DE69001309T2

DE69001309T2 - Verfahren zur herstellung von antihaemophilem faktor (faktor viii), der eine hohe reinheit aufweist.

Info

Publication number: DE69001309T2
Application number: DE9090400203T
Authority: DE
Inventors: Bernard Jules Dazey; Mohamed Hamsany; Gerard Paul Vezon
Original assignee: AQUITAINE DEV TRANSF SANGUINE
Current assignee: AQUITAINE DEV TRANSF SANGUINE
Priority date: 1989-02-17
Filing date: 1990-01-24
Publication date: 1993-08-05
Anticipated expiration: 2010-01-25
Also published as: ES2055875T3; EP0383645B1; EP0383645A1; JP2521551B2; JPH02282400A; FR2644064A1; ATE88188T1; DE69001309D1; DK0383645T3; FR2644064B1

Description

Die Erfindung betrifft im wesentlichen ein Verfahren zur Herstellung des antihämophilen Faktors (FVIIIc) in sehr hoher Reinheit, den so erhaltenen antihämophilen Faktor sowie eine pharmazeutische Zusammensetzung, die diesen Faktor enthält.
Im Stand der Technik sind bereits verschiedene Verfahren zur Reinigung des antihämophilen Faktors (FVIIIc) bekannt. So beschreibt beispielsweise WO 86/04486 (New York University) ein Verfahren zur Reinigung des antihämophilen Faktors durch säulenchromatographische Verfahren in Gegenwart von Zucker, mehrwertigen Alkoholen, Aminosäuren oder Salzen (vgl. Seite 1, Zeilen 16 - 23, sowie Anspruch 1 von Seite 30).
Nach diesem vorbekannten Verfahren erfolgt die Zugabe dieser Zusätze, welche die Zucker, die mehrwertigen Alkohole, die Aminosäuren und die Salze umfassen, in einer beiliebigen Stufe des Verfahrens, d.h. entweder vor der Chromatographie oder während der Chromatographie oder nach der Chromatographie.
Es ist festzuhalten, daß ein derartiger Zusatz von Zucker bei dem herkömmlichen Verfahren in weitem Maße angewandt wurde, da sogar in der Beschreibung der genannten Druckschrift auf den Seiten 3 und 4 zahlreiche Publikationen genannt sind, die sich auf die chromatographische Reinigung von Faktor VIIIc beziehen. So kann geeigneterweise diesbezüglich z.B. auf die Publikation von Austen in Thromb. Haemostas. (Stuttgart) 48 (1) : 46 (1982) hingewiesen werden, der ein Verfahren zur Behandlung von Plasma durch Chromatographie an einer Aminohexylsepharosesäule unter Elution mit einer Pufferlösung von Lysinacetat und mit einem Salzgradienten beschreibt. Ebenso beschreibt Faure in J. Chromatog. 257 : 387 (1983) die Verwendung von 1 bis 10 % Saccharose in Lysinacetat-Puffern zur Verbesserung der Ausbeute an Faktor VIIIc während der Chromatographie eines Cryopräcipitats an einem Aminohexylsepharosegel, das in einer Chromatographiesäule eingesetzt wird. Dabei wird von den Autoren angegeben, daß die Verwendung von Zucker die Unterdrückung der Bildung eines molekularen Komplexes erlaubt. Diese Druckschrift entspricht US 4 743 680.
In ähnlicher Weise wird gemäß EP-A-383 234 der Zusatz von 5 bis 30 Gew.-% Kohlenhydrat (insbesondere Saccharose) vor dem Ionenaustausch an der Säule vorgesehen, wodurch die ionischen Bedingungen des Verfahrens in erheblichem Maß modifiziert werden.
Weitere Druckschriften zum Stand der Technik sind beispielsweise US-A- 4 508 709 = EP-A-144 957 sowie ferner US-A-4 578 218 = DE-A-3 504 385. Ein weiteres herkömmliches Verfahren ist in FR-A-2 570 276 beschrieben, das in Gegenwart von murinen Immunglobulinen durchgeführt wird, die in der Humantherapie einige Nachteile mit sich bringen, wie für den Fachmann leicht erkennbar ist.
Im einzelnen beschreibt die Druckschrift EP-A-144 957 ARMOUR (= US-A-4 508 709) ein Verfahren zur Reinigung von Faktor VIIIc, das auf der kombinierten Adsorption von Faktor VIIIc und des von-Willebrand-Faktors und einer anschließenden selektiven Desorption des Faktors VIIIc vom von-Willebrand- Faktor beruht, um so den von-Willebrand-Faktor abzutrennen. Diesbezüglich besteht ein grundlegender Unterschied zwischen diesem herkömmlichen Verfahren und dem erfindungsgemäßen Verfahren, dessen Prinzip, wie nachstehend erläutert wird, darauf beruht, daß lediglich der Faktor VIIIc, im wesentlichen ohne den von-Willebrand-Faktor, adsorbiert wird. Darüber hinaus wird, nach dem herkömmlichen Verfahren von ARMOUR zur Adsorption des Gemischs von Faktor VIIIc und des von-Willebrand-Fraktors eine Elutionslösung verwendet, die als "Puffer A" bezeichnet ist und einen pH-Wert von etwa 6,8 aufweist, jedoch kein CaCl&sub2; enthält (vgl. Seite 5, Zeilen 6 bis 18 und Seite 6, Zeilen 14 bis 26).
Nach dem herkömmlichen Verfahren nach ARMOUR werden anschließend Waschvorgänge mit modifizierten Pufferlösungen durchgeführt, die 10 mM CaCl&sub2; enthalten. Von ARMOUR wird dabei unterstrichen, daß CaCl&sub2; zur Stabilisierung von Faktor VIIIc bekannt ist, jedoch zuvor wegen der Gefahr der Aktivierung der Gerinnungsfaktoren nicht verwendet werden kann, die zur Bildung von Fibrincloc auf dem Harz und ggf. zu einem Abbau des Faktors VIIIc führt (vgl. Seite 6, Zeile 27 bis Seite 7, Zeile 5).
Demzufolge bestand im Stand der Technik ein Vorurteil gegen die Verwendung von Lösungen zur anfänglichen Elution, die CaCl&sub2; enthalten.
Dementsprechend, wie nachstehend erläutert ist, überwindet die vorliegende Erfindung dieses Vorurteil des Standes der Technik und sieht die selektive Absorption von Faktor VIIIc, der im wesentlichen frei von dem von-Willebrand-Faktor ist, vor, wobei für diesen Zweck eine erste Elutionslösung verwendet wird, die CaCl&sub2; in einer Menge von 10 mM enthält.
Der vorliegenden Erfindung liegt entsprechend die Aufgabe zugrunde, das neue technische Problem zu lösen, ein Verfahren zur Herstellung des antihämophilen Faktors (Faktor VIIIc) mit sehr hoher Reinheit ohne Verwendung muriner Immunglobuline anzugeben, der keine Verunreinigungen enthält, die für den hämophilen Patienten eine Unannehmlichkeit darstellen könnten.
Es ist ferner Aufgabe der vorliegenden Erfindung, das neue technische Problem zu lösen, ein Verfahren zur Herstellung des antihämophilen Faktors (Faktor VIIIc) anzugeben, der zum überwiegenden Teil vom von-Willebrand-Faktor isoliert ist, im Gegensatz zu bestimmten herkömmlichen Verfahren und insbesondere im Gegensatz zu dem in FR-A-2 570 287 oder EP-A- 144 957 (= US-A-4 508 709) beschriebenen Verfahren, um so die Aktivität des so erhaltenen antihämophilen Faktors in signifikanter Weise bis auf hohe Werte von 250 I.U./mg Protein zu steigern.
Der vorliegenden Erfindung liegt ferner die Aufgabe zugrunde, diese neuartigen technischen Probleme durch Angabe eines besonders einfachen, reproduzierbaren Herstellungsverfahrens zu lösen, das sich in technischem Maßstab anwenden läßt.
Die vorliegende Erfindung stellt die erste zufriedenstellende Lösung dieser technischen Probleme dar, aufgrund deren sie in technischem Maßstab anwendbar ist, wobei, im Gegensatz zu den herkömmlichen Verfahren, die auf den Labormaßstab beschränkt waren, große Mengen ohne Volumenbegrenzung behandelt werden können.
Darüber hinaus wird erfindungsgemäß eine Virusinaktivierung vorgenommen, die in den Druckschriften des Standes der Technik nicht vorgesehen ist.
Demgemäß gibt die vorliegende Erfindung, gemäß einem ersten Aspekt, ein Verfahren zur Herstellung des antihämophilen Faktors (FVIIIc) in sehr hoher Reinheit an, aus dem der größte Teil des von-Willebrand-Faktors entfernt ist, das einen Schritt der Reinigung durch Ionenaustauschchromatographie mit Hilfe einer ein Gel enthaltenden Chromatographiesäule umfaßt, wobei die gelchromatographische Reinigung einen Schritt der Adsorption des antihämophilen Faktors am Gel dieser Säule und einen Schritt der Desorption des gereinigten antihämophilen Faktors, der gewonnen wird, umfaßt; das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man eine erste Pufferlösung zur Elution ohne Kohlenhydratzusatz herstellt, die eine zur Trennung des Faktors VIIIc vom Großteil des von-Willebrand-Faktors sowie von den Hauptverunreinigungen des Plasmas geeignete Ionenstärke besitzt, man eine Rohlösung des Faktors VIIIc aus einem Cryopräcipitat ohne Kohlenhydratzusatz herstellt, die etwa die gleiche Ionenstärke aufweist wie die erste Pufferlösung zur Elution, man selektiv den Faktor VIIIc, im wesentlichen ohne den von-Willebrand-Faktor, am Gel der Säule adsorbiert, wobei die Rohlösung des Faktors VIIIc mit der ersten Elutionslösung eluiert wird, und man den am Gel der Säule mit Hilfe der ersten Elutionslösung adsorbierten Faktor VIIIc unter Verwendung einer zweiten Pufferlösung zur Elution desorbiert, die eine höhere Ionenstärke als die erste Elutionslösung aufweist, wobei man eine gereinigte Lösung des Faktors VIIIc in sehr hoher Reinheit erhält, aus welcher der größte Teil des von-Willebrand-Faktors sowie die Hauptverunreinigungen des Plasmas entfernt sind.
Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird anschließend eine Diafiltration gegen eine dritte Pufferlösung durchgeführt, wodurch vorzugsweise eine intravenöse Injektion ermöglicht wird. Nach einem weiteren vorteilhaften Kennzeichen der Erfindung wird die gereinigte Lösung des Faktors VIIIc aufkonzentriert und vorzugsweise lyophilisiert.
Nach einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die zu reinigende Rohlösung des Faktors VIIIc durch Auflösen eines Cryopräcipitats hergestellt, das aus Humanplasma gewonnen ist.
Nach einem weiteren vorteilhaften Kennzeichen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die durch Auflösen des Cryopräcipitats in Wasser, das vorteilhaft mit Heparin versetzt ist, erhaltene Lösung mit Aluminiumhydroxid behandelt.
Die Menge an Aluminiumhydroxid, die dabei eingebracht wird, ist nicht kritisch und kann innerhalb weiter Grenzen variieren. Es ist allerdings vorzuziehen, eine Menge an Aluminiumhydroxid von mehr als 10 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der den Faktor VIIIc enthaltenden Lösung, einzusetzen. Gegenwärtig bevorzugte Mengen liegen in der Größenordnung von 15 Vol-%.
Nach einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens wird anschließend das Aluminiumhydroxid durch Zentrifugieren von der Lösung des Faktors VIIIc abgetrennt, die so von den Vitaminen-K-abhängigen Faktoren befreit wird. Nach einer anderen vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann anschließend eine Virusinaktivierung der den Faktor VIIIc enthaltenden Lösung mit Hilfe einer Pufferlösung durchgeführt werden, die ein Lösungsmittel/Detergens-Gemisch enthält, wie in EP-A-0 131 740 oder US-A-4 540 573 beschrieben.
Die zu reinigende Rohlösung des Faktors VIIIc wird vorzugsweise gegen die erste Pufferlösung, die zur Elution der Säule dient, diafiltriert, bevor der Schritt der Adsorption an der Säule durchgeführt wird.
Nach einem vorteilhaften Charakteristikum des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das zur Reinigung in der Chromatographiesäule durch Ionenaustausch verwendete Gel ein Gel mit folgenden wesentlichen Eigenschaften:
- Es handelt sich um ein Gel vom Anionenaustauschertyp auf der Basis von vernetzter Agarose, insbesondere mit einem Vernetzungsgrad von etwa 6 %, in Form von Kügelchen. Das Gel ist vorzugsweise vom quaternären Amintyp, wobei sich die Gruppen insbesondere am Ende eines kleinen Spacers befinden, beispielsweise vom C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylen-Typ, der an die Agarosekügelchen gebunden ist.
- Es handelt sich um ein Gel, das diese Eigenschaften aufweist und unter der Handelsbezeichnung Q-Sepharose fast flow im Handel erhältlich und durch die schwedische Firma Pharmacia vertrieben wird und dessen Kügelchen in feuchtem Zustand einen Durchmesser von 45 bis 165 µm aufweisen.
Nach einem weiteren vorteilhaften Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens besitzt die erste Pufferlösung zur Elution folgende Zusammensetzung:
- NaCl ..... 250 mM/l,
- Tris 20 ..... mM/l,
- CaCl&sub2;.2H&sub2;O ..... 10 mM/l.
Diese Zusammensetzung wird mit konzentrierter, 12 N HCl auf pH 6,6 eingestellt.
Nach einem weiteren vorteilhaften Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens besitzt die zweite Pufferlösung, die zur Desorption des Faktors VIIIc von der Säule dient, folgende Zusammensetzung:
- NaCl 700 ..... mM/l,
- Tris 20 ..... mM/l,
- CaCl&sub2;.2H&sub2;O ..... 10 mM/l.
Diese Zusammensetzung wird ebenfalls mit konzentrierter, 12 N HCl auf pH 6,6 eingestellt.
Nach einem weiteren vorteilhaften Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens besitzt die oben genannte dritte Pufferlösung, die zur Diafiltration des gereinigten und eluierten Faktors VIIIc herangezogen wird, folgende Zusammensetzung:
- NaCl ..... 100 mM/l,
- Tris ..... 20 mM/l,
- CaCl&sub2;.2H&sub2;O ..... 0,6 mM/l,
- L-Arginin ..... 17 mM/l,
- L-Lysin.HCl ..... 20 mM/l.
Diese Lösung wird ebenfalls mit konzentrierter, 12 N HCl auf pH 7 eingestellt.
Nach einem weiteren vorteilhaften Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die gereinigte und eluierte Lösung des Faktors VIIIc vor dieser Diafiltration mit der dritten Pufferlösung mit 17 mM/l L-Arginin sowie 20 mM/l L-Lysin.HCl pro Liter Lösung versetzt.
Nach einem weiteren vorteilhaften Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die genannten Diafiltrationen mit Diafiltrationsmembranen durchgeführt, die mit einem 0,1 M Hydrogencarbonatpuffer von pH 9,6, der 30 g/l apyrogenes Humanalbumin und 0,1 Vol.-% Emulgator enthält, behandelt wurden.
Zur Konservierung der so erhaltenen eluierten Lösung von Faktor VIIIc mit sehr hoher Reinheit, die vom größten Teil des von-Willebrand-Faktors befreit ist und eine antihämophile Wirksamkeit bezogen auf Hämophilie A von mindestens 250 I.U./mg Protein aufweist, wird sie einer Sterilfiltration mit einem sterilisierenden Filter mit einer Porengröße von 0,22 µm unterzogen, worauf die erhaltene gereinigte und sterilisierte Lösung von Faktor VIIIc in siliconbeschichtete Fläschchen abgefüllt wird.
Weitere Ziele, Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen aus der nachfolgenden Beschreibung hervor, die sich auf ein lediglich zur Erläuterung dienendes Ausführungsbeispiel bezieht, das entsprechend in keiner Weise einschränkend ist. In diesem Beispiel sind die Prozentwerte, sofern nichts anderes angegeben, gewichtsbezogen.

Erfindungsgemäßes Beispiel

Es werden 3 kg Cryopräcipitat aus Humanplasma eingesetzt, das aus 300 l Humanplasma gewonnen ist. Es wird im 3,2-fachen Volumen isotonischem Wasser mit negativem Limulus-Test, das mit Heparin in einer Menge von 3 I.U./ml Lösung versetzt ist, bei Labortemperatur und unter Rühren während 2 h so gelöst, daß eine vollständige Auflösung erzielt wird.
Nach Messung des resultierenden Volumens wird die erhaltene Lösung mit Aluminiumhydroxid in einer Menge von 15 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Lösung, versetzt, um die Vitamin-K-abhängigen Faktoren abzutrennen. Das Rühren wird 5 min lang vorgenommen, um diese Adsorption der Vitamin-K-abhängigen Faktoren am Aluminiumhydroxid zu erzielen.
Anschließend wird zur Abtrennung des Aluminiumhydroxids von der Lösung bei einer relativen Zentrifugalbeschleunigung von 6000 zentrifugiert.
Danach wird die den Faktor VIIIc enthaltende Lösung nach dem in EP-A-0 131 740 oder US-A-4 540 573 beschriebenen Verfahren so behandelt, daß eine Virusinaktivierung erzielt wird.
Im Anschluß daran wird die inaktivierte, den Faktor VIIIc enthaltende Lösung gegen eine erste Pufferlösung diafiltriert, die anschließend für die Äquilibrierung und die erste Elution der Chromatographiesäule herangezogen wird; sie besitzt folgende Zusammensetzung:
- NaCl ..... 250 mM/l,
- Tris ..... 20 mM/l,
- CaCl&sub2;.2H&sub2;O ..... 10 mM/l.
Diese Lösung wird mit konzentrierter, 12 N HCl auf pH 6,6 eingestellt.
Die Diafiltration wird mit dem doppelten Volumen der inaktivierten Lösung von Faktor VIIIc durchgeführt, wodurch der größte Teil der Verbindungen entfernt wird, die zur Virusinaktivierung dienten. Als erste Membran zur Diafiltration wird eine Millipor-Membran der Bezeichnung 4PTHK verwendet, die einen Molekulargewichtsschnitt bei 100 000 erlaubt. Man erhält so eine inaktivierte, diafiltrierte und auf eine Gesamtmenge von 10 l konzentrierte Lösung von Faktor VIIIc.
Dann wird verifiziert, daß diese auf 10 l konzentrierte Lösung im wesentlichen die gleiche Ionenstärke wie die erste Pufferlösung zur Elution der Chromatographiesäule aufweist. Die Chromatographiesäule ist beispielsweise eine Säule mit einer Höhe von 25 cm und einem Durchmesser von 40 cm, in die 32 l Gel (Pharmacia Q-Sepharose fast flow ) eingefüllt werden.
Das Gel wird mit der ersten Elutionslösung äquilibriert, bevor die 10 l Lösung von zu reinigendem Faktor VIIIc bei einem Durchsatz von 25 l/h eingeführt wird, worauf die erste Pufferlösung zur Elution bei gleichem Durchsatz eingeleitet wird, bis am Säulenausgang, durch spektrophotometrische Messung bei 280 nm, kein Proteinpeak mehr festgestellt wird, der im wesentlichen dem von-Willebrand-Faktor, Fibrinogen, Albumin und X-Globulinen entspricht, die abgetrennt werden sollen.
Nach dieser Elution der Säule mit der ersten Pufferlösung zur Elution wird eine zweite Pufferlösung zur Elution mit höherer Ionenstärke und folgender Zusammensetzung verwendet:
- NaCl ..... 700 mM/l,
- Tris ..... 20 mM/l,
- CaCl&sub2;.2H&sub2;O ..... 10 mM/l,
die durch Zusatz von konzentrierter, 12 N HCl auf pH 6,6 eingestellt wurde.
Diese Elution wird mit der zweiten Pufferlösung bei gleichem Durchsatz wie vorher durchgeführt, bis der dem Faktor VIIIc entsprechende Peak festgestellt wird. Diese Ermittlung erfolgt mit modifizierter Empfindlichkeit des Spektralphotometers, wie dies dem Fachmann geläufig ist.
Dabei wird festgestellt, daß innerhalb des nicht zurückgehaltenen Anfangspeaks, der insbesondere sämtliche Verunreinigungen, darunter auch den von-Willebrand-Faktor, enthält, ein Volumen von 80 bis 100 l Lösung gewonnen wird, die beiseite gestellt wird und zur Abtrennung des von-Willebrand- Faktors in gereinigter Form behandelt werden kann, der ebenfalls von therapeutischem Interesse ist, wie dem Fachmann dieses Gebiets hinsichtlich der durch Mangel an von-Willebrand-Faktor bedingten Hämophilie geläufig ist.
Die nach der Elution erhaltene Lösung von Faktor VIIIc besitzt ferner ein Gesamtvolumen von 40 bis 50 l, in den der Faktor VIIIc in einer sehr kleinen Menge, nämlich in einer Konzentration von 0,5 bis 1 I.U./ml, vorliegt.
Diese so erhaltene verdünnte Lösung wird mit 17 mM/l L-Arginin und 20 mM/l L-Lysin.HCl versetzt.
Anschließend wird die Lösung durch Diafiltration gegen eine dritte Pufferlösung aufkonzentriert, die folgende Zusammensetzung besitzt:
- NaCl ..... 100 mM/l,
- Tris ..... 20 mM/l,
- CaCl&sub2;.2H&sub2;O ..... 0,6 mM/l,
- L-Arginin ..... 17 mM/l,
- L-Lysin.HCl ..... 20 mM/l,
die mit konzentrierter, 12 N HCl auf pH 7 eingestellt wird.
Diese Verfahrensweise erlaubt eine Verringerung des Natriumgehalts auf 100 mM/l Aufkonzentrierung des Faktors VIIIc auf 30 I.U./ml. Die in dieser Stufe verwendete Diafiltrationsmembran ist eine Millipor-Membran mit der Bezeichnung 4PTTK, mit der ein Molekulargewichtsschnitt bei 30 000 durchgeführt werden kann.
Es ist hervorzuheben, daß es sehr wichtig ist, alle Diafiltrationsmembranen vorher durch ausreichendes Spülen mit isotonischem Wasser mit negativem Limulus-Test zu behandeln. Außerdem werden 5 l einer 0,1 M Hydrogencarbonat-Pufferlösung von pH 9,6 hergestellt, die 30 g/l apyrogenes Humanalbumin und 0,1 Vol.-% eines Emulgators, beispielsweise Tween 80 , enthält und mit Hilfe einer ASTI - Pumpe mit Teflonkolben und Körper aus Pyrex-Glas 2 h lang in einem geschlossenen Kreislauf durch diese Membranen hindurchgepumpt wird. Anschließend wird 1 h mit isotonischem Wasser mit negativem Limulus-Test gespült, worauf 20 l der oben genannten zweiten Pufferlösung hindurchgeschickt werden. Durch Proteinbestimmung unter Verwendung der Mikromethode von Marion M. Bradford, die in ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 72, 248-254 (1976) beschrieben ist, wird verifiziert, daß der Proteingehalt am Ausgang der Diafiltrationsmembran gleich null ist.
Anschließend wird eine Sterilfiltration der Lösung des Faktors VIIIc mit einer Sterilfiltrationsmembran durchgeführt, beispielsweise einer Millidisk-Membran der Firma Millipore mit einem Porendurchmesser von 0,22 µm.
Man erhält so eine sterilisierte Lösung von Faktor VIIIc sehr hoher Reinheit, die zur Lagerung der Produkte auf siliconisierte Fläschchen verteilt werden kann, insbesondere im Hinblick auf die Lyophilisierung, die anschließend in der herkömmlichen Weise vorgenommen werden kann. Man erhält so ein Faktor VIIIc-Präparat mit 30 I.U./ml und einer spezifischen Aktivität von mindestens 250 I.U./mg Protein.
Dieses Faktor VIIIc-Präparat, das vorteilhaft lyophilisiert wird, stellt somit eine höchst wertvolle pharmazeutische Zusammensetzung dar, die einem an Hämophilie leidenden Patienten nur in Mengen injiziert werden muß, die zur Hämophilie- Behandlung erforderlich sind, was einen signifikanten technischen Fortschritt darstellt, der für den Fachmann völlig unerwartet war.
Es ist ferner noch festzustellen, daß dieses Produkt eine hohe zeitliche Stabilität aufweist. So verringert sich insbesondere die Aktivität des Faktors VIIIc nach Auflösen des Lyophilisats nach 24 h um weniger als 10 %.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden ferner ausgezeichnete Ausbeuten in technischem Maßstab erzielt, die in der Größenordnung von 50 bis 55 %, bezogen auf das als Ausgangsmaterial verwendete, gelöste Cryopräcipitat, liegen.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung des antihämophilen Faktors (FVIIIc) in sehr hoher Reinheit, aus dem der größte Teil des von-Willebrand-Faktors entfernt ist, das einen Reinigungsschritt durch Ionenaustauschchromatographie mit Hilfe einer ein Gel enthaltenden Chromatographiesäule umfaßt, der einen Adsorptionsschritt des antihämophilen Faktors am Gel der Säule und einen Desorptionsschritt des gereinigten antihämophilen Faktors, den man sammelt, umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß man eine erste Pufferlösung zur Elution ohne Kohlenhydratzusatz herstellt, die eine zur Trennung des Faktors VIIIc vom Großteil des von Willebrand- Faktors und von den Hauptplasmaverunreinigungen ausreichende Ionenstärke besitzt, man eine Rohlösung des Faktors VIIIc, ausgehend von einem Cryopräcipitat, ohne Kohlenhydratzusatz herstellt, die ungefähr die gleiche Ionenstärke wie die erste Pufferlösung zur Elution besitzt, man selektiv den Faktor VIIIc, im wesentlichen ohne den von Willebrand-Faktor, auf dem Gel der Säule adsorbiert, indem die Rohlösung des Faktors VIIIc mit der ersten Elutionslösung eluiert wird, und man den am Gel der Säule mit Hilfe der ersten Elutionslösung adsorbierten Faktor VIIIc unter Verwendung einer zweiten Pufferlösung zur Elution mit einer höheren Ionenstärke als der ersten Elutionslösung desorbiert, wobei man eine gereinigte Lösung des Faktors VIIIc in sehr hoher Reinheit gewinnt, aus dem der größte Teil des von Willebrand-Faktors und die Hauptplasmaverunreinigungen entfernt sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Diafiltration gegen eine dritte Pufferlösung durchführt, die vorzugsweise die intravenöse Injektion erlaubt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die gereinigte Lösung des Faktors VIIIc, die vorzugsweise lyophilisiert ist, aufkonzentriert.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu reinigende Rohlösung des Faktors VIIIc durch Auflösen eines Cryopräcipitats eines Extraktes von Humanplasma herstellt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die durch Auflösung des Cryopräcipitats in vorteilhaft heparinhaltigem Wasser erhaltene Lösung mit Aluminiumhydroxid behandelt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Zugabemenge an Aluminiumhydroxid über 10 Vol.-% in bezug auf das Gesamtvolumen der den Faktor VIIIc enthaltenden Lösung und vorzugsweise in der Größenordnung von 15 Vol.-% liegt.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Zentrifugierung durchführt, um das Aluminiumhydroxid aus der so von den Vitamin K-abhängigen Faktoren befreiten Lösung des Faktors VIIIc abzutrennen.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die den Faktor VIIIc enthaltende Lösung mit Hilfe einer ein Lösungsmittel/Detergens-Gemisch enthaltenden Pufferlösung virusinaktiviert.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die gereinigte Rohlösung des Faktors VIIIc vor dem Adsorptionsschritt an der Säule gegen die vorher erwähnte erste Pufferlösung, die zur Elution der Säule dient, diafiltriert wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das in der Säule zur Ionenaustauschchromatographie verwendete Reinigungsgel ein Gel mit den folgenden Haupteigenschaften ist:

- ein anionisches Ionenaustauschgel auf der Basis von vernetzter Agarose, insbesondere mit ungefähr 6 % in Form von Kügelchen, vorzugsweise auf der Basis von quaternärem Amin, insbesondere am Ende eines kleinen Spacers, beispielsweise des C&sub1;-C&sub6;-Alkylentyps, der an die Agarosekügelchen gebunden ist.

- vorzugsweise ist das Gel ein unter dem Handelsnamen Q-Sépharose fast flow (PHARMACIA) bekanntes Gel mit Kügelchen eines Durchmessers von 45 - 165 µm im feuchten Zustand.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die vorgenannte erste Pufferlösung zur Elution die folgende Zusammensetzung besitzt:

- NaCl ..... 250 mmol,

- Tris ..... 20 mmol,

- CaCl&sub2; 2H&sub2;O ..... 10 mmol,

wobei diese Zusammensetzung mit konzentrierter 12 N HCl auf einen pH-Wert von 6,6 eingestellt ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die vorgenannte zweite Pufferlösung zur Desorption des Faktors VIIIc von der Säule die folgende Zusammensetzung besitzt:

- NaCl ..... 700 mmol,

- Tris ..... 20 mmol,

- CaCl&sub2; 2H&sub2;O ..... 10 mmol,

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Diafiltration des gereinigten und eluierten Faktors VIIIc verwendete vorgenannte dritte Pufferlösung folgende Zusammensetzung besitzt:

- NaCl ..... 100 mmol,

- Tris ..... 20 mmol,

- CaCl&sub2; 2H&sub2;O ..... 0,6 mmol,

- L-Arginin ..... 17 mmol,

- L-Lysin HCl ..... 20 mmol,

wobei diese Lösung mit konzentrierter 12 N HCl auf einen pH-Wert von 7 eingestellt ist.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Diafiltration mit der dritten Pufferlösung der gereinigten und eluierten Lösung des Faktors VIIIc 17 mmol L-Arginin und 20 mmol L-Lysin HCl pro Liter Lösung zusetzt.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Filtration zur Sterilisierung der eluierten Lösung des Faktors VIIIc sehr hoher Reinheit über einem sterilisierenden Filter mit einem Porendurchmesser von 0,22 um durchführt, und man dann diese gereinigte, sterilisierte Lösung des Faktors VIIIc in siliconbeschichtete Flaschen abfüllt.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man die Diafiltrationen mit Membranen zur Diafiltration durchführt, die mit einem 30 g/l apyrogenes Humanalbumin und 0,1 Vol.-% eines Emulgiermittels enthaltenden Bicarbonatpuffer (0,1 M, pH 9,6) behandelt sind.

17. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß man als Wirkstoff einen Faktor VIIIc sehr hoher Reinheit verwendet, wie er mit dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16 erhalten ist, vorzugsweise in lyophilisierter Form, die die Herstellung einer injizierbaren Präparation unmittelbar vor der Behandlung erlaubt.