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CN1192780B - 新的脂解酶 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了新的脂解酶，该脂解酶在一个周期的洗涤中能够从猪脂沾污的布样除去实质量的猪脂。优选的脂解酶是可以通过重组DNA技术制备的Humicola lanuginosa脂酶的变体。该酶用于去垢剂组合物中是有利的。

Description

新的脂解酶
发明所属技术领域
本发明涉及新的脂解酶，该脂解酶在一个周期的洗涤中能够除去实质量的脂肪物质。
发明背景
许多年来，脂解酶都用作去垢剂酶，即从衣服以及其它纺织品除去类脂或脂肪污物。例如，曾建议用各种微生物脂酶作为去垢剂酶。这样的脂酶的例子包括Humicola lanuginosa脂酶(如在EP 258 068和EP 305 216中所描述的)、Rhizomucor miehei脂酶(如EP 238 023和Boel，等，脂类23，701-706，1988中所描述的)、Absidia sp.脂解酶(WO96/13578)、假丝酵母属脂酶(如C.antarctica脂酶，例如在EP 214 761中描述的C.antarctica脂酶A或B)、假单胞菌属脂酶(如产碱假单胞菌(Ps.alcaligenes)和类产碱假单胞菌(Ps.pseudoalcaligenes)脂酶，例如在EP 218 272中所描述的，洋葱伯克霍尔德氏菌(Ps.cepacia)脂酶，如在EP 331 376中所描述的)、在WO95/14783中的公开的Pseudomonas sp.脂酶、芽孢杆菌属脂酶(如枯草芽孢杆菌脂酶(Dartois等，1993)、嗜热脂肪芽孢杆菌脂酶(JP64/744992)以及短小芽孢杆菌脂酶(EP 91 00664))。
而且，描述了许多克隆的脂酶，包括由Yamaguchi，S.等，1991描述的沙门柏干酪青霉(Penicillium camembertii)脂酶、白地霉(Geotricumcandidum)脂酶(Schimada，Y.等，1989，Schrag，J.D等(1991)自然351，761)以及各种根霉属脂酶(如R.delemar脂酶(R.D.Joerger和M.J.Hass(1993)，脂类28，81-88)、雪白根霉(R.niveus)脂酶(W.Kugimiya等(1992)，生物科学生物技术与生物化学，5，716-719)、爪哇根霉(R.javinicus)(W.Uyttenbroeck等(1993)，Biol.chem.Hoppe-Seyler 374，245-254)以及具有与其它根霉属脂酶实质上相同的序列的米根霉(R.oryzre)(Haas，M.J.，Allen，J.和Berka，T.R.(1991)基因，109，107-113)。
建议作为去垢剂酶的其它类型的脂解酶包括所谓的角质酶，例如，如在WO 88/09367中所描述的源自门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)的角质酶，或源自Fusarium solani pisi的角质酶(如在WO 90/09446中所描述的)。
近年来曾试图制备用于去垢剂用途的具有改进的性质的脂酶变体。例如，WO 92/05249公开了具有改进的性质的脂酶变体，其中某些野生型脂酶的特征通过其氨基酸序列的特异性的，即定点的修饰改变。更具体地说，描述了这样的脂酶变体，其中修饰了亲本脂酶的所谓的脂接触区的一个或多个氨基酸残基。
WO 94/01541描述了具有改进的性质的脂酶变体，其中修饰了在与脂酶活性位点相当的关键位置的氨基酸残基。
EP 407 225公开了具有对解蛋白酶提高的抗性的脂酶变体，该变体通过特异性地限定的氨基酸修饰制备。
EP 260 105描述了水解酶，其中一个离活性部位之内的氨基酸残基被取代。
WO 95/35381公开了Pseudomonas sp.脂酶变体，具体来说是荚壳伯克霍尔德氏菌(P.glumae)以及类产碱假单胞菌脂酶变体，修饰该脂酶变体以提高酶表面的疏水性。
WO 96/00292公开了Pseudomonas sp.脂酶变体，具体来说是荚壳伯克霍尔德氏菌(P.glumae)以及类产碱假单胞菌脂酶变体，修饰该脂酶变体以提高酶对阴离子表面活性剂的相容性。
WO 95/30744公开了突变体脂酶如Pseudomonas sp.脂酶，修饰该脂酶以增加表面活性剂抗性。
WO94/25578公开了这样的突变体脂酶，该突变体脂酶包含至少一个蛋氨酸的取代，该蛋氨酸对应于在类产碱假单胞菌脂酶中的位置21，具体来说是亮氨酸、丝氨酸或丙氨酸。
通过使用定点诱变导致特异性氨基酸残基的修饰构建所有上述的脂酶变体。该氨基酸残基基于其类型或其在亲本脂酶的二级或三级结构的位置选择。
构建给定的蛋白质的突变体或变体的替代方法基于随机突变。例如，美国4,898,331和WO 93/01285公开了这样的技术。
WO 95/22615公开了具有改进的洗涤性能的脂解酶变体，该变体通过下述方法制备：对编码亲本脂解酶的DNA序列进行随机诱变，筛选与亲本脂解酶相比对钙具有降低的依赖性和/或具有对一种去垢剂或一种或多种去垢剂组分提高的耐受性的变体。
WO95/09909特别公开了化学修饰的脂酶或脂酶突变体，该脂酶或脂酶突变体与相应的修饰酶相比具有更高的pI。
迄今为止描述的所有去垢剂脂解酶的缺点是：它们在一次以上的洗涤周期后发挥出最好的脂肪去除作用，这大概是因为已知的脂解酶(当沉积在待除去的脂肪污物上时)在干燥期间比洗涤期间活性高(Gormsen等，去垢剂第3次世界会议论文集，AOCS出版社，1993，198-203)。这有如下的实际后果：至少需要两个洗涤周期(由充足的干燥时期分开)以获得实质上除去脂肪污物。
按照一些脂解酶的描述，它们能够在第一个洗涤周期期间除去脂肪物质。这样，WO 94/03578公开了一种去垢剂组合物，该去垢剂组合物除了各种去垢剂组分之外还包含一种酶，该酶被宣称在洗涤过程中的主要周期期间表现出实质上的脂解活性。依其所述，表现出上述活性的脂解酶的例子包括茎-特异性角质酶(如得自Fusarium solani pisi、Fusarium roseumculmorum、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和(Alternaria brassicicola)。然而，当在实际的洗涤条件下试验时，这些酶中没有一种能在一个周期的洗涤过程中除去实质量的脂肪污物(参考下文的实施例)。
这样，存在对脂解酶的需要，该脂解酶在实际的洗涤条件下在一个周期的洗涤过程中能够除去实质量的脂肪污物。
发明概述
本发明的发明人令人惊奇地鉴别并构建了新种类的脂解酶，该脂解酶在实际的洗涤条件下在一个周期的洗涤期间能够除去实质量的脂肪物质。本发明基于这个发现。
因此，本发明第一个方面涉及脂解酶，当该脂解酶存在于本文定义的去垢剂组合物A和/或B中时，在一个周期的洗涤测定中能够从猪脂沾污的布样除去比没有该酶的相同去垢剂组合物至少多15％的猪脂，该一个周期的洗涤测定包括使每烧杯7个猪脂沾污的棉花布样(9×9cm)在恒温箱Terg-O-to-Meter(TOM)中进行一个周期的洗涤，每个烧杯包含1000ml的水，在水中包含3.2mM Ca2+/Mg2+(以5∶1的比率)以及5g/l所说的去垢剂组合物，pH 10，还包含12500LU/l的脂解酶，在30℃的温度下进行20分钟的洗涤处理，其后在流动自来水下冲洗15分钟并于室温下在绳子上晾干(linedrying)过夜，随后通过Soxhlet提取来提取并定量测定在布样上的脂肪物质。
去垢剂组合物A和/或B以及一个周期的洗涤测定在本文的材料和方法部分进一步描述。
本发明组成令人惊奇的事实的第一种真实的证明，该事实是可能开发(鉴别和/或产生)第一洗涤脂解酶。这样，迄今为止被认为是不可能的事情(基于全世界的许多研究小组的几年的广泛研究(通过上述的在本领域中提出的有希望的专利申请的数目反映)显示出变得可能了。
本发明的发明人开发了产生第一洗涤脂解酶的十分方便的和成功的方法。
因此，本发明的第二个重要方面涉及一种制备第一洗涤突变的脂解酶的方法，该方法至少包括下列步骤：
(a)诱变(方便的是随机诱变)编码亲本脂解酶的DNA序列以形成各种突变的DNA序列；
(b)在宿主细胞中表达形成的突变的DNA序列，
(c)筛选表达突变的脂解酶的宿主细胞，该突变的脂解酶与亲本脂解酶相比，对钙的依赖性降低和/或对去垢剂或去垢剂组合物的耐受性提高；和
(d)在从步骤(c)中形成的脂解酶中选择突变的脂解酶，该突变的脂解酶当以12500LU/l的浓度存在于去垢剂组合物A和/或B中时，在上述的一个周期的洗涤测定中，能够比没有该酶的相同去垢剂组合物从猪脂沾污的布样多除去至少15％的猪脂。
本发明的另一个方面涉及制备第一洗涤突变的脂解酶的方法，该方法至少包括下列步骤：
(a)通过组合下列组分构建突变的DNA序列：编码第一亲本脂解酶的DNA序列，编码第二亲本脂解酶的DNA序列，可有可无的编码第三(任选的)亲本脂解酶的DNA序列，要组合的这些DNA序列具有足够的同源性以使得整个DNA序列或部分之间可以发生重组，
(b)在宿主细胞中表达形成的突变的DNA序列，和
(c)选择由突变的DNA序列编码的突变的脂解酶，该突变的脂解酶当以12500LU/l的浓度存在于去垢剂组合物A或B中时，在上述的一个周期的洗涤中，能够比没有该酶的相同去垢剂组合物从猪脂沾污的布样多除去至少15％的猪脂。
在优选的实施方案中，组合按照本发明的第二和第三方面的方法，即从第二方面的方法形成的突变的脂解酶用作按照第三方面的方法的亲本酶。
本发明的另一个方面还涉及包含编码如上所述的第一洗涤脂解酶的DNA序列的DNA构建体。
本发明的另一个方面还涉及携带DNA构建体的重组表达载体、用所说的DNA构建体或载体转化的细胞以及一种产生第一洗涤脂解酶的方法，该方法通过在有利于该酶产生的条件下培养所说的细胞，然后从培养物中回收该酶。
本发明的最后一个方面涉及第一洗涤脂解酶作为去垢剂酶(特别是用于洗涤或餐具洗涤)的用途，本发明还涉及包含该酶的去垢剂添加剂与去垢剂组合物。
附图的简要描述
图1显示了质粒pYESHL，
图2：质粒pAO1，
图3：质粒pAHL，
图4和5：PCR诱变方法的图解描述，
图6：质粒pJSO37；
图7：质粒pDM177的构建，
图8：曲霉属载体pCaHj485的构建
图9显示了反射犁头霉(Absidia reflexa)ATTC44896脂酶的起点序列。划线的是成熟NL127的第一氨基酸丝氨酸的三联体密码子以及终止密码子。
图10显示了在酵母表达载体pTiK05中的反射犁头霉ATTC44896序列。
图11显示了交配因子α1信号序列
脂酶结构的定义和背景
本申请中所用的术语的定义
在本发明中，术语“脂解酶”指根据生物化学和分子生物学国际联合会(IUBMB)在酶分类号E.C.3.1.1(羧酸酯水解酶)下分类的酶(1992)。这样，脂解酶对存在于下列脂类中的至少一种的至少一种类型的酯键显示出水解活性：甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯、磷脂(所有种类)、硫酯、胆甾醇酯、蜡酯、角质、软木脂、合成酯等(参见在E.C.3.1.1上下文中论及的不同类型的酯键)。
这样，脂解酶可以，例如，是通常称为脂酶、磷脂酶、酯酶或角质酶的酶。术语“脂解酶”意在包括天然产生的酶以及这样的酶，该酶与天然产生的酶相比，通过，例如酶的一个或多个氨基酸残基的修饰或通过化学修饰来修饰。在本发明的上下文中，后一类型的脂解酶称为变体。
在本发明的上下文中，酶在一个周期的洗涤中除去实质量的脂肪物质的能力也称为第一洗涤作用，一个周期的洗涤作用、整个洗涤(through-the-wash)作用等。类似地，本发明的脂解酶(能够在一个周期的洗涤中有效除去实质量的脂肪物质)称为第一洗涤脂解酶、整个洗涤脂解酶、一个周期洗涤脂解酶等。
在本发明的上下文中，用于定义本发明的给定的脂解酶的猪脂除去能力的术语“去垢剂组合物A和/或B”是指：当脂解酶存在于去垢剂组合物A或B中或者A和B中时，脂解酶具有指定的猪脂除去能力。
在本发明的上下文中，术语“亲本酶”旨在包括天然产生的酶以及这样的酶的变体。因此，本术语用于鉴别有待按照本发明的方法(该方法用于制备第一洗涤脂解酶)修饰的开始物质，不论所说的开始物质是天然产生的酶还是这样的酶的变体。
有关按照第二方面的方法的术语“各种突变的序列”是指：至少两种，但优选地是更多的不同序列，如至少10、至少50、至少100、至少1000个序列产生于诱变。
术语“随机诱变”可以以常规的方式理解为：在亲本酶的随机位点引入一个或多个突变或在亲本酶的选择的位置或区引入随机氨基酸残基。随机诱变通常伴随着筛选，该筛选使得可以选择突变的脂解酶，该脂解酶与亲本酶相比具有改进的性质。用于引入随机突变以及筛选改进的性质的适合技术在下面详尽讨论。
有关本文公开的脂解酶的术语“令人满意的洗涤性能”是指该酶当在适合的洗涤测定中或洗涤相关的测定(如在下面材料和方法以及实施例5中描述的测定)中试验时，与市售的脂解酶(得自Genencor的Lumafast和Lipomax，得自Novo Nordisk的Lipolase和Lipolase和Liposam(得自Showa Denko))相比具有改进的性能。改进的性能是指除去脂污物能力和/或降低的钙依赖性、对去垢剂或去垢剂组分改进的耐受性、提高的疏水性、有意义的底物特异性等。
在本发明的上下文中，当用于指对突变的脂解酶的筛选，尤其是对对脂酶底物(该脂酶底物具有超过大约6-8个原子的烃链(ffa-部分))表现出酶促活性的脂解酶的筛选时，术语“对钙降低的依赖性”是指：当在类似的条件下试验时，突变的脂解酶需要更低量的Ca2+以表现出与亲本酶相同程度的活性和/或稳定性。换句话说，在无钙的情况下与亲本酶相比，该酶的稳定性和/或活性提高。稳定性可以，例如，通过无钙条件下预温育和/或在游离Ca2+缺乏/存在时DSC(示差扫描量热法)测定剩余活性来测定。优选地，本发明的突变的脂解酶是实质上不依赖于钙的存在而表现出酶的活性，尤其是pH高于8时。
当用于与筛选突变的脂解酶相关的情况时，术语“对去垢剂或去垢剂组分的改进的耐受性”是指突变的脂解酶在比亲本脂解酶更高浓度的去垢剂或去垢剂组分中是活性的。
在本发明的上下文中，术语“去垢剂”是指通常用于洗涤或餐具洗涤的去垢剂成分的混合物。相似地，“去垢剂组分”是指在去垢剂或餐具洗涤组合物中通常发现的组分或成分，其特定的例子在下面标题为“去垢剂组合物”的部分中给出。
脂解酶结构与结构术语定义的背景
已确定了许多脂解酶的3D结构。已经发现该结构在由中央β-折叠、包括活性丝氨酸残基的亲核弯头(elbow)的一条链末端组成的蛋白质的核心中具有共同的基元(Ollis等，1992)。脂解酶包含脂接触区，该脂接触区是具有增加的表面疏水性的表面，该表面在水解时或水解过程中与脂底物相互作用。对于包含盖(lid)的脂解酶，当该酶由底物激活时(该盖由此被取代)，典型地形成脂接触区。对于不包含盖的脂解酶，通常很少或没有相应的实质性运动导致脂接触区的产生。该脂底物是单一脂底物分子的聚合物。脂接触区包含结合区，在水解前单一脂底物分子结合到该结合区上。结合区包含酰基-结合疏水裂缝与所谓的水解袋，该水解袋定位在活性位点丝氨酸周围，认为在其中发生了脂底物的水解。脂接触区包括一个或多个蛋白质二级结构单元，即当脂解酶被活化时，环序列、其氨基酸残基在水解期间接触、结合到底物上和/或与底物相互作用。
脂接触区可以，例如，从通过适合的计算机程序产生的所说的脂解酶的三维结构识别。脂接触区可以通过寻找定义该区的相关特征的结构来鉴别，所说的脂接触区包括定位在活性位点残基顶部的区并包含盖结构(对于包含盖的脂解酶)，当其打开时产生包含狭窄的疏水结合袋的疏水表面。失活的和活化的H.lanuginosa脂解酶的构象分别在WO 92/05249的图1和2中显示。
根据氨基酸残基，H.lanuginosa脂解酶的脂接触区由氨基酸残基21-25、36-38、56-62、81-98、110-116、144-147、172-174、199-213与248-269限定。这些残基在脂解酶与脂底物相互作用的计算机模型模拟基础上鉴别。对于具有与H.lanuginosa脂解酶实质上相同结构的脂解酶，如由Rhizomucor miehei、米根霉、沙门柏干酪青霉和Absidia sp.产生的脂解酶(参见上述“发明背景”部分)，脂接触区由占据与对上述H.lanuginosa酶给定的氨基酸残基同源位置的氨基酸残基组成。同源位置可以通过相关的氨基酸序列的序列对比寻找序列相似的基团鉴别(如利用UWGCG GAP程序)，但是可以更方便地通过比较相关酶的结构或结构模型进行。更具体地说，这些酶的脂接触区由下列残基组成(所利用的编号参考成熟酶中的氨基酸残基，除非特别指出，其序列由上述发明背景部分中公开的参考文献来看是明显的)：
沙门柏干酪青霉：21-25、36-38、56-62、81-98、109-115、143-146、172-174、198-212、247-280；
米根霉：29-33、39-41、57-62、81-98、109-115、143-146、175-177、202-216、245-269。
Rhizomucor miehei：29-33、39-41、56-61、80-97、108-114、142-145、174-176、201-215、245-269；
Absidia sp.脂酶：29-33、39-41、56-61、80-97、108-114、142-145、171-173、198-212与239-263，上述编号基于成熟酶，具有下列N-末端序列：SSKQDYR。整个序列通过(SEQ ID No.98)是明显的。
作为取代或除了基于同源性的脂接触区鉴别之外，该脂接触区可通过下列步骤鉴别：
a)计算活化的酶的3-D分子结构的疏水向量(hydrophobic vector)；
b)在线性序列的活性部位丝氨酸后，制作通过第二个氨基酸残基的CA-原子(Cα-原子)与向量垂直的切口；
c)包括所有在向量指向的切口侧具有至少一个原子的残基；
d)从这些残基选择那些在蛋白质的表面5埃之内具有至少一个原子的残基。
通过加和所有用于具有至少15％的表面可及性的残基的残基向量从蛋白质结构计算疏水向量(Lee等，分子生物学，55，379-400(1971))。残基向量的起点定义为该残基的CA-原子，其方向通过侧链质量中心。每个残基向量的大小定义为水与更疏水的溶剂之间转移的残基相对自由能(参见，例如，Creighton，蛋白质，W.Freeman&公司，p151(1984))。每种残基的表面可及性利用Connolly程序计算(Lee等，op.cit.)。
利用上述方法和/或各种序列的序列对比(这从Svendsen等，Biochimica et Biophysica Acta，1259(1995)9-17是明显的)，鉴别了分离自各种Pseudomonas sp.的下列的脂解酶的脂接触区(利用的编号参考在以上提及的出版物中提出的成熟酶的氨基酸残基(Svendsen等(1995))：
洋葱伯克霍尔德氏菌脂酶：15-36、110-167、209-266、281-304；
类产碱假单胞菌脂酶：15-35、106-163、200-232、250-271；
荚壳假单胞菌(Pseudomonas glumae)：15-36、110-167、209-266、281-304；
门多萨假单胞菌(SD702)脂酶：19-39、111-166、213-244、258-279(序列通过WO 95/14783是明显的)，
Pseudomonas sp.脂酶：17-37、109-161、208-239、253-274(SEQ ID No.99)。
Pseudomonas wisconsinensis脂酶：13-34、106-161、200-242、250-270(该序列通过WO96/12012是明显的)
不包含盖结构的脂解酶的脂接触区可以从核心的拓扑结构测定，这在脂解酶的三维结构的结构或模型中评价。按这种方式，Fusarium solanipisi脂解酶的脂接触区测定为氨基酸残基40-50、78-91、119-121、147-154、171-193(这在成熟酶的基础上评价)。
一些脂解酶也包含表面环结构，即盖，它是脂接触区的部分。当脂解酶处于灭活形式时，表面环结构覆盖活性丝氨酸。当酶被激活时，表面环结构变换就暴露出活性丝氨酸残基。表面环结构具有面向结合袋的优越的疏水内部表面以及优越的亲水外部表面。
具有表面环结构的脂解酶的例子是由Humicola lanuginosa、Rhizomucor miehei、Rhizopus sp.、沙门柏干酪青霉和Absidia sp.、许多Pseudomonas sp.(如洋葱伯克霍尔德氏菌、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeroginosa)、莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)(参见上述“发明背景”部分)、皱落假丝酵母(Candida rugosa)(Grochulski.P等(1993)，生物化学杂志，268，p12843)以及人胰脂肪酶(在Winkler等，自然，343，p771-74(1990)中描述)产生的脂解酶。
通过Humicola lanuginosa DSM 4109产生的脂解酶的表面环结构通过位置82-96的氨基酸残基限定。具有实质上相同的三维结构的脂解酶的表面环结构(见上)通过占据与H.lanuginosa脂解酶同源的位置的氨基酸残基，即81-98(对于沙门柏干酪青霉脂酶)、82-99(对于米根霉)、80-97(对于Rhizomucor miehei)、80-97(对于Absidae sp脂酶)定义。
通过Pseudomonas sp.产生的脂解酶的一些代表性的表面环结构是在SEQ ID No.99中显示的：荚壳伯克霍尔德氏菌：135-155，洋葱伯克霍尔德氏菌135-155，类产碱假单胞菌132-152)，Pseudomonas sp脂酶(SD705)
Figure G1996196233X19940529D000111
129-149。
发明详述
本发明的第一洗涤脂解酶
优选地，本发明的脂解酶能够产生比上述的脂解酶更高的猪脂除去能力。因此，在优选的实施方案中，当以12500LU/l的浓度在本文描述的一个周期的洗涤测定中试验时，包含本发明的脂解酶的去垢剂组合物A和/或B分别比不包含脂解酶的去垢剂组合物A和/或B多除去至少15％，如至少20％的猪脂。在更优选的实施方案中，当在本文描述的一个周期的洗涤测定中试验时，所述脂解酶是这样的脂解酶，当存在于去垢剂组合物A和/或B中时使得去垢剂组合物比没有该脂解酶的去垢剂组合物A和/或B多除去至少25％，如至少30％或35％或40％或50％的猪脂。
可以认为用于上述的一个周期的洗涤测定的脂解酶浓度(即12500LU/1)对实际应用是高的，但是为了使分析变化最小化被选择用于测定目的。一种更实际的浓度是1250LU/1，在替代的实施方案中，该浓度可以用来定义本发明的脂解酶除去猪脂的能力。因此，在另一个实施方案中，所述脂解酶是这样的脂解酶，该脂解酶当以1250LU/l的浓度在本文描述的一个周期的洗涤测定中试验时，能够比不包含脂解酶的去垢剂组合物A和/或B多除去至少15％，如至少20％的猪脂。在更优选的实施方案中，当以1250LU/l的浓度存在于去垢剂组合物A和/或B中时，在本文描述的一个周期的洗涤测定中试验时，该脂解酶使得去垢剂组合物比没有该脂解酶的去垢剂组合物A和/或B多除去至少25％，如至少30％或35％的猪脂。
在优选的实施方案中，当在本文描述的一个周期的洗涤测定中试验时，本发明的第一洗涤脂解酶能够除去：
■当以1250LU/l的浓度存在于去垢剂组合物A中时，可比不包含该酶的去垢剂组合物A从猪脂沾污的布样多除去至少15％的猪脂，
■当以12500LU/l的浓度存在于去垢剂A中时，可比不包含该酶的去垢剂组合物A从猪脂沾污的布样多除去至少40％的猪脂，
■当以1250LU/l的浓度存在于去垢剂组合物B中时，可比不包含该酶的去垢剂组合物B从猪脂沾污的布样多除去至少15％的猪脂，
■当以12500LU/l的浓度存在于去垢剂B中时，可比不包含该酶的去垢剂组合物B从猪脂沾污的布样多除去至少15％的猪脂。
在本文的实施例5中显示了本发明的脂解酶与WO 94/03578中所描述的、宣称具有整个洗涤效果的脂解酶除去脂肪能力的比较。看起来在一个周期的洗涤中，本发明的酶比现有技术的酶能除去实质上多的猪脂。通过使用相同的测定进行了酶之间的比较。
本发明的脂解酶可以是任何以上提及的脂解酶的类型，如对酯和/或磷脂键表现出活性的水解酶，尤其优选的是：该酶是对甘油单酯、甘油二酯和/或甘油三酯中的酯键表现出活性的脂解酶和/或对角质表现出活性的脂解酶。这样的酶通常被认为很可能作为去垢剂酶。
在材料和方法部分与下面的实施例5中，给出了鉴别第一洗涤脂解酶的适合的测定。这些测定可以用于鉴别天然产生的第一洗涤脂解酶。更具体地说，为了鉴别按照本发明的天然产生的第一洗涤脂解酶，从预期产生脂解酶的适合有机体(如与在以上“发明背景”部分中给出的或稍后在“亲本脂解酶”部分中讨论的有机体在分类学上有关的有机体，或在为了流行需要有机体产生脂解酶的环境中发现的有机体)回收候选酶的脂解酶。其后，使回收的酶进行本文公开的第一洗涤脂解酶测定。
尽管本发明的第一洗涤脂解酶可以是新的天然产生的酶(基于其第一洗涤性能鉴别)，目前优选的酶是修饰的酶，即通过对亲本脂解酶进行诱变和/或化学修饰以产生具有第一洗涤活性的修饰的脂解酶而制备的酶。亲本脂解酶可以是具有第一洗涤活性的酶(该酶可以通过诱变或化学修饰改进)或可以是没有本文定义的第一洗涤活性的酶。在一个实施方案中，有利的是，亲本酶本身具有令人满意的洗涤性能或甚至是第一洗涤性能，然后通过突变改进后者的性质。具有令人满意的洗涤性能(但不必是第一洗涤性能)的亲本酶可以利用下文实施例6中所描述的测定选择。
亲本酶的氨基酸残基的化学修饰可以，如按照WO 95/09909中公开的原理进行，本文一并参考了其内容。例如，化学修饰可以通过把胺配体(如胺化的糖、胺化的醇或胺化的葡糖胺或其异构形式)偶联到酶中谷氨酸或天冬氨酸残基的羧基上完成。化学修饰可以通过在本领域中已知的方法(如在WO 95/09909中所描述的方法)进行。化学修饰可以对酸基团进行以除去负电荷。
优选地进行亲本脂解酶的诱变以改进亲本酶的底物结合亲和性。更具体地说，已经发现，提高的底物结合亲和性可以导致获得第一洗涤活性。目前考虑的是，通过使亲本酶的表面所带的负电荷减少可以改进底物结合亲和性。因此，可以进行诱变以用具有正电荷的氨基酸残基取代定位于亲本酶表面的至少一个中性氨基酸残基、缺失定位在亲本酶表面的带负电荷的氨基酸残基，或用中性(包括疏水性)或带正电氨基酸残基取代定位于亲本酶的表面的带负电的氨基酸残基。位于酶表面的氨基酸残基可以通过使用在上述定义部分中的Conolly程序鉴别。在一个优选的实施方案中，进行诱变以除去氨基酸残基D和/或E，和/或方便地通过取代插入R、K、W、F、Y、I、L。用于改进的底物结合亲和性的适合试验在下文实施例11中描述。
上述从负电到正电表面改变的第一洗涤作用可以通过引入优化结构或稳定性的交换改进和/或稳定。这样，例如把脯氨酸残基引入酶表面可以导致提高的解蛋白和/或热稳定性；引入亲水氨基酸的残基(如谷氨酸和/或天冬氨酸)可以增加阴离子洗涤剂稳定性，引入疏水氨基酸的残基可以增加酶的吸附/亲和性。引入上述类型的氨基酸残基可以简单地通过把氨基酸残基插入酶表面的适合位置中或通过取代位于这样的位置的氨基酸残基完成。
目前认为：本发明的第一洗涤脂解酶是亲本脂解酶的变体，该亲本脂解酶包含至少一个突变，但是典型地包含多个突变，突变优选地定位在酶表面。变体可以包含更多的突变，如至少2、3、4或5个突变，如在1-20、1-15、1-12、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5或1-4个突变的范围中，或不削弱酶的酶促活性的任何数量的突变。
已经发现在本文公开的H.lanuginosa脂酶的脂接触区之内以及在外部的突变对达到第一洗涤活性是重要的。因此，携带突变的本发明第一洗涤脂解酶可以通过亲本酶的脂接触区外部的至少一种氨基酸残基的修饰和/或通过所说的区外部的至少一种氨基酸残基的添加和/或通过亲本酶的脂接触区内部的至少一种氨基酸残基的修饰和/或通过所说的区内部的至少一种氨基酸残基的添加来构建。
因此，在另一个实施方案中，本发明的脂解酶是这样的酶，该酶通过亲本酶的脂接触区中的至少一种氨基酸残基的修饰、缺失或取代，或者向所说的区添加至少一种氨基酸残基从亲本酶制备。在另一个实施方案中，脂解酶是这样的酶，该酶通过亲本酶的脂接触区外部的至少一种氨基酸残基的修饰、缺失或取代，或者向所说的区添加至少一种氨基酸残基从亲本酶制备，该氨基酸残基优选地位于亲本酶的表面。优选地进行在脂接触区之内或之外的突变以改进形成的修饰酶的底物结合亲和性，方便地是如上所述地除去负电荷。
虽然按照上述原理的定点诱变(并与试验形成的酶变体的第一洗涤活性组合)可以用于产生第一洗涤脂解酶，目前优选地是利用其它的产生第一洗涤脂解酶的方法。发现随机诱变，尤其是定域随机诱变以及同源基因的体内重组对于该目的特别令人感兴趣-这些方法在下面进一步详尽地描述。
在C-和/或N-末端的非结构部分修饰的第一洗涤脂解酶
令人惊奇地发现：通过把至少一种N-末端和/或C-末端肽添加应用在成熟形式的亲本酶的非结构部分上或其之内，或者通过把其它改变引入亲本成熟酶的C-末端和/或N-末端的非结构部分中可能把第一洗涤效果赋予亲本脂解酶或明显地提高第一洗涤效果。
因此，在进一步高度优选的实施方案中，本发明的第一洗涤脂解酶是亲本脂解酶的变体，该变体与亲本酶相比，在亲本酶的N-和/或C-末端或其内的非结构部分受到修饰。
在本发明的上下文中，术语“修饰”是指：i)把适当的肽添加用于亲本酶，或ii)在亲本成熟酶的C-末端和/或N-末端的非结构部分之内一个或多个氨基酸残基缺失或被其它氨基酸残基取代，或iii)亲本酶通过i)或ii)的组合修饰。在本发明的上下文中，以这种方法修饰的本发明的第一洗涤脂解酶可以称为是本发明的修饰酶。
在本发明的上下文中，术语“肽添加”是指把一列一个或多个连续的氨基酸残基添加到亲本酶的N-和/或C-末端的其中之一或两端(即熔合到亲本酶的第一和/或最后一个氨基酸残基上)或插入到亲本酶的N-和/或C-末端非结构部分之内。修饰酶可以在亲本脂解酶的N-末端或C-末端其中之一或N-和C-末端两端包含肽添加。如果把肽添加应用到亲本酶的N-和C-末端两者，在任何一端的肽添加可以具有相同的氨基酸序列或不同的氨基酸序列。可以插入或添加相同或不同的肽添加的多个拷贝。
术语“适当的肽添加”用来指所用的肽添是这样的肽添加，该肽添加能够影响第一洗涤性能或改进的第一洗涤性能。肽添加的“适合性”可以通过分别比较分析应用了肽添加的修饰的酶与相应的亲本酶的第一洗涤性能来检查。洗涤性能可以，例如，通过在材料和方法部分中所描述的一个周期洗涤测定来测定。
本发明涉及通过肽添加完成的改进的第一洗涤性能是(至少部分是)由于修饰的脂解酶的对其脂底物增加的亲和性(虽然这可能不是唯一原因)。因此，在一个优选的实施方案中，肽添加是赋予修饰的酶对其脂底物增加的亲和性的肽添加。
术语“成熟酶”以其通常的含义使用，即通过所说的生产有机体在表达和翻译后加工(以除去原-和/或前-序列)之后产生的酶的活性形式。当酶是分泌的酶时，成熟的酶通常是分泌后形成的酶的形式。更具体地说，这是指从最初翻译的酶(即未加工的酶)除去前-和原-肽序列(如果存在)。
术语“非结构部分”分别指N-和C-末端部分；该部分分别在折叠成熟酶的最前或最后结构单元如α-螺旋或β-折叠结构的外部。在所说的酶的三维结构或模型中，易于鉴别非结构部分。典型地，非结构部分包含组成酶的氨基酸序列的最前或最后大约1-20个氨基酸残基。对于具有与H.lanuginosa脂解酶类似的三维结构的酶，可以在所说的酶的对应于H.lanuginosa脂解酶的“非结构部分”的部分插入。
H.lanuginosa脂解酶的非结构部分通常包含成熟酶的最前或最后大约1-20个氨基酸残基。
目前相信：提高所需的第一洗涤作用的肽添加的能力取决于，例如，待修饰的亲本酶的一致性、肽添加的结构(包括长度)、肽添加对整个脂解酶结构的影响、肽添加的氨基酸残基的性质或官能度等。肽添加能够提供所需的作用的先决条件当然是，包含肽添加的修饰酶在适合的宿主有机体中是可表达的。下列通常的考虑事项对设计适合的肽添加是适当的：
肽添加的长度：已经发现：包含不同数目的氨基酸残基的肽添加能够提供所需的第一洗涤作用，这样，就不可能确定按照本发明使用的肽添加中存在的氨基酸残基的确切数目。本发明还考虑到，确定氨基酸残基数量的上限特别要根据肽添加对产生的修饰酶表达、结构和/或活性的影响。相信肽添加可以包含实质数量的氨基酸残基，然而，不是所有这些氨基酸残基对于所需的第一洗涤作用是需要的(即使肽添加包含实质数量的氨基酸残基，仅一小部分氨基酸残基对于提供所需的功能是需要的，这小数量可以称为肽添加的功能部分)。关于肽添加的氨基酸残基的数量的下限的主要考虑因素通常是数量应该足以提供所需的第一洗涤作用。
肽添加可以包含单个氨基酸残基或氨基酸链，该氨基酸链包含从2至500个氨基酸(如从1至200，或从2至100)，优选地从2至50(如3至50)，更优选地从7至45，更优选地是1至15(如1至10或1至7)，尤其是4至10(如4至7个氨基酸)。
稳定性：应该优选地选择肽添加以提供具有稳定的肽添加与亲本酶可接受的结构稳定性的修饰脂解酶。例如，其自身形成结构单元(如α-螺旋或β-折叠)的肽添加可以稳定形成的修饰酶，这样用于本发明的上下文。能够形成这样的结构的肽序列在本领域中是已知的。另外，可以通过在本发明的修饰脂解酶中引入半胱氨酸桥提供提高的结构稳定性。例如，如果肽添加的至少一个氨基酸残基是半胱氨酸残基(被定位以能够与酶成熟部分的半胱氨酸残基形成共价结合)，可以建立在肽添加与酶的成熟部分之间的半胱氨酸桥。如果在成熟酶中不存在适合的半胱氨酸，可以方便地通过取代亲本酶的氨基酸(该氨基酸被认为对活性不重要)把半胱氨酸插入到所说的亲本酶的适当位点。
此外，合乎需要的是，选择肽添加的至少一个氨基酸残基以使肽添加对用于表达修饰脂解酶的宿主细胞的解蛋白酶的解蛋白降解作用敏感性降低。例如，肽添加可以包含至少一个，优选地至少两个脯氨酸残基。优选地，肽添加包含1-5，如1-4或1-3个或两个或一个脯氨酸残基。脯氨酸残基位于解蛋白的裂解位点或其相邻位点。另外，肽添加可以是对修饰脂酶提供蛋白酶稳定环(如在EP 407 225或WO 93/11254中所描述的)的肽添加。
肽添加的氨基酸残基的性质：如上所述并不限于任何理论，目前相信：改进的性能至少部分是因为通过肽添加提供的修饰脂解酶对底物增加的亲和性。具体地说，人们相信：可以在带负电脂表面和带正电的和/或在修饰酶中存在的疏水氨基酸残基之间获得有用的静电相互作用。因此，特别优选的是，本发明的修饰酶包含这样的肽添加，该肽添加具有至少一个正电荷，如至少2、3、4或更多个正电荷，或用其它表达方式来说，其中肽添加的实质量的氨基酸残基是带正电和/或疏水的。
相似地，为了在亲本酶的非结构末端减少负电荷，优选地是从选择的亲本酶的非结构的N-末端或C-末端部分除去至少一个(如两个或更多)带负电的氨基酸残基，具体地说是从构建的亲本脂酶的部分除去1-5个最前或最后N-末端或C-末端的氨基酸残基(如1-4或1-3或1-2)。带负电的氨基酸残基也可以被中性的、带正电的或疏水氨基酸残基除去或取代。例如，待除去的带负电的氨基酸残基可以是E或D，它们可以被带正电的氨基酸残基R、K或H、中性的氨基酸残基S、T、G或Q或者疏水的氨基酸残基A、I、W F或L取代。同样地，可以用上面定义的带正电的或疏水的氨基酸残基取代亲本酶的非结构的N-末端或C-末端部分的中性氨基酸残基。
因此，本发明的修饰脂解酶除了或作为N-末端和/或C-末端延伸的替代外还可以在亲本酶的非结构C-末端和/或N-末端包含突变，该突变具有缺失或用带正电或中性的氨基酸残基或用疏水氨基酸残基取代所说的非结构部分的带负电的氨基酸残基。
如果肽添加存在于亲本酶的N-和C-末端，在每个末端或其之内的肽添加可以具有相同的或不同的氨基酸序列。
肽添加的适宜性试验：利用给定的肽添加(例如，在上述原理基础上设计的)的作用可以通过构建包含肽添加的修饰脂解酶、试验形成的酶的第一洗涤活性的性质来试验。
肽添加可以以下列方法概述。
第一残基(从外部残基计数)命名为“a”，第二命名为“b”，第三命名为“c”等。这样，在N-末端添加的情况下，第一个氨基酸残基命名为“a”，在C-末端添加的情况下，最后一个氨基酸残基命名为“a”。
在本发明的一个重要实施方案中，肽添加由1至7个氨基酸组成。这样的肽添加(可以运用于亲本酶的N-和/或C-末端)可以表示为：
a(一个氨基酸肽添加)
a-b(两个氨基酸肽添加)
a-b-c(三个氨基酸肽添加)
a-b-c-d(四个氨基酸肽添加)
a-b-c-d-e(五个氨基酸肽添加)
a-b-c-d-e-f(六个氨基酸肽添加)
a-b-c-d-e-f-g(七个氨基酸肽添加)
每个字母定义一个氨基酸残基。
a、b、c、d、e、f和g可以独立地是任何氨基酸，该氨基酸包括丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、甲硫氨酸(M)、甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)。
在特定的实施方案中，a、b、c、d、e、f和g独立地是下列氨基酸之一：
a：Leu，Ile，Val，Trp，Phe，Ser，Arg，Cys，或Lys，
b：Leu，Ile，Val，Trp，Phe Ser，Pro，Arg，Lys，Cys或His，
c：Leu，Ile，Val，Trp，Phe，Ser，Pro，Arg，Cys，或Lys.
d：Leu，Ile，Val，Trp，Phe Ser，Pro，Arg，Cys，或Lys.
e：Leu，Ile，Val，Trp，Phe，Pro，Arg，Lys，Ala，Glu，Cys，或Asp，
f：Leu，Ile，Val，Trp，Phe，Pro，Arg，Lys，Ala，Glu，Cys，或Asp，
g：Leu，Ile，Val，Trp，Phe，Pro，Arg，Lys，Cys，或Met.
在优选的实施方案中，a、b、c、d、e、f或g中至少一个(如一个、两个、三个或四个)是带正电氨基酸(即Arg(R)或Lys(K))或疏水氨基酸(即Leu、Ile、Val、Trp或Phe)。
如上所述，依赖于选择的宿主细胞，通常相信重要的是：肽添加包含至少一个脯氨酸残基，为了在通过选择的宿主细胞加工酶期间保护修饰脂解酶抗解蛋白降解。合乎需要的是：脯氨酸残基占据肽添加的位置2(即b)和/或3(即c)或临近所需的裂解点的位置(即据信是发生由所述的宿主细胞进行加工的位置)。因此，在一个实施方案中，肽添加的b和c是脯氨酸。
在本发明的另一个实施方案中，a-b是SP(Ser-Pro)、A-P或Q-P。如果肽添加包含更多的氨基酸残基(如4至7个氨基酸)，肽添加具有通式SPcd、SPcde、SPcdef、SPcdefg或APcd、APcde、APcdef、APcdefg或QPcd、QPcde、QPcdef、QPcdefg。在每个这样的公式中，c、d、e、f和g可以是任何氨基酸。然而，优选的是以上提及的氨基酸的组。
在另一个实施方案中，a-b包含至少一个带正电的氨基酸(即Arg和Lys)或疏水氨基酸残基(即Leu、Ile、Val、Trp和Phe)。
特别是，运用于亲本脂解酶的肽添加可以优选地是下列的氨基酸残基或肽之一：
Arg(R)，或Lys(K)，或Leu(L)，或Ile(I)，或
Val(V)，或Trp(W)或Phe(F)，或
Arg-Pro(RP)，或
Lys-Lys(KK)，或
Arg-Lys(RK)，或
Lys-Arg(KR)，或
Arg-Arg(RR)，或
Arg-Arg-Pro(RRP)，或
Arg-Pro-Val-Ser-Gln-Asp(RPVSQD)
Ser-Pro-Ile-Arg-Met(SPIRM)，或
Ser-Pro-Ile-Arg-Ala-Arg(SPIRAR)，或
Ser-Pro-Ile-Arg-Pro-Arg(SPIRPR)或
Ser-Pro-Ile-Arg-Glu-Arg(SPIRER)，或
Ser-Pro-Ile-Arg-Lys(SPIRK)，或
Ser-Pro-Ile-Lys-Lys(SPIKK)，或
Ser-Pro-Ile-Arg-Arg-Pro(SPIRRP)，或
Ser-Pro-Pro-Arg-Arg(SPPRR)，或
Ser-Pro-Iso-Pro-Arg(SPIPR)，或
Ser-Pro-Arg-Pro-Arg(SPRPR)，或
Ser-Pro-Ile-Arg(SPIR)，或
Ser-Pro-Ile-Arg-Arg(SPIRR)，或
Ser-Cys-ile-Arg-Arg，(SCIRR)，或
Ser-Pro-Ile-Arg-Pro-Arg-Pro(SPIRPRP)，或
Ser-Cys-Ile-Arg-Pro-Arg-Pro(SCPIRPRP)，或
Ser-Pro-Arg-Arg-Pro-Arg-Thr(SPRRPRT)，或
Ser-Pro-Phe-Arg-Pro-Lys-Leu(SPFRPKL)，或
Ser-Pro-Pro-Arg-Arg-Pro(SPPRRP)，或
Ser-Pro-Ile-Arg-Arg-Glu(SPIRRE)，或
Ser-Pro-Pro-Arg-Pro-Pro(SPPRPP)，或
Ser-Pro-Pro-Arg-Pro-Arg(SPPRPR)，或
Ser-Pro-Pro-Trp-Trp-Pro(SPPWWP)，或
Ser-Pro-Pro-Trp-Arg-Pro(SPPWRP)，或
Ser-Pro-Pro-Arg-Trp-Pro(SPPRWP)，或
Ser-Pro-Pro-Arg-Trp-Pro(SPPRWP)，或
Ser-His-Trp-Arg-Arg-Trp(SHWRRW)，或
Ser-His-Trp-Arg-Lys(SHWRK)，或
Ser-His-Trp-Arg-Arg(SHWRR)，或
Thr-Ala-Ile-Arg-Pro-Arg-Lys(TAIRPRK)，
Ser-Thr-Arg-Arg-Pro-Arg-Pro(STRRPRP)，
Gly-Pro-Ile-Arg-Pro-Arg-Pro(GPIRPRP)，或
Leu-Pro-Phe-Arg-Gln-Arg-Pro(LPFRQRP)，或
Ser-Arg-Ser-Arg-His-Asn-Ala(SRSRHNA)，或
Ile-Pro-Ile-Arg-Pro-Arg-Arg(IPIRPRR)，或
Ser-Thr-Arg-Arg-Pro-Arg-Pro(STRRPRP)，或
Thr-Ala-Ile-Arg-Pro-Arg-Lys(TAIRPRK)，或
Trp-Arg-Trp-Arg-Trp-Arg(WRWRWR)，或
Gln-Pro-Ile-Arg-Arg(QPIRR)，或
Ser-His-Trp-Gln-Gln(SHWQQ)，或
Ser-Ala-Leu-Arg-Pro-Arg-Lys(SALRPRK).
按照本发明也涉及的是包含超过7个氨基酸(如8至15个氨基酸)的添加。
这样的肽可以概括为：
a-b-c-d-e-f-g-h(8氨基酸肽)
a-b-c-d-e-f-g-h-i(9氨基酸肽)
a-b-c-d-e-f-g-h-i-j(10氨基酸肽)
a-b-c-d-e-f-g-h-i-j-k(11氨基酸肽)
a-b-c-d-e-f-g-h-i-j-k-l(12氨基酸肽)
a-b-c-d-e-f-g-h-i-j-k-l-m(13氨基酸肽)
a-b-c-d-e-f-g-h-i-j-k-1-m-n(14氨基酸肽)
a-b-c-d-e-f-g-h-i-j-k-l-m-n-o(15氨基酸肽)。
a至o可以是如上所述的二十种氨基酸任一种。
关于包含1至7个氨基酸残基的肽添加，a-g链可以如上限定。
以上提及的h、i、j、k、1、m、n、o可以是任何氨基酸，优选地任何下列氨基酸：Arg、Lys、Ala、Val、Trp、Ile、Phe、Ser或Pro。
这样的添加的特定例子列出如下：
Arg-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro(RPRPRPRP)，或
Ser-Ser-Thr-Arg-Arg-Ala-Ser-Pro-Ile-Lys-Lys(SSTRRASPIKK)，或
Ala-Trp-Trp-Pro-Ser-Pro-Ile-Arg-Pro-Arg-Pro(AWWPSPIRPRP)，或
Ala-Pro-Pro-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro(APPPRPRPRPRP)，或
Ala-Pro-Pro-Pro-Arg-Thr-Arg-Pro-Arg-Pro-Arg-Ser(APPPRTRPRPRS)，或
Ser-Pro-Lys-Arg-Lys-Pro-Arg-Pro(SPKRKPRP)，或
Ser-Gln-Arg-Ile-Lys-Gln-Arg-Ile-Lys(SQRIKQRIK)，或
Ser-Pro-Pro-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro(SPPPRPRP)，或
Ser-Pro-Ile-Arg-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro-Arg SPIRPRPRPR，或
Ser-Pro-Ile-Arg-Lys-Ala-Trp-Trp-Pro(SPIRKAWWP)，或
Ala-Pro-Pro-Pro-Lys-Ala-Ser-Pro-Arg-Gln-Arg-Pro(APPPKASPRQRP)，或
Ser-Pro-Ile-Arg-Pro-Arg-Pro-Ser-Pro-Ile-Arg-Pro-Arg-Pro-Arg(SPIRPRPSPIRPRP)，或
Ser-Pro-Pro-Arg-Trp-Pro-Arg-Arg(SPPRWPRR)，或
Ser-Pro-Pro-Arg-Trp-Pro-Arg-Trp(SPPRWPRW)，或
Ser-Pro-Pro-Arg-Trp-Pro-Trp-Arg(SPPRWPWR)，或
Ser-Pro-Pro-Trp-Arg-Pro-Arg-Arg(SPPWRPRR)，或
Ser-Pro-Pro-Trp-Trp-Pro-Arg-Trp(SPPWWPRW，或
Ser-Pro-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SPPWWPWR)，或
Ser-Pro-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Trp(SPPWWPWW)，或
Ser-Pro-Pro-Trp-Pro-Arg-pro-Arg-Pro(SPPWPRPRP)，或
Ala-Pro-Pro-Pro-Arg-Pro-Arg-Leu-Leu-Pro-Ile-Ser(APPPRPRLLPIS)，或
Ala-Pro-Pro-Pro-Thr-Arg-Gln-Arg-Gln-Ser-Pro(APPPTRQRQSP)，或
Ala-Pro-Pro-Pro-Arg-Thr-Ile-Pro-Arg-Ser-Ser-Pro(APPPRTIPRSSP).
在任一上述特定的肽添加中(不论是包含1至7还是1至15个氨基酸残基)(其中位置“a”是Ser、Ala、Arg、Lys或Pro)，Ser可以用Ala、Arg、Lys或Pro取代，Ala可以用Ser、Arg、Lys或Pro取代，Arg、Lys或Pro可以用Ala或Ser取代。
需强调的是：上述的肽添加可以在N-末端和/或C-末端。具有N-和C-末端肽添加的修饰脂解酶的例子包括上述特定地提到的肽添加的组合。这样的两个具体例子是N-末端添加SPIRPRP与C-末端添加RRP或RR。
除了上述特定的肽添加之外，现已发现适合的添加可以简单地通过包含一部分或整个通常与所说的亲本脂解酶相关的原肽(propeptide)序列组成或包含它。这样，例如，关于第一洗涤H.lanuginosa脂解酶变体，适合的肽添加可以包含或由SPIRR-即H.lanuginosa脂解酶序列的正常的原肽序列的部分组成。
如果把肽添加插入亲本酶的非结构部分，它可以取代所说的非结构部分的一个或多个氨基酸残基。例如，肽添加可以取代一个或多个占据N-末端前面(如1-5)的氨基酸残基和/或酶的最后(如1-5)的氨基酸残基(即C-末端的1-5个氨基酸残基)的氨基酸残基。例如，肽添加可以从亲本酶的任一端取代氨基酸残基1和/或2和/或3和/或4和/或5等。
当亲本酶是在其结构的成熟部分包含氨基酸修饰的H.lanuginosa脂酶的变体时，它具有特别的利益：把上述肽添加(运用于N-末端)中的任一个与成熟亲本酶的第一个氨基酸残基(即1E)的缺失组合。
把肽添加应用到亲本脂解酶的方法
尽管本发明的第一洗涤脂解酶可以通过把合成产生的肽添加添加(融合或插入)到所说的亲本脂解酶中来制备，目前优选的是通过以下方法制备本发明的修饰酶：i)修饰编码亲本酶的核苷酸(优选地是DNA)序列以编码应用到亲本酶N-和/或C-末端的所需的肽添加(如通过把编码肽添加的核酸(优选地是DNA)序列插入到编码亲本酶的核酸(优选地是DNA)序列中的有关位置)，ii)在适合的表达系统中表达形成的修饰核酸(优选地是DNA)序列，以及iii)回收形成的修饰酶。
在本发明的上下文中，术语“应用于”是指把添加融合到成熟酶的N-和/或C-末端(如融合到最前或最后的氨基酸残基上)或插入到成熟酶的N-末端和/或C-末端的非结构部分中。
许多酶由“前原酶(prepro-penzyme)”表述，即由成熟酶、分泌信号肽(即前肽(prepeptide))和原肽组成的酶。前原酶在胞内加工以分泌进发酵培养基，从其中可以分离和/或纯化成熟酶。添加至亲本酶的肽可以通过把编码所需的肽添加上游(N-末端肽添加)和/或下游(C-末端肽添加)的核酸序列应用于编码亲本酶的DNA序列进行。
插入应该以这样的方法进行：通过宿主细胞在酶的转录、翻译、加工后表达并分泌所需的修饰酶(即具有所需的肽添加)。术语“加工”在上下文中是指除去前肽与原肽(当然，除了当原肽与所需的肽添加相同之外。这一点将在下面进一步说明)。
可以把下游序列(编码C-末端添加)插入到编码亲本酶的DNA序列和终止密码子之间。然而，如果未加工的DNA序列在C-末端包含编码原肽的DNA序列，编码肽添加的DNA序列的插入/添加也可以发生在分别编码原肽和成熟酶的DNA序列之间。
在大多数情况下，可能通过把编码肽添加的DNA序列插入编码原肽或前肽(如果原序列不存在)的DNA序列和编码成熟酶的DNA序列之间来延伸亲本酶的上游。
当然要选择所说的编码肽添加的DNA序列以使之与用于产生本发明的第一洗涤脂解酶的表达系统的密码子优先相匹配。
编码肽添加的DNA序列的插入/添加可以通过分子生物学领域任何熟练技术人员已知的标准技术进行(参见，如Sambrook等，1989)。这包括，例如，使用特定引物的聚合酶链反应(PCR)，例如在美国专利4,683,202或R.K.Saiki et al.，(1988)，科学，239，487-491中所述。如何提供相邻DNA序列的表达和分泌描述如下。
与本发明相关，现已发现一些宿主细胞很少适宜于产生包含肽添加的第一洗涤脂解酶，其中在宿主细胞进行的翻译后或其它加工期间，可以切除肽添加的部分或整体。因此，术语“适合的表达系统”是下述表达系统(宿主细胞和任选的表达载体)，该表达系统使得包含肽添加的完整的所需的第一洗涤脂解酶的至少一部分可以产生，即不(例如，作为通过选择的宿主细胞的翻译后或其它加工的部分)除去肽添加的部分或全部(进而产生没有所需的肽添加的酶)的表达系统。采用另外的表述，优选地选择该表达系统(包括宿主细胞、培养条件和/或回收条件)在脂解酶的前、原或前原形式的大部分加工发生导致产生的酶分子的至少5％(如至少10％，如至少15％，如至少20％，如至少25％，如至少50％，如至少75％)包含所需的肽添加，如整个原序列或其实质性部分。典型地，所利用的表达系统没有或降低表现出不合需要的翻译后加工的一种或多种解蛋白活性。如同将详尽地在下面讨论的，表达系统和宿主细胞的选择取决于要产生的脂解酶。
必须注意选择用以产生本发明的第一洗涤脂解酶的适当的表达系统，其中本发明的脂解酶在其N-和/或C-末端包含肽添加(特别是当修饰的DNA序列用于这种产生时)，现已发现，当肽添加是与所说的亲本脂解酶正常相关的原肽或其部分时，可以使肽添加(这样构成部分或整个原肽序列)通过在表达系统中表达编码所说的亲本脂解酶的DNA序列来应用，所说的表达系统不能以正常方式加工翻译的多肽，进而导致酶的产生，这种酶在其加工前包含部分或整个原肽或与成熟蛋白质相关的类似肽序列。在这种情况下，原肽或类似的肽序列构成肽添加。原肽或类似的肽序列对亲本酶可以是异源或同源的，也可以存在于亲本酶的N-和C-末端。
因此，如果已经编码出亲本酶的前原形式的适合的氨基酸链，这种氨基酸链在给定的表达系统的酶加工中被切除，就可以这样应用肽添加：通过把表达宿主系统改变成这样的系统应用，在这样的系统中，所说的氨基酸链的所说的加工不发生或修饰基因序列以消除翻译后加工，如通过用一个或多个类原肽的拷贝(如本文所示的一种肽添加)使加工酶饱和，或通过改变原肽序列，如除去翻译后加工位点。在这样的情况下，在分泌期间或其后切除分泌信号前肽，产生由包含通过相应的DNA序列编码的原肽或其部分或类似的肽序列的亲本酶组成的修饰酶，即在其N-末端或C-末端伸长的脂解酶。
换句话说，包含肽添加的本发明的第一洗涤脂解酶可以通过下述方法设计和/或产生，该方法包括：
在适合于包含整个原(前)序列的至少一部分的酶产生的条件下，培养用编码亲本脂解酶(包含其原(前)序列)的DNA序列转化的宿主细胞(宿主细胞是这样的细胞，该细胞在原酶的加工中不能或无效表达进成熟酶)，回收并任选地纯化形成的修饰酶。
当转化进宿主细胞时，编码亲本脂解酶的DNA序列可以存在于表达载体中。
宿主细胞可以与亲本酶起源不同，如是另一个属，而不是衍生亲本酶的属，或可以具有另一种翻译后加工结构，而不是亲本酶的来源。由于与丝状真菌细胞相比，酵母细胞不同的加工系统，发现酵母细胞把肽添加(以原肽或其部分的形式)运用于亲本丝状真菌脂解酶(具体来说是H.lanuginosa脂解酶变体)尤其有用。用于所说目的的适合酵母细胞的例子是源自Saccharomyces sp.菌株特别是酿酒酵母，或Hansenula sp.的菌株的细胞。
在替代的和高度优选的实施方案中，包含肽添加的第一洗涤脂解酶可以通过这样的方法设计和/或产生，该方法包括下列步骤：
a)使编码具有肽添加的亲本脂解酶的DNA序列在肽添加或亲本酶C-末端或N-末端的非结构部分进行定域随机诱变，
b)在宿主细胞中表达步骤a)获得的突变的DNA序列，
c)筛选表达突变的脂解酶的宿主细胞，该突变的脂解酶与亲本脂解酶相比具有改进的性能，
d)在从步骤c)产生的突变的脂解酶中选择突变的脂解酶，当该突变的脂解酶以12500LU/l去垢剂的浓度存在于去垢剂组合物A和/或B中时，在本文所述的一个周期的洗涤测定中，能够比没有该酶的去垢剂组合物从猪脂沾污的布样多除去至少15％的猪脂。
通过这种方法产生了许多具有不同的肽添加的高度有利的第一洗涤脂解酶。待诱变的DNA上的肽添加可以由通常与亲本脂解酶相关的原序列或其部分构成或包含它们，或可以是任何其它的肽添加，如上述例举的肽添加之一。步骤a)-d)可以如下面标题为“随机诱变”和“定域随机诱变”部分描述的那样进行。
亲本脂解酶
按照本发明修饰的亲本脂解酶可以是任何起源。这样，酶可以属于哺乳动物、植物、脊椎动物或任何其它起源。然而，目前优选的是，酶是微生物起源的，其中发现许多微生物菌株可产生特定地用于去垢剂用途的酶。
更具体地说，亲本脂解酶可以源自真菌，即酵母或丝状真菌。例如，酶可以源自不整囊菌纲(Plectomycetes)的丝状真菌，优选地是散囊菌目(Eurotiales)，更优选地是如单囊菌科、Monoascaceae、Pseudoeurotiaceae和发菌科，后者包含如Emericella、曲霉属、青霉属、正青霉属、拟青霉属、Talaromyces、嗜热子囊菌属和Sclerocleista。更具体地说，亲本酶可以是源自Humicola sp.的菌株[如H.brevispora、H.lanuginosa、H.brevis var.thermoidea与H.insolens(美国专利4,810,414)]、Rhizomucor sp.的菌株[如Rh.miehei(EP 238023)]、Rhizopus sp.的菌株[如R.delemar(Hass等，1991)，基因109，107-113)、雪白根霉(Kugimiya等，(1992)生物科学生物技术生物化学56，716-719)或米根霉、Candida sp.的菌株[如皱落假丝酵母(C.cylindracea)(也称为C.rugosa)或C.antarctica(WO 88/02775)或C.antarctica脂酶A或B(EP 214761)]、Fusarium sp.的菌株[如尖镰孢(F.oxysporum(EP 130,064)或F.solani pisi(WO 90/09446)或其变体(WO 94/14964)、F.solani pisi(GB 2296 011)]、Venturia spp.的菌株[如苹果黑星菌(V.inaequalis)]、Colletotrichum spp.的菌株[如盘长孢状刺盘孢(C.gloeosporioides)或葫芦科刺盘孢(C.lagenarium)、Geotricum的菌株[如G.candidum(Schimada等，(1989)，生物化学杂志，106，383-388]、曲霉属的菌株[如黑曲霉]或Aspergillus sp.脂解酶变体(EP 167,309)，或Penicillium spp.的菌株[如小刺青霉(P.spinulosum)或沙门柏干酪青霉(Yamaguchi等，(1991)，基因103，61-67)。
在本发明的上下文中，“可源自”不仅指通过所说的有机体的菌株产生的酶，而且指由分离自这样的菌株的DNA序列编码并在用所说的DNA序列转化的宿主有机体产生的酶。而且，该术语是指这样的酶，该酶由合成的和/或cDNA起源的DNA序列编码并具有所说的酶的鉴别特征。最后，该术语是指包含所述酶的变体，例如，与天然产生的酶或同源酶相比携带一个或多个突变，其中同源酶可以是通过其它菌株或有机体天然产生的酶，这些菌株或有机体可以，例如，通过与寡核苷酸探针杂交分离，该寡核苷酸探针在任何上述酶的氨基酸或DNA序列的基础上制备(杂交条件包括：在5xSSC中预浸渍，～40℃下在20％甲酰胺、5xDenhardt’s溶液、50mM磷酸钠pH 6.8以及50g变性的声处理的小牛胸腺DNA的溶液中预杂交1小时，其后在用100M ATP添加的相同溶液中于～40℃下杂交18小时，或其它由Sambrook等，1989描述的方法)，或者该同源酶与所说的酶是免疫交叉反应的(如通过Hudson等，1989的方法测定的)。
作为亲本脂解酶特别感兴趣的是源自H.lanuginosa的菌株(如H.lanuginosa菌株DSM 4109)的脂解酶，例如，酶的成熟形式(在EP 305 216中描述)或其变体(在WO 92/05249，WO 94/01541，WO 94/14951，WO94/25577，PCT/DK94/00079(均得自Novo Nordisk A/S)中描述，本文一并参考)。
在本申请中，名称Humicola lanuginosa用于鉴别一种优选的亲本酶，即上面刚提到的亲本酶。然而，近年来，因为H.lanuginosa表现出与Thermomyces lanuginosus的形态和生理相似之处，该真菌也曾命名为Thermomyces lanuginosus(1989年首先由Tsiklinsky引入的种)。因此，可以理解：在参考H.lanuginosa时，这个术语可以用Thermomyceslanuginosus代替。对得自Thermomyces lanuginosus(或H.lanuginosa)的18S核糖体的基因DNA编码部分进行了测序。产生的18S序列与在GenBank数据库中的18S序列比较，利用parsimony(PAUP，3.1.1版，Smithsonian研究所，1993)进行系统发育分析。这清楚地把Thermomyceslanuginosus分到不整囊菌纲中，有可能是散囊菌目。按照在NCBI(生物技术信息国家中心)中的Entrez Browser，叙述了把Thermomyceslanuginosus分到如单囊菌科(Eremascaceae)、Monoascaceae、Pseudoeurotiaceae和发菌科的科中，后者包含如Emericella、曲霉属、青霉属、正青霉属、拟青霉属、Talaromyces、嗜热子囊菌属和Sclerocleista的属。
按照本发明修饰的亲本脂解酶可以源于细菌。例如，编码亲本脂解酶的DNA序列可以源自Pseudomonas spp.的菌株[如洋葱伯克霍尔德氏菌、产碱假单胞菌、类产碱假单胞菌、门多萨假单胞菌(也称为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeroginosa)、Pseudomonas wisconsinensis(WO96/12012)或莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)]、Bacillus spp.的菌株[如枯草芽孢杆菌或短小芽孢杆菌]、Streptomyces sp.的菌株[如S.scabies]。
就Pseudomonas sp.脂酶而言，现已发现得自下列有机体的脂酶具有高度同源性，如至少60％同源，至少80％同源或至少90％同源，这样考虑到属于相同科的脂酶：假单胞菌属ATCC 21808、作为市售的Pseudomonas sp.脂酶、铜绿假单胞菌EF2、铜绿假单胞菌PAC1R、铜绿假单胞菌PAO1、铜绿假单胞菌TE3285、Ps.sp.109、类产碱假单胞菌M1、荚壳伯克霍尔德氏菌、洋葱伯克霍尔德氏菌DSM3959、洋葱伯克霍尔德氏菌M-12-33、Ps.sp.KWI-56、恶臭假单胞菌IFO3458、恶臭假单胞菌IFO12049(Gilbert，E.J.，(1993)，假单胞菌属脂酶：生物化学性质和分子克隆。酶微生物技术，15，634-645)。最近洋葱伯克霍尔德氏菌重新分类为洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)，但是在本申请中定名为Ps.cepacia。
关于此点的特定例子包括假单胞菌属脂解酶，如莓实假单胞菌、施氏假单胞菌、洋葱伯克霍尔德氏菌和荧光假单胞菌(WO 89/04361)或植物伯克霍尔德氏菌(Ps.plantarii)或唐苜蒲伯克霍尔德氏菌(Ps.gladioli)(美国专利4,950,417)或产碱假单胞菌和类产碱假单胞菌(EP 218 272，EP 331 376或WO 94/25578(公开了具有突变M21S、M21L或M21A的类产碱假单胞菌脂解酶的变体)、在EP 407 225中公开的Pseudomonas sp.变体，或Pseudomonas sp.脂解酶(如门多萨假单胞菌脂解酶，在WO 88/09367和美国专利5,389,536中描述，其变体在美国专利5,352,594中描述)。
其它特定的例子包括芽孢杆菌属脂解酶，如得自枯草芽孢杆菌的脂解酶(Dartois等，(1993)Biochemica et Biophysica Acta 1131，253-260)或嗜热脂肪芽孢杆菌(JP 64/7744992)或短小芽孢杆菌(WO 91/16422)和色杆菌属脂解酶(具体地说是源于粘稠色杆菌(Chromobacterium.viscosum)的脂解酶)。
可作为按照本发明的亲本脂解酶的易于得到的商业脂解酶的特定例子包括
Figure G1996196233X19940529D000301
Figure G1996196233X19940529D000302
Ultra(可从Novo Nordisk A/S得到)。
特定地涉及的、按照本发明可修饰的其它脂解酶的例子是(即门多萨假单胞菌脂解酶)和
Figure G1996196233X19940529D000304
(即产碱假单胞菌脂解酶)、得自Unilever的腐皮镰孢(Fusarium solani)脂酶(角质酶)、得自Solvay酶(US 5427936、EP 528828)的Bacillus sp.脂酶以及
Figure G1996196233X19940529D000305
(得自Showa Denko的门多萨假单胞菌脂酶)以及在WO 95/06720中描述的Pseudomonas sp.脂酶(对该脂酶进行了测序并发现其具有在SEQ ID NO 99中显示的氨基酸序列)。
重点是：按照本发明修饰的亲本脂解酶可以是任何以上提及的脂解酶及其任何变体、修饰体或截短体。特定地涉及的这样的亲本酶的例子包括在WO92/05249、WO 94/01541、WO94/14951、WO94/25577、WO95/22615中描述的酶以及在EP 407 225中描述的蛋白质工程操作的脂酶变体；在美国专利5,352,594中描述的蛋白质工程操作的门多萨假单胞菌脂酶；在WO 94/14964中描述的角质酶变体；在EP专利167,309中描述的曲霉属脂解酶变体以及在WO 95/06720中描述的Pseudomonas sp.脂酶。
特定的第一洗涤H.lanuginosa脂解酶变体
为了易于参考，本发明的特定变体通过使用下列命名法描述：最初的氨基酸:位置:替代的氨基酸。
按照这种命名法，例如，在位置96天冬氨酸由缬氨酸的取代可显示为：
Asp 96Val或D96V
在相同的位置中的天冬氨酸的缺失显示为：
Asp 96＊或D96＊
其它的氨基酸残基如赖氨酸的插入显示为：
Asp 96ValLys或D96VK
通过正号分离多个突变，即：
Asp 96Val+Glu 87Lys或D96V+E87K
分别代表在位置96和87的突变，通过缬氨酸和赖氨酸取代天冬氨酸和谷氨酸。
当一个或多个替代的氨基酸残基可以插入给定的位置时，表示为D96V，N或
D96V或D96N
进而，当本文鉴别出的适合于修饰的位置没有建议任何特定的修饰时，可以理解为：任何氨基酸残基可以取代在该位置中的氨基酸残基。这样，例如，当提到(但是未指定)在位置96中的天冬氨酸修饰时，可以理解为天冬氨酸可以缺失或被任何其它氨基酸(即R、N、A、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V任一)取代，或另外的氨基酸残基插入该位置。
最后，当本文鉴别出亲本H.lanuginosa脂解酶的突变时，可以理解为包括在脂解酶中占据同源位置的氨基酸残基的突变，这种酶具有和H.lanuginosa酶实质上相同的结构或可以与其进行序列对比的结构或氨基酸序列(如本文论及的米根霉、Rhizomucor miehei、Absidia sp.和沙门柏干酪青霉脂解酶)。同源位置可以通过结构之间的比较轻易地鉴别。
H.lanuginosa脂解酶变体的特征是至少两个不同的亲本变体的组合，已发现或指出这些变体具有如上所述的良好的洗涤性能或其它有意义的性质。好的洗涤性能可以如实施例6所述测定。亲本变体之间的组合可以是随机的或特定的。关于本发明，已经发现：当要组合的亲本变体包含下列位置中至少一个的突变时，可以获得特别有意义的结果，但是优选地是下列位置中的多个：1、2、3、4、5、19、49、53、56、57、59、62、83、85、90、94、96、97、99、101、102、111、116、126、127、137、167、170、181、187、210、221、225、234、239、249、252、256、263、264、267，如至少一个或优选地多个下列突变：E1K、E1S、V2G、S3T、Q4P、D5E、A19T、A49P、Y53C、E56K、D57G、G59V、D62R、S83T、S85F、I90F、N94K、F95L、D96A、D96H、D96L、L97M、E99K、N101S、D102Y、D111N、S116P、Q126R、K127C、D137G、D167G、S170P、F181L、V187A、E210K、E210V、W221L、W221A、G225P、D234R、D234Y、E239C、Q249R、I252L、P256T、G263A、L264Q、T267R。可以理解：上述突变或突变的位置可以存在于相同的亲本脂解酶中，但是优选地存在于待组合的各种不同亲本脂解酶中。
尤其是，已经发现：本发明的第一洗涤H.lanuginosa脂解酶可以是至少两个下列亲本H.lanuginosa脂解酶变体或这些变体的部分的组合：
(a)E56R+D57L+I90F+D96L+E99K
(b)E56R+D57L+V60M+D62N+S83T+D96P+D102E
(c)D57G+N94K+D96L+L97M
(d)E87K+G91A+D96R+I100V+E129K+K237M+I252L+P256T+G263A+L264Q
(e)E56R+D57G+S58F+D62C+T64R+E87G+G91A+F95L+D96P+K98I
(f)E210K
(g)S83T+N94K+D96N
(h)E87K+D96V
(i)N94K+D96A
(j)E87K+G91A+D96A
(k)D167G+E210V
(l)S83T+G91A+Q249R
(m)E87K+G91A
(n)S83T+E87K+G91A+N94K+D96N+D111N
(o)N73D+E87K+G91A+N94I+D96G
(p)L67P+I76V+S83T+E87N+I90N+G91A+D96A+K98R
(q)S83T+E87K+G91A+N92H+N94K+D96M
(s)S85P+E87K+G91A+D96L+L97V
(t)E87K+I90N+G91A+N94S+D96N+I100T
(u)I34V+S54P+F80L+S85T+D96G+R108W+G109V+D111G+S116P+L124S+V132M+V140Q+V141A+F142S+H145R+N162T+I166V+F181P+F183S+R205G+A243T+D254G+F262L，
(v)N94K，D96A，Q249R，
(w)E87K，G91A，D96W，D102N
适于组合不同的亲本变体的方法在下面标题为“编码脂解酶的DNA序列的组合”部分描述。一种特别适合的方法是在本文材料和方法部分中描述的方法。在另一个实施方案中，本发明的第一洗涤脂解酶是H.lanuginosa脂解酶的变体(其氨基酸序列在SEQ ID No.1中显示)，该变体包含至少一个下列位置的突变，但是优选地是在下列位置的多个突变：1、2、3、4、5、19、49、53、56、57、59、62、83、85、90、94、96、97、99、101、102、111、116、126、127、137、167、170、181、187、210、221、225、234、239、249、252、256、263、264、267，如至少一个或优选地多个下列突变：E1K、E1S、V2G、S3T、Q4P、D5E、A19T、A49P、Y53C、E56K、D57G、G59V、D62R、S83T、S85F、I90F、N94K、F95L、D96A、D96H、D96L、L97M、E99K、N101S、D102Y、D111N、S116P、Q126R、K127C、D137G、D167G、S170P、F181L、V187A、E210K、E210V、W221L、W221A、G225P、D234R、D234Y、E239C、Q249R、I252L、P256T、G263A、L264Q、T267R。
在更特定的实施方案中，本发明的第一洗涤脂解酶是H.lanuginosa脂解酶的变体(其氨基酸序列在SEQ ID No.1中显示)，其中至少一个下列的氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代：
A49、G59、S85、I90、S116、Q126、D137、S170或W221。
虽然上述鉴别的氨基酸残基可以由任何其它19种氨基酸残基取代，但优选氨基酸残基是如下取代：A49P、G59V、S85F、I90F、S116P、Q126R、D137G、S170P或W221L取代，或被属于与被插入的氨基酸残基相同的电荷基团(参见下面的定义)的氨基酸残基取代，如A49T取代A49P。如果带负电的氨基酸残基被取代，如D137，优选的是被属于正电荷基团或中性基团的氨基酸残基取代(如D137G、N、K)，定义如下：
负电荷基团：D、E
正电荷基团：K、R、H
中性基团：I、C、S、T、P、W、M、G、A、P、N、Y、Q、L、V
注意到在下列位置包含突变的变体能够表现出第一洗涤活性或改进的洗涤性能：
D57X+N94(K或R)+D96X+L97X+Q249(K或R)
N94(K或R)+D96X+L97X+Q249(K或R)
N94(K或R)+D96X+Q249(K或R)
D137X+D167X+E210X+W221X
D137X+D167X+E210X
I90X+D96X+E99X+V187X
I90X+D96X+E99X
I90(F或W或Y)+D96X+E99X
E56X+D57X+D62X+S85X+D96X+D102X+E210X N94(K或R)+F95L+D96X+D234X，
其中X可以是任何氨基酸残基，并且可以是相同的、逐对(pairwise)相同或不同。
本发明的H.lanuginosa脂解酶变体可以包含下列的突变：
D57G+N94K+D96L+Q249R
D57G+N94K+D96L+S116P+Q249R
D57G+G59V+N94K+D96L+Q249R
D57G+N94K+D96L+S116P+S170P+Q249R
D57G+G59V+N94K+D96L+S170P+Q249R
D57G+N94K+D96L+S170P+Q249R
D167G+E210V+Q249R
E56K+D167G+E210V
D137G+D167G+E210V+Q249R
D167G+E210V+W221L+Q249R
D57G+N94K+F95L+D96H，L+Q249R
D57G+N94K+D96L+E210K
D57G+G59V+N94K+D96L+S116P+S170P+Q249R
S3R+D137G+D167G+E210V+W221L
D137G+D167G+E210V+W221L+N233R
S3R+I90F+D96L+E99K+V187A+Q249R
I90F+D96L+E99K+V187A+D233R
I90F+D96L+E99K+V187A+D234Y
I90F+D96L+E99K+V187A+T231R
I90F+D96L+E99K+V187A
D62R+I90F+D96L+E99K+V187A
I90F+D96L+E99K+V187A+N200R+R209A
I90F+D96L+E99K+V187A+T199R+N200R+R209A
D57G+D62R+N94K+D96L+Q249R
D57G+N94K+D96L+N200R+R209A+Q249R
D57G+N94K+D96L+T199R+N200R+Q249R
I90F+D96L+E99K+V187A+T199R
D57G+N94K+D96L+T199R+R209A+Q249R
I90F+D96L+E99K+V187A+Q249R
I90F+D96L+E99K+V187A+P253R
I90F+D96L+E99K+D137G+D167G+V187A+Q249R
I90F+D96L+E99K+D137G+V187A+Q249R
D96L+E99K+V187A+Q249R
V2P+N94K+D96L+Q249R
V2W+S3R+N94K+D96L+Q249R
V2R+S3R+N94K+D96L+Q249R
V2R+S3R+N94K+D96L+Q249R
V2R+S3W+N94K+D96L+Q249R
V2W+S3R+N94K+D96L+Q249R
N94K+D96L+Q249R
V2G+S3T+D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R
V2G+S3T+Q4P+D5E+D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R
V2G+D5Q+L6M+D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R
下列变体具有特殊的意义：
D57G+G59V+N94K+D96L+L97M+S116P+S170P+Q249R
A49P+D167G+E210V
E56K+D57G+D62R+S83T+S85F+D96L+D102Y+E210K
D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R
D137G+D167G+E210V+W221L
N94K+F95L+D96H+N101S+F181L+D234Y+I252L+P256T+G263A+L264Q
I90F+D96L+E99K+V187A
N94K+D96A+Q249R
A19P+D167G+E210V+W221L
N94K+D96L+L97M+Q249R
D57G+N94K+D96L+Q249R
I90F+D96L+E99K+D137G+V187A
N94K+D96L+E99K+Q249R
N94K+D96L+E99K+T231R+N233R+D234R+Q249R
N94K+D96L+E99K+D111N+F211A+G225P+Q249R+T267R
N94K+D96L+E99K+D111N+F211A+G225P+T231R+N233R+D234R+Q249R+T267R
E1K+N94K+D96L+E99K+Q249R
N94K+D96L+K223R+Q249R
N94K+D96L+E99K+N233R
N94K+D96L+E99K+T231R+N233R+Q249R
N94K+D96L+E99K+N233R+Q249R
N94K+D96L+E99K+D234R+Q249R
本发明的变体可以有利地在位置El包含另一个突变，突变是El的缺失或E被任何其它的氨基酸残基(特别是P或S)取代。
此外，上述特定的变体可以包含任何本文描述的N-末端或C-末端肽延伸，特定的例子是SPIRR、TAIRPRK、SPIRPRP、SPPRRP、RP、GPIRPRP、SRSRHNA、SALRPRK、STRRPRP、SPRRPRT、APPPRPRPLLPIS、SPIRK、SPPRPRP、WP、SPPPRPRP、SPIRRP、APPPRPRPRPR或SPIRPR。N-末端延伸可以，例如，应用于成熟亲本脂酶的氨基酸残基El或应用于氨基酸残基2-20，如成熟亲本酶的2、3、4或5，残基E1(以及任选地亲本酶的非结构部分的多个氨基酸残基，如在成熟亲本酶的2-20N-末端部分之内的氨基酸残基)被缺失。此外，可以应用肽添加，以便本文提到的肽延伸的最后氨基酸残基的一个或多个取代成熟亲本酶占据位置1、任选的位置2和其它位置的氨基酸残基。例如，肽延伸“SPPRRP”可以这样应用：用肽添加的最后“P”取代成熟亲本H.lanuginosa脂酶的E1并以“SPPRR”取代野生型原肽“SPIRR”。
当在成熟亲本酶的N-末端部分没有进行取代时，N-末端添加可以作为在酿酒酵母中表达的变体的结果应用(如果N-末端延伸和亲本酶的原肽(的一部分)相同，或更优选地通过编码亲本酶的DNA序列部分的有关修饰，其编码(前)原序列或另一种编码成熟亲本酶的氨基酸残基1的密码子的序列下游。
目前本发明最优选的变体包含：
SPIRPRP+D57G+N94K+D96L+Q249R
SPPRRP+I90F+D96L+E99K+D137G+V187A
SPIRPRP+N94K+D96L+L97M+Q249R
SPPPRPRP+N94K+D96L+L97M+Q249R
SPIRPRP+D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R
SPPRRP+I90F+D96L+E99K+V187A
SPIRPRP+D137G+D167G+E21V+W221L
E1SPIRPRP+I90F+D96L+E99K+V187A
E1SRKRKRK+I90F+D96L+E99K+V187A
E1SPRIPRIK+I90F+D96L+E99K+V187A
E1SPPRRP+D62R+I90F+D96L+E99K+V187A
E1SPPRRP+I90F+D96L+E99K+V187A+N200R+R209A
E1SPPRRP+I90F+D96L+E99K+V187A+T199R+N200R+R209A
E1SPIRPRP+D57G+D62R+N94K+D96L+Q249R
E1SPIRPRP+D57G+N94K+D96L+N200R+R209A+Q249R
E1SPIRPRP+D57G+N94K+D96L+T199R+N200R+Q249R
E1SPPRRP+I90F+D96L+E99K+V187A+T199R
E1SPIRPRP+D57G+N94K+D96L+T199R+R209A+Q249R
E1SPIRPRP+I90F+D96L+E99K+V187A+Q249R
E1SPPRRP+I90F+D96L+E99K+V187A+P253R
E1SPPRRP+I90F+D96L+E99K+D137G+D167G+V187A+Q249R
E1SPPRRP+I90F+D96L+E99K+D137G+V187A+Q249R
E1SPPRRP+D96L+E99K+V187A+Q249R
E1SPPRPR+V2P+N94K+D96L+Q249R
E1SPPWWP+V2W+S3R+N94K+D96L+Q249R
E1SPPWRP+V2R+S3R+N94K+D96L+Q249R
E1SPPRWP+V2R+S3R+N94K+D96L+Q249R
E1SPPWWP+V2R+S3W+N94K+D96L+Q249R
E1SPPRWP+V2W+S3R+N94K+D96L+Q249R
E1SPPRWP+V2R+S3W+N94K+D96L+Q249R
E1SPPRWP+N94K+D96L+Q249R
E1SPPRRP+N94K+D96L+Q249R
E1APPPRPRPRPRP+V2G+S3T+D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R
E1APPPRTRPRPRS+V2G+S3T+Q4P+D5E+D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R
E1APPPKASPRQRP+V2G+D5Q+L6M+D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R
SCIRR+N94K+D96L+E239C+Q249R
E1SPPRRP+D57G+N94K+D96L+Y53C+K127C+Q249R
E1SPPRRPR+V2R+S3P+N94K+D96L+Q249R
E1SPPWPRP+V2R+S3P+N94K+D96L+Q249R
E1SPPRRP+N94K+D96L+E99K
E1SPPRRP+N94K+D96L+E99K+Q249R
E1SPPCGRRP+N94K+D96L+E239C+Q249R
E1SPCRPRP+N94K+D96L+E239C+Q249R
SPPCRRRP+N94K+D96L+E239C+Q249R
变体在下文的实施例中公开。当N-末端延伸存在于上述特定的变体中时，命名法“El....”是指在位置1中的E由“E1”后列出的肽添加的最后氨基酸残基取代，将其余的残基融合到占据位置1的氨基酸残基。例如，“E1SPPEQP”是指氨基酸残基E1由“P”取代，将余下的残基“SPPEQ”融合到E1P上。实际上，通过用肽延伸的有关氨基酸残基取代未加工的亲本酶的氨基酸残基(-5)-(-1)并用有关氨基酸残基取代El方便地构建这样的变体，取代通过在相应的DNA序列中引入有关突变进行，其后在表达系统中产生形成的变体使得至少一部分表达的变体保持其N-末端延伸(如同本文进一步公开的)。在没有指出El取代的情况下，N-末端肽添加被简单地融合到成熟亲本酶中占据位置1的氨基酸残基上。
上述变体最初利用本发明的随机诱变和/或基因穿梭方法构建，其后确定引入的突变的特征。明显的是构建这些变体的替代方法将按照本领域中已知的方法利用适合的寡核苷酸探针基于定点诱变。
注意到，当上述特定的各突变之一被属于上述建议的突变的相同电荷基团的氨基酸残基的突变取代时，可以保持好的洗涤性能/第一洗涤活性。例如，突变N94K可以由N94R、H取代，在突变D137G或D167G中的“G”可以被属于中性基团的其它氨基酸残基之一取代等。进而，优选地是用属于正电荷基团的氨基酸残基取代中性基团的氨基酸残基，如在D137G和D167G中的“G”分别被K、R或H取代，分别形成突变D137K、R、H和D167K、R、H。
已经论及，H.lanuginosa脂解酶与其它脂解酶(如源自Rhizomucormiehei、沙门柏干酪青霉、Absidia sp.以及本文公开的各种Rhizopur sp.的脂解酶)在结构上密切相关。因此，人们相信：对应于以上提及的H.lanuginosa脂酶并引入其它在结构上有关的脂解酶的同源位置的修饰对于第一洗涤性能也是功能性的。因此，在另一方面，本发明涉及亲本脂解酶的第一洗涤变体，这种脂解酶具有可以与H.lanuginosa脂酶氨基酸序列或结构对比的氨基酸序列或三维结构(如使用UWGGG GAP程序或“结构”相似性，至少20％序列相同使得至少50％(如至少60％或70％)的间隙或全部蛋白质相似性)，修饰其氨基酸序列以引入对应于上述的H.lanuginosa脂酶的氨基酸序列的突变和/或把在野生型H.lanuginosa脂酶中发现的氨基酸残基引入所说的亲本脂解酶。在结构上或序列上同源的脂酶中修饰的氨基酸残基或位置可以从与H.lanuginosa脂酶的有关结构/序列的序列对比来鉴别。这样的变体可以通过构建第一洗涤脂解酶变体(制备自与H.lanuginosa脂酶(这样的脂解酶在上面鉴别)表现出结构和/或序列同源性的亲本脂解酶)的方法构建，该方法包括：把所说的亲本酶序列与H.lanuginosa脂酶或其第一洗涤变体进行序列对比，或叠加所说的亲本酶与H.lanuginosa脂酶或变体的结构，鉴别亲本酶中与H.lanuginosa脂酶或变体同源的位置(被认为对于达到第一洗涤活性是必要的(参见上述公开的突变)，按照t取代占据有关位置的氨基酸残基，并产生形成的变体酶。
克隆编码亲本脂解酶的DNA序列
编码亲本脂解酶的DNA序列(按照本发明从中产生第一洗涤脂解酶)可以通过使用本领域已知的方法分离自任何产生所说的亲本酶的细胞或微生物。
例如，DNA序列可以通过由预期携带所述序列的有机体建立cDNA或基因组文库，并通过常规方法筛选阳性克隆来分离。这样的方法的例子是按照标准技术(参见Sambrook等，1989)，与在亲本酶(如果序列信息可以得到)或有关的脂解酶(如果得不到亲本酶的序列信息)的氨基酸或DNA序列基础上制备的寡核苷酸探针杂交，和/或选择表达脂解活性的克隆，和/或选择产生与抗亲本脂解酶产生的抗体反应的蛋白质的克隆。
按照本发明从cDNA或基因组文库分离编码待修饰的亲本脂解酶的DNA序列的优选方法是：通过使用在亲本酶的DNA或氨基酸序列基础上制备的简并寡核苷酸探针用聚合酶链式反应(PCR)。例如，PCR可以使用在美国专利4,683,202或R.K.Saiki等(1988)所描述的技术进行。
另外，编码亲本酶的DNA序列可以用已建立的标准方法合成制备，所说的方法如由Beaucage和Caruthers(1981)描述的亚磷酰胺(phosphoamidite)方法或由Matthes等(1984)等描述的方法。按照亚磷酰胺方法，寡核苷酸在，如自动DNA合成仪中合成、纯化、退火、连接并克隆进适当的载体。
最后，按照标准的技术，编码亲本酶的DNA序列可以制备自混合的基因组和合成的、混合的合成的和cDNA或混合的基因组和cDNA起源的DNA，该DNA通过连接合成的、基因组或cDNA起源的片段(在适当的情况下)制备，片段对应于编码亲本酶的整个DNA序列的各个部分。
构建第一洗涤脂解酶变体的方法
如同从本发明的简要描述会变得明显一样，本发明人已开发了用于产生在本文所描述的一个洗涤周期测定期间能够除去实质量的脂肪物质的脂解酶的十分有效的方法。
这样，在一个高度优选的实施方案中，本发明的脂解酶是天然产生的亲本脂解酶的变体，这种脂解酶是至少包含下列步骤的方法的结果：
(a)在适合宿主细胞中表达各种起源于亲本脂解酶的突变的DNA序列；
(b)筛选表达突变的脂解酶的宿主细胞，该突变的脂解酶与亲本脂解酶相比，对钙的依赖性降低和/或对去垢剂或去垢剂组分的耐受性提高；
(c)在从步骤(b)中形成的脂解酶中选择突变的脂解酶，该突变的脂解酶当以12500LU/l的浓度存在于去垢剂组合物A或B中时，在本文所述的一个周期的洗涤测定中，能够比没有该酶的去垢剂组合物从猪脂沾污的布样多除去至少15％的猪脂。
在步骤(a)中所指的各种突变的DNA序列可以通过使编码亲本脂解酶的DNA序列进行诱变以形成突变的DNA序列来获得。尽管诱变可以通过任何适当的方法进行，如通过定点诱变，目前优选的是诱变以随机诱变形式进行。这样，通过使用随机诱变，可以产生比使用定点诱变高得多的突变DNA序列。随机诱变在下面标题为“随机诱变”的部分中进一步详细解释。在该部分中，也描述了方法的步骤(a)-(c)中的一个或多个步骤如何可以重复一次或多次以产生连续的改进。例如，使选自步骤(a)-(c)第一轮的突变的脂解酶进行该方法的第二轮，其中筛选步骤(b)包括在比第一轮筛选步骤(b)所利用的条件更严格的条件下选择，由此选择突变的脂解酶，该突变的脂解酶与第一轮产生的突变脂解酶相比，对钙的依赖性降低和/或对去垢剂或去垢剂组分的耐受性提高。
随机诱变
按照上述方法的步骤(a)进行的编码亲本脂解酶(或肽添加)的DNA序列的随机诱变可以方便地通过使用本领域已知的任何方法进行。
例如，随机诱变可以通过使用适合的物理或化学诱变剂、通过使用适合的寡核苷酸、或通过使DNA序列进行PCR产生的诱变进行。进而，随机诱变可以通过任何这些诱变剂的组合进行。
诱变剂可以，例如，是引起转换、颠换、倒位、拼凑(scrambling)、缺失和/或插入的诱变剂。
适合于本发明用途的物理或化学诱变剂的例子包括紫外(UV)照射、羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲羟胺、亚硝酸、乙基甲磺酸(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸、γ照射、1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(NTG)和核苷酸类似物。
当利用这样的试剂时，诱变典型地这样进行：在适合诱变发生的条件下，在选择的诱变剂存在下温育要诱变的编码亲本酶的DNA序列，然后选择具有所需的性质的突变的DNA。
当通过利用寡核苷酸进行诱变时，在寡核苷酸的合成期间，在要改变的位置以三个非亲本核苷酸掺入寡核苷酸。可以进行掺入以便通过降低其用量或完全避免产生这些密码子的核苷酸来避免不需要的氨基酸的密码子。可以使用技术知识状态和计算机程序以用于计算给定的氨基酸优先性的最优核苷酸混合物。可以通过利用任何发表的技术，使用例如PCR、LCR或任何DNA聚合酶和连接酶把掺入的寡核苷酸掺入编码脂解酶的DNA。
当使用PCR产生的诱变时，使化学处理的或非处理的编码亲本脂解酶的基因在提高核苷酸错掺的条件下进行PCR(Deshler 1992，Leung等，1989)。
可以使用大肠杆菌的突变体菌株(Fowler等，1974)、酿酒酵母或任何其它微生物有机体使编码脂解酶的DNA进行随机诱变，所用的方法如把包含亲本酶的质粒转化进突变体菌株，培养具有质粒的突变体菌株，并从突变体菌株分离突变的质粒。随后把突变的质粒转化进表达有机体。
要诱变的DNA序列可以方便地存在于制备自表达亲本脂解酶的有机体的基因组或cDNA文库中。另外，DNA序列可以存在于适合的载体(如质粒或噬菌体)中，这样可以与诱变剂温育或以其它方式接触。要诱变的DNA也可以通过整合进所说的细胞的基因组中或存在于细胞中携带的载体中而存在于宿主细胞中。最后，要诱变的DNA可以是分离形式。进行随机诱变的DNA序列优选地是cDNA或基因组DNA序列。
在某些情况下，在进行表达或筛选之前，可以方便地进行突变的DNA序列的扩增。这样的扩增可以按照本领域已知的方法进行，目前优选的方法是利用在亲本酶的DNA或氨基酸序列的基础上制备的寡核苷酸引物的PCR产生的扩增。
在与诱变剂温育或暴露于诱变剂之后，通过在使得表达发生的条件下培养携带DNA序列的宿主细胞表达突变的DNA。用于这个目的的宿主细胞可以是用突变的DNA序列(任选地存在于载体上)转化的宿主细胞，或在诱变处理期间携带编码亲本酶的DNA序列的宿主细胞。适合的宿主细胞的例子给出如下。利用酵母细胞作为宿主细胞是特别优选的，尤其是当亲本脂解酶源自真菌(如丝状真菌或酵母)时。突变的DNA序列还可以包含编码允许突变的DNA序列表达的功能的DNA序列。
可以理解：细心地选择了在本发明的方法的步骤(b)提到的筛选标准。这样，不限于任何理论，认为筛选在碱性pH(pH高于7)下对钙降低的依赖性导致具有全面改进的性能的变体，其中对钙的需要可以考虑为对最理想的活性的限制因素，特别在大多数洗涤条件下，该条件的特征在于这样的事实：在去垢剂基质(助洗剂)中通过螯合剂特意降低了游离钙离子的浓度。
去垢剂或去垢剂组分(变体对其具有提高的耐受性)可以是任何类型，如下面的进一步描述。优选地，去垢剂组分是非离子的、阴离子的、阳离子的、两性离子的或两性表面活性剂。非离子表面活性剂的例子包括脂肪醇乙氧基化物，阴离子表面活性剂的例子包括LAS、烷基硫酸盐、脂肪醇乙氧基硫酸盐等。对去垢剂的选择，例如，取决于亲本脂解酶的固有弱点(与去垢剂耐受性有关)。
关于Humicola lanuginosa脂解酶和同源酶(如青霉属、Rhizomucor、根霉属和Absidia sp.脂解酶)，本发明涉及对非离子型表面活性剂脂肪醇乙氧基化物(其一个市售的例子是)的提高的耐受性可以表明改进的洗涤性能。关于假单胞菌属类型的脂解酶(如类产碱假单胞菌、洋葱伯克霍尔德氏菌)，本发明涉及对阴离子型表面活性剂(如烷基硫酸盐(其一个市售的例子是NEODOL 45)或LAS(其一个市售的例子是Nansa 1169/P)的提高的耐受性可以表明改进的洗涤性能。
步骤(b)的筛选通常通过使用基于下列原则的过滤测定方便地进行：
在适合的培养基上以及适合于酶分泌的条件下培养能够表达感兴趣的突变的脂解酶的微生物，培养基提供有包含第一蛋白质结合滤纸的双面滤纸，在其顶端第二层滤纸表现出低的蛋白质结合能力。微生物位于第二层滤纸上。在培养后，包含从微生物分泌的酶的第一层滤纸与包含微生物的第二层滤纸分离。使第一层滤纸筛选所需的酶促活性，鉴别存在于第二层滤纸上的相应微生物菌落。
另外，携带菌落的第二层滤纸可以直接在筛板上利用。这使选择正确的菌落变得更容易，在某些情况下产生更强的信号。仅利用一层滤纸，在许多情况下蛋白质结合或非蛋白质结合是足够的。
用于结合酶促活性的滤纸可以是任何蛋白质结合滤纸，如尼龙或硝化纤维素。携带表达有机体的菌落的上层滤纸可以是任何无蛋白质结合亲和性或亲和性低的滤纸，如乙酸纤维素或DuraporeTM。滤纸可以用任何用于筛选的条件预处理或在酶促活性的检测期间处理。
酶促活性可以通过染料、荧光、沉淀、pH指示剂、IR-吸光度或任何其它检测酶促活性的已知技术检测。
检测化合物可以通过固化剂(如琼脂糖、琼脂、明胶、聚丙烯酰胺、淀粉、滤纸、布)或固化剂的任何组合固定。
脂解活性可以通过与脂(例如橄榄油或猪脂)组合的亮绿、若丹明B或苏丹黑检测。鉴别具有改进的洗涤性能的亲本脂解酶变体的筛选标准可以是例如，EGTA、EDTA、非离子和/或阴离子表面活性剂、碱性pH或与上述酶促活性检测剂之一组合起来的任何去垢剂组合物。
在步骤(b)筛选后，分离具有所需性质的脂解酶(即由筛选标准限定的)，其第一洗涤能力在本文材料和方法部分中所描述的一个周期洗涤测定中试验。
在一轮上述的处理后如果酶的第一洗涤活性不足够好，为了改进酶的第一洗涤性能，可以，如通过定点或随机诱变修饰酶(例如，按照上述给出的修饰脂酶的任何原理)以达到第一洗涤性能。
最方便的是，在步骤(b)中产生的宿主细胞进行如步骤(a)-(b)以及上述任选的(c)限定的再一轮诱变，诱变方便地通过利用与以前诱变处理相比更严格的选择标准。再一轮的诱变可以是随机的、定域随机的或定点的以引入先前鉴别的有利的突变(具体地说是D96L、Q249R、E87K、D254K、E210K)或在所选择的区(例如，脂接触区)中引入随机突变(尤其是对正电荷和/或疏水氨基酸残基的引入具有掺入的寡核苷酸的随机突变)，或引入任何本文提到的其它特异性突变。另外，编码不同的同源亲本脂解酶的基因可以以随机方式组合以便得到携带从每一变体获得的一个或多个突变的新变体。这在下面标题为“编码脂解酶的DNA序列的组合”中进一步详细讨论。
选择用于步骤(b)或(c)的宿主细胞可以直接用于产生脂解酶变体。另外，编码变体的DNA可以方便地通过使用在下面标题为“本发明的变体的表达”的部分描述的方法(在其中列出了适合的宿主细胞)，分离自宿主细胞并插入到另一个适合的宿主细胞中。
定域随机诱变
按照本发明，随机诱变可以有利地定位到所说的亲本脂解酶的一部分。当鉴别出酶的某些区对于酶(当被修饰时，预期导致具有改进的性质的变体)的给定性质具有特殊的重要性时，这可以，例如，是有利的。当阐明了亲本酶的三级结构并涉及到酶的功能时，通常可以鉴别出这样的区。
对于修饰氨基酸残基特别感兴趣的区域位于脂接触区之内或之外的亲本酶的表面上，即脂解酶部分，该部分与脂底物接触并且，例如，包含盖区、疏水裂缝或这些结构的任何部分。对于本发明脂解酶的另一个感兴趣的区域包含肽添加或在成熟亲本酶N-末端或C-末端的非结构部分之内的另一个修饰。
定域随机诱变通常如上所述的PCR产生的突变技术或任何其它本领域已知的适合技术方便地进行。尤其是对于诱变大的肽添加，可以有关地使用PCR产生的诱变(如由Deshler 1992或Leung等，1989所描述的)，其中使用了一个或多个适合的寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针在诱变区的侧面。对于较短的肽添加的诱变，更优选地是使用掺入的寡核苷酸进行定域随机诱变。使用掺入可以，例如，避免不需要的氨基酸残基的密码子或增加特定类型氨基酸残基(如带正电的或疏水氨基酸残基)引入所需的位置的可能性。
另外，可以，如通过插入到适合的载体中分离编码待修饰的DNA序列部分的DNA序列，其后可以通过使用上述的任一种突变方法使所说的部分进行诱变。
特别感兴趣的是进行随机诱变的DNA序列包含编码亲本脂解酶的脂接触区或盖区的DNA序列的部分或由其组成。定域随机诱变可以在这些区中的一个或多个和/或构成脂接触区的区中一个或多个区中进行，优选地是在至少两个区中进行。按照本发明的这个方面用于修饰的特别感兴趣的亲本脂解酶包括H.lanuginosa脂解酶，该脂解酶可从菌株DSM 4109或变体或其类似物、源自沙门柏干酪青霉的亲本脂解酶、源自米根霉的亲本脂解酶、源自Rhizomucor miehei的亲本脂解酶、源自Absidia sp.的亲本脂解酶、源自Pseudomonas sp.的亲本脂解酶(优选地属于铜绿假单胞菌科，如洋葱伯克霍尔德氏菌脂酶、类产碱假单胞菌脂酶、荚壳伯克霍尔德氏菌脂酶、门多萨假单胞菌脂酶、Pseudomonas wisconsinensis或Pseudomonas sp.脂酶(SD705)
Figure G1996196233X19940529D000481
(在SEQ ID No.99中显示)获得。
脂接触区和盖区在上述定义部分中鉴别。
定域随机诱变可以通过使用掺入的寡核苷酸完成，这些寡核苷酸，例如，在确保大约90-93％野生型和大约7-10％突变体的条件下，以L、I、V、F、W、A(疏水氨基酸残基)或K、R(正电荷氨基酸残基)的方向掺入。适合的掺入方式的特定例子在下面的实施例部分给出。
体内重组
按照本发明优选的实施方案，可以通过一种方法构建编码第一洗涤脂解酶的DNA序列，作为该方法一个重要步骤包括选择的编码不同的亲本脂解酶的DNA序列或这样的DNA序列的部分的组合。
优选地，要组合的DNA序列源于编码具有令人满意的洗涤和/或餐具洗涤性能的脂解酶的基因(如在实施例6中鉴别的)。组合DNA序列的目标是得自每一种“亲本酶”的最好成分组合成一种和相同的变体酶。
在本发明的上下文中，术语“令人满意的洗涤性能”是指当存在于适合的去垢剂中时，亲本酶能够在一个或几个洗涤周期期间除去脂肪污点。优选地，所说的亲本酶具有比Lipolase(TM)更好的洗涤性能。
DNA序列的组合可以通过本领域已知的任何适合方法进行。例如，当要组合的DNA序列包含同源片段时，组合优选地通过同源交换达到，例如，通过使用常规方法如美国专利5,093,257，或通过基因改组(Stemmer(1994)，美国科学院学报，vol.91，10747-10751；Stemmer(1994)，自然，vol.370，389-391；Smith(1994)，自然，vol.370，p.324-25)、WO 95/17413。基因改组是指两个或多个同源DNA序列之间核苷酸序列的重组，它形成具有许多交换的核苷酸的DNA序列。
特别感兴趣的是基于下列过程的体内基因改组方法：
a)形成至少一种包含编码亲本脂解酶或其实质性部分的DNA序列的环状表达载体，
b)在编码脂解酶或其部分的DNA序列之内打开所说的环状表达载体，
c)制备至少一种DNA片段，该DNA片段包括与在至少一种环状表达载体上的酶编码区的至少一部分同源的DNA序列，
d)把至少一种所说的打开的载体以及至少一种所说的同源DNA片段引入重组宿主细胞，该DNA片段把编码所说的脂解酶或其部分的全长DNA序列覆盖，
e)在有利于同源DNA片段之间重组发生的条件下培养所说的酵母重组宿主细胞，
f)筛选具有改进的洗涤性能的阳性脂解酶变体。
在上述步骤a)中使用的载体可以是酵母表达载体，该酵母表达载体可以转化进酵母重组宿主细胞并在其中表达。这样的表达载体的例子包括从pYES 2.0(Invitrogene)构建的酵母表达载体，如包含野生型Humicolalanuginosa脂酶基因的pJSO37。
在步骤b)中打开载体可以通过任何本领域已知的常规技术完成，例如，可以通过在单一位点切割或通过使载体产生间隙(即切割，如在两点切割导致切割基因的一小部分)在脂酶基因之内打开载体来进行。
在步骤c)中的同源DNA片段的制备可以使用任何适合的方法通过扩增同源DNA序列(如，在脂解基因中包含一个或多个突变并包含在质粒或载体中)进行，所说的适合的方法如在美国专利4,683,202或Saiki等，(1988)，科学，239，487-491中描述的标准PCR扩增方法。
载体可以通过转化引入重组宿主细胞(步骤d)。在重组宿主细胞是酿酒酵母菌株(如酿酒酵母YNG318(描述如下))的情况下，转化可以如Sambrooks等，((1989)，分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港，NY，美国)所描述的进行。
阳性脂解酶变体的筛选可以，例如，通过关于上述随机诱变所描述的筛选方法进行。
步骤a)至f)的多个周期之一可以在使用上面定义的选择条件进行第一洗涤脂解酶的选择之前进行。
按照改组方法，显著地超过两种DNA序列就可以改组。任何数目的不同DNA片段与包含在适合质粒中的同源脂解酶可以同时改组。
要组合的DNA序列可以是其至少一部分表现出与其它基因同源性(该同源性足以使基因的重组发生)的整个基因。另外，DNA序列可以是部分基因，这部分基因当组合时可以产生能够表达脂解酶的功能基因。
当要组合的DNA序列是高度同源的或部分相同的，可以进行有控制的组合(如在两种DNA序列组合的情况下)以组合序列之一的N-末端部分与另一种的C-末端部分(与第一种序列的余下部分相对应)，或通过组合所说的各自基因的其它有关部分。
在进行基因改组前，天然产生的酶可以通过如上所述的随机、定域随机或定点诱变遗传修饰。另外，一种酶的部分可以被另一种酶的部分取代以获得嵌合酶。该取代可以通过常规的体外基因剪接技术或通过体内重组或通过两种技术的组合进行。当利用常规体外基因剪接技术时，可以使用适当的位点特异性限制酶缺失脂解酶基因的所需部分；然后编码序列的缺失部分可以通过不同脂解酶编码序列的所需部分的插入而被取代以产生编码新的脂解酶的嵌合核苷酸序列。另外，可以融合脂解酶基因，如通过使用Higuchi等1988描述的PCR重叠添加(overlay addition)技术。
体内重组技术取决于这样的事实：具有高度同源区的不同的DNA片段(DNA序列的等同性)可以重组(即打断并交换DNA)并在同源区中建立新键。因此，当两个或多个不同但同源的脂解酶的编码序列用来转化宿主细胞时，体内同源序列的重组将导致嵌合基因序列的产生。这些编码序列通过宿主细胞的翻译导致嵌合脂解酶基因产物的产生。特定的体内重组技术在美国专利5,093,257和EP 252 666中描述。
为了使同源重组发生，理想的是脂解酶包含至少60％同源的部分。特别优选的是，整个酶至少有60％是同源的。要组合的酶可以是相同亲本酶的不同变体，如源自本文公开的H.lanuginosa脂解酶的变体、或源自上面提到的产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌脂解酶的变体、或源自F.solani pisi脂解酶的变体(见上)、或源自门多萨假单胞菌脂解酶或Pseudomonas sp.脂酶(Liposam)(见上)的变体。可以理解：随机重组可以在天然产生的脂解酶和所说的酶的一种或多种变体之间、在不同的天然产生的酶之间、在天然产生的酶的变体之间(变体是相同亲本酶或不同酶的变体)、或在天然产生的酶与天然产生的酶的变体的任何组合之间进行(只要相应的DNA序列能够重组)。当要组合的DNA序列是亲本酶的变体时，这些变体可以方便地通过诱变制备，尤其是上面公开的随机诱变方法。
在另一个实施方案中，杂合酶可以按本领域已知的标准化学方法合成。例如，参见Hunkapiller等(1984)。因此，具有以上所述的氨基酸序列的肽可以整个或部分合成并连接以形成本发明的杂合酶。
在一个高度优选的实施方案中，本发明的第一洗涤脂解酶通过下述方法构建，该方法包括对亲本脂解酶进行诱变(尤其是随机诱变)以形成各种突变的DNA序列，在适合的宿主中表达突变的DNA序列，筛选产生突变的脂解酶的宿主细胞(该突变的脂解酶具有降低的钙依赖性和/或对去垢剂或去垢剂组分提高的耐受性)，使在所说的筛选中选择的编码突变的脂解酶的DNA序列与一个或多个突变的其它DNA序列(以类似的方式从相同的亲本脂解酶制备)进行体内重组(尤其是基因改组或有性PCR)，在适合的宿主中表达突变的重组DNA序列，任选地选择产生突变的脂解酶的宿主细胞(该突变的脂解酶具有降低的钙依赖性和/或对去垢剂或去垢剂组分提高的耐受性)，任选地利用更严格的筛选标准重复上述诱变和体内重组方法其中之一或两者一次或多次，最后选择编码表现出本文定义的第一洗涤活性的脂解酶的重组DNA序列。
进而，可以理解：在亲本酶的结构部分包含肽添加和突变的本发明的第一洗涤脂解酶可以通过下述方法构建，这种方法包括：在编码肽添加的DNA序列部分与编码亲本脂解酶的成熟部分的DNA序列的选择部分中定域诱变(尤其是定域随机诱变)，即在亲本酶的结构部分中进行的、按照本发明的第二方面的随机诱变方法与在N-末端和/或C-末端的非结构部分中和/或应用于N-末端和/或C-末端部分的肽添加中的随机诱变的组合。
可以理解：本文公开的体内重组和突变方法可以运用于在本文“亲本脂解酶”部分中论及的任何亲本脂解酶。尤其优选的亲本脂解酶源自Humicolalanuginosa以及Pseudomonas sp.(如产碱假单胞菌和类产碱假单胞菌)。
本发明的脂解酶的表达
编码本发明的第一洗涤脂解酶的分离的核酸序列可以以各种方法操作以提供酶的表达。在其插入载体之前，编码第一洗涤脂解酶的核酸序列的操作取决于表达载体可以是合乎需要的或必要的。利用克隆方法修饰核酸序列的技术在本领域是已知的。
术语“控制序列”在本文中定义为包括对于核酸序列的编码序列的表达是必要的或有利的所有组分。各控制序列对编码脂解酶的核酸序列可以是天然的或外源的。这样的控制序列包含(但不限于)：前导序列、聚腺苷酸化序列、原肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。在最小的程度下，控制序列包含启动子以及转录和翻译终止信号。控制序列可以提供有接头，其目的在于引入特定的限制位点以促进控制序列与编码脂解酶的核酸序列的编码区连接。
控制序列可以是适当的启动子序列、表达核酸序列的宿主细胞识别的核酸序列。启动子序列包含转录和翻译控制序列，该序列介导第一洗涤脂解酶的表达。启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列，并可以从编码对宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。用于指导本发明的核酸构建体转录的适合启动子的例子(尤其是在细菌宿主细胞中)是从下列基因获得的启动子：大肠杆菌乳糖操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌蔗糖6-果糖基转移酶基因(sacB)或碱性蛋白酶基因、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌生麦淀粉酶基因(amyM)、液解化淀粉杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、短小芽孢杆菌木糖苷酶基因和原核生物β-内酰胺酶或色氨酸基因(Villa-Kamaroff等，1978，美国科学院学报，75：3727-3731)以及tac基因(DeBoer等，1983，美国科学院学报，80：21-25)。其它启动子在科学美国人，“得自重组细菌的有用蛋白质”，1980，242：74-94以及Sambrook等，1989(同上)中描述。用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的适合启动子的例子是获自编码下列酶的基因的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、Rhizomucor miehei脂酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、尖镰孢(Fusarium oxysporum)类胰蛋白酶蛋白酶(如在美国专利4,288,627中描述的，本文一并参考)或ADH-3启动子(McKnight等，(1985)，EMBO杂志，4，2093-3099)及其杂合体。在丝状真菌宿主细胞中使用的尤其优选的启动子是TAKA淀粉酶和glaA启动子。在酵母宿主中是得自酵母糖酵解基因(Hitzeman等，(1980)，生物化学杂志，255，12073-12080；Alber和Kawasaki，(1982)，J.Mol.Appl.Gen.1，419-434)或醇脱氢酶基因(Young等，产生化学药品的微生物的遗传工程学(Hollaender等编辑)，Plenum出版社，纽约，1982)的启动子或TPI1(美国专利4,599,311)或ADH2-4c(Russell等，(1983)，自然304，652-654)启动子。有用的启动子获自酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)基因、酿酒酵母半乳糖激酶基因(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(ADH2/GAP)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因。其它酵母宿主细胞有用的启动子由Romanos等，1992，酵母8：423-488描述。
控制序列也可以是适合的转录终止序列、即被宿主细胞识别以终止转录的序列。终止序列可操作地连接到编码修饰的脂解酶的核酸序列的3’末端。终止序列对编码脂解酶的核酸序列可以是天然的或可以从外源来源获得。在选择的宿主细胞中是功能性的任何终止子都可以用于本发明。丝状真菌宿主细胞的优选的终止子从编码下列酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉氨茴酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、尖镰孢类胰蛋白酶蛋白酶。用于酵母宿主细胞的优选的终止子获自编码下列酶的基因：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)或酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。其它用于酵母宿主细胞的有用的终止子由Romanos等，1992(同上)描述。
控制序列也可以是适合的前导序列，对宿主细胞的翻译来说重要的mRNA的非翻译区。前导序列可操作地连接到编码脂解酶的核酸序列的5’末端。前导序列对编码脂解酶的核酸序列可以是天然的或可以获自外源来源。在选择的宿主细胞中是功能性的任何前导序列都可以用于本发明。丝状真菌宿主细胞的优选的前导序列从编码下列酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶。对于酵母宿主细胞适合的前导序列获自酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)基因、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因、酿酒酵母α-因子以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(ADH2/GAP)。
控制序列也可以是聚腺苷酸化序列，是可操作地连接到核酸序列3’末端的序列，当其转录时，被宿主细胞识别为把聚腺苷残基添加到转录的mRNA上的信号。聚腺苷酸化序列对编码脂解酶的核酸序列可以是天然的或可以获自外源来源。在选择的宿主细胞中是功能性的任何聚腺苷酸化序列都可以用于本发明。丝状真菌宿主细胞的优选的聚腺苷酸化序列从编码下列酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉氨茴酸合酶以及黑曲霉α-葡糖苷酶。对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，分子细胞生物学15：5983-5990描述。聚腺苷酸化序列在哺乳动物宿主细胞领域是已知的。
控制序列也可以是信号肽编码区，该编码区编码连接到第一洗涤脂解酶氨基末端的氨基酸序列，所述第一洗涤脂解酶氨基末端可以指导表达的第一洗涤脂解酶进入细胞的分泌途径。信号肽编码区对本发明的第一洗涤脂解酶可以是天然的或可以获自外源来源。核酸序列的编码序列的5’末端可以固有地包含天然地连接在具有编码区片段的翻译读框中的信号肽编码区，该编码区编码分泌的第一洗涤脂解酶。另外，编码序列的5’末端可以包含信号肽编码区，该编码区对于编码分泌的第一洗涤脂解酶的编码序列是外源的。在编码序列通常不包含信号肽编码区的地方需要外源信号肽编码区。另外，外源信号肽编码区可以简单地取代天然信号肽编码区以获得比与编码序列联系的天然信号肽编码区更强的脂解酶分泌。信号肽编码区可以获自曲霉属物种的葡糖淀粉酶或淀粉酶基因、Rhizomucor物种的脂酶或蛋白酶基因、酿酒酵母的a-因子基因、芽孢杆菌属物种的淀粉酶或蛋白酶基因或小牛前原凝乳酶基因。用于细菌宿主细胞的有效的信号肽编码区是获自下列基因的信号肽编码区：芽孢杆菌属NCIB 11837生麦淀粉酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌枯草溶菌素基因、地衣形芽孢杆菌β-内酰胺酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶基因(nprT，nprS，nprM)和枯草芽孢杆菌PrsA基因。其它信号肽由Simonen和Palva，1993，微生物回顾，57：109-137描述。用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码区是获自下列基因的信号肽编码区：米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉中性淀粉酶基因、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶基因、H.lanuginosa纤维素酶基因或Rhizomucor miehei脂酶基因。用于酵母宿主细胞的有用的信号肽获自酿酒酵母a-因子和酿酒酵母转化酶的基因。其它有用的信号肽编码区由Romanos等，1992(同上)描述。然而，能够指导表达的酶进入选择的宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区都可以用于本发明。
本发明的核酸构建体也可以包含一种或多种核酸序列，该核酸序列编码在表达第一洗涤脂解酶中有利的一种或多种因子，例如，活化剂(例如，反式作用因子)、陪伴分子和加工蛋白酶。编码这些因子中的一个或多个的核酸序列与编码第一洗涤脂解酶的核酸序列不必是一前一后。活化剂是活化编码第一洗涤脂解酶的核酸序列转录的蛋白质(Kudla等，1990，EMBO杂志，9：1355-1364；Jarai和Buxton，1994，当今遗传学，26：2238-244；Verdier，1990，酵母，6：271-297)。编码活化剂的核酸序列可以获自编码下列物质的基因：嗜热脂肪芽孢杆菌NprA(nprA)、酿酒酵母血红素活化剂蛋白质1(hapl)、酿酒酵母半乳糖代谢蛋白质4(ga14)和构巢曲霉氨调节蛋白质(aerA)。对于其它的例子，参见Verdier，1990，(同上)和MacKenzie等，1993，普通微生物学杂志，139：2295-2307。陪伴分子是帮助另一种多肽正确折叠的蛋白质(Hartl等，1994，TIBS，19：20-25；Bergeron等，1994，TIBS，19：124-128；Demolder等，1994，生物技术杂志，32：179-189；Craig，1993，科学，260：1902-1903；Gething和Sambrook，1992，自然，355：33-45；Puig与Gilbert，1994，生物化学杂志，269：7764-7771；Wang和Tsou，1993，FASEB杂志，7：1515-11157；Robinson等，1994，生物/技术，1：381-384)。编码陪伴分子的核酸序列可以获自编码下列蛋白质的基因：枯草芽孢杆菌GroE蛋白质、米曲霉蛋白质二硫化物异构酶、酿酒酵母钙联接蛋白、酿酒酵母BiP/GRP78和酿酒酵母Hsp70。对于其它的例子，参见Gething和Sambrook，1992，(同上)以及Hartl等，1994，同上。任何在选择的宿主细胞中有功能的因子都可以用于本发明。
添加调节序列也可以是合乎需要的，该调节序列使得第一洗涤脂解酶的表达的调节与宿主细胞的生长有关。调节系统的例子是使基因的表达响应化学或物理刺激而开或关的系统，它包括调节化合物的存在。在原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子可以用作调节序列。调节序列的其它例子是允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些序列包括在氨甲蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及与重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码第一洗涤脂解酶的核酸序列与调节序列一前一后放置。
表达载体
本发明也涉及包含本发明的核酸序列、启动子以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。上述的各种核酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包含一个或多个方便的限制位点以使得在这样的位点插入或取代编码第一洗涤脂解酶的核酸序列。另外，本发明的核酸序列也可以通过把核酸序列或包含该序列的核酸构建体插入到适当的表达用载体中表达。在产生表达载体时，编码序列位于载体中以便编码序列可操作地与用于表达的适当控制序列连接并有可能分泌。
重组表达载体可以是任何可以方便地进行重组DNA方法并可以引起核酸序列表达的载体。载体的选择典型地取决于载体与其所引入的宿主细胞的相容性。载体可以线性或封闭的环状质粒。载体是可以自主复制载体，即，作为染色体外遗传实体存在的载体，其复制不依赖于染色体的复制，例如，质粒、染色体外因子、微型染色体或人工染色体。载体可以包含任何保证自主复制的工具。另外，载体可以是下述载体，即当将其引入宿主细胞时，整合进基因组并与它所整合的染色体一道复制。载体系统可以是单一载体或质粒或两个或多个载体或质粒，它们共同包含待引入宿主细胞的基因组的整个DNA或转座子。
本发明的载体优选地包含一个或多个可选择的标记，该标记使得容易选择转化的细胞。可选择的标记是基因，其产物提供杀虫剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养型(prototrophy)等。细菌可选择的标记的例子是得自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的标记。经常利用的哺乳动物标记是二氢叶酸还原酶基因。酵母宿主细胞的适合标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的可选择的标记可以选自这样的组，该组包括(但不限于)：amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(phosphinothricin乙酰转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸盐还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸盐脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)、trpC(氨茴酸合酶)与glufosinate抗性标记以及得自其它物种的相当物。用于曲霉属细胞优选的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG标记和Streptomyces hygroscopicus的bar标记。进而，选择可以通过共转化完成，例如，在WO 91/17243中所描述的，其中可选择的标记在单独的载体上。
本发明的载体优选地包含下述因子分，该因子使得可以把载体稳定地整合进宿主细胞基因组或使载体可以独立于细胞的基因组而在细胞中自主复制。
当引入宿主细胞时，本发明的载体可以整合进宿主细胞基因组。对于整合，载体可以依赖于编码第一洗涤脂解酶或载体的任何其它因子的核酸序列，这些因子通过同源或非同源重组用于把载体稳定地整合进基因组。另外，载体可以包含其它的核酸序列，这些核酸序列通过同源重组指导整合进宿主细胞的基因组。所述其它核酸序列能够使载体整合进宿主细胞基因组的染色体中的精确位置。为了提高在精确位置整合的可能性，整合因子应该优选地包含足够数量的核酸(如100至1,500个碱基对，优选地400至1,500个碱基对，最优选地是800至1,500个碱基对)，该核酸与相应的靶序列是高度同源的以提高同源重组的可能性。整合因子可以是与在宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。进而，整合因子可以是非编码或编码的核酸序列。另一方面，载体可以通过非同源重组整合进宿主细胞的基因组。这些核酸序列可以是与在宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列，进而，可以是非编码或编码序列。
对于自主复制，载体还可以包含复制起点，该复制起点使载体能够在所说的宿主细胞中自主复制。细菌的复制起点的例子是质粒pBR322、pUC19、pACYC177、pACYC184、pUB110、pE194、pTA1060和pAMB1的复制起点。用于酵母宿主细胞的复制起点的例子是复制的2微米起点、CEN6和ARS4的重组以及CEN3和ARS1的重组。复制起点可以是具有突变的起点，该突变使其在宿主细胞中起温度敏感的作用(参见，例如，Ehrlich，1978，美国科学院学报，75：1433)。
编码本发明的第一洗涤脂解酶的核酸序列一个以上的拷贝可以插入宿主细胞以扩增核酸序列的表达。核酸序列的稳定扩增可以通过利用本领域已知的方法把至少一种附加拷贝的序列整合进宿主细胞基因组并选择转化体而获得。
用于连接上述因子以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域熟练技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等，1989，同上)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含本发明的核酸序列，它在用于重组产生第一洗涤脂解酶时是有利地。细胞优选地以包含本发明核酸序列的载体转化，其后把载体整合进宿主染色体。“转化”指把包含本发明的核酸序列的载体引入宿主细胞以使该载体作为染色体整合物或作为自主复制染色体外载体保持。由于核酸序列更可能稳定地保持在细胞中，一般认为整合是有优点的。把载体整合进宿主染色体可以通过以上所述的同源或非同源重组发生。
选择宿主细胞在很大程度上取决于编码第一洗涤脂解酶的基因及其来源。此外，宿主细胞的选择经常取决于宿主细胞的解蛋白酶系统及其对本发明的第一洗涤脂解酶产生的影响。因此，理想的是利用在一个或多个解蛋白酶或其它酶加工方式上有缺失的宿主细胞。细菌以及真菌(丝状真菌和酵母)细胞的蛋白酶缺失宿主细胞在本领域中是众所周知的。当本发明的第一洗涤脂解酶包含肽添加时，有利的是：宿主是在一个或多个外蛋白酶(外蛋白酶能够在临近于肽添加的位点裂解修饰的脂解酶)或一个蛋白酶(能够在肽添加之内裂解)上有降低或缺失的菌株。例如，宿主细胞可以在下列酶中降低或缺失：三肽基-氨肽酶(TPAP)(参见，如Novo Nordisk A/S的WO96/14404)、二肽基-氨肽酶(DPAP)和/或Kex2蛋白酶或类Kex2蛋白酶，因此不能在二碱性位点诸如Arg-Arg(RR)裂解。
宿主细胞的其它例子包括碱性蛋白酶缺失或降低的宿主细胞、天冬氨酸蛋白酶缺失的宿主细胞(EP 429 490)、解蛋白酶缺失的宿主细胞(如在WO93/00925、WO 92/17595、EP 341 215、EP 574 347和PCT/DK96/00111中描述的宿主细胞)。
宿主细胞可以是单细胞微生物或非单细胞微生物。有用的单细胞是细菌细胞，如：革兰氏阳性细菌，包括但不限于：芽孢杆菌属细胞，例如，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌；或链霉菌属细胞，例如，S.lividans或S.murinus，或革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌和Pseudomonas sp.(尤其当细菌脂解酶(如Pseudomonas sp.酶，产生时)。细菌宿主细胞的转化可以，例如，通过原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen，1979，分子普通遗传学168：111-115)、利用感受态的细胞(参见，例如，Young和Spizizin，1961，细菌学杂志，81：823-829，或Dubnar和Davidoff-Abelson，1971，分子生物学杂志，56：209-221)、电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower，1988，生物技术，6：742-751)或通过缀合(参见，例如，Koehler和Thorne，1987，细菌学杂志，169：5771-5278)进行。
宿主细胞可以是真核生物，优选的是真菌(即酵母细胞或丝状真菌细胞)，尤其是对于真核起源的修饰脂解酶的产生。
本文所利用的“酵母”包括产子囊孢子(ascosporogenous)酵母(酵母目)、产担子孢子(basidiosporogenous)酵母以及属于不完全菌纲(芽生菌)的酵母。产子囊孢子酵母划分在蚀精霉科(spermophthoracaae)和酵母科。后者由四个亚科组成：裂殖酵母亚科(如裂殖酵母属)、拿逊酵母亚科、油脂酵母亚科和复膜酵母亚科(Saccharomycoideae)(例如，毕赤酵母属、克鲁维酵母属和酵母菌属)。产担子孢子酵母包括白冬孢酵母属、Rhodosporidium、锁掷酵母属、Filobasidium和Filobasidiella。属于不完全菌纲的酵母划分在两个科：掷孢酵母科(例如Sorobolomyces和布勒掷孢酵母属)和隐球酵母科(例如，假丝酵母属)。因为酵母的分类在将来可能改变，为了本发明的目的，将酵母定义为如酵母的生物学和活性(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.和Davenport，R.R.编辑，应用细菌学协会专题研讨系列9，1980)中描述。酵母生物学与酵母遗传学的操作在本领域是熟知的(参见，例如，酵母的生物化学和遗传学，Bacil，M.，Horecker，B.J.和Stopani，A.O.M.编辑，第2版，1987；酵母，Rose，A.H.和Harrison，J.S.编辑，第2版，1987；酵母的分子生物学，Strathern等，编辑，1981)。在与本发明相关时，使用酵母细胞(典型地具有另一个蛋白酶处理系统，例如，细菌和丝状真菌)，对于制备修饰的脂解酶特别有用；作为肽添加，该酶包含所说的亲本脂解酶的部分或所有天然的原序列。当真菌宿主细胞是酵母细胞时，如用于应用肽添加(以亲本酶的部分或整个原序列的形式)，酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、克鲁维酵母属、酵母属、Schizosaccharomyces、毕赤酵母属或Yarrowia的细胞，如酿酒酵母细胞、卡尔酵母(S.scarlsbergensis)、糖化酵母(S.diastaticus)细胞、S.douglasii细胞、克鲁弗酵母(S.kluyveri)细胞、诺地酵母(S.norbensis)细胞或S.oviformis细胞。
本文所用的“真菌”包括phyla Ascomycota、Basidiomycota、Chytridiomycota和Zygomycota(如由Hawksworth等所限定，In，Ainsworth和Bisby真菌字典，第8版，1995，CAB国际，大学出版社，剑桥，英国)以及Oomycota(如在Hawksworth等，1995，同上，p171中所引用)与所有的mitosporic真菌(Hawksworth等，1995，同上)。代表性的Ascomycota组包括，例如，脉孢菌属、正青霉属(＝青霉属)、Emcricella(＝曲霉属)、散囊菌属(＝曲霉属)以及如上所述的真酵母。Basidiomycota的例子包括蘑菇、锈菌和黑粉菌。代表性的Chytridiomycota组包括，例如，异水霉属、小芽枝霉属、雕蚀菌属和水生真菌。代表性的Oomycota组包括，例如，Saprolegniomycetous水生真菌(水粘液菌类)如绵霉属。mitosporic真菌的例子包括曲霉属、青霉属、假丝酵母属和链格孢属。代表性的Zygomycota组包括，例如，根霉属和毛霉属。
“丝状真菌”包括所有丝状形式的Eumycota和Oomycota亚组(如由Hawksworth等，1995，同上所限定的)。丝状真菌的特征在于：营养菌丝体由几丁质、纤维素、葡聚糖、脱乙酰壳多糖、甘露聚糖和其它复合多糖类组成。营养生长通过菌丝延长，碳分解代谢是专性需气的。相对地，酵母(如酿酒酵母)的营养生长通过萌发单细胞菌体进行，碳分解代谢可以是发酵型的。
在优选的实施方案中，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。在更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是下列属(但不限于)的细胞：顶孢霉属、曲霉属、镰孢属、腐质霉属、毁丝霉属、毛霉属、脉孢菌属、青霉属、梭孢壳属、弯劲霉属和木霉属。在更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是曲霉属细胞。在另一个更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是镰孢属细胞。在最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是米曲霉细胞、黑曲霉细胞、臭曲霉(A.foetidus)细胞或日本曲霉(A.japonicus)细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是尖镰孢细胞或禾谷镰孢(F.graminearum)细胞。
真菌细胞可以一种方法转化，该方法包括以本来已知的方式进行原生质体形成、原生质体转化、细胞壁的再生。关于曲霉属宿主细胞转化的适合方法在EP 238 023和Yelton等，1984，美国科学院学报，81：1470-1474中描述。转化镰孢属物种的适合方法由Malardier等，1989，基因，78：147-156或在WO 96/00787中描述。酵母可以利用下面描述的方法转化：Becker和Guarente，在Abelson，J.N和Simon，M.I.，编辑，酵母遗传学和分子生物学指导，酶学方法，194卷，182-187页，学院出版社公司，纽约；Ito等，1983，细菌学杂志，153：163；以及Hinnen等，1978，美国科学院学报，75：1920。哺乳动物细胞可以利用Graham和van der Eb的磷酸钙沉淀法(1978，病毒学，52：546)通过直接摄取转化。
产生方法
本发明也涉及产生本发明的第一洗涤脂解酶的方法，该方法包括：(a)在有利于第一洗涤脂解酶表达的条件下，培养用编码第一洗涤脂解酶的DNA序列转化的宿主细胞；b)回收第一洗涤脂解酶。
宿主细胞可以利用本领域已知的方法在适合于第一洗涤脂解酶产生的营养培养基中培养。例如，细胞可以通过摇动培养瓶培养物培养、在适合的培养基中以及使得修饰脂解酶可以表达和/或分离的条件下于实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续的、间歇的、流加或固态发酵)。培养利用本领域已知的方法发生于适合的营养培养基中，营养培养基包含碳和氮源和无机盐(参见，例如，细菌和酵母的参考文献；Bennett，J.W.和LaSure，L.，编辑，在真菌中的更多基因操作，学院出版社，CA，1991)。适合培养基可从商业供给者得到或可以按照所公开的组分制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果第一洗涤脂解酶分泌进营养培养基，脂解酶可以直接从培养基回收。如果第一洗涤脂解酶不分泌，它从细胞溶胞产物中回收。
形成的第一洗涤脂解酶可以通过本领域已知的方法回收。例如，第一洗涤脂解酶可以通过常规方法从营养培养基回收，该方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。回收的第一洗涤脂解酶可以通过各种色谱方法(例如，离子交换色谱法、凝胶过滤色谱、亲合色谱法等)进一步纯化。
本发明的第一洗涤脂解酶可以通过本领域已知的各种方法纯化，该方法包括但不限于色谱(例如，离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦和大小排斥)、电泳方法(例如，制备型等电点聚焦(TEF)、示差溶解性(例如，硫酸铵沉淀)或提取(参见，例如，蛋白质纯化，J.-C.Janson和Lars Ryden，编辑，VCH出版社，纽约，1989)。
按照本发明，也涉及把一个或多个带电的氨基酸运用于第一洗涤脂解酶，这些氨基酸使得修饰酶可以有效纯化。用以此目的的技术是分子生物学领域的熟练技术人员熟知的。
优选地选择宿主细胞、培养条件和/或回收条件以至多使亲本酶的前、原或前原形式的部分加工发生以导致产生的修饰酶分子的至少5％，如至少10％，如至少15％，如至少20％，如至少25％，如至少50％或至少75％包含所需的序列，如整个前序列或其实质性部分。
本发明的酶组合物
在本发明的另一个方面涉及包含本发明的第一洗涤脂解酶的酶组合物。
本文所定义的“实质上的纯化的”酶是指这样的酶，该酶根本无其它同源杂质(与第一洗涤脂解酶起源于相同来源)，例如，至少大约20％纯度，优选地至少大约40％纯度，更优选地大约60％纯度，更优选地大约80％纯化的，最优选地大约90％纯度，进而最优选地大约95％纯度(通过SDS-PAGE测定)。
当本发明的第一洗涤脂解酶包含肽添加时，发现并非所有通过给定的宿主细胞表达的第一洗涤脂解酶分子在相同的裂解位点加工。这样的后果是：通过这样的宿主细胞从发酵回收的第一洗涤脂解酶产物包含具有全长肽添加的部分以及仅具有肽添加一部分的一个或多个部分。本发明人发现这不显著影响洗涤性能。因而，尽管不是所有的本发明的酶组合物的脂解酶可以保持全长肽添加，酶组合物仍能够发挥第一洗涤作用。实际上，现已发现：只要包含肽添加的本发明的第一洗涤脂解酶总量的至少大约5％具有如上所述的完整的肽添加，就可以发现足以提供所需的第一洗涤作用。然后第一洗涤脂解酶分子的余下部分可以具有短于预定的肽添加的肽添加(如，是一个或多个氨基酸残基在宿主有机体的酶加工期间被切除的结果)。因此，本发明的酶组合物仅需要包含至少大约5％，优选地至少大约10％，如至少大约25％，更好的是至少大约50％，尤其是至少大约75％的具有全长添加物的第一洗涤脂解酶。
所说的酶组合物可以进一步包含选自蛋白酶、纤维素酶、过氧化物酶、角质酶、淀粉酶和/或脂酶的酶，当用于洗涤时，也包含去垢剂组合物中常用的成分。
去垢剂公开
表面活性剂系统
按照本发明的去垢剂组合物包含表面活性剂系统，其中所说的表面活性剂可选自非离子的和/或阴离子的和/或阳离子的和/或两性的和/或两性离子的和/或半极性的表面活性剂。
表面活性剂典型地以重量的0.1％至60％的水平存在。
表面活性剂优选地制成制剂与存在于组合物中的酶组分相容。在液态或凝胶组合物中，表面活性剂最优选地制成制剂以使其促进或至少不降低在这些组合物中的酶的稳定性。
按照本发明使用的优选的表面活性剂系统包含作为表面活性剂的、本文描述的一种或多种非离子的和/或阴离子的表面活性剂。
非离子去垢剂表面活性剂通常由水溶性聚烷氧烯或者单或二链烷醇酰胺基团与有机疏水基团化学组合组成，有机疏水基团源自，例如，烷基酚(其中烷基包含大约6至大约12个碳原子)，二烷基酚(其中每个烷基包含6至12个碳原子)，伯、仲、叔脂族醇(或其烷基加帽的衍生物)(优选地具有8至20个碳原子)、在烷基中具有10至大约24个碳原子的单羧酸以及聚氧丙烯。脂肪酸单和二链烷醇酰胺也是常见的，其中脂肪酸基团的烷基包含10至大约20个碳原子而烷酰基具有1至3个碳原子。任选地，在任何单和二链烷醇酰胺衍生物中，有聚氧亚烷部分连接后者基团与分子的疏水部分，在任何包含聚烷氧烯的表面活性剂中，聚烷氧烯组分优选地由2至20个基团的环氧乙烷或环氧乙烷和环氧丙烷基团组成。
烷基酚的聚环氧乙烷、聚环氧丙烷、聚环氧丁烷缩合物适合于用作本发明的表面活性剂系统的非离子表面活性剂，聚环氧乙烷缩合物物是优选的。这些化合物包括烷基酚的缩合产物，所述烷基酚具有包含大约6至大约14个碳原子，优选地大约8至大约14个碳原子的烷基，与烯化氧呈直链或支链构型。在优选的实施方案中，环氧乙烷以相等于每摩尔烷基酚大约2至大约25摩尔的量存在，更优选地是从大约3至大约15摩尔的环氧乙烷。市售的这种类型的非离子表面活性剂包括IgepalTM CO-630(由GAF公司出售)与TritonTM X-45、X-114、X-100与X-102(所有均由Rohm&Haas公司出售)。这些表面活性剂通常称为烷基酚烷氧化物(例如，烷基酚乙氧化物)。
具有大约1至大约25摩尔的环氧乙烷的伯和仲脂族醇的缩合产物适合于作为本发明的非离子表面活性剂系统的非离子表面活性剂。脂族醇的烷基链可以是直链或支链，伯或仲，通常包含大约8至大约22个碳原子。优选的是具有包含大约8至大约20个碳原子(更优选地是大约10至大约18个碳原子)的烷基的醇的缩合产物(每摩尔醇含有大约2至大约10摩尔环氧乙烷。每摩尔醇大约2至大约7摩尔环氧乙烷(最优选地是2至5摩尔的环氧乙烷)存在于所说的缩合产物中。市售的这种类型的非离子表面活性剂的例子包括TergitolTM 15-S-9(C11-C15线性醇与9摩尔环氧乙烷的缩合产物)、TergitolTM24-L-6NMW(C12-C14伯醇与6摩尔的环氧乙烷的缩合产物，窄分子量分布)，上述两种均由联合碳化物公司出售；NeodolTM 45-9(C14-C15线性醇与9摩尔环氧乙烷的缩合产物)、NeodolTM 23-3(C12-C13线性醇与3.0摩尔环氧乙烷的缩合产物)、NeodolTM 45-7(C14-C15线性醇与7摩尔环氧乙烷的缩合产物)、NeodolTM 45-5(C14-C15线性醇与5摩尔环氧乙烷的缩合产物)(由Shell化学公司出售)、KyroTM EOB(C13-C15醇与9摩尔环氧乙烷的缩合产物)(由Procter&Gamble公司出售)、Genapol LA050(C12-C14醇与5摩尔环氧乙烷的缩合产物)(由Hoechst出售)。在这些产物中HLB优选的范围是8-11，最优选的是8-10。
本发明去垢剂组合物可以包含非离子物质，该非离子物质是包含至少25个环氧烷基团的烷氧化的脂族醇，优选地包含至少50个环氧烷，更优选地包含至少80个环氧烷基团。
也可以作为本发明的表面活性剂系统的非离子表面活性剂是在美国专利4,565,647中公开的烷基多糖，该烷基多糖具有包含大约6至大约30个碳原子(优选地是从大约10至大约16个碳原子)的疏水基团以及多糖(如聚苷)，亲水基团包含大约1.3至大约10(优选地是从大约1.3至大约3，更优选地是大约1.3至大约2.7)个糖单位。可以使用任何包含5或6个碳原子的还原糖，例如，葡萄糖、半乳糖，而半乳糖基部分可以替代葡糖基部分(任选地，疏水基团连接在2-，3-，4-等位置，这样产生了相对于葡糖苷或半乳糖苷的葡萄糖或半乳糖)。糖间键可以，例如，在其它糖单位的一个位置与上述糖单位的2-，3-，4-和/或6-位置之间。
另一个有用的非离子表面活性剂是糖醛酸的苷、糖醛酸盐或糖醛酸内脂或聚糖醛酸，该聚糖醛酸具有直链或支链的、饱和或不饱和的、6至24个碳原子的脂族链，任选地包含芬芳的、环脂族的、混合的芳族-脂族或聚烷氧烷基，如WO 95/10524所述。
优选的烷基聚苷具有式
R2O(CnH2nO)t(糖基)x
其中R2选自烷基、烷苯基、羟烷基、羟烷苯基及其混合物，其中烷基包含大约10至大约18、优选地大约12至大约14个碳原子；n是2或3，优选地是2；t从0至大约10，优选地是0；x从大约1.3至大约10，优选地从大约1.3至大约3，更优选地从大约1.3至大约2.7。糖基优选地源自葡萄糖。为制备这些化合物，首先形成醇或烷基聚乙氧醇，然后与葡萄糖或葡萄糖来源进行反应以形成葡糖苷(连接在1-位置)。然后其它的糖基单位可以连接在1-位置和上述糖基单位2-，3-，4-，和/或6-位置之间，优选地主要是2-位置。
通过环氧丙烷与丙二醇缩合形成的疏水基与环氧乙烷的缩合产物也适合作为本发明的其它非离子表面活性剂系统。这些化合物的疏水部分优选地具有大约1500至大约1800的分子量并表现出水不溶解性。把聚氧乙烯部分添加至这个疏水部分导致提高了该分子整体的水溶性，该产物的液态特征保持直至聚氧乙烯含量是缩合产物总重的大约50％之处，相应于与高达大约40摩尔的环氧乙烷缩合。这种类型的化合物的例子包括某些市售的PluronicTM表面活性剂(由BASF出售)。
也适合于用作本发明的非离子表面活性剂系统的非离子表面活性剂是环氧乙烷与由环氧丙烷和1，2-乙二胺反应得到的产物的缩合产物。这些产物的疏水部分由1，2-乙二胺和过量的环氧丙烷的反应产物组成，通常具有大约2500至大约3000的分子量。该疏水部分与环氧乙烷缩合至这样的程度，即缩合产物包含大约40％至大约80％重量的聚氧乙烯并具有大约5,000至大约11.000的分子量。这种类型非离子表面活性剂的例子包括某些市售的TetronicTM化合物(由BASF出售)。
优选地作为本发明的表面活性剂系统的非离子表面活性剂的是烷基酚的聚环氧乙烷缩合物、伯和仲脂族醇与大约1至大约25摩尔的环氧乙烷的缩合产物、烷基多糖及其混合物。最优选的是C8-C14烷基酚乙氧化物(具有3至15个乙氧基)和C8-C18脂肪醇乙氧化物(优选地是平均为C10)(具有2至10个乙氧基)及其混合物。高度优选的非离子表面活性剂是下式的聚羟基脂肪酸酰胺表面活性剂：
其中R1是H，或R1是C1-4烃基、2-羟乙基、2-羟丙基或其混合物，R2是C5-31烃基，Z是具有线性烃基链(具有与链直接连接的至少3个羟基)的聚羟烃基，或其烷氧化衍生物。优选地，R1是甲基，R2是直C11-15烷基或C16-18烷基或链烯基链，如椰子烷基或其混合物，Z源自在还原胺化反应中的还原糖如葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖。
包含烷氧基化的非离子表面活性剂的非离子表面活性剂系统，所述表面活性剂具有至少6的平均烷氧基化程度与结构ANR1R2的乙醛糖酸酰胺，其中A是糖部分，它是乙醛糖酸(不同之处是它不包含通常从醛糖酸上羰基延伸的OH基团)。NR1R2连接在通常会发现乙醛糖酸上的羟基的位置上。R1与R2可以相同或不同，是氢原子、脂族烃基团、芳基、环脂族基、氨基酸酯或醚胺。R1和R2不能都是氢原子(如WO 95/2770中所描述的)。
其它所谓的非离子去垢剂化合物包括长链氧化叔胺、长链氧化叔膦和二烷基亚砜。
高度优选的阴离子表面活性剂包括烷基烷氧化的硫酸盐表面活性剂，该表面活性剂是式RO(A)mSO3M的水溶性的盐或酸，其中R是具有C10-C24烷基组分的非取代的C10-C24烷基或羟烷基，优选的是C12-C20烷基或羟烷基，更优选地是C12-C18烷基或羟烷基，A是乙氧基或丙氧基单位，m大于零，典型地在大约0.5至大约6之间，更优选地在大约0.5至大约3之间，M是H或阳离子，可以是，例如，金属阳离子(例如，钠、钾、锂、钙、镁等)、铵或取代铵阳离子。烷基乙氧化硫酸盐以及烷基丙氧化硫酸盐包括在本文之内。取代的铵阳离子的特定例子包括甲基-、二甲基、三甲基铵阳离子和季铵阳离子，如四甲基铵和二甲基哌啶翁阳离子以及源自烷基胺，如乙胺、二乙胺、三乙胺的那些，及其混合物等。例证性的表面活性剂是C12-C18烷基聚乙氧(1.0)硫酸盐(C12-C18E(1.0)M)、C12-C18烷基聚乙氧(2.25)硫酸盐(C12-C18(2.25)M)、C12-C18烷基聚乙氧(3.0)硫酸盐(C12-C18E(3.0)M)、以及C12-C18烷基聚乙氧(4.0)硫酸盐(C12-C18E(4.0)M)，其中M方便地选自钠和钾。所利用的适合的阴离子表面活性剂是烷基酯磺酸盐表面活性剂(包括C8-C20羧酸(即脂肪酸)的线性酯)，该羧酸按照“美国石油化学家学会杂志”，52(1975)，p323-329用气体SO3磺化。适合的开始物质包括天然的脂肪物质，如源自牛脂、棕榈油等的物质。
优选的烷基酯磺酸盐表面活性剂(具体地说用于洗衣)包含结构式如下的烷基酯磺酸盐表面活性剂：
其中R3是C8-C20烃基，优选地是烷基或其组合，R4是C1-C6烃基，优选地是烷基或其组合，M是与烷基酯磺酸盐形成水溶性盐的阳离子。适合形成盐的阳离子包括金属(如钠、钾和锂)与取代或非取代铵阳离子(如一乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺)。优选地，R3是C10-C16烷基，R4是甲基、乙基或异丙基。尤其优选的是甲酯磺酸盐，其中R3是C10-C16烷基。
其它适合的阴离子表面活性剂包括烷基硫酸盐表面活性剂，该表面活性剂是式ROSO3M的水溶性盐或酸，其中R优选地是C10-C24烃基，优选地是具有C10-C20烷基组分的烷基或羟烷基，更优选地是C12-C18烷基或羟烷基，M是H或阳离子，例如，碱金属阳离子(如钠、钾、锂)或铵或取代铵(如甲基-、二甲基-和三甲基铵阳离子与季铵阳离子，如四甲基铵和二甲基哌啶翁阳离子以及源自烷基胺如乙胺、二乙胺、三乙胺的季铵阳离子，及其混合物等)。典型地，C12-C16的烷基链对于较低的洗涤温度(如低于大约50℃)是优选的，C16-C18的烷基链对于较高洗涤温度(如高于50℃)是优选的。
用于洗涤目的的其它阴离子表面活性剂也可以包括在本发明的洗衣去垢剂组合物中。这些组合物可以包括皂的盐(包括，例如，钠、钾、铵以及取代铵盐，如一、二和三乙醇胺盐)、C8-C22伯或仲烷基磺酸盐、C8-C24烯属磺酸酯、磺化多羧酸(通过碱土金属柠檬酸的热解产物的磺酸化制备，例如，如在GB 1,082,179中所描述的)、C8-C24烷基聚乙二醇醚硫酸盐(包含多达10摩尔的环氧乙烷)；烷基甘油磺酸盐、脂肪酰基甘油磺酸盐、脂肪油酰甘油硫酸盐、烷基酚环氧乙烷醚硫酸盐、石蜡磺酸盐、烷基磷酸盐、羟乙基磺酸酯(如酰基羟乙基磺酸酯、烷氧基羧酸的羟乙基磺酸酯(如在WO95/14661中所描述的)、N-酰基牛磺酸盐(taurates)、烷基琥珀酰胺酸酯和磺基琥珀酸酯、磺基琥珀酸单酯(尤其是饱和的与不饱和的C12-C18单酯)和磺基琥珀酸二酯(尤其是饱和的与不饱和的C6-C12二酯)、酰基肌氨酸盐、油酰基肌氨酸盐、烷基多糖硫酸盐如烷基多葡糖苷硫酸盐(非离子非硫酸盐化的化合物见下述)、支链伯烷硫酸盐以及烷基聚乙氧羧酸盐如式RO(CH2CH2O)k-CH2C00-M+的羧酸盐，其中R是C8-C22烷基，k是1至10的整数，M是形成可溶性盐的阳离子)。树脂酸和氢化树脂酸也是适合的，如存在于或源自妥尔油的松香、氢化松香以及树脂酸和氢化树脂酸。烷基苯磺酸盐是高度优选的，尤其是线形烷基苯磺酸盐(LAS)，其中烷基优选地包含10至18个碳原子。
其它例子在“表面活性剂和洗涤剂”(第I和II卷，Schwartz、Perrry和Berch)中描述。各种这样的表面活性剂总体上在美国专利3,929,678(23列、58行至29列、23行)中公开。
当包括在其中时，本发明的洗衣去垢剂组合物典型地包含重量的大约1％至大约40％，优选地包含大约3％至大约20％的阴离子表面活性剂。
本发明的洗衣去垢剂组合物也可以包含阳离子的、两性的、两性离子的和半极性的表面活性剂以及不同于本文已经描述的表面活性剂的非离子和/或阴离子表面活性剂。
适合于本发明的洗衣去垢剂组合物的阳离子洗涤剂表面活性剂是具有一条长链烃基的表面活性剂。这样的阳离子表面活性剂的例子包括铵表面活性剂(如烷基三甲基卤化铵)以及具有下式的表面活性剂：
[R2(OR3)y][R4(OR3)y]2R5N+X-
其中R2是在烷基链中具有大约8至大约18个碳原子的烷基或烷苄基，每个R3选自-CH2CH2-、-CH2CH(CH3)-、-CH2CH(CH2OH)-、-CH2CH2CH2-及其混合物；每个R4选自C1-C4烷基、C1-C4羟烷基、通过连接两个R4基团所形成的苄基环结构、-CH2CHOHCHOHCOR6CHOHCH2OH(其中当y不是0时，R6是具有分子量小于大约1000的任何己糖或己糖聚合物以及氢)；R5与R4相同或是烷基链，其中碳原子的总数或R2加R5不大于大约18；每个y是0至大约10，y值的总数是0至大约15；X是任何相容的阴离子。
高度优选的阳离子表面活性剂是在本发明化合物中使用的、具有下式的水溶性季铵化合物：
R1R2R3R4N+X-(i)
其中R1是C8-C16烷基，R2、R3与R4独立地是C1-C4烷基、C1-C4羟烷基、苄基与-(C2H40)xH(其中x值为2至5)，而且X是阴离子。R2、R3或R4中不超过一个应该是苄基。
R1优选的烷基链长度是C12-C15，特别是当烷基是源自椰子或棕榈核脂肪的链长的混合物或合成地源自烯烃增大或OXO醇合成时。
R2R3和R4优选的基团是甲基和羟乙基，阴离子X可以选自卤化物、甲基硫酸、醋酸盐和磷酸盐离子。本文使用的适合的式(i)的季铵化合物的例子是：
椰子三甲基氯化或溴化铵；
椰子甲基二羟乙基氯化或溴化铵；
癸基三乙基氯化铵；
癸基二甲基羟乙基氯化或溴化铵；
C12-15二甲基羟乙基氯化或溴化铵；
椰子二甲基羟乙基氯化或溴化铵；
肉豆蔻基三甲基甲基硫酸铵；
月桂基二甲基苄基氯化或溴化铵；
月桂基二甲基(氧乙烯基)4氯化或溴化铵；
胆碱酯(式(i)的化合物，其中R1是
烷基，R2R3R4是甲基)。
二烷基咪唑啉[式(i)的化合物]。
本文使用的其它阳离子表面活性剂也在美国专利4,228,044和EP 000224中描述。
当包括在其中时，本发明的洗衣去垢剂组合物典型地包含重量的0.2％至大约25％，优选地包含大约1％至大约8％的这类阳离子表面活性剂。
两性表面活性剂也适用于本发明的洗衣去垢剂组合物。这些表面活性剂可以广义地描述为仲或叔胺的脂族衍生物或杂环仲和叔胺的脂族衍生物，其中脂族基团可以是直链或支链。一个脂族取代基包含至少大约8个碳原子，典型地包含大约8至大约18个碳原子，至少一个包含阴离子水增溶基团(如羧基、磺酸盐、硫酸盐)。参见美国专利3,929,678(19列，18-35行)两性表面活性剂的例子。
当包括在其中时，本发明的洗衣去垢剂组合物典型地包含重量的0.2％至大约15％，优选地包含大约1％至大约10％的这类两性表面活性剂。
两性离子表面活性剂也适用于洗衣去垢剂组合物。这些表面活性剂可以广义地描述为仲和叔胺的衍生物、杂环仲和叔胺的衍生物或季铵、季
Figure G1996196233X19940529D000711
或叔锍化合物的衍生物。参见美国专利3,929,678(19列，38行至22列，48行)两性离子表面活性剂的例子。
当包括在其中时，本发明的洗衣去垢剂组合物典型地包含重量的0.2％至大约15％，优选地包含大约1％至大约10％的这类两性离子表面活性剂。
半极性非离子表面活性剂是非离子表面活性剂的特定类别，该类别包括水溶性胺氧化物(该水溶性胺氧化物包含一个大约10至大约18个碳原子的烷基部分和2个选自包含大约1至大约3个碳原子的烷基和羟烷基的部分)；水溶性膦氧化物(该水溶性膦氧化物包含一个大约10至大约18个碳原子的烷基部分和2个选自包含大约1至大约3个碳原子的烷基和羟烷基的部分)；水溶性亚砜(该水溶性亚砜包含一个大约10至大约18个碳原子的烷基部分和一个选自包含大约1至大约3个碳原子的烷基和羟烷基的部分)。
半极性非离子去垢剂表面活性剂包括具有下式的胺氧化物表面活性剂：
Figure G1996196233X19940529D000712
其中R3是包含大约8至大约22个碳原子的烷基、羟烷基或烷苯基或其混合物；R4是包含大约2至大约3个碳原子的亚烷基或羟亚烷基或其混合物；x是0至大约3：每个R5是包含大约1至大约3个碳原子的烷基或羟烷基或包含大约1至约3个环氧乙烷基团的聚环氧乙烷基团。R5基团可以相互连接(例如，通过氧或氮原子)以形成环状结构。
这些胺氧化物表面活性剂特别包括C10-C18烷基二甲胺氧化物与C8-C12烷氧乙基二羟乙基胺氧化物。
当包括在其中时，本发明的洗衣去垢剂组合物典型地包含重量的0.2％至大约15％，优选地包含大约1％至大约10％的这类半极性非离子表面活性剂。
助洗剂系统
按照本发明的组合物还可以包含助洗剂系统。任何常规的助洗剂系统适用于本文，包括硅铝酸盐物质、硅酸盐、多羧酸盐和脂肪酸、如乙二胺四乙酸盐的物质、金属离子螯合剂如氨基多膦酸盐，特别是乙二胺四亚甲基膦酸和二亚乙基三胺五亚甲基膦酸。本文也可以利用磷酸盐助洗剂，例如，焦磷酸、正磷酸盐或多磷酸盐。
适合助洗剂可以是无机离子交换物质，一般是无机水合的硅铝酸盐物质，更具体地说是水合合成沸石(如水合沸石A、X、B、HS或MAP)。另一种适合的无机助洗剂物质是层状硅酸盐，如SKS-6(Hoechst)。SKS-6是由硅酸钠组成的结晶层状硅酸盐(Na2Si2O5)。
包含一个羧基的适合多羧酸盐包括乳酸、乙醇酸及其醚衍生物(如在BE831,368、BE 821,369和BE 521,370中公开的)。包含两个羧基的多羧酸盐包括琥珀酸、丙二酸、(亚乙二氧基)双乙酸、马来酸、二乙醇酸、酒石酸、丙醇二酸和富马酸的水溶性盐以及醚羧化物(在DE 2,446,686、DE2,446,487、美国专利3,935,257中描述)、亚硫酰基羧化物(在BE 840,623中描述)。包含三个羧基的多羧酸盐包括，特别是，水溶性柠檬酸盐、乌头酸盐和柠康酸盐以及琥珀酸衍生物(如在GB 1,379,241中所描述的羧甲氧琥珀酸盐、在NL申请7205873中所描述的乳氧(lactoxy)琥珀酸盐)和在GB 1,387,447中所描述的氧多羧酸盐物质，如2-氧杂-1，1，3-丙烷三羧酸盐。
包含四个羧基的多羧酸盐包括在GB 1,261,829中公开的氧联二琥珀酸盐，包含磺基取代基的1，1，2，2-乙烷四羧酸盐、1，1，3，3-丙烷四羧酸盐包括在GB 1,398,421、GB 1,398,422与美国专利3,936,448中公开的磺基琥珀酸盐衍生物以及在GB 1,082,179中所描述的磺化热解的柠檬酸盐，同时包含膦酸(phosphone)取代基的多羧酸盐在GB 1,439,000中公开。
脂环和杂环多羧酸盐包括顺式、顺式-顺式-环戊烷四羧酸盐、五羧基(pentacarboxylato)环戊二烯、顺式、顺式、顺式-四氢呋喃-四羧酸盐、顺式-四氢呋喃-2，5-二羧酸盐、四氢呋喃-2，2，5，5-四羧酸盐、己烷-1，2，3，4，5，6-六羧酸盐以及多元醇(如山梨醇、甘露糖醇和木糖醇)的羧甲基衍生物。芳族多羧酸盐包括在GB 1,425,343中公开的苯六甲酸、1，2，4，5-苯四酸、苯二甲酸衍生物。在上述物质中，优选的多羧酸盐是每分子含多达三个羧基的羟羧酸盐，更具体地说是柠檬酸盐。
用于本发明的组合物的优选的助洗剂系统包括水不溶性硅铝酸盐助洗剂(如沸石A)或层状硅酸盐(SKS-6)与水溶性羧酸盐螯合剂(如柠檬酸)的混合物。
包括在按照本发明的去垢剂组合物中的适合螯合剂是亚乙基二胺-N，N’-二琥珀酸(EDDS)或其碱金属、碱土金属、铵或取代铵盐或其混合物。优选的EDDS化合物是游离酸形式及其钠或镁盐。EDDS的这样的优选的钠盐的例子包括Na2EDDS和Na4EDDS。EDDS的这样的优选的镁盐的例子包括MgEDDS和Mg2EDDS。镁盐是包括在按照本发明的组合物中最优选的。
优选的助洗剂系统包括水不溶性硅铝酸盐助洗剂(如沸石A)和水溶性羧酸盐螯合剂(如柠檬酸)的混合物。
可以形成粒状组合物用的助洗剂系统的部分的其它助洗剂物质包括无机物质(如碱金属碳酸盐、碳酸氢盐、硅酸盐)和有机物质(如有机膦酸盐、氨基多亚烷基膦酸盐和氨基多羧酸盐)。
其它适合的水溶性有机盐是高-或共-聚合酸或其盐，其中多羧酸包括至少两个被不超过两个碳原子相互分离的羧基。
这种类型的聚合物在GB-A-1,596,756中公开。这样的盐的例子是MW2000-5000的聚丙烯酸盐及其与马来酐的共聚物，这样的共聚物具有20,000至70,000的分子量，具体地说是大约40,000。
去垢剂助洗剂盐通常以组合物重量的5％至80％的量包括在内。用于液体去垢剂的助洗剂的优选的水平是5％至30％。
酶
优选的去垢剂组合物除了本发明的酶之外还包含其它酶，这些酶提供了清洁性能和/或织物护理益处。这样的酶包括蛋白酶、脂酶、角质酶、淀粉酶、纤维素酶、过氧化物酶、氧化酶(如漆酶)。
蛋白酶：可以使用任何在碱性溶液中使用的蛋白酶。适合的蛋白酶包括动物、植物或微生物起源的蛋白酶。微生物起源是优选的。本发明包括化学或遗传修饰的突变体。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶，优选地是碱性微生物蛋白酶或类胰蛋白酶蛋白酶。碱性蛋白酶的例子是枯草溶菌素，具体地说是源自芽孢杆菌属的枯草溶菌素，例如，枯草溶菌素Novo、枯草溶菌素Carlsberg、枯草溶菌素309、枯草溶菌素147和枯草溶菌素168(在WO89/06279中描述)。类胰蛋白酶蛋白酶的例子是在WO89/06270中描述的胰蛋白酶(如猪或牛起源)以及镰孢菌属蛋白酶。优选的市售蛋白酶包括以商品名Alcalase、Savinase、Primase、Durazym和Esperase由NovoNordisk A/S(Denmark)出售的蛋白酶、以商品名Maxatase、Maxacal、Maxapem和Properase由Gist-Brocades/Genencor出售的蛋白酶、以商品名Purafect和Purafect OXP由Genencor International出售的蛋白酶以及以商品名Opticlean和Optimase由Solvay Enzymes出售的蛋白酶。蛋白酶可以以组合物重量0.0001％至2％酶蛋白质的水平(具体地说以组合物重量的0.001％至0.1％的酶蛋白质的水平)掺入本发明的组合物。
脂酶：可以使用任何适用于碱性溶液的脂酶。适合的脂酶包括细菌起源或真菌起源的脂酶和化学或遗传修饰的脂酶突变体。
有用的脂酶的例子包括Humicola lanuginosa脂酶(例如，在EP 258 068和EP 305 216中所描述的)及其突变体(在WO 92/05249、WO 95/22615、WO 94/25577中描述的)、Rhizomucor miehei脂酶(如在EP 238 023中所描述D)、假丝酵母属脂酶(如C.antarctica脂酶，例如在EP 214 761中描述的C.antarctica脂酶A或B)、假单胞菌属脂酶(如产碱假单胞菌以及类产碱假单胞菌脂酶，例如，在EP 218 272中所描述的)或所说的假单胞菌属脂酶的任何突变体、洋葱伯克霍尔德氏菌脂酶(例如，在EP 331 376中所描述的)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)脂酶(例如，在BP 1,372,034中公开的)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)脂酶、芽孢杆菌属脂酶(例如，枯草杆菌脂酶(Dartois等，(1993)，Biochemica et Biophysica Acta 1131，253-256)、嗜热脂肪芽孢杆菌脂酶(JP 64/744992)以及短小芽孢杆菌脂酶(WO91/16422)。而且，许多克隆的脂酶是有用的，包括由Yamaguchi等，(1991)，基因103，61-67描述的沙门柏干酪青霉脂酶、白地霉(Geotricumcandidum)脂酶(Schimada，Y.等，(1989)，生物化学杂志，106，383-388)以及各种根霉属脂酶(如R.delemar脂酶(Hass，M.J等，(1991)，基因109，117-113)、雪白根霉脂酶(Kugimiya等，(1992)，生物科学生物技术生物化学，56，716-719)和米根霉脂酶。
其它类型的脂解酶(如角质酶)也可以是有用的，例如，源自门多萨假单胞菌的脂酶(如在WO 88/09367中所描述的)、或源自腐皮镰孢pisi的角质酶(如在WO 90/09446中所描述的)。尤其适合的脂酶是下述脂酶，如M1LipaseTM、Luma fastTM和LipomaxTM(Gist-Broca-des/Genencor)、LipolaseTM和Lipolase  UltraTM(Novo Nordisk A/S)以及LipaseP“Amano”(Amano药学有限公司)。
脂酶通常以去垢剂组合物重量0.0001％至2％酶蛋白质的水平(具体地说以组合物重量的0.001％至0.1％的酶蛋白质水平)掺入本发明的去垢剂组合物。
淀粉酶：可以使用任何适用于碱性溶液的淀粉酶(a和/或b)。适合的淀粉酶包括细菌或真菌起源的淀粉酶。本发明也包括化学或遗传修饰的突变体。淀粉酶包括，例如，获自地衣形芽孢杆菌特定菌株的α-淀粉酶(在GB1,296,839中更详细地描述)。市售的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM和BANTM(可从Novo Nordisk A/S得到)和RapidaseTM以及Maxamyl PTM(可从Gist-Brocades/Genencor得到)。
淀粉酶通常以去垢剂组合物重量0.0001％至2％酶蛋白质的水平(具体地说以组合物重量的0.001％至0.1％的酶蛋白质水平)掺入本发明的组合物。
纤维素酶：可以使用任何适用于碱性溶液的纤维素酶。适合的纤维素酶包括细菌或真菌起源的纤维素酶。本发明也包括化学或遗传修饰的突变体。适合的纤维素酶在美国专利4,435,307中公开，它公开了产自Humicolainsolens的真菌纤维素酶。尤其适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的纤维素酶。这样的纤维素酶的例子是在出版的欧洲专利申请0495257中描述的纤维素酶。市售的纤维素酶是由Humicola insolens菌株产生的Novo Nordisk A/S)和
Figure G1996196233X19940529D000762
Kao公司)。
所说的纤维素酶通常以去垢剂组合物重量0.0001％至2％酶蛋白质的水平(具体地说以组合物重量的0.001％至0.1％的酶蛋白质水平)掺入本发明的组合物。
过氧化物酶/氧化酶：可以使用过氧化物酶和/或氧化酶，如漆酶，前者与过氧化氢来源(例如过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐)组合用于溶液漂白(即当所说的织物在洗液中共同洗涤时，防止纺织品染料从染色的织物转移到其它织物上)，优选地与在例如，WO 95/01426和WO 94/12621所描述的增强剂一起。这些类型的适合的酶包括植物、细菌或真菌起源的酶。本发明也包括化学或遗传修饰的突变体。
所说的过氧化物酶和/或氧化酶可以以去垢剂组合物重量0.0001％至2％酶蛋白质的水平(具体地说以组合物重量的0.001％至0.1％的酶蛋白质水平)掺入去垢剂组合物。
以上提及的酶的混合物包括在本文之内，特别是蛋白酶、淀粉酶、脂酶和/或纤维素酶的混合物。
任选的去垢剂成分
漂白剂：可以包括在本发明的去垢剂组合物中的其它任选的去垢剂成分包括过氧化物漂白剂，如过硼酸钠-水(1/1)、PB1、过硼酸钠-水(1/4)、PB4与碳酸钠-过氧化氢2/3、过碳酸盐，其粒子大小为400-800微米。如果包括，过氧化物漂白剂典型地以大约1％至大约25％的水平存在。
其它可以利用的基于过氧化物的漂白剂是过羧酸及其盐。这类药剂的适合的例子包括一过氧邻苯二甲酸镁六水合物、间-氯代-过苯甲酸镁盐、4-壬氨基-4-羰基过氧丁酸和二过氧十二烷二酸。这样的漂白剂在美国专利4,483,781、美国专利740,446、EP 0 133 354和美国专利4,412,934中公开。高度优选的漂白剂也包括在美国专利4,634,551中描述的6-壬氨基-6-羰基过氧己酸。
本文使用的漂白剂也可以是本领域已知的用于去垢剂组合物的其它漂白剂。
非水液体洗涤剂组合物可以包含过氧酸物质，例如，由N，N’-二(4-过羧基苯甲酰基)乙二胺(PCBED)、N，N-对苯二酰-二(6-氨基过羧己酸)(TPCAP)、N，N’-二(4-过羧基苯甲酰基)哌嗪(PCBPIP)、N，N’-二(4-过羧基苯甲酰基)-1，4-二氨基环己烷(PCBHEX)、N，N’-二(4-过羧基苯甲酰基)-1，4-丁二胺(PCBBD)、N，N’-二(4-过羧基苯胺)-对苯二酸盐(DPCAT)、N，N，N’N’-1，2，4，5-四羧基苯甲酰基-二(6-氨基过羧基己酸)(DiPAP)、N，N’-二(过羧基己二酰)苯二胺(DPAPD)、N，N’-琥珀酰-二(4-过羧基)苯胺(SDPCA)、N，N’-对苯二酰-二(8-氨基过氧辛酸)(TPOCT)(如在WO95/06104中所描述的)组成的过氧酸。
可以使用的另一个这类漂白剂包括卤素漂白剂。释放次卤化物(hypohalite)的漂白剂的例子，例如，包括三氯异氰脲酸以及二氯异氰脲酸钠和钾盐、N-氯代和N-溴代链烷磺胺。这样的物质通常以最终产物重量的0.5-10％添加，优选地是重量的1-5％。
另一类具有特殊利益的不基于过氧化物酶的漂白剂包括光活化的漂白剂(如磺化锌和/或铝酞菁染料)。这些物质在洗涤过程中可以沉积在底物上。在氧存在下，通过用光照射(如通过挂衣服在日光下干燥)，磺化酞菁复合物被活化，随后，底物被漂白。优选的锌酞菁复合物和光活化的漂白方法在美国专利4,033,718中描述。典型地，去垢剂组合物包含大约0.025％至大约1.25％(重量)的磺化锌酞菁。
基于过氧化物的漂白剂可以与漂白活化剂(如四乙酰乙二胺(TAED)、壬酰氧苯磺酸盐(NOBS，在美国专利4,412,934中描述)、3，5，5-三甲基己酰氧苯磺酸盐(ISONOBS，在EP 120 591中描述)或五乙酰葡萄糖(PAG))结合使用，所述漂白活化剂被过水解(perhydrolyze)形成作为活性漂白物质的过酸，导致提高的漂白效果。另外，十分适合的是漂白活化剂6-辛酰氨基己酰氧苯磺酸盐、6-壬酰氨基己酰)氧苯磺酸盐和6-癸酰氨基己酰氧苯磺酸盐或其混合物。也适合的活化剂是酰化的柠檬酸酯，如在欧洲专利申请91870207.7中公开的。
也有用的漂白剂包括过氧酸和漂白系统(包含用于按照本发明的清洁组合物的漂白活化剂和过氧漂白化合物)，如在申请USSN 08/136,626中所描述的。
过氧化氢也可以通过把酶促系统(即酶及其底物)添加在去垢剂溶液中产生，该酶促系统在洗涤和/或冲洗过程开始时或在其期间能够产生过氧化氢。这样的酶促系统在出版的EP专利申请0537381中公开。
从过氧漂白来源释放过酸可以通过使用本发明的脂酶活化。用于酶促水解系统的必要组分是过酸前体底物：二酰基过氧化物R1-CO-O-O-CO-R，其中R和R1可以是饱和或不饱和的烷基、芳基或烷芳基。在洗涤中脂酶与底物进行反应并释放过酸。
亚胺季盐可以与WO 95/13352中所描述的过氧化合物一起用作漂白催化剂。
基于过氧化物的漂白系统也可以包括锰催化剂。锰催化剂可以，例如，是在“低温漂白有效的锰催化剂”，自然369，1994，637-639中所描述的化合物之一。
抑泡剂：另一个任选的成分是抑泡剂，以例说明的是有机硅氧聚合物，以及硅石-硅氧烷混合物。有机硅氧聚合物通常可以由烷基化的聚硅氧烷物质代表，而硅石通常以细分形式使用，通过各种类型的硅气凝胶、干凝胶和疏水硅石示例说明。这些物质可以作为微粒掺入，其中抑泡剂优选地可释放地掺入水溶性或水可分散性、实质上非表面活性去垢剂不透性载体。另外，可以将抑泡剂溶解或分散在液态载体中，并通过喷雾到一种或多种其它组分上应用。
优选的硅氧烷泡沫控制剂在美国专利3,933,672中公开。其它特别有用的抑泡剂是自身乳化的硅氧烷抑泡剂(在DE 2,646,126中描述)。这样的化合物的例子是DC-544，由Dow Corning市售，它是硅氧烷-乙二醇共聚物。尤其优选的泡沫控制剂是包含硅氧烷油与2-烷基-链烷醇的混合物的抑泡剂系统。适合的2-烷基-链烷醇的2-丁基-辛醇(以商品名Isofol 12R出售)。
这样的抑泡剂系统在出版的欧洲专利中请0593841中描述。
特别优选的硅氧烷泡沫控制剂在出版的欧洲专利申请0573699中描述。所说的组合物可以包含与烟雾的非多孔硅石AerosilR组合的硅氧烷/硅石混合物。
以上所述的抑泡剂通常以组合物重量的0.001％至2％的水平使用，优选地是重量的0.01％至1％。
其它组分：可以使用其它用于去垢剂组合物的组分，如污垢悬浮剂、污垢释放剂、荧光增白剂、研磨剂、杀菌剂、晦暗抑制剂、着色剂和/或胶囊化的或非胶囊化的香料。
尤其适合的胶囊化物质是水溶性胶囊，该胶囊由在GB 1,464,616中描述的多糖和多羟基化合物的基质组成。
其它适合的水溶性胶囊化物质包括源自取代的二羧酸的未凝胶化的淀粉酸酯的糊精，如在美国专利3,455,838中所描述的。
这些酸酯糊精优选地制备自这样的淀粉，如含蜡玉米、含蜡高粱、西米、木薯淀粉和马铃著。所说的胶囊化物质的适合例子包括由NationalStarch制造的N-Lok。N-Lok胶囊化物质是由修饰的玉米淀粉和葡萄糖组成。淀粉通过添加单功能的取代基团(如辛烯基琥珀酸酐)修饰。
本文适合的抗再沉积剂和污垢悬浮剂包括纤维素衍生物如甲基纤维素、羧甲基纤维素和羟乙基纤维素、高-或共-聚合多羧酸或其盐。这种类型的聚合物包括聚丙烯酸酯和马来酐-丙烯酸共聚物，例如，Sokalan CP5(前面作为助洗剂提到)以及马来酐与乙烯、甲基乙烯基醚或异丁烯酸的共聚物。马来酐占共聚物至少为20摩尔百分数。这些物质通常以组合物重量的0.5％至10％的水平使用，更优选地是0.75％至8％，最优选地是1％至6％。
优选的荧光增白剂特征是阴离子的，其例子是4，4’-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)二苯乙烯-2：2’二磺酸二钠、4，-4’-双-(2-吗啉代-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基-二苯乙烯-2：2’二磺酸二钠、4，4’-双-(2，4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)二苯乙烯-2：2’二磺酸二钠、4’，4”-双-(2，4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)二苯乙烯-2-磺酸单钠、4，4’-双-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羟乙氨基)-s-三嗪-6-基氨基)二苯乙烯-2，2’二磺酸二钠、4，4’-双-(4-苯基-2，1，3-三唑-2-基)-二苯乙烯-2，2’-二磺酸二钠、4，4’-双-(2-苯胺基-4-(1-甲基-2-羟乙氨基)-s-三嗪-6-基氨基)二苯乙烯-2，2’二磺酸二钠、2(二苯乙烯基(stilbyl)-4”-(萘并-1’，2’：4，5)-1，2，3-三唑-2”磺酸钠以及4，4’-双-(2-磺基苯乙烯基)联苯。
其它有用的聚合物是聚乙二醇，具体地说是分子量为1000-10000的聚乙二醇，更具体地说是2000至8000，最优选地是约4000。这些以重量的0.20％至5％的水平利用，更优选地是0.25％至2.5％。这些聚合物与以前所论及的高-或共-聚合多羧酸盐用于改进白色保养、织物灰沉积和对粘土、蛋白质和可氧化的污垢(在过渡金属元素杂质存在时)的清洁性能是有价值的。
也可以利用在WO 95/22593中所描述的接枝聚合物。
在本发明的组合物中有用的污垢释放剂通常是对苯二甲酸与乙二醇和/或丙二醇单位以各种排列形成的共聚物或三元共聚物。这样的聚合物的例子在美国专利4,116,885、美国专利4,711,730和EP 0 272 033中公开。按照EP 0 272 033的尤其优选的聚合物具有式：
(CH3(PEG)43)0.75(POH)0.25[T-PO)2.8(T-PEG)0.4]T(POH)0.25((PEG)43CH3)0.75
其中PEG是-(OC2H4)O-，PO是(OC3H6O)，T是(pcOC6H4CO)。
也十分有用的是作为下列物质的无机共聚物的改性聚酯：对苯二甲酸二甲基酯、磺基苯二甲酸二甲酯、乙二醇和1-2丙二醇，主要由磺基苯甲酸酯次要地由乙二醇和/或丙二醇的单酯组成端基。目的在于获得在其两个末端“主要”由磺基苯甲酸酯基封闭的聚合物，在本发明的上下文中，本文所说的大多数共聚物由磺基苯甲酸酯基封端。然而，某些共聚物不是完全封闭的，因此其端基可以由乙二醇和/或丙烷1-2二醇的单酯组成，其“次要地”由这样的物质组成。
本文选择的聚酯包含重量的大约46％的二甲基对苯二甲酸、重量的大约16％的丙烷-1.2二醇、重量的大约10％的乙二醇、重量的大约13％的二甲基磺基苯甲酸、重量的大约15％的磺基间苯二甲酸，并具有大约3.000的分子量。聚酯及其制备方法在EP 311 342中详尽地描述。
软化剂：按照本发明，织物软化剂也可以掺入洗衣去垢剂组合物中。这些物质可以是无机或有机的。无机软化剂通过在GB-A-1400898和美国专利5,019,292中公开的绿粘土(smectite clay)以例说明。有机织物软化剂包括如在GB-A1 514 276和EP 0 011 340中公开的水不溶性叔胺类，在EP026 528中公开的其与单C12-C14季铵盐的组合，在EP 0 242 919中公开的二长链酰胺。其它有用的织物软化系统的有机成分包括在EP 0 299 575和0313 146中公开的高分子量的聚环氧乙烷物质。
绿粘土的水平通常在5％至15％的范围内，更优选地是重量的8％至12％，其作为干燥的混合组分添加至制剂的其余部分。有机织物软化剂(如水不溶性叔胺类或二长链酰胺物质)以重量的0.5％至5％的水平掺入，通常是重量的1％至3％，而高分子量的聚环氧乙烷物质与水溶性阳离子物质以重量的0.1％至2％的水平添加，通常是重量的0.15％至1.5％。这些物质通常添加至组合物的喷雾干燥部分，虽然在某些实例中，可以更方便地以干燥的混合微粒形式添加它们，或以熔化的液体形式喷雾到组合物的其它组分中。
聚合染料转移抑制剂：按照本发明的去垢剂组合物也可以包含重量的0.001％至10％、优选地是0.01％至2％、更优选地是0.05％至1％的聚合染料转移抑制剂。所说的聚合染料转移抑制剂通常掺入去垢组合物以抑制染料从着色织物上转移至与其一起洗涤的织物上。这些聚合物在染料有机会吸附到洗涤的其它织物前有能力复合或吸附从染色织物洗出的游离染料。
尤其适合的聚合染料转移抑制剂是多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮和N-乙烯咪唑的共聚物、聚乙烯吡咯烷酮聚合物、聚乙烯噁唑烷酮、聚乙烯咪唑或其混合物。添加这样的聚合物也提高了按照本发明的酶的性能。
按照本发明的去垢剂组合物可以是液体、糊状物、凝胶、棒状物或粒状形式。无尘粒剂可以如在美国专利4,106,991和4,661,452(均属于NovoIndustri A/S)公开的方法产生并任选地按照本领域已知的方法包衣。蜡状表面盖覆剂的例子是具有1000至20000的平均分子量的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单位的乙氧化的壬基酚；乙氧化的脂肪醇(其中所说的醇包含12至20个碳原子，其中具有15至80个环氧乙烷单位)；脂肪醇；脂肪酸；脂肪酸的单、双和三甘油酯。适合于通过流化床技术应用的成膜表面盖覆剂的例子在GB 1483591中给出。
按照本发明的粒状组合物也可以是“致密形式”，即它们可以有比常规粒状去垢剂更高的密度，即550至950g/l；在这样的情况下，按照本发明的粒状去垢剂组合物与常规的粒状去垢剂相比包含更低量的“无机填料盐”；典型的填料盐是硫酸盐和氯化物的碱土金属盐，典型地是硫酸钠；“致密”的去垢剂典型地包含不超过10％的填料盐。按照本发明的液态组合物也可以是“浓缩形式”，在这样的情况下，按照本发明的液体洗涤剂与常规液体洗涤剂相比包含更低量的水。典型地，浓缩液体去垢剂的水含量低于去垢剂组合物重量的30％，更优选地是低于20％，最优选地是低于10％。
本发明的组合物可以，例如制成手工和机械洗衣去垢剂组合物，该洗衣去垢剂组合物包括洗衣添加组合物和适用于染色织物预处理、冲洗添加的织物软化剂组合物的组合物以及用于一般家庭硬表面清洁操作和餐具洗涤操作的组合物。
本发明中的洗衣去垢剂组合物的特定形式包括：
1)具有至少600g/l的堆积密度的制成粒剂的去垢剂组合物，该组合物包含：
  线性烷基苯磺酸盐(作为酸计算)   7-12％
  脂肪醇乙氧基硫酸盐(如C<sub>12-18</sub>醇，1-2EO)或烷基硫酸盐(如C<sub>16-18</sub>)   1-4％
  脂肪醇乙氧化物(如C<sub>14-15</sub>醇，7EO)   5-9％
  碳酸钠(作为Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>)   14-20％
  可溶性硅酸盐(作为Na<sub>2</sub>O，2SiO<sub>2</sub>)   2-6％
  线性烷基苯磺酸盐(作为酸计算)   7-12％
  沸石(作为NaAlSiO<sub>4</sub>)   15-22％
  硫酸钠(作为Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)   0-6％
  柠檬酸钠/柠檬酸(作为C<sub>6</sub>H<sub>5</sub>Na<sub>3</sub>O<sub>7</sub>/C<sub>6</sub>H<sub>8</sub>O<sub>7</sub>)   0-15％
 过硼酸钠(作为NaBO<sub>3</sub>.H<sub>2</sub>O)   11-18％
 TAED   2-6％
 羧甲基纤维素   0-2％
 聚合物(如马来酸/丙烯酸共聚物、PVP、PEG)   0-3％
 酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1％
 次要组分(如抑泡剂、香料、荧光增白剂、光漂白剂)   0-5％
2)具有至少600g/l的堆密度的制成粒剂的去垢剂组合物，该组合物包含：
  线性烷基苯磺酸盐(作为酸计算)   6-11％
  脂肪醇乙氧基硫酸盐(如C<sub>12-18</sub>醇，1-2EO)或烷基硫酸盐(如C<sub>16-18</sub>)   1-3％
  脂肪醇乙氧化物(如C<sub>14-15</sub>醇，7EO)   5-9％
  碳酸钠(作为Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>)   15-21％
  可溶性硅酸盐(作为Na<sub>2</sub>O，2SiO<sub>2</sub>)   1-4％
  沸石(作为NaAlSiO<sub>4</sub>)   24-34％
  硫酸钠(作为Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)   4-10％
  柠檬酸钠/柠檬酸(作为C<sub>6</sub>H<sub>5</sub>Na<sub>3</sub>O<sub>7</sub>/C<sub>6</sub>H<sub>8</sub>O<sub>7</sub>)   0-15％
  羧甲基纤维素   0-2％
  线性烷基苯磺酸盐(作为酸计算)   6-11％
  聚合物(如马来酸/丙烯酸共聚物、PVP、PEG)   1-6％
  酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1％
  次要组分(如抑泡剂、香料)   0-5％
3)具有至少600g/l的堆密度的制成粒剂的去垢剂组合物，该组合物包含：
  线性烷基苯磺酸盐(作为酸计算)   5-9％
  脂肪醇乙氧化物(如C<sub>12-15</sub>醇，7EO)   7-14％
  作为脂肪酸的皂(如C<sub>16-22</sub>脂肪酸)   1-3％
  碳酸钠(作为Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>)   10-17％
  可溶性硅酸盐(作为Na<sub>2</sub>O，2SiO<sub>2</sub>)   3-9％
  沸石(作为NaAlSiO<sub>4</sub>)   23-33％
  硫酸钠(作为Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)   0-4％
  过硼酸钠(作为NaBO<sub>3</sub>.H<sub>2</sub>O)   8-16％
  TAED   2-8％
  膦酸盐(如EDTMPA)   0-1％
  羧甲基纤维素   0-2％
  聚合物(如马来酸/丙烯酸共聚物、PVP、PEG)   0-3％
  酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1％
  次要组分(如抑泡剂、香料、荧光增白剂)   0-5％
4)具有至少600g/l的堆密度的制成粒剂的去垢剂组合物，该组合物包含：
 线性烷基苯磺酸盐(作为酸计算)   8-12％
 脂肪醇乙氧化物(如C<sub>12-15</sub>醇，7EO)   10-25％
 碳酸钠(作为Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>)   14-22％
 可溶性硅酸盐(作为Na<sub>2</sub>O，2SiO<sub>2</sub>)   1-5％
 沸石(作为NaAlSiO<sub>4</sub>)   25-35％
 硫酸钠(作为Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)   0-10％
 羧甲基纤维素   0-2％
 聚合物(如马来酸/丙烯酸共聚物、PVP、PEG)   1-3％
 酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1％
 次要组分(如抑泡剂、香料)   0-5％
5)一种含水液体去垢剂组合物，该组合物包含：
  线性烷基苯磺酸盐(作为酸计算)   15-21％
  脂肪醇乙氧化物(如C<sub>12-15</sub>醇，7EO或C<sub>12-15</sub>醇，5EO)   12-18％
  作为脂肪酸的皂(如油酸)   3-13％
  烯基琥珀酸(C<sub>12-14</sub>)   0-13％
  氨基乙醇   8-18％
  柠檬酸   2-8％
  膦酸盐   0-3％
  聚合物(如PVP、PEG)   0-3％
  硼酸盐(作为B<sub>4</sub>O<sub>7</sub>)   0-2％
  线性烷基苯磺酸盐(作为酸计算)   15-21％
  乙醇   0-3％
  丙二醇   8-14％
  酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1％
  次要组分(如分散剂、抑泡剂、香料、荧光增白剂)   0-5％
6)一种含水液体去垢剂组合物，该组合物包含：
  线性烷基苯磺酸盐(作为酸计算)   15-21％
  脂肪醇乙氧化物(如C<sub>12-15</sub>醇，7EO或C<sub>12-15</sub>醇，5EO)   3-9％
  作为脂肪酸的皂(如油酸)   3-10％
  沸石(作为NaAlSiO<sub>4</sub>)   14-22％
  柠檬酸钾   9-18％
  硼酸盐(作为B<sub>4</sub>O<sub>7</sub>)   0-2％
  羧甲基纤维素   0-2％
  聚合物(如PEG、PVP)   0-3％
  锚定聚合物如，例如异丁烯酸月桂基酯/丙烯酸共聚物；摩尔比率25∶1；MW3800   0-3％
  甘油   0-5％
  酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1％
  次要组分(如分散剂、抑泡剂、香料、荧光增白剂)   0-5％
7)具有至少600g/l的堆密度的制成粒剂的去垢剂组合物，该组合物包含：
脂肪醇硫酸盐   5-10％
乙氧基化的脂肪酸一乙醇酰胺   3-9％
作为脂肪酸的皂   0-3％
碳酸钠(作为Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>)   5-10％
可溶性硅酸盐(作为Na<sub>2</sub>O，2SiO<sub>2</sub>)   1-4％
沸石(作为NaAlSiO<sub>4</sub>)   20-40％
硫酸钠(作为Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)   2-8％
过硼酸钠(作为NaBO<sub>3</sub>.H<sub>2</sub>O)   12-18％
TAED   2-7％
聚合物(如马来酸/丙烯酸共聚物、PEG)   1-5％
酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1％
  次要组分(如荧光增白剂、抑泡剂、香料)   0-5％
8)制成粒剂的去垢剂组合物，该组合物包含：
 线性烷基苯磺酸盐(作为酸计算)   8-14％
 乙氧基化的脂肪酸一乙醇酰胺   5-11％
 作为脂肪酸的皂   0-3％
 碳酸钠(作为Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>)   4-10％
 可溶性硅酸盐(作为Na<sub>2</sub>O，2SiO<sub>2</sub>)   1-4％
 沸石(作为NaAlSiO<sub>4</sub>)   30-50％
 硫酸钠(作为Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)   3-11％
 柠檬酸钠(作为C<sub>6</sub>H<sub>5</sub>Na<sub>3</sub>O<sub>7</sub>)   5-12％
 线性烷基苯磺酸盐(作为酸计算)   8-14％
 聚合物(如PVP、马来酸/丙烯酸共聚物、PEG)   1-5％
 酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1％
 次要组分(如抑泡剂、香料)   0-5％
9)制成粒剂的去垢剂组合物
  烷基硫酸盐(例如，C<sub>12-18</sub>)   6-12％
  皂，Na盐   0-3％
  非离子的(例如，脂肪醇乙氧化物C<sub>10-18</sub>，2-7EO)   2-8％
  烷基葡糖酰胺(Alkylglucamid)(例如，C<sub>16-18</sub>)   2-6％
  沸石(作为NaAlSiO<sub>4</sub>)   14-24％
  碳酸钠(作为Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>)   7-13％
  二硅酸钠(作为Na<sub>2</sub>O:2SiO<sub>2</sub>)(例如SKS6)   10-14％
  硫酸钠(作为Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)   5-9％
  过碳酸钠   10-16％
  TAED   1-5％
  CMC   0-3％
  多羧酸盐   1-7％
  聚合物(如PVP、PEG、马来酸/丙烯酸共聚物)   0-2％
  包括脂解酶的酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1％
  次要组分(如抑泡剂、香料、荧光增白剂、光漂白剂)   0-5％
  烷基硫酸盐(例如，C<sub>12-18</sub>)   6-12％
  堆密度(g/l)至少   700
10)制成粒剂的去垢剂组合物
  烷基硫酸盐(例如，C<sub>12-18</sub>)   7-11％
  皂，Na盐   0-3％
  非离子的(例如，脂肪醇乙氧化物C<sub>10-18</sub>，2-7EO)   7-11％
  烷基葡糖酰胺(例如，C<sub>16-18</sub>)   2-6％
  沸石(NaAlSiO<sub>4</sub>)   19-29％
  碳酸钠(Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>)   12-18％
  二硅酸钠(Na<sub>2</sub>O:2SiO<sub>2</sub>)(例如SKS6)   7-11％
  硫酸钠(Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)   5-9％
  CMC   0-3％
  多羧酸盐   4-8％
  聚合物(如PVP、PEG、马来酸/丙烯酸共聚物)   1-3％
  包括脂解酶的酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1％
  次要组分(如抑泡剂、香料、荧光增白剂、光漂白剂)   0-5％
  堆密度(g/l)至少   700
11)制成粒剂的去垢剂组合物
  烷基硫酸盐(例如，C<sub>12-18</sub>)   4-10％
  非离子的(例如，脂肪醇乙氧化物C<sub>10-18</sub>，2-7EO)   2-7％
  烷基硫酸盐(例如，C<sub>12-18</sub>)   4-10％
  磷酸盐(STPP)   17-27％
  碳酸钠(Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>)   4-8％
  二硅酸钠(Na<sub>2</sub>O:2SiO<sub>2</sub>)(例如SKS6)   4-8％
  硫酸钠(Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)   18-26％
  过硼酸钠四水合物   13-19％
  TAED   1-4％
  CMC   0-2％
  包括脂解酶的酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1％
  次要组分(如抑泡剂、香料、荧光增白剂、光漂白剂)   0-5％
  堆密度(g/l)至少   600
12)制成粒剂的去垢剂组合物
  烷基硫酸(例如，C<sub>12-18</sub>)   2-9％
  皂，Na盐   1-4％
  非离子的(例如，脂肪醇乙氧化物C<sub>10-18</sub>，2-7EO)   9-15％
  沸石(NaAlSiO<sub>4</sub>)   35-45％
  碳酸钠(Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>)   3-10％
  二硅酸钠(Na<sub>2</sub>O:2SiO<sub>2</sub>)(例如SKS6)   0-4％
  硫酸钠(Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)   2-6％
  过碳酸钠   14-20％
  TAED   2-7％
  烷基硫酸(例如，C<sub>12-18</sub>)   2-9％
  CMC   0-3％
  多羧酸盐   0-2％
  包括脂解酶的酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1
  次要组分(如抑泡剂、香料、荧光增白剂、光漂白剂)   0-5％
  堆密度(g/l)至少   700
13)制成粒剂的去垢剂组合物
  烷基苯磺酸   8-14％
  烷基硫酸(例如，C<sub>12-18</sub>)   2-6％
  非离子的(例如，脂肪醇乙氧化物C<sub>10-18</sub>，2-7EO)   9-13％
  沸石(NaAlSiO<sub>4</sub>)(例如沸石4A)   20-30％
  碳酸钠(Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>)   0-6％
  二硅酸钠(Na<sub>2</sub>O:2SiO<sub>2</sub>)   0-3％
  硫酸钠(Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)   0-6％
  过硼酸钠四水合物   22-28％
  TAED   5-9％
  CMC   0-2％
  聚合物(如马来酸/丙烯酸共聚物)   0-4％
  包括脂解酶的酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1
  次要组分(如抑泡剂、香料、荧光增白剂、光漂白剂)   0-5％
  堆密度(g/l)至少   600
14)制成粒剂的去垢剂组合物
  烷基苯磺酸   6-12％
  烷基醚硫酸(例如，C<sub>12-18</sub>醇，4-10EO)或烷基硫酸盐(例如C<sub>12-18</sub>)   2-6％
  皂，Na盐   0-2％
  非离子的(例如，脂肪醇乙氧化物C<sub>12-18</sub>，3-10EO)   9-13％
  沸石(NaAlSiO<sub>4</sub>)(例如沸石4A)   39-49％
  碳酸钠(Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>)   2-8％
  二硅酸钠(Na<sub>2</sub>O:2SiO<sub>2</sub>)   0-3％
  硫酸钠(Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)   2-8％
  CMC   0-3％
  聚合物(如马来酸/丙烯酸共聚物)   0-4％
  包括脂解酶的酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1
  次要组分(如抑泡剂、香料、荧光增白剂、光漂白剂)   0-5％
  堆密度(g/l)至少   600
15)制成粒剂的去垢剂组合物
  Alkyl suefate烷基硫酸盐(例如c<sub>12</sub>-C<sub>18</sub>)   2-8％
  皂，Na盐   0-3％
  非离子的(例如，脂肪醇乙氧化物C<sub>12-16</sub>，3-10EO)   10-16％
  沸石(NaAlSiO<sub>4</sub>)(例如沸石4A)   47-57％
  碳酸钠(Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>)   15-23％
  Alkyl suefate烷基硫酸盐(例如c<sub>12</sub>-C<sub>18</sub>)   2-8％
  柠檬酸钠/柠檬酸(C<sub>6</sub>H<sub>5</sub>Na<sub>3</sub>O<sub>7</sub>/C<sub>6</sub>H<sub>8</sub>O<sub>7</sub>)   0-16％
  硫酸钠(Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)   1-5％
  CMC   0-3％
  多羧酸盐   0-2％
  聚合物(如PVP)   0-2％
  包括脂解酶的酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1
  次要组分(如抑泡剂、香料、荧光增白剂、光漂白剂)   0-5％
  堆密度(g/l)至少   800
16)制成粒剂的去垢剂组合物
  烷基苯磺酸   0-3％
  非离子的(例如，脂肪醇乙氧化物C<sub>12-18</sub>，3-10EO)   1-5％
  磷酸盐(STPP)   12-18％
  碳酸钠(Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>)   16-24％
  二硅酸钠(Na<sub>2</sub>O:2SiO<sub>2</sub>)   1-3％
  硫酸钠(Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)   38-48％
  过硼酸钠四水合物   8-14％
  TAED   0-3％
  CMC   0-3％
  包括脂解酶的酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1
  次要组分(如抑泡剂、香料、荧光增白剂、光漂白剂)   0-5％
  烷基苯磺酸   0-3％
  堆密度(g/l)至少   500
17)制成粒剂的去垢剂组合物
  皂，Na盐   1-3％
  非离子的(例如，脂肪醇乙氧化物C<sub>12-18</sub>，3-10EO)   2-6％
  甜菜碱(例如烷基酰氨基丙基甜菜碱)   0-3％
  磷酸盐(STPP)   27-37％
  碳酸钠(Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>)   17-23％
  二硅酸钠(Na<sub>2</sub>O:2SiO<sub>2</sub>)   3-7％
  硫酸钠(Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)   4-11％
  过硼酸钠四水合物   15-21％
  TAED   1-4％
  CMC   1-3％
  包括脂解酶的酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1
  次要组分(如抑泡剂、香料、荧光增白剂、光漂白剂)   0-5％
  堆密度(g/l)至少   600
18)制成粒剂的去垢剂组合物
  烷基苯磺酸   5-11％
  皂，Na盐   0-3％
  非离子的(例如，脂肪醇乙氧化物C<sub>12-18</sub>，3-10EO)   3-7％
  烷基苯磺酸   5-11％
  沸石(NaAlSiO<sub>4</sub>)(例如沸石4A)   20-30％
  碳酸钠(Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>)   15-23％
  柠檬酸钠/柠檬酸(C<sub>6</sub>H<sub>5</sub>Na<sub>3</sub>O<sub>7</sub>/C<sub>6</sub>H<sub>8</sub>O<sub>7</sub>)   0-3％
  硫酸钠(Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)   4-10％
  过碳酸钠   7-13％
  TAED   2-6％
  CMC   1-3％
  包括脂解酶的酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1
  次要组分(如抑泡剂、香料、荧光增白剂、光漂白剂)   0-5％
  堆密度(g/l)至少   600
19)制成粒剂的去垢剂组合物
  烷基苯磺酸   0-4％
  皂，Na盐   0-3％
  非离子的(例如，脂肪醇乙氧化物C<sub>12-18</sub>，3-10EO)   2-6％
  沸石(NaAlSiO<sub>4</sub>)(例如沸石4A)   11-17％
  磷酸盐(STPP)   25-35％
  碳酸钠(Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>)   3-7％
  二硅酸钠(Na<sub>2</sub>O:SiO<sub>2</sub>)   0-19％
  硫酸钠(Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)   20-28％
  过硼酸钠四水合物   9-13％
  烷基苯磺酸   0-4％
  TAED   1-5％
  CMC   0-2％
  包括脂解酶的酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1
  次要组分(如抑泡剂、香料、荧光增白剂、光漂白剂)   0-5％
  堆密度(g/l)至少   600
20)制成粒剂的去垢剂组合物
  烷基苯磺酸   17-23％
  皂，Na-盐   0-3％
  非离子的(例如，脂肪醇乙氧化物C<sub>12-18</sub>，3-10EO)   11-15％
  沸石(NaAlSiO<sub>4</sub>)(例如沸石4A)   60-70％
  碳酸钠(Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>)   0-3％
  硫酸钠(Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)   5-11％
  CMC   0-3％
  聚合物(例如PVP，PEG，马来酸/丙烯酸共聚物)   2-6％
  包括脂解酶的酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1
  次要组分(如抑泡剂、香料、荧光增白剂、光漂白剂)   0-5％
  堆密度(g/l)至少   350
21)制成粒剂的去垢剂组合物
  烷基苯磺酸   16-22％
  皂，Na-盐   0-2％
  烷基苯磺酸   16-22％
  非离子的(例如，脂肪醇乙氧化物C<sub>12-18</sub>，3-10EO   3-9％
  沸石(NaAlSiO<sub>4</sub>)   25-33％
  碳酸钠(Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>)   3-7％
  二硅酸钠；(Na<sub>2</sub>O:SiO<sub>2</sub>)   0-4％
  硫酸钠(Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)   5-11％
  膦酸盐   0-3％
  过硼酸钠单水合物   15-19％
  TAED   3-7％
  CMC   0-3％
  聚合物(例如PVP，PEG，马来酸/丙烯酸共聚物)   0-3％
  包括脂解酶的酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1
  次要组分(如抑泡剂、香料、荧光增白剂、光漂白剂)   0-5％
  堆密度(g/l)至少   700
22)制成粒剂的去垢剂组合物
  烷基苯磺酸   4-8％
  烷基硫酸盐(例如C<sub>12-18</sub>)   0-3％
  非离子的，(例如，脂肪醇乙氧化物C<sub>12-18</sub>，3-10EO)   5-9％
  沸石(NaAlSiO<sub>4</sub>)   20-28％
  碳酸钠(Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>)   9-15％
  二硅酸钠；(Na<sub>2</sub>O:2SiO<sub>2</sub>)   0-4％
  烷基苯磺酸   4-8％
  过硼酸钠四水合物   21-31％
  TAED   1-5％
  CMC   0-3％
  聚合物(例如PVP，PEG，马来酸/丙烯酸共聚物)   0-3％
  包括脂解酶的酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1
  次要组分(如抑泡剂、香料、荧光增白剂、光漂白剂)   0-5％
  堆密度(g/l)至少   600
23)制成粒剂的去垢剂组合物
  线形烷基苯磺酸盐(作为酸计算)   6-12％
  非离子表面活性剂   1-4％
  作为脂肪酸的皂   2-6％
  碳酸钠(作为Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>)   14-22％
  沸石(作为NaAlSiO<sub>4</sub>)   18-32％
  硫酸钠(作为Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)   5-20％
  柠檬酸钠(作为C<sub>6</sub>H<sub>5</sub>Na<sub>3</sub>O<sub>7</sub>)   3-8％
  过硼酸钠(作为NaBO<sub>3</sub>·H<sub>2</sub>O)   4-9％
  漂白活化剂(例如NOBS或TAED)   1-5％
  羧甲基纤维素   0-2％
  聚合物(例如多羧酸盐或PEG)   1-5％
  酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1％
  线形烷基苯磺酸盐(作为酸计算)   6-12％
  次要组分(例如荧光增白剂，香料)   0-5％
24)含水液态去垢剂组合物，该组合物包含：
线形烷基苯磺酸盐(作为酸计算)   15-23％
脂肪醇乙氧硫酸盐(例如C<sub>12-15</sub>醇，2-3EO)   8-15％
脂肪醇乙氧化物(例如C<sub>12-15</sub>醇，7EO或C<sub>12-15</sub>醇，5EO)   3-9％
作为脂肪酸的皂(例如月桂酸)   0-3％
氨基乙醇   1-5％
柠檬酸钠   5-10％
水溶助长剂(例如甲苯磺酸钠)   2-6％
硼酸盐(作为B<sub>4</sub>O<sub>7</sub>)   0-2％
羧甲基纤维素   0-1％
乙醇   1-3％
丙二醇   2-5％
酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1％
次要组分(例如聚合物、分散剂、香料、荧光增白剂)   0-5％
25)含水液态去垢剂组合物，该组合物包含：
  线形烷基苯磺酸盐(作为酸计算)   20-32％
  脂肪醇乙氧化物(例如C<sub>12-15</sub>醇，7EO或C<sub>12-15</sub>醇，5EO)   6-12％
  氨基乙醇   2-6％
  线形烷基苯磺酸盐(作为酸计算)   20-32％
  柠檬酸   8-14％
  硼酸盐(作为B<sub>4</sub>O<sub>7</sub>)   1-3％
  聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，锚定聚合物如，例如，异丁烯酸月桂基酯/丙烯酸共聚物)   0-3％
  甘油   3-8％
  酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1％
  次要组分(例如水溶助长剂、分散剂、香料、荧光增白剂)   0-5％
26)制成浓缩液体的去垢剂组合物
  烷基苯磺酸   6-12％
  烷基硫酸   0-4％
  一乙醇胺   2-6％
  非离子的(例如，脂肪醇乙氧化物C<sub>12-18</sub>，3-10EO)   9-15％
  柠檬酸钠/柠檬酸(C<sub>6</sub>H<sub>5</sub>Na<sub>3</sub>O<sub>7</sub>/C<sub>6</sub>H<sub>8</sub>O<sub>7</sub>)   2-8％
  甘油   2-6％
  硼酸盐(作为Na<sub>2</sub>B<sub>4</sub>O<sub>7</sub>)   0-4％
  聚合物(例如PVP、PEG、马来酸/丙烯酸共聚物))   0-3％
  包括脂解酶的酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1
  次要组分(如抑泡剂、香料、荧光增白剂、光漂白剂)   0-5％
  总水量   40％
27)制成浓缩液体的去垢剂组合物
  烷基苯磺酸   11-17％
  烷基醚硫酸(例如，C<sub>12-18</sub>醇，4-10EO或烷基硫酸盐(例如，C<sub>12-18</sub>)   0-4％
  三乙醇胺   0-3％
  非离子的(例如，脂肪醇乙氧化物C<sub>12-18</sub>，3-10EO)   6-10％
  柠檬酸钠/柠檬酸(C<sub>6</sub>H<sub>5</sub>Na<sub>3</sub>O<sub>7</sub>/C<sub>6</sub>H<sub>8</sub>O<sub>7</sub>)   2-6％
  水溶助长剂(例如甲苯磺酸钠)   1-5％
  甘油   6-12％
  MPG   0-5％
  乙醇   0-3％
  包括脂解酶的酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1
  次要组分(如抑泡剂、香料、荧光增白剂、光漂白剂)   0-5％
  总水量   55％
28)具有至少600g/l的堆密度的制成粒剂的去垢剂组合物，该组合物包含：
  阴离子表面活性剂(线形烷基苯磺酸盐、烷基硫酸盐、α-烯烃磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲基酯、链烷磺酸盐、皂)   25-40％
  非离子表面活性剂(例如脂肪醇乙氧化物)   1-10％
  碳酸钠(作为Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>)   8-25％
  可溶性硅酸盐(作为Na<sub>2</sub>O，2SiO<sub>2</sub>)   5-15％
  硫酸钠(作为Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)   0-5％
  沸石(作为NaAlSiO<sub>4</sub>)   15-28％
  阴离子表面活性剂(线形烷基苯磺酸盐、烷基硫酸盐、α-烯烃磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲基酯、链烷磺酸盐、皂)   25-40％
  过硼酸钠(NaBO<sub>3</sub>·4H<sub>2</sub>O)   0-20％
  漂白活化剂(TAED或NOBS)   0-5％
  酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1％
  次要组分(如香料、荧光增白剂)   0-3％
29)制成粒剂的去垢剂组合物
  烷基苯磺酸   25-35％
  非离子的(例如，脂肪醇乙氧化物C<sub>12-18</sub>，3-10EO)   0-3％
  沸石(NaAlSiO<sub>4</sub>)   3-9％
  磷酸盐(作为STPP)   25-35％
  碳酸钠(Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>)   0-3％
  二硅酸钠；(Na<sub>2</sub>O:2SiO<sub>2</sub>)   2-8％
  硫酸钠(Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)   17-23％
  过硼酸钠单水合物   1-5％
  TAED   0-3％
  CMC   0-3％
  包括脂解酶的酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1
  次要组分(如抑泡剂、香料、荧光增白剂、光漂白剂)   0-5％
  堆密度(g/l)至少   600
30)制成粒剂的去垢剂组合物
  烷基苯磺酸   25-35％
  皂，脂肪酸Na-盐   0-3％
  非离子的(例如，脂肪醇乙氧化物C<sub>13-15</sub>，7EO)   4-9％
  沸石(NaAlSiO<sub>4</sub>)   7-11％
  磷酸盐(作为STPP)   26-36％
  碳酸钠(Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>)   6-12％
  二硅酸钠；(Na<sub>2</sub>O:2SiO<sub>2</sub>)   4-10％
  硫酸钠(Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)   4-8％
  CMC   0-3％
  包括脂解酶的酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1
  次要组分(如抑泡剂、香料、荧光增白剂、光漂白剂)   0-5％
  堆密度(g/l)至少   700
下列特定组合物是本发明的例证性组合物，但不必是限制或以其它方式定义本发明的范围。
在去垢剂组合物中，简写组分具有下列意义：
LAS：线性的C12烷基苯磺酸钠
TAS：脂烷基硫酸钠
XYAS：C1X-C1Y烷基硫酸钠
SS：式2-丁基辛酸的次要皂表面活性剂
25EY：与平均为Y摩尔的环氧乙烷缩合的C12-C15主要线性伯醇
45EY：与平均为Y摩尔的环氧乙烷缩合的C14-C15主要线性伯醇
XYEZS：与每摩尔平均为Z摩尔的环氧乙烷缩合的C1X-C1Y烷基硫酸钠
非离子：具有3.8的平均乙氧基化程度与平均4.5的丙氧基化程度的C13-C15混合的乙氧基化的/丙氧基化的脂肪族醇，以商品名Plurafax LF404由BASF Gmbh出售
CFAA：C12-C14烷基N-甲基葡糖酰胺
TFAA：C16-C18烷基N-甲基葡糖酰胺
硅酸盐：无定形硅酸钠(SiO2∶Na2O比＝2.0)
NaSKS-6：式d的结晶层状硅酸盐-Na2Si2O5
碳酸盐：无水碳酸钠
磷酸盐：三磷酸钠
MA/AA：1∶4马来酸/丙烯酸的共聚物，平均分子量大约为80,000
聚丙烯酸酯：聚丙烯酸酯均聚物，平均分子量为8,000，以商品名PA30由BASF Gmbh出售
沸石A：式Na12(AlO2SiO2)12·27H2O的水合硅酸铝钠，主要粒子大小在1至10微米的范围
柠檬酸盐：柠檬酸三钠二水合物
柠檬：柠檬酸
过硼酸盐：无水过硼酸钠一水合物漂白剂，实验式为NaBO2·H2O2
PB4：无水过硼酸钠四水合物
过碳酸盐：无水过碳酸钠漂白剂，实验式为2Na2CO3·3H2O2
TAED：四乙酰乙二胺
CMC：羧甲基纤维素钠
DETPMP：二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)，由Monsanto以Dequest2060商品名出售
PVP：聚乙烯吡咯烷酮聚合物
EDDS：乙二胺-N，N’-二琥珀酸，以钠盐形式的[S，S]异构体
抑泡剂：25％石蜡Mpt 50℃，17％疏水硅石，58％石蜡油
粒状泡沫剂：12％硅氧烷/硅石，18％十八烷醇，粒状形式的70％淀粉
硫酸盐：无水硫酸钠
HMWPEO：高分子量聚环氧乙烷
TAE25：脂醇乙氧化物(25)
组合物1
按照本发明的粒状织物清洁组合物制备如下：
线性C12烷基苯磺酸钠                        6.5
硫酸钠                                     15.0
沸石A                                      26.0
次氮基三乙酸钠                             5.0
本发明的酶                                 0.1
PVP                                        0.5
TAED                                       3.0
硼酸                                       4.0
过硼酸盐                                   18.0
苯酚磺酸盐                                 0.1
次要组分                                   添加至100
组合物2
按照本发明的致密粒状织物清洁组合物(密度800/l)制备如下：
45AS                        8.0
25E3S                       2.0
25E5                        3.0
25E3                        3.0
TFAA                        2.5
沸石A                       17.0
NaSKS-6                     12.0
柠檬酸                      3.0
碳酸盐                      7.0
MA/AA                       5.0
CMC                         0.4
本发明的酶                  0.1
TAED                        6.0
过碳酸盐                    22.0
EDDS                        0.3
粒状抑泡剂                  3.5
水/次要组分                 添加至100％
组合物3
按照本发明的粒状织物清洁组合物(该组合物特定地用于着色织物的洗涤)制备如下：
LAS              10.7                -
TAS              2.4                 -
TFAA             -                   4.0
45AS             3.1                 10.0
45E7             4.0                 -
25E3S            -                   3.0
68E11            1.8                 -
25E5             -                   8.0
柠檬酸盐         15.0                7.0
碳酸盐           -                   10
柠檬酸           2.5                 3.0
沸A              32.1                25.0
Na-SKS-6         -                   9.0
MA/AA            5.0                 5.0
DETPMP           0.2                 0.8
本发明的酶       0.10                0.05
硅酸盐           2.5                 -
硫酸盐           5.2                 3.0
PVP              0.5                 -
聚(4-乙烯基吡啶)-N-氧化物/           0.2
乙烯基咪唑和乙烯基吡咯烷酮
共聚物
过硼酸盐         1.0
苯酚磺酸盐       0.2
水/次要组分      添加至100％
组合物4
按照本发明的粒状织物清洁组合物(提供“通过洗涤软化”能力)制备如下：
45AS                                  -            10.0
LAS                                   7.6          -
68AS                                  1.3          -
45E7                                  4.0          -
25E3                                  -            5.0
椰子(coco)-烷基-二甲基羟乙基氯化铵    1.4          1.0
柠檬酸盐                              5.0          3.0
Na-SKS-6                              -            11.0
沸石A                                 15.0         15.0
MA/AA                                 4.0          4.0
DETPMP                                0.4          0.4
过硼酸盐                              15.0         -
过碳酸盐                              -            15.0
TAED                                  5.0          5.0
绿粘土                                10.0         10.0
HMWPEO                                -            0.1
本发明的酶                            0.10         0.05
硅酸盐                                3.0          5.0
碳酸盐                                10.0         10.0
粒状抑泡剂                            1.0          4.0
CMC                                   0.2          0.1
水/次要组分                           添加至100％
组合物5
按照本发明的重垢型液态织物清洁组合物制备如下：
                                      I            II
LAS酸形式                             -            25.0
柠檬酸                                5.0          2.0
25AS酸形式                            8.0          -
25AE2S酸形式                          3.0          -
25AE7                               8.0          -
CFAA                                5            -
DETPMP                              1.0          1.0
脂肪酸                              8            -
油酸                                -            1.0
乙醇                                4.0          6.0
丙二醇                              2.0          6.0
本发明的酶                          0.10         0.05
椰子-烷基二甲基羟乙基氯化铵         -            3.0
绿粘土                              -            5.0
PVP                                 2.0          -
水/次要组分                         添加至100％
组合物6
制成粒剂的去垢剂组合物
  脂肪醇乙氧化物C<sub>12-18</sub>，5-7EO   6   4
  烷基苯磺酸盐；C<sub>11-13</sub>   5   20
  线形烷基硫酸盐；C<sub>16-18</sub>(例如Sulfopon)   5   0
  皂   1   4
  碳酸钠   10   0
  Zeolith Na-A   25   35
  二硅酸钠；Na<sub>2</sub>O∶SiO<sub>2</sub>＝3   2   2
  硫酸钠(Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)   1   20
  多羧酸盐(Sokalan-CP5)   5   5
  羧酸(SokaianDCS)   0   4
  过硼酸钠四水合物   20   0
  TAED   6   0
  抑泡剂   5   0
  包括脂解酶的酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1   0.0001-0.1
组合物7
制成粒剂的包含漂白剂的去垢剂组合物
 伯醇硫酸盐(CocoPAS)   5   6
 Nonion3EO(例如脂肪醇乙氧化物(Alkohol ethoylate)C<sub>12-15</sub>；3EO)   5   0
 Nonion7EO(脂肪醇乙氧化物C<sub>12-15</sub>；7EO)   8   14
 Sokalan HP22<sup>＊</sup>   0,7   0,8
 皂   1,3   0
 沸石MAP   39   39
 柠檬酸钠   4   5
 碳酸钠   3,3   1
 水/盐   0,4   0,5
 止泡剂/荧光剂/香料   4   5
 TAED   5   5
 Mn-催化剂   1,7   1,7
 过碳酸钠   21   21
 EDTMP   0,4   0,4
 包括脂解酶的酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1   0.0001-0.1
＊如WO 95/22593所述的接枝聚合物
组合物8
制成粒剂的非漂白去垢剂组合物
Figure G1996196233X19940529D001041
Figure G1996196233X19940529D001051
＊如WO 95622593所述的接枝聚合物
组合物9
制成粒剂的去垢剂组合物
组合物10
制成粒剂的去垢剂组合物
组合物11
制成粒剂的去垢剂组合物
  线形烷基苯磺酸盐   9
  非离子的乙氧基化的醇7EO-(例如Synperonic A7)   2
  非离子的乙氧基化的醇，Superionic A3&A7(3/7EO基团)的1∶1混合物   5
  沸石4A   29
  多羧酸盐(例如Sokalan CP5)   4
  碳酸钠   7
  粒状硅酸钠   4
  线形烷基苯磺酸盐   9
  TAED   8
  过硼酸钠一水合物   16
 EDTMP(乙二胺四亚甲基膦酸)   0.4
 包含至少25EO基团的非离子物质(例如LutensolAT-BASF与BRIJ-ICI)   0-1
 次要成分(荧光剂、CMC、盐止泡剂颗粒、香料   4
 包括脂解酶的酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1
 水分   加至100
组合物12
制成粒剂的去垢剂组合物
  伯烷基硫酸钠(PAS)   6
  非离子乙氧基化的醇3EO-(例如Synperonic A3)   7
  非离子乙氧基化的醇7EO-(例如Synperonic A7)   6
  沸石MAP   36
  硬脂酸   2
  牛脂80EO   0.2
  硅酸钠   3
  TAED   5
  锰催化剂   2
  过碳酸钠   21
  Dequest 2047   0,4
  伯烷基硫酸钠(PAS)   6
  次要组分(荧光剂、CMC、盐止泡剂颗粒、香料)   4
  包括脂解酶的酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1
  水分   加至100
组合物13
制成粒剂的去垢剂组合物
Figure G1996196233X19940529D001071
组合物14
制成粒剂的去垢剂组合物
Figure G1996196233X19940529D001091
组合物15
粉状去垢剂组合物
 烷基苯磺酸钠C<sub>11-13</sub>   11   11.5   7   11   15
 脂肪醇乙氧硫酸盐(硫酸化Alfonic1412-70)   5.5
 伯醇硫酸盐   10   9   5
 脂肪醇乙氧化物(例如Neodol 25-9)   3   2   3   10
 皂   1   1
 三磷酸钠   25
 硅铝酸盐，例如沸石4A   10-35   0-15   5-20   0-12
 多羧酸盐(例如CP5)   0-3
 MA/AA/疏水的三元共聚物<sup>＊</sup>   2-25   2-25   2-25   2-25   5   2-20
 碱性硅酸盐   2-5   20   5   3-20   15   15
 碳酸钠   18   18   15   30   20   40
 季胺   2.4
 乙氧基化胺(例如Varonic U202)   2
 烷基苯磺酸钠C<sub>11-13</sub>   11   11.5   7   11   15
 溶胀粘土   10
 荧光剂(Tinopal AMS)   0.15   0.2   0.25   0.15   1.5   1.5
 香料   0.1   0.2   0.1   0.1   0.1   0.1
 包括脂解酶的酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1
 硫酸钠   平衡
＊如在US 5,308,530中描述
组合物16
含水液态洗涤剂
组合物17
液态去垢剂组合物
  脂肪酸甘油单酯(例如Cutina AGS，Henkel)   0.5
  C<sub>12-18</sub>脂肪酸(例如Edenor K12-18，Henkel)   5
  脂肪醇乙氧化物，C<sub>12-18</sub>；7EO   20
  烷基苷，C<sub>12-14</sub>，聚合度：1，4   20
  烷基硫酸盐C<sub>16-18</sub>(例如Sulfopon K35，Henkel)   5
乙醇 5
  1，2丙二醇   8
  包括脂解酶的酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1
  水   加至100
组合物18
制成非水液态去垢剂的去垢剂组合物
  脂肪醇乙氧化物C<sub>10-12</sub>；7EO   28
  脂肪醇乙氧化物C<sub>10-12</sub>；3EO   23
  甘油三乙酸酯   6
  硅氧烷止泡剂   1.5
  烷基苯磺酸   7
  碳酸钠   20
  方解石   7
  防接种聚合物(Antiseeding polymer)   2
  硅石   4
  羧甲基纤维素   2
  过酸<sup>＊</sup>   0-1
  增白剂   0,2
  香料   0.6
  包括脂解酶的酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1
＊如在WO 95/06104中描述
组合物19
制成非水液态去垢剂的去垢剂组合物
  亚癸基或亚十二烷基二甘油   25
  C<sub>10-15</sub>EO7乙氧化物   25
  碳酸钠   17
  过硼酸钠单水合物   11
  亚癸基或亚十二烷基二甘油   25
烷基苯磺酸 6
  碳酸钙   6
  硅石(分散剂)   4
硅氧烷抑泡剂 3
  荧光剂/抗灰化聚合物/抗再沉积聚合物   3
  包括脂解酶的酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1
组合物20
制成含水液态去垢剂的去垢剂组合物
Figure G1996196233X19940529D001121
组合物21
液态去垢剂组合物，该组合物包含：
Figure G1996196233X19940529D001122
＊如在发明US 5,308,530中描述的
组合物22
含水液态去垢剂组合物
  硅止泡剂   0.3
  柠檬酸   8
  甘油   2
  硼砂   2
  KOH   10
  沸石4A   8
  聚合物：抗絮凝聚合物，具有在EP 346,995中聚合物A11的化学结构   1.0
  QCC 200：膨润粘土   8
  油酸   5
  LAS-酸   17
  Synperonic A3   5
  Synperonic A7   5
  PVP   0.3
  香料   0.5
  包括脂解酶的酶(作为纯化的酶蛋白质计算)   0.0001-0.1
  水   加至100
餐具洗涤组合物
餐具洗涤去垢剂组合物包含这样的表面活性剂，该表面活性剂可以是阴离子的、非离子的、阳离子的、两性的或这些类型的混合物。去垢剂包含0-90％的非离子型表面活性剂(如低泡至不起泡的乙氧化的丙氧化的直链醇。
去垢剂组合物可以包含无机和/或有机类型的去垢剂助洗剂盐。去垢剂助洗剂可以细分成含磷和不含磷类型。去垢剂组合物通常包含1-90％的去垢剂助洗剂。
含磷无机碱性去垢剂助洗剂的例子(当存在时)包括水溶性盐，尤其是碱金属焦磷酸盐、正磷酸盐、多磷酸盐以及膦酸盐。不含磷的无机助洗剂的例子(当存在时)包含水溶性碱金属碳酸盐、硼酸盐和硅酸盐以及各种类型的水不溶性结晶或无定形的硅铝酸盐，其中沸石是熟知的代表。
适合的有机助洗剂的例子包括碱金属、铵和取代铵、柠檬酸盐、琥珀酸盐、丙二酸盐、脂肪酸磺酸盐、羧甲氧琥珀酸盐、铵聚乙酸盐、羧酸盐、多羧酸盐、氨基多羧酸盐、聚乙酰羧酸盐和聚羟磺酸盐。
其它适合的有机助洗剂包括更高分子量聚合物以及已知具有助洗剂性质的共聚物，例如适当的聚丙烯酸、聚马来酸和聚丙烯酸/聚马来酸的共聚物及其盐。
餐具洗涤去垢剂组合物可以包含氯/溴型或氧型的漂白剂。无机氯/溴型漂白剂的例子是锂、钠或钙的次氯酸盐和次溴酸盐以及氯化磷酸三钠。有机氯/溴型漂白剂的例子是杂环N-溴代和N-氯代酰亚胺，如三氯异氰脲酸、三溴异氰脲酸、二溴异氰脲酸和二氯雷尿酸及其与水增溶性阳离子(如钾和钠)的盐。海因化合物也是适合的。
氧漂白剂是优选的，例如无机过酸盐的形式，优选地含有漂白前体或作为过氧酸化合物。适合的过氧漂白化合物的典型例子是碱金属过硼酸盐(四水合物与一水合物)、碱金属过碳酸盐、过硅酸盐和过磷酸盐。优选的活化剂物质是TAED和甘油三乙酸酯。
本发明的餐具洗涤去垢剂组合物可以利用通常用于酶的稳定剂(例如，多元醇如丙二醇，糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，如芳族硼酸酯)来稳定。
餐具洗涤去垢剂组合物也可以包含其它酶，具体地说是淀粉酶、蛋白酶和/或纤维素酶。
本发明的餐具洗涤去垢剂组合物也可以包含其它常规的去垢剂成分，如抗絮凝剂物质、填充物质、抑泡剂、防腐剂、污垢悬浮剂、螯合剂、抗污垢再沉积剂、脱水剂、染料、杀菌剂、荧光剂、增稠剂和香料。
本发明的第一洗涤脂解酶可以以通常去垢剂中使用的浓度掺入。在本发明的去垢剂中，本发明包括：在本发明去垢剂组合物中，脂解酶可以以相应于每升洗液0.00001-1mg(作为纯化的酶蛋白质计算)脂解酶的量添加。
下面，以例说明了特别优选的餐具洗涤组合物：
1)粉状自动餐具洗涤组合物
  非离子表面活性剂   0.4-2.5％
  硅酸钠   0-20％
  二硅酸钠   3-20％
  三磷酸钠   20-40％
  碳酸钠   0-20％
  过硼酸钠   2-9％
  四乙酰乙二胺(TAED)   1-4％
  硫酸钠   5-33％
  非离子表面活性剂   0.4-2.5％
  酶   0.0001-0.1％
2)粉状自动餐具洗涤组合物
 非离子表面活性剂(例如脂肪醇乙氧化物)   1-2％
 二硅酸钠   2-30％
 碳酸钠   10-50％
 磷酸钠   0-5％
 柠檬酸三钠二水合物   9-30％
 次氮基乙酸三钠(NTA)   0-20％
 过硼酸钠一水合物   5-10％
 四乙酰乙二胺(TAED)   1-2％
 聚丙烯酸酯聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物)   6-25％
 酶   0.0001-0.1％
 香料   0.1-0.5％
 水   5-10
3)粉状自动餐具洗涤组合物
 非离子表面活性剂   0.5-2.0％
 二硅酸钠   25-40％
 柠檬酸钠   30-55％
 碳酸钠   0-29％
 碳酸氢钠   0-20％
 过硼酸钠单水合物   0-15％
 非离子表面活性剂   0.5-2.0％
 四乙酰乙二胺(TAED)   0-6％
 马来酸/丙烯酸共聚物   0-5％
 粘土   1-3％
 聚氨基酸   0-20％
 聚丙烯酸钠   0-8％
 酶   0.0001-0.1％
4)粉状自动餐具洗涤组合物
 非离子表面活性剂   1-2％
 沸石MAP   15-42％
 二硅酸钠   30-34％
 柠檬酸钠   0-12％
 碳酸钠   0-20％
 过硼酸钠单水合物   7-15％
 四乙酰乙二胺(TAED)   0-3％
 聚合物   0-4％
 马来酸/丙烯酸共聚物   0-5％
 有机膦酸盐   0-4％
 粘土   1-2％
 酶   0.0001-0.1％
 硫酸钠   平衡
5)粉状自动餐具洗涤组合物
  非离子表面活性剂   1-7％
  二硅酸钠   18-30％
  柠檬酸三钠   10-24％
  碳酸钠   12-20％
  单过硫酸盐(2KHSO<sub>5</sub>.KHSO<sub>4</sub>.K<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)   15-21％
  漂白剂稳定剂   0.1-2％
  马来酸/丙烯酸共聚物   0-6％
  二亚乙基三胺五乙酸盐，五钠盐   0-2.5％
  酶   0.0001-0.1％
  硫酸钠，水   平衡
6)具有清洁表面活性剂系统的粉剂和液态餐具洗涤组合物
  非离子表面活性剂   0-1.5％
  十八基二甲胺N-氧化物二水合物   0-5％
  十八基二甲胺N-氧化物二水合物和十六基二甲胺N-氧化物二水合物的80∶20重量C18/C16混合物   0-4％
  十八基二(羟乙基)胺N-无水氧化物和十六基二(羟乙基)胺N-无水氧化物的70∶30重量C18/C16混合物   0-5％
  具有平均为3的乙氧化度的C<sub>13</sub>-C<sub>15</sub>烷基乙氧硫酸盐   0-10％
  具有平均为3的乙氧化度的C<sub>12</sub>-C<sub>15</sub>烷基乙氧硫酸盐   0-5％
  具有平均为12的乙氧化度的C<sub>13</sub>-C<sub>15</sub>乙氧化的醇   0-5％
  具有平均为9的乙氧化度的C<sub>12</sub>-C<sub>15</sub>乙氧化的醇的混合物   0-6.5％
  非离子表面活性剂   0-1.5％
  具有平均为30的乙氧化度的C<sub>13</sub>-C<sub>15</sub>乙氧化的醇的混合物   0-4％
  二硅酸钠   0-33％
  三磷酸钠   0-46％
  柠檬酸钠   0-28％
  柠檬酸   0-29％
  碳酸钠   0-20％
  过硼酸钠单水合物   0-11.5％
  四乙酰乙二胺(TAED)   0-4％
  马来酸/丙烯酸共聚物   0-7.5％
  硫酸钠   0-12.5％
  酶   0.0001-0.1％
7)非水液态自动餐具洗涤组合物
  液态非离子表面活性剂(例如脂肪醇乙氧化物)   2.0-10.0％
  碱金属硅酸盐   3.0-15.0％
  碱金属磷酸盐   20.0-40.0％
  选自高级二元醇、聚乙二醇、多氧化物、乙二醇醚的液态载体   25.0-45.0％
  稳定剂(例如磷酸与C<sub>16</sub>-C<sub>18</sub>烷醇的部分酯)   0.5-7.0％
  抑泡剂(例如硅氧烷)   0-1.5％
  酶   0.0001-0.1％
8)非水液态餐具洗涤组合物
  液态非离子表面活性剂(例如脂肪醇乙氧化物)   2.0-10.0％
  硅酸钠   3.0-15.0％
  碱金属碳酸盐   7.0-20.0％
  柠檬酸钠   0.0-1.5％
  稳定系统(例如精细分离的硅氧烷与低分子量的二烷基聚乙二醇醚的混合物)   0.5-7.0％
  低分子量聚丙烯酸酯聚合物   5.0-15.0％
  粘土凝胶增稠剂(例如膨润土)   0.0-10.0％
  羟丙基纤维素聚合物   0.0-0.6％
  酶   0.0001-0.1％
  选自高级二元醇、聚乙二醇、多氧化物、乙二醇醚的液态载体   平衡
9)触变性液体自动的餐具洗涤组合物
  C<sub>12</sub>-C<sub>14</sub>脂肪酸   0-0.5％
  嵌段共聚物表面活性剂   1.5-15.0％
  柠檬酸钠   0-12％
  三磷酸钠   0-15％
  碳酸钠   0-8％
  三硬脂酸铝   0-0.1％
  异丙基苯磺酸钠   0-1.7％
  聚丙烯酸酯增稠剂   1.32-2.5％
  聚丙烯酸钠   2.4-6.0％
  C<sub>12</sub>-C<sub>14</sub>脂肪酸   0-0.5％
  硼酸   0-4.0％
  甲酸钠   0-0.45％
  甲酸钙   0-0.2％
  n-癸二苯基氧化物二磺酸钠   0-4.0％
  一乙醇胺(MEA)   0-1.86％
  氢氧化钠(50％)   1.9-9.3％
  1，2-丙二醇   0-9.4％
  酶   0.0001-0.1％
  抑泡剂、染料、香料、水   平衡
10)液态自动餐具洗涤组合物
  脂肪醇乙氧基化物   0-20％
  脂肪酸酯磺酸盐   0-30％
  十二烷基硫酸钠   0-20％
  烷基聚苷   0-21％
  油酸   0-10％
  二硅酸钠一水合物   18-33％
  柠檬酸钠二水合物   18-33％
  硬脂酸钠   0-2.5％
  过硼酸钠单水合物   0-13％
  四乙酰乙二胺(TAED)   0-8％
  脂肪醇乙氧基化物   0-20％
  马来酸/丙烯酸共聚物   4-8％
  酶   0.0001-0.1％
11)包含受保护的漂白剂颗粒的液态自动餐具洗涤组合物
  硅酸钠   5-10％
  焦磷酸四钾   15-25％
  三磷酸钠   0-2％
  碳酸钾   4-8％
  受保护的漂白剂颗粒，例如氯   5-10％
  聚合增稠剂   0.7-1.5％
  氢氧化钾   0-2％
  酶   0.0001-0.1％
  水   平衡
11)如1)、2)、3)、4)、6)和10)中所描述的自动餐具洗涤组合物，其中过硼酸盐由过碳酸盐取代。
12)如1)-6)中描述的自动餐具洗涤组合物，自动餐具洗涤组合物还包含锰催化剂。锰催化剂可以，例如，是在“低温漂白的有效锰催化剂”，自然369，1994，p.637-539中描述的化合物之一。
进而，本发明的第一洗涤脂解酶可以用于软化组合物：
本发明的脂解酶可以用作织物软化剂，如在表面活性剂和消费产品，J.Falbe编辑，1987，p.295-296中所描述的；表面活性剂洗涤剂，30(1993)，6，pp.394-399；JAOCS，第61卷(1984)，2，pp.367-376；EP 517762；EP123400；WO 92/19714；WO 93/19147；US 5,082,578；EP 494 769；EP 544493；EP 543 562；US 5,235,082；EP 568 297；EP 570 237。
材料与方法
脂酶活性(LU)
脂酶的底物通过利用阿拉伯树胶作为乳化剂乳化甘油三丁酸酯(MERCK)制备。脂酶活性在pH 7时利用pH stat方法测定。一单位的脂酶活性(LU)定义为每分钟释放1微摩尔脂肪酸所需要的量。
菌株和质粒：
Humicola lanuginosa DSM 4109可从Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroderweg 1b，D-3300Braunschweig，西德(EP 305,216)得到。
酿酒酵母YNG318：MATa Dpep4[cir+]ura3-52，leu2-D2，his 4-539
米曲霉IFO 4177
米曲霉A1560-T40，米曲霉IFO 4177的蛋白酶缺失衍生物(WO91/17243)。
米曲霉JaL 125：米曲霉IFO 4177，可从发酵研究所得到，大阪；17-25Juso Hammachi 2-Chome Yodogawa-ku，大阪，日本，命名为“alp”的碱性蛋白酶基因(由Murakami K等，(1991)，农业生物化学，55，p.2807-2811描述)利用米曲霉pyrG基因作为标记通过一步基因取代方法缺失(由G.May在“丝状真菌的应用分子遗传学”(1992)，p.1-25.Eds.J.R.Kinghom和G.Turner；Blackie学院和专业中描述)。
反射犁头霉ATTC 44896可从ATCC(美国典型培养物保藏中心，12301，Parklawn Drive，Rockville，马里兰20852.美国)(其作为反射犁头霉ATTC 44896)以及IFO(发酵研究所，17-85Juso-horrmachi 2-chomee，Yodogawa-ku，大阪532，日本)(作为反射犁头霉IFO 5874)得到，如WO 96/113578(Novo Nordisk A/S)所述。
酵母细胞YPH499(Stratagene)
大肠杆菌DH10B(Gibco)
pTiK04：构建自包括成熟反射犁头霉NL 127脂酶基因与编码脂酶基因的开始延伸上游的SPIRR的pJSO37。
pTiK05：作为没有SPIRR延伸的pTiK04
pTiK06：具有MFαl信号序列的pTik04
pTiK07：具有MFαl信号序列的pTik05
pYESHL是酵母/大肠杆菌穿梭载体，该穿梭载体在酵母中表达并分泌低水平的H.lanuginosa脂解酶。更具体地说，pYESHL是pYES2的衍生物，其中切除了GAL1启动子，把H.lanuginosa脂解酶基因与得自酿酒酵母的TPI(磷酸丙糖异构酶)启动子(Alber，T.和Kawasaki，G.，分子应用遗传学杂志，1，419-434(1982)克隆在SphI和Xbal位点之间。pYESHL的限制图在图1中显示。
PJSO37(酿酒酵母表达质粒)(J.S.Okkels，(1996)“在pYES载体中URA3-启动子的缺失提高了在酿酒酵母中真菌脂酶的表达水平。重组DNA生物技术III：生物和工程科学的结合，纽约科学院年报的第782卷)。更具体地说，表达质粒pJSO37源自pYES 2.0，其方法是通过用得自啤酒糖酵母的组成型表达的TPI(磷酸丙糖异构酶)-启动子(Albert和Karwasaki，(1982)，分子应用遗传学杂志，1，419-434)取代诱导型的pYES 2.0GAL1-启动子并缺失URA3启动子。pJSO37的限制图在图6中显示。
pYES 2.0(Invitrogen公司，英国)
p960米曲霉表达质粒(在EP 305 216中描述)
pUC19(Yanish-Perron等(1985)基因，33，103-119)
pHD414(曲霉属表达载体，是在EP 238 023中描述的质粒p775的衍生物)。pHD414的构建在WO 93/11249中进一步描述)。
PJVi245(参见图8)
pCaHj383(参见图8)
pCaHj385(参见图8)
低钙滤纸测定
方法
1)提供具有第一蛋白质结合滤纸(尼龙膜)和在上部的第二低的蛋白质结合滤纸(乙酸纤维素)的SC Ura复制平板(用于选择携带表达载体的菌株)。
2)把包含亲本脂解酶基因或突变的脂解酶的酵母细胞铺在双滤纸上并在30℃下培养2或3天。
3)通过把上部滤纸转移到新板上把菌落保持在上部滤纸上。
4)把蛋白质结合滤纸移到空的陪替氏培养皿中。
5)把包含橄榄油乳液(2％P.V.A.∶橄榄油＝3∶1)，亮绿(指示剂，0.004％)、100mM tris缓冲液pH 9和EGTA(最终浓度为5mM)的琼脂糖溶液倒入底部滤纸上以鉴别蓝绿斑形式的表达脂解活性的菌落。
6)鉴别在步骤5)发现的菌落，该菌落与亲本脂解酶相比具有降低的对钙依赖性。
Figure G1996196233X19940529D001251
25-7滤纸测定：
用于对去垢剂组分的提高的耐受性的筛选通过使用滤纸测定进行，该滤纸测定除了在步骤5)的溶液再包含0.02％25-7外如上所述。
替代的筛选测定如下：
1)提供具有第一蛋白质结合滤纸(如尼龙)和在上部的非蛋白质结合滤纸(乙酸纤维素)的SC Ura平板(用于选择携带表达载体的菌株)。
2)把包含亲本脂酶基因或突变的脂酶基因的酵母细胞铺在滤纸上并在30℃下培养3或4天。
3)通过把上部滤纸转移到新板上把菌落保持在上部滤纸上。
4)把蛋白质结合滤纸移到陪替氏培养皿中，该陪替氏培养皿包含：
包含橄榄油乳液(2％P.V.A.∶橄榄油＝3∶1)、亮绿(指示剂，0.004％)、100mM tris缓冲液pH 10与去垢剂或去垢剂组分的琼脂糖溶液，例如，PCS板。蛋白质结合滤纸应具有面对筛选板的teh菌落面。
5)鉴别在步骤4)中发现的蓝绿斑形式的表达脂解活性的菌落。
另外，携带酵母菌落的非蛋白质结合滤纸(或蛋白质结合滤纸)可以直接用于筛选板。
随机诱变文库的构建
a)设计随机诱变文库的基本原理和数学
随机诱变的全面基本原理本质上在于模仿进化，其中低的连续诱变与更好的突变体的连续选择偶联，然后再对突变体进行诱变。同样地，在文献中描述的最近体外进化研究用连续诱变和增加的选择压进行(参见回顾Joyce 1992)。我们通过在前几轮诱变中利用wt基因适应这些。然后，改进的变体用于下几轮的诱变(通过小步骤改进)。我们在洗涤相关的条件下筛选，该条件仅足够敲除(knock out)wt酶活性或改进变体活性。这意味着当分离到越来越好的变体时，我们增加了筛选的严格性。
为了增加交换的数量并增加发现改进的变体的可能性，进行了定域随机诱变。选择从Lipolase结构和定点诱变的结果推论的重要区域。如整个脂接触区被认为是改进的重要区域，尤其是盖区和盖接触区。脂接触区对应于突变的基因上的7个区。进行了这些区的组合。
b)完整脂解酶编码基因的随机诱变
质粒pYESHL在室温下用12M甲酸处理20分钟。形成的脂解酶编码基因在诱变条件下(0.5mM MnCl2和1/5正常量的ATP，参见如Leung等，1989)利用PCR扩增自甲酸处理的质粒。预期该处理产生大范围的突变，因为甲酸主要产生颠换，PCR产生的突变主要是转换。
形成的PCR片段或通过双重组(Muhlrad等)在体内克隆进穿梭载体或消化并连接进穿梭载体并转化大肠杆菌。
对八个随机选择的克隆进行测序，发现了平均包含2-3个突变-颠换和转换都有。
通过使用这种方法，制造了包含10,000至140,000个克隆的七个文库。
c)定域随机诱变
合成诱变引物(寡核苷酸)，该引物对应于待诱变的DNA序列的部分(除了与待诱变的氨基酸密码子对应的核苷酸)。其后，形成的诱变引物用于和适合的相对引物的PCR反应。纯化形成的PCR片段并消化再克隆进穿梭载体。另外，如果必要，形成的PCR片段作为引物用于和第二个适合的相对引物进行第二次PCR反应以使诱变区域消化并克隆进穿梭载体。PCR反应在标准条件下进行。
当合成用于定域随机诱变的寡核苷酸时，掺入水平的计算对估计诱变频率是重要的。核苷酸交换的频率可以利用二项式分布式计算：
N！
P(i)＝i！(N-i)！xpix(1-p)N-i
其中N＝掺入的寡核苷酸的数量；p＝不是wt核苷酸的分数；i＝核苷酸交换的数量；P(i)＝交换数量i的概率；。难于从核苷酸交换的数量计算aa交换的确切数量，因为对于大多数aa的密码子的第三位置可以是没有改变aa的两个或所有四个核苷酸。对于具有6个密码子的三个aa的第一个或第二位置，情况是相同的。为了估计aa交换的数量，Monte-Carlo模拟是更适当的。例如，称为RAMHA的程序进行了这样的模拟(在Siderovski和Mak，1993中描述)。该程序模拟了，例如，具有所需的掺入的10,000个寡核苷酸的合成并计算0至n个aa交换的频率。
掺入例子
在13密码子区中的掺入和aa交换之间的关系(利用Monte Carlo模拟计算)：
掺入水平  0       1       2       3       4       5       6      7
百分比  个突变
5％     0.2      0.35    0.27    0.13    0.05    0       0       0
10％    0.04     0.13    0.24    0.25    0.19    0.11    0.05    0
15％    0.005    0.03    0.10    0.20    0.24    0.23    0.13    0.07
可以利用下式计算13aa的aa交换的组合的可能数量：
y！
        20x
                y＝aa诱变的数量
N＝x！(y-x)！
                x＝aa交换的数量
在13aa中1个aa交换＝260个可能的交换
在13aa中2个aa交换＝31200种可能组合
在13aa中3个aa交换＝2.3×106种可能组合
从此可以得出：当筛选，例如用13密码子中的10％掺入文库的100,000个菌落时产生的在上表中显示的分布意味着一个aa交换的大约13,000个筛选(13％)。然而，仅有260个可能的一个aa交换，因此筛选出大量相同的aa交换。更高的掺入，例如，15％(如上表)给出更少的一个aa交换(大约3％)，然而，两个aa交换也降低到这样的程度(10％)，在此程度下不能进行具有大约100.000筛选容量的31200个可能组合的筛选。
最后，aa交换通过wt氨基酸的起源产生误差。如把Glu变成Ala仅需一个核苷酸交换，但是从Glu到Phe需要三个。这意味着与需要一个核苷酸交换的概率相比，需要2或3个核苷酸交换的aa交换概率更低。因此，在某些情况下，我们使在我们知道它是可能的位置进行超过一个aa的交换。我们总是在具有四或六个密码子的第三个密码子的位置选择G/C。这降低了wt密码子的偏差，也降低了终止密码子的概率(如果完全混杂，从4.7％降低至3.1％)。对于给定的库大小是否包含最可能的和最不可能的取代突变体的概率的计算，参见Palzkill等，1994。
在扩增文库筛选时群体分布的计算
可以考虑另一个因素。本文提出的大多数文库在其转化进酵母之前在大肠杆菌中扩增。这意味着有大于一次筛选相同的扩增克隆的概率-参见盒子I。
盒子I
例如，100,000个不同克隆的扩增的随机诱变文库的筛选
当筛选100,000个菌落时，筛选了64％的文库。
当筛选230,000个菌落时，筛选了90％的文库。
当筛选300,000个菌落时，筛选了95％的文库。
这假定所有100,000个克隆平均扩增。
下式可以用来计算这种情况：
N = ln ( l - P ) ln ( l - 1 / D )
N是筛选的克隆的数量，P是筛选的不同克隆的分数，D是不同克隆的总数。
抗终止策略
为了避免早熟的截短的蛋白质，应该在有潜力形成终止密码子的密码子中避免无义突变。对于可以用没有潜力形成终止密码子的替代密码子取代的密码子，可以利用下列的策略：
Gly：GGA         GG(G，C，T)
Leu：TT(A，G)    CTN
Arg：(A，C)GA    (A，C)GG或CG(C，T)
Ser：TC(A，G)    TC(C，T)或AG(C，T)
然而，下列aa仅可以以表现出终止密码子潜力的密码子确定：Cys，Glu，Lys，Gln，Trp和Tyr。因此，仅仅可以设计掺入以围绕产生核苷酸的产生终止密码子的核苷酸的随机位置。例如：
Glu(类似于Lys和Gln)：(90％G/5％C，A)(90％A/3.3％C，G，T)
(90％A/3.3％C，G，T)。无TAA或TAG＝终止。
Tyr(类似于Cys)：(90％T/3.3％A，C，G)(90％A/3.3％C，G，T)(90％C/10％T)。无TAG或TAA＝终止。
Trp：(90％T/3.3％A，C，G)(90％G/5％C，T)(90％G/5％C，T)。无TGA或TAG＝终止。
当然，这样的策略除去了某些a.a.交换。利用这些策略，早熟的截短的蛋白质的数目会剧烈降低。
Humicola lanuginosa脂酶变体的体内重组(基因改组)
可以把许多Humicola lanuginosa脂酶变体的DNA序列体内重组在同一混合物中。
载体通过连接进酵母表达载体pJSO37制备自脂酶变体。所有载体用Nrul切割开。
所有同源DNA序列的DNA片段使用标准方法通过PCR扩增制备。
混合DNA片段与打开的载体并通过标准方法转化进酿酒酵母YNG318。培养重组宿主细胞并如上所述地进行筛选。分离出现的转化体并使用上述滤纸测定方法之一实验其改进的洗涤性能。
阳性转化体是具有改进的洗涤性能的变体，该变体是从同源DNA序列的基因改组形成的。
脂解酶基因的体外定点诱变
一种可以用于把突变引入脂解酶基因的方法在Nelson和Long，分析生物化学，180，147-151(1989)中描述。它包含含有所需突变的PCR(聚合酶链式反应)片段的3步产生，其中所需突变通过在PCR-反应中利用化学合成的DNA链作为引物之一而引入。PCR片段的构建可以按照本领域已知的方法进行。从PCR产生片段，可以通过用限制酶裂解分离携带突变的DNA片段并再插入到表达质粒中。在图4和5中进一步概述了此方法。
用于构建H.lanuginosa脂解酶变体的替代方法包括按照制造厂商的说明使用商业的试剂盒，Chamelon双链、定点突变试剂盒。
把编码所说的脂解酶的基因插入到质粒pHD414中。按照制造厂商的说明，通过使用下列引物把pHD414的氨苄青霉素基因的ScaI位点改变成Mlul位点：
引物3：AGAAATCGGGTATCCTTTCAG
然后，包含所说的脂解基因的pHD414载体用作DNA聚合酶和寡核苷酸7258和7770的模板，其序列在下文的实施例中公开。通过添加包含所需突变的适当寡核苷酸把所需的突变(如在脂解基因的N-末端)引入所说的脂解基因。当应用N-末端肽添加时，这可以通过使编码亲本脂解酶的原或前原部分的DNA序列的密码子突变来完成。
PCR反应按照制造厂商的介绍进行。
DNA测序通过按照ABI Dye终止子循环测序试剂盒中的方案利用应用生物系统ABI DNA序列模型373A进行。
Humicola lanuginosa脂解酶在米曲霉中的表达
H.lanuginosa脂解酶的克隆如EP 305 216所述。它也描述了该酶在米曲霉中的表达和特征确定。所利用的表达质粒命名为p960。
用于本申请的表达质粒除了3’到脂酶编码区的小修饰外与p960相同。该修饰通过下列方法进行：以NruI和BamHI限制酶消化p960。在这两个位点之间，克隆了得自质粒pBR322的BamHI/NheI片段，其中NheI片段以Klenow聚合酶填充，由此产生质粒pAOl(图2)，这包含单一的BamHI和NheI位点。在这些单一位点之间，克隆得自p960的BamHI/XbaI片段以产生pAHL(图3)。
米曲霉的转化(一般方法)
米曲霉的转化(一般方法)
以米曲霉孢子接种100ml的YPD(Sherman等，(1981)，酵母遗传学中的方法，冷泉港实验室)并随振荡培养大约24小时。菌丝体通过米拉(miracloth)过滤而收获并以200ml 0.6M MgSO4洗涤。把菌丝体悬浮在15ml的1.2M MgSO4、10mM NaH2PO4、pH 5.8中。在冰上冷却悬浮液，添加1ml包含120mg Novozym 234(第1687批)的缓冲液。5分钟后，添加1ml 12mg/ml的BSA(西格马类型H25)，随轻微搅拌的培养在37℃下持续1.5-2.5小时，直到在显微镜下检查的样品中可以见到大量原生质体。
悬浮液通过米拉布过滤，把滤液转移至无菌试管中并以5ml 0.6M山梨醇、100mM Tris-HCl、pH 7.0覆盖。在1000g下离心15分钟，从MgSO4垫顶部收集原生质体。把2体积STC(1.2M山梨醇、10mM Tris-HCl，pH 7.5、10mM CaCl2)添加至原生质体悬浮液中，混合物在1000g下离心5分钟。把原生质体沉淀重新悬浮在3ml STC中并再次沉淀。重复进行。最后，把原生质体重新悬浮在0.2-1ml的STC中。
把100μl的原生质体悬浮液与5-25μg p3SR2混合(携带质粒的构巢曲霉amdS基因，在Hynes等，分子和细胞生物学，vol.3，No.8，1430-1439，1983年，8月中描述)在10μl的STC中。把混合物置于室温下25分钟。添加0.2ml 60％的PEG 4000(BDH 29576)、10mM CaCl2、10mMTris-HCl pH 7.5并细心地混合(两次)，最后添加0.85ml的相同溶液并细心地混合。把混合物置于室温下25分钟，在2.500g下旋转15分钟，把沉淀重新悬浮在2ml的1.2M山梨醇中。在更多次沉积之后，把原生质体铺在最小平板上(Cove，(1966)，生物化学生物物理学报113，51-56)，该平板包含1.0M蔗糖pH 7.0、作为氮源的10mM乙酰胺以及20mM CsCl以抑制背景生长。在37℃下培养4-7天后，选择孢子，将其悬浮在无菌水中并铺成单一菌落。重复此方法，在第二次重新分离后的单个菌落的孢子作为限定的转化体保存。
米曲霉A1560-T40的转化
把携带编码本发明的变体的DNA序列的质粒转化进米曲霉A1560-T40(米曲霉IFO 4177的蛋白酶缺失衍生物)中，所用的方法是在乙酰胺上通过与pToC 90(携带作为2.7kb XbaI片段(Corrick等，(1987)，基因53，63-71)的得自构巢曲霉的amdS基因)在pUC19载体(Yannisch-Perron等，(1985)，基因33，103-119)上共转化选择。转化如EP 238 023中所描述的进行。
流加发酵
流加发酵在包含麦芽糖糊精作为碳源、尿素作为氮源以及酵母提取物的培养基中进行。流加发酵通过把所说的米曲霉宿主细胞的摇动培养瓶培养物接种于包含3.5％碳源与0.5％氮源的培养基中进行。在pH 5.0和34℃下培养24小时后，开始连续添加另外的碳和氮源。将碳源保持为限制因子并保证氧气过量存在。流加培养继续4天，其后酶通过离心、超滤、澄清过滤和细菌过滤回收。进一步的纯化可以通过本领域已知的阴离子交换色谱方法完成。
在酿酒酵母中表达的H.lanuginosa脂解酶变体的纯化
无菌过滤发酵肉汤并向滤液(1400ml)中添加乙酸铵(92g)以产生0.8M的乙酸铵溶液。把溶液添加至Toy-opearl Butyl柱(XK 16/10)中。柱以0.8M乙酸铵洗涤，脂解酶在水中以5ml/分钟的流速洗脱。收集10ml级分，按照在标准脂酶滴定测定中的活性集中包含脂解酶的级分。过滤包含脂酶的库并把pH调整到pH 8.5，然后加至Q-Sepharose柱(HPQ XK 26/10)中。柱以200ml 0.1M Tris-HCl pH 8.5洗涤，脂解酶在400ml 0.1M Tris-HCl pH8.5中以5ml/分钟的流速在0至0.3M NaCl的线性梯度中洗脱。收集10ml级分，按照在标准脂酶滴定测定中的活性集中包含脂酶的级分。集中包含脂酶活性而且吸光度A280/A260nm大于1.7的级分。
没有肽添加的H.lanuginosa脂解酶变体与表达的米曲霉的纯化
将得自米曲霉培养物的发酵上清液离心，丢弃细胞碎片。使上清液通过0.45μ微孔滤纸过滤。然后用60％饱和硫酸铵沉淀。把沉淀溶解在水中，添加固体醋酸胺至0.8M的最终浓度。把溶液加到用0.8M乙酸铵预平衡的Butyl Toyopearl柱上。使用水和50％乙醇作为洗脱剂用梯度洗脱结合酶。
然后集中包含酶活性的级分，将电导调节至低于5mSi，pH调整至8.5。
然后将包含活性的集中物加到用25mM Tris一乙酸盐缓冲液pH 8.5预平衡的阴离子交换柱中(如高效Q
Figure G1996196233X19940529D001331
结合活性利用相同缓冲液和0.5M氯化钠以线性盐梯度洗脱。集中包含高脂解酶活性的级分。集中包含脂酶活性而且吸光度A280/A260nm大于1.7的级分。
第一洗涤作用的试验测定
在一个周期的洗涤试验中试验脂解酶的洗涤性能，该洗涤试验在恒温箱Terg-O-Tometer(TOM)进行，其后在绳子上晾干。
实验条件如下：
洗液：每烧杯1000ml
布样：每烧杯7个棉花布样(9×9cm)。
污物：用苏丹红染色的猪脂(Sigma)(0.75mg苏丹红/g猪脂)。将加热至70℃的50μl猪脂/苏丹红施用于每块布样的中心。在应用污物后，在炉子中将布样加热至75℃保持25分钟。
在室温下存储过夜。
水：3.2mM Ca2+/Mg2+(以5∶1的比率)
去垢剂：5g/l去垢剂组合物A或去垢剂B。通过NaOH将pH人工调整至10。
去垢剂组合物A：
0.300g/l烷基硫酸盐(AS；C14-16)
0.650g/l脂肪醇乙氧化物(AEO；C12-14，6EO)
1.750g/l沸石P
0.145g/l Na2CO3
0.020g/lSokalan CP5
0.050g/l CMC(羧甲基纤维素)
混合于在Milli-Q水中的3.2mM Ca2+/Mg2+(5∶1)，pH 10.2中。
去垢剂组合物B
如同去垢剂组合物A，但是还包含下列漂白剂：
0.900g/l碳酸钠过氧水合物。
0.300g/l TAED(四乙酰乙二胺)
脂解酶浓度(在去垢剂组合物A和B中)：0和1250或12500LU/l
洗涤时间：20分钟
洗涤温度：30℃
冲洗：在流动自来水中15分钟
干燥：在室内条件下过夜(大约20℃，相对湿度30-40％)。
评估：在400nm测量反射率。以后在Soxhlet抽提器中用三氯甲烷从布样中提取脂肪物质，蒸馏出溶剂，并用重量分析测定留在布样中的脂肪物质的量。应用薄层层析法(TLC)/火焰电离检测器(FID)，也可以测定脂肪物质的量。
除去的猪脂的百分率测定如下：
1)除去％定义如下：
[(用没有脂解酶的去垢剂洗涤的样布上保留的脂肪)减去(用含有脂解酶的去垢剂洗涤的样布上保留的脂肪)]再除以(用没有脂解酶的去垢剂洗涤的样布上保留的脂肪)并乘以100％，或
2)δ反射率(dR)定义如下：
(R(用含有脂酶的去垢剂洗涤的样品)-R(用没有脂酶的去垢剂洗涤的样品)。
反射率(也可称为减弱(remission))在Elrepho 2000仪器得自(Datacolor)上测定，该仪器能用2个氙闪灯照射样品，并测定反射光的量，因此，完全白对应于100％的反射率，全部黑对应于0％的反射率。
培养基和底物：
YPD：10g酵母提取物，20g胨，加水至810ml。高压灭菌，加入90ml 20％葡萄糖(无菌过滤的)。
LB-培养基：1升水中有10g Bacto胰化蛋白胨，5g Bacto酵母提取物，10gNaCl。
FG4培养基：3％豆粉，3％麦芽糖糊精，1％胨，用4M NaOH把pH调到7.0
SC Ura-平板：10％没有氨基酸的10x基础盐，0.5％酪蛋白氨基酸，0.02％苏氨酸，0.01％色氨酸，2％葡萄糖，1.5％琼脂。I0x没有氨基酸的基础盐：1升水中含60g NaOH，66.8g没有氨基酸的酵母氮碱(Difco)，和100g琥珀酸。
Litex琼脂糖HSB 2000(CAT NO：F90472)
BG试剂：把4mg/ml亮绿(BG)溶解在水中
底物1：
10ml橄榄油(Sigma CAT NO.0-1500)
20ml 2％聚乙烯醇(PVA)
使底物匀浆15-20分钟。
PCS去垢剂
10g/l：
SDS                0.52g
Dobanol 25-3       0.60g
Dobanol 25-1       0.58g
NaBO3H2O           1.50g
添加1升0.1M Tris缓冲液(pH 9)，并用Tris缓冲液进一步稀释到PCS平板上所需浓度的2倍浓度。
PCS平板
用于制造PCS平板的溶液
亮绿(BG-试剂)                             10ml
底物1                                     24ml
PCS去垢剂                                 500ml
2％琼脂糖(在TRIS缓冲液中(pH 9))           500ml
脂酶底物(Sigma目录no.800-1)
亮绿(Merck，art.No.1.01310)
实施例
实施例1
随机脂解酶变体的构建
如在以上材料和方法中所述，制备完全H.lanuginosa脂解酶基因及其氨基酸(aa)91-97和206-211的随机诱变文库。
氨基酸区域91-97和206-211被选作第一轮的定域诱变，因为已经发现这些区域对洗涤性能重要。区域91-97是酶的盖区域的一部分，区域206-211构成酶的疏水裂缝部分。
为每一区域合成一种寡核苷酸，该寡核苷酸包含93％的野生类型的核苷酸和待诱变的氨基酸密码子处其它三种核苷酸每种各2.33％。在可能没有改变氨基酸的地方，密码子中第三个核苷酸(摆动碱基)用50％G/50％C合成以得到变成含有一或两种密码子的氨基酸的更大可能性。91-97区域的诱变的寡核苷酸的组成在表1中显示。
通过使用这种寡核苷酸，能够使文库中已经引入亲本脂酶的一种氨基酸的变化的估算的突变频率达大约65-70％。对于已经引入的两个或更多氨基酸的变化的突变频率小于35％。选择这种低频率以保证在阳性克隆中所观察到的氨基酸变化和酶的改进有关，不只是由于高突变频率的“中性”变化。
在和适合的相反引物的PCR反应中使用诱变引物。纯化合成的PCR片段，在区域206-211的情形中消化并克隆进入穿梭载体。在区域91-97的情形中，合成的PCR片段作为引物在和第二个适合的相反引物的第二次的PCR反应中使用。这个步骤对能够消化和克隆诱变区域进入穿梭载体是必要的。
已经制备了包含从10,000-80,000克隆/文库的区域91-97和区域206-211的文库。在亲本脂酶是阳性的条件下检测时，大多数菌落是阳性(大于90％)，即，表现脂酶活性。阳性反应是在用2.5mM Ca(不是5mM EGTA)的滤膜测定中测定的。
使用25-7以上材料和方法中所述的低钙测定从不同的文库中筛选出450,000个菌落。分离得自aa91-97文库(盖区)的25个低钙阳性菌落和得自全部基因文库的12个25-7阳性菌落。对得自aa 91-97诱变的14个低钙阳性菌落进行了测序。
三个其它突变(在密码子83、103、145)(在诱变区外部)可以通过PCR错掺解释，虽然S83T的突变是颠换，该颠换对于PCR错掺是十分不寻常的。
序列
5′           5            C        G
T             5            C        3′
T             7            A
A             8            G        瓶 5：93％A；2.33％C；2.33％G和2.33％T
T             8            T
T             A/C          T
T             5            C
C             7            T
T             5            C        瓶 6：93％C；2.33％A；2.33％G和2.33％T
T             8            T
T             8            A
6             C/G          T
5             6            G        瓶 7：93％G；2.33％A；2.33％C和2.33％T
5             6            G
7             G            A
8             AA           A
6             T            C        瓶 8：93％T；2.33％A；2.33％C和2.33％G
7
表1：用于H.lanuginosa脂解酶的氨基酸91-97的定域随机诱变的寡核苷酸(SEQ ID No.4)构建的描述。在序列中存在的数量指这样的瓶子，其组成在序列的右边。
表2
菌株号  变体类型
59    I                         G91A     N94K             D96A
60    II      S83T                       N94K             D96N
61    II      S83T                       N94K             D96N
62    III              E87K                               D96V
63    IV               E87K     G91A                      D96V
64    II      S83T                       N94K             D96N
65    III              E87K                               D96V
67    V                                  N94K    F95L     D96H
69    V                                  N94K    F95L     D96H
71    III              E87K                               D96V
72    II      S83T                       N94K             D96N
表2：菌株号指克隆进曲霉属表达载体pAHL的最初选择克隆。变体类型指同一克隆，该克隆可能在随机诱变的文库的扩增期间出现。变体类型I和II在0.01％25-7中是活性的，而其余如野生型一样是失活的。
                                    表3
                                  DNA序列
菌株号  变体类型
                           (序列之上是氨基酸号)
                   82  83  84  85  86  87  88  89  90  91  92
wt                 GGC TCT CGT TCC ATA GAG AAC TGG ATC GGG AAT
59       I                                              C
60       II            A                                 C
61       II            A                                 C
62       III                           A                 C
63       IV                            A                C
64       II            A                                 C
65       III                           A                 C
67       V                                               C
52/68    wt
53       wt
69       V                                               C
71       III                           A                 C
72       II            A                                 C
73       VI
                  93  94  95  96  97  98  99  100 -103 -145
wt                CTT AAC TTC GAC TTG AAA GAA ATA -ATT -CAT
59       I          G   G      C
60       II         G   G      A
61       II         G   G      A
62       III                    T  
                                                     C    C
63       IV                     C
64       II         G   G      A
65       III        G           T
67       V              A C A C
52/68    wt
53       wt
69       V              A C A C
71       III        G          T
72       II         G   A     A
73       VI                   A          ？
表3：野生型序列在顶行显示。只有不同于wt的核苷酸写成变体序列。密码子91和93的碱基分别以1∶1C/T和T/G渗入。其它在密码子91-97的核苷酸利用93％wt和2.33％的三个其它核苷酸掺入。
得自筛选具有掺入的aa 85-99(盖区)的随机诱变的文库的结果，基于获自aa91-97的随机诱变的阳性克隆的结果。
随机诱变文库的构建
背景
在盖区(aa91-97，参见以前的例子)的第一文库的筛选中发现五种不同类型的强阳性突变体。D96变为A、V、N或H，氨基酸改变E87K、G91A和N94K在两至三个独立的突变体与D96的改变(表明其对Lipolase的钙的独立性的重要性)中发现。由于这些突变在低钙/Dobanol活性方面与几个测定中的wt相比具有改进，它们在整个盖区的第二次随机诱变中用作起点。
定域随机诱变。
氨基酸区aa85-99+83S/T随机诱变如下。掺入方案：S83-50％S/50％T；E87-93％/K/7％X；G91-93％A/7％X；N94-50％K/50％N；D96-100％X；其余是93％wt/7％X(百分比指密码子在核苷酸水平的掺入(参见寡核苷酸序列)。从这些掺入形成的各个氨基酸的密码子的理论百分比可以利用本领域计算机程序水平计算)。在可能不改变氨基酸的地方，在密码子中的第三核苷酸(摆动碱基)以50％G/50％C合成以得到变成仅具有一个或两个密码子的氨基酸的更大的可能性。诱变寡核苷酸的组成在SEQ ID No.寡核苷酸2(SEQ ID No.6)中显示。不诱变的寡核苷酸区使用优化稳定性和无二级结构的寡核苷酸程序选择。
这种诱变给出在文库中的起点(不包括S83、N94和D96)的大约93％改变的计算频率。这是十分高的突变频率，该突变频率应给出盖区的主要改变的机会。
诱变引物用于与适合的相反引物的PCR反应。形成的PCR片段作为引物用于与适合的第二相反引物的第二PCR反应。该步骤是能够消化并把诱变区克隆进酵母表达载体pYESHL所必需的。重要的是考虑通过Taq聚合酶将A添加至PCR片段的3′末端。当设计用于这样的两步PCR反应的诱变引物时，重要的是要考虑把A通过Taq聚合酶添加到PCR片断的3’端。
以该方法制备区aa 85-99+83S/T的随机诱变文库。
筛选
采用Dobanol和LAS使用低钙滤纸测定。盖2文库的筛选以5mMEGTA、0.01％Dobanol和0.006％LAS进行。检测并分离了几个阳性克隆，测序并转化进曲霉属，纯化并在洗涤试验中试验。
选择的阳性克隆的序列和洗涤效果
划线部分显示用于滤纸测定的条件。IF＝在3-周期洗涤中的改进因子。
5mM EGTA，0.01％ Dobanol，0.006％ LAS
E87K，G91A，L93I，N94K，D96A.IF＝1.3
5mM EGTA，0.02％ Dobanol
N73D，S85T，E87K，G91A，N94K，D96A.IF＝1.1
S83T，E87K，W89G，G91A，N94K，D96V.IF＝0.8
E87K，G91A，D96R，I100V.IF＝5.2
S83T，E87K-，Q249R
2g/l PCS
E87K，G91A.IF＝5.0
寡核苷酸-盖2的序列(SEQ ID No.6)：
5′-C ATT TAT 886 888 655(C/G)(A/C/G/T)(A/C/G/T)755(C/G)88(A/C)57 588(C/G)76(7/8)58 665 788 688(8/7)58 775 ACG AG(A/T)GCC ACG-3′
瓶5：93％A；2.33％C；2,33％G og2,33％T.
瓶6：93％C；2,33％A；2,33％G og2,33％T.
瓶7：93％G；2,33％A；2,33％C og2,33％T.
瓶8：93％T；2,33％A；2,33％C og2,33％G.
在两个区同时进行的定域随机诱变
如上述材料和方法所描述的使用在表4显示的两个寡核苷酸004和005在PCR反应中制备aa区56至64和81至99+102的随机诱变文库。合成用于aa区81至99+102的寡核苷酸004(具有93％wt核苷酸和在每个位置2.33％的每种其它3种核苷酸，除了S83密码子，掺入该密码子以产生50％S/50％T(参见表4))。对于具有4或6个密码子的aa，50％/50％的G/C或A/C混合物用于第三碱基(参见表4)。对于异亮氨酸密码子的第三碱基，使用瓶7和8的50％/50％混合物。D96L在随机诱变中用作起点，由于它在以前的良好性能变体中发现。合成用于aa区56至64的寡核苷酸005(具有93％wt核苷酸和在每个位置的2.33％的每种其它3种核苷酸)。对于位置56、57和62，引入在其它中的带正电的aa的偏移(参见表4)。对于具有4或6个密码子的aa，50％/50％的G/C或G/T混合物用于第三碱基。通常PCR反应可以在掺入区外部引入突变，这是一个优点，因为这样的突变可以有益于变体的性质。
寡核苷酸004也用于和通过双PCR反应产生覆盖区域81至99+102和区域248-257，259，263-269的文库而克隆的寡核苷酸006(参见表4)组合。合成寡核苷酸006用于每个位置包含93％wt核苷酸和2.33％的每个其它3种核苷酸的aa区域248-257，259，263-269。对于包含4或6个密码子的氨基酸，一种50％/50％的G/C或A/C混合物用于第三碱基(参见表4)。对于异亮氨酸密码子的第三碱基，使用瓶7和8的50％/50％混合物。
寡核苷酸005和006也可采用盖区中的正区作为模板用于随机诱变的文库的构建。
表4：
寡核苷酸004    102：    T    C    A
盖3                     C    T    G
(反义)         5′-     C    G    C
aa 81-99，     G        C    C    C
G            G    5        6        A/C
G            C    C？G     5        6
A            A    5        7        7
             A    7        8        G
             A    7        8        A
             T    5        6        A
             7    5        8        A
             8    C/G      6        G
             6    8        7/8      -3′
             A    8        5        瓶 5：93％A；
             T    A/C      8        2,33％C；2,33％G
             T    5        C/G      og 2,33％T.
             T    7        7        瓶 6：93％C；
             A    5        5        2,33％A；2,33％G
             T    8        A/C      og 2,33％T.
             8    8        6        瓶 7：93％G；
             8    C/G      7        2,33％A；2,33％C
             6    6        A        og 2,33％T.
             8    6        G        瓶 8：93％T；
             8    7/8      A/T      2,33％A；2,33％C
             8    5        C/G      og 2,33％G.
             6    8        6
             5    6        6
                                    寡核苷酸005盖-接触
                                    aa 56-64：
                                    5′-
                                    G
                                    A
                                    A
                                    A
                                    T
                                    G
                                    C
                                    A
                                    T
                                    G
                                    C
                                    C
                                    C
                                    C
                                    G
A    5/7        8        G
G    6/8        6        G
G               T/G      C
T               7        T
A               7        T
G               G/T      C
A               7        3′
G               8
A               G/C      瓶 5：
A               7        93％A；
G               7        2,33％C；
G               G/C      2,33％G og
C               6/7      2,33％T.
G               5/7      瓶 6：
G               6/8      93％C；
A               7        2,33％A；
T               8        2,33％G og
G               G/C      2,33％T.
C               5        瓶 7：
A               6        93％G；
A               G/C      2,33％A；
C                        2,33％C og
G                        2,33％T.
T                        瓶 8：
T                        93％T；
T                        2,33％A；
C                        2,33％C og
T                        2,33％G.
C
T
A
C
T
C
G
T
T
T
7/5
7/5
7/5
6/7
寡核苷酸006    6             A            C/G            G
C-末端         5             C            7              C
aa 248-        A/C           C            7              C
257，259，     7             A            5/8            -3′
263-269        8             A/C          5              瓶 5：93％A；
               C/G           5            8              2,33％C；2,33％G
5′-           6             7            7              og 2,33％T.
G              6             G            8              瓶 6：93％C；
C              5/8.          T            8              2,33％A；2,33％G
C              5             G            A/C            og 2,33％T.
C              8             C/G          7              瓶 7：93％G；
T              A/C           7            7              2,33％A；2,33％C
C              5             6            6              og2,33％T.
T              7             A/C          8              瓶 8：93％T；
A              C/G           7            7              2,33％A；2,33％C
G              6             7            7              og2,33％G.
A              6             7/8          8
C              G             5            8
T              A             8            A
A              A             5            T
A/C            G             8            T
5              T             6
7
5
在包含去垢剂的平板上筛选这些文库而获得的某些阳性克隆显示如下：
E56R+D57L+I90F+D96L+E99K
E56R+D57L+V60M+D62N+S83T+D96P+D102E
D57G+N94K+D96L+L97M
E87K+G91A+D96R+I100V+E129K+K237M+I252L+P256T+G263A+L264Q
E56R+D57G+S58F+D62C+T64R+E87G+G91A+F95L+D96P+K98I
A47V+D62G+D96L+A121T
E56G+D57G+V60E+D62G+N94K+D96L
下列变体从整个基因的随机诱变单独获得(通过如材料和方法部分中所述的PCR或PCR+甲酸)，并在包含去垢剂的平板上筛选：
I34V+S54P+F80L+S85T+D96G+R108W+G109V+D111G+S116P+L124S+V132
M+V140Q+
V141A+F142S+H145R+N162T+I166V+F181P+F183S+R205G+A243T+D254G+
F262L
A19T+D167G+E210V+W221L(基于D167G+E210V的随机诱变)
A49P+D167G+E210V(基于D167G+E210V的随机诱变)
实施例2
H.lanuginosa脂解酶的第一洗涤变体的构建
1.通过重组和筛选的结构域的改组
具有很好的洗涤性能(如在各种与洗涤相关的检测中所评估的)、有些是根据实施例1构建的20个H.lanuginosa脂解酶变体可通过如本文在材料和方法部分中所述的用酿酒酵母YNG318中体内重组的方法重组。所利用的脂解酶变体可从表1明显看出。这些变体大多是通过以上材料和方法部分中所述的随机或定域随机诱变并筛选对钙的依赖性减少和对去垢剂组分Dobanol25-7(参见以上材料和方法部分)耐性提高而构建。有些变体是两次或更多次诱突变和筛选的连续循环的结果。
限制酶打开的载体和从下表明显看出并在材料和方法部分中进一步讨论的PCR片段以大约1∶1的摩尔比混合，并用于转化感受态的酿酒酵母细胞(用“分子生物学中当代方案”(eds.F.M.Ausubel等，13.7章，JohnWiley&Son公司，美国)中所描述的乙酸锂方法构造)。把转化的细胞涂抹在滤膜上，使用如以上材料和方法部分中所述的过滤测定，筛选减小对钙依赖和增加对去垢剂耐性的菌落。
把给出阳性信号的菌落划线挑选为单一的菌落置于新的平板和滤膜上并再次筛选。2至4次再筛选后，阳性菌落发酵如下：
酵母中H.lanuginosa脂解酶和变体的发酵
10ml的SC-ura-培养基以酿酒酵母菌落接种并在30℃下生长2天。将这10ml用于接种300ml接种后在30℃生长3天的SC-ura-培养基。这300ml用于接种下列G-底物5升：
400g Amicase
6.7g酵母提取物(Difco)
12.5g L-亮氨酸(Fluka)
6.7g(NH4)2SO4
10g  MgSO4.7H2O
17g K2SO4
10ml痕量化合物，见下
5ml维生素溶液，见下
6.7ml H3PO4
25ml  20％Pluronic(抗泡沫)
在5000ml的总体积中。
痕量化合物：
6.8g ZnCl2
54.0g  FeCl2.6H2O
19.1g MnCl2.4H2O
2.2g CuSO4.5H2O
2.58g CoCl2
0.62g H3BO3
0.024g(NH4)6Mo7O24.4H2O
0.2g KI
100ml HCl(浓缩的)
在1升的总体积中。
维生素溶液：
250mg生物素
3g硫胺素
10g D-泛酸钙
100g肌醇
50g胆碱盐酸盐
1.6g吡哆素
1.2g烟酰胺
0.4g叶酸
0.4g核黄素
在1升的总体积中。
把酵母细胞在5000ml的培养基中在30℃发酵5天。开始以100ml 70％的葡萄糖剂量向发酵罐加入葡萄糖，以后每天加入400ml 70％的葡萄糖。发酵肉汤的pH通过有控制的添加10％的NH3溶液保持在pH 5.0。
开始22小时以300rpm搅拌，接着在其余的发酵期间以900rpm搅拌。开始22小时以1升空气/升/分钟通入空气，其余的发酵期间以1.5升空气/升/分钟通入。
纯化后，在材料和方法部分中所描述的一个循环洗涤测试中检测变体除去猪脂的能力。结果由下面的实施例2和3给出。
表1：用于重组的变体
Humicola lanuginosa脂酶的变体，用于制备用于invo重组(基因改组)的 载体(用NruI打开)：
E56R，D57L，I90F，D96L，E99K
E56R，D57L，V60M，D62N，S83T，D96P，D102E
D57G，N94K，D96L，L97M
E87K，G91A，D96R，I100V，E129K，K237M，I252L，P256T，G263A，L264Q
E56R，D57G，S58F，D62C，T64R，E87G，G91A，F95L，D96P，K98I，(K237M)
E210K
Humicola lanuginosa脂酶变体，用于制备用于invo重组(基因改组)的 DNA片段(通过来自包含变体的质粒的整个基因的标准PCR扩增)：
S83T，N94K，D96N
E87K，D96V
N94K，D96A
E87K，G91A，D96A
D167G，E210V
S83T，G91A，Q249R
E87K，G91A
S83T，E87K，G91A，N94K，D96N，D111N.
N73D，E87K，G91A，N94I，D96G.
L67P，I76V，S83T，E87N，I90N，G91A，D96A，K98R.
E210K
S83T，E87K，G91A，N92H，N94K，D96M
S85P，E87K，G91A，D96L，L97V.
E87K，I90N，G91A，N94S，D96N，I100T.
I34V，S54P，F80L，S85T，D96G，R108W，G109V，D111G，S116P，L124S，V132M，V140Q，V141A，F142S，H145R，N162T，I166V，F181P，F183S，R205G，A243T，D254G，F262L.
E56R，D57L，I90F，D96L，E99K
E56R，D57L，V60M，D62N，S83T，D96P，D102E
D57G，N94K，D96L，L97M
E87K，G91A，D96R，I100V，E129K，K237M，I252L，P256T，G263A，L264Q
E56R，D57G，S58F，D62C，T64R，E87G，G91A，F95L，D96P，K98I，(K237M)
2.通过两个正因子一起的传统克隆的结构域改组
包含编码Humicola lanuginosa脂酶变体(D57G+N94K+D96L+L97M)的DNA序列的曲霉属表达载体pHD414以限制酶NarI和XbaI消化，产生两个片段。两片段通过琼脂糖凝胶电泳分离，并把最大片段从琼脂糖凝胶中分离出来。把这个片段和来自以NarI和XbaI消化的变体(S83T+G91A+Q249R)的最小片段连接。把连接片段转化入大肠杆菌，并把产生的质粒构建体从其中一个转化体中分离，为测试正确的组装进行测序。把质粒转入如以上材料和方法部分中所述的发酵并纯化的米曲霉中。变体包含下列突变D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R。
实施例3
米曲霉JaL125中H.lanuginosa脂解酶变体HL9的构建和表达
变体HL9的成熟部分中包含下列突变：
E1P+D57G+N94K+D96L+Q249R和融合到E1P的N-末端肽添加SPIRPR(产生全部N-末端肽添加SPIRPRP。
把一个N-末端肽添加运用于这样的亲本H.lanuginosa(DSM 4109)脂解酶：分别具有如EP 305 216的氨基酸和DNA序列，此外，在DNA序列(EP 305216)的成熟部分(由常规定点诱变插入)携带下列的突变D57G+N94K+D96L+Q249R。肽添加SPIRPRP运用于亲本酶的N-末端，如下所述：
pIVI220的构建：
根据所描述的方案，使用来自Stratagene的Chamelon双链、定点诱变试剂盒构建质粒。
pHL296用作质粒模板。所说的质粒包含编码具有以上提及的克隆进入pHD414的突变(D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R)的H.lanuginosa脂解酶的基因。
引物no.7258用作选择引物。
7258：5’p gaa tga ctt ggt tga cgc gtc acc agt cac 3’
(这样改变氨苄青霉素抗性基因中发现的并用于切成MluI位点的ScaI位点)。
引物no.7770用作选择引物。
7770：5’p tct agc cca gaa tac tgg atc aaa tc 3’(变化没有改变氨基酸序列的H.lanuginosa脂酶基因中发现的ScaI位点)。
引物no.8479用作突变引物。
8479：5’p gcg tgg acg gcc ttg gct agc cct att cgt cctcga ccg gtc tcg cag gat ctg(取代亲本H.lanuginosa酶(通过SPIRPRP取代SPIRRE)的原肽和N-末端E1)。
pIVI245的构建
根据所描述的方案，使用来自Stratagene(cat no.200509)的Chameleon双链、定点诱变试剂盒构建质粒。
pIVI220用作质粒模板，引物no.7887用作选择引物(改变氨苄青霉素抗性基因中发现的并用于切成ScaI位点的引入的MluI位点)。7887：5’p-gaatga ctt ggt tga gta ctc  acc agt cac 3’
引物no.8932用作诱变引物(8932：5’p-g aac tgg ata gga aatttg aag ttc ctg ttg aaa gaa ata aat gac 3’(这样把M97作为野生型变回到L97并保留了两个突变N94K和D96L))。
2.米曲霉表达质粒pCaHj483的构建
在图8中描述了pCa Hj483。它从下列片段构建：
a)载体pToC65(WO91/17243)，用EcoRI和XbaI切割。
b)一个携带amdS基因的来自构巢曲霉的2.7kb的XbaI片段(C.M.Corrick等，(1987)，基因53，p.63-71)。amdS基因在真菌转化中用作选择性标记。amdS基因已经修饰，因此通常在基因中存在的BamHI位点已被破坏。这个过程是通过使用引物3：AGAAATCGGGTATCCTTTCAG(SEQ ID No.1)引入沉默的点突变完成的。
c)一个0.6kb的coRI/BamHI片断，它携带融合到编码构巢曲霉tpi基因的mRNA 5’未翻译末端的序列的60bp DNA片段的黑曲霉NA2启动子。把NA2启动子从质粒pNA2(EP 383 779)中分离，并通过PCR融合到60bp tpi序列。编码60bp tpi序列的引物(引物4SEQ ID No.7)有下列序列：
5′-GCTCCTCATGGTGGATCCCCAGTTGTGTATATAGAGGATTGAGGAAGGAAGAG
AAGTGTGGATAGAGGTAAATTGAGTTGGAAACTCCAAGCATGGCATCCTTGC-3′
d)一个携带黑曲霉葡糖淀粉酶转录终止子的675bp Xbal片段。
该片段从质粒pICAMG/Term(EP 238 023)中分离。
把片段c)的BamHI位点通过pIC19R接头(BamHI至Xbal)连接到片段d)上转录终止子之前的Xbal位点。
HL9表达质粒pCaHj485的构建
把质粒pJVi245以BamH I和Sal I消化，并把产生的编码HL9脂解酶的904bp片段分离。把pCaHj 483用BamH I和Sal I消化，把大的载体片段(6757)和HL9片段连接。连接混合物用于转化大肠杆菌DH5α细胞，并把携带所期待的质粒的转化体分离。把该质粒称为pCaHj485。
3.把pCaHj 485转化入JaL 125
把米曲霉JaL 125如专利EP 0 531 372中所述利用在乙酰胺上选择用pCaHj 485来转化。转化体是两次再分离的孢子。来自第二次再分离每个转化体的孢子用于在96孔的微型滴定皿中接种200μl YPM(1％酵母提取物，2％胨，2％麦芽糖)。YPM培养物在34℃生长4天，并利用丁酸对硝基苯酯测定选择产率最高的：
贮存溶液：把18μl丁酸对硝基苯酯溶于1ml异丙醇。
工作溶液：把0.1ml贮存溶液和10m 50mM Tais/HCl pH7.5；10mMCaCl2混合。
测定：把1μl的YPM上清液和200μl工作溶液在96孔微量滴定皿中混合，使用ELISA读数仪在450nm下测量显色。
选择一个转化体用于罐发酵。
4.JaL 125/pCaHj485的罐发酵
发酵使用34℃的恒定培养温度和1.2升的开始体积，以流加发酵形式进行。培养基的初始pH置于6.5。一旦pH增加至7.0，通过添加10％H3PO4保持该值。在培养基中溶解氧的水平利用每分钟每升培养基1.0升空气的固定充气速率通过改变搅拌速率控制。在全部流加期间流加速率以恒定的水平保持。
批式培养基包含麦芽糖糖浆作为碳源，尿素和酵母提取物作为氮源以及痕量金属和盐的混合物。在流加阶段继续添加的物料包含麦芽糖糖浆作为碳源，而添加酵母提取物和尿素以保证氮的足够供应。
5.第一洗涤脂解酶的纯化
1)发酵上清液通过微孔滤纸Cat.No.AP2504700滤纸型AP25过滤。
2)发酵上清液通过得自Millipore膜型号GS 0.22微米的无菌滤纸过滤一次以上。
3)然后通过添加固体乙酸铵将发酵上清液调整至0.8M乙酸铵。
4)在TSK凝胶Butyl-Toyopearl 650上的疏水色谱。用Butyl-Toyopearl基质装入50ml柱。洗涤柱并以0.8M乙酸铵平衡。然后将以乙酸铵调整的一升发酵上清液加到Butyl柱中。柱以0.8M乙酸铵洗涤直到洗出所有未结合的物质。然后依次用水和50％乙醇洗脱结合的物质。收集各级分并利用标准的LU测定分析脂酶活性。收集包含脂酶活性的级分并稀释以将收集物的电导率调整至4mSi以下，pH调整至8.5。
5)在高效Q琼脂糖凝胶上的阴离子交换色谱(Pharmacia，Code No.17-1014-01)。装入50ml柱并以50mM硼酸盐缓冲液pH 8.5洗涤。
然后将包含脂解酶活性的收集物加到高效Q琼脂糖凝胶柱中。用硼酸盐缓冲液pH 8.5洗涤未结合的物质。然后利用包含1M氯化钠的硼酸盐缓冲液pH 8.5用线性梯度洗脱。
收集各级分并分析脂酶活性。收集具有在A280和A260UV吸光度比率超过1.7的包含脂酶活性的级分。
实施例4
通过随机诱变构建N-末端添加
把编码加入到成熟H.lanuginosa脂解酶(从DSM4109获得)的第一个氨基酸残基上的N-末端添加SPIRPRP、并且在其成熟部分含有下列突变的DNA序列部分进行随机诱变：D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R。通过PCR驱动的定点诱变、利用适当的引物序列和WO 95/26215中所描述的方法进行亲本脂解酶的成熟部分的突变。如实施例3的描述加入肽添加SPIRPRP(即最后一个P代替E1)。
SPIRPRP密码子的核苷酸掺入方案如下：
寡核苷酸1：5’-GCG TGG ACG GCC TTG GCC86(T/A)66(A/T)58(T/A)67(T/A)66(T/A)575 66(T/A)GAG GTC TCG CAGGAT CTG-3’(57多聚体)(SEQ ID No.11)。将使用下列各种核苷酸
瓶5：80％A；6.66％C；6.66％G og6.66％T。
瓶6：80％C；6.66％A；6.66％G og6.66％T。
瓶7：80％G；6.66％A；6.66％C og6.66％T。
瓶8：80％T；6.66％A；6.66％C og6.66％G。
使用了两步PCR反应方案：使用pHL296作为质粒模板实施以上述引物作为5’引物，引物2056(5′gca cgt aat gtt tgt acc 3′)作为3’引物的第一步。使用同样的模板将第一个PCR循环的产物用在新的PCR中，此PCR以4699(5′cgg tac ccg ggg atc cac 3′)作为5’引物(以导入BamHI位点和第一部分编码序列)，以此PCR产物作为3’引物。在Spin 100(来自克隆技术实验室，公司)上纯化所得的产物，并用BamHI和PvuII切割。在带有SpinX(Costar)的琼脂糖凝胶上纯化所得的DNA片段，并把它作为用BamHI和PvuII切割的BamHI-XbaI片段，连接到含有H.lanuginosa脂解酶基因的衍生于pHL296cloed的酵母表达载体pJSO37上。使用常规技术将所得的DNA电转化到DH10/DH12大肠杆菌细胞(Gibco/BRG生命技术公司)。
在转化入大肠杆菌并扩增后，纯化该质粒并用其转化酿酒酵母YNG318。在另一含有去垢剂(3g/l的PCS)的脂酶滤纸测定中筛选性能较好的酿酒酵母细胞。对表现为阳性的进行测序，发现其含有下列肽添加：GPIRPRP、SHSRHNA，TAIRPRK、SALRRRP、STRRPRP、SPRRPRT、SPIPPGP、LPFRQRP、SPFRPKL和SALRRP(分别称为HL10sI-10)。
在30℃下使用5g/l酶灭活的Ariel Futur作为去垢剂，按照上文材料和方法部分的描述(测定第一洗涤效果的实验)，分别实验HL10s1-6的一次循环的洗涤性能。每一种改进的酶除去的脂肪物质的量如下：
  脂酶变体   低剂量   猪脂除去％   高剂量   猪脂除去％
  HLv10s1   1250LU/l   26   12500LU/l   54
  HLv10s2   1250LU/l   22   12500LU/l   53
  HLv10s3   1250LU/l   34   12500LU/l   55
  HLv10s4   1250LU/l   33   12500LU/l   55
  HLv10s5   1250LU/l   23   12500LU/l   47
  HLv10s6   1250LU/l   30   12500LU/l   53
趋势为：在N-末端添加中具有更多的带正电的氨基酸表现出最好的洗涤性能。
类似地，也进行了加入到H.lanuginosa脂酶变体El＊+D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R加其它变体上的N-末端添加RPRPRPRP的随机诱变。
RPRPRPRP密码子的核苷酸掺入方案如下：
寡核苷酸2：5′-GTC TCT GCG TGG ACG GCC TTG GCG GCG CCA CCT CCA 67(T/A)
66(T/A)575 66(T/A)67(T/A)66(T/A)575 66(T/A)(6/7)(7/8)(C/G)57(C/G)C57
(5/7)5(C/G)CTG TTT AAC CAG TTC AAT CTC-3′(93-聚体)
瓶5：80％A；6.66％C；6.66％G og 6.66％T.
瓶6：80％C；6.66％A；6.66％G og 6.66％T.
瓶7：80％G；6.66％A；6.66％C og 6.66％T.
瓶8：80％T；6.66％A；6.66％C og 6.66％G.
将APPP加入到随机诱变的RPRPRPRP的N-末端，并使之在信号肽之前，目的是防止N-末端添加的蛋白降解作用。也可以不需要这一步。为了除去一个带负电的氨基酸，使E1缺失。对位于成熟H.lanuginosa脂酶序列2-5位的氨基酸也进行了诱变，目的是为了在此脂酶的非结构部分发现改进的变体。其它方面与上文所述的用于SPIRPRP随机诱变的方法相同。
得到下列N-末端肽添加：Ala-Pro-Pro-Pro-Arg-Pro-Arg-Leu-Leu-Pro-Ile-Ser(APPPRPRLLPIS)(除了缺失的E1残基外，此变体在成熟酶的非结构性N-末端部分中携带所说的附加突变D5E)。
Ala-Pro-Pro-Pro-Thr-Arg-Gln-Arg-Gln-Ser-Pro(APPPTRQRQSP)(除了缺失的E1残基外，此变体在成熟酶的非结构性N-末端部分中携带所说的附加突变V2L、S3T、D5V)。
Ala-Pro-Pro-Pro-Arg-Thr-Ile-Pro-Arg-Ser-Ser-Pro(APPPRTIPRSSP)(除了缺失的E1残基外，此变体在成熟酶的非结构性N-末端部分中携带所说的附加突变V2L、S3R、D5E)。
Ala-Pro-Pro-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro(APPPRPRPRPR P)(除了缺失的E1残基外，此变体在成熟酶的非结构性N-末端部分中携带所说的附加突变V2G、D5E)。
Ala-Pro-Pro-Pro-Arg-Thr-Arg-Pro-Arg-Pro-Arg-Ser(APPPRTRPRPRS)(除了缺失的E1残基外，此变体在成熟酶的非结构性N-末端部分中携带所说的附加突变V2GL、S3T、Q4P、D5E)。
Ala-Pro-Pro-Pro-Lys-Ala-Ser-Pro-Arg-Gln-Arg-Pro(APPPKASPRQRP)(除了缺失的E1残基外，此变体在成熟酶的非结构性N-末端部分中携带所说的附加突变V2GL、D5Q、L6M)。
实施例5
本发明脂解酶的第一洗涤活性
利用在上述材料和方法部分所述的“第一洗涤效果检验分析”，使用去垢剂组合物A或B检验了脂解酶的第一洗涤活性。把一些新的第一洗涤脂酶和被认为是本领域现有的去垢剂用的脂酶相比较。
注意：□代表如实施例2所述的在米曲酶中产生的
＊代表如实施例4所述的在酵母中产生的
Figure G1996196233X19940529D001601
Figure G1996196233X19940529D001621
实施例6
去垢剂中活性(AiD)测定
AiD测定是一种用于选择亲本脂解酶的分析测定方法，这种亲本脂解酶用于构建本文所述的第一洗涤脂解酶。
设备：150ml烧杯的水浴。搅拌器进行搅拌
脂解酶剂量：12500LU/I。
底物：每个实验使用带有6μl橄榄油的6块(3.5＊3.5cm)棉布
去垢剂：溶解在0.36mM Ca2./Mg.2(5∶1)中的0.5g/l模型液体去垢剂＊，pH调节到10，每烧杯100ml。
30℃下将样品搅拌60分钟后，用自来水冲洗15分钟以除去布样上残留的去垢剂。将布样放置在含有10ml四氢呋喃和6.25ml 4M HCl的烧瓶中，蒸发过夜，然后把布样重新溶解在四氢呋喃中。通过TLC/FID测定脂类成分，FFA(游离脂肪酸)的％量用于在脂解酶之间进行区别。
＊去垢剂制剂如下：
注意：□代表如实施例2所述的在米曲酶中产生。
＊代表所有变体如实施例4所述的在酵母中产生。
  模型液体去垢剂：
  组分   ％W/W
  模型液体去垢剂：
  LAS   17.50
  AEO   14.40
  DTSA   10.00
  油酸   3.00
  椰子油   5.00
  MEA   14.50
  MPG   10.70
  乙醇   1.40
  膦酸盐   1.00
  硼酸   0.80
  柠檬酸   3.90
  氯化钠   0.13
  氯化钾   0.38
  盐酸4M   6.00
  水   9.7
实施例7
利用在上述材料和方法部分所述的“第一洗涤效果检验分析”，使用特殊的商业上的去垢剂Ariel Futur(能够买到的商品批号为4279 B23：35)检验了大量的潜在的第一洗涤脂解酶的第一洗涤活性。在洗涤前通过加热(微型炉中85℃，4分钟)将已经存在于去垢剂中的酶灭活。
可以使用第一表比较实施例5和实施例6。
所得的结果分述如下：
a)当加入一定量的LU-单位(参见材料和方法部分的定义)时，除去％。
b)当加入一定量的纯酶蛋白质(毫克)时，除去％。
c)当加入一定量的LU-单位(参见材料和方法部分的定义)时，δ反射率。
d)当加入一定量的纯酶蛋白质(毫克)时，δ反射率。
注意：□代表如实施例2所述的在米曲酶中产生的。
＊代表如实施例4所述的在酵母中产生的。
得到下面的结果：
Figure G1996196233X19940529D001671
Figure G1996196233X19940529D001701
Figure G1996196233X19940529D001711
实施例8
利用在上述材料和方法部分所述的“第一洗涤效果检验分析”，使用一系列商业上的去垢剂检验一种第一洗涤脂解酶的第一洗涤活性。在洗涤前通过加热(微型炉中85℃，4分钟)将已经存在于去垢剂中的酶灭活。
使用如实施例2所述的在米曲酶中产生的Lipolase变体E1SPIRPRP+D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R。
使用下列不同地理条件：
欧洲：时间：20分钟
温度：30℃
水硬度：3.2mM Ca2./Mg2.(5∶1)~18°dH
美国：时间：10分钟
温度：30℃
水硬度：1.07mM Ca2./Mg2.(5∶1)～6°dH
实施例9
在禾本科镰孢中产生第一洗涤脂酶
菌株和培养基
起始菌株是禾本科镰孢(Fusarium graminearum)A3/5(ATCC 20334)。
COVE平板每升中含有343.3g蔗糖、20ml COVE盐溶液、10ml 1M乙酰胺、10ml 3MCsCl、25g Noble琼脂。COVE盐(50X)溶液由26gKCl、26g MgSO4-7H2O、76gKH2PO4、50ml的COVE微量金属溶液组成。COVE微量金属溶液每升含有0.04g的NaB4O7-10H2O、0.040g的CuSO4-5H2O、0.70g的FeSO4-H2O、0.80g的Na2MoO2-2H2O、10g的ZnSO4。
M400Da培养基每升含有50g的麦芽糖糊精、2.0g的MgSO4-7H2O、2.0g的KH2PO4、4.0g柠檬酸、8.0g酵母提取物、2.0g尿素、0.5ml微量金属溶液。用5N NaOH将培养基的pH调节到6.0。所说的微量金属溶液每升含有14.3g的ZnSO4-7H2O、2.5g CuSO4-5H2O、0.5g的NiCl2-6H2O、13.8g的FeSO4-7H2O、8.5g的MnSO4-H2O和3.0g的柠檬酸。
用于禾本科镰孢的H.lanuginosa脂解酶变体HLA(E1SPIRPRP+D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R)表达质粒的构建
图7概述了用于禾本科镰孢的表达质粒的构建。
具体地讲，使用重叠PCR技术(Higuchi.R.，In Innis，M.A..Gelfond，D.H.，Snisky.J.J.，和White.T.J.，编辑，PCR方案：方法和应用指南，p177-183，.学院出版社公司，纽约)通过将1.24kb的尖镰孢(Fusariumoxysporum)胰蛋白酶启动子融合到1.1kb尖镰孢胰蛋白酶终止子上(Royer等，1995生物/技术13：1479-1483)来产生镰孢菌属表达盒。将含有SwaI、KpnI和PacI限制性位点的多接头区作为重叠PCR反应的一部分插入到所说的启动子和终止子之间。在所说的启动子5’末端，加入XhoI位点，保护天然的EcoRI位点。在所说的终止子3’末端，通过PCR反应加入EcoRI，HindIII和NsiI位点。
使用下列引物由质粒pJRoy20(Royer等，1995，同上文)产生含有尖镰孢胰蛋白酶启动子的-1208至-1加25bp的多接头的PCR片段：
                      XhoI EcoRI    启动子的5’端
正向引物1：    5’-gagctcgagGAATTCTTACAAACCTTCAAC-3’
                      PacI KpnI  SwaI    启动子的3’端
反向引物2：    5’-
ttaattaaggtacctgaatttaaatGGTGAAGAGATAGATATCCAAG-3’
大写的字母为尖镰孢胰蛋白酶启动子的天然序列。
所用的PCR条件是95℃，3分钟；之后是25个循环(95℃，30秒；50℃，1分钟；72℃，1分钟)。最后的延伸循环是72℃，5分钟。以厂商提供的缓冲液使用Pwo DNA聚合酶(
Figure G1996196233X19940529D001761
Mannheim，Indianapolis，IN.)。
使用下列引物由质粒pJRoy20产生含有尖镰孢胰蛋白酶启动子的-5至-1、25bp的多接头和1060bp的尖镰孢胰蛋白酶基因的3’非翻译区(终止子区)的PCR片段：
                    启动子SwaI  KpnI PacI    终止子的5’端
正向引物3：    5’-TCACCatttaaattcaggtaccttaattaaATTCCTTGTTGGAAGCGTCGA-3’
                    NsiI HindIII EcoRI    终止子的3’端
反向引物4：    5’-tggtatgcataagcttgaattcAGGTAAACAAGATATAATTT-3’
大写的字母为尖镰孢胰蛋白酶启动子和终止子的天然序列。所用的PCR条件如上所述。
使用0.2μl的第一个PCR(启动子)反应和3μl的第二个(终止子)反应作为模板、引物1和4产生含有尖镰孢胰蛋白酶启动子的-1208至-1、25bp的多接头、1060bp的尖镰孢胰蛋白酶终止子的最终2.3kb重叠PCR片段。所用的PCR条件是95℃，3分钟；之后是30个循环(95℃，30秒；62℃，1分钟；72℃，3分钟)。最后的延伸循环是72℃，5分钟。在此反应中也使用了Pwo DNA聚合酶。
用XhoI和NsiI消化所得的2.3kb带，并将其克隆到NsiI部分消化、用SalI完成消化的质粒pBaNe6中。实际上，尖镰孢胰蛋白酶启动子和终止子序列代替了pBaNe6的曲霉属启动子和终止子序列。用SwaI和PacI消化所得的构建体(pDM174.3)。
将下列DNA引物HLIP-A和HLIP-B用于PCR反应以从质粒pJVi220扩增HLA脂酶基因：
HLIP-A(引物5)：5’-cccatttaaatATGAGGAGCTCCCTTGTGCTG-3’
HLIP-B(引物6)：5’-cccttaattaaCTAAAGACATGTCCCAATTAA-3’
大写字母代表脂酶基因序列。
在含有约.50ng pHLA、dATP，dTTP，dGTP，dCTP各0.05mM、HLIP-A和HLIP-B各100pmol、1X PwoI Buffer(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)、和2.5单位的PwoI(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)的50μl反应物中进行PCR。PCR条件是95℃，3分钟；之后是30个循环(95℃，1分钟；60℃，1分钟；72℃，1.5分钟)，然后是72℃，5分钟。将PCR混合物在琼脂糖凝胶上跑胶，并切下约0.9kbHLA DNA带。使用3倍体积的Qia-ex增溶缓冲液(Qiagen，洛杉矶，CA)通过琼脂糖的增溶作用，之后按照厂商的说明经Qiaquick PCR旋转柱(Qiagen，洛杉矶，CA)纯化所得的DNA。在50μl 1mM EDTA-10mMTris(pH 8)中回收所得的DNA。如厂商的建议在含有1X限制酶缓冲液和限制酶PacI和SwaI的最终体积为25μl的溶液中切割20μl的DNA等分试样。然后，将反应混合物加热到80℃(持续10分钟)。将1μl的PacI/SwaI切割的HLA脂酶基因连接到PacI/SwaI切割的质粒pBANe6中。使用所得的连接混合物转化大肠杆菌菌株DH5α。含有pBANe6和HLA序列的质粒命名为pJeRS33。
将pJeRS33的0.9kb的SwaI/PacI HLA片段克隆到SwaI/PacI消化的pDM174.3载体中以产生质粒pDM177。
禾本科镰孢的转化
在25℃下将禾本科镰孢菌株A3/5(ATCC 20334)在10×15mm陪替氏平皿上的Vogels培养基(Vogel，1964，美国自然杂志98：435-446)+1.5％葡萄糖和琼脂中培养3周。使用转移环将分生孢子(每平皿大约108)转移到10ml的无菌水中，经过4层的乳酪布过滤，最后再经过一层米拉布过滤将其纯化。通过离心浓缩分生孢子悬浮液。在50ml含有1％酵母提取物、2％细菌蛋白胨和2％葡萄糖的YPG培养基上接种大约100个分生孢子，在24℃、150rpm下培养14小时。将形成的菌丝收集到无菌的0.4mm滤器上，并用无菌蒸馏水和1.0M MgSO4连续洗涤。将所说的菌丝重悬浮在10ml的NOVOZYM 234TM(Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，丹麦)溶液(2-10mg/毫升，在1.0M MgSO4中)中，34℃下以80rpm振荡消化15-30分钟。经4层乳酪布和米拉布连续过滤从所得到的原生质体悬浮液中除去未消化的菌丝物质。将20ml 1M山梨醇通过乳酪布和米拉布，并与原生质体溶液合并。混合后，通过离心沉淀原生质体，通过在20ml的1M山梨醇和在20mlSTC(0.8M山梨醇、0.05M Tris(pH8.0)、0.05M CaCl2)中重悬浮和离心进行连续洗涤。将洗涤的原生质体以1-2×108/ml的浓度重悬浮在4份的STC和1份SPTC(0.8M山梨醇、40％PEG4000、0.05M Tris(pH8.0)、0.05MCaCl2)中。在聚丙烯管(17×100mm)中将100μl原生质体悬浮液加入到3μg pDM177DNA和5μl肝素(以5mg/ml的浓度溶解在STC中)中，并在冰上培养30分钟。将1ml SPTC温和地混合到原生质体悬浮液中，并在室温下继续温育20分钟。将15ml熔化的溶液(冷却到40℃，由COVE盐、0.8M蔗糖和1％低熔点的琼脂糖(Sigma化学公司，St.Louis，MO))和所说的原生质体混合，然后将其铺在150mm含有COVE琼脂的陪替氏平皿上。在室温下继续培养10至14天。
脂酶活性的表达
30℃下，将5个禾本科镰孢A3/5的pDM177转化体于摇瓶中M400Da培养基上培养7天。作为对照，同时将质粒pDM155的A3/5转化体(Royer等，1995生物/技术13：1479-1483)在同样的条件下培养，所说的转化体含有插入到尖镰孢胰蛋白酶启动子和终止子之间的野生型Humicola lanuginosa脂酶。
HL A的第一洗涤活性
使用酶灭活的Ariel Futur在本文描述的“第一洗涤效果检验分析”中检验上述产生的脂酶和类似脂酶(由米曲酶产生的携带相同的突变)。得到下列结果：
E1SPIRPRP+D57G+N94K+D96L+L97M           dR
+Q249R
                                1250 LU/1 12500 LU/1
米曲酶产生的                        8         15
禾本科镰孢产生的                    9         14
实施例10
反射犁头霉突变体的构建
材料和方法
菌株和质粒列于实施例前面的材料和方法部分。
引物：引物TiK57，引物TiK58，引物TiK59，引物TiK60，引物TiK 61，引物TiK62，引物TiK64，引物Tik66，引物TiK72，引物TiK74，引物Tik75，引物TiK76。
试剂盒、溶液、培养基和其它：
Taq-DNA聚合酶(Promega)
添加100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基
DNA Maxi-Prep试剂盒(QIAGEN)
聚乙二醇/LiOAc酵母转化试剂盒(Yeastmaker，Clontech)
酵母氮碱w/o氨基酸(Difco 0919-15-3)
酪蛋白氨基酸(Difco 0230-01-1)
细菌琼脂(Difco)
YPG-培养基(20g酪蛋白胨和10g酵母提取物(Difco))
添加100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基
仪器
应用生物系统373DNA测序仪
醋酸纤维素滤纸(Schleicher-Schüll)
SYC-平板
将13.6gNaOH和22.6g的丁二酸完全溶解在500ml H2O、15g酵母氮碱w/o氨基酸(Difco 0919-15-3)、10g酪蛋白氨基酸(Difco 0230-01-1)中。加入20ml 2％苏氨酸溶液和20ml 1％色氨酸溶液。用水将此溶液体积定容到1升。无菌过滤，并贮存在4℃。加入200ml 20％葡萄糖溶液和800ml水稀释1升的SYC，以便制备液体培养基。在60℃下用800ml细菌琼脂(37.5g细菌琼脂(Difco)溶解在1升水中)和200ml 20％葡萄糖溶液稀释1升SYC，以制备琼脂平板。
亮绿测定
为了制备BG-琼脂平板，将10g琼脂糖通过加热溶解在500ml 100mMTris-C1缓冲液(pH 9.0)中。将此琼脂糖溶液在60℃下与24ml橄榄油乳剂(将8ml橄榄油(Signa)和16ml 2％聚乙烯醇(Signa)水溶液混合，并在冰上用Ultra-Turrax T25彻底匀化)、10ml亮绿贮存物(4mg/ml水溶液)、含有6.45g所说的去垢剂的465ml 100mM Tris-Cl缓冲液(pH 9.0)、1.4ml 250mM CaCl2溶液混合。
30℃下，将转化的酵母菌落在SYC-琼脂平板的无菌醋酸纤维素滤纸(Schleicher-Schüll)上培养3天。然后将此滤纸转移到BG-琼脂平板上，37℃下培养2-8小时。在琼脂上产生绿点的菌落判定为阳性。
限制性酶分析和突变文库的测序
将回收的质粒DNA用NcoI消化。正确的克隆产生2.9和3.1kb两个片段。接下来将所得的质粒DNA进行染料终止子PCR循环测序或者在应用生物系统373DNA测序仪上进行测序。对于从文库3和4(表1)分离出来的克隆，寡核苷酸TiK61和TiK66用于双链测序，而对于从文库7中分离出来的克隆，使用TiK62和TiK72。
实施例10A
反射犁头霉ATTC 44896脂酶表达载体的构建
为了在酿酒酵母中表达野生型反射犁头霉ATTC 44896脂酶(有或没有SPIRR肽延伸)，构建两个载体。
使用引物对TiK57/59(提供N-末端SPIRR延伸)或者引物对TiK58/59(没有SPIRR延伸)对编码成熟反射犁头霉ATTC 44896脂酶的cDNA克隆(SEQ ID No.13和图1)进行PCR扩增(Ta＝50℃，25个循环，5个单位的Taq-DNA聚合酶)。经NheI/XbaI位点将此PCR片段连接到酵母表达载体pJSO37(在导入的信号肽下游带有NheI位点)，此酵母表达载体在原来的BamHI/XbaI克隆位点处含有编码活性H.lanuginosa脂酶的区。
通过在BamHI位点的下游导入NheI-位点稍微改变编码活性H.lanuginosa脂酶的基因(参见图2)。因为NheI和XbaI位点是相容的，所以在连接前用碱性磷酸酶处理此载体。最后，得到两个载体构建体，即恰好在所说的成熟脂酶基因起点上游包含SPIRR延伸的pTiK04和不包含SPIRR延伸编码部分的pTiK05。在这两种情况下，Humicola lanuginosa脂酶原来的信号序列在BamHI和NheI位点之间保持不变。
MFαl信号序列构建体
由交配因子α1信号代替H.lanuginosa脂酶信号序列。
根据标准方案(Ausubel等，(1995)，分子生物学现状，John Wiley和Sons)制备酵母菌株YPH499(Stratagene)的基因组DNA。使用引物对TiK74/75将1μg的基因组DNA进行PCR(Ta＝50℃，25个循环，5个单位的Taq-DNA聚合酶)。通过BamHI和NheI位点将扩增的MFα1信号序列片段(图3)分别插入到pTiK04和pTiK05中，产生pTiK06和pTiK07。
实施例10B
经带有掺入寡核苷酸的诱变构建反射犁头霉ATTC 44896脂酶变体
使用掺入的寡核苷酸构建4个文库。
在文库A和B(参见下文的表1)中，在反射犁头霉ATTC 44896脂酶推定的盖区导入随机突变。在文库A中SPIRR序列保持不变，在文库B中将其除去。
在反射犁头霉ATTC 44896的N-末端的两个推定的脂接触区中用突变构建文库C和D。在文库C中，SPIRR序列保持不变。
使用pTiK05作为模板、5个单位的Taq-DNA聚合酶、引物对TiK60/TiK64、通过标准的PCR(Ta＝50℃，25个循环)(Sambrook等，(1989)，分子克隆实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)对反射犁头霉ATTC 44896脂酶基因的推定的盖区(氨基酸位置82-99)进行诱变。在第二个标准PCR中，使用引物TiK62和在第一个PCR中产生的琼脂糖凝胶纯化的DNA片段及第一个PCR中所用的同样扩增条件恢复整个反射犁头霉ATTC 44896脂酶基因。和第一个PCR相比，选择pTiK04或pTiK05作为模板，这样就获得了文库(有或没有SPIRR N-末端延伸)。
为了诱变氨基酸30-45位，将引物TiK76和TiK64用于第一个PCR。第二个PCR原则上与上面描述的PCR相同。
经BamHI/Xbal位点将获得的PCR片段连接到pJSO37中。如上所述，转化大肠杆菌并随后转化感受态YNG318酵母细胞。
表1构建和筛选的反射犁头酶ATTC 44896突变体文库的概述
  号   备注和诱变区   大肠杆菌中的文库大小   筛选的酿酒酵母克隆数   Xg/l去垢剂时BG-分析中的阳性克隆数目   xg/l去垢剂时BG-分析中的阳性克隆数(第二轮)   限制性酶分析
  A   盖(82-99值)(.SPIRR)   8×10<sup>6</sup>   180000   3g/l时21个   3g/l时9个   6
  B   盖(82-99位)   7×10<sup>6</sup>   200000   6g/l时1个3g/l时5个   6g/l时0个3g/l时2个   2
  C   30-45位(.SPIRR)   1×10<sup>6</sup>   160000   3g/l时38个   3g/l时4个   3
  D   30-45值   6×10<sup>5</sup>   170000   3g/l时27个   3g/l时2个   1
实施例10C
筛选反射犁头霉ATTC 44896脂酶突变体文库并回收阳性克隆的质粒
将如实施例10B中描述所获得的转化的酵母细胞涂布在14cm SYC-琼脂平板的乙酸纤维素滤纸上。在转化体选择生长并转移到BG-琼脂平板上后，挑取阳性克隆，重悬浮在水中，并重新涂布在SYC-琼脂平板的乙酸纤维素滤纸上，以进行第二轮证实性的BG-分析(参见材料和方法部分)。将第二轮得到的阳性克隆转移到20ml SYC-培养基上，并且在30℃下于摇床上培养两天。按照标准的酚/玻璃珠方法(Ausubel等，(1995)，分子生物学现状，John Wiley和Sons)由1.5ml的这种饱和酵母培养物制备质粒DNA。
将一份所说的质粒制剂电穿孔到大肠杆菌DH10B细胞中，然后将这些细胞铺在填加有100μg/ml氨苄青霉素的LB-琼脂平板上。分离这些菌落的DNA，对其进行限制酶分析，并如上文的材料和方法部分的描述进行测序。测序
在文库A和B中15个随机挑取的克隆的测序表明：10％选择掺入的最后结果如下：
20％是野生型，
13％具有1个氨基酸的交换，
20％具有2个氨基酸的交换，
13％具有3个氨基酸的交换，
20％具有4个氨基酸的交换，
0％具有5个氨基酸的交换，
在每个分子上13％具有6个氨基酸的交换。
在BG-分析中，从文库A中以3g/l去垢剂筛选的1.8×105菌落中分离出6个克隆(每3×104中筛选出一个)，从文库B中筛选的2.0×105菌落中分离出2个阳性克隆(每1.0×105中筛选出一个，表1)。下表2描述了此8个克隆之间的明显序列差异。
如以上所述，对反射犁头霉ATTC 44896脂酶N-末端的两个推定的脂接触区中使用突变构建文库C和D。13个随机挑取的克隆的测序表明：
10％选择掺入水平的结果如下：
8％是野生型，
15％具有1个氨基酸的交换，
46％具有2个氨基酸的交换，
15％具有3个氨基酸的交换，
在每个分子上15％具有4个氨基酸的交换。
在BG-分析中，文库C中的以3g/l去垢剂筛选的1.6×105菌落中产生3个克隆(每53333中筛选出一个)，从文库D中筛选的1.7×105菌落中分离出1个阳性克隆(表1)。下表2也描述了此4个克隆的序列。
表2.改进的反射犁头霉ATTC 44896变体的序列
Figure G1996196233X19940529D001841
实施例10D
反射犁头霉ATTC 44896变体的表达和脂酶单位的测定
测量从文库A中鉴别的四个改进的突变体分泌到培养基中的LU，并测量粗制的胞质溶胶/膜级分的LU。
把10ml的YPG-培养基溶解在900ml水中，高压灭菌，然后加入100ml20％的葡萄糖溶液，在SYC-培养基中用1ml饱和的酵母培养物接种。在30℃下将培养物在摇床上培养2天。通过离心(5分钟×4000g)收获细胞，将上清液储存在冰中，以便用于LU测定。用NovozymTM 234处理细胞沉淀中的原生质球制剂并使用玻璃珠方法(Ausubel等，(1995)，分子生物学现状，John Wiley和Sons)裂解。为了使蛋白降解最小，将得到的也含有膜级分的粗制胞质溶胶级分立即进行LU测定(参见材料和方法部分)。
结果如表3所示。四个克隆在胞质溶胶/膜级分中显示出较弱的但是明显的LU值。此外，这四个克隆中，可以记录2个的微弱LU信号。如通过重复测定所确认，所有非0.0LU/ml的数据都表明明显的酶活性。
表3.分泌到培养基中的或由文库A的ATTC 44896变体的胞质溶胶级分中测量到的脂酶单位。
标准差是10％。
 样品   上清液中的脂酶单位(LU/ml)   胞质溶胶中的脂酶单位(LU/ml)
 YNG318(阴性对照)   0.0   0.0
 303   0.0   1.0
 309   0.0   0.5
 312   1.7   0.6
 321   0.6   1.0
实施例12
脂解酶的底物亲和性
已经研究出一种在碱性pH(pH9.0)和非离子表活性剂Dobanol 25-7(100ppm)存在下简单比较脂解酶在底物相(橄榄油，incl.FFA)上/中累积能力的方法(即测定底物的亲和性)。
方法：
1.在20ml可密封的瓶中制备两瓶(“样品”(s)和“对照”(r))相同的缓冲液(5ml)。
2.将酶加入到″样品″和″对照″中，并测定脂酶浓度(X LU/ml)。
3.在“样品”中加入橄榄油，并剧烈地振荡两种脂酶溶液。4℃下过夜温育。
4.在温育后测定水相中的残留的脂酶浓度(Yi LU/ml；i＝r，s)。
温育条件概述：
缓冲液：100mM甘氨酸(5ml)。
pH：9.0。
底物：橄榄油(5ml)。
Dobanol 25-7：100ppm。
T：4℃。
脂酶：5-10LU/ml。
温育：过夜(24-26小时)。
数据的评价：
通过比较与橄榄油接触的水相在温育后活性的损失和不含橄榄油的水相中活性的损失来计算实验后的结果：
α＝Ys/Yr(参见上文)
结果：
表11：
脂酶                                     α(％)
LipolaseTM                               95％
D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R                65％
SPIRPR+E1P+D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R     45％
SALRPRK+D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R        25％
SPIRPR+E1P+D137G+D167G+E210V+W221L       50％
将上述数据与实施例5-8中公开的洗涤数据进行比较清楚地表明，具有增加的第一洗涤性能的Lipolase变体与Lipolase比较通常具有增加的底物亲和力。
实施例13
Pseudomonas sp.脂酶(Liposam)的定域随机诱变
用于将所需要的突变导入以便产生上述脂酶的第一洗涤活性的合适的掺入方案可以包括在下列一个或多个区的全部或部分中定域随机诱变。“93％wt/7％随机”的意思是，在用于构建随机诱变文库的寡核苷酸中合成带有93％wt核苷酸和7％其它3种核苷酸的各个密码子。“90％wt/l0％随机”的意思与此相似。
在氨基酸区17-37中：
氨基酸位置17-18+20-24+26-29+32-37：93％wt/7％随机M19：掺入以便优先产生L，I，F
在氨基酸区109-161：
氨基酸位置109-118：93％wt/7％随机
氨基酸位置120+123-137+139-161：90％wt/10％随机
在氨基酸区208-239：
氨基酸位置208-212+214-215+217-231+233-239：90％wt/l0％随机
在氨基酸区253-271：
氨基酸位置253+255+259-268+270-271：90％wt/l0％随机
V258：90％wt/l0％随机但掺入的不是带正电的氨基酸。
可以如材料和方法部分及本文实施例1的描述进行定域随机诱变，所筛选的突变体对钙的依赖性降低和/或对去垢剂或去垢剂成分的耐性及第一洗涤活性增加。接下来，如果必要，可以对所得的突变体重复进行定域随机诱变和/或将所说的基因如本文所述进行基因改组。
参考文献
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Grochulski，P.等(1993)生物化学杂志268，p.12843。
序列表
(1)一般信息：
(i)申请人：
(A)名称：Novo Nordisk A/S
(B)街道：Novo Alle
(C)城市：Bagsvaerd
(E)国家：丹麦
(F)邮政编码(ZIP)：DK-2880
(G)电话：+4544448888
(H)传真：+4544493256
(ii)发明名称：新的脂解酶
(iii)序列数：100
(iv)(iv)计算机可读形式：
(A)介质类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容机
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：Patentln Release#1.0，#1.30B版(EPO)
(2)关于SEQ ID NO：1的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：21个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“引物3”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：
AGAAATCGGG TATCCTTTCA G                                21
(2)关于SEQ ID NO：2的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“引物7258”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：
gaatgacttg  gttgacgcgt  caccagtcac                            30
(2)关于SEQ ID NO：3的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：26个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“引物7770”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：
tctagcccag  aatactggat  caaatc                                26
(2)关于SEQ ID NO：4的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：53个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“randon 1”
(B)
瓶5：93％A；2.33％C；2.33％G and 2.33％T
瓶6：93％C；2.33％A；2.33％G and 2.33％T
瓶7：93％G；2.33％A；2.33％C and 2.33％T
瓶8：93％T；2.33％A；2.33％C and 2.33％G
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：
5′    5    C    G
T      5    C    3′
T      7.   A
A      8    G
T      8    T
T      A/C  T
T      5    C
C      7    T
T      5    C
T      8    T
T      8    A
6      C/G  T
5      6    G
5      6    G
7      G    A
8      AA   A
6      T    C
7
(2)关于SEQ ID NO：5的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：93个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“Oligo 2”
瓶5：80％A；6,66％C；6,66％G og 6,66％T.
瓶6：80％C；6,66％A；6,66％G og 6,66％T.
瓶7：80％G；6,66％A；6,66％C og 6,66％T.
瓶8：80％T；6,66％A；6,66％C og 6,66％G.
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：
GTCTCTGCGT GGACGGCCTT GGCGGCGCCA CCTCCA67(T/A)
66(T/A)57566(T/A)67(T/A)66(T/A)57566(T/A)(6/7)(7/8)(C/G)
57(C/G)C57(5/7)5(C/G)CTGT TTAACCAGTT CAATCTC    93
(2)关于SEQ ID NO：6的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：64个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“Oligo lid2”
瓶5：93％A；2,33％C；2,33％G og 2,33％T.
瓶6：93％C；2,33％A；2,33％G og 2,33％T.
瓶7：93％G；2,33％A；2,33％C og 2,33％T.
瓶8：93％T；2,33％A；2,33％C og 2,33％G.
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：
CATTTAT886888655(C/G)(A/C/G/T)(A/C/G/T)755(C/G)88(A/C)5758
8(C/G)76(7/8)58665788688(8/7)58775ACGAG(A/T)GC CACG  64
2)关于SEQ ID NO：7的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：105个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“引物4”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：
GCTCCTCATG GTGGATCCCC AGTTGTGTAT ATAGAGGATT
GAGGAAGGAA GAGAAGTGTG GATAGAGGTA AATTGAGTTG
GAAACTCCAA GCATGGCATC CTTGC                                    105
(2)关于SEQ ID NO：8的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：54个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“引物8479”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：
GCGTGGACGG CCTTGGCTAG CCCTATTCGT CCTCGACCGG TCTCGCAGGA TCTG    54
(2)关于SEQ ID NO：9的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“引物7887”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：
GAATGACTTG GTTGAGTACT CACCAGTCAC                            30
(2)关于SEQ ID NO：10的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：46个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“引物8932”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：
GAACTGGATA GGAAATTTGA AGTTCCTGTT GAAA AAATA AATGAC          46
(2)关于SEQ ID NO：11的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：57个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“Oligo 1”
瓶5：80％A；6.66％C；6.66％G og 6.66％T.
瓶6：80％C；6.66％A；6.66％G og 6.66％T.
瓶7：80％G；6.66％A；6.66％C og 6.66％T.
瓶8：80％T；6.66％A；6.66％C og 6.66％G.
(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：
GCGTGGACGG CCTTGGCC86(T/A)66(A/T)58(T/A)67(T/A)66(T/A)
57566(T/A)GAGGTC TCG CAGGATC TG                                57
(2)关于SEQ ID NO：12的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：18个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“引物2056”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：
GCACGTAATG TTTGTACC                                            18
(2)关于SEQ ID NO：13的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：18个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“引物4699”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：
CGGTACCCGG GGATCCAC                                            18
(2)关于SEQ ID NO：14的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“正向引物1”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：
GAGCTCGAGG AATTCTTACA AACCTTCAAC                            30
(2)关于SEQ ID NO：15的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：47个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“反向引物2”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：
TTAATTAAGG TACCTGAATT TAAATGGTGA AGAGATAGAT ATCCAAG         47
(2)关于SEQ ID NO：16的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：51个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“正向引物3”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：
TCACCATTTA AATTCAGGTA CCTTAATTAA ATTCCTTGTT GGAAGCGTCG A    51
(2)关于SEQ ID NO：17的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：42个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“反向引物4”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：
TGGTATGCAT AAGCTTGAAT TCAGGTAAAC AAGATATAAT TT                     42
(2)关于SEQ ID NO：18的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：32个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“HLIP-A引物5”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：
CCCATTTAAA TATGAGGAGC TCCCTTGTGC TG                                32
(2)关于SEQ ID NO：19的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：32个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“HLIP-B引物6”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：
CCCTTAATTA ACTAAAGACA TGTCCCAATT AA                                32
(2)关于SEQ ID NO：20的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：6个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：
Arg-Pro-Val-Ser-Gln-Asp                                            6
                  5
(2)关于SEQ ID NO：21的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：5个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：
Ser-Pro-Ile-Arg-Met                                                5
                5
(2)关于SEQ ID NO：22的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：6个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：
Ser-Pro-Ile-Arg-Ala-Arg                                           6
                  5
(2)关于SEQ ID NO：23的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：6个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：
Ser-Pro-Ile-Arg-Pro-Arg                                           6
                 5
(2)关于SEQ ID NO：24的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：6个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：
Ser-Pro-Ile-Arg-Glu-Arg                                           6
                  5
(2)关于SEQ ID NO：25的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：5个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：
Ser-Pro-Ile-Arg-Lys                                               5
                5
(2)关于SEQ ID NO：26的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：5个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：26：
Ser-Pro-Ile-Lys-Lys                                               5
                 5
(2)关于SEQ ID NO：27的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：6个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：27：
Ser-Pro-Ile-Arg-Arg-Pro                                           6
                 5
(2)关于SEQ ID NO：28的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：5个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：28：
Ser-Pro-Pro-Arg-Arg                                              5
                  5
(2)关于SEQ ID NO：29的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：5个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：29：
Ser-Pro-Iso-Pro-Arg                                              5
                 5
(2)关于SEQ ID NO：30的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：5个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：30：
Ser-Pro-Arg-Pro-Arg                                              5
                5
(2)关于SEQ ID NO：31的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：4个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：31：
Ser-Pro-Ile-Arg                                                  4
(2)关于SEQ ID NO：32的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：5个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：32：
Ser-Pro-Ile-Arg-Arg                                              5
                 5
(2)关于SEQ ID NO：33的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：4个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：33：
Ser-Cys-Ile-Arg-Arg                                              5
                 5
(2)关于SEQ ID NO：34的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：7个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：34：
Ser-Pro-Ile-Arg-Pro-Arg-Pro                                  7
                 5
(2)关于SEQ ID NO：35的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：7个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：35：
Ser-Cys-Ile-Arg-Pro-Arg-Pro                                  7
                 5
(2)SEQ ID NO：36的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：7个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：36：
Ser-Pro-Arg-Arg-Pro-Arg-Thr                                  7
                 5
(2)关于SEQ ID NO：37的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：7个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：37：
Ser-Pro-Phe-Arg-Pro-Lys-Leu                                  7
                 5
(2)关于SEQ ID NO：38的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：6个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：38：
Ser-Pro-Pro-Arg-Arg-Pro                                      6
                 5
(2)关于SEQ ID NO：39的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：6个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：39：
Ser-Pro-Ile-Arg-Arg-Glu                                      6
                 5
(2)关于SEQ ID NO：40的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：6个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：40：
Ser-Pro-Pro-Arg-Pro-Pro                                        6
                 5
2)关于SEQ ID NO：41的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：6个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：41：
Ser-Pro-Pro-Arg-Pro-Arg                                        6
                 5
(2)关于SEQ ID NO：42的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：6个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：42：
Ser-Pro-Pro-Trp-Trp-Pro                                        6
                 5
(2)关于SEQ ID NO：43的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：6个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：43：
Ser-Pro-Pro-Trp-Arg-Pro                                     6
                 5
(2)关于SEQ ID NO：44的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：6个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：44：
Ser-Pro-Pro-Arg-Trp-Pro                                     6
                 5
(2)关于SEQ ID NO：45的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：6个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：45：
Ser-Pro-Pro-Arg-Trp-Pro                                    6
                 5
(2)关于SEQ ID NO：46的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：6个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：46：
Ser-His-Trp-Arg-Arg-Trp                                        6
                  5
(2)关于SEQ ID NO：47的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：5个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：47：
Ser-His-Trp-Arg-Lys                                            5
                 5
(2)关于SEQ ID NO：48的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：5个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：48：
Ser-His-Trp-Arg-Arg                                           5
                 5
(2)关于SEQ ID NO：49的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：7个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：49：
Thr-Ala-Ile-Arg-Pro-Arg-Lys                                    7
                 5
(2)关于SEQ ID NO：50的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：7个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：50：
Ser-Thr-Arg-Arg-Pro-Arg-Pro                                     7
                 5
(2)关于SEQ ID NO：51的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：7个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：51：
Gly-Pro-Ile-Arg-Pro-Arg-Pro                                     7
                 5
(2)关于SEQ ID NO：52的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：7个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：52：
Leu-Pro-Phe-Arg-Glu-Arg-Pro                                    7
                 5
(2)关于SEQ ID NO：53的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：7个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：53：
Ser-Arg-Ser-Arg-His-Asp-Ala                                    7
                 5
(2)关于SEQ ID NO：54的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：7个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：54：
Ile-Pro-Ile-Arg-Pro-Arg-Arg                                    7
                5
(2)关于SEQ ID NO：55的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：7个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：55：
Ser-Thr-Arg-Arg-Pro-Arg-Pro                                  7
                 5
(2)关于SEQ ID NO：56的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：7个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：56：
Thr-Ala-Ile-Arg-Pro-Arg-Lys                                  7
                 5
(2)关于SEQ ID NO：57的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：6个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：57：
Trp-Arg-Trp-Arg-Trp-Arg                                     6
                 5
(2)关于SEQ ID NO：58的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：5个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：58：
Glu-Pro-Ile-Arg-Arg                                              5
                 5
(2)关于SEQ ID NO：59的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：5个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：59：
Ser-His-Trp-Glu-Glu                                              5
                 5
(2)关于SEQ ID NO：60的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：8个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：60：
Arg-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro                                  8
                 5
(2)关于SEQ ID NO：61的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：11个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：61：
Ser-Ser-Thr-Arg-Arg-Ala-Ser-Pro-Ile-Lys-Lys                    11
                 5                   10
(2)SEQ ID NO：62的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：11个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：62：
Ala-Trp-Trp-Pro-Ser-Pro-Ile-Arg-Pro-Arg-Pro                    11
                 5                   10
(2)关于SEQ ID NO：63的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：12个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：63：
Ala-Pro-Pro-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro                12
                 5                   10
(2)关于SEQ ID NO：64的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：12个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：64：
Ala-Pro-Pro-Pro-Arg-Thr-Arg-Pro-Arg-Pro-Arg-Ser              12
                 5                   10
(2)关于SEQ ID NO：65的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：8个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：65：
Ser-Pro-Lys-Arg-Lys-Pro-Arg-Pro                               8
                 5
(2)关于SEQ ID NO：66的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：9个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：66：
Ser-Gln-Arg-Ile-Lys-Gln-Arg-Ile-Lys                           9
                 5
(2)关于SEQ ID NO：67的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：8个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：67：
Ser-Pro-Pro-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro                               8
                 5
(2)关于SEQ ID NO：68的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：10个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：68：
Ser-Pro-Ile-Arg-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro-Arg                       10
                 5                   10
(2)关于SEQ ID NO：69的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：9个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：69：
Ser-Pro-Ile-Arg-Lys-Ala-Trp-Trp-Pro                           9
                 5
(2)关于SEQ ID NO：70的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：12个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：70：
Ala-Pro-Pro-Pro-Lys-Ala-Ser-Pro-Arg-Gln-Arg-Pro                12
                 5                  10
(2)关于SEQ ID NO：71的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：71：
Ser-Pro-Ile-Arg-Pro-Arg-Pro-Ser-Pro-Ile-Arg-Pro-Arg-Pro-Arg    15
                5                   10                  15
(2)SEQ ID NO：72信息：
(i)序列特征：
(A)长度：8个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：72：
Ser-Pro-Pro-Arg-Trp-Pro-Arg-Arg                                8
                 5
(2)关于SEQ ID NO：73的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：8个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：73：
Ser-Pro-Pro-Arg-Trp-Pro-Arg-Trp                                8
                 5
(2)关于SEQ ID NO：74的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：8个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：74：
Ser-Pro-Pro-Arg-Trp-Pro-Trp-Arg                                8
                 5
(2)关于SEQ ID NO：75的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：8个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：75：
Ser-Pro-Pro-Trp-Arg-Pro-Arg-Arg                                8
                 5
(2)关于SEQ ID NO：76的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：8个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：76：
Ser-Pro-Pro-Trp-Trp-Pro-Arg-Trp                                8
                 5
(2)关于SEQ ID NO：77的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：8个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：77：
Ser-Pro-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg                                8
                 5
(2)关于SEQ ID NO：78的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：8个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：78：
Ser-Pro-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Trp                                8
                 5
(2)关于SEQ ID NO：79的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：8个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：79：
Ser-Pro-Pro-Trp-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro                                 8
                    5
(2)关于SEQ ID NO：80的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：7个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽添加
(xi)序列描述：SEQ ID NO：80：
Ser-Ser-Lys-Gln-Asp-Tyr-Arg                                         7
                 5
(2)SEQ ID NO：81的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：42个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“引物TiK 57”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：81：
CTTGGCTAGC CCTATACGTA GATCATCCAC ACAAGATTAT CG                     42
(2)关于SEQ ID NO：82的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：32个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“引物TiK 58”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：82：
CTTGGCTAGC TCCACACAAG ATTATCGTAT TG                       32
(2)关于SEQ ID NO：83的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：32个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“引物TiK 59”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：83：
GCCCTCTAGA CTATAAACAG AGACCAGTGT TC                       32
(2)关于SEQ ID NO：84的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：83个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“引物TiK 60”
(B)5：90％A与C、G、T每种3.33％.
6：90％C与A、G、T每种3.33％.
7：90％G与A、C、T每种3.33％.
8：90％T与A、C、G每种3.33％.
(xi)序列描述：SEQ ID NO：84：
GTAGTTTTTC GTGGT5CA57(C/G)TCA58(5/8)67(C/G)
556(7/8)(6/7)(C/G)58(5/8)76(T/G)75658(5/8)78
(T/G)88878(T/G)66(G/C)78(C/G)55885TC CACCTGTTAA TGG    83
(2)关于SEQ ID NO：85的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：17个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“引物TiK 61”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：85：
AGAACAGCTG TTGCACC                                     17
(2)关于SEQ ID NO：86的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：19个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“引物TiK 62”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：86：
CCGGGGA TCCACCATG                                        19
(2)关于SEQ ID NO：87的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：20个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“引物TiK 64”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：87：
GCCCTCTAGA CTATAAACAG                                    20
(2)关于SEQ ID NO：88的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：17个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“引物TiK 66”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：88：
CTGCAGAACT  GTCATTC                                     17
(2)关于SEQ ID NO：89的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：16个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“引物TiK 72”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：89：
TTGAGCTTGT ACCACG                                               16
(2)关于SEQ ID NO：90的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：36个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“引物TiK 74”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：90：
CCGGGGATCC ACCATGAGAT TTCCTTCTAT TTTTAC                         36
(2)关于SEQ ID NO：91的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：31个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“引物TiK 75”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：91：
TGGAGCTAGC TCTTTTATCC AAAGAAACAC C                       31
(2)关于SEQ ID NO：92的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：85个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“引物TiK 76”
(B)5：90％G与C、G、T每种3.33％.
6：90％A与A、G、T每种3.33％.
7：90％T与A、C、T每种3.33％.
8：90％C与A、C、G每种3.33％.
(xi)序列描述：SEQ ID NO：92：
CAGCCAATGC ATACTGC655 6885776778 8755755765
575565875T 88786775T5 57577GCATC CAATTTGCAA
ATTAC                                                    85
(2)SEQ ID NO：93的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：1115个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(vi)原始来源：
(B)菌株：反射犁头霉ATTC 44896
(xi)序列描述：SEQ ID NO：93：
AAAGGCATTC TCATTTTGTA GTCTTATTGC TAGCAGTATT CATCTGCATG TGCTCTGTAT    60
CGGGTGTGCC ACTGCAAATT GATCCACGCG ATGACAAGAG CTATGTTCCT GAACAATATC    120
CTTTGAAGGT GAATGGTCCT TTGCCAGAAG GTGTAAGCGT GATCCAAGGC TATTGTGAAA    180
ACTGTACCAT GTATCCTGAA AAAAATAGTG TATCGGCATT CTCGTCATCA TCCACACAAG    240
ATTATCGTAT TGCAAGCGAG GCAGAGATTA AGGCACACAC ATTTTACACA GCATTGTCAG    300
CCAATGCATA CTGCAGAACT GTCATTCCTG GTGGTCGATG GAGCTGTCCC CACTGTGGTG    360
TTGCATCCAA TTTGCAAATT ACCAAGACTT TCAGCACCTT AATCACTGAT ACTAATGTCT    420
TGGTGGCTGT TGGCGAAAAG GAGAAGACCA TCTATGTAGT TTTTCGTGGT ACAAGCTCAA    480
TTCGCAACGC CATTGCTGAC ATTGTTTTTG TACCAGTGAA TTATCCACCT GTTAATGGAG    540
CCAAAGTACA CAAAGGATTT CTTGATAGCT ATAACGAAGT CCAGGATAAA CTTGTTGCTG    600
AAGTCAAGGC ACAACTTGAT CGTCATCCAG GATACAAGAT CGTCGTCACT GGACATTCCT    660
TGGGAGGTGC AACAGCTGTT CTCAGTGCAC TTGACCTTTA TCACCATGGC CATGCCAATA    720
TCGAAATCTA TACTCAAGGT CAGCCACGTA TAGGTACTCC AGCATTTGCA AACTATGTGA    780
TAGGCACCAA GATTCCATAC CAACGTCTTG TCCATGAGCG TGACATTGTT CCTCACCTTC    840
CACCTGGTGC ATTTGGTTTC TTGCATGCTG GTGAAGAGTT TTGGATCATG AAAGATAGCT    900
CGTTGCGCGT ATGTCCAAAT GGCATTGAAA CTGACAACTG CAGCAACTCC ATTGTTCCCT    960
TCACTAGTGT CATTGACCAT TTAAGCTATC TTGACATGAA CACTGGTCTC TGTTTATAAT    1020
CTTTAGTATC ATCCACTCCT CCTCTTTAAT GCAATACTTT TTAAGATAAA TCACAAGTAT    1080
ACTTTGTACA AAACCAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA                               1115
(2)关于SEQ ID NO：94的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：1020个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：环型
(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“酵母表达载体pTik05”
(ix)特征：
(A)名称/关键词：CDS
(B)位置：3..1020
(xi)序列描述：SEQ ID NO：94：
CA CAT ACA GGA ATT CAT TCA AGA ATA GTT CAA ACA AGA AGA TTA CAA     47
   His Thr Gly Ile His Ser Arg Ile Val Gln Thr Arg Arg Leu Gln
     1               5                  10                  15
ACT ATC AAT TTC ATA CAC AAT ATA AAC GAC GGT ACC CGG GGA TCC ACC    95
Thr Ile Asn Phe Ile His Asn Ile Asn Asp Gly Thr Arg Gly Ser Thr
                 20                  25                  30
ATG AGG AGC TCC CTT GTG CTG TTC TTT GTC TCT GCG TGG ACG GCC TTG    143
Met Arg Ser Ser Leu Val Leu Phe Phe Val Ser Ala Trp Thr Ala Leu
             35                  40                  45
GCT AGC TCC ACA CAA GAT TAT CGT ATT GCA AGC GAG GCA GAG ATT AAG    191
Ala Ser Ser Thr Gln Asp Tyr Arg Ile Ala Ser Glu Ala Glu Ile Lys
         50                  55                  60
GCA CAC ACA TTT TAC ACA GCA TTG TCA GCC AAT GCA TAC TGC AGA ACT    239
Ala His Thr Phe Tyr Thr Ala Leu Ser Ala Asn Ala Tyr Cys Arg Thr
     65                  70                  75
GTC ATT CCT GGT GGT CGA TGG AGC TGT CCC CAC TGT GGT GTT GCA TCC    287
Val Ile Pro Gly Gly Arg Trp Ser Cys Pro His Cys Gly Val Ala Ser
 80                  85                  90                  95
AAT TTG CAA ATT ACC AAG ACT TTC AGC ACC TTA ATC ACT GAT ACT AAT    335
Asn Leu Gln Ile Thr Lys Thr Phe Ser Thr Leu Ile Thr Asp Thr Asn
                100                 105                 110
GTC TTG GTG GCT GTT GGC GAA AAG GTT GTT TTT GTA CCA GTG AAT TAT    383
Val Leu Val Ala Val Gly Glu Lys Val Val Phe Val Pro Val Asn Tyr
            115                 120                 125
CCA CCT GTT AAT GGA GCC AAA GTA CAC AAA GGA TTT CTT GAT AGC TAT    431
Pro Pro Val Asn Gly Ala Lys Val His Lys Gly Phe Leu Asp Ser Tyr
        130                 135                 140
AAC GAA GTC CAG GAT AAA CTT GTT GCT GAA GTC AAG GCA CAA CTT GAT    479
Asn Glu Val Gln Asp Lys Leu Val Ala Glu Val Lys Ala Gln Leu Asp
    145                 150                 155
CGT CAT CCA GGA TAC AAG ATC GTC GTC ACT GGA CAT TCC TTG GGA GGT    527
Arg His Pro Gly Tyr Lys Ile Val Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly
160                 165                 170                 175
GCA ACA GCT GTT CTC AGT GCA CTT GAC CTT TAT CAC CAT GGC CAT GCC    575
Ala Thr Ala Val Leu Ser Ala Leu Asp Leu Tyr His His Gly His Ala
                180                 185                 190
AAT ATC GAA ATC TAT ACT CAA GGT CAG CCA CGT ATA GGT ACT CCA GCA    623
Asn Ile Glu Ile Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg Ile Gly Thr Pro Ala
            195                 200                 205
TTT GCA AAC TAT GTG ATT GGC ACC AAG ATT CCA TAC CAA CGT CTT GTC    671
Phe Ala Asn Tyr Val Ile Gly Thr Lys Ile Pro Tyr Gln Arg Leu Val
        210                 215                 220
CAT GAG CGT GAC ATT GTT CCT CAC CTT CCA CCT GGT GCA TTT GGT TTC    719
His Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu Pro Pro Gly Ala Phe Gly Phe
    225                 230                 235
TTG CAT GCT GGT GAA GAG TTT TGG ATC ATG AAA GAT AGC TCG TTG CGC    767
Leu His Ala Gly Glu Glu Phe Trp Ile Met Lys Asp Ser Ser Leu Arg
240                 245                 250                 255
GTA TGT CCA AAT GGC ATT GAA ACT GAC AAC TGC AGC AAC TCC ATT GTT    815
Val Cys Pro Asn Gly Ile Glu Thr Asp Asn Cys Ser Asn Ser Ile Val
                260                 265                 270
CCC TTC ACT AGT GTC ATT GAC CAT TTA AGC TAT CTT GAC ATG AAC ACT    863
Pro Phe Thr Ser Val Ile Asp His Leu Ser Tyr Leu Asp Met Asn Thr
            275                 280                 285
GGT CTC TGT TTA TAG TCT AGA GGG CCG CAT GAT GTA ATT AGT TAT GTC    911
Gly Leu Cys Leu  ＊ Ser Arg Gly Pro His Asp Val Ile Ser Tyr Val
        290                 295                 300
ACG CTT ACA TTC ACG CCC TCC CCC CAC ATC CGC TCT AAC CGA AAA GGA    959
Thr Leu Thr Phe Thr Pro Ser Pro His Ile Arg Ser Asn Arg Lys Gly
    305                 310                 315
AGG AGT TAG ACA ACC TGA AGT CTA GGT CCC TAT TTA TTT TTT TAT AGT    1007
Arg Ser  ＊ Thr Thr  ＊ Ser Leu Gly Pro Tyr Leu Phe Phe Tyr Ser
320                 325                 330                 335
TAT GTT AGT ATT  A                                                 1020
Tyr Val Ser Ile
(2)关于SEQ ID NO：95的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：339个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：95：
His Thr Gly Ile His Ser Arg Ile Val Gln Thr Arg Arg Leu Gln Thr
  1               5                  10                  15
Ile Asn Phe Ile His Asn Ile Asn Asp Gly Thr Arg Gly Ser Thr Met
             20                  25                  30
Arg Ser Ser Leu Val Leu Phe Phe Val Ser Ala Trp Thr Ala Leu Ala
         35                  40                  45
Ser Ser Thr Gln Asp Tyr Arg Ile Ala Ser Glu Ala Glu Ile Lys Ala
     50                  55                  60
His Thr Phe Tyr Thr Ala Leu Ser Ala Asn Ala Tyr Cys Arg Thr Val
 65                  70                  75                  80
Ile Pro Gly Gly Arg Trp Ser Cys Pro His Cys Gly Val Ala Ser Asn
                 85                  90                  95
Leu Gln Ile Thr Lys Thr Phe Ser Thr Leu Ile Thr Asp Thr Asn Val
            100                 105                 110
Leu Val Ala Val Gly Glu Lys Val Val Phe Val Pro Val Asn Tyr Pro
        115                 120                 125
Pro Val Asn Gly Ala Lys Val His Lys Gly Phe Leu Asp Ser Tyr Asn
    130                 135                 140
Glu Val Gln Asp Lys Leu Val Ala Glu Val Lys Ala Gln Leu Asp Arg
145                 150                 155                 160
His Pro Gly Tyr Lys Ile Val Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala
                165                 170                 175
Thr Ala Val Leu Ser Ala Leu Asp Leu Tyr His His Gly His Ala Asn
            180                 185                 190
Ile Glu Ile Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg Ile Gly Thr Pro Ala Phe
        195                 200                 205
Ala Asn Tyr Val Ile Gly Thr Lys Ile Pro Tyr Gln Arg Leu Val His
    210                 215                 220
Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu Pro Pro Gly Ala Phe Gly Phe Leu
225                 230                 235                 240
His Ala Gly Glu Glu Phe Trp Ile Met Lys Asp Ser Ser Leu Arg Val
                245                 250                 255
Cys Pro Asn Gly Ile Glu Thr Asp Asn Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro
            260                 265                 270
Phe Thr Ser Val Ile Asp His Leu Ser Tyr Leu Asp Met Asn Thr Gly
        275                 280                 285
Leu Cys Leu  ＊ Ser Arg Gly Pro His Asp Val Ile Ser Tyr Val Thr
    290                 295                 300
Leu Thr Phe Thr Pro Ser Pro His Ile Arg Ser Asn Arg Lys Gly Arg
305                 310                 315                 320
Ser  ＊ Thr Thr  ＊ Ser Leu Gly Pro Tyr Leu Phe Phe Tyr Ser Tyr
                325                 330                 335
Val Ser Ile
(2)关于SEQ ID NO：96的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：255个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(vi)原始来源：
(A)有机体：MFαl信号序列(交配因子)
(B)菌株：酵母菌株YPH499
(ix)特征：
(A)名称/关键词：信号肽
(B)位置：1..255
(ix)特征：
(A)名称/关键词：CDS
(B)位置：1..255
(xi)序列描述：SEQ ID NO：96：
ATG AGA TTT CCT TCT ATT TTT ACT GCT GTT TTA TTC GCT GCT TCC TCC          48
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
  1               5                  10                  15
GCT TTA GCT GCT CCA GTC AAC ACT ACC ACT GAA GAT GAA ACG GCT CAA          96
Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln
             20                  25                  30
ATT CCA GCT GAA GCT GTC ATC GGT TAC CTT GAT TTA GAA GGT GAT TTC          144
Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Leu Asp Leu Glu Gly Asp Phe
         35                  40                  45
GAT GTT GCT GTT TTG CCA TTT TCC AAC TCC ACC AAT AAC GGT TTA TTG          192
Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu
     50                  55                  60
TTT ATC AAT ACT ACT ATT GCC TCC ATT GCT GCT AAA GAA GAA GGT GTT          240
Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val
 65                  70                  75                  80
TCT TTG GAT AAA AGA                                                      255
Ser Leu Asp Lys Arg
                 85
(2)关于SEQ ID NO：97的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：85个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：97：
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
  1               5                  10                  15
Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln
             20                  25                  30
Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Leu Asp Leu Glu Gly Asp Phe
         35                  40                  45
Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu
     50                  55                  60
Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val
 65                  70                  75                  80
Ser Leu Asp Lys Arg
                 85
(2)关于SEQ ID NO：98的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：98：
MRFYSVVSLLAVSICTYGVSGVPVQIGPRDKSYVPEQ YPLKMNGPLPEGVSVIQGYCENCTMYPEENS-
VTALSSSKQDYRTASETEIQAHTFYTALSANAYCRNVIPGGRWSCPHCDVTSNLKITKTFSTLITDTNVAVAV
GEKEKTIYIVFRGTNSIRNAIADIVFVPVDYPPVDGAKVHKGFLDSYNEVQDQLVAEVKKQLDNHPGYKIVVA
GHSLGGATAVLCALDLYHHGHHNIEIYTQGQPRVGTPAFAKYVIGTKIPYQRLVNERDIVPHLPPGAFGFLHA
GEEFWIMKDSSLRVCPNGIETDDCSNSIVPFTSVIDHLSYLDMNTGLCL＊
(2)关于SEQ ID NO：99的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：864个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(vi)原始来源：
(B)菌株：Pseudomonas sp.
(ix)特征：
(A)名称/关键词：mat_肽
(B)位置：1..864
(ix)特征：
(A)名称/关键词：CDS
(B)位置：1..864
(xi)序列描述：SEQ ID NO：99：
TTC GGC TCC TCG AAC TAC ACC AAG ACC CAG TAC CCG ATC GTC CTG ACC    48
Phe Gly Ser Ser Asn Tyr Thr Lys Thr Gln Tyr Pro Ile Val Leu Thr
  1               5                  10                  15
CAC GGC ATG CTC GGT TTC GAC AGC CTG CTT GGA GTC GAC TAC TGG TAC    96
His Gly Met Leu Gly Phe Asp Ser Leu Leu Gly Val Asp Tyr Trp Tyr
             20                  25                  30
GGC ATT CCC TCA GCC CTG CGT AAA GAC GGC GCC ACC GTC TAC GTC ACC    144
Gly Ile Pro Ser Ala Leu Arg Lys Asp Gly Ala Thr Val Tyr Val Thr
         35                  40                  45
GAA GTC AGC CAG CTC GAC ACC TCC GAA GCC CGA GGT GAG CAA CTG CTG    192
Glu Val Ser Gln Leu Asp Thr Ser Glu Ala Arg Gly Glu Gln Leu Leu
     50                  55                  60
ACC CAA GTC GAG GAA ATC GTG GCC ATC AGC GGC AAG CCC AAG GTC AAC    240
Thr Gln Val Glu Glu Ile Val Ala Ile Ser Gly Lys Pro Lys Val Asn
 65                  70                  75                  80
CTG TTC GGC CAC AGC CAT GGC GGG CCT ACC ATC CGC TAC GTT GCC GCC    288
Leu Phe Gly His Ser His Gly Gly Pro Thr Ile Arg Tyr Val Ala Ala
                 85                  90                  95
GTG CGC CCG GAT CTG GTC GCC TCG GTC ACC AGC ATT GGC GCG CCG CAC    336
Val Arg Pro Asp Leu Val Ala Ser Val Thr Ser Ile Gly Ala Pro His
            100                 105                 110
AAG GGT TCG GCC ACC GCC GAC TTC ATC CGC CAG GTG CCG GAA GGA TCG    384
Lys Gly Ser Ala Thr Ala Asp Phe Ile Arg Gln Val Pro Glu Gly Ser
        115                 120                 125
GCC AGC GAA GCG ATT CTG GCC GGG ATC GTC AAT GGT CTG GGT GCG CTG    432
Ala Ser Glu Ala Ile Leu Ala Gly Ile Val Asn Gly Leu Gly Ala Leu
    130                 135                 140
ATC AAC TTC CTT TCC GGC AGC AGT TCG GAC ACC CCA CAG AAC TCG CTG    480
Ile Asn Phe Leu Ser Gly Ser Ser Ser Asp Thr Pro Gln Asn Ser Leu
145                 150                 155                 160
GGC ACG CTG GAG TCA CTG AAC TCC GAA GGC GCC GCA CGG TTT AAC GCC    528
Gly Thr Leu Glu Ser Leu Asn Ser Glu Gly Ala Ala Arg Phe Asn Ala
                165                 170                 175
CGC TTC CCC CAG GGG GTA CCA ACC AGC GCC TGC GGC GAG GGC GAT TAC    576
Arg Phe Pro Gln Gly Val Pro Thr Ser Ala Cys Gly Glu Gly Asp Tyr
            180                 185                 190
GTG GTC AAT GGC GTG CGC TAT TAC TCC TGG AGG GGC ACC AGC CCG CTG    624
Val Val Asn Gly Val Arg Tyr Tyr Ser Trp Arg Gly Thr Ser Pro Leu
        195                 200                 205
ACC AAC GTA CTC GAC CCC TCC GAC CTG CTG CTC GGC GCC ACC TCC CTG    672
Thr Asn Val Leu Asp Pro Ser Asp Leu Leu Leu Gly Ala Thr Ser Leu
    210                 215                 220
ACC TTC GGT TTC GAG GCC AAC GAT GGT CTG GTC GGA CGC TGC AGC TCC    720
Thr Phe Gly Phe Glu Ala Asn Asp Gly Leu Val Gly Arg Cys Ser Ser
225                 230                 235                 240
CGG CTG GGT ATG GTG ATC CGC GAC AAC TAC CGG ATG AAC CAC CTG GAC    768
Arg Leu Gly Met Val Ile Arg Asp Asn Tyr Arg Met Asn His Leu Asp
                245                 250                 255
GAG GTG AAC CAG ACC TTC GGG CTG ACC AGC ATC TTC GAG ACC AGC CCG    816
Glu Val Asn Gln Thr Phe Gly Leu Thr Ser Ile Phe Glu Thr Ser Pro
            260                 265                 270
GTA TCG GTC TAT CGC CAG CAA GCC AAT CGC CTG AAG AAC GCC GGG CTC    864
Val Ser Val Tyr Arg Gln Gln Ala Asn Arg Leu Lys Asn Ala Gly Leu
        275                 280                 285
(2)关于SEQ ID NO：100的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：288个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：100：
Phe Gly Ser Ser Asn Tyr Thr Lys Thr Gln Tyr Pro Ile Val Leu Thr
  1               5                  10                  15
His Gly Met Leu Gly Phe Asp Ser Leu Leu Gly Val Asp Tyr Trp Tyr
             20                  25                  30
Gly Ile Pro Ser Ala Leu Arg Lys Asp Gly Ala Thr Val Tyr Val Thr
         35                  40                  45
Glu Val Ser Gln Leu Asp Thr Ser Glu Ala Arg Gly Glu Gln Leu Leu
     50                  55                  60
Thr Gln Val Glu Glu Ile Val Ala Ile Ser Gly Lys Pro Lys Val Asn
 65                  70                  75                  80
Leu PHe Gly His Ser His Gly Gly Pro Thr Ile Arg Tyr Val Ala Ala
                 85                  90                  95
Val Arg Pro Asp Leu Val Ala Ser Val Thr Ser Ile Gly Ala Pro His
            100                 105                 110
Lys Gly Ser Ala Thr Ala Asp Phe Ile Arg Gln Val Pro Glu Gly Ser
        115                 120                 125
Ala Ser Glu Ala Ile Leu Ala Gly Ile Val Asn Gly Leu Gly Ala Leu
    130                 135                 140
Ile Asn Phe Leu Ser Gly Ser Ser Ser Asp Thr Pro Gln Asn Ser Leu
145                 150                 155                 160
Gly Thr Leu Glu Ser Leu Asn Ser Glu Gly Ala Ala Arg Phe Asn Ala
                165                 170                 175
Arg Phe Pro Gln Gly Val Pro Thr Ser Ala Cys Gly Glu Gly Asp Tyr
            180                 185                 190
Val Val Asn Gly Val Arg Tyr Tyr Ser Trp Arg Gly Thr Ser Pro Leu
        195                 200                 205
Thr Asn Val Leu Asp Pro Ser Asp Leu Leu Leu Gly Ala Thr Ser Leu
    210                 215                 220
Thr Phe Gly Phe Glu Ala Asn Asp Gly Leu Val Gly Arg Cys Ser Ser
225                 230                 235                 240
Arg Leu Gly Met Val Ile Arg Asp Asn Tyr Arg Met Asn His Leu Asp
                245                 250                 255
Glu Val Asn Gln Thr Phe Gly Leu Thr SerIle Phe Glu Thr Ser Pro
            260                 265                 270
Val Ser Val Tyr Arg Gln Gln Ala Asn Arg Leu Lys Asn Ala Gly Leu
        275                 280                 285

Claims (45)

1.一种制备突变的脂解酶的方法，该方法至少包括下列步骤：
(a)使编码亲本脂解酶的DNA序列进行诱变以形成各种突变的DNA序列；
(b)在宿主细胞中表达突变的DNA序列；
(c)筛选表达突变的脂解酶的宿主细胞，该突变的脂解酶与亲本脂解酶相比，对钙的依赖性降低和/或对去垢剂或去垢剂组分的耐受性提高；
(d)在从步骤(c)中形成的脂解酶中选择突变的脂解酶，该突变的脂解酶当存在于去垢剂组合物中时，在一个周期的洗涤测定中，能够比没有该酶的去垢剂组合物从猪脂沾污的布样多除去至少15％的猪脂，洗涤测定包括：
使每烧杯7个猪脂沾污9×9cm棉花布样在恒温箱Terg-O-to-Meter中进行一个周期的洗涤，每个烧杯包含1000ml的水，在水中包含Ca2+/Mg2+比率为5∶1的3.2mM Ca2+/Mg2+以及5g/l所说的去垢剂组合物，调至pH 10，还包含12500LU/l的脂解酶，在30℃的温度下进行20分钟的洗涤处理，其后在流动自来水下冲洗15分钟并于室温下在绳子上晾干过夜，随后通过Soxhlet提取来提取并定量测定所得布样中的脂肪物质。
2.权利要求1的方法，其中所说的步骤(a)的诱变是随机诱变。
3.上述权利要求任一项的方法，其中所说的诱变是定域随机诱变，该诱变在脂接触区或在存在于亲本脂解酶的N-末端和/或C-末端的任何肽添加中进行。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中步骤(a)、(b)、(c)和/或(d)重复一次或多次。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中所说的亲本脂解酶源自Humicola lanuginosa菌株DSM 4109并具有EP 305 216中公开的氨基酸序列。
6.上述权利要求任一项的方法，其中所说的突变的脂解酶与亲本脂解酶相比包含至少3个突变。
7.上述权利要求任一项的方法，其中所说的突变的脂解酶与亲本脂解酶相比包含至少一个中性氨基酸残基被带正电的氨基酸残基取代，至少一个带负电的氨基酸残基缺失，或至少一个带负电的氨基酸残基被中性或带正电的氨基酸残基取代。
8.上述权利要求任一项的方法，其中所说的突变的脂解酶与亲本脂解酶相比，已通过在亲本脂解酶的脂接触区的至少一个氨基酸残基的缺失或取代、或把至少一个氨基酸残基添加至所说的脂接触区而被修饰。
9.上述权利要求任一项的方法，其中所说的突变的脂解酶与亲本脂解酶相比，在亲本脂解酶的脂接触区内包含至少一个突变，在亲本脂解酶的脂接触区外包含至少一个突变。
10.上述权利要求任一项的方法，其中所说的突变的脂解酶与亲本脂解酶相比，包含应用在亲本脂解酶成熟形式的C-和/或N-末端处或其内的肽添加。
11.上述权利要求任一项的方法，其中所说的肽添加形成与亲本脂解酶成熟部分的共价结合。
12.上述权利要求任一项的方法，其中所说的突变的脂解酶包含在肽添加中的半胱氨酸残基，在亲本脂解酶的成熟部分中的半胱氨酸残基，和所说的两个半胱氨酸残基之间的半胱氨酸桥。
13.权利要求10-12任一项的方法，其中所说的肽添加包含至少一个脯氨酸残基。
14.上述权利要求任一项的方法，其中所说的肽添加包含两个或三个脯氨酸残基。
15.权利要求10-14任一项的方法，其中所说的肽添加包含至少一个带正电的或疏水的氨基酸残基。
16.上述权利要求任一项的方法，其中所说的肽添加包含两个或三个疏水的氨基酸残基。
17.权利要求10-16任一项的方法，其中所说的肽添加的长度是1至15个氨基酸。
18.权利要求17的方法，其中所说的肽添加的长度是4-10个氨基酸。
19.权利要求10-18任一项的方法，其中所说的突变的脂解酶还包含在亲本脂解酶的N-末端和/或C-末端的非结构部分的突变。
20.上述权利要求任一项的方法，其中所说的突变导致除去至少一个带负电的氨基酸残基。
21.权利要求19或20的方法，其中所说的非结构部分的带负电氨基酸残基已被缺失或被中性或带正电的氨基酸残基或被疏水氨基酸残基取代，或其中的中性氨基酸残基已被带正电的氨基酸残基取代。
22.一种制备突变的脂解酶的方法，该方法至少包括下列步骤：
(a)通过组合下列组分构建突变的DNA序列：i)编码第一亲本脂解酶的DNA序列或所说的DNA序列的部分，ii)编码第二亲本脂解酶的DNA序列或所说的DNA序列的部分，iii)编码第三亲本脂解酶的DNA序列或所说的DNA序列的部分，要组合的DNA序列具有足够的同源性以使序列之间可以发生同源重组，
(b)在宿主细胞中表达形成的突变的DNA序列，以及
(c)在从步骤(b)中形成的脂解酶中选择突变的脂解酶，该突变的脂解酶当存在于去垢剂组合物中时，在一个周期的洗涤测定中，能够比没有该酶的去垢剂组合物从猪脂沾污的布样多除去至少15％的猪脂，洗涤测定包括：
使每烧杯7个猪脂沾污9×9cm棉花布样在恒温箱Terg-O-to-Meter中进行一个周期的洗涤，每个烧杯包含1000ml的水，在水中包含Ca2+/Mg2+比率为5∶1的3.2mM Ca2+/Mg2+以及5g/l所说的去垢剂组合物，调至pH 10，还包含12500LU/l的脂解酶，在30℃的温度下进行20分钟的洗涤处理，其后在流动自来水下冲洗15分钟并于室温下在绳子上晾干过夜，随后通过Soxhlet提取来提取并定量测定所得布样中的脂肪物质。
23.权利要求22的方法，其中在步骤(c)之前进行表达突变的脂解酶的宿主细胞的筛选，该突变的脂解酶与任一亲本脂解酶相比，对钙的依赖性降低和/或对去垢剂或去垢剂组分的耐受性提高。
24.权利要求22或23的方法，其中通过下列方法制备一种或多种用于构建步骤(a)的突变的DNA序列的同源DNA序列i)-iii)
(a)使编码亲本脂解酶的DNA序列进行诱变以形成各种突变的DNA序列；
(b)在宿主细胞中表达形成的突变的DNA序列，
(c)筛选表达突变的脂解酶的宿主细胞，该突变的脂解酶与亲本脂解酶相比，对钙的依赖性降低和/或对去垢剂或去垢剂组分的耐受性提高；并
(d)在从步骤(c)中形成的脂解酶中选择突变的脂解酶，该突变的脂解酶当存在于去垢剂组合物中时，在一个周期的洗涤测定中，能够比没有该酶的去垢剂组合物从猪脂沾污的布样多除去至少15％的猪脂，洗涤测定包括：
使每烧杯7个猪脂沾污9×9cm棉花布样在恒温箱Terg-O-to-Meter中进行一个周期的洗涤，每个烧杯包含1000ml的水，在水中包含Ca2+/Mg2+比率为5∶1的3.2mM Ca2+/Mg2+以及5g/l所说的去垢剂组合物，调至pH 10，还包含12500LU/l的脂解酶，在30℃的温度下进行20分钟的洗涤处理，其后在流动自来水下冲洗15分钟并于室温下在绳子上晾干过夜，随后通过Soxhlet提取来提取并定量测定所得布样中的脂肪物质。
25.权利要求22-24任一项的方法，其中所说的由同源DNA序列i)，ii)和iii)编码的亲本脂解酶组成相同的天然产生的脂解酶的不同变体。
26.权利要求22-25任一项的方法，其中所说的亲本脂解酶源自真菌或源自细菌。
27.上述权利要求任一项的方法，其中所说的亲本脂解酶源自Humicola lanuginosa菌株DSM 4109并具有EP 305 216中公开的氨基酸序列。
28.权利要求22-27任一项的方法，其中所说的DNA序列的组合通过有性PCR或基因改组进行。
29.一种脂解酶，其为亲本脂解酶的变体，其中所说的亲本脂解酶源于Humicola lanuginosa菌株DSM 4109并具有EP 305 216中公开的氨基酸序列，且所说的变体具有下列突变之一：
a)SPIRPRP+D57G+N94K+D96L+Q249R；
b)SPPRRP+I90F+D96L+E99K+D137G+V187A；
c)SPIRPRP+N94K+D96L+L97M+Q249R；
d)SPPPRPRP+N94K+D96L+L97M+Q249R；
e)SPIRPRP+D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R；
f)SPPRRP+I90F+D96L+E99K+V187A；
g)SPIRPRP+D137G+D167G+E21V+W221L；
h)E1SPIRPRP+I90F+D96L+E99K+V187A；
i)E1SRKRKRK+I90F+D96L+E99K+V187A；
j)E1SPRIKPRIK+I90F+D96L+E99K+V187A；
k)E1SPPRRP+D62R+I90F+D96L+E99K+V187A；
1)E1SPPRRP+I90F+D96L+E99K+V187A+N200R+R209A；
m)E1SPPRRP+I90F+D96L+E99K+V187A+T199R+N200R+R209A；
n)E1SPIRPRP+D57G+D62R+N94K+D96L+Q249R；
0)E1SPIRPRP+D57G+N94K+D96L+N200R+R209A+Q249R；
p)E1SPIRPRP+D57G+N94K+D96L+T199R+N200R+Q249R；
q)E1SPPRRP+I90F+D96L+E99K+V187A+T199R；
r)E1SPIRPRP+D57G+N94K+D96L+T199R+R209A+Q249R；
s)E1SPIRPRP+I90F+D96L+E99K+V187A+Q249R；
t)E1SPPRRP+I90F+D96L+E99K+V187A+P253R；
u)E1SPPRRP+I90F+D96L+E99K+D137G+D167G+V187A+Q249R；
v)E1SPPRRP+I90F+D96L+E99K+D137G+V187A+Q249R；
w)E1SPPRRP+D96L+E99K+V187A+Q249R；
x)E1SPPRPR+V2P+N94K+D96L+Q249R；
y)E1SPPWWP+V2W+S3R+N94K+D96L+Q249R；
z)E1SPPWRP+V2R+S3R+N94K+D96L+Q249R；
aa)E1SPPRWP+V2R+S3R+N94K+D96L+Q249R；
bb)E1SPPWWP+V2R+S3W+N94K+D96L+Q249R；
cc)E1SPPRWP+V2W+S3R+N94K+D96L+Q249R；
dd)E1SPPRWP+V2R+S3W+N94K+D96L+Q249R；
ee)E1SPPRWP+N94K+D96L+Q249R；
ff)E1SPPRRP+N94K+D96L+Q249R；
gg)E1APPPRPRPRPRP+V2G+S3T+D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R；
hh)
E1APPPRTRPRPRS+V2G+S3T+Q4P+D5E+D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R；
ii)
E1APPPKASPRQRP+V2G+D5Q+L6M+D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R；
jj)SCIRR+N94K+D96L+E239C+Q249R；
kk)E1SPPRRP+D57G+N94K+D96L+Y53C+K127C+Q249R；
ll)E1SPPRRPR+V2R+S3P+N94K+D96L+Q249R；
mm)E1SPPWPRP+V2R+S3P+N94K+D96L+Q249R；
nn)E1SPPRRP+N94K+D96L+E99K；
oo)E1SPPRRP+N94K+D96L+E99K+Q249R；
pp)E1SPPCGRRP+N94K+D96L+E239C+Q249R；
qq)E1SPCRPRP+N94K+D96L+E239C+Q249R；
rr)SPPCRRRP+N94K+D96L+E239C+Q249R；或
ss)E1SPPRRP+D57G+N94K+D96L+Q249R。
30.一种DNA构建体，该构建体包含编码权利要求29的脂解酶的DNA序列。
31.一种载体，该载体携带权利要求30的DNA构建体。
32.权利要求31的载体，该载体是质粒或噬菌体。
33.权利要求31或32的载体，该载体是还包含使得脂解酶进行表达的DNA序列的表达载体。
34.一种宿主细胞，该宿主细胞携带权利要求30的DNA构建体或权利要求31-33任一项的载体。
35.权利要求34的细胞，该细胞是微生物细胞。
36.权利要求35的细胞，该细胞是真菌或细菌菌株的细胞。
37.权利要求36的细胞，该细胞是曲霉属的细胞，镰孢属的细胞或是酵母属的细胞。
38.权利要求37的细胞，该细胞为黑曲霉(A.niger)、米曲霉(A.oryzae)、构巢曲霉(A.nidulans)、禾本科镰孢(F.graminearum)或酿酒酵母(S.cerevisiae)。
39.一种呈无尘粒剂、稳定的液体或保护酶的形式的去垢剂添加剂，该去垢剂添加剂包含权利要求29的脂解酶。
40.权利要求39的去垢剂添加剂，该去垢剂添加剂包含0.02-200mg酶蛋白质/g添加剂。
41.权利要求39或40的去垢剂添加剂，该去垢剂添加剂还包含另一种酶。
42.权利要求41的去垢剂添加剂，其中所说的酶为蛋白酶、淀粉酶、过氧化物酶、角质酶、脂酶和/或纤维素酶。
43.一种去垢剂组合物，该去垢剂组合物包含表面活性剂和权利要求29的脂解酶。
44.权利要求43的去垢剂组合物，该去垢剂组合物还包含另一种酶。
45.权利要求44的去垢剂组合物，其中所说的酶为蛋白酶、淀粉酶、过氧化物酶、角质酶、脂酶和/或纤维素酶。
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