DE2551966C3

DE2551966C3 - Verfahren zum Reinigen von Urokinase

Info

Publication number: DE2551966C3
Application number: DE2551966A
Authority: DE
Inventors: Peter George Waukegan Sesin; Gene Alan Zion Stried
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1974-11-20
Filing date: 1975-11-19
Publication date: 1978-06-01
Also published as: CA1041449A; NL7511803A; DK140555B; ZA756197B; FR2291983B1; AR208000A1; DK140555C; SE431226B; DE2551966B2; JPS5167787A; DE2551966A1; CH608021A5; FR2291983A1; NL162657B; GB1493018A; SE7513027L; US3957582A; AU8545075A; DK521375A; BE835330A

Description

Urokinase ist ein komplexes Protein, das in Spurenmengen im Urin des Menschen zu finden isi. Sie stellt ein wirksames, Blutgerinnsel auflösendes Mittel dar und fördert bei Injektion in Mengen, welche die natürlich im Urin vorkommenden weit überschreiten, die Auflösung von Blutgerinnseln. Auf Grund ihrer guten Wirkungserwartung für die Behandlung von Thrombusemboliestörungen ist versucht worden, sie zu isolieren und auf ein Wirkungsvermögen zu reinigen, das für die Auflösung von Blutgerinnseln des menschlichen Blutes von Wert ist, und einen Reinheitsgrad zu erzielen, der dem direkten Ginsatz zur Blutgerinnselauflösung beim Menschen entspricht.

Es sind verschiedene Methoden zur Isolierung und partiellen Reinigung von Urokinase bekannt, z. B. die Methode nach US-PS 29 83 647 und 32 56 158, bei denen von Urin herrührende Urokinase Verwendung findet. Moderne Techniken arbeiten mit Gewebekulturen als Urokinasequelle. In diesem Falle hat sich bedauerlicherweise aber keine der bisher bekannten Reinigungsmethoden oder irgendeine Kombination derselben als genügend erwiesen, um eine Urokinase zu erhalten, die direkt als injektionsfähige Lösung verwendet werden kann.

Eine der bisher bekannten Methoden besteht im Hindurchleiten einer klaren, wäßrigen Urokinaselösung durch eine bestimmte lonenaustauschsäule, wodurch zahlreiche Verunreinigungen entfernt werden und eine rinhflra Vi on7ontroliAn γριπργ I I rr\\/ inocA im FIi ι u t

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erhalten wird. Eine andere, in der obengenannten US-PS 32 56 158 beschriebene Methode besteht in der Behandlung einer Urokinaselösung mit einem partiell vernetzten Dextrangel. Keine dieser Methoden ergibt eine Urokinaselösung, die direkt für medizinische Zwecke verwendet werden kann. Eine Kombination dieser Methoden ist ebenfalls ungenügend, wenn die Urokinase aus menschlichem Gewebe vermehrt wird.

Aus der DT-OS 22 46 969 ist ein Verfahren zur

ίο Reinigung von Urokinase bekannt, wobei man eine Urokinaselösung mit einer Leitfähigkeit von 15 bis 25 Millisiemens und einem pH-Wert von 6 bis 9 mit einem Diäthylaminoäthylcelluloseharz mehrfach in Berührung bringt. Dieses Verfahren ist zu umständlich und ergibt keine befriedigenden Resultate

Die vorliegende Erfindung zielt besonders auf die Erzeugung einer Urokinaselösung höchster Reinheit bei Anwendung in Verbindung mit älteren, bekannten Methoden zur Urokinasereinigung ab. Die Erfindung ist speziell auf eine Einzelstufe gerichtet, die bei Ausführung in einer Arbeitsfolge mit bisher bekannten Urokinasereinigungsstufen eine Urokinaselösung von noch nie in solch leichter Weise erreichter Reinheit ergibt.

Gemäß der Erfindung wird Urokinase gereinigt, indem man eine klare Lösung derselben in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von 6 bis 9 und einer lonenstärke von 2,0 bis 5,0 Millisiemens (mmho.) bildet, die Lösung in Kontakt mit gequollenen Körnern basischen Anionenaustauschharzes bringt, an das tertiäres oder quaternäres Amin in einer Menge von mindestens 3,0 Milliäquiv./g chemisch gebunden ist und das eine durchschnittliche Korngröße im Bereich von 40 bis 120 Mikron hat, genügend Zeit gibt, damit das Ionenaustauschharz bei einer Temperatur im Bereich zwischen 0° und dem Siedepunkt der wäßrigen Lösung wirkt, und von dem Harz, an das eine wesentliche Menge der anfänglich anwesenden Verunreinigungen adsorbiert ist, die Flüssigphase trennt.

Urokinase ist auch bei höheren Temperaturen verhältnismäßig stabil, so daß das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren bei Temperaturen bis zu etwa 100⁰C durchgeführt werden kann. Bei einer Temperatur von 100⁰C sind zwar Verluste an Urokinase zu erwarten, denn alle Proteine werden bei diesen Temperaturen geschädigt. Aber diese Verluste sind minimal, denn das erfindungsgemäße Verfahren dauert nur ein paar Minuten.

Bei dem Verfahren gemäß der Erfindung kann eine Urokinaselösung eingesetzt werden, die durch Hindurchleiten durch eine zweckentsprechende Kationenaustauschsäule vorgereinigt worden ist. Wenn die anfallende Urokinaselösung dann nach der Methode von US-PS 32 56 158 unter Verwendung eines nichtmo-

SS difizierten Dextrangels behandelt wird, das mit etwa 6% Epichlorhydrin vernetzt ist, hat die anfallende Urokinase einen höheren Reinheitsgrad als er jemals zuvor erzielt worden ist (von Methoden, die viel schwieriger reproduzierbar, durchführbar oder in einem Maßstab, der über einen kleinen Laboratoriumansatz hinausgeht, handhabbar sind, abgesehen). Eine solche dreistufige.. die neue Stufe gemäß der Erfindung umfassende Arbeitsweise ergibt Urokinase in einer Reinheit, mit der die Urokinase unmittelbar für medizinische Zwecke

6s verwendbar ist.

Nach einer spezielleren Ausführungsform wird die Einstufenbehandlung gemäß der Erfindung durchgeführt, !pciem γπηπ die !onenstärke der LJrckinäselcsuris

auf 2,5 bis 3,5 Millisiemens einstellt, wenngleich auch der allgemeine Bereich von 2 bis 5 Millisiemens akzeptabel ist. Bei einer Ionenstärke von unter 2 Millisiemens ist die Urokinase nicht leicht löslich, und bei über 5 Millisiemens gehen die in der Lösung enthaltenden Verunreinigungen eine zu schwache Bindung an das anionische Austauschharz ein, was zu einer unvollständigen Entfernung derselben führt. In ähnlicher Weise ergibt die Urokinase bei einem pH-Wert von unter 6 keine richtige Bindung an das Harz, während sie bei einem pH-Wert von über 9 einer gewissen, unerwünschten Modifizierung unterliegen kann, da Enzyme allgemein bei stark alkalischen Bedingungen unbeständig sind.

Bezüglich des an das anionische Austauschharz gebundenen tertiären oder quaternären Amins ist die genannte Minimalmenge von 3,0 Milliäquivalenten notwendig, um eine genügende Bindungskapazität für die gewöhnlich mit Urokinase assoziierten Verunreinigungen sicherzustellen. In der Praxis wird die Menge des an das Austauschharz gebundenen Amins 4,0 MiIIiäquivalente nicht überschreiten; höhere Werte sind akzeptabel, aber nicht leicht erreichbar. Gewöhnlich reicht etwa I g (Trockengewicht) des genannten Anionenaustauschharzes aus, um 2 bis 4 Millionen Einheiten Urokinase zu reinigen, die man gewöhnlich in einem Volumen von etwa 7,5 I Wasser vorlegen würde, das entsprechend gepuffert ist und die obengenannte lonenstärke aufweist. Vorzugsweise jedoch arbeitet man mit dem etwa Doppelten der Harzmenge, um eine vollständige Entfernung von Verunreinigungen sicherzustellen. Wenn das Harz eine Menge an tertiärem oder quaternärem Amin von über 4,0 Milliäquivalenten enthält, genügen kleinere Harzmengen für die gleiche Menge an Urokinase. In allen Fällen gewinnt man mit dem einstufigen Prozeß gemäß der Erfindung ef'a ^9ς bis 95% der ursprünglich in der Lösunp vorliegenden Urokinase.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung, ohne daß diese auf sie beschränkt ist. Alle für die verschiedenen Stufen bei dieser Arbeitsweise genannten Reinheitsgrade sind in CTA-Einheiten (International Standard) bei Absorption bei 280 Millimikron angegeben, ausgedrückt als Trockengewicht in Form von Einheiten/mg an Protein, das leicht aus dem UV-Spektrum errechenbar ist.

Beispiel 1

a) Urokinase, aus Gewebekulturmedium isoliert und ungefähr 200 CTA-Einheiten/mg an Urokinase enthallend, wurde durch Absorption auf kationischem Austauschharz isoliert, das in 0,05molarem Natriumphosphatpuffer bei pH 6,25 ins Gleichgewicht gebracht worden war. Die Urokinase wurde mit 0,5molarem, zweibasischem Natriumphosphat von pH 9,0 von dem Harz eluiert. Der Reinheitsgrad der auf diese Weise erhaltenen Urokinase war auf etwa 3500 CTA-Einheiten/mg erhöht.

b) Diese Urokinase wurde dann gegen O.lnolaren Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-acetat-Puffer von pH 6,0 dialysiert und mit einer Suspension im Handel erhältlichen schwach basischen Dextrangels vermischt, das mit 5 bis 15 Gew.% Vinylbenzol vernetzt war und chemisch an sich gebunden 3,0 bis 4,0 Milliäquivalante/g an Diäthylaminoäthan aufwies und eine durchschnittliche Korngröße zwischen 40 und 120 Mikron hatte. Nach langsamem Bewegen dieser Mischung von etwa 15 Minuten Dauer wurde filtriert. In dem anfallenden Filtrat la*» Urokinase in einer Reinheit von 22 000 CTA-Einheiten/mg gelöst vor.

c) Diese Urokinaselösung wurde dann über eine Säule mit modifiziertem Dextran-Gel, entsprechend der Methode von US-PS 32 56 158. das in 2%igem Natriumchlorid in Gleichgewicht gebracht war (mit 0,22%igem Dinatriumversenate auf pH 6,5 gepuffert). Die eluierte Urokinase hatte nun einen Reinheitsgrad von 64 000 CTA-Einheiten/mg.

Bei Weglassung der Stufe b) bei der obigen Arbeitsweise hat die anfallende Urokinase eine Reiheit von nur 18 000 CTA-Einheiten/mg. Diese Reinheit ist für den medizinischen Einsatz ungenügend, da sie der Mindestspezifikation des »Committee on Thrombolytic Agents« (CTA) von 35 000 CTA-Einheiten/mg nicht genügt.

Beispiel 2

Während in dem vorstehenden Beispiel ein schwach basischer Anionenaustauscher verwendet wurde, arbeitet das vorliegende Beispiel mit einem stark basischen Anionenautauscher. Das hier verwendete Material weist funktionell DiäthyI-(2-hydroxypropyl)-aminoäthylchlorid-Gi-uppen auf.

Die Austauscherkörner wurden 24 Stunden in destilliertem Wasser quellen gelassen und dann in 0,05molarem Natriumphosphat/0,05molarem Natriumchlorid bei pH 6,0 ins Gleichgewicht gebracht und in eine Glassaule von 0,8 cm Durchmesser und 110 cm Höhe gepackt. Durch diese Säule wurde eine Lösung von Urokinase mit einer Reinheit von 3000 CTA-Einheiten/mg geleitet; das anfallende Eluat zeigte als Gehalt an Urokinase eine Reinheit von 21 000 Einheiten/mg.

Bei einer Säulen-Endpassage entsprechend Stufe c) von Beispiel 1 cinöhte sich die Urokinasepotenz auf über 60 000 Einheiten/mg.

Beispiel 3

Bei einer Wiederholung von Stufe b) von Beispiel 1 unter Verwendung jedoch eines 0,1 molaren Tris-(hydroxymethyl)-aminoäthanphosphat-Puffers bei pH 0,8 und Arbeiten von 3 bis 5°C erhöhte sich die Einheit der Urokinaselösung von 1900 auf 50 000 Einheiten/mg.

Bei einer Wiederholung dieses Beispiels mit einer 1100 Einheiten/mg enthallenden Urokinaselösung ergab sich eine Erhöhung der Reinheit auf 37 000 Einheiten/mg.

In ähnlicher Weise ergab eine Urokinaselösung, die mit 0,025molarem Natriumphosphat und 0,025molarem Natriumchlorid bei pH 8 gepuffert war, bei Behandlung bei 3 bis 5°C eine Reinheitserhöhung von 900 auf 41 000 Einheiten/mg. Unter Einsatz des gleichen Puffersystems bei pH 6,0 wurde sowohl bei 0 bis 5° als auch bei Raumtemperatur, ausgehend von einem Material mit 5500 Einheiten/mg eine Urokinase mit 15 000 Einheiten/mg erhalten. Beide Produkte zeigten bei Passage über eine Sephadex-G-75-Säule, wie in Beispiel 1, c, eine Potenzerhöhung auf 55 000 Einheiten/mg.

In den obigen Beispielen werden schwach oder stark basische Dextrangele als Anionenaustauscherharze gemäß der Erfindungsdefinition eingesetzt, aber man kann als solche auch andere, routinemäßig als Gelfiltrationsmaterialien verwendete polymere Materialien unter Erzielung gleich guter und zufriedenstellender Ergebnisse einsetzen, wie Acrylharze.

Man erhält eine leichte Durchführbarkeit, indem man die entsprechend gepufferte Urokinaselösung der obengenannten lonenstärke das Harz mindestens 15 Minuten kontaktieren läßt. Eine längere Yerweüzeii

ist für das Eintreten des Austausches nicht notwendig, da die Verunreinigungen einer fast sofortigen Bindung an das anionische Austauschharz unterliegen, !m Ergebnis kann man das Verfahren gemäß der Erfindung bei einer diskontinuierlichen Arbeitsweise anwenden, bei der das Harz in die Urokinaseiosung eingeschlämmt wird, oder auch gleich gute oder noch bessere Ergebnisse erzielen, wenn man die Urokinaseiosung durch eine Säule leitet, die das obengenannte schwach oder stark anionische Austauschharz enthält.

Die Erfindung ermöglich! sornu eine besonders gute Reinigung von Urokinase, insbesondere die Gewinnung von Urokinase, die ein hches Wirkungsvermögen besitzt und von gerinnungsfördernden Substanzen wie Thromboplastin, frei ist, durch Behandlung ihrer unreinen, wäßrigen Lösungen, insbesondere mit modifiziertem, verneuiem Dextrange!

Claims

Patentansprüche:

!. Verfahren zum Reinigen von Urokinase, dadurch gekennzeichnet, daß man eine klare Urokinaselösung in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von 6 bis 9 und einer lonenstärke von 2,0 bis 5,0 Millisiemens bildet, die Lösung in Kontakt mit gequollenen Körnern basischen Anionenaustauschharzes bringt, an das tertiäres oder quaternäres Amin in einer Menge von mindestens 3,0 MilliäquivVg chemisch gebunden ist und das eine durchschnittliche Korngröße im Bereich von 40 bis 120 Mikron hat, genügend Zeit gibt, damit das Ionenaustauschharz bei einer Temperatur im Bereich zwischen 0" und dem Siedepunkt der wäßrigen Lösung wirkt, und von dem Harz, an das im wesentlichen die gesamten, anfänglich anwesenden Verunreinigungen adsorbiert sind, die Flüssigphase trennt.
2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß man den Ionenaustausch bei etwa Raumtemperatur durchführt.
3. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß man die Urokinaselösung mit dem anionischen Austauschharz aufschlämmt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Urokinaselösung durch eine Säule leitet, die das anionische Austauschharz enthält.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die wäßrige Urokinaselösung mit Tris- (hydroxymethyl) -aminoäthan puffen.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einer lonenstärke im Bereich von 2,5 bis 3,5 Millisiemens arbeilet.