DE2924744C2

DE2924744C2 - Gewinnung von reiner Urokinase

Info

Publication number: DE2924744C2
Application number: DE2924744A
Authority: DE
Inventors: Robert Dr. Zürich Häfeli
Original assignee: ALPHA PATENT Ltd TEL-AVIV IL; Alpha Patent Ltd Tel Aviv
Current assignee: Merck Serono SA
Priority date: 1978-06-30
Filing date: 1979-06-20
Publication date: 1982-09-16
Also published as: NL185573B; IT7923835A0; FR2429837B1; GB2025977A; DE2924744A1; FR2429837A1; AR220202A1; JPS5832591B2; IT1121914B; JPS5523993A; CH643297A5; NL930096I1; NL185573C; IL57596A0; NL7905045A; US4259447A; GB2025977B; IL57596A

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Urokinase in hoher Konzentration und Aktivität aus vorgereinigten und aufkonzentrierten Urokinase-Rohlösungen gemäß Patentanspruch 1. Die Ansprüche 2 bis 8 nennen Ausgestaltungen der Erfindung.

Urokinase ist ein Enzym, das in kleinen Mengen im Harn von Säugetieren und auch im menschlichen Urin vorkommt und die Umwandlung von Plasminogen in Plasmin bewirkt Letzteres löst Fibringerinnsel auf. Urokinase-Präparate stellen daher wertvolle therapeutische Produkte, z. B. zur Behandlung von Thromboembolien.dar.

Zur Isolierung von Urokinase aus menschlichem Urin und der anschließenden Reinigung und Konzentrierung zu einem hochwirksamen Produkt sind eine Reihe von Verfahren bekannt Sie bestehen darin, daß man den Urin mit einem Adsorptionsmittel in Kontakt bringt und darauf das adsorbierte Material aus dem Adsorptionsprodukt eluiert Im erhaltenen Extrakt liegt die rohe Urokinase in erhöhter Konzentration vor. Der Extrakt wird mittels verschiedener Adsorptions-EIutions- und anderer Trennverfahren aufgearbeitet, so daß schließlich eine konzentrierte, gereinigte Urokinaselösung erhalten wird.

Verwendete Adsorptionsmittel sind Calciumcarbonat, Bariumsulfat, Aluminiumoxid, Calciumphosphat, Zinkhydroxid, Aktivkohle, hydrierte Aluminiumsilikate, wie Bentonit und Kaolin, Ionenaustauschsilikate, Molekularsiebe sowie eine Reihe anderer, organischer und anorganischer Stoffe.

Ein neues derartiges Adsorptionsmittel, nämlich ein Acrylharz-Kationenaustauscher, ist in der DE-PS 24 28 248 beschrieben.

Die meisten der bekannten Verfahren für die chromatographische Konzentrierung und Reinigung von Urokinase verwenden für die Adsorption eine Feststoffmatrix, die immobilisiert an ihrer Oberfläche z. B. die folgenden Verbindungen enthält: ε-Aminocapronsäure und p-Aminobenzamidin auf Agarose, Antikörper zur Urokinase auf Agarose, Arginin auf Polyacrylamidharzen, Agmatin-e-amino-capronsäure auf Agarose, Trypsininhibitor auf Agarose, Lysin oder Arginin auf Agarose, Trypsininhibitor auf Sepharose, Urokinaseinhibitor aus menschlicher Plazenta auf Agarose und ähnliche Kombinationen.

Es ist auch bekannt, Aprotinin an der Oberfläche einer Feststoffmatrix zu immobilisieren und die so behandelten Harze für die chromatographische Trennung und Konzentrierung verschiedener Verbindungen, jedoch nicht von Urokinase zu verwenden. Zum Beispiel wird in der Zeitschrift Biochemie, Band 55, Seite 1323 (1973) ein chromatographisches Verfahren zur Konzentrierung von Trypsinen an derartigen Harzen beschrieben, siehe auch Band 15, Seite 4 (1976). Weiter wird im Journal of Physiological Chemistry, Band 357, Seite 1153 ff (1976), ein Verfahren zur Reinigung und Charakterisierung von menschlicher Pankreaselastase angegeben. Schließlich ist noch auf die Arbeit im Journal of Clinical Chemistry/Clinical Biochemistry, Band 15, Seite 479 ff (1977) hinzuweisen, wo ein Verfahren für die Isolierung von menschlichem Kallikrein angegeben ist

Es wurde nun gefunden, daß man durch an Feststoffe immobilisiertes Aprotinin in ausgezeichneter und wirtschaftlich äußerst günstiger Wsise eine Trennung und Konzentrierung von Urokinase erreichen kann. Diese Wirkung des immobilisierten Aprotinins zur spezifischen Adsorption von Urokinase ist vor allem deswegen erstaunlich, weil Aprotinin in Lösung bei den üblichen Konzentrationen die Urokinase-Wirkung nicht inhibiert Außerdem haben die Aprotinin an ihrer Oberfläche gebunden enthaltenden Harze, verglichen mit den üblichen chromatographischen Säulen, eine längere und konstantere Lebensdauer. Die bekannten Verfahren zur Gewinnung von Urokinase scheinen im allgeinen zu zwei Verbindungsformen zu führen, einer höhermolekularen mit einem mittleren Molekulargewicht um 54 000 und einer niedrigermolekularen mit einem mittleren Molekulargewicht um 33 000. Das Molekulargewicht der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Urokinase variiert nur um einen mittleren Wert von ungefähr 54 000. Worauf dies zurückzuführen ist, konnte bislang noch nicht geklärt werden. Zur Zeit wird untersucht, ob die Urokinase mit dem niedrigeren mittleren Molekulargewicht ein Ab-

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is

bauprodukt der höhermolekularen ist.

Besonders zweckmäßig for die technische Anwendung ist die Verwendung der Feststoffmatrix mit an ihrer Oberfläche immobilisiertem Aprotinin in säulenchromatographischen Verfahren, Die verwendete Urokinase-Rohlösung sollte 2000 bis 10000 IE Urokinase, zweckmäßig 3000 bis 5000IE Urokinase je ml Lösung enthalten, bei einer Reinheit von 200 bis 2000IE und zweckmäßig von 300 bis 1000IE Urokinase' je mg vorhandener Proteine.

Als poröse Feststoffmatrix mit hoher spezifischer Oberfläche können verschiedene Harze eingesetzt werden, beispielsweise solche auf der Basis von Zellulose, von Agarose oder von Dextranen oder auf der Basis von copolymeren Additionsprodukten von Polyacrylamiden und Agrose. Selbstverständlich können auch andere Feststoffmatrices eingesetzt werden. Hauptvoraussetzung ist die Fähigkeit, mit dem Aprotinin entweder dir Jet oder über Bindungsvermittler kovaler.te Bindungen, einzugehen. Solche Bindungsvermittler sind beispielsweise die ε-Aminocapronsäure, Divinylsulfon und verschiedene bis-Oxirane.

Die Feststoffmatrix kann, wie dies oft geschieht, zuvor aktiviert werden, z. B. mit BrCN.

Zur Aufarbeitung von Rohurin ist das erfindungsgemäße Verfahren nicht geeignet Die Konzentration an Urokinase ist in einer solchen Lösung zu gering. Die erfindungsgemäß verwendete Uiokinase-Rohlösung kann durch Zugabe von verschiedenen Salzen, beispielsweise NaCI oder KCi, auf eine Gesamtsalzkonzentration von 04 bis 1 m gebracht werden.

Vor der eigentlichen Adsorption wird das Adsorptionsmittel, speziell wenn es in einer Säule vorliegt, mit einem flüssigen Medium bei einem pH- <Vert von 6 bis 9 und einer Gesamtsalzkonzentration von 0,5 bis 1 m konditioniert Als Puffersubstanzen können die bekannten Phosphatpuffer oder Tris-Puffer und andere eingesetzt werden. Als Salze für die Konditionierung eignen sich NaG, KCl und andere ähnliche Verbindun

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Nach der Adsorption der Urokinase an der Feststoffmatrix mit dem gebundenen Aprotinin und vor der Elution der Urokinase wird die beladene Feststoffmatrix gewaschen. Hierfür kann eine 0,5 bis 1 m NaCI-Lösung verwendet werden. Die Zwischenspülung dient vor allem der Entfernung von unerwünschten Proteinen auu der Feststoffmatrix. Es kann so lange gespült werden, bis das austretende Medium bei einer Wellenlänge von 280nm optisch inaktiv ist, d.h. praktisch kein Protein mehr anzeigt

Als Elutionsmittel kann eine Lösung von 0,5 bis 1 m NaCI oder KCI dienen. Da die Elution erfindungsgemäß bei einem pH-Wert <4,5 ausgeführt werden muß, körnen Lösungen der oben genannten Salze in den angegebenen Konzentrationen bei einem pH-Wert von 2 bis 4,5 eingesetzt werden. Die Lösungen können z. B. durch Zugabe von Essigsäure oder HCI auf diesen pH-Wert eingestellt werden.

Dem Elutionsmittel können auch an und für sich bekannte Elutionshilfsmittel, wie Aminosäuren, beispielsweise Lysin oder Arginin, zugesetzt werden.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Urokinase-Lösungen erhalten, die die Urokinase in hoher Konzentration und Reinheit enthalten. In bezug auf die Konzentration und/oder die Reinheit der Urokinase können Verbesserungen gegenüber der Ausgangssubstanz um den Faktor 100 erreicht werden. Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Urokinase-Lösungen können eine Reinheit von über 50 000IE Urokinase je mg vorhandener Proteine besitzen. Solche Reinheiten gelten heute allgemein als genügend hoch, um das Produkt direkt klinisch anwenden zu können. Zu den genannten Vorteilen kommt die schon erwähnte Tatsache, daß die erfindungsgemäß gewonnene Urokinase ein einheitliches Molekulargewicht von ungefähr 54 000 aufweist

Zur Erläuterung der Mengen- und Konzentrationsverhältnisse der Urokinase-Gewinnurj sind nachfolgend tabellarisch verschiedene Werte zusammengestellt:

Tabelle

Material	Verfahrensschritte	Reinheit	Ausbeuten	Volumina
		[It Urokinase	[IE Urokinase]	[Litcrl
		pro mg Proteine)	(bezogen auf I Liter
			Ausganjjslösung)
Urin	Adsorption		8000	10000
Urokinase-	erfindungsgemäßes	300 bis I 000	8000	25
Rohlösung	Verfahren
Reinkonzentrat	Depyrogenation,	30000 bis 100000	5000	abhängig von
	andere Verfahren			Verfahren

Das erfindungsgemäße Verfahren wird anhand der folgenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

500 ml einer Urokinase-Rohlösung, enthaltend 12 · 10⁶IE Urokinase, d.h. 24000IE Urokinase je ml Lösung mit einer Reinheit von 630IE Urokinase je mg Proteine, wurden über eine 11 Agarose-Aprotinin-Säule perkoliert Die Säule war zuvor mit 0,1 m Tris-Puffer auf pH 8 konditioniert worden. Die Konditionierflüssigkeit enthielt außerdem 04 m NaCI. Nach der Adsorption wurde die Säule mit der gleichen Konditionierflüssigkeit gespült, bis die austretende Spülflüssigkeit bei 280 nm eine optische Dichte von weniger als 0,100 aufwies. Anschließend wurde die Säule mit I I 04 m NaCI-Lösung gespült.

Die adsorbierte Urokinase wurde mit einer Lösung von 04 m NaCl, die mit HCI auf pH 24 eingestellt war, eluiert

Es wurden 14 Liter Eluat erhalten, die insgesamt 8 160 000IE Urokinase enthielten (Ausbeute 68%). Die Reinheit betrug 53 000IE Urokinase je mg Proteine.

Beispiel 2

4,21 einer Urokinase-Rohlösung mit insgesamt 22 260 000IE Urokinase, d. h. 5200 IE Urokinase je ml Lösung und einer Reinheit von 370IE Urokinase je mg vorhandener Proteine wurden über eine 1,51 Säule aus Agarose-E-Aminocapronsäure-Aprotinin perkoliert Die Säule war zuvor mit 0,02 m Phosphat-Puffer auf pH 7,2 konditioniert worden. Die Puffer-Lösung enthielt außerdem 1,0 m NaCI. Das beladene Harz wurde mit 31

der genannten Puffer-Lösung und darauf mit 21 1,0 m NaCI-Lösung gespült. Die adsorbierte Urokinase wurde dann mit einer 1,0 m NaCI-Lösung, die mit Essigsäure auf einen pH-Wert von 3,9 eingestellt worden war, eluiert

Es wurden 21 Urokinase*Lösung erhalten, die insgesamt 15 915 000IE Urokinase enthielten, was einer Ausbeute von 71,5% entspricht. Die Reinheit der erhaltenen Lösung betrug 61 500IE Urokinase je mg Proteine.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung von Urokinase in hoher Konzentration und Aktivität aus vorgereinigten und aufkonzentrierten Urokinase-Rohlösungen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine poröse Feststoffmatrix mit hoher spezifischer Oberfläche, an die fiber kovalente chemische Bindungen Aprotinin gebunden ist, mit einem ι ο flOssigen Medium vom pH 6 bis 9 und einer Gesamtsalzkonzentration von 0,5 bis 1 m behandelt, die konditionierte Matrix bei pH > 6 mit der Urokinase-Rohlösung in Berührung bringt, die Matrix nach der Adsorption der Urokinase zur Entfernung unerwünschter Proteine einer Zwischenspülung unterwirft und darauf die adsorbierte Urokinase bei pH < 4,5 eluiert

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Urokinase-Rohlösung über 2ü eine Säule aus der porösen Feststoffmatrix mit an sie kovalent gebundenem Aprotinin führt

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß dabei die poröse Feststoffmatrix aus einem Harz auf der Basis von Zellulose, Agarose oder von Dextranen oder auf der Basis von copolymeren Additionsprodukten von Polyacryla miden und Agarose besteht

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet daß dabei das Aprotinin entweder direkt über kovalente Bindungen oder über Bindungsverrnittler an die Feststoffmatrix gebunden ist

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet daß man dabei eine mit Aktivierungsmitteln aktivierte Feststoffmatrix verwendet a

6. Verfahren nach Anspruch 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet daß man die Konditionierung der Feststoffmatrix mit Phosphatpuffern oder Tris-Puffern und NaCI oder KCl bewirkt

7. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Elution bei pH 2 bis 4,5 und einer Salzkonzentration von 0,5 bis 1 m durchführt, wobei der pH-Wert mit Essigsäure oder HCl und die Salzkonzentration mit NaCl oder KCI eingestellt ist

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Elutionsmittel Hilfsmittel zugibt