise p-Toluolsulfonat, Hydrochlorid oder Hydrobromid, benutzt werden. Bevorzugte Dipeptid-Derivate sind Verbindungen, in denen X eine neutrale oder basische Aminosäure ist. Dipeptide, in denen X eine saure Aminosäure bedeutet, sind weniger hydrolysiert.
  • Das beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendete synthetische Substrat kann in beliebiger für Peptidsynthesen bekannter Weise synthetisiert werden. Beispielswsise kann die Schutzgruppe der N-geschützten-X-Prolylamino-Vsrbindung (I) entfernt sein. N-geschützte Aminosaure-L-prolylaminoverbindung (I) wird gewonnen durch Reaktion einer L-Prolyl-aminoverbindung (I) mit einer N-geschützten Aminosäure unter Verwendung eines Kondensierungsmittels, wie beispielsweise Carbodiimid, oder mittels der aktierter Ester-Methode unter Verwendung einer N-geschützten Aminosaure, die eine aktivierte Carboxylgruppe enthält. Für die Schutzgruppe kann man beliebige übliche Schutzgruppen auswählen, beispielsweise die Benzyloxycarbonyl-, t-Butyloxycarbonyl-, t-Amyloxycarbonyl- oder Formyl-Gruppe. Die funktionelle Seitengruppen wird, sofern eine solche vorhanden ist, zuvor in üblicher Weise geschützt. Beispielsweise schützt man eine Carboxy-Seitenkette in einer sauren Aminosäure durch einen Benzylester.
  • Die Guanidino-Gruppe in Arginin läßt sich mittels üblicher Schutzgruppen, wie beispielsweise einer Tosyl-, Nitro-, p-Nitrobenzyloxycarbonyl- oder 2-(Isopropyloxycarbonyl)-3, 4,5,6 ,-tetrachlorbenzoyl-Gruppe, vorzugsweise mit der Tosyl- oder Nitro-Gruppe schützen. Die N- E -Aminogruppe in Lysin wird zweckmäßig mittels einer für eine c(-Aminogruppe üblichen Schutzgruppe geschützt. Die Schutzgruppe an einer N-geschützten-X-L-Prolylaminoverbindung (I) wird mittels konventioneller Methoden entfernt. Zweckmäßig bedient man sich der selektiven Entfernung der Schutzgruppe.
  • Dipeptid-Derivate kann man auch gewinnen mittels einer Methode, bei der zuvor bereits synthetisiertes N-geschütztes X-L-Prolin mit einer Aminoverbindung (I) kondensiert wird, wobei eine N-geschützte X-L-Prolyl-Aminoverbindung (I) gewonnen wird; dann entfernt man die Schutzgruppe.
  • Protease ist ein allgemeiner Ausdruck für Enzyme, die Peptid-Bindungen an Peptiden und Proteinen hydrolysieren.
  • Beispiele dafür sind Pepsin, Trypsin, d-Chymotrypsin, mikrobielle Protease, Thrombin, Plasmin, Plasmagewebe-Kallikrain, Urokinase, Faktor Xa, Collagenase, Elestase oder Cathepsin.
  • Die für diagnostische Zwecke bedeutsamen Proteinasen sind Trypsin und i-Chymotrypsin für Pankreas-Funktion und Protease für das Gerinnungs-System oder fibrinolytische System, wie Plasmin, Thrombin, Plasma, Gewebe-Kallikrein, Urokinase oder Faktor Xa.
  • Derivate chromogener Peptide sind verwendet worden als synthetische Substrate für diese Untersuchungen. Beispielsweise können die folgenden Substrate erwähnt werden: Substrate für Thrombin: Bz-Phe-Val-Arg-p-Nitroanilid HC1, H-D-Phe-Pro-Arg-p-Nitroanilid HC1, Tos-Gly-Pro-Arg-p-Nitroanilid . HCl, Boc-Val-Pro-Arg-Methylcoumarinamid, H-D-Phe-Pro-Arg-Aminoisophthalatdimethylester.
  • Substrate für Faktor Xa: Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-p-Nitroanilid- HC1, Boc-Ile-Glu-Gly-Arg-Methylcoumarinamid.
  • Substrate für Plasma-Kallikrein: Bz-Pro-Phe-Arg-p-Nitroanilid ' HCl, H-D-Pro-Phe-Arg-p-Nitroanilid 2 2 HC1, Z-Phe-Arg-Methylcoumarinamid.
  • Substrate für Plasmin: H-D-Val-Leu-Lys-p-Nitroanilid ' 2 HC1, Tos-Gly-Pro-Arg-p-Nitroani lid HC1, Boc-Glu-Lys-Lys-Methylcoumarinamid, Boc-Val-Leu-Lys-Methylcoumarinamid, H-D-Val-Leu-Lys-Aminoisophthalatdimethylester.
  • Substrate für Urokinase: Bz.-Val-Gly-Arg-p-Nitroanilid HC1, Pyro-Glu-Gly-Arg-p-Nitroani lid HC1, Glutaryl-Gly-Arg-Methylcoumarinamid.
  • Substrate für Gewebe-Kallikrein: H-D-Val-Leu-Arg-p-Nitroanilid 2 2 HC1, H-Pro-Phe-Arg-Methylcoumarinamid.
  • Was die Untersuchungsmethode angeht, so kann freigesetztes p-Nitroanilin, Aminomethylcoumarin oder Aminoisophthalatdimethylester durch die Wirkung eines Enzyms in dem Material gemessen werden. Bei diesen Methoden zeigt das freigesetzte p-Nitroanilin eine gelbe Färbung, und diese wird beeinträchtigt durch beispielsweise die gelbe Farbe der Gelbsucht oder die hemolytische Rotfärbung. Aminomethylcoumarin oder Aminoisophthalatdimethylester lassen sich fluorometrisch bestimmen, jedoch werden die Warte beeinträchtigt durch Serum-Komponenten. Zur Vermeidung dieser Nachteile ist Deproteinisierung erforderlich. Die Substrate für Trypsin und Chymotrypsin sind generell acyl-basische Aminosaure- oder acylaromatische Aminosaure-p-Nitroanilid. Daraus freigesetztes p-Nitroanilin wird zur Bestimmung dieser Enzyme gemessen.
  • Dabei werden ähnliche Nachteile festgestellt.
  • Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird als synthetisches Substrat eine Verbindung der Formel (V) verwendet, beispielsweise eine acyl-basische Aminosäure-Aminoverbindung (I) oder eine acyl-aromatische Aminosäure-Aminoverbindung (1), und durch die Einwirkung von Trypsin, Chymotrypsin oder Protease (ein Enzym, das auf das Blutgerinnungssystem und das fibrinolytische System wirkt) in der Materialprobe wird eine Aminoverbindung (I) aus diesem synthetischen Substrat freigesetzt. Die freigesetzte Aminoverbindung (I) wird in Anwesenheit einer Kupplungskomponente durch eine Oxidase oxidativ kondensiert, und das dabei gebildete Pigment wird colorimztrisch gemessen. Die Methode läßt sich vorteilhaft einsetzen für fortlaufende automatisierte Untersuchungen und wird nicht beeintrachtigt durch Serum-Komponenten, weil bei einer spezifischen Wellenlänge des Absorptionsmaximums bei 500-750 nm gemessen wird.
  • Beispiele für für diese Enzyme in synthetischen Substraten bevorzugt verwendete acyl-basische Aminosäuren sind die folgenden: Für Thrombin: Bz-Phe-Val-Arg-OH H-D-Phe-Pro-Arg-OH Tos-Gly-Pro-Arg-OH Boc-Val-Pro-Arg-OH H-D-Pro-Arg-OH Für Faktor Xa: Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-OH Boc-Ile-Glu-Gly-Arg-OH Für Plasma-Kallikrein: Bz-Pro-Phe-Arg-OH H-D-Pro-Phe-Arg-OH Z-Phe-Arg-OH Für Plasmin: Tos-Gly-Pro-Arg-OH Boc-Glu-Lys-Lys-OH Boc-Val-Leu-Lys-OH H-D-Val-Leu-Lys-OH Für Urokinase: Bz-Val-Gly-Arg-OH Pyro-Glu-Gly-Arg-OH Glutaryl-Gly-Arg-OH Für Gewebe-Kallikrein: H-D-Val-Leu-Arg-OH Pro-Phe-Arg-OH Synthetische Substrate, die diese Komponenten enthalten, lassen sich in der gleichen Weise herstellen, wie dies im Zusammenhang mit CAP und GPDAP zuvor veranschaulicht wurde. Ein Beispiel für die Synthese einer Aminoverbindung (I), die N,N-Diethylamino-p-phenylendiamin aufweist, ist das folgende: Boc-Arg(N02)-OH und N,N-Diethylamino-p-phenylendiamin (DEAA) wurden mittels eines wasserlöslichen Carbodiimids (WSC) kondensiert, und es wurde Boc-Arg(N02) -DEAA erhalten. Die tert.-Butyloxycarbonylgruppe (Boc-) wurde mittels HCl/Ethylaoetat hydratisiert und es wurde H-Arg(N02)-DEAA gewonnen. Das so erhaltene H-Arg(N02)-DEAA und die Aminogruppe geschützt enthaltende Peptide wurden in der gleichen Weise, wie für CAP und GPDAP, kondensiert, beispielsweise durch dehydratisierende Kondensation in Anwesenheit von WSC in Butanol. Dann wurde die NO2-Gruppe durch katalytische Reduktion mit Palladium/Kohlenstoff entfernt, und es wurde eine acylierte basische Aminosäure-Aminoverbindung (I) erhalten.
  • Die Verbindung (V) kann zur Auffindung von bakteriellem Endotoxin eingesetzt werden. Bisher wurde die Spurenanalyse von bakteriellem Endotoxin so vorgenommen, daß man sich des Phänomens der Gelierung von Amoebocyt-Lysat von Hufeisen-Krabbennit einer Spurenmenge von bakteriellem Endotoxin bediente. Kürzlich ist Endotoxin in der klinischen Pathologie verwendet worden. Beispielsweise wurde ein Lymrus-Amoebocyt-Lysat-Test in Chirurgie benutzt für klinische Diagnose von Fällen exogener Endotoxemie oder endotoxinem Schock, verursacht durch Krankheiten, die eine scheinbare Infektion zeigten. Auf diesem Feld der inneren Medizin ist die Beeinträchtigung durch Endotoxin intestinaler gramnegativer Bakterien auf Hepatopathie und endogene Endotoxemie, beispielsweise die Abnahme der Funktionen des rektikuloendotherialen Systems, wie beispielsweise die Detoxication von bakteriellem Endotoxin in der Leber, ein Problem. Für diese Zwecke ist die klinische Bestimmung von Endotoxin auf Blutgerinnung, auf das firinolytische System, auf das Kinin-System, auf das zirkulatorische System und auf das Immunsystem sehr wichtig geworden.
  • Bei der Untersuchung des zuvor angegebenen bakteriellen Endotoxins werden Materialproben, wie beispielsweise Patienten-Blutflüssigkeit, speziell Blut, Aszites, Urin, Pankreassaft, Gallenflüssigkeit u.a. verwendet. Diese Körperflüssigkeiten haben jedoch Eigenfärbung, und diese Färbungen und die durch die Krankheiten verursachten Pigmente, wie beispielsweise die tiefe Gelbfärbung bei Gelbsucht und die hemolytische Rotfärbung, inhibieren die Colorimetrie. Weiterhin enthalten Körperflüssigkeiten fluoreszierende Substanzen, und demzufolge kann es vorkommen, daß fluorometrische Messungen beeinträchtigt sind.
  • Bei der erfindungsgemäßen Untersuchungsmethode werden ein synthetisches Substrat der Verbindung (V), worin R lgCO-R'l9-Gly-Arg ist, wobei R'l9 für einen L-AminosAurerest oder einen Peptidrest steht, die geschütztes endständiges N aufweisen, und Amoebocyt-Lysat und/oder einem Enzym-Prekursor, der daraus isoliert ist, zusammen mit bakterielles Endotoxin enthaltender Materialprobe zur Reaktion gebracht, und dabei wird eine Aminoverbindung (I) freigesetzt.
  • Die Aminoverbindung (I) wird durch Oxidase mit einer Kupplungskomponenten oxidativ kondensiert, und dann wird das Endotoxin colorimetrisch bestimmt. Die colorimetrische Prüfung kann bei 500 - 750 nm vorgenommen werden und wird bevorzugt angewendet für Bestimmungen in einer automatischen Analyse, ohne daß Inhibierungen durch Verunreinigungen in dem Proben-Serum auftreten.
  • Man kann Amoebocyt-Lysat durch hypotonische Behandlung von Amoebocyten in den Lymphocyten von IIufeisen-Krabben erhalten, oder man verwendet ein handelsübliches Produkt (LAL-Test; Lymus-Amoecyt-Lysat-Test). Im Handel erhiltliche Produkte sind beispielsweise Pregel (Difco Lab., USA) und Pyrogent (Mallinckrodt Inc., USA).
  • Zur Isolierung und Reinigung des Enzym-Prekursors kann man ein Amoebocyt-Lysat saulenchromatographisch, durch Elektrophorese oder durch Affinitäts-Chromatographie behandeln.
  • Das Amoebocyt-Lysat oder der Enzym-Prekursor, der davon abgetrennt wurde, lassen sich durch bakterielles Endotoxin aktivieren, so daß ein aktives Enzym vorliegt, das speziell auf ein Peptid des sythetischen Substrats der Formel (V) wirkt, worin R' 19 beispielsweise Boc-Leu-, Boc-Val-Leu-, Boc-Ser-, Boc-Val-Ser-, Bz-Leu-, Bz-Val-Leu-, Bz-Ser- oder Bz-Val-Ser- ist. Man kann die Synthese des Substrats in der gleichen Weise vornehmen, wie dies zuvor für die Protease veranschaulicht worden ist.
  • 2) Zucker-Hydrolase (Amylase, Glycosidase): Beispiele für Zucker-Hydrolase sind Amylase, Dextranase (EC: 3.2.1.11), Cellulase (EC: 3.2.1.4) und Glycosidase.
  • Amylase kann man klassifizieren als ot-Amylase (EC: 3.2.1.1), ß-Amylase (EC: 3.2.1.2) oder Amylase (EC: 3.2.1.3).
  • d -Amylase spaltet die d (l 4)-Verknüpfung zwischen dem Gluco~se-Anteil in Stärke oder einer niedriger polymerisierten Glucose und dem Oligomer. Das Enzym wird in der Pankreas und Speicheldrüse produziert und vermehrt sich infolge akuter Pankreatitis. -Amylase-Prüfung ist demzufolge ein wichtiges Verfahren in der klinischen Diagnostik.
  • Es sind verschiedene Methoden zur Prüfung der Amylase-Aktisitzt bekannt. Weit verbreitet ist die Blau-Stärke-Methode, bei der die blaue Farbe, die durch die Amylasewirkung frei wird, colorimetrisch bestimmt wird. Bei dieser Methode ist das Substrat in Wasser unlöslich, und es muß eine Filtration durchgeführt werden, bevor colorimetrisch gemessen werden kann. Dies ist jedoch für eine automatisch durchgeführte Untersuchung unerwünscht. Es ist weiterhin eine Bestimmungsmethode bekannt, bei der ein synthetisches Substrat für Amylase benutzt wird. Bei dieser Methode wird ein synthetisches Substrat p-Nitrophenylmaltopentaosid mit &-Amylase zur Reaktion gebracht, durch die Wirkung von a--Glucosidase wird p-Nitrophenyl frei, und dieses läßt sich colorimetrisch bestimmen. Jedoch ist diese Methode für die Prüfung von Serum-Amylase nachteilig, weil das Reaktionsgemisch gelb ist, ähnlich wie Bilirubin-Serum oder Hemolysat. Es ist eine weitere Methode bekannt, bei der ein synthetisches Substrat aus 2 ,5-Dichlorphenylmaltopentaosid mit oL-Amylase zur Reaktions gebracht wird und dann weiter behandelt wird mit ot-Glucosidase und ß-Glucosidase, wobei 2,4-Dichlorphenol frei wird, das dann mittels Natriumperjodat oxidativ kondensiert wird mit 4-Aminoantipyrin, und wobei der Absorptionswert bei 500 nm bestimmt wird. Diese Methode ist ebenfalls nachteilig, weil es unmöglich ist, sie in einem automatisch ablaufenden Prüfsystem zu benutzen.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren ist eine verbesserte Untersuchungsmethode, die sich vorteilhaft auch für automatisch laufende Reihenuntersuchungen einsetzen läßt.
  • Für die Amylase-Prüfung mittels der erfindungsgemäßen Untersuchungsmethode wird ein synthetisches Substrat benutzt, das hergestellt wird durch Kondensieren einer Hydroxylgruppe eines Malto-oligosaccharids und einer phenolischen lIydroxylgruppe eines Phenolverbindung (I). Durch Amylase wird das synthetische Substrat an der Malto-oligosaccharid-ffalfte hydrolysiert, und es wird die Phenolverbindung (I) in Kombination mit Glucosid, Maltosid oder Maltopentaosid frei.
  • Diese wird mit t- und ß-Glucosidase behandelt, und es bildet sich die Phenolverbindung (I). Die freigesetzte Phenolverbindung (I) wird colorimetrisch bestimmt.
  • Zu den beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Malto-oligosacchariden gehören Saccharide, die aus 2 - 10 D-Glucose mit einer α ib-1,4-Glucosid-Bindung bestehen. Beispiele sind Maltose, Maltotriose, Maltotetraose, Maltopentaose und Maltohexaose. Maltotetraose, Maltopentaose und Maltehexaose gemäß der nachstehenden Formel (VI) werden bevorzugt verwendet.
  • Beispiele für Phenolverbindungen (I) sind Verbindungen, die eine d- ode-r ß-Verknüpfung aufweisen mit Maltooligosaccharid oder dessen reduzierter Endgruppe, die leicht durch d-Glucosidase oder ß-Glucosidase hydrolysiert werden können und leicht meßbar sind. Beispiele für solche Phenolverbindungen (I) sind Verbindungen der Aminophenol-Reihe, wie sie zuvor angegeben wurden.
  • Ein für die erfindungsgemäßen Zwecke brauchbares synthetisches Substrat ist eine Verbindung der Formel worin einer der Reste R"1 und R"2 ein (S)n-O-Rest und der andere Wasserstoff ist, wobei S für eine Monosaccharid-Einheit steht und n eine ganze Zahl größer als 1 ist, und worin R3, R4, R5 und R6 die zuvor angegebene Bedeutung haben.
  • Bevorzugt wird eine Verbindung der Formel (VI) eingesetzt, in der (S) eine Glucose-EIalfte und n = 2-8 sind.
  • Das synthetische Substrat (VI) wird mittels üblicher Synthesemethode mit einem Malto-oligosaccharid hergestellt. Beispielsweise wird ein Malto-oligosaccharid acetyliert und das Acetyl-Malto-oligosaccharid wird mit einer Phenolverbindung (I) kondensiert, danach wird die resultierende Verbindung deacetyliert und so das Produkt gewonnen. (Experimental Chemistry, Vol. 24, S. 304 (1958), in Japanischer Sprache).
  • Man kann eine Verbindung (VI) auch durch enzymatische Reaktion von Phenolverbindung (I)-+ -D-Glucosid, die eine Glycosylgruppe hat, und Maltodextrin durch Cyclomaltodextrin-Gluconotransferase (EC: 2.4.1.19) erhaiten.
  • (Wallenfels u.Mitarb., Carbohydrate Res., 61, 359 (1978)).
  • Dabei wird eine Verbindung der Formel (VI), worin n = 2-8 ist, erhalten, und diese läßt sich mittels einer beliebigen gebräuchlichen Methode reinigen.
  • Serum-Amylase läßt sich bestimmen durch Bebrüten des Enzyms und eines synthetischen Substrats und α -Glucosidase, gewünschtenfalls mit ß-Glucosidase, in einer Pufferlösung und Messung der dabei freigesetzten Phenolverbindung (I) mit einer Kupplungskomponente und einer Oxidase.
  • Beispiele für zu bestimmende Glucosidase sind α-Glucosidase, (EC: 3.2.1.20), ß-Glucosidase (EC: 3.2.1.21), α-Galacto sidase (EC: 3.2.1.22), ß-Galactosidase (EC: 3.2.1.23), i -Mannosidase (EC: 3.2.1.24), ß-Mannosidase (EC: 3.2.1.25), ß-Glucuronidase (EC:3.2.1.31), ß-Xylosidase (EC: 3.2.1.37), d -L-Fusocidase (EC : 3 .2.1.51), -N-Acetylgalactosaminidase (EC: 3.2.1.49) , Acetylglucosaminidase (EC: 3.2.1.50), ß-N-Acetylgalactosaminidase (EC: 3.2.1.53) und ß-N-Acetylglucosaminidase (EC: 3.2.1.30).
  • Deren enzymatische Aktivität kann man bestimmen, wenn man ein synthetisches Substrat der Formel (VI) benutzt, worin der Monosaccharid-Anteil (S) eine Pentose, Hexose, Hexosamin oder Uronsäure-Einheit und n = 1 ist. Als Beispiele können genannt werden: Eine Pentose-Einheit, wie beispielsweise eine Xylose-Einheit, eine Hexose-Einheit, wie beispielsweise eine Glucose-Einheit, eine Galaktose-Einheit, eine Mannose-Einheit, oder eine Fucose-Einheit, eine Hexosamin-Einheit, wie beispielsweise eine N-Acetylgalactosamin-Einheit oder eine N-Acetylglucosamin-Einheit und eine Uronsaure-Einheit, wie beispielsweise Glucuronsäure. Glucosidase kann man bestimmen dadurch, daß man eine Phenolverbindung (I) durch die Einwirkung der entsprechenden Glucosidase aus einem synthetischen Substrat freisetzt und die Phenolverbindung (I) mit r einer Kupplungskomponenten und einer Oxidase meßtechnisch ermittelt. Beispielsweise wird ein im Handel erhältliches Substrat für Glucosidase, Phenyl-ß-D-Glucosid, mit einer Glucosidase in einem geeigneten Puffer enthaltenden Probe bei 37°C in Kontakt gebracht, und das freigesetzte Phenol wird mit der entsprechenden Kupplungskomponenten und Oxidase in eine Farbstoff-Substanz umgewandzlt.
  • 3) Phosphatase: Phosphatase ist ein Enzym, das die Hydrolyse von Phosphatestern katalysiert, wobei nicht nur Hydrolyse sondern auch eine reversible Reaktion stattfindet, und die Richtung des Reaktionsablaufs ist abhängig von der relativen Konzentration des Substrats und des Produkts.
  • Es sind zahlreiche Phosphatester-Verbindungen bekannt, die im menschlichen Körper vorkommen. Die Phosphatasen, die an dem Metabolismus dieser Phosphatester beteiligt sind, lassen sich entsprechend der Verbindungsstelle des Substrats klassifizieren, zum Beispiel wie folgt: (1) Phosphomonoesterase; (2) Phosphodiesterase; (3) Pyrophosphatase; (4) Metaphosphatase; (5) Polyphosphatase; (6) Phosphoamidase.
  • Für klinische Untersuchungen wird Phosphomonoesterase verwendet.
  • Phosphomonoesterase hydrolysiert unspezifisch Phenylphosphat, p-Nitrophenylphosphat oder ß-Glycerophosphat. Generell wird das Enzym, dessen pH-Optimum im alkalischen Bereich liegt, als alkalische Phosphatase (EC: 3.1.3.1) (nachstehend als A1P bezeichnet) und das Enzym, dessen pH-Optimum im sauren Bereich liegt, als Säure-Phosphatase (EC: 3.1.3.2) (nachstehend als ACP bezeichnet) bezeichnet.
  • Meist stammt A1P aus den Knochen, der Leber, der Plazenta, dem Dünndarm oder der Schleimhaut; und da dieses Enzym meistenteils in den Cellmembranen sitzt, partizipiert es an dem aktiven Transport durch die Membranen, am Stoffwe chse 1.
  • Man weiß, daß bei bestimmten Krankheiten, wie beispielsweise Rachitis, Osteomalazie, Diaclasis, Hepatopathie, Cholangitis und Tumor, Serum-AlP ansteigt, und die Bestimmung von Serum-AlP ist wichtig für die klinische Diagnose dieser Krankheiten. Serum-ACP-Bestimmungen benutzt man hauptsächlich für die Diagnose von Prostata-Krebs, und es heißt, daß damit ein gewisser Effekt hinsichtlich der 55etastu >»sierung von Brustkrebs sich zeigen läßt.
  • Bisher hat man Phosphatase untersucht mittels einer Methode, bei der freigesetztes Phosphat gemessen wurde, nachdem ein organischer Phosphatester hydrolysiert worden war, und mittels einer Methode, bei der aus einem Substrat freigesetztes Phenol gemessen wurde, wobei es sich bei dem Substrat um einen organischen Phosphatester eines Phenols handelte.
  • Aber diese Methode, bei der Phosphat gemessen wird, ist nachteilig, weil das in dem Ansatz coexistierende Phosphat gleichzeitig bei der Messung erfaßt wird, so daß man in der Prob-e vorhandene anorganische Phosphate gesondert bestimmen und eliminieren muß. Darüber hinaus benötigt diese Reaktion relativ lange Zeit, und es ist Deproteination erforde rlich.
  • Eine Methode zur Bestimmung von Phenolen, die Kind-King-Methode, besteht darin, daß ein Phenylphosphat-Substrat hydrolysiert und dabei Phenol freigesetzt wird, und das freigesetzte Phenol in Anwesenheit von Kaliumferricyanat mit 4-Aminoantipyrin oxidativ kondensiert wird, wobei sich rotgefärbtes Chinon bildet, das colorimetrisch bestimmt wird.
  • Bei einer modifizierten Kind-King-Methode wird ein Boratpuffer eingesetzt, um die Färbung zu stabilisieren. Weiterhin hat man bereits eine Methode in Vorschlag gebracht, bei der mit einem Alkalisalz eines aromatischen Sulfonhalogenamids, wie beispielsweise Chloramin T und dergleichen anstelle von Kaliumferricyanid gearbeitet wird (Ungeprüfte Japanische Patentveröffentlichung No. 52-155597), oder bei der Wasserstoffperoxid-Peroxidase eingesetzt wird. Das Kaliumferricyanat, das bei dissen Arbeitsweisen benutzt wird, ist eine Cyanidverbindung, die Verunreinigung und Gefährdung verursacht und deren Einsatz für B>triebs-Bestimmungnn nicht empfehlenswert ist; darüber hinaus ist das Wasserstoffperoxid instabil.
  • Eine andere bekannte Methode, die sogenannte Bessey-Lowry-Methode oder Huggins-Talalay-Methode, ist bekannt, bei der ein p-Nitrophenylphosphat- oder Phenylphthaleinphosphat-Substrat umgesetzt wird mit einer Phosphomonoesterase enthaltenden Probe, und das dabei freigesetzte p-Nitrophenol bzw. Phenolphthalein wird unter alkalischen Bedingungen colorimetrisch bestimmt. Jedoch hat diese Methode Nachteile, weil sie durch das Bilirubin und das Hemoglobin im Blut beeinträchtigt wird.
  • In ähnlicher Weise hat eine weitere Methode, bei der aus einem i-Naphthylphosphat-S-ubstrat Naphthol freigesetzt wird, das bei 340 nm bestimmt werden kann, Nachteile, weil Verunreinigungen in der Probe Nebeneffekte geben und weil cC-iJaphthol karzinogen wirkt.
  • Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird für die Phosphat-Bestimmung ein synthetisches Substrat verwendet, das die Formel worin einer der Reste R" '1 und R" '2 eirnn und der andere Wasserstoff bedeuten, wobei R20-O-eine HO-Gruppe oder ein substituierter oder unsub-stituierter Glycerin-Rest ist, und worin R3, R4, R5 und R6 die zuvor angegebene Bedeutung haben.
  • Wenn es sich bei der R20-0-Gruppe um eine HO-Gruppe handelt, wird durch die enzymatische Wirkung der Phosphomonoesterase in der Probe aus diesem synthetischen Substrat Phenolverbindung (I) freigesetzt, und die Phenolverbindung (I) wird mit einer entsprechenden Kupplungskomponente und Oxidase zu einem Farbstoff umgesetzt, der zwecks Bestimmung der Phosphomonoesterase-Aktivität meßtechnisch erfaßt wird.
  • Beispiele für solche synthetischen Substrate der Formel (VII) sind Verbindungen, die verbunden sind mit einer Phenol verbindung (I) und einem Mono- oder Digly Diglyceridphosphat oder -phosphorsaure und Glycerophosphat oder einem Fettsdureester-Substituenten dieser Verbindung. Beispiele für eine Phenolverbindung (I) wurden bereits angegeben. Eine Verbindung der Formel (VII) kann mittels üblicher Synthesemethoden unter Verwendung von Phenolverbindung (I) und Phosphorsäure oder Glycerophosphat oder einem Fettsaure-Substituenten dieser Verbindung oder einem im Handel erhältlichen Reagens synthetisiert werden. Die enzymatische Aktivität laßt sich in einem geeigneten Puffer bei 370C bestimmen in der Weise, daß man eine Phosphomonoesterase enthaltende Probe mit einem synthetischen Sub-strat in Kontakt bringt, wobei die Phenolverbindung (I) freigesetzt wird, die man in der gleichen Art, wie zuvor bereits beschrieben, meßtechnisch ermittelt.
  • Als Beispiele für Phosphodiesterase-Enzyme können Phospholipase C (EC: 3.1.4.4) und Phospholipase D (EC: 3.1.4.4) benannt werden. Das synthetische Substrat dafür ist eine Verbindung der Formel (VII), worin die R20-O-Gruppe ein substituierter oder unsubstituierter Glycerin-Rest ist.
  • Beispiele für einen substituierten Glycerin-Rest sind mono- und disubstituierte Fettsäureester von zuGlycerin.
  • Diese synthetischen Substrate können in der gleichen Art wie für Phosphomonoesterase beschrieben, benutzt werden.
  • Die Phenolverbndung (I) wird, wenn Phospholipase D eingesetzt wird, rasch freigesetzt; wenn Phospholipase C benutzt wird, wird die Phenolverbindung (I) freigesetzt, wenn zusammen mit Phospholipase C Phosphatase verwendet wird.
  • 4) Esterase und Lipase: Esterase ist ein Enzym, das Ester von Fettsäuren und Alkoholen hydrolysiert oder diese synthetisiert. Man nennt ein Enzym, das Ester der niedrigen Fettsäuren und einwertigen Alkohole hydrolysiert, eine Esterase im engeren Sinn; und man nennt ein Enzym, das einen Ester einer höheren FettsAure und dem dreiwertigen Alkohol Glycerin hydrolysiert, eine Lipase.
  • Beispiele für solche Enzyme sind Lipase im Pankreassaft oder Castoröl und Esterase in der Leber, im Magen oder im Serum. Bekanntlich ist Lipase ein wichtiges Enzym für die Diagnose von Pankreatitis in der klinischen Biochemie.
  • Bisher bekannte Bestimmungsmethoden für Esterase und Lipase arbeiten so, daß als Substrat ein Fettsäureester eingesetzt und die enzymatisch abgespaltene Fettsäure durch Titration bestimmt wird. Diese Methode hat Nachteile; beispielsweise sind die hohen Werte bei der Titration ungünstig und der Vorgang ist kompliziert, und daher ist diese Untersuchungsmethode für viele Proben unbrauchbar. Es besteht also Bedarf für eine einfache colorimetrische Bestimmungsraethode.
  • Eine colorimetrische Bestimmungsmethode, bei der als synthetisches Sub-strat p-Nitrophenolacetat, p-Nitrophenollaurylat oder p-Nitrophenolpalmitat verwendet wird, ist eine solche, bei der enzymatisch freigesetztes p-Nitrophenol gemessen wird. Diese Methode ist wegen der Gelbfärbung des Mediums unvorteilhaft, weil sie durch Pigmente (Gelbsucht-Serum und Hemolysat) in den zu untersuchenden Proben beeinträchtigt wird.
  • Eine weitere Methode, bei der synthetische Substrate, beispielsweise Fettsäureester von Phenol, t -Naphthol oder ß-Naphthol, wie beispielsweise Phenollaurylat, ß-Naphthollaurylat oderL-Naphthylpalmitat benutzt werden, und bei der enzymatisch freigesetztes Phenol, ,£- oder ß-Naphthol meßtechnisch bestimmt werden, ist ebenfalls bekannt. Dabei wird Phenol mittels der colorimetrischen Methode von Folin-Ciocalteau bestimmt. Aber diese Arbeitsweise ist sehr kompliziert und verbraucht sehr viel Zeit, so daß sie praktisch überhaupt nicht eingesetzt wird.
  • Bei einer weiteren bekannten Methode wird ct-Naphthol mit Fast-Violet-B unter alkalischen Bedingungen umgesetzt, und die so gebildete rote Farbe des Diazoniumsalzes wird mittels 2% Triton-X-100 - Lösung in den farblosen Zustand umgewnadelt, und dieser Vorgang wird colorimetrisch bei 520 nm meßtechnisch bestimmt. ß-aphthol wird mit Tetrazo-orthoanisidin gebunden, und es bildet sich ein rotgefärbtes unlösliches Pigment, das mit Ethylacetat extrahiert und dann colorimetrisch gemessen wird. Bei dieser Methode handelt es sich jedoch ebenfalls um eine relativ komplizierte Methode, und es besteht wegen der karzinogenen Wirkung des Naphthols gesundheitliche Gefahr.
  • Die erfindungsgemäße Bestimmungsmethode ist eine solche, bei der eine Esterverbindung einer Fettsäure und eine Phenolverbindung (I) als synthetisches Substrat eingesetzt werden. Dieses Substrat hat die Formel worin eine der Gruppen R""1 und R""2 eine R21-CO-O-Gruppe und die andere ein Wasserstoffatom ist, wobei der Rest R21-CO-ein Fettsäurerest ist, und worin R3, R4, R5 und R6 die zuvor angegebene Bedeutung hab-en. Dieses synthetische Substrat wird durch die in der Probe vorhandene Esterase oder Lipase hydrolysiert, und es wird Phenolverbindung (I) frei, die mit einer Kupplungskomponenten durch Oxidase oxidativ kondensiert wird. Diese Methode wird vorteilhaft für automatische Analyse während einer laufenden Betriebsbestimmung eingesetzt, sie wird nicht durch in dem Serum vorhandene Verunreinigungen beeinträchtigt, da die Messung bei langen Wellenlängen bei 500 - 750 nm vorgenommen wird.
  • Das synthetische Substrat läßt sich mittels üblicher Verfahren synthetisieren; man kann es auch im Handel erwerben.
  • Beispiele für brauchbare Fettsäuren sind Essigsäure, Propionsäure, BUttersäure, Valeriansäure, Capronsäure, Oenanthsaure, Caprylsäure, Pelargonsäure, CaprinsRure, Undecylsaure, Laurinsäure, Tridecansäure, Myristinsäure, Pentadecansäure und Palmitinsäure. Es lassen sich übliche Synthesemethoden einsetzen.
  • Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Untersuchungsverfahrens wird vorteilhaft eine Pufferlösung benutzt.
  • Die Menge an synthetischem Substrat hängt ab von der Probenmenge, der enzymatischen Aktivität und der Reaktionszeit und beträgt im allgemeinen 0,1 - 20 mM/Lit. und 0,01-5 ml.
  • Die enzymatische Reaktion wird bei annähernd 37°C über eine so ausreichende Zeit durchgeführt, daß die Aminoverbindung (I) bzw. die Phenolverbindung (I) freigesetzt wird, was gewöhnlich mehr als eine Minute dauert.
  • Aminoverbindung (I) und Phenolverbindung (I) können in der zuvor b-eschriebenen Weise meßtechnisch erfaßt werden. Die enzymatische Reaktion zur Freisetzung der Verbindung (I) aus dem Substrat und die Messung für die Verbindung (I) können entweder in gesonderten Verfahrensstufen oder vorzugsweise einstufig durch vorherige Zugabe der erforderlichen Reagentien und des Enzyms vorgenommen werden.
  • Man kann weiterhin verbrauchten Sauerstoff mittels einer Sauerstoff-Elektrode messen, und es kann eine automatische Betriebsbestimmung oder ein sonstiges colorimetrisches Verfahren eingesetzt werden.
  • Die b-ei der enzymatischen Bestimmungsmethode benutzten Reagentien und die Oxidase können in flüssiger Form, in immobilisierter Form oder beschichtet auf einer Folie oder auf Filterpapier vorhanden sein. Zum Löslichmachen und zur Verstärkung der hydrophilen Natur des synthetischen Substrats kann man nicht-ionische Tenside mitbenutzen, und es können sonstige Stabilisierungsmittel für die Oxidase zweckmäßig zugegeben werden.
  • In den beigefügten Zeichnungen zeigen: Fig. 1 die Absorptionskurve des Pigments bei Verwendung von 2,6-Dibrom-4-aminophenol, ASOD und l-Naphthol-2-sulfonat (ausgezogene Linie); Fig. 2 die Absorptionskurve des Pigments bei Verwindung von 2,6-Dibrom-4-aminophenol, ASOD und Phenol (ausgezogene Linie); Fig. 3 die Absorptionskurbe des Pigments bei Verwendung von 2,6-Dibrom-4-aminophenol, Laccase und l-Naphthol-2-sulfonat (ausgezogene Linie); Fig. 4 die Absorptionskurve des Pigments bei Verwendung von 2 ,6-Dibrom-4-aminophenol, Laccase und 2,5-Dimethylphenol (ausgezogene Linie); Fig. 5-52 die Absorptionskurven (ausgezogene Linien) von Pigmenten bei Verwenduung der nachstehend für jede einzelne Figur mit den folgenden Abkürzungen angegebenen Substanzen: Nachstehend benutzte Abkürzungen: 2,6-Dibrom-4-Aminophenol: 2,6-DBAP N,N-Diethyl-p-phenylendiamin: N ,N-DEPD N,N.Dimethyl-p-phenylendiamin: N,N-DMPD; Fig. 5: 2,6-DBAP, Laccase und Phenol; Fig. 6: N,N-DEPD, ASOD und Phenol; Fig. 7: X,N-DMPD, ASOD und Phenol; Fig. 8: 2,6-DBAP, ASOD und o-Methylanilin; Fig. 9: 2,6-DBAP, ASOD und m-Methylanilin; Fig. 10: 2,6-DBAP, ASOD und 4-Chlor-l-naphthol; Fig. 11: 2,6-DBAP, ASOD und Clève's Säure; Fig. 12: 2,6-DBAP, ASOD und l-Hydroxy-2-naphthoesïure; Fig. 13: N ,N-DEPD, Laccase und l-Naphthol-2-sulfonat; Fig. 14: 2,6-DBAP, ASOD und o-Chlorphenol; Fig. 15: 2,6-DBAP, ASOD und m-Aminophenol; Fig. 16: 2,6-DBAP, ASOD und m-Phenylendiamin; Fig. 17: 2,6-DBAP, ASOD und 2,6-Dibromphenol; Fig 18: 2,6-DBAP, ASOD und 2,6-Dimethoxyphenol; Fig. 19: 2,6-DBAP, ASOD und 3,5-Dimethylphenol; Fig. 20: 2,6-DBAP, ASOD und 2,6-Dimethylphenol; Fig. 21: 2,6-DBAP, ASOD und 2,4-Dimethylphenol; Fig. 22: 2,6-DBAP, ASOD und 2,3-Dimethylphenol; Fig. 23: 2,6-DBAP, ASOD und 2,5-Dimethylphenol; Fig. 24: 2,6-DBAP, ASOD und Anthranilsäure; Fig. 25: 2,6-DBAP, ASOD und N,N-Dimethylanilin; Fig. 26: 2,6-DBAP, ASOD und Anilin; Fig. 27: 2,6-DBAP, ASOD und m-Chloranilin; Fig. 28: 2,6-DBAP, ASOD und o-Aminophenol; Fig. 29: N,N-DEPD, ASOD und o-Chlorphenol; Fig. 30: N,N-DEPD, ASOD und m-Phenylendiamin; Fig. 31: N,N-DEPD, ASOD und o-Methylanilin; Fig. 32: N,N-DEPD, ASOD und m-Methylanilin; Fig. 33: N,N-DEPD, ASOD und Clevc's Säure; Fig. 34: N,N-DEPD, ASOD und l-Naphthol-2-sulfonat; Fig. 35: N,N-DEPD, ASOD und 2,6-Dibromphenol; Fig. 36: N,N-DEPD, ASOD und 2,6-Dimethoxyphenol; Fig. 37: N,N-DEPD, ASOD und 2,6-Dimethylphenol; Fig. 38: N,N-DEPD, ASOD und 2,5-Dimethylphenol; Fig. 39: N,N-DEPD, ASOD und N,N-Dimethylanilin; Fig. 40: N,N-DEPD, ASOD und Anilin; Fig. 41: N,N-DMPD, ASOD und o-Chlorphenol; Fig. 42: N,N-DMPD, ASOD und 2,6-Dibromphenol; Fig. 43: N,N-DMPD, ASOD und Anthranilsäure; Fig. 44: N,N-DMPD, ASOD und Anilin; Fig. 45: N,N-DMPD, ASOD und d -Naphthol; Fig. 46: N,N-DMPD, ASOD und 4-Chlor-l-naphthol; Fig. 47: N,N-DMPD, ASOD und l-Naphthol-2-sulfonat; Fig. 48: N,N-DMPD, ASOD und m-Phenylendiamin; Fig. 49: N,N-DMPD, ASOD und o-Methylanilin; Fig. 50: N,N-DMPD, ASOD und m-Methylanilin; Fig. 51: 2,6-DBAP, ASOD und m-Bromanilin; Fig. 52: 2,6-DBAP, Tyrosinase und N,N-Ethylhydroxyethylanilin; Fig. 53 die Standardkurve von 2,6-DBAP bei Verwendung von l-Naphthol-2-sulfonat und ASOD; Fig. 54 die Standardkurve von N,N-DEPD bei Verwendung von Phenol und ASOD; Fig. 55 die Standardkurve von Phenol bei Verwendung von X,-Diethyl-p-phenylendiamin und ASOD; Fig. 56 die Standardkurve von 2,6-DBAP bei Verwendung von 2,5-Dimethylphenol und ASOD; Fig. 57 die Änderungen in der Absorptionskurve des Pigments bei 2-Minuten-Intervallen während der Reaktion im Verlauf der l,-Glucosidase-Bestimmung bei Verwendung von Phenyl-& -glucosid und ASOD; Fig. 58 die Änderungen in der Absorptionskurve des Pigmasts bei 5-Minuten-Intervallen während der Reaktion im Verlauf der AlP-Bestimmung bei Verwendung von Phenylphosphat und ASOD; Fig. 59 die Änderungen in der Absorptionskurve des Pigments bei 2-Minuten-Intervallen während der Reaktion im Verlauf der Esterase-Bestimmung bei Verwendung von Phenylacetat und ASOD; Fig. 60 eine graphische Darstellung des Verhältnisses von Sauerstoffverbrauch gegen Reaktionszeit bei Verwendung von 2,6-DBAP, 2,5-Dimethylphenol und ASOD; und Fig. 61 eine graphische Darstellung des Verhältnisses von Sauerstoffverbrauch gegen Reaktionszeit bei Verwendung von 2,6-DBAP, 2,5-Dimethylphenol und Laccase .
  • In den folgenden Beispielen sind die Versuchsbedingungen, die jeweiligen Verbindungen (I), die Einsatzstoffe usw.
  • der erfindungsgemäßen Bestimmungsmethode noch näher veranschaulicht.
  • Beispiel 1 Colorimetrie bei Verwendung von 2,6-Dibrom-4-aminophenol, Ascob-at-Oxidase (nachstehend als ASOD bezeichnet) und l-Naphthol-2-sulfonat: 2,6-Dibrom-4-aminophenolhydrochlorid wurde in einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst, und es wurde eine 0,5 mM-Lösung (Lösung A) hergestellt. Kalium- l-Naphthol- 2-sulfonat wurde in einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst, und es wurde eine 0,5 mM - Lösung (Lösung B) hergestellt. Zu einem Gemisch aus Lösung A (1,0 ml) und Lösung B (1,0 ml) wurde ASOD (100/uhr 130 E), erhalten aus Sechium edule (Japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung No. 5688793), 0 zugegeben, und das Gemisch wurde 10 Minuten lang bei 37 C bebrütet. Die Absorptions-Wellenlänge des gebildeten Pigments ist in Fig. 1 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht.
  • Als Kontrolluntersuchung wurde anstelle der Lösung B ein 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) benutzt. Die Ergebnisse sind in Fig. (als gestrichelte Linie) gezeigt. Es wurde gefunden, daß das spezifische Absorptions-Maximum bei 630 nm liegt, und daran konnte 2,6-Dibrom-4-aminophenol quantitativ bestimmt werden.
  • Die Standardkurve für 2,6-Dibrom-4-aminophenol wurde in der Weise hergestellt, daß verschiedene Konzentrationen von 2,6-Dibrom-4-aminophenol (2 ml), l-Naphthol-2-sulfonat (0,5 mM, 1 ml) und ASOD (100 µl, 103 E) 10 Minuten lang bei 370C bebrütet und jeweils die Meßwerte bei 630 nm aufgezeichnet wurden (Fig. 53).
  • Beispiel 2 Colorimetrie bei Verwendung von 2,6-Dibrom-4-aminophenol, ASOD und Phenol: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde Phenol (10 mM) anstelle von Kalium-l-naphthol-2-sulfonat eingesetzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 2 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Die Absorptionskurve bei Verwendung eines 0,1 M Phosphatpuffers ( pH 7,0 ) anstelle von Phenol ist in Fig. 2 (als gestrichelte Linie) gezeigt. 2 ,6-Dibrom-4-aminophenol kann bei Verwendung von ASOD und Phenol bei 610 nm erfindungsgemäß bestimmt werden.
  • Anschließend wurde die 2,6-Dibrom-4-aminophenol-Lösung durch 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) ersetzt, und es wurde die Absorption gemessen (Fig. 2, die Linie ( Wie vorstehend gezeigt, lassen sich mit der erfindungsgemäßen Untersuchungsmethode 2,6-Dibrom-4-aminophenol oder Phenol quantitativ bestimmen.
  • Beispiel 3 Colorimetrie bei Verwendung von 2,6-Dibrom-4-aminophenol, Laccase und l-Naphthol-2-sulfonat: 2,6-Dibrom-4-aminophenolhydrochlorid wurde in einem 0,1 M Phopshatpuffer (pH 7,0) gelöst, und es wurde eine 0,5 mM Lösung (Lösung A) hergestellt. Kalium-l-naphthol-2-sulfonat wurde in einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst, und es wurde eine 0,5 mM - Lösung (Lösung B) hergestellt.
  • Zu einem Gemisch der Lösung A (1,0 ml) mit der Lösung B (1,0 ml) wurde Laccase (100 /ul, 80 E), erhalten aus Polyporus versicolor, zugesetzt, und das resultierende Gemisch wurde 20 Minuten lang bei 370C bebrütet.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 3 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Als Kontrolluntersuchung wurde das Kalium-1-naphthol-2-sulfonat durch 0,1 M Phosphatpuffer (sH 7,0) ersetzt (Fig. 3, gestrichelte Linie) Bei Verwendung von Laccase und Kalium-l-naphthol-2-sulfonat kann man 2,6-Dibrom-4-aminophenol bei 630 nm quantitativ bestimmen.
  • Beispiel 4 Colorimetrie bei Verwendung von 2,6-Dibrom-4-aminophenol, Laccase und 2,5-Dimethylphenol: Es wurde wie in Beispiel 3 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde anstelle von Kalium-l-naphthol-2-sulfonat 2,5-Dimethylphenol (10 mM) eingesetzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 4 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Es sind weiterhin in Fig. 4 (als gestrichelte Linie) die Ergebnisse veranschaulicht, die man erhält, wenn man anstelle von 2,5-Dimethylphenol 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) benutzt.
  • Wie zuvor veranschaulicht, kann man bei Verwendung von Laccase und 2,5-Dimethylphenol 2,6-Dibrom-4-aminophenol bestimmen.
  • Asntelle der zuvor angegebenen Laccase wurde Tyrosinase ( 50 /ul, 100 E ) benutzt, und es wurde eine Absorptionskurve gewonnen, die ähnlich der in Fig. 4 dargestellten war (spezifische Absorptionswellenlänge 585 nm, A OD585nm = 0,8).
  • 1 mM 2,6-Dibrom-4-aminophenol und lO mM 2,5-Dimethylphenol in einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0), 1 ml) wurden in eine Bebrütungszelle mit einer Sauerstoff-Elektrode eingefüllt, und es wurde bei 370C vorbebrütet. Dazu wurde ASOD-Lösung (100 µl, 250 E) gegeben, und das Gemisch wurde bei 37°C bebrütet. Ausgehend von dem Zeitpunkt Null, das war der Zeitpunkt der ASOD - Zugabe, wurden die elektrochemischen Änderungen mittels einer Sauerstoff-Elektrode gemessen, und so wurde die Menge an verbrauchtem Sauerstoff im Verhältnis zur Zeit ermittelt. Die Ergebnisse sind in Fig. 60 veranschaulicht.
  • Anstelle der zuvor angegebenen ASOD wurde Laccase (100 ,ulr 200 E) eingesetzt. Der Sauerstoffverbrauch dabei ist in Fig.
  • 61 veranschaulicht.
  • Beispiel 5 Colorimetrie bei Verwendung von 2,6-Dibrom-4-aminophenol, Laccase und Phenol: Es wurde wie in Beispiel 3 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde Phenol,*aOnsglle von Kalium-1-naphthol- 2-sulfonat eingesetzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 5 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Wenn man anstelle von Phenol 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) benutzt, erhält man die in Fig. 5 (als gestrichelte Linie) gezeigten Ergebnasse.
  • Wie zuvor veranschaulicht, lassen sich Phenol und 2,6-Dibrom-4-aminophenol bei 600 nm bestimmen.
  • Beispiel 6 Colorimetrie bei Verwendung von N,N-Diethyl-p-phenylendiamin, ASOD und Phenol: N,N-Diethyl-p-phenylendiamin-dihydrochlorid wurde in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst, und es wurde eine 1 mM Lösung (Lösung A) hergestellt. Phenol wurde in einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst, und es wurde eine 10 mM Lösung (Lösung B) hergestellt. Zu dem Gemisch aus Lösung A (1,0 ml) und Lösung B (1,0 ml) wurde ASOD (100 µl, 130 E) hinzugegeben, und das Gemisch wurde 20 Minuten lang bei 370C bebrütet. Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 6 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Es wurde die gleiche Reaktion durchgeführt, jedoch wurde anstelle der Phenollösung ein 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) benutzt.
  • Die Ergebnisse sind in Fig. 6 (als gestrichelte Linie) veranschaulickt. Wie zuvor gezeigt kann man N,N-Diethyl-p-phenyl diamin oder Phenol nach der erfindungsgemäßen Methode bei 670 nm bestimmen.
  • Die Standardkurve für die zuvor erläuterte Reaktion ließ sich wie folgt gewinnen: Es wurden unterschiedliche Konzentrationen von N,N-Diethylp-phenylendiamin-Lösung ( 2 ml) , Phenol ( 10 mM, 1,0 ml) und ASOD (100 /ul, 130 E) 10 Minuten lang bei 370C bebrütet, dann wurde colorimetrisch bei 670 nm gemessen, und so wurde die Standardkurve von N,N-Diethyl-p-phenylendiamin (Fig. 54) gewonnen.
  • Verschiedene Konzentrationen von Phenol (1 ml), N,N-Diethylp-phenylendiamin (1 mM, 2 ml ) und ASOD ( 100 ,ul, 130 E 0 wurden 10 Minuten lang bei 37 C bebrütet, und dann wurde bei 670 nm colorimetrisch gemessen und so die Standardkurve für Phenol (Fig. 55) gewonnen.
  • Beispiel 7 Colorimetrie bei Verwendung von N , N-Dimethyl-p-phe nyle ndiamin, ASOD und Phenol: Es wurde wie in Beispiel 6 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde N ,N-Dimethyl-p-phenylendiamindihydrochlorid anstelle von N ,N-Diethyl-p-phenylendiamindihydrochlorid benutzt und das Gemisch wurde 30 Minuten lang bebrütet.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 7 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Wenn man einen 0,1 M Phosphatpuffer ( pB 7,0 ) anstelle der Phenollösung benutzt, erhält man die in Fig. 7 (als gestrichelte Linie) veranschaulichten Ergebnisse.
  • Wie zuvor gezeigt, lassen sich N,N-Dimethyl-p-phenylendiamin und Phenol mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens bei 655 nm bestimmen.
  • Beispiel 8 Colorimetrie bei Verwendung von 2,6-Dibrom-4-aminophenol, ASOD und o-Methylanilin: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde o-Methylanilin (0,5 mM ) anstelle von Kalium-l-naphthol-2-sulfonat benutzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 8 <als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Wenn man 0,1 M Phosphatpuffer ( plI 7,0 ) anstelle von o-Methylanilin benutzt und den Test durchführt, erhält man die in Fig. 8 (als gestrichelte Linie) veranschaulichten Ergebnisse.
  • Wie in diesem Beispiel illustriert, läßt sich 2,6-Dibrom-4-aminophenol bei Verwendung von ASOD und o-Methylanilin mit der erfindungsgemäßen Untersuchungsmethode bei 670 nm bestimmen.
  • Beispiel 9 Colorimetrie bei Verwendung von 2,6-Dibrom-4-aminophenol, ASOD und m-Methylanilin: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde m-Methylanilin (0,5 mM ) anstelle von Kalium-l-naphthol 2-sulfonat benutzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 9 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Es wurde ein weiterer Versuch durchgeführt, bei dem ein 0,1 M Phosphatpuffer ( pH 7,0 ) anstelle von m-Methylanilin benutzt wurde. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Fig. 9 (als gestrichelte Linie) v; ranschaulicht.
  • Wie damit gezeigt, läßt sich 2,6-Dibrom-4-aminophenol bei Verwendung von ASOD und m-Methylanilin mit der erfindungsgemaßen Untersuchungsmethode bei 670 nm bestimrien.
  • Beispiel 10 Colorimetrie bei Verwendung von 2 ,6-Dib-rom-4-aminophenol, ASOD und 4-Chlor-l-naphthol: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde 4-Chlor-l-naphthol (0,5 mM ) anstelle von Kalium-lnaphthol-2-sulfonat benutzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 10 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Es sind weiterhin diejenigen Ergebnisse in Fig. 10 (als gestrichelte Linie) gezeigt, die man erhält, wenn man einen 0,1 M Phosphatpuffer ( pH 7,0 ) anstelle von 4-Chlor-l-naphthol benutzt.
  • Wie illustriert kann man 2,6-Dibrom-4-aminophenol bei Verwendung von ASOD und 4-Chlor-l-naphthol mit der erfindungsgemäßen Methode bei 580 nm bestimmen.
  • Beispiel 11 Colorimetrie bei Verwendung von 2 ,6-Dibrom-4-aminophenol, ASOD und Clève 's Saure: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde Cleve's Saure (0,5 mM ) anstelle von Kalium-l-naphthol-2-sulfonat benutzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 11 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Es sind in Fig. 11 (als gestrichelte Linie) auch die Ergebnisse gezeigt, die man erhalt, wenn man einen 0,1 M Phosphatpuffer ( pH 7,0 anstelle von ClvIs Saure benutzt.
  • Wie in diesem Beispiel gezeigt, kann man 2,6-Dibrom-4-aminophenol bei Verwendung von ASOD und Cleve's Säure mittels der erfindungsgemäßen Untersuchungsmethode bei 560 nm bestimmen.
  • Beispiel 12 Colorimetrie bei Verwendung von 2,6-Dibrom-4-aminophenol, ASOD und l-Hydroxy-2-naphthoesNure: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde l-Hydroxy-2-naphthoesäure anstelle von Kalium-lnaphthol-2-sulfonat verwendet.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 12 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Es sind in Fig. 12 (als gestrichelte Linie) auch die Ergebnisse veranschaulicht, die erhalten wurden, als ein O,L M Phosphatpuffer ( pH 7,0 anstelle von l-Hydroxy-2-naphthoesure eingesetzt wurde.
  • Wie gezeigt kann man 2,6-Dibrom-4-aminophenol nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bei Verwendung von ASOD und l-Hydroxy-2-naphthoesäure bei 590 nm bestimmen.
  • Beispiel 13 Colorimetrie bei Verwendung von N,N-Diethyl-p-phenylendiamin, Laccase und l-Naphthol-2-sulfonat: Es wurde wie in Beispiel 3 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde N,N-Diethyl-p-phenylendiamin 2 HC1 (1 mM) anstelle von 2,6-Diethyl-p-phenylendiamin 2 HC1 benutzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 13 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Es sind in Fig. 13 (als gestrichelte Linie) auch die Ergebnisse gezeigt, die erhalten wurden, als 0,1 M Phosjatpuffer ( pH 7,0 ) anstelle von Kalium-l-naphthol-2-sulfonat eingesetzt wurde.
  • Wie zuvor veranschaulicht kann man mit der erfindungsgemäßen Untersuchungsmethode N ,N-Diethyl-p-phenylendiamin bei Verwendung von Laccase und Kalium-l-naphthol-2-sulfonat bei 660 nm bestimmen.
  • Beispiel 14 Colorimetrie bei Verwendung von 2 ,6-Dibrom-4-aminophenol, ASOD und o-Chlorphenol: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch -wurde o-Chlorphenol (0,1 mM) anstelle von Kalium-l-naphthol-2-sulfonat eingesetzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 14 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Es sind in Fig. 14 (als gstrichelte Linie) auch die Ergebnisse gezeigt, die mit 0,1 M Phosphatpuffer ( pH 7,0 ) anstelle von o-Chlorphenol erhalten wurden.
  • Wie veranschaulicht kann man mit der erfindungsgemaßen Untersuchungsmethode 2 ,6-Dibrom-4-aminophenol bei Verwendung von ASOD und o-Chlorphenol bei 650 nm bestimmen.
  • Beispiel 15 Colorimetrie bei Verwendung von 2,6-Dibrom-4-aminophenol, ASOD und m-Aminophenol: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde m-Aminophenol (0,5 mM ) anstelle von Kalium-l-naphthol-2-sulfonat benutzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 15 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. fs sind weiterhin in Fiy. 15 (als gestrichelte Linie) die Ergebnisse gezeigt, die mit 0,1 M Phosphatpuffer ( pH 7,0 ) anstelle von m-Aminophenol erhalten wurden.
  • Wie illustriert läpt sich mittels der erfindungsgemäßen Untersuchungsmethode 2 ,6-Dibrom-4-aminophenol bei Verwendung von ASOD und m-Aminophenol bei 565 nm bestimmen.
  • Beispiel 16 Colorimetrie bei Verwendung von 2,6 2 ,6-Dibrom-4-aminophenol, ASOD und m-Phenylendiamin: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde m-Phenylendiamin (0,5 mM ) anstelle von Kalium-lnaphthol-2-sulfonat eingesetzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 16 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Es sind in Fig. 16 (als gestrichelte Linie) auch die Ergebnisse gezeigt, die mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0 ) anstelle von m-Phenylendiamin erhalten wurde.
  • Wie zu sehen ist läßt sich mit dem erfindungsgemäßen Prüfverfahren 2,6-Dibrom-4-aminophenol bei Verwendung von ASOD und m-Phenylendiamin bei 610 nm bestimmen.
  • In Fig. 16 ist als zu <- - ) weiterhin die Absorptionskurve gezeigt, die resultierte, wenn ASOD, m-Phenylendiamin und Phosphatpuffer benutzt wurden.
  • Beispiel 17 Colorimetrie bei Verwendung von 2,6-Dibrom-4-aminophenol, ASOD und 2,6-Dibromphenol: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde 2,6-Dibromphenol anstelle von Kalium-l-naphthol-2-sulfonat benutzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 17 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Es ist in Fig. 17 (als gestrichelte Linie) auch das Ergebnis gezeigt, das mit 0,1 M Phosphatpuffer ( pH 7,0 ) anstelle von 2,6-Dibromphenol erhalten wurde.
  • Man sieht,daß mit der erfindungsgemäßen Prüfmethode 2,6-Dibrom-4-aminophenol bei Verwendung von ASOD und 2,6-Dibromphenol bei 670 nm bestimmt werden kann.
  • Beispiel 18 Colorimetrie bei Verwendung von 2 ,6-Dibrom-4-aminophenol, ASOD und 2,6-Dimethoxyphenol: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde 2,6-Dimethoxyphenol (0,1 mM ) anstelle von Kalium-lnaphthol-2-sulfonat benutzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 18 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Es ist in Fig. 18 (als gestrichelte Linie) auch das Ergebnis gezeigt, das mit 0,1 M Phosphatpuffer ( pH 7,0) anstelle von 2,6-Dimethoxyphenol erhalten wurde.
  • Wie man sieht läßt sich 2,6-Dibrom-4-aminophenol bei Verwendung von ASOD und 2,6-Dimethoxyphenol bei 580 nm bestimmen.
  • Beispiel 19 Colorimetrie bei Verwendung von 2 ,6-Dibrom-4-aminophenol, ASOD und 2,5-Dimethylphenol: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet,. jedoch wurde 3,5-Dimethylphenol (0,5 mM) anstelle von Kalium-lnaphthol-2-sulfonat benutzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 19 (ausgezogene Linie) veranschaulicht. Es ist in Fig. 19 (gestrichelte Linie) auch das Ergebnis gezeigt, das erzielt wurde, als 0,1 M Phosphatpuffer ( pH 7,0 ) anstelle von 3 ,5-Dimethylphenol eingesetzt wurde.
  • Wie man sieht läßt sich 2,6-Dibrom-4-aminophenol bei Verwendung von ASOD und 3,5-Dimethylphenol bei 620 nm bestimmen.
  • Beispiel 20 Colorimetrie bei Verwendung von 2, 6-Dibrom- 4-aminophe nol, ASOD und 2,6-Dimethylphenol: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde 2,6-Dimethylphenol (0,5 mM) anstelle von Kalium-lnaphthol-2-sulfonat benutzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigment ist in Fig. 20 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Es ist in Fig. 20 (als gestrichelte Linie) auch das Ergebnis gezeigt, das erhalten wurde, als 0,1 M Phosphatpuffer ( pH 7,0 ) anstelle von 2,6-Dimethylphenol benutzt wurde.
  • Wie man sieht läßt sich 2,6-Dibrom-4-aminophenol bei Verwendung von ASOD und 2,6-Dimethylphenol erfindungsgemäß bei 580 nm bestimmen.
  • Beispiel 21 Colorimetrie bei Verwendung von 2,6-Dibrom-4-aminophenol, ASOD und 2,4-Dimethylphenol: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde 2,4-Dimethylphenol ( 0,5 mM ) anstelle von Kalium-lnaphthol-2-sulfonat benutzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 21 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Es ist in Fig. 21 weiterhin (als gestrichelte Linie) das Ergebnis gezeigt, das bei Benutzung von 0,1 M Phosphatpuffer ( plI 7,0 ) anstelle von 2,4-Dimethylphenol gewonnen wurde.
  • Wie illustriert läßt sich 2,6-Dibrom-4-aminophenol bei Benutzung von ASOD und 2,4-Dimethylphenol nach der erfindungsgemäßen Untersuchungsmethode bei 585 nm bestimmen.
  • Beispiel 22 Colorimetrie bei Verwendung von 2,6-Dibrom-4-aminophenol, ASOD und 2,3-Dimethylphenol: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde 2,3-Dimethylphenol (0,5 mM ) anstelle von Kalium-lnaphthol-2-sulfonat benutzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 22 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Fig. 22 zeigt weiterhin (als gestrichelte Linie) das Ergebnis, das bei Benutzung von 0,1 M Phosphatpuffer ( pH 7,0 ) asntelle von 2, 3-Dimethylphenol gewonnen wurde.
  • Wie illustriert läßt sich 2,6-Dibrom-4-aminophenol bei Verwendung von ASOD und 2,3-Dimethylphenol erfindungsgemäß bei 590 nm bestimmen.
  • Beispiel 23 Colorimetrie bei Verwendung von 2,6-Dibrom-4-aminophenol, ASOD und 2,5-Dimethylphenol: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde 2,5-Dimethylphenol ( 10 nm ) anstelle von Kalium-lnaphthol-2-sulfonat benutzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 23 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Fig. 23 zeigt weiterhin (als gestrichelte Linie) das Ergebnis, das mit 0,1 M Phosphatpuffer ( pH 7,0 ) anstelle von 2,5-Dimethylphenol erhalten wurde.
  • Wie man sieht läßt sich 2,6-Dibrom-4-aminophenol bei Verwendung von ASOD und 2,5-Dimethylphenol bei 585 nm erfindungsgemäß bestimmen.
  • Es wurden unterschiedliche Konzentrationen von 2,6-Dibrom-4-aminophenol ( 2 ml ), 2,5-Dimethylphenol (13,3 mM, 1 ml und ASOD ( 100 /ul, 130 E ) 10 minuten lang bei 370C bebrütet, und dann wurde bei 585 nm colorimetrisch gemessen, und so wurde die Standardkurve für 2,6-Dibrom-4-aminophenol (Fig. 56) erhalten.
  • Beispiel 24 Colorimetrie bei Verwendung von 2,6-Dibrom-4-aminophenol, ASOD und Anthranilsäure: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde Anthranilsäure ( 0,5 mM ) anstelle von Kalium-lnaphthol-2-sulfonat eingesetzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 24 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Fig. 24 zeigt auch (als gestrichelte Linie) das Ergebnis, das mit 0,1 M Phosphatpuffer ( pil 7,0 ) anstelle von Anthranilsïure erhalten wurde.
  • Wie illustriert läßt sich 2,6-Dibrom-4-aminophenol bei Verwendung von ASOD und Anthranilsäure bei 640 nm bestimmen.
  • Beispiel 25 Colorimetrie bei Verwendung von 2,6-Dibrom-4-aminophenol, ASOD und N,N-Dimethylanilin: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde N,N-Dimethylanilin ( 0,5 mM ) anstelle von Kalium-lnaphthol-2-sulfonat eingesetzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 25 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Fig. 25 zeigt weiterhin (als gestrichelte Linie) das Ergebnis, das man erhält, wenn 0,1 M Phosphatpuffer ( pH 7,0 ) anstelle von N,N-Dimethylanilin eingesetzt wird.
  • Wie illustriert läßt sich 2,6-Dibrom-4-aminophenol bei Verwendung von ASOD und N,N-Dimethylanilin bei 700 nm bestimmen.
  • Beispiel 26 Colorimetrie bei Verwendung von 2 ,6-Dibrom-4-aminophenol, ASOD und Anilin: Es wurde wie in Beispiel 1 angegeben gearbeitet, jedoch wurde Anilin ( 0,5 mM ) anstelle von Kalium-l-naphthol-2-sulfonat eingesetzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigment ist in Fig. 26 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Fig. 26 zeigt weiterhin (als gestrichelte Linie) das Ergebnis, das erhalten wird, wenn man 0,1 M Phosphatpuffer ( pH 7,0 ) anstelle von Anilin benutzt.
  • Wie man sieht läßt sich 2,6-Dibrom-4-aminophenol bei Verwendung von ASOD und Anilin bei 630 nm bestimmen.
  • Beispiel 27 Colorimetrie bei Verwendung von 2,6-Dibrom-4-aminophenol, ASOD und m-Chloranilin: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet~, jedoch wurde m-Chloranilin ( 0,5 mM ) anstelle von Kalium-lnaphthol-2-sulfonat benutzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 27 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Fig. 27 zeigt weiterhin (als gestrichelte Linie) das Ergebnis, das man beim Einsatz von 0,1 M Phosphatpuffer ( pH 7,0 ) anstelle von m-Chloranilin erhält.
  • Wie illustriert läßt sich 2,6-Dibrom-4-aminophenol bei Benutzung von ASOD und m-Chloranilin bei 635 nm erfindungsgemäß bestimmen.
  • Beispiel 28 Colorimetrie bei Verwendung von 2 ,6-Dibron-4-aminophenol, ASOD und o-Aminophenol: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde o-Aminophenol ( 0,5 mM ) anstelle von Kalium-lnaphthol-2-sulfonat benutzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 28 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Fig. 28 zeigt weiterhin (als gestrichelte Linie) das Ergebnis, das man bei Einsatz von 0,1 M Phosphatpuffer ( pH 7,0 ) anstelle von o-Aminophenol erzielt.
  • Wie illustriert läßt sich 2,6-Dib-rom-4-aminophenol bei Verwendung von ASOD und o-Aminophenol bei 580 nm erfindungsgemäß bestimmen.
  • Die Absorptionskurve, die man erhält, wenn man ASOD und o-Aminophenol verwendet, ist ebenfalls in Fig. 28 als ( ) - Linie gezeigt.
  • Beispiel 29 Colorimetrie bei Verwendung von N,N-Diethyl-p-phenylendiamin, ASOD und o-Chlorphenol: Es wurde wie in Beispiel 6 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde; o-Chlorphenol ( 0,1 mM ) anstelle von Phenol eingesetzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 29 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Fig. 29 zeigt ausserdem (als gestrichelte Linie) das Ergebnis, das man mit 0,1 M Phosphatpuffer ( pH 7,0 ) anstelle von o-Chlorphenol erhält.
  • Wie illustriert läßt sich N,N-Diethyl-p-phenylendiamin bei Verwendung von ASOD und o-Chlorphenol bei 690 nm erfindungsgemäß bestimmen.
  • Beispiel 30 Colorimetrie bei Verwendung von N,N-Diethyl-p-phenylendiamin, ASOD und m-Phenylendiamin: Es wurde wie in Beispiel 6 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde m-Phenylendiamin ( 0,5 mM ) anstelle von Phenol eingesetzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 30 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Fig. 30 zeigt weiterhin (als gestrichelte Linie) das Ergebnis, das man bei Verwendung von 0,1 M Phosphatpuffer ( < pH 7,0 ) anstelle von m-Phenylendiamin erzielt.
  • Wie illustriert läßt sich N,N-Diethyl-p-phenylendiamin bei Verwendung von ASOD und m-Phenlynediamin erfindungsgemäß bei 665 nm bestimmen.
  • Beispiel 31 Colorimetrie bei Verwendung von N ,N-Diethyl-p-phenylendiamin, ASOD und o-Methylanilin: Es wurde wie in Beispiel 6 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde o-Methylanilin ( 0,5 mM ) anstelle von Phenol eingesetzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 31 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Fig. 31 zeigt weiterhin (als gestrichelte Linie)das Ergebnis, das man bei Benutzung von o,l M Phosphatpuffer ( pH 7,0 ) anstelle von o-Methylanilin erzielt.
  • Wie veranschaulicht läßt sich X,N-Diethyl-p-phenylendiamin bei Verwendung von ASOD und o-Methylanilin erfindungsgemäß bei 700 nm bestimmen.
  • Beispiel 32 Colorimetrie bei Verwendung von N,N-Diethyl-p-phenylendiamin, ASOD und m-Methylanilin: Es wurde wie in Beispiel 6 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde m-Methylanilin ( 0,5 mM ) anstelle von Phenol eingesetzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 32 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Fig. 32 zeigt weiterhin (als gestrichelte Linie) das Ergebnis, das man bei Benutzung von 0,1 M Phosphatpuffer ( pH 7,0 ) anstelle von m-Methylanilin erzielt.
  • Wie veranschaulicht läßt sich N,N-Diethyl-p-phenylendiamin bei Benutzung von ASOD und m-Methylanilin erfindungsgemäß bei 710 nm bestimmen.
  • Beispiel 33 Colorimetrie bei Verwendung von N,N-Diethyl-p-phenylendiamin, ASOD und Clève's Säure: Es wurde wie in Beispiel 6 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde Cleve's Säure ( 0,5 mM ) anstelle von Phenol eingesetzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 33 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Fig. 33 zeigt weiterhin (als gestrichelte Linie) das Ergebnis, das man beim Einsatz von 0,1 M Phosphatpuffer ( pH 7,0 ) anstelle von Clisve 's Saure erzielt.
  • Wie man sieht läßt sich N,N-Diethyl-p-phenylendiamin bei Verwendung von ASOD und Clz've's Säure erfindungsgemäß bei 755 nm bestimmen.
  • Beispiel 34 Colorimetrie bei Verwendung von N,N-Diethyl-p-phe nylendiamin ASOD und l-Naphthol-2-sulfonat: Es wurde wie in Beispiel 6 beschieben gearbeitet, jedoch wurde Kalium-l-naphthol-2-sulfonat/anstelle von Phenol eingesetzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 34 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Fig. 34 zeigt weiterhin (als gestrichelte Linie) das Ergebnis, das man bei Benutzung von 0,1 M Phosphatpuffer ( pH 7,0 ) anstelle von Kalium-l-naphthol-2-sulfonat erzielt.
  • Man sieht, daß N,N-Diethyl-p-phenylendiamin bei Benutzung von ASOD und Kalium-l-nsphthol-2-sulfonat erfindungsgemäß bei 655 nm bestimmt werden kann.
  • Beispiel 35 Colorimetrie bei Verwendung von N,N-Diethyl-p-phenylendiamir ASOD und 2,6-Dibromohenol: Es wurde wie in Beispiel 6 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde 2,6-Dibromphenol ( 0,5 mM ) anstelle von Phenol eingesetzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 35 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Fig. 35 zeigt weiterhin (als gestrichelte Linie ) das Ergebnis, das man bei Benutzung von 0,1 M Phosphatpuffer ( ph 7,0 ) anstelle von 2,6-DibromiJhe nol e rzie lt.
  • Man erkennt, daß das N,N-Diethyl-p-phenylendiamin bei Verwendung von ASOD und 2,6-Dibromphenol erfindungsgemäß bei 700 nm bestimmt werden kann.
  • Beispiel 36 Colorimetrie bei Verwendung von N N-Diethyl-p-phenylendiamin, ASOD und 2,6-Dimethoxyphenol: Es wurde wie in Beispiel 6 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde 2,6-Dimethoxyphenol ( 0,5 mM ) anstelle von Phenol eingesetzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 36 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Fig. 36 zeigt weiterhin (als gestrichelte Linie) das Ergebnis, das man bei Benutzung von 0,1 M Phosphatpuffer ( pH 7,0 ) anstelle von 2,6-Dimsthoxyphenol erzielt.
  • Es ist erkennbar, daß N,N-Diethyl-p-phenylendiamin bei Benutzung von ASOD und 2,6-Dimethoxyphenol erfindungsgemäß bei 630 nm bestinunt werden kann.
  • Die Absorptionskurve, die man erhält, wenn man ASOD und 2,6-Dimethoxyphenol zur Reaktion bringt, ist ebenfalls in Fig. 36 als ( - . - ) - Linie gezeigt.
  • Beispiel 37 Colorimetrie bei Verwendung von N ,N-Diethyl-p-phenylendiamin, ASOD und 2,6-Dimethylphenol: Es wurde wie in Beispiel 6 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde 2,6-Dimethylphenol ( 10 mM ) anstelle von Phenol eingesetzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 37 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Fig. 37 zeigt weiterhin (als gestrichelte Linie) das Ergebnis, das man bei Benutzung von 0,1 M Phosphatpuffer ( pH 7,0 ) anstelle von 2,6-Dimethylphenol erzielt.
  • Wie zu sehen ist, läßt sich N,N-Diethyl-p-phenylendiamin bei Benutzung von ASOD und 2,6-Dimethylphenol erfindungsgemäß bei 630 nm bestimmen.
  • Beispiel 38 Colorimetrie bei Verwendung von N,N-Diethyl-p-phenylendiamin, ASOD und 2,5-Dimethylphenol: Es wurde wie in Beispiel 6 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde 2,5-Dimethylphenol ( 10 mM ) anstelle von Phenol eingesetzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 38 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Fig. 38 zeigt weiterhin (als gestrichelte Linie) das Ergebnis, das man beim Einsatz von 0,1 M Phosphatpuffer ( pH 7,0 ) anstelle von 2,5-Dimethylphenol erzielt.
  • Wie erkennbar läßt sich N,N-Diethyl-p-phenylendiamin bei Verwendung von ASOD und 2,5-Dimethylphenol erfindungsgemäß bei 640 nm bestimmen.
  • Beispiel 39 Colorimetrie bei Verwendung von N,N-Diethyl-p-phenylendiamin, ASOD und N,N-Dimethylanilin: Es wurde wie in Beispiel 6 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde N,N-Dimethylanilin ( 0,5 mM ) anstelle von Phenol eingesetzt.
  • Die Absorptionskurva des gebildeten Pigments ist in Fig. 39 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Fig. 39 zeigt weiterhin (als gestrichelte Linie) das Ergebnis, das man erzielt, wenn man 0,1 M Phosphatpuffer ( pH 7,0 ) anstelle von N,N-Dimethylanilin benutzt.
  • Wie illustriert laßt sich N,N-Diethyl-p-phenylendiamin bei Verwendung von ASOD und N Dimiothylanilin erfindungsgemäß bei 730 nm bestimmen.
  • Beispiel 40 Colorimetrie bei Verwendung von N,N-Diethyl-p-phenylendiamin, ASOD und Anilin: Es wurde wie in Beispiel 6 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde Anilin ( 0,5 mM ) anstelle von Phenol eingesetzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 40 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Fig. 40 zeigt weiterhin (als gestrichelte Linie) das Ergebnis, das man bei Verwendung von 0,1 M Phosphatpuffer ( pH 7,0 ) anstelle von Anilin erzielt.
  • Wie ersichtlich läßt sich N,N-Diethyl-p-phenylendiamin bei Verwendung von ASOD und Anilin erfindungsgemäß bei 690 nm bestimmen.
  • Die Absorptionskurve, die man bei der Reaktion von ASOD und Anilin erhält, ist ebenfalls in Fig. 40 als ( gezeigt.
  • Beispiel 41 Colorimetrie bei Verwendung von N,N-Dimethyl-p-phenylendiamin, ASOD und o-Chlorphenol: Es wurde wie in Beispiel 7 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde o-Chlorphenol ( 0,1 mM ) anstelle von Phenol eingesetzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 41 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Fig. 41 zeigt weiterhin (als gestrichelte Linie) das Ergebnis, das man bei Einsatz von 0,1 M Phosphatpuffer ( pH 7,0 ) anstelle von o-Chlorphenol erzielt.
  • Wie zu sehen ist läßt sich N,N-Dimethyl-p-phenylendiamin bei Verwendung von ASOD und o-Chlorphenol erfindungsgenäß bei 680 nm bestimmen.
  • Beispiel 42 Colorimetrie bei Verwendung von N,N-Dimethyl-p-phenylendiamin ASOD und 2,6-Dibromphsnol: Es wurde wis in Beispiel 7 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde 2,6-Dibromphenol ( 0,5 mM ) anstelle von Phenol eingesetzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 42 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Fig. 42 zeigt weiternin (als gestrichelte Linie) das Ergebnis, das man bei Benutzung von 0,1 M Phopshatpuffer ( pH 7,0 ) anstelle von 2,6-Dibromphenol erzielt.
  • Wie illustriert läßt sich N,N-Dimethyl-p-phenylendiamin bei Benutzung von ASOD und 2,6-Dibromphenol erfindungsgemäß bei 695 nm bestimmen.
  • B;is;zial 43 Colorimetrie bei Verwendung von N,N-Dime thyl-p-phe nylendiamin ASOD und Anthranilsäure: Es wurde wie in Beispiel 7 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde Anthranilsïure (0,5 mM ) anstelle von Phenol eingesetzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 43 (als ausgezogene Linie) veranschauliit. In Fig. 43 ist weiterhin (als gestrichelte Linie) das Ergebnis gezeigt, das man beim Einsatz von 0,1 M Phosphatpuffer ( pH 7,0 ) anstelle von Ånthranilsaure erzielt.
  • Wie ersichtlich läßt sich N,N-Dimethyl-p-phenylendiamin bei Verwendung von ASOD und Anthranilsäure erfindungsgemaß bei 680 nm bestimmen.
  • Beis£ie1 44 Colorimatrie bei Verwendung von N,N-Dimthyl-p-phenyle ndiamin, ASOD und Anilin; Es wurde wie in Beispiel 7 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde Anilin anstelle von Phenol eingesetzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 44 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Fig. 44 zeigt weiterhin (als gestrichelte Linie) das Ergebnis, das man beim Einsatz von 0,1 M Phosphatpuffer ( pH 7,0 ) an stelle von Anilin erzielt.
  • Wie ersichtlich läßt sich N,N-Dimethyl-p-phenylendiamin bei Verwendung von ASOD und Anilin erfindungsgemäß bei 690 nm bestimmen.
  • Beispiel 45 Colorimetrie bei Verwendung von N ,N-Dimethyl-ph-phe nylendiamin, ASOD und 2-Naphthol: Es wurde wie in Beispiel 7 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde 2-Naphthol ( 0,5 Mn ) anstelle von Phenol eingesetzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 45 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Fig. 45 zeigt ausserdem (als gestrichelte Linie) das Ergebnis, das erhalten wird, wenn man mit 0,1 M Phosphatpuffer ( pH 7,0 ) anstelle von 2-NaphthQl arbeitet.
  • Wie gezeigt läßt sich N,N-Dimethyl-p-phenylendiamin bei Verwendung von ASOD und 2-Naphthol erfindungsgemïß bei 630 nm bestimmen.
  • Beispiel 46 Colorime trie bei Verwendung von N,N-Dimethyl-p-phenylendiamin, ASOD und 4-Chlor-l-naphthol: Es wurde wie in Beispiel 7 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde 4-Chlor-l-naphthol ( 0,5 mM ) anstelle von Phenol eingesetzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 46 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Fig. 46 zeigt ausserdem (als gestrichelte Linie) das Ergebnis, das man mit 0,1 M Phosphatpuffer ( pH 7,0 ) anstelle von 4-Chlor-1-naphthol erhält.
  • Wie zu sehen ist, läßt sich N,N-Dimethyl-p-phenylendiamin bei Verwendung von ASOD und 4-Chlor-l-naphthol erfindungsgemäß bei 640 nm bestimmen.
  • Beispiel 47 Colorimetne bei Verwendung von N,N-Dimethyl-p-phe N,N-Dimethyl-p-phenylendiamin, ASOD und l-Naphthol-2-sulfonat: Es wurde wie in Beispiel 7 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde Kalium-1-naphthol-2-sulfonat ( 0,5 mM ) anstelle von Phenol eingesetzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 47 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. In Fig. 47 ist weiterhin (als gestrichelte Linie) ds Ergebnis gezeigt, das man erhalt, wenn man 0,1 M Phosphatpuffer ( pH 7,0 anstelle von Kalium-1-naphthol-2-sulfonat benutzt.
  • Wie man sieht, laßt sich N,'S-Dimthyl-p-phenylendiamin bei Verwendung von ASOD und Kalium-l-naphthol-2-sulfonat erfindungsgamäß bei 650 nm bestimmen.
  • Beispiel 48 Colorimetrie bei Verwendung von N ,N-Dimethyl-p-phe nyle ndiamin, ASOD und m-Phenylendiamin: Es wurde wie in Beispiel 7 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde m-Phenylendiamin (0,5'mM ) anstelle von Phenol eingesetzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 48 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. In Fig. 48 ist weiterhin (als gestrichelte Linie) das Ergebnis gezeigt, das man mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0 ) anstelle von m-Phe nylendiamin erzielt.
  • Wie zu ersehen ist, läßt sich N,N-Dimethyl-p-phenylendiamin bei Verwendung von ASOD und m-Phanylendiamin erfindungsgemäß bei 650 nm bestimmen.
  • Bsispie 1 49 Colorimetrie bei Verwendung von N,N-Dimethyl-p-phenylendiamin, ASOD und o-Methylanilin: Es wurde wie in Beispiel 7 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde o-Methylanilin ( 0,5 mM ) anstelle von Phenol eingesetzt.
  • Die Ab-sorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 49 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. In Fig. 49 ist (als gestrichelte Linie) weiterhin das Ergebnis gezeigt, das man erhält, wenn man 0,1 M Phosphatpuffer ( pH 7,0 anst-elle von o-Methylanilin einsetzt.
  • Man sieht, daß N,N-Dimethyl-p-phenylendiamin bei Verwendung von ASOD und o-Methylanilin erfindungsgemäß bei 695 nm bestimmt werden kann.
  • Beispiel 50 Colorimetrie bei Verwendung von N,N-Dimzthyl-p-phenylendiamin, ASOD und m-Methylanilin: Es wurde wie in Beispiel 7 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde m-Methylanilin ( 0,5 mM ) anstelle von Phenol eingesetzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 50 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Fig. 50 zeigt weiterhin (als gestrichelte Linie) das Ergebnis, das man mit 0,1 M Phosphatpuffer ( pH 7,0 ) anstelle von m-hthylanilin erzielt.
  • Wie illustriert läßt sich N,N-Dimethyl-p-phenylendiamin bei Verwendung von ASOD und m-Methylanilin erfindungsgemäß bei 705 nm bestimmen.
  • Beispiel 51 Colorimetrie bei Verwendung von 2,6-Dibrom-4-aminophenol, ASOD und m-Bromanilin: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde m-Bromanilin ( 0,5 mM ) anstelle von Kalium-l-' naphthol-2-sulfonat eingesetzt.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 51 (als ausgezogene Linie) veranschaulicht. Fig. 51 zeigt weiterhin ( als gestrichelte Linia) das Ergebnis, das man mit 0,1 M Phosphatpuffer ( pH 7,0 ) anstelle von m-Bromanilin erzielt.
  • Wie illustriert llßt sich 2,6-Dibrom-4-aminophenol bei Verwendung von ASOD und m-Bromanilin erfindungsgemäß bei 635 nm bestimmen.
  • Beispiel 52 Colorimetrie bei Verwendung von 2,6-Dibrom-4-aminophenol, Tyrosinase und N,N-Ethylhydroxye X,N-Ethylhydroxyethylanilin: 2,6-Dibrom-4-aminophenolhydrochlorid wurde in einem 0,1 M Phosphatpuffer ( pH 7,0 ) gelöst, und es wurde eine 0,05 M Lösung (Lösung A) hergestellt. N ,N-Ethyl-hydroxyethylanilin wurde in einem 0,1 M Phosphatpuffer ( pH 7,0 ) gelöst, und es wurde eine 5 mM Lösung ( Lösung B) hergestellt. Zu einem Gemisch aus Lösung A (1,0 ml) und Lösung B (1,0 ml) wurde Tyrosinase-Lösung ( 50 /ul, 100 E) zugegeben, und das Gemisch wurde 10 Minuten lang bei 370C bebrütet.
  • Die Absorptionskurve des gebildeten Pigments ist in Fig. 52 dargestellt, aus der man sieht, daß die spezifische Absorption bei 705 nm liegt, und 2,6-Dibrom-4-aminophenol kann so bei 705 nm bestimmt werden.
  • Bei Verwendung von ASOD bzw. Laccase anstelle von Tyrosinase wurden Pigmente erhalten, die gleiche spezifische Absorption aufweisen.
  • Beispiel 53 Colorimetrie bei Verwendung von 2,6-Dibrom-4-aminophenol, ASOD und m-Chlorphenol: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet,jedoch wurde m-Chlorphenol ( 0,1 mM ) anstelle von Kalium-lnaphthol-2-sulfonat eingesetzt.
  • Das Absorptionsmaximum des gebildeten Pigments lag bei annähernd 650 nm. Dies bedeutet, daß 2,6-Dibrom-4-aminophenol bei Verwendung von ASOD und m-Chlorphenol bei 650 nm bestimmt werden kann.
  • Beispiel 54 Colorimetrie bei Verwendung von 2,6'-Dibrom-4-aminophenol, ASOD und o-Chloranilin: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde o-Chloranilin ( 0,5 mM ) anstelle von Kalium-lnaphthol-2-sulfonat eingesetzt.
  • Das Absorptionsmaximum des gebildeten Pigments lag bei annähernd 630 nm. Dies bedeutet, daß 2,6-Dibrom-4-aminophenol bei Verwendung von ASOD und o-Chloranilin bei 630 nm bestimmt werden kann.
  • Beispiel 55 Colorimetrie bei Verwendung von 2,6-Dibrom-4-aminophenol, ASOD und p-Chlorphenol: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde p-Chlorphenol (1 mM ) anstelle von Kalium-lnaphthol -2-sulfonat eingesetzt.
  • Das Absorptionsmaximum des gebildeten Pigments lag bei annähernd 620 nm. Folglich konnte 2,6-Dibrom-4-aminophenol bei Verwendung von ASOD und p-Chlorphenol bei 620 nm bestimmt werden.
  • Beispiel 56 Colorimetrie bei Verwendung von 2,6-Dibrom-4-aminophenol, ASOD und p-Bromphenol: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde p-Bromphenol ( 1 mM ) anstelle von Kalium-l-naphthol-2-sulfonat eingesetzt.
  • Das Absorptionsmaximum des gebildeten Pigments lag bei annähernd 600 nm. Folglich konnte 2,6-Dibrom-4-aminophenol bei Verwendung von ASOD und p-Bromphenol bei 600 nm bestimmt werden.
  • Beissie 1 57 Colorimetrie bei Verwendung von 2,6-Dibrom-4-aminophenol, ASOD und 2,4-Dichlorphenol: Es wurde wie in-Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde 2,4-Dichlorphenol ( 0,1 mM ) anstelle von Kalium-lnaphthol-2-sulfonat eingesetzt.
  • Das Absorp-tionsmaximum des gebildeten Pigments lag bei annähern 66:J nm. Folglich konnte 2,6-Dibrom-4-aminophenol bei Verwendung von ASOD und 2,4-Dichlorphenol bei 660 nm bestimmt werden.
  • Beispiel 58 Colorimetrie bei Verwendung von 2,6-Dibrom-4-aminophenol, ASOD und 2,4-Dibromphenol: Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde 2,4-Dibromphenol ( 1 mM ) anstelle von Kalium-lnaphthol -2-sulfonat eingesetzt.
  • Das Absorptionsmaximum des gebildeten Pigments lag bei annähernd 660 nm. Folglich konnte 2,6-Dibrom-4-aminophenol bei Verwendung von ASOD und 264-Dibromphenol bei 660 nm bestimmt werden.
  • Beispiel 59 Colorimetrie bei Verwendung von N,N-Diethyl-p-phenylendiamin, ASOD und ot-Naphthol: Es wurde wie in Beispiel 6 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde oC-Naphthol ( 0,5 mM ) anstelle von Phenol eingesetzt.
  • Das Absorptionsmaximum des gebildeten Pigments lag bei annahernd 620 nm. Folglich konnte N,N-Diethyl-p-phenylendiamin bei Verwendung von ASOD und d-Naphthol bei 620 nm bestimmt werden.
  • Beispiel 60 Colorimetrie bei Verwendung von N,N-Diethyl-p-phenylendiamin, ASOD und m-Chlorphenol: Es wurde wie in Beispiel 6 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde m-Chlorphenol ( 0,5 mM ) anstelle von Phenol eingesetzt Das Absorptionsmaximum des gebildeten Pigments lag bei annahe rund 695 nm. Folglich konnte N,N-D-iethyl-p-he nyle ndiamin bei Verwendung von ASOD und m-Chlorphenol bei 695 nm bestimmt werden.
  • Beispiel 61 Colorimetrie bei Verwendung von N,N-Diethyl-p-phenylendiamin, ASOD und 2,3-Dimethylphenol: Es wurde wie in Beispiel 6 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde 2,3-Dimethylphenol ( 10 mM ) anstelle von Phenol eingesetzt.
  • Das Absorptionsmaximum des gebildeten Pigments lag bei annähern 625 nm. Folglich onnte N,N-Diethyl-p-phenylendiamin b-ei Verwendung von ASOD und 2,3-Dimethylphenol bei 625 nm bestimmt werden.
  • Beispiel 62 Colorimetrie bei Verwendung von N ,N-Diethyl-p-phenylendiamin, ASOD und Anthranilsäure: Es wurde wie in Beispiel 6 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde Anthranilsäure ( 0,5 mM ) anstelle von PhenolMeingesetzt.
  • Das Absorptionsmaximum des gebildeten Pigments lag bei annahernd 680 nm. Folglich konnte N,N-Diethyl-p-phenylendiamin bei Verwendung von ASOD und Anthranilsäure bei 680 nm bestimmt werden.
  • Beispiel 63 Colorimetrie bei Verwendung von N,N-Diethyl-p-phenylendiamin, ASOD und 2,4-Dimethylphenol: Es wurde wie in Beispiel 6 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde 2,4-Dimethylphenol ( 10 mM ) anstelle von Phenol eingesetzt.
  • Das Absorptionsmaximum des gebildeten Pigments lag bei annähern 630 nm. Folglich konnte N,N-Diethyl-p-phenylendiamin bei Verwendung von ASOD und 2,4-Dimethylphenol bei 630 nm bestimmt werden.
  • Beispiel 64 Colorimetrie bei Verwendung von N , N-Dimethyl-p-phe nyle ndiamin ASOD und N,N-Dimethylanilin: Es wurde wie in Beispiel 7 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde N,£Dimethy1anilin ( 0,5 mM ) anstelle von Phenol eingesetzt.
  • Das Absorptionsmaximum des gebildeten Pigments lag bei annähern 725 nm. Folglich konnte N,N-Dimethyl-p-phenylendiamin bei Verwendung von ASOD und N,N-Dimethylanilin bei 725 nm bestimmt werden.
  • Beispiel 65 Bestimmungsmethode für CAP: S-Benzyl-L-cysteinyl-p-dimethylaminoanilid (100 mg), das durch übliche Dehydrations-Kondensation von N,N-Dimethylp-phenylendiamin . 2 HC1, N-Benzyloxycarbonyl-S-benzyl-L-cystein und Dicyclohexylcarbodiimid und nachfolgende Entfernung der Schutzgruppe erhalten worden war, wurden einem Gemisch aus Dioxan ( 3 ml ) und 0,16 n HC1 gelöst.
  • Dann wurde mit 0,1 M Triethanolamin-Citrat-Puffer (pH 7,4, 100 ml), worin 1,25% Tween 80 (Tensid) enthalten waren, vermischt, und so wurde eine synthetisches Substrat-Lösung zubereitet. Die Substratlösung ( 2 ml ), p-Xylenol ( 5mM, 0,1 ml ) und Laccase ( 2000 E/ml, 100 /Ul) wurden in einer für Colorimetrie geeigneten Zelle vermischt, und das 0 Gemisch wurde bei 37 C vorbebrütet. Schwanger-Serum, das CAP (238 mE/ml ) enthielt, wurde dazu gemischt, und die Reaktion lief an. Der Absorptionswert nach 30 Minuten, gemessen bei 600 nm, betrugt O.D.600 = 0,18. Als Ergebnis kann festgestellt werden, daß mittels dieser Methode eine CAP-B>stimmung in vorteilhafter Weise durchgeführt werden kann.
  • Beispiel 66 Bestimmungsmethode für CAP: Es wurde wie in Beispiel 65 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde 3 ,5-Dibrom-4-hydroxyanilin anstelle von ';,-Dimethylp-phenylendiamin 2 HC1 eingesetzt, und es wurde S-Benzyl-L-cysteinyl-3,5-dibrom-4-hydroxyanilid hergestellt.
  • Der Absorptionswert nach 30 Minuten, gemessen bei 585 nm, betrug O.D.585 = 0,195. Als Ergebnis kann festgestellt werden, daß mit dieser Methode CAP in vorteilhafter Weise bestimmt werden kann.
  • Beispiel 67 Es wurde wie in Beispiel 66 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde ASOD ( 1320 E/ml ) anstelle von Laccase eingesetzt.
  • Es wurde O.D.585 = 0,175 erhalten. Mittels dieser Methode läßt sich CAP in vorteilhafter Weise bestimmen.
  • Beispiel 68 Es wurde wie in Beispiel 65 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde N ,N-Diethyl-p-phe nyle ndiamin anstelle von N ,N-Dimethyl-p-pilenylendiamin 2 lIC1 eingesetzt, und es wurde S-B>nzyl-L-cysteinyl-p-diethylaminoanilid erhalten. Es wurde ferner 1-Naphthol-2-sulfonat ( 2 mM ) anstelle von p-Xylenol ( 5 mM ) eingesetzt. Der Absorptionswert, der erhalten wurde, betrug, gemessen bei 655 nm, OD 655 = 0,205. Mittels dieser Methode ließ sich CAP in vorteilhafter Weise bestimmen.
  • Beispiel 69 Bestimmung von CL-Chymotrypsin: p-Dimt thylaminoanilin 2 IIC1 und ;q-Benzyloxycarbonyl-L-tyrosin wurden mit Dicyclohexylcarbodiimid kondensiert, die Schutzgruppe wurde dann mittels Palladium-Kohle-Katalysator entfernt, und danach wurde die resultierende Verbindung mit Benzoylchlorid umgesetzt, und es wurde ein synthetisches Substrat N-Benzoyl-L-tyrosinyl-p-dirrethylaminoanilid gewonnen. Das synthetische Substrat ( 30 mg ) wurde in Aceton ( 5 ml ) gelöst, und so wurde eine Original-Substrat-Lösung zubereitet. Zu der Original-Substrat-Lösung wurde 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,8, 100 ml) (worin 5 mM Calciumchlorid und 1% Tween 80 enthalten waren) zugegeben, und so wurde ine Substrat-Lösung zubereitet.
  • Die Substrat-Lösung ( 2 ml ), p-Xylenol ( 15 mM, 0,1 ml) und Laccase (2000 E/ml, 100 /ul) wurden in einer colorimetrischen Zelle gut miteinander vermischt, und das Gemisch wurde bei einer konstanten Temperatur von 370C vorbebrutet. Dazu wurde d-Chymotrypsin ( 3 mg/ml, 50 ul) hinzugegeben, und die Reaktion setzte ein. Der Absorptionswert nach 30 Minuten, gemessen bei 600 nm, betrug O.D.600 = 0,48. Als Ergebnis ist festzustellen, daß mittels dieser Methode ot-Chymotrypsin vorteilhaft bestimmt werden kann.
  • Beispiel 70 Bestimmungsmethode für Trypsin: N-Be nzyloxycarbonyl-L-tryptophan und N ,N-Die thyl-p-phe nyle ndiamin wurden unter Eiskühlung mit Dicyclohexylcarbodiimid kondensiert, dann wurde die Schutzgruppe durch Palladium-Kohlenstoff-Katalysator entfernt, und danach wurde das Produkt mit Essigsäureanhydrid acetyliert, wobei N-Acetyl-L-tryptophan-p-diethylaminoanilid gewonnen wurde. Diese Ve rbindung ( 30 mg ) wurde in Aceton ( 5 ml ) gelöst, und so wurde eine Original-Substrat-Lösung zubereitet.
  • Dazu wurde 0,1 M Tris-HCl-Puffer ( pH 7,8, 100 ml, worin 5 mM Calciumchlorid und 1% Tween 80 enthalten waren) zugegeb-en, und so wurde die synthetisches Substrat-Lösung zubereitet.
  • Die synthetisches Substrat-Lösung ( 2 ml ), l-Naphthol-2-sulfonat ( 2 mM, 0,1 ml ) und Laccas (2000 E/ml, 100 ,ul) wurden in einer colorimetrischen Zelle gut miteinander vermischt, und dann wurde das Gemisch bei einer konstanten Temperatur von 370C vorbebrütet. Dazu wurde Trypsin ( 50 /kl) gegeben, und die Reaktion setzte ein. Der Ab-sorptionswert nach 30 Minuten betrug, gemessen bei 655 nm, O.D.655= 0,38.
  • Als Ergebnis kann festgestellt werden, daß Trypsin mittels dieser Methode vorteilhaft bestimmt werden kann.
  • Beispiel 71 Bestimmungsmethode für α-Chymotrypsin: Es wurde wie in Beispiel 69 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde p-Diethylaminoanilin anstelle von p-Dimathylaminoanilin 2 HC1 eingesetzt. So wurde N-Denzyl-L-tyrosinylp-diethylaminoanilid erhalten. Diese Verbindung (30 mg) wurde in Aceton (5 ml) gelöst, und es wurde so eine Original-Sub-strat-Lösung zubereitet. Die Substrat-Lösung wurde in der gleichen Weise, wie in Beispiel 69 beschrieben, zubereitet.
  • Danach wurde weiter wie in Beispiel 69 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde l-Naphthyl-2-sulfonat (2 mM) anstelle von p-Xylenol eingesetzt, und der Absorptionswert wurde bei 655 nm gemessen. Er betrug O.D.655= 0,52. Als Ergebnis kann festgestellt werden, daß mittels dieser Methode oCa-Chymotrypsin in vorteilhafter Weise bestimmt werden kann.
  • Beispiel 72 Bestimmungsnethode für oC-Chymotrypsin: 3 ,5-Dibrom-4-hydroxyanilin und N-Benzyloxycarbonyl-L-tyrosin wurden mittels üblicher Dehydrations-Kondensation mit Dicyclohexylcarbodiimid kondensiert, die Schutzgruppe wurde mittels Palladium-Kohlenstoff-Katalysator entfernt, und dann wurde das Produkt mit srnzoylchlorid umgesetzt, und es wurde ein synthetisches Substrat erhalten, bei dem es sich um N-Benzoyl-L-tyrosin-3,5-dibrom-4-hydroxyanilid handelte. Das synthetische Substrat (30 mg) wurde in Aceton (5 ml) gelöst, und so wurde die Original-Substrat-Lösung zub-eritet. Dazu wurde 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,8, 100 ml, worin 5 mM Calciumchlorid und 1% Tween 80 enthalten waren) zugegeben, und so wurde die Substrat-Lösung zubereitet.
  • Die Substrat-Lösung (2 ml), p-Xylenol (5 mM, 0,1 ml) und Laccase (2000 E/ml, 100 ul) wurden in einer colorimetrischen Zelle gut miteinander vermischt, und das Gemisch wurde bei einer konstanten Temperatur von 370C vorbebrütet.
  • Es wurde çC-Chymotrypsin (3 mg/ml, 50 /ul) hinzugegeben, und die Reaktion lief an. Nach 39 Minuten wurde der Absorptions-wert bei 585 nm (O.D.585 = 0,465) gemessen. Als Ergebnis ist festzustellen, daß mittels dieser Methode d -Chymotrypsin in vorteilhafter Weise meßtechnisch ermittelt werden kann.
  • Beispiel 73 Bestimmungsmethode für ct-Chymotrypsin: Es wurde wie in Beispiel 72 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde ASOD (1320 E/ml, 100 ,ul) anstelle von Laccase eingesetzt, und es wurde ein Absorptionswert O.D.585 = 0,452 erhalten. Als Ergebnis ist festzustellen, daß mittels dieser Methode i-Chymotrypsin in vorteilhafter Weise meßtechnisch ermittelt werden kann.
  • Beispiel 74 Bestimmung von d-Glucosidase unter Verwendung von Phenyl- d-D-glucosid und ASOD: In einer colorimetrischen Zelle wurden Phenyl--D-glucosid (Nakarai Chem. Co.) (0,24 mM), gelöst in einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0, 2 ml), 2,6-Dibrom-4-aminophenol ( 1 mM, 1 ml) und ASOD, erhalten aus Sechium edule (1320 E/ml, 100 /ul) gemischt und bei konstanter Temperatur von 300C vorbebrütet.
  • Dazu wurde ol*-Glucosidase (Toyobo Co., 3000 E/ml, 10 /ul) hinzugefügt, und die Reaktion setzte ein. In Zeitabstinden von je 2 Minuten wurde die Änderung der Absorptions-W2llenlange aufgezeichent. Die Ergebnisse sind in Fig. 57 veranschaulicht. Als Ergebnis ist festzustellen, daß die ol--Glucosidase-Aktivität bei 610 nm bestimmt werden kann, durch Reaktion mit freigesetztem Phenol aus Substrat-Phenyl-&-D-glusidase, ASOD und einer Kupplungskomponenten.
  • Beispiel 75 Bestimmungsmethode für Amylase: Eine Hydroxylgruppe in Maltopentaose wurde in üblicher Weise unter Verwendung von Natriumacetat und Essigsiureanhydrid acetylie rt. Das so erhaltene Maltope ntaoase -ß-hept ade caacetat wurde mit Phenol und wasserfreiem Zinkchlorid vermischt und so eine Kupplungsreaktion bewirkt. Das erhaltene d- und ß-Phenylhexadecaacetylmaltopentaosid wurde in einer Natriummethoxid-Lösung in Methanol deacetyliert.
  • Das so erhaltene Phenylhexadecamaltopentaosid wurde in einem 0,05 M Glycerophosphat-Puffer (pH 7,0), der 2% &-Cyclodextrin enthielt, gelöst, und so wurde eine 0,4% Sub-strat-Lösung hergestellt. Eine Enzymlösung ( 50 die oL-Glucosidase (500 E/ml) und ß-Glucosidase (100 E/ml) enthielt, 2,6-Dibrom-4-aminophenol (5 mM, 50 /ul) und Laccase (2000 E/ml, 100 /ul) wurden in einer colorimetrischen Zelle gut miteinander vermischt, und das Gemisch wurde bei 370C vorbebrütet. Es wurde oC-Amylse (Boehringer GmbH, 5000 I.E./Lit., 500 ul) hinzugefügt, und dann setzte die Reaktion ein. Nach 20 Minuten betrug die Absorption O.D.610 = 0,412. Als Ergebnis kann festgestellt werden, daß sich d-Amylase-Aktivitat mittels dieser Methode in gewünschter Weise bestimmen läßt.
  • Beispiel 76 Be stimmungsmethode für Amylse unter Verwendung von o-Chlorphenylmaltopentaosid, 2 ,6-Dibrom-4-aminophenol und Laccase: Ein ck,ß-Gemisch von o-Chlorphenylmaltopentaosid wurde in einem 0,05 M Glycerophosphat-Puffer (pH 7,0), der 2% α-Cyclodextrin enthielt, gelöst, und so wurde eine 0,4%ige Substrat-Lösung hergestellt. Die Substrat-Lösung (2 ml), eine Enzymlösung (50 µl), die d-Glucosidase (500 E/ml) und ß-Glucosidase (100 E/ml) enthielt, 2,6-Dibrom-4-aminophenol (5 mM, 50 /ul) und Laccase (2000 E/ml, 100 ul) wurden in einer colorimetrischen Zelle gut miteinander vermischt und bei 37°C vorbebrütet. od-Amylase (Boehringer, 5000 I.E./Lit., 500 iul) wurde hinzugegeben, und dann lief die Reaktion an. Nach 20 Minuten wurde der Absorptionswert bei 650 nm gemessen, und es wurde O.D. = 0,38 erhalten.
  • Als Ergebnis kann festgestellt werden, daß ot-Amylase-Aktivität mittels dieser Methode in gewünschter Weise bestimmt werden kann.
  • Beispiel 77 Bestimmungsmethode für Amylase: Eine Hydroxylgruppe in Maltopentaose wurde mittels üblicher Methoden unter Verwendung von Natriumacetat und Essigsaureanhydrid acetyliert. Das so erhaltene Maltopentaose-ß-heptadecaacetat, 2,6-Dibromphenol und wasserfreies Zinkchlorid wurden wie üblich für eine Kupplungsreaktion verwendet, und es wurde d- und ß-2,6-Dibromphe ß-2,6-Dibromphenylhexadecaacetylmaltopentaosid gewonnen. Dieses Produkt wurde mittels Natriummethoxid in Methanol deacetyliert, und es wurde 2,6-Dibromphenylhexadecamaltopentaosid erhalten, das in einem 0,05 M Glycerophosphat-Puffer (pH 7,0), der 2% d-Cyclodextrin enthielt, gelöst, und so wurde eine 0,4%ige Substrat-Lösung zubereitet.
  • Die Substrat-Lösung (2 ml), eine cL-Glucosidase (500 E/ml) und ß-Glucosidase (100 E/ml) enthaltende Enzymlösung (50 2,6-Dibrom-4-aminophenol (5 mM, 50 µl) und Laccase (2000 U/ml, 100 ul) wurden in einer colorimetrischen Zelle sehr gut miteinander vermischt und bei einer konstanten Temperatur von 370C vorbebrütet. Dazu wurde d Amylase (Boehringer, 5000 I.E./Lit., 50 /ul) gegeben, und dann lief die Reaktion an.
  • Der Absorptionswert betrug nach 20 Minuten O.D.670= 0,387.
  • Als Ergebnis kann festgestellt werden, daß mittels dieser Methode Amylase in vorteilhafter Weise meßtechnisch bestimmt werden kann.
  • Beispiel 78 Bestimmungsinethode für Amylase: Es wurde wie in Beispiel 77 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde ASOD (1310 E/ml) anstelle von Laccase eingesetzt, und es wurde ein Absorptionswert von O.D.670= 0,378 erhalten. Als Ergebnis kann festgestellt werden, daß mittels dieser Methode OL-Amylase-Aktivität in vorteilhafter Weise bestimmt werden kann.
  • Beispiel 79 Bestimmungsmethode für A1P unter Verwendung von Phenylphosphat und ASOD: In einer colorimetrischen Zelle wurden Phenylphosphat 2Na (5 mM, 2 ml), gelöst in einem 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), 2,6-Dibrom-4-aminophenol (1 mM, 1 ml) und ASOD (1320 E/ml, 100 ,um), erhalten aus Sechium edule , gut miteinander vermischt, und es wurde bei 300C vorbebrütet. Dazu wurde A1P (Boehringer, 400 E/0,17 ml, 10 /ul) gegeben, und die Reaktion setzte ein. In Zeitabstanden von jeweils 5 Minuten wurde die Veränderung des Absorptionswertes untersucht.
  • Die Ergebnisse sind in Fig. 58 veranschaulicht. AlP-Aktivitat kann durch Reaktion des aus Phenylphosphat freigesetzten Phenols, ASOD und einer Kupplungskomponenten bestimmt werden.
  • Beispiel 80 Bestimmungsmethode für A1P: 2,6-Dibromphenylphosphat, das durch Veresterung eines Phosphats erhalten worden war, und 2,6-Dibromphenol wurden in einem 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) gelöst, und so wurde eine Substrat-Lösung (5 mbl) zubereitet. Diese Substrat-Lösung (2 ml) , 2,6-Dibrom-4-aminophenol (1 mM, 1 ml) und Laccase (2000 E/ml, 100 ul) wurden in einer colorimetrischen Zelle gut miteinander vermischt, und es wurde bei 370C vorbebrütet. Dazu wurde A1P (Boehringer, 400 E/0,17 ml, 10 ,ul) gegeben, und die Reaktion setzte ein. Der Absorptionswert nach 30 Minuten betrug O.D.670 = o,253. Mittels dieser Methode kann A1P in vorteilhafter Weise bestimmt werden.
  • Beispiel 81 Bestimmungsmethode für Esterase unter Verwendung von Phenylacetat und ASOD: Phenylacetat (Tokyo Kasei K.K., 5 mM, 1 ml), gelöst in einem 0,1 M Phosphat-Puffer (pH 7,0), 2,6-Dibrom-4-aminophenol (0,5 mM, 1 ml) und ASOD, erhalten aus Sechium edule ( 60 E/ml, 20 /ul) wurden in einer colorimetrischen Zelle gut miteinander vermischt, und es wurde bei 300C vorbebrütet. Dazu wurde Lipase (Toyo Jozo Co., 2545 E/ml, 100 /ul) gegeben, und die Reaktion lief an. In Zeitabständen von 2 Minuten wurde die Änderung der Absorption gemessen (Fig. 59). Als Ergebnis kann festgestellt werden, daß Lipase (Esterase) vorteilhaft bestimmt werden kann durch Reaktion des aus dem Sub-strat Phenylacetat freigesetzten Phenols, ASOD und einer Kupp lungskomponenten.
  • Beispiel 82 Bestimmungs-methode für bakterielles Endotoxin: Boc-Arg(N02)-OII und N,N-Diethylamino-p-phenylendiamin wurden mittels eines wasserlöslichen Carbodiimids kondensiert, und die Schutzgruppe wurde entfernt, und so wurde H-Arg(N02)-diethylaminoanilid hergestellt. Boc-Leu-Gly-Ester wurde mittels eines Alkalis entzstert, und es wurde Boc-Lau-Gly-OH erhalten. Diese beiden Produkte wurden mittels eines wasserlöslichen Carbodiimids in Butanol kondensiert, und es wurde Boc-Leu-Gly-Arg (NO2) -diethylaminoanilid erhalten. Durch katalytische Reduktion mittels Palladium wurde von dieser Verbindung die Gruppe -N°2 abgetrennt, und es wurde Boc-Leu-Gly-Arg-diethylaminoanilid erhalten. Das Produkt wurde in einem 0,2 M Tris-BC1-Puffer (plI 7,3), der 0,005 M CaC12 enthielt, gelöst, und so wurde eine Substrat-Lösung (2,5 mM) zubereitet.
  • Die Sub-strat-Lösung (2 ml), l-Naphthol-2-sulfonat ( 2 mM, 1 ml) und Laccase ( 2000 E/ml, 100 ,ul) wurden in einer colorimetrischen Zelle gut miteinander vermischt, und es wurde bei 370C vorbebrütet. Dazu wurde ein Endotoxin-Aktivations-Enzym (50 /ul) gegeben, so daß die Reaktion anlief.
  • Der Absorptionswert wurde bei 655 nm gemessen (O.D.655=0,268) Als Ergebnis kann festgestellt werden, daß sich mittels dieser Methode bakterielles Endotoxin bestimmen läßt.
  • (Zubereitung des Endotoxin-Aktivations-Enzym): Aus Tachypleus tridentatus (etwa 2 kg an Gewicht) wurden Blut-Lymphocyten (etwa 100 ml) gesammelt, wobei sorgfältig Kontamination vermieden wurde (Japanische Patentveröffentlichung No. 51-40131). Amoebocyteg, die durch Zentrifugieren abgetrennt worden waren, wurden mit 3% wässr. NaC1 gewaschen und so wurden Amoebocyte-Pellets erhalten. Dazu wurde in einem von Verhältnis von 1/10 V/V zu den Original-Blut-Lymphucytes eine Pufferlösung (Tris-I1C1 0,05 M; CaCl2 0,001 M; NaCl 0,15 M; pH 7,2) gegeben, und das Gemisch wurde in einem sterilisierten Homogenisator sehr gut verwahrt und der Gefriertrocknung und Zentrifugierung mit 50 000 UpM 15 Minuten lang unterworfen. Die überstehende Flüssigkeit, die als Amoebocyt-Lysat Tachypleus (ALT) bezeichnet wurde, wurde gewonnen. Dieses ALT wurde durch Sephadex G-50 (Pharmacia Fine Chem. Co.) gel-filtriert gemaß der Methode von Young und Mitarb (N.S. Young et al., J.Clin.Invest., 51, 1790 (1972)), und es wurde eine Fraktion gewonnen, die einen Precursor der Amidase enthielt. Dieser wurde mit aus Salmonella minesota R595 (M. Niwa et al., Jap. J. Med. Sci.
  • Biol., 26, 20 (1973)) gewonnenem Endotoxin behandelt, und so wurde ein Endotoxin-Aktivations-Enzym erhalten.
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Claims (19)

  1. Pate ntansp rü che 1. Methode zur Bestimmung einer Verbindung der Formel worin R1 für eine Hydroxyl- oder Aminogruppe oder, sofern wenigstens einer der Reste R2, R3, R4, R5 und R6 eine Hydroxyl- oder Aminogruppe ist, für Wasserstoff steht, und R2, R3, R4, R5 und R6 Wasserstoff, Halogen,eine niedrige Alkyl-Gruppe, eine niedrige Alkoxy-Gruppe, eine Amino-Gruppe, eine substituierte Amino-Gruppe, einen Hydroxy-, Carboxyl-oder Sulfo-Rest bedeuten, oder R5 und R6 gemeinsam einen Ring bilden, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Reaktionssystem ansetzt, das diese Verbindung und eine Kupplungskomponente und ein Sauerstoff verbrauchendes Enzym, das die Fähigkeit hat, in Anwesenheit dieser Verbindung und dieser Kupplungskomponenten ein Pigment zu bilden, enthält, und daß man eine erkennbare änderung in diesem Reaktionssystem zur Bestimmung dieser Verbindung meßtechnisch erfaßt und auswertet.
  2. 2. Methode nach Anspruch 1 zur Bestimmung einer Verbindung der in Anspruch 1 angegebenen Formel, in der R1 eine Aminogruppe, oder, sofern wenigstens einer der Reste R2, R3, R4, R5 und R6 eine Aminogruppe bedeutet, Wasserstoff ist, und in der R2, R3, R4, R5 und R6 die zuvor angegebene Bedeutung haben, dadurch gekennzeichnet, daß als Kupplungskomponente eine Verbindung eingesetzt wird mit der Formel worin R7 eine Hydroxylgruppe, eine Aminogruppe oder eine substituierte Aminogruppe bedeutet und R8, Rg, R10, R11 und R12 für Wasserstoff, Halogen, eine niedrige Alkylgrupps, eine niedrige Alkoxygruppe, eine Aminogruppe, eine substituierte Aminogruppe, eine Hydroxylgruppe, eine Carboxylgruppe oder eine Sulfogruppe stehen oder R11 und R12 gemeinsam einen Ring bilden.
  3. 3. Methode nach Anspruch 1 für eine Verbindung der darin angegebenen Formel, in der R1 eine Hydroxylgruppe oder, sofern wenigstens einer der Reste R2, R3, R4, R5 und R6 für eine IIydroxylgruppe stehen, Wasserstoff bedeutet, und R2,-R3, R4, R5 und R6 die zuvor angegebene Bedeutung haben, dadurch gekennzeichnet, daß als Kupplungskomponente eine Verbindung verwendet wird mit der Formel worin R13 für einen Aminorest oder einen substituierten Aminorest steht und R14, R15, R16 R17 und R18 Wasserstoff, Halogen, eine niedrige Alkylgruppe, einen niedrige Alkoxygruppe, eine Aminogruppe, eine substituierte Aminogruppe, eine lIydroxylgruppe, eine Carboxylgruppe oder eine Sulfogruppe bedeuten oder R17 und R18 gemeinsam einen Ring bilden.
  4. 4. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Oxidase eine Oxidase für eine einen Hydroxyl-oder Amino-Substituenten aufweisenden aromatischen Ring besitzende Verbindung verwendet wird.
  5. 5. Methode nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Oxidase Ascorbat-Oxidase, Laccase oder Tyrosinase verwendet wird.
  6. 6. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als erkennbare Änderung die Menge an verbrauchtem Sauerstoff oder an gebildetem Pigment ausgewertet wird.
  7. 7. Methode nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Auswertung durch elektrochemische Messung vorgenommen wird.
  8. 8. Methode nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die elektrochemische Messung an einer Sauerstoff-Elektrode vorgenommen wird.
  9. 9. Methode nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge an gebildetem Pigment gemessen wird durch colorimetrische Bestimmung einer spezifischen Adsorptions-Wellenlänge des Pigments.
  10. 10. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung der in Anspruch l angegebenen Formel für das Reaktionssystem aus einem synthetischen Substrat durch die Einwirkung von Hydrolase freisetzt.
  11. 11. Methode nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hydrolase eine Peptidase oder Protease verwendet und die Verbindung freisetzt aus einem synthetischen Substrat der Formel worin eine der Gruppen R'l oder R'2 den Rest R19C0.-NH-und die andere ein Wasserstoffatom bedeuten, wobei R19CO- ein Aminosäurerest oder ein Peptidrest ist, und worin R3, R4, R5 und R6 die zuvor angegebene Bedeutung haben.
  12. 12. Methode nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hydrolase eine Glycosidase verwendet und die Verbindung freisetzt aus einem synthetischen Substrat der Formel worin einer der Reste R"1 und R"2 ein (s) -O-Rcst und der andere Wasserstoff ist, wobei S für eine Monosaccharid-Einheit steht und n eine ganze Zahl größer als 1 ist, und worin R3, R4, R5 und R6 die zuvor angegebene Bedeutung haben.
  13. 13. Methode nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hydrolase eine Phosphatase verwendet und die Verbindung freisetzt aus einem synthetischen Substrat der Formel worin einer der Reste R111 und R"' 2 einen Rest und der andere Wasserstoff bedeuten, wobei R20 -0- eine HO-Gruppe oder ein sub-stituierter oder unsubstituierter Glycerin-Rest ist, und worin R3, R4, R5 und R6 die zuvor angegebene Bedeutung haben.
  14. 14. Methode nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hydrolase eine Esterase oder Lipase verwendet und die Verbindung freisetzt aus einem synthetischen Substrat der Form 1 worin eine der Gruppen R""1 und R""2 eine R21-CO-O-Gruppe und die andere ein Wasserstoffatom ist, wobei der Rest R21-CO- ein Fettsaurerest ist, und worin R3, R4, R5 und R6 die zuvor angegebene Bedeutung haben.
  15. 15. Methode nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man diese Bestimmungsmethode für die Bestimmung von Hydrolase verwendet.
  16. i6. Methode nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hydrolase-Bestimmung einer Bestimmung von Peptidase oder Protease vornimmt.
  17. 17. Methode nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hydrolase-Bestimmung eine Bestimmung von Glycosidase vornimmt.
  18. 18. Methode nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hydrolase-Bestimmung eine Bestimmung von Phosphatase vornimmt.
  19. 19. Methode nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hydrolase-Bestimmung eine Bestimmung von Esterase oder Lipase vornimmt.
DE19833342109 1983-11-18 1983-11-18 Enzymatische pruefmethode Withdrawn DE3342109A1 (de)

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