CN111094561B - 靶特异性crispr变体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及人工操纵的CRISPR/Cas9系统。更具体而言，本发明涉及具有增强的靶特异性的人工操纵的CRISPR酶以及包含相同酶的人工操纵的CRISPR/Cas9系统在基因组和/或表观基因组操纵或修饰、基因组靶向、基因组编辑以及体外诊断中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及人工工程化CRISPR/Cas9系统。更具体而言，本发明涉及具有改善的靶特异性的人工工程化CRISPR酶，以及使用包含CRISPR酶的人工工程化CRISPR/Cas9系统用于基因组和/或表观基因组操纵或修饰、基因组靶向、基因组编辑以及体外诊断等的用途。
背景技术
CRISPR-Cas系统由引导RNA(gRNA)(其具有针对靶基因或核酸的互补序列)和CRISPR酶(其为可切割靶基因或核酸的核酸酶)组成，其中，gRNA和CRISPR酶形成CRISPR复合体，并且所形成的CRISPR复合体切割或修饰靶基因或核酸。
然而，除修饰靶基因或核酸的效果外，尚未解决对不期望的非靶基因或核酸进行修饰的问题。非靶基因或核酸为具有与gRNA部分互补的序列并且可与gRNA形成部分互补的键的基因位点，其中，由于部分互补的结合，CRISPR复合体可切割或修饰相应的基因位点，而该基因位点为并不是修饰对象的非靶基因或核酸。
因此，为提高使用CRISPR-Cas系统特异性修饰靶基因或核酸的效率或解决诸如可引起非靶基因或核酸的修饰的遗传结合的问题，增加CRISPR-Cas系统的靶特异性是重要的。为增加CRISPR-Cas系统的靶特异性，尝试了关于具有少量非靶基因候选物的gRNA的选择以及CRISPR酶的活性和/或特异性的调节的多种研究。
现有技术文件
非专利文件
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(非专利文件0016)McKenzie，G.J.&Craig，N.L.，BMC Microbiol6，39(2006)
(非专利文件0017)Kulcsar，P.I.等，Genome Biol 18，190(2017)
(非专利文件0018)Zhang D.等，Genome Biol 18，191(2017)
(非专利文件0019)Komor，A.C.，Kim，Y.B.，Packer，M.S.，Zuris，J.A.&Liu，D.R.Nature 533，420-424(2016)
(非专利文件0020)Kim，D.，Kim，S.，Park，J.&Kim，J.S.Genome Res 26，406-415(2016)
(非专利文件0021)Geissmann，Q.PLoS One8，e54072
发明内容
[技术问题]
一方面，本发明涉及提供具有改善的靶特异性的人工工程化CRISPR酶。
[技术方案]
为解决该问题，本发明涉及人工工程化CRISPR酶。更具体而言，本发明涉及具有改善的针对靶基因或核酸的靶特异性的Cas9和使用所述Cas9的CRISPR/Cas9系统。
本发明提供了用于特定目的的人工工程化CRISPR酶。
一方面，人工工程化CRISPR酶可为具有改善的靶特异性的包含人工操纵(artificialmanipulation)的SpCas9变体(突变体)，其中，所述人工操纵可以包括对存在于选自于野生型酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)Cas9(SpCas9)的第一区域、第二区域、第三区域和第四区域中的一个或多个区域中的一个或多个氨基酸的人工操纵(修饰)。
野生型SpCas9的第一区域可为选自于由以下部分所组成的组中的一个或多个部分：与gRNA相互作用的野生型SpCas9的部分、与靶序列相互作用的野生型SpCas9的部分、与gRNA-靶序列异源双链(heteroduplex)相互作用的野生型SpCas9的部分以及与gRNA-靶序列异源双链的PAM(前间区序列邻近基序)远端(distal end)相互作用的野生型SpCas9的部分。
此处，gRNA-靶序列异源双链的PAM远端可为远离PAM位置的gRNA-靶序列异源双链的末端处的6-10个碱基对。
此处，PAM可为5′-NGG-3′。
野生型SpCas9的第二区域可为执行切割核酸的功能的野生型SpCas9的部分。
野生型SpCas9的第三区域可为执行切割核酸的功能的野生型SpCas9的部分。
野生型SpCas9的第四区域可为选自于由以下部分所组成的组中的一个或多个部分：识别靶基因或核酸中的PAM序列或与靶基因或核酸中的PAM序列相互作用的野生型SpCas9的部分以及与gRNA的核苷酸序列的一部分相互作用的野生型SpCas9的部分。
野生型SpCas9的第一区域可为选自于由以下区域所组成的组中的一个或多个区域：位于野生型SpCas9的REC叶中的区域、野生型SpCas9的整个REC结构域以及野生型SpCas9的REC结构域的一部分。
野生型SpCas9的第二区域可为选自于由以下区域所组成的组中的一个或多个区域：位于野生型SpCas9的NUC叶中的区域、野生型SpCas9的整个RuvC结构域、野生型SpCas9的RuvC结构域的一部分以及野生型SpCas9的RuvC结构域的包含金属依赖性核酸切割区域的部分。
此处，RuvC结构域的金属依赖性核酸切割区域可为RuvC结构域中能够通过与金属相互作用而切割靶位置处的核酸之间的结合的区域。
野生型SpCas9的第三区域可为选自于由以下区域所组成的组中的一个或多个区域：位于野生型SpCas9的NUC叶中的区域、野生型SpCas9的整个HNH结构域、野生型SpCas9的HNH结构域的一部分以及野生型SpCas9的HNH结构域的包含金属依赖性核酸切割区域的部分。
此处，HNH结构域的金属依赖性核酸切割区域可为HNH结构域中能够通过与金属相互作用而切割靶位置处的核酸之间的结合的区域。
野生型SpCas9的第四区域可为选自于由以下区域所组成的组中的一个或多个区域：位于野生型SpCas9的NUC叶中的区域、野生型SpCas9的整个PI结构域以及野生型SpCas9的PI结构域的一部分。
第一区域可包含选自于由以下区域所组成的组中的一个或多个区域：由野生型SpCas9的第196位的苯丙氨酸(F196)至第282位的异亮氨酸(I282)的氨基酸序列组成的区域1-1、由野生型SpCas9的第316位的脯氨酸(P316)至第394位的天冬酰胺(N394)的氨基酸序列组成的区域1-2、由野生型SpCas9的第510位的赖氨酸(K510)至第612位的天冬酰胺(N612)的氨基酸序列组成的区域1-3以及由野生型SpCas9的第678位的苏氨酸(T678)至第698位的组氨酸(H698)的氨基酸序列组成的区域1-4。
第一区域可包含野生型SpCas9的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696和I697。
此处，第二区域可包含选自于由以下区域所组成的组中的一个或多个区域：由野生型SpCas9的第1位的蛋氨酸(M1)至第22位的苏氨酸(T22)的氨基酸序列组成的区域2-1、由野生型SpCas9的第731位的脯氨酸(P731)至第770位的苏氨酸(T770)的氨基酸序列组成的区域2-2以及由野生型SpCas9的第926位的谷氨酰胺(Q926)至第1040位的丝氨酸(S1040)的氨基酸序列组成的区域2-3。
第二区域可包含野生型SpCas9的I7，G8，L9，D10，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，E762，M763，A764，R765，E766，N767，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，Y1036，F1037，F1038和Y1039。
此处，第三区域可包含由野生型SpCas9的第775位的赖氨酸(K775)至第900位的亮氨酸(L900)的氨基酸序列组成的区域3-1。
第三区域可包含野生型SpCas9的K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，V838，D839，H840，K848，D849，D850，D853，N854，K855，R859，D861，K862，N863，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，A889，K890，L891，R895，K896和D898。
此处，第四区域可包含由野生型SpCas9的第1099位的谷氨酸(E1099)至第1139位的缬氨酸(V1139)的氨基酸序列组成的区域4-1。
第四区域可包含野生型SpCas9的T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。
在一个示例性实施方式中，存在于选自于野生型SpCas9的第一区域、第二区域、第三区域和第四区域中的一个或多个区域中的一个或多个氨基酸可为选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸：野生型SpCas9的I7，G8，L9，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696，I697，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，M763，A764，K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，D839，H840，K848，D849，D850，D853，K855，R859，D861，K862，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，K890，R895，K896，D898，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，A984，A987，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，F1037，F1038，T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。
在一个示例性实施方式中，存在于选自于野生型SpCas9的第一区域、第二区域、第三区域和第四区域中的一个或多个区域中的一个或多个氨基酸可为选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸；野生型SpCas9的A203，N277，G366，F539，I601，M763，K890，D965，F1038，T1102和D1127。
人工操纵可为存在于选自于野生型SpCas9的第一区域、第二区域、第三区域和第四区域中的一个或多个区域中的一个或多个氨基酸的删除。
人工操纵可为用不同的氨基酸置换存在于选自于野生型SpCas9的第一区域、第二区域、第三区域和第四区域中的一个或多个区域中的一个或多个氨基酸。
此处，不同的氨基酸可为比存在于选自于野生型SpCas9的第一区域、第二区域、第三区域和第四区域中的一个或多个区域中的一个或多个氨基酸具有更小的功能性基团的氨基酸。
此处，不同的氨基酸可为比存在于选自于野生型SpCas9的第一区域、第二区域、第三区域和第四区域中的一个或多个区域中的一个或多个氨基酸具有更大的功能性基团的氨基酸。
此处，不同的氨基酸可为比存在于选自于野生型SpCas9的第一区域、第二区域、第三区域和第四区域中的一个或多个区域中的一个或多个氨基酸具有更高的亲水指数(hydropathy index)的氨基酸。
此处，不同的氨基酸可为比存在于选自于野生型SpCas9的第一区域、第二区域、第三区域和第四区域中的一个或多个区域中的一个或多个氨基酸具有更低的亲水指数的氨基酸。
一方面，SpCas9变体可为包含选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸的人工操纵的靶特异性SpCas9(TS-SpCas9)变体：野生型SpCas9的A203，N277，G366，F539，I601，M763，K890，D965，F1038，T1102和D1127。
人工操纵可为选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸的删除或用不同的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸：野生型SpCas9的A203，N277，G366，F539，I601，M763，K890，D965，F1038，T1102和D1127。
此处，不同的氨基酸可为比选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸具有更大或更小的功能性基团的氨基酸：野生型SpCas9的A203，N277，G366，F539，I601，M763，K890，D965，F1038，T1102和D1127。
此处，不同的氨基酸可为比选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸具有更高或更低的亲水指数的氨基酸：野生型SpCas9的A203，N277，G366，F539，I601，M763，K890，D965，F1038，T1102和D1127。
TS-SpCas9变体可包含野生型SpCas9的F539的人工操纵。
TS-SpCas9变体可包含野生型SpCas9的M763的人工操纵。
TS-SpCas9变体可包含野生型SpCas9的K890的人工操纵。
TS-SpCas9变体可包含野生型SpCas9的F539/M763(F539和M763)、F539/K890或M763/K890的人工操纵。
TS-SpCas9变体可包含野生型SpCas9的F539、M763和K890的人工操纵。
一方面，人工工程化CRISPR酶可为包含TS-SpCas9变体的融合蛋白。
融合蛋白可包含一个或多个功能性结构域。
此处，功能性结构域可为选自于由以下结构域所组成的组中的一种或多种结构域：具有甲基化酶活性、去甲基化酶活性、转录活化活性、转录抑制活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA切割活性或核酸结合活性的结构域；用于蛋白质(包括肽)的分离和纯化的标签；报告基因；NLS(核定位序列或信号)；NES(核输出序列或信号)；以及脱氨酶。
一方面，人工工程化CRISPR酶可为编码SpCas9变体、TS-SpCas9变体和/或融合蛋白的核酸的形式。
一方面，核酸可包含在载体中。
一方面，可将载体和/或编码SpCas9变体、TS-SpCas9变体和/或融合蛋白的核酸导入细胞中。
一方面，可使用SpCas9变体、TS-SpCas9变体和/或融合蛋白与gRNA来对细胞的基因组进行人工操纵。
gRNA可为包含互补结合至存在于细胞的基因组中的靶基因的靶序列的核苷酸序列的核酸。
[有益效果]
根据本发明，使用人工操纵CRISPR酶的具有改善的靶特异性的CRISPR-Cas系统可用于基因组和/或表观基因组操纵或修饰、基因组靶向、基因组编辑以及体外诊断中。
附图说明
图1为示出了代表通过SpCas9的第一区域变体对靶基因(DMD基因)的操纵效果的插入缺失(插入和删除)频率(％)的图。
图2为示出了代表通过SpCas9的第一区域变体对靶基因(EMX基因)的操纵效果的插入缺失频率(％)的图。
图3为示出了代表通过SpCas9的第一区域变体对靶基因(VEGFA基因)的操纵效果的插入缺失频率(％)的图。
图4和图5为示出了代表通过SpCas9的第二区域变体对靶基因(DMD基因)的操纵效果的插入缺失频率(％)的图。
图6和图7为示出了代表通过SpCas9的第二区域变体对靶基因(EMX基因)的操纵效果的插入缺失频率(％)的图。
图8为示出了代表通过SpCas9的第二区域变体对靶基因(VEGFA基因)的操纵效果的插入缺失频率(％)的图。
图9为示出了代表通过SpCas9的第二区域变体对靶基因(HBB03基因)的操纵效果的插入缺失频率(％)的图。
图10为示出了代表通过SpCas9的第二区域变体对靶基因(HBB04基因)的操纵效果的插入缺失频率(％)的图。
图11为示出了代表通过SpCas9的第三区域变体对靶基因(DMD基因)的操纵效果的插入缺失频率(％)的图。
图12为示出了代表通过SpCas9的第四区域变体对靶基因(DMD基因)的操纵效果的插入缺失频率(％)的图。
图13为示出了代表通过SpCas9的第四区域变体对靶基因(EMX基因)的操纵效果的插入缺失频率(％)的图。
图14为示出了代表通过具有SpCas9的四个区域中的两个区域中的突变的SpCas9变体对靶基因(DMD基因)的操纵效果的插入缺失频率(％)的图。
图15为示出了代表通过具有SpCas9的四个区域中的两个区域中的突变的SpCas9变体对靶基因(EMX基因)的操纵效果的插入缺失频率(％)的图。
图16为示出了代表通过具有SpCas9的四个区域中的两个区域中的突变的SpCas9变体对靶基因(VEGFA基因)的操纵效果的插入缺失频率(％)的图。
图17为示出了代表通过具有SpCas9的四个区域中的两个区域中的突变的SpCas9变体对靶基因(HBB03基因)的操纵效果的插入缺失频率(％)的图。
图18为示出了代表通过具有SpCas9的四个区域中的两个区域中的突变的SpCas9变体对靶基因(HBB04基因)的操纵效果的插入缺失频率(％)的图。
图19为示出了代表通过具有SpCas9的四个区域中的三个区域中的突变的SpCas9变体对靶基因(DMD基因)的操纵效果的插入缺失频率(％)的图。
图20为示出了代表通过具有SpCas9的四个区域中的三个区域中的突变的SpCas9变体对靶基因(VEGFA基因)的操纵效果的插入缺失频率(％)的图。
图21为示出了代表通过具有SpCas9的四个区域中的三个区域中的突变的SpCas9变体对靶基因(HBB03基因)的操纵效果的插入缺失频率(％)的图。
图22为示出了代表通过具有SpCas9的四个区域中的三个区域中的突变的SpCas9变体对靶基因(HBB04基因)的操纵效果的插入缺失频率(％)的图。
图23为示出了代表通过具有SpCas9的四个区域中的三个区域中的突变的SpCas9变体对靶基因(DMD基因)的操纵效果的插入缺失频率(％)的图。
具体实施方式
除非另有定义，否则本说明书中使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员常规理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的方法和材料类似或相同的方法和材料可用于本发明的实践或测试中，下面描述了合适的方法和材料。本文所述的所有出版物、专利申请、专利以及其它参考文献以引用的方式整体并入本文。另外，材料、方法和实例仅为说明性的，但并不旨在为限制性的。
本文公开的公开内容的一个方面涉及CRISPR酶。
“CRISPR酶”是成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关蛋白(Cas)系统的主要蛋白质成分，并且与引导RNA(gRNA)形成复合体，从而形成CRISPR-Cas系统。
“gRNA”是指能够将CRISPR复合体(即gRNA-CRISPR酶复合体)特异性靶向至靶基因或核酸的RNA。gRNA为针对靶序列的特异性RNA，可结合至CRISPR酶并将CRISPR酶引导至靶基因或核酸。此处，“靶序列”为存在于靶基因或核酸中的核苷酸序列；具体而言，是靶基因或核酸中的靶区域的部分核苷酸序列。本文使用的“靶区域”为靶基因或核酸中的可被引导核酸-编辑蛋白修饰的位点。
gRNA可包含多个结构域。根据每个结构域，相互作用可发生在gRNA的活性形式或三维结构的链中或链之间。
gRNA可被称为单链gRNA(单RNA分子；单gRNA；sgRNA)；或双链gRNA(包含多于一个、通常为两个独立的RNA分子)。
在一个示例性实施方式中，单链gRNA可在5′至3′方向上包含：引导结构域(即包含能够与靶基因或核酸形成互补结合的引导序列的结构域)、第一互补结构域、接头结构域、第二互补结构域(其具有与第一互补结构域序列互补的序列，并且可与第一互补结构域序列形成双链核酸)、近端结构域(proximaldomain)以及任选的尾部结构域。
在另一实施方式中，双链gRNA可包含：第一链，所述第一链在5′至3′方向上包含引导结构域(即包含能够与靶基因或核酸形成互补结合的引导序列的结构域)和第一互补结构域；以及第二链，所述第二链在5′至3′方向上包含第二互补结构域(其具有与第一互补结构域序列互补的序列，并且可与第一互补结构域序列形成双链核酸)、近端结构域以及任选的尾部结构域。
此处，第一链可被称为crRNA，而第二链可被称为tracrRNA。crRNA可包含引导结构域和第一互补结构域，而tracrRNA可包含第二互补结构域、近端结构域以及任选的尾部结构域。
在又一实施方式中，单链gRNA可在5′至3′方向上包含：引导结构域(即包含能够与靶基因或核酸形成互补结合的引导序列的结构域)、第一互补结构域以及第二互补结构域(其具有与第一互补结构域序列互补的序列，并且可与第一互补结构域序列形成双链核酸)。
CRISPR酶为具有编码CRISPR酶的序列的核酸或多肽(或蛋白质)，并且代表性地，II型CRISPR酶或V型CRISPR酶被广泛使用。
CRISPR酶可为II型CRISPR酶。
II型CRISPR酶可为Cas9。
此处，Cas9可衍生自各种微生物，例如酿脓链球菌、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、链球菌属(Streptococcus sp.)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、达森维尔诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)、始旋链霉菌(Streptomycespristinaespiralis)、绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)、绿色产色链霉菌、玫瑰链孢囊菌(Streptosporangium roseum)、玫瑰链孢囊菌、酸热脂环酸芽孢杆菌(AlicyclobacHlus acidocaldarius)、假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)、Bacillus selenitireducens、Exiguobacterium sibiricum、德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、海洋微颤菌(Microscillamarina)、伯克氏菌目细菌(Burkholderiales bacterium)、Polaromonasnaphthalenivorans、极单孢菌属(Polaromonas sp.)、Crocosphaera watsonii、蓝杆藻属(Cyanothece sp.)、铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)、聚球藻属(Synechococcussp.)、阿拉伯糖醋盐杆菌(Acetohalobium arabaticum)、Ammonifex degensii、Caldicelulosiruptor bescii、Candidatus Desulforudis、肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、艰难梭菌(Clostridium dififficile)、Finegoldia magna、嗜热盐碱厌氧菌(Natranaerobius thermophilus)、Pelotomaculum thermopropionicum、喜温嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)、嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans)、Allochromatium vinosum、海杆菌属(Marinobacter sp.)、嗜盐亚硝化球菌(Nitrosococcus halophilus)、Nitrosococcus watsoni、游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)、Ktedonobacter racemifer、调查甲烷盐菌(Methanohalobium evestigatum)、多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)、泡沫节球藻(Nodularia spumigena)、念珠藻属(Nostoc sp.)、极大节旋藻(Arthrospira maxima)、钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)、节旋藻属(Arthrospira sp.)、鞘丝藻属(Lyngbyasp.)、原型微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)、颤藻属(Oscillatoria sp.)、运动石袍菌(Petrotoga mobilis)、非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)以及Acaryochlorismarina等。
此处，Cas9可从天然存在的微生物中分离，或通过重组方法或合成方法非天然地产生。
根据关于两种以上天然微生物II型CRISPR酶分子的研究(Jinek等，Science，343(6176)：1247997，2014)以及关于与gRNA复合的酿脓链球菌Cas9(SpCas9)的研究(Nishimasu等，Cell，156：935-949，2014；以及Anders等，Nature，2014，doi：10.1038/nature13579)确定了II型CRISPR酶的晶体结构。
II型CRISPR酶包含两个叶(lobe)，即识别(REC)叶和核酸酶(NUC)叶，并且每个叶包含数个结构域。
REC叶包含富含精氨酸的桥螺旋(bridge helix，BH)结构域、REC1结构域以及REC2结构域。
此处，BH结构域为长α-螺旋且为富含精氨酸的区域，而REC1结构域和REC2结构域在识别gRNA(例如单链gRNA、双链gRNA或tracrRNA)中形成的双链中发挥重要作用。
NUC叶包含RuvC结构域、HNH结构域以及PAM相互作用(PI)结构域。此处，RuvC结构域涵盖RuvC样结构域，并且HNH结构域涵盖HNH样结构域。
此处，RuvC结构域与天然存在的具有II型CRISPR酶的微生物家族的成员共享结构相似性，并且切割单链(例如靶基因或核酸的非互补链，即不与gRNA形成互补结合的链)。在本领域中，RuvC结构域有时被称为RuvCI结构域、RuvCII结构域或RuvCIII结构域，并且通常被称作RuvCI、RuvCII或RuvCIII。
HNH结构域与HNH核酸内切酶共享结构相似性，并且切割单链(例如靶核酸分子的互补链，即与gRNA形成互补结合的链)。HNH结构域位于RuvCII基序和RuvCIII基序之间。
PI结构域识别靶基因或核酸中的特定核苷酸序列(即前间区序列邻近基序(PAM))或与PAM相互作用。此处，PAM可根据II型CRISPR酶的来源而变化。例如，当CRISPR酶为SpCas9时，PAM可为5′-NGG-3′；当CRISPR酶为嗜热链球菌Cas9(StCas9)时，PAM可为5′-NNAGAAW-3(W＝A或T)；当CRISPR酶为金黄色葡萄球菌Cas9(SaCas9)时，PAM可为5′-NNGRR-3′(R＝A或G)；当CRISPR酶为脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides)Cas9(NmCas9)时，PAM可为5′-NNNNGATT-3′；并且当CRISPR酶为空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)Cas9(CjCas9)时，PAM可为5′-NNNVRYAC-3′(V＝G、C或A；R＝A或G；Y＝C或T)，其中N可为A、T、G或C；或A、U、G或C。尽管通常理解PAM是根据上述酶的来源而确定的，但根据对衍生自上述来源的酶的突变体的研究进展，PAM也可变化。
CRISPR酶可为具有切割靶基因或核酸的双链的功能的核酸酶或限制酶。
CRISPR酶可为完全活性CRISPR酶。
“完全活性”是指具有与野生型CRISPR酶的功能相同的功能，并且此状态下的CRISPR酶被称为完全活性CRISPR酶。此处，“野生型CRISPR酶的功能”是指具有切割DNA的双链的功能(即切割DNA的双链的第一链的第一功能以及切割DNA的双链的第二链的第二功能)的野生型CRISPR酶的状态。
完全活性CRISPR酶可为切割DNA的双链的野生型CRISPR酶。
完全活性CRISPR酶可为通过对切割DNA的双链的野生型CRISPR酶进行修饰或操纵而形成的CRISPR酶变体。
CRISPR酶变体可为通过在野生型CRISPR酶的氨基酸序列中去除一个或多个氨基酸或用不同的氨基酸置换一个或多个氨基酸而形成的酶。
CRISPR酶变体可为通过向野生型CRISPR酶的氨基酸序列添加一个或多个氨基酸而产生的酶。此处，添加的氨基酸可位于野生型酶的N-末端或C-末端，或野生型酶的氨基酸序列中。
CRISPR酶变体可为与野生型CRISPR酶相比具有改善的功能的完全活性酶。
例如，野生型CRISPR酶的特定修饰或工程化形式(即CRISPR酶变体)可在不结合至待切割的双链DNA或与其保持恒定距离的状态下切割双链DNA。在此情况下，与野生型CRISPR酶相比，修饰或工程化形式可为具有改善的功能活性的完全活性CRISPR酶。
CRISPR酶变体可为与野生型CRISPR酶相比具有减弱的功能的完全活性CRISPR酶。
例如，野生型CRISPR酶的特定修饰或工程化形式(即CRISPR酶变体)可在与待切割的双链DNA接近一定距离或与待切割的双链DNA形成特异性结合的状态下切割双链DNA。此处，特异性结合可为例如CRISPR酶变体的特定位点处的氨基酸与切割位点处的DNA核苷酸序列之间的结合。在此情况下，与野生型CRISPR酶相比，修饰或工程化形式可为具有减弱的功能活性的完全活性CRISPR酶。
CRISPR酶可为不完全活性或部分活性CRISPR酶。
“不完全活性或部分活性”是指具有一种选自于野生型CRISPR酶的功能(即切割DNA的双链的第一链的第一功能以及切割DNA的双链的第二链的第二功能)的状态。此状态下的CRISPR酶被称为不完全活性或部分活性CRISPR酶。另外，不完全活性或部分活性CRISPR酶可被称为切口酶(nickase)。
术语“切口酶”是指经工程化或修饰以仅切割靶基因或核酸的双链的一条链的CRISPR酶，并且切口酶具有切割单链(例如与靶基因或核酸的gRNA不互补或互补的链)的核酸酶活性。因此，为切割双链，需要两种切口酶的核酸酶活性。
切口酶可具有由CRISPR酶的RuvC结构域引起的核酸酶活性。即，切口酶可不包含由CRISPR酶的HNH结构域引起的核酸酶活性，为此，HNH结构域可被操纵或修饰。
在一个实例中，当CRISPR酶为II型CRISPR酶时，切口酶可为包含修饰的HNH结构域的II型CRISPR酶。
例如，当II型CRISPR酶为野生型SpCas9时，切口酶可为由于野生型SpCas9的氨基酸序列中位置840处的组氨酸突变为丙氨酸而具有HNH结构域的失活的核酸酶活性的SpCas9变体。由于由此产生的切口酶(即SpCas9变体)具有由RuvC结构域引起的核酸酶活性，可切割靶基因或核酸的非互补链，即不与gRNA互补结合的链。
又例如，当II型CRISPR酶为野生型CjCas9时，切口酶可为由于野生型CjCas9的氨基酸序列中位置559处的组氨酸突变为丙氨酸而具有HNH结构域的失活的核酸酶活性的CjCas9变体。由于由此产生的切口酶(即CjCas9变体)具有由RuvC结构域引起的核酸酶活性，可切割靶基因或核酸的非互补链，即不与gRNA互补结合的链。
此外，切口酶可具有由CRISPR酶的HNH结构域引起的核酸酶活性。即，切口酶可不包含由CRISPR酶的RuvC结构域引起的核酸酶活性，为此，RuvC结构域可被操纵或修饰。
在一个实例中，当CRISPR酶为II型CRISPR酶时，切口酶可为包含修饰的RuvC结构域的II型CRISPR酶。
例如，当II型CRISPR酶为野生型SpCas9时，切口酶可为由于野生型SpCas9的氨基酸序列中位置10处的天冬氨酸突变为丙氨酸而具有RuvC结构域的失活的核酸酶活性的SpCas9变体。由于由此产生的切口酶(即SpCas9变体)具有由HNH结构域引起的核酸酶活性，可切割靶基因或核酸的互补链，即与gRNA互补结合的链。
又例如，当II型CRISPR酶为野生型CjCas9时，切口酶可为由于野生型CjCas9的氨基酸序列中位置8处的天冬氨酸突变为丙氨酸而具有RuvC结构域的失活的核酸酶活性的CjCas9变体。由于由此产生的切口酶(即CjCas9变体)具有由HNH结构域引起的核酸酶活性，可切割靶基因或核酸的互补链，即与gRNA互补结合的链。
CRISPR酶可为失活CRISPR酶。
“失活”可意为野生型CRISPR酶的功能(即切割双链DNA的第一链的第一功能以及切割双链DNA的第二链的第二功能两者)丧失的状态。此状态下的CRISPR酶被称为失活CRISPR酶。
失活CRISPR酶可由于具有野生型CRISPR酶的核酸酶活性的结构域中的突变而具有核酸酶失活。
失活CRISPR酶可由于RuvC结构域和HNH结构域中的突变而具有核酸酶失活。即，失活CRISPR酶可不包含由CRISPR酶的RuvC结构域和HNH结构域引起的核酸酶活性，为此，RuvC结构域和HNH结构域可被操纵或修饰。
在一个实例中，当CRISPR酶为II型CRISPR酶时，失活CRISPR酶可为包含修饰的RuvC结构域和修饰的HNH结构域的II型CRISPR酶。
例如，当II型CRISPR酶为野生型SpCas9时，失活CRISPR酶可为SpCas9变体，所述SpCas9变体通过野生型SpCas9的氨基酸序列中位置10处的天冬氨酸和位置840处的组氨酸均突变为丙氨酸而具有RuvC结构域和HNH结构域的失活核酸酶活性。由于由此产生的失活CRISPR酶(即SpCas9变体)具有RuvC结构域和HNH结构域的失活核酸酶活性，靶基因或核酸的双链均不能被切割。
又例如，当II型CRISPR酶为野生型CjCas9时，失活CRISPR酶可为CjCas9变体，所述CjCas9变体通过野生型CjCas9的氨基酸序列中位置8处的天冬氨酸和位置559处的组氨酸均突变为丙氨酸而具有RuvC结构域和HNH结构域的失活核酸酶活性。由于由此产生的失活CRISPR酶(即CjCas9变体)具有RuvC结构域和HNH结构域的失活核酸酶活性，靶基因或核酸的双链均不能被切割。
除上述核酸酶活性外，CRISPR酶还可具有解旋酶活性，即解开双链核酸的螺旋结构的功能。
另外，CRISPR酶可被修饰，以具有完全活性、不完全活性或部分活性或失活的解旋酶活性。
根据本说明书的公开内容的示例性实施方式，CRISPR酶可为人工工程化CRISPR酶。
术语“人工工程化(人工修饰或操纵)”意为通过人工修饰形成的状态，而非天然发生的状态。此处，人工修饰可发生在编码CRISPR酶的核酸和/或其蛋白质中。此外，人工修饰包括在由编码CRISPR酶的核酸产生蛋白质的过程(即包括转录、转录后修饰、翻译和翻译后修饰在内的整个过程)中发生的可能的人工操纵的所有修饰。在下文中，可将非天然的人工工程化或修饰CRISPR酶与人工CRISPR酶或CRISPR酶变体(CRISPR酶突变体)互换使用。
人工工程化CRISPR酶可为具有修饰的野生型CRISPR酶的功能(即切割双链DNA的第一链的第一功能和/或切割双链DNA的第二链的第二功能)的CRISPR酶变体。
例如，CRISPR酶变体可处于其中野生型CRISPR酶的功能的第一功能丧失的形式。
或者，CRISPR酶变体可处于其中野生型CRISPR酶的功能的第一功能改善的形式。
例如，CRISPR酶变体可处于其中野生型CRISPR酶的功能的第二功能丧失的形式。
或者，CRISPR酶变体可处于其中野生型CRISPR酶的功能的第二功能改善的形式。
例如，CRISPR酶变体可处于其中野生型CRISPR酶的所有功能(即第一功能和第二功能)丧失的形式。
或者，CRISPR酶变体可处于其中野生型CRISPR酶的所有功能(即第一功能和第二功能)改善的形式。
或者，CRISPR酶变体可处于其中野生型CRISPR酶的功能中的第一功能丧失而第二功能改善的形式。
或者，CRISPR酶变体可处于其中野生型CRISPR酶的功能中的第一功能改善而第二功能丧失的形式。
人工工程化CRISPR酶可通过与gRNA相互作用形成gRNA-CRISPR酶复合体。
此处，人工工程化CRISPR酶可为被修饰以具有野生型CRISPR酶的与gRNA相互作用的功能的CRISPR酶变体。
例如，与野生型CRISPR酶相比，CRISPR酶变体可处于具有减少的与gRNA的相互作用的形式。
或者，与野生型CRISPR酶相比，CRISPR酶变体可处于具有增加的与gRNA的相互作用的形式。
例如，CRISPR酶变体可处于具有减少的与gRNA的相互作用并同时具有野生型CRISPR酶的第一功能的形式。
或者，CRISPR酶变体可处于具有增加的与gRNA的相互作用并同时具有野生型CRISPR酶的第一功能的形式。
例如，CRISPR酶变体可处于具有减少的与gRNA的相互作用并同时具有野生型CRISPR酶的第二功能的形式。
或者，CRISPR酶变体可处于具有增加的与gRNA的相互作用并同时具有野生型CRISPR酶的第二功能的形式。
例如，CRISPR酶变体可处于具有减少的与gRNA的相互作用并同时不具有野生型CRISPR酶的第一功能和第二功能的形式。
或者，CRISPR酶变体可处于具有增加的与gRNA的相互作用并同时不具有野生型CRISPR酶的第一功能和第二功能的形式。
此处，各种gRNA-CRISPR酶复合体可根据gRNA与CRISPR酶变体之间的相互作用强度而形成，并且根据CRISPR酶变体而在接近或切割靶序列的功能中具有差异。
例如，仅当由具有减少的与gRNA的相互作用的CRISPR酶变体形成的gRNA-CRISPR酶复合体变得非常接近或定位于完全互补结合至gRNA的靶序列时，可切割靶序列的双链或单链。
本文公开的人工工程化CRISPR酶可为通过修饰野生型CRISPR酶的氨基酸序列的至少一个氨基酸而形成的CRISPR酶变体。
CRISPR酶变体可处于其中野生型CRISPR酶的氨基酸序列中去除至少一个氨基酸的形式。
在一个实例中，CRISPR酶变体可处于其中野生型CRISPR酶的带正电荷的氨基酸中去除一个或多个氨基酸的形式。
在另一实例中，CRISPR酶变体可处于其中野生型CRISPR酶的带负电荷的氨基酸中去除一个或多个氨基酸的形式。
在又一实例中，CRISPR酶变体可处于其中野生型CRISPR酶的不带电荷的氨基酸(或非带电荷的氨基酸)中去除一个或多个氨基酸的形式。
在又一实例中，CRISPR酶变体可处于其中野生型CRISPR酶的带正电荷的氨基酸、带负电荷的氨基酸和不带电荷的氨基酸中去除一个或多个氨基酸的形式。
CRISPR酶变体可处于其中用不同的氨基酸置换选自于野生型CRISPR酶的氨基酸序列中的至少一个氨基酸的形式。
此处，不同的氨基酸(即置换的氨基酸)可为选自于以下氨基酸中的一种氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
此处，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸可以以它们自身或它们的化学修饰形式(包括甲基化、乙酰化和磷酸化)使用。
在一个实例中，CRISPR酶变体可处于其中用不同的氨基酸置换选自于野生型CRISPR酶的带正电荷的氨基酸中的一个或多个氨基酸的形式。此处，不同的氨基酸可为选自于所选择的一个或多个氨基酸的立体异构体、其它带正电荷的氨基酸、带负电荷的氨基酸和非带电荷的氨基酸中的一个或多个氨基酸。
在另一实例中，CRISPR酶变体可处于其中用不同的氨基酸置换野生型CRISPR酶的带负电荷的氨基酸中的一个或多个氨基酸的形式。此处，不同的氨基酸可为选自于所选择的一个或多个氨基酸的立体异构体、带正电荷的氨基酸、其它带负电荷的氨基酸和非带电荷的氨基酸中的一个或多个氨基酸。
在又一实例中，CRISPR酶变体可处于其中用不同的氨基酸置换野生型CRISPR酶的非带电荷的氨基酸中的一个或多个氨基酸的形式。此处，不同的氨基酸可为选自于所选择的一个或多个氨基酸的立体异构体、其它非带电荷的氨基酸、带正电荷的氨基酸和带负电荷的氨基酸中的一个或多个氨基酸。
在又一实例中，CRISPR酶变体可处于其中用不同的氨基酸置换野生型CRISPR酶的带正电荷、带负电荷和非带电荷的氨基酸中的一个或多个氨基酸的形式。此处，不同的氨基酸可为选自于所选择的一个或多个氨基酸的立体异构体、带正电荷的氨基酸、带负电荷的氨基酸和非带电荷的氨基酸中的一个或多个氨基酸。
CRISPR酶变体可处于其中野生型CRISPR酶的氨基酸序列中至少一个氨基酸被置换或去除的形式。
本文公开的人工工程化CRISPR酶可为通过将至少一个氨基酸添加至野生型CRISPR酶的氨基酸序列而形成的CRISPR酶变体。
与野生型CRISPR酶的氨基酸序列相比，CRISPR酶变体可处于其中添加至少一个氨基酸的形式。
或者，CRISPR酶变体可处于其中至少一个功能性结构域被添加至野生型CRISPR酶的氨基酸序列的形式。
此处，功能性结构域可由一个或多个氨基酸组成，并且可为肽或多肽。
此处，功能性结构域可为除野生型CRISPR酶的原始功能(例如切割双链DNA的第一链的第一功能以及切割双链DNA的第二链的第二功能)外还具有额外功能的结构域。
或者，功能性结构域可为具有与野生型CRISPR酶的原始功能(例如切割双链DNA的第一链的第一功能以及切割双链DNA的第二链的第二功能)相似的功能的结构域。
在一个实例中，功能性结构域可为具有甲基化酶活性、脱甲基化酶活性、转录活化活性、转录抑制活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA切割活性或核酸结合活性的结构域。
在另一实例中，功能性结构域可为用于蛋白质(包括肽)的分离和纯化的标签或报告基因。此处，标签包括组氨酸(His)标签、V5标签、FLAG标签、流感血细胞凝集素(HA)标签、Myc标签、VSV-G标签和硫氧还蛋白(Trx)标签等；并且报告基因包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶(β-glucoronidase)、萤光素酶(luciferase)、自发荧光蛋白(包括绿色荧光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和蓝色荧光蛋白(BFP))，但本发明不限于此。
在又一实例中，功能性结构域可为脱氨酶。
例如，不完全或部分CRISPR酶可额外包含胞苷脱氨酶作为功能性结构域。或者，不完全或部分CRISPR酶可额外包含腺嘌呤脱氨酶作为功能性结构域。
在又一实例中，功能性结构域可为核定位序列或信号(NLS)或核输出序列或信号(NES)。
例如，CRISPR酶可包含一个或多个NLS。此处，可在以下位置处包含一个或多个NLS：CRISPR酶的N-末端或其附近；CRISPR酶的C-末端或其附近；或它们的组合。NLS可为衍生自以下NLS的NLS序列，但本发明不限于此：具有氨基酸序列PKKKRKV(SEQ ID NO：12)的SV40病毒大T抗原的NLS；来自核质蛋白的NLS(例如具有序列KRPAATKKAGQAKKKK(SEQ IDNO：13)的核质蛋白二分体(nucleoplasmin bipartite)NLS)；具有氨基酸序列PAAKRVKLD(SEQ ID NO：14)或RQRRNELKRSP(SEQ ID NO：15)的c-myc NLS；具有序列NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY(SEQ ID NO：16)的hRNPA1 M9 NLS；来自输入蛋白-α(importin-α)的IBB结构域的序列RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV(SEQ ID NO：17)；肌瘤T蛋白的序列VSRKRPRP(SEQ ID NO：18)和PPKKARED(SEQ ID NO：19)；人p53的序列PQPKKKPL(SEQ ID NO：20)；小鼠c-ab1 IV的序列SALIKKKKKMAP(SEQ ID NO：21)；流感病毒NS1的序列DRLRR(SEQ ID NO：22)和PKQKKRK(SEQ ID NO：23)；丁型肝炎病毒抗原的序列RKLKKKIKKL(SEQID NO：24)；小鼠Mx1蛋白的序列REKKKFLKRR(SEQ ID NO：25)；人聚(ADP-核糖)聚合酶的序列KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(SEQ ID NO：26)；或类固醇激素受体(人)糖皮质激素的序列RKCLQAGMNLEARKTKK(SEQ ID NO：27)。
人工工程化CRISPR酶可为通过修饰野生型CRISPR酶的特定区域的氨基酸序列中的至少一个氨基酸而形成的CRISPR酶变体。
人工工程化CRISPR酶可为通过将一个或多个氨基酸添加至野生型CRISPR酶的特定区域而形成的CRISPR酶变体。
此处，野生型CRISPR酶的特定区域可为选自于第一区域、第二区域、第三区域和第四区域中的一个或多个区域。
第一区域可为与gRNA相互作用的野生型CRISPR酶的部分。
第一区域可为与靶序列相互作用的野生型CRISPR酶的部分。
第一区域可为与gRNA-靶序列异源双链相互作用的野生型CRISPR酶的部分。
第一区域可为与gRNA-靶序列异源双链的PAM远端相互作用的野生型CRISPR酶的部分。
此处，gRNA-靶序列异源双链的PAM远端可意为远离PAM位置的gRNA-靶序列异源双链的末端处的6-10个碱基对，其为gRNA的6-10个碱基的序列以及互补结合至gRNA的靶序列的6-10个碱基的序列。
第一区域可为位于野生型CRISPR酶的REC叶中的区域。
第一区域可为野生型CRISPR酶的REC结构域的全部或部分。
第二区域可为具有野生型CRISPR酶的第一功能或第二功能的野生型CRISPR酶的部分。
第二区域可为位于野生型CRISPR酶的NUC叶中的区域。
第二区域可为野生型CRISPR酶的RuvC结构域的全部或部分。
第二区域可为包含野生型CRISPR酶的RuvC结构域的金属依赖性核酸切割区域的RuvC结构域的部分。
此处，RuvC结构域的金属依赖性核酸切割区域可意为RuvC结构域中能够通过与金属相互作用而切割靶位置处的核酸之间的结合的区域。
金属依赖性核酸切割区域可由与金属相互作用的部分以及能够切割靶位置处的核酸之间的结合的部分组成。
第三区域可为具有野生型CRISPR酶的第一功能或第二功能的野生型CRISPR酶的部分。
第三区域可为位于野生型CRISPR酶的NUC叶中的区域。
第三区域可为野生型CRISPR酶的HNH结构域的全部或部分。
第三区域可为包含野生型CRISPR酶的HNH结构域的金属依赖性核酸切割区域的HNH结构域的部分。
此处，HNH结构域的金属依赖性核酸切割区域可意为HNH结构域中能够通过与金属相互作用而切割靶位置处的核酸之间的结合的区域。
第四区域可为可识别靶基因或核酸中的特定核苷酸序列(即前间区序列临近基序(PAM))的野生型CRISPR酶的部分。
第四区域可为与靶基因或核酸中的特定核苷酸序列(即PAM)相互作用的野生型CRISPR酶的部分。
第四区域可为与gRNA的核苷酸序列的一部分相互作用的野生型CRISPR酶的部分。
第四区域可为位于野生型CRISPR酶的NUC叶中的区域。
第四区域可为野生型CRISPR酶的PI结构域的全部或部分。
人工工程化CRISPR酶可为通过修饰选自于野生型CRISPR酶的第一区域、第二区域、第三区域和第四区域中的一个或多个区域的氨基酸序列中的至少一个氨基酸而形成的CRISPR酶变体。
CRISPR酶变体可处于其中野生型CRISPR酶的第一区域的氨基酸序列中的至少一个氨基酸被修饰的形式。
CRISPR酶变体可处于其中野生型CRISPR酶的第二区域的氨基酸序列中的至少一个氨基酸被修饰的形式。
CRISPR酶变体可处于其中野生型CRISPR酶的第三区域的氨基酸序列中的至少一个氨基酸被修饰的形式。
CRISPR酶变体可处于其中野生型CRISPR酶的第四区域的氨基酸序列中的至少一个氨基酸被修饰的形式。
CRISPR酶变体可处于其中野生型CRISPR酶的第一区域和第二区域的氨基酸序列中的至少两个氨基酸被修饰的形式。此处，两个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
CRISPR酶变体可处于其中野生型CRISPR酶的第一区域和第三区域的氨基酸序列中的至少两个氨基酸被修饰的形式。此处，两个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
CRISPR酶变体可处于其中野生型CRISPR酶的第一区域和第四区域的氨基酸序列中的至少两个氨基酸被修饰的形式。此处，两个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
CRISPR酶变体可处于其中野生型CRISPR酶的第二区域和第三区域的氨基酸序列中的至少两个氨基酸被修饰的形式。此处，两个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
CRISPR酶变体可处于其中野生型CRISPR酶的第二区域和第四区域的氨基酸序列中的至少两个氨基酸被修饰的形式。此处，两个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
CRISPR酶变体可处于其中野生型CRISPR酶的第三区域和第四区域的氨基酸序列中的至少两个氨基酸被修饰的形式。此处，两个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
CRISPR酶变体可处于其中野生型CRISPR酶的第一区域、第二区域和第三区域的氨基酸序列中的至少三个氨基酸被修饰的形式。此处，三个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
CRISPR酶变体可处于其中野生型CRISPR酶的第一区域、第二区域和第四区域的氨基酸序列中的至少三个氨基酸被修饰的形式。此处，三个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
CRISPR酶变体可处于其中野生型CRISPR酶的第一区域、第三区域和第四区域的氨基酸序列中的至少三个氨基酸被修饰的形式。此处，三个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
CRISPR酶变体可处于其中野生型CRISPR酶的第二区域、第三区域和第四区域的氨基酸序列中的至少三个氨基酸被修饰的形式。此处，三个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
CRISPR酶变体可处于其中野生型CRISPR酶的第一区域、第二区域、第三区域和第四区域的氨基酸序列中的至少四个氨基酸被修饰的形式。此处，四个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
CRISPR酶变体可包含选自于一个或多个区域中的至少一个氨基酸的修饰。
此处，修饰可为所选择的一个或多个氨基酸的删除。
此处，修饰可为用不同的氨基酸置换所选择的一个或多个氨基酸。
在一个实例中，不同的氨基酸可为所选择的氨基酸的立体异构体。
例如，修饰可为用D-谷氨酰胺置换位于野生型CRISPR酶的第一区域中的L-谷氨酰胺。
在另一实例中，不同的氨基酸可为具有比所选择的氨基酸的亲水指数更低的亲水指数的氨基酸。
例如，修饰可为用具有更低的亲水指数(-0.4)的甘氨酸置换位于野生型CRISPR酶的第二区域中的苯丙氨酸(亲水指数：2.8)。
在另一实例中，不同的氨基酸可为具有比所选择的氨基酸的亲水指数更高的亲水指数的氨基酸。
例如，修饰可为用具有更高的亲水指数(3.8)的亮氨酸置换位于野生型CRISPR酶的第一区域中的丝氨酸(亲水指数：-0.8)。
在一个实例中，不同的氨基酸可为具有比所选择的氨基酸的功能性基团更小的功能性基团的氨基酸。
例如，修饰可为用具有比缬氨酸的功能性基团更小的功能性基团的丙氨酸置换位于野生型CRISPR酶的第三区域中的缬氨酸。
在另一实例中，不同的氨基酸可为具有比所选择的氨基酸的功能性基团更大的功能性基团的氨基酸。
例如，修饰可为用具有比甘氨酸的功能性基团更大的功能性基团的组氨酸置换位于野生型CRISPR酶的第二区域中的甘氨酸。
在一个实例中，不同的氨基酸可为具有比所选择的氨基酸的疏水性更高的疏水性的氨基酸。
例如，修饰可为用苏氨酸(Kyte-Doolittle疏水性：-0.7)置换位于野生型CRISPR酶的第一区域中的天冬酰胺(Kyte-Doolittle疏水性：-3.5)。
在另一实例中，不同的氨基酸可为具有比所选择的氨基酸的疏水性更低的疏水性的氨基酸。
例如，修饰可为用脯氨酸(Kyte-Doolittle疏水性：-1.6)置换位于野生型CRISPR酶的第四区域中的半胱氨酸(Kyte-Doolittle疏水性：2.5)。
在一个实例中，不同的氨基酸可为比所选择的氨基酸更大的氨基酸。
例如，修饰可为用色氨酸(分子量(m.w.)：204.228)置换位于野生型CRISPR酶的第三区域中的赖氨酸(m.w.：146.189)。
在另一实例中，不同的氨基酸可为比所选择的氨基酸更小的氨基酸。
例如，修饰可为用谷氨酸(m.w.：147.131)置换位于野生型CRISPR酶的第二区域中的苯丙氨酸(m.w.：165.192)。
修饰可为用相同数目的其它氨基酸置换所选择的一个或多个氨基酸。
例如，修饰可为用一个甘氨酸置换位于野生型CRISPR酶的第一区域中的一个丙氨酸。或者，修饰可为分别用一个亮氨酸(第一区域)和一个丝氨酸(第四区域)置换位于野生型CRISPR酶的第一区域中的一个精氨酸和位于野生型CRISPR酶的第四区域中的一个组氨酸。或者，修饰可为分别用一个苯丙氨酸(即总计三个苯丙氨酸)置换位于野生型CRISPR酶的第二区域中的一个精氨酸和一个缬氨酸以及位于野生型CRISPR酶的第三区域中的一个亮氨酸。
修饰可为用不同数目的其它氨基酸置换所选择的一个或多个氨基酸。
例如，修饰可为用半胱氨酸-丙氨酸-丙氨酸(即总计三个氨基酸)置换位于野生型CRISPR酶的第二区域中的一个亮氨酸。或者，修饰可为分别用蛋氨酸-缬氨酸(第一区域)和脯氨酸(第三区域)置换位于野生型CRISPR酶的第一区域中的一个组氨酸和位于野生型CRISPR酶的第三区域中的两个连续氨基酸(丙氨酸-谷氨酰胺)。或者，修饰可为分别用丙氨酸(第一区域)、蛋氨酸-脯氨酸(第二区域)以及半胱氨酸-丙氨酸-苏氨酸-缬氨酸(第三区域)置换位于野生型CRISPR酶的第一区域中的一个谷氨酸、位于野生型CRISPR酶的第二区域中的三个连续氨基酸(丙氨酸-亮氨酸-组氨酸)以及位于野生型CRISPR酶的第三区域中的两个连续氨基酸(色氨酸-丝氨酸)。
人工工程化CRISPR酶可为通过将至少一个氨基酸添加至选自于野生型CRISPR酶的第一区域、第二区域、第三区域和第四区域中的一个或多个区域中而形成的CRISPR酶变体。
此处，添加可为将一个或多个氨基酸添加至存在于所选择的一个或多个区域中的一个或多个氨基酸的N-末端和/或C-末端位置。
在一个实例中，添加可为将一个或多个具有正电荷的氨基酸添加至存在于所选择的一个或多个区域中的一个或多个氨基酸的N-末端和/或C-末端位置。
例如，添加可为将一个精氨酸添加至所选择的位于第一区域中的一个丙氨酸的C-末端。或者，添加可为将两个氨基酸(组氨酸-赖氨酸)添加至所选择的位于第三区域中的谷氨酸的N-末端。
在另一实例中，添加可为将一个或多个具有负电荷的氨基酸添加至存在于所选择的一个或多个区域中的一个或多个氨基酸的N-末端和/或C-末端位置。
例如，添加可为将一个天冬氨酸添加至所选择的位于第二区域中的一个苏氨酸的N-末端。或者，添加可为将三个氨基酸(谷氨酸-天冬氨酸-谷氨酸)添加至所选择的位于第四区域中的组氨酸的C-末端。
在又一实例中，添加可为将一个或多个不具有电荷的氨基酸添加至存在于所选择的一个或多个区域中的一个或多个氨基酸的N-末端和/或C-末端位置。
例如，添加可为将两个氨基酸(丝氨酸-缬氨酸)添加至所选择的位于第二区域中的一个半胱氨酸的C-末端。或者，添加可为将五个氨基酸(甘氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺-苯丙氨酸-亮氨酸)添加至所选择的位于第三区域中的赖氨酸的N-末端。
在另一实例中，添加可为将选自于带正电荷的氨基酸、带负电荷的氨基酸以及非带电荷的氨基酸中的一个或多个氨基酸添加至存在于所选择的一个或多个区域中的一个或多个氨基酸的N-末端和/或C-末端位置。
例如，添加可为将6个氨基酸(组氨酸-精氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丙氨酸-谷氨酸)添加至所选择的位于第一区域中的一个精氨酸的C-末端。或者，添加可为将10个氨基酸(赖氨酸-赖氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-谷氨酰胺-苏氨酸-蛋氨酸-半胱氨酸-天冬氨酸-丝氨酸)添加至所选择的位于第四区域中的一个甘氨酸的N-末端。
添加可为将一个或多个功能性结构域添加至存在于所选择的一个或多个区域中的一个或多个氨基酸的N-末端和/或C-末端位置。
此处，功能性结构域可为除野生型CRISPR酶的原始功能(其为切割双链DNA的第一链的第一功能以及切割双链DNA的第二链的第二功能)外还具有额外功能的结构域。
或者，功能性结构域可为具有与野生型CRISPR酶的原始功能(例如切割双链DNA的第一链的第一功能以及切割双链DNA的第二链的第二功能)相似的功能的结构域。
在一个实例中，功能性结构域可为具有甲基化酶活性、脱甲基化酶活性、转录活化活性、转录抑制活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA切割活性或核酸结合活性的结构域。
在另一实例中，功能性结构域可为用于蛋白质(包括肽)的分离和纯化的标签或报告基因。此处，标签包括组氨酸(His)标签、V5标签、FLAG标签、流感血细胞凝集素(HA)标签、Myc标签、VSV-G标签和硫氧还蛋白(Trx)标签等；并且报告基因包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、萤光素酶和自发荧光蛋白(包括绿色荧光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和蓝色荧光蛋白(BFP))，但本发明不限于此。
在另一实例中，功能性结构域可为脱氨酶。此处，脱氨酶可为腺嘌呤脱氨酶和/或胞苷脱氨酶。
在另一实例中，功能性结构域可为核定位序列或信号(NLS)或核输出序列或信号(NES)。
在本文公开的公开内容的一个示例性实施方式中，人工工程化CRISPR酶可为人工工程化Cas9。
人工工程化Cas9可为通过修饰野生型Cas9的特定区域的氨基酸序列中的至少一个氨基酸而形成的Cas9变体。
人工工程化Cas9可为通过将至少一个氨基酸添加至野生型Cas9的特定区域而形成的Cas9变体。
此处，野生型Cas9的特定区域可为选自于第一区域、第二区域、第三区域和第四区域中的一个或多个区域。
第一区域可为与gRNA相互作用的野生型Cas9的部分。
第一区域可为与靶序列相互作用的野生型Cas9的部分。
第一区域可为与gRNA-靶序列异源双链相互作用的野生型Cas9的部分。
第一区域可为与gRNA-靶序列异源双链的PAM远端相互作用的野生型Cas9的部分。
此处，gRNA-靶序列异源双链的PAM远端可意为远离PAM位置的gRNA-靶序列异源双链的末端处的6-10个碱基对，其为gRNA的6-10个碱基的序列以及互补结合至gRNA的靶序列的6-10个碱基的序列。
第一区域可为位于野生型Cas9的REC叶中的区域。
第一区域可为野生型Cas9的REC结构域的全部或部分。
第一区域可为由野生型Cas9的REC结构域的C-末端处的300个氨基酸组成的区域。
第一区域可为由野生型Cas9的REC结构域的N-末端处的220个氨基酸组成的区域。
在一个实例中，当野生型Cas9为野生型SpCas9(SEQ ID NO：1)时，
第一区域可为野生型SpCas9的第94位的天冬氨酸(D94)至第717位的甘氨酸(G717)的氨基酸序列的全部或部分。
在一个示例性实施方式中，第一区域可为野生型SpCas9的第196位的苯丙氨酸(F196)至第282位的异亮氨酸(I282)的氨基酸序列(区域1-1，SEQ ID NO：2)。
在另一示例性实施方式中，第一区域可为野生型SpCas9的第316位的脯氨酸(P316)至第394位的天冬酰胺(N394)的氨基酸序列(区域1-2，SEQ ID NO：3)。
在另一示例性实施方式中，第一区域可为野生型SpCas9的第510位的赖氨酸(K510)至第612位的天冬酰胺(N612)的氨基酸序列(区域1-3，SEQ ID NO：4)。
在又一示例性实施方式中，第一区域可为野生型SpCas9的第678位的苏氨酸(T678)至第698位的组氨酸(H698)的氨基酸序列(区域1-4，SEQ ID NO：5)。
在一个示例性实施方式中，第一区域可为选自于以下氨基酸序列中的两个区域：野生型SpCas9的第196位的苯丙氨酸(F196)至第282位的异亮氨酸(I282)的氨基酸序列(区域1-1)、野生型SpCas9的第316位的脯氨酸(P316)至第394位的天冬酰胺(N394)的氨基酸序列(区域1-2)、野生型SpCas9的第510位的赖氨酸(K510)至第612的天冬酰胺(N612)的氨基酸序列(区域1-3)以及野生型SpCas9的第678位的苏氨酸(T678)至第698位的组氨酸(H698)的氨基酸序列(区域1-4)。
在另一示例性实施方式中，第一区域可为选自于以下氨基酸序列中的三个区域：野生型SpCas9的第196位的苯丙氨酸(F196)至第282位的异亮氨酸(I282)的氨基酸序列(区域1-1)、野生型SpCas9的第316位的脯氨酸(P316)至第394位的天冬酰胺(N394)的氨基酸序列(区域1-2)、野生型SpCas9的第510位的赖氨酸(K510)至第612的天冬酰胺(N612)的氨基酸序列(区域1-3)以及野生型SpCas9的第678位的苏氨酸(T678)至第698位的组氨酸(H698)的氨基酸序列(区域1-4)。
在另一示例性实施方式中，第一区域可为以下氨基酸序列：野生型SpCas9的第196位的苯丙氨酸(F196)至第282位的异亮氨酸(I282)的氨基酸序列(区域1-1)、野生型SpCas9的第316位的脯氨酸(P316)至第394位的天冬酰胺(N394)的氨基酸序列(区域1-2)、野生型SpCas9的第510位的赖氨酸(K510)至第612的天冬酰胺(N612)的氨基酸序列(区域1-3)以及野生型SpCas9的第678位的苏氨酸(T678)至第698位的组氨酸(H698)的氨基酸序列(区域1-4)。
在另一实例中，当野生型Cas9为野生型SaCas9时，
第一区域可为野生型SaCas9的第75位的天冬酰胺(N75)至第426位的赖氨酸(K426)的氨基酸序列的全部或部分。
在一个示例性实施方式中，第一区域可为野生型SaCas9的第207位的苏氨酸(T207)至第426位的赖氨酸(K426)的氨基酸序列。
第二区域可为具有野生型Cas9的第一功能或第二功能的野生型Cas9的部分。
第二区域可为位于野生型Cas9的NUC叶中的区域。
第二区域可为野生型Cas9的RuvC结构域的全部或部分。
第二区域可为包含野生型Cas9的金属依赖性核酸切割区域的RuvC结构域的部分。
此处，RuvC结构域的金属依赖性核酸切割区域可意为RuvC结构域中能够通过与金属相互作用而切割靶位置处的核酸之间的结合的区域。
金属依赖性核酸切割区域可由与金属相互作用的部分以及切割靶位置处的核酸之间的结合的部分组成。
在一个实例中，当野生型Cas9为野生型SpCas9时，
第二区域可为野生型SpCas9的第1位的蛋氨酸(M1)至第59位的丙氨酸(A59)的氨基酸序列(RuvC I区域)的全部或部分。
第二区域可为野生型SpCas9的第718位的天冬氨酸(D718)至第774位的谷氨酰胺(Q774)的氨基酸序列(RuvC II区域)的全部或部分。
第二区域可为野生型SpCas9的第909位的丝氨酸(S909)至第1098位的苏氨酸(T1098)的氨基酸序列(RuvC III区域)的全部或部分。
第二区域可为野生型SpCas9的RuvC I区域、RuvC II区域和/或RuvC III区域。
在一个示例性实施方式中，第二区域可为野生型SpCas9的第1位的蛋氨酸(M1)至第22位的苏氨酸(T22)的氨基酸序列(区域2-1，SEQ ID NO：6)。
在另一示例性实施方式中，第二区域可为野生型SpCas9的第731位的脯氨酸(P731)至第770位的苏氨酸(T770)的氨基酸序列(区域2-2，SEQ ID NO：7)。
在又一示例性实施方式中，第二区域可为野生型SpCas9的第926位的谷氨酰胺(Q926)至第1040位的丝氨酸(S1040)的氨基酸序列(区域2-3，SEQ ID NO：8)。
在示例性实施方式中，第二区域可为野生型SpCas9的第1位的蛋氨酸(M1)至第22位的苏氨酸(T22)的氨基酸序列(区域2-1)以及野生型SpCas9的第731位的脯氨酸(P731)至第770位的苏氨酸(T770)的氨基酸序列(区域2-2)。
在另一示例性实施方式中，第二区域可为野生型SpCas9的第1位的蛋氨酸(M1)至第22位的苏氨酸(T22)的氨基酸序列(区域2-1)以及野生型SpCas9的第926位的谷氨酰胺(Q926)至第1040位的丝氨酸(S1040)的氨基酸序列(区域2-3)。
在另一示例性实施方式中，第二区域可为野生型SpCas9的第731位的脯氨酸(P731)至第770位的苏氨酸(T770)的氨基酸序列(区域2-2)以及野生型SpCas9的第926位的谷氨酰胺(Q926)至第1040位的丝氨酸(S1040)的氨基酸序列(区域2-3)。
在又一示例性实施方式中，第二区域可为野生型SpCas9的第1位的蛋氨酸(M1)至第22位的苏氨酸(T22)的氨基酸序列(区域2-1)、野生型SpCas9的第731位的脯氨酸(P731)至第770位的苏氨酸(T770)的氨基酸序列(区域2-2)以及野生型SpCas9的第926位的谷氨酰胺(Q926)至第1040位的丝氨酸(S1040)的氨基酸序列(区域2-3)。
在另一实例中，当野生型Cas9为野生型SaCas9时，
第二区域可为野生型SaCas9的第1位的蛋氨酸(M1)至第41位的缬氨酸(V41)的氨基酸序列(RuvC I区域)的全部或部分。
第二区域可为野生型SaCas9的第436位的异亮氨酸(I436)至第481位的谷氨酸(E481)的氨基酸序列(RuvC II区域)的全部或部分。
第二区域可为野生型SaCas9的第651位的酪氨酸(Y651)至第775位的缬氨酸(V775)的氨基酸序列(RuvC III区域)的全部或部分。
第二区域可为野生型SaCas9的RuvC I区域、RuvC II区域和/或RuvC III区域。
在一个示例性实施方式中，第二区域可为野生型SaCas9的第1位的蛋氨酸(M1)至第25位的苏氨酸(T25)的氨基酸序列(区域2-1)。
在另一示例性实施方式中，第二区域可为野生型SaCas9的第471位的脯氨酸(P471)至第481位的谷氨酸(E481)的氨基酸序列(区域2-2)。
在又一示例性实施方式中，第二区域可为野生型SaCas9的第667位的天冬酰胺(N667)至第740位的丝氨酸(S740)的氨基酸序列(区域2-3)。
第三区域可为具有野生型Cas9的第一功能或第二功能的野生型Cas9的部分。
第三区域可为位于野生型Cas9的NUC叶中的区域。
第三区域可为野生型Cas9的HNH结构域的全部或部分。
第三区域可为包含野生型Cas9的金属依赖性核酸切割区域的HNH结构域的全部或部分。
此处，HNH结构域的金属依赖性核酸切割区域可意为HNH结构域中能够通过与金属相互作用而切割靶位置处的核酸之间的结合的区域。
在一个实例中，当野生型Cas9为野生型SpCas9时，
第三区域可为野生型SpCas9的第775位的赖氨酸(K775)至第908位的亮氨酸(L908)的氨基酸序列的全部或部分。
在一个示例性实施方式中，第三区域可为野生型SpCas9的第775位的赖氨酸(K775)至第900位的亮氨酸(L900)的氨基酸序列(区域3-1，SEQ ID NO：9)。
在另一实例中，当野生型Cas9为野生型SaCas9时，
第三区域可为野生型SaCas9的第521位的异亮氨酸(I521)至第629位的谷氨酸(E629)的氨基酸序列的全部或部分。
在一个示例性实施方式中，第三区域可为野生型SaCas9的第523位的赖氨酸(K523)至第627位的亮氨酸(L627)的氨基酸序列(区域3-1)。
第四区域可为可识别靶基因或核酸中的特定核苷酸序列(即PAM)的野生型Cas9的部分。
第四区域可为与靶基因或核酸中的特定核苷酸序列(即PAM)相互作用的野生型Cas9的部分。
第四区域可为与gRNA的核苷酸序列的一部分相互作用的野生型Cas9的部分。
第四区域可为位于野生型Cas9的NUC叶中的区域。
第四区域可为野生型Cas9的PI结构域的全部或部分。
在一个实例中，当野生型Cas9为野生型SpCas9时，
第四区域可为野生型SpCas9的第1099位的谷氨酸(E1099)至第1368位的天冬氨酸(D1368)的氨基酸序列的全部或部分。
在一个示例性实施方式中，第四区域可为野生型SpCas9的第1099位的谷氨酸(E1099)至第1139位的缬氨酸(V1139)的氨基酸序列(区域4-1，SEQ ID NO：10)。
在另一实例中，当野生型Cas9为野生型SaCas9时，
第四区域可为野生型SaCas9的第910位的赖氨酸(K910)至第1053位的甘氨酸(G1053)的氨基酸序列的全部或部分。
在一个示例性实施方式中，第四区域可为野生型SaCas9的第910位的赖氨酸(K910)至第970位的天冬氨酸(D970)的氨基酸序列(区域4-1)。
人工工程化Cas9可为通过修饰选自于野生型Cas9的第一区域、第二区域、第三区域和第四区域中的一个或多个区域的氨基酸序列中的至少一个氨基酸而形成的Cas9变体。
Cas9变体可处于其中选自于野生型Cas9的第一区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸被修饰的形式。
在一个实例中，当野生型Cas9为野生型SpCas9时，
SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的第一区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸被修饰的形式。
在一个示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域1-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸被修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为具有选自于以下氨基酸(其为野生型SpCas9的区域1-1的具有脂肪族或酰胺基功能性基团的氨基酸)中的一个或多个氨基酸的修饰的形式：
N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281和I282。
在另一示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域1-2的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸被修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸(其为野生型SpCas9的区域1-2的非极性氨基酸)所组成的组中的一个或多个氨基酸的修饰的形式：P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391和L393。
在一个示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域1-3的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸被修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由野生型SpCas9的区域1-3的K510，Y515，F539，G582，V583，E584，D585，N588和I601所组成的组中的一个或多个氨基酸的修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸(其为野生型SpCas9的区域1-3的非极性氨基酸)所组成的组中的一个或多个氨基酸的修饰的形式：L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606和L607。
在又一个示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域1-4的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸被修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由野生型SpCas9的区域1-4的N692、M694、Q695和H698所组成的组中的一个或多个氨基酸的修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由非极性氨基酸(即野生型SpCas9的区域1-4的I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696和I697)所组成的组中的一个或多个氨基酸的修饰的形式。
在又一示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和区域1-4的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。此处，所选择的两个或更多个氨基酸可分别位于不同的区域。或者，所选择的两个或更多个氨基酸可位于相同的区域。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和区域1-4的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，1548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696和I697。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和区域1-4的A203，N277，G366，K510，Y515，F539，G582，V583，E584，D585，N588，I601，N692，M694，Q695和H698。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域1-3和区域1-4的K510，Y515，F539，G582，V583，E584，D585，N588，I601，N692，M694，Q695和H698。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由非极性氨基酸(即野生型SpCas9的区域1-3和区域1-4的L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696和I697)所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式。
在另一示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和区域1-4的氨基酸序列中的三个或更多个氨基酸被修饰的形式。此处，所选择的三个或更多个氨基酸可分别位于不同的区域。或者，所选择的三个或更多个氨基酸可位于相同的区域。或者，所选择的三个或更多个氨基酸可分别位于相同或不同的区域。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的三个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696和I697。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的三个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和区域1-4的A203，N277，G366，K510，Y515，F539，G582，V583，E584，D585，N588，I601，N692，M694，Q695和H698。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的三个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域1-1、区域1-3和区域1-4的A203，N277，K510，Y515，F539，G582，V583，E584，D585，N588，I601，N692，M694，Q695和H698。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的三个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域1-2、区域1-3和区域1-4的G366，K510，Y515，F539，G582，V583，E584，D585，N588，I601，N692，M694，Q695和H698。
Cas9变体可处于其中选自于野生型Cas9的第二区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸被修饰的形式。
在一个实例中，当野生型Cas9为野生型SpCas9时，
SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的第二区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸被修饰的形式。
在一个示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域2-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸被修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由野生型SpCas9的区域2-1的I7、G8、L9、D10、I11和G12所组成的组中的一个或多个氨基酸的修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由非极性氨基酸(即野生型SpCas9的区域2-1的I7，G8，L9，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20和I21)所组成的组中的一个或多个氨基酸的修饰的形式。
在另一示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域2-2的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸被修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由野生型SpCas9的区域2-2的I761、E762、M763、R765、E766和N767所组成的组中的一个或多个氨基酸的修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由非极性氨基酸(即野生型SpCas9的区域2-2中的P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，M763和A764)所组成的组中的一个或多个氨基酸的修饰的形式。
在又一示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域2-3的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸被修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域2-3的D965，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，Y1036，F1037，F1038和Y1039。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由非极性氨基酸(即野生型SpCas9的区域2-3的I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，F966，F970，F972，V975，U978，A984，A987，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，F1037和F1038)所组成的组中的一个或多个氨基酸的修饰的形式。
在一个示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域2-1和区域2-2的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。此处，所选择的两个或更多个氨基酸可分别位于区域2-1和区域2-2中。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域2-1和区域2-2的I7，G8，L9，D10，I11，G12，I761，E762，M763，R765，E766和N767。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由非极性氨基酸(即野生型SpCas9的区域2-1和区域2-2的I7，G8，L9，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，M763和A764)所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式。
在另一示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域2-1和区域2-3的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。此处，所选择的两个或更多个氨基酸可分别位于区域2-1和区域2-3中。
例如，SpCas9变体可为包含选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域2-1和区域2-3的I7，G8，L9，D10，I11，G12，D965，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，Y1036，F1037，F1038和Y1039。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由非极性氨基酸(即野生型SpCas9的区域2-1和区域2-3的I7，G8，L9，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，F966，F970，F972，V975，U978，A984，A987，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，F1037和F1038)所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式。
在另一示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域2-2和区域2-3的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。此处，所选择的两个或更多个氨基酸可分别位于区域2-2和区域2-3中。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域2-2和区域2-3的I761，E762，M763，R765，E766，N767，D965，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，Y1036，F1037，F1038和Y1039。
例如，SpCas9变体可为包含选自于由非极性氨基酸(即野生型SpCas9的区域2-2和区域2-3的P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，M763，A764，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，F966，F970，F972，V975，U978，A984，A987，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，F1037和F1038)所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式。
在另一示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域2-1、区域2-2和区域2-3的氨基酸序列中的三个或更多个氨基酸被修饰的形式。此处，所选择的三个或更多个氨基酸可分别位于野生型SpCas9的区域2-1、区域2-2和区域2-3中。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的三个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域2-1、区域2-2和区域2-3的I7，G8，L9，D10，I11，G12，I761，E762，M763，R765，E766，N767，D965，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，Y1036，F1037，F1038和Y1039。
例如，SpCas9变体可为包含选自于由非极性氨基酸(即野生型SpCas9的区域2-1、区域2-2和区域2-3的I7，G8，L9，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，M763，A764，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，F966，F970，F972，V975，U978，A984，A987，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，F1037和F1038)所组成的组中的三个或更多个氨基酸的修饰的形式。
Cas9变体可处于其中野生型Cas9的第三区域的氨基酸序列中的至少一个氨基酸被修饰的形式。
在一个实例中，当野生型Cas9为野生型SpCas9时，
SpCas9变体可为其中选自于野生型SpCas9的第三区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸被修饰的形式。
在一个示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域3-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸被修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为包含选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域3-1的V838，D839，H840，D853，N854，K855，K862，N863，R864，A889，K890和L891。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由带电荷的氨基酸(即野生型SpCas9的区域3-1的K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，D839，H840，K848，D849，D850，D853，K855，R859，D861，K862，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，K890，R895，K896和D898)所组成的组中的一个或多个氨基酸的修饰的形式。
Cas9变体可处于其中选自于野生型Cas9的第四区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸被修饰的形式。
在一个实例中，当野生型Cas9为野生型SpCas9时，
SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的第四区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸被修饰的形式。
在一个示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域4-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸被修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域4-1的T1102、S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。
Cas9变体可处于其中选自于野生型Cas9的第一区域和第二区域的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。此处，两个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
在一个实例中，当野生型Cas9为野生型SpCas9时，
SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的第一区域和第二区域的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。此处，两个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
在一个示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域1-1和区域2-1的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域1-1和2-1的I7，G8，L9，D10，I11，G12，N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281和I282。
在另一示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域1-1和区域2-2的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为包含选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域1-1和2-2的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，I761，E762，M763，R765，E766和N767。
在又一示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域1-1和区域2-3的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域1-1和区域2-3的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，D965，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，Y1036，F1037，F1038和Y1039。
在一个示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域1-2和区域2-1的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域1-2和区域2-1的I7，G8，L9，D10，I11，G12，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391和L393。
例如，SpCas9变体可为包含选自于由非极性氨基酸(即野生型SpCas9的区域1-2和区域2-1的I7，G8，L9，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391和L393)所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式。
在另一示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域1-2和区域2-2的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域1-2和区域2-2的P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，I761，E762，M763，R765，E766和N767。
在另一示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域1-2和区域2-3的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域1-2和区域2-3的P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，D965，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，Y1036，F1037，F1038和Y1039。
在一个示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域1-3和区域2-1的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为包含选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域1-3和区域2-1的I7，G8，L9，D10，I11，G12，K510，Y515，F539，G582，V583，E584，D585，N588和I601。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由非极性氨基酸(即野生型SpCas9的区域1-3和区域2-1的I7，G8，L9，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606和L607)所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式。
在另一示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域1-3和区域2-2的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域1-3和区域2-2的K510，Y515，F539，G582，V583，E584，D585，N588，I601，I761，E762，M763，R765，E766和N767。
例如，SpCas9变体可为包含选自于由非极性氨基酸(即野生型SpCas9的区域1-3和区域2-2的L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，M763和A764)所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式。
在又一示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域1-3和区域2-3的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域1-3和区域2-3的K510，Y515，F539，G582，V583，E584，D585，N588，I601，D965，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，Y1036，F1037，F1038和Y1039。
例如，SpCas9变体可为包含选自于由非极性氨基酸(即野生型SpCas9的区域1-3和区域2-3的L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，1580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，F966，F970，F972，V975，U978，A984，A987，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，F1037和F1038)所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式。
在一个示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域1-4和区域2-1的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为包含选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域1-4和区域2-1的I7，G8，L9，D10，I11，G12，N692，M694，Q695和H698。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由非极性氨基酸(即野生型SpCas9的区域1-4和区域2-1的I7，G8，L9，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696和I697)所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式。
在另一示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域1-4和区域2-2的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为包含选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域1-4和区域2-2的N692，M694，Q695，H698，I761，E762，M763，R765，E766和N767。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由非极性氨基酸(即野生型SpCas9的区域1-4和区域2-2的I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696，I697，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，M763和A764)所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式。
在又一示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域1-4和区域2-3的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为包含选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域1-4和区域2-3的N692，M694，Q695，H698，D965，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，Y1036，F1037，F1038和Y1039。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由非极性氨基酸(即野生型SpCas9的区域1-4和区域2-3的I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696，I697，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，F966，F970，F972，V975，U978，A984，A987，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，F1037和F1038)所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式。
在一个示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的第一区域和第二区域的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。
此处，第一区域可为区域1-1、区域1-2、区域1-3和区域1-4。
此处，第二区域可为区域2-1、区域2-2和区域2-3。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的第一区域和第二区域的I7、G8，L9，D10，I11，G12，A203，N277，G366，K510，Y515，F539，G582，V583，E584，D585，N588，I601，N692，M694，Q695，H698，I761，E762，M763，R765，E766，N767，D965，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，Y1036，F1037，F1038和Y1039。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的第一区域和第二区域的I7、G8，L9，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696，I697，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，M763，A764，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，A984，A987，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，F1037和F1038。
Cas9变体可处于其中选自于野生型Cas9的第一区域和第三区域的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。此处，两个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
在一个实例中，当野生型Cas9为野生型SpCas9时，
SpCas9变体可为其中选自于野生型SpCas9的第一区域和第三区域的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。此处，两个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
在一个示例性实施方式中，SpCas9变体可为其中选自于野生型SpCas9的区域1-1和区域3-1的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域1-1和区域3-1的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，V838，D839，H840，D853，N854，K855，K862，N863，R864，A889，K890和L891。
在一个示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域1-2和区域3-1的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由非极性氨基酸(即野生型SpCas9的区域1-2的P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391和L393)和带电荷的氨基酸(即野生型SpCas9的区域3-1的K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，D839，H840，K848，D849，D850，D853，K855，R859，D861，K862，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，K890，R895，K896和D898)所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式。
在一个示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域1-3和区域3-1的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域1-3和区域3-1的K510，Y515，F539，G582，V583，E584，D585，N588，I601，V838，D839，H840，D853，N854，K855，K862，N863，R864，A889，K890和L891。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由非极性氨基酸(即野生型SpCas9的区域1-3的L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606和L607)以及带电荷的氨基酸(即野生型SpCas9的区域3-1的K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，D839，H840，K848，D849，D850，D853，K855，R859，D861，K862，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，K890，R895，K896和D898)所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式。
在另一示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域1-4和区域3-1的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域1-4和区域3-1的N692，M694，Q695，H698，V838，D839，H840，D853，N854，K855，K862，N863，R864，A889，K890和L891。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由非极性氨基酸(即野生型SpCas9的区域1-4的I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696和I697)以及带电荷的氨基酸(即野生型SpCas9的区域3-1的K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，D839，H840，K848，D849，D850，D853，K855，R859，D861，K862，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，K890，R895，K896和D898)所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式。
在一个示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的第一区域和第三区域的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。
此处，第一区域可为区域1-1、区域1-2、区域1-3和区域1-4。
此处，第三区域可为区域3-1。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的第一区域和第三区域的A203，N277，G366，K510，Y515，F539，G582，V583，E584，D585，N588，I601，N692，M694，Q695，H698，V838，D839，H840，D853，N854，K855，K862，N863，R864，A889，K890和L891。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的第一区域和第三区域的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696，I697，K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，D839，H840，K848，D849，D850，D853，K855，R859，D861，K862，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，K890，R895，K896和D898。
Cas9变体可处于其中选自于野生型Cas9的第一区域和第四区域的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。此处，两个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
在一个实例中，当野生型Cas9为野生型SpCas9时，
SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的第一区域和第四区域的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。此处，两个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
在一个示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域1-1和区域4-1的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域1-1和区域4-1的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。
在一个示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域1-2和区域4-1的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域1-2和区域4-1的P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。
在一个示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域1-3和区域4-1的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域1-3和区域4-1的K510，Y515，F539，G582，V583，E584，D585，N588，I601，T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由非极性氨基酸(即野生型SpCas9的区域1-3的L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606和L607)以及野生型SpCas9的区域4-1的T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式。
在另一示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域1-4和区域4-1的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域1-4和区域4-1的N692，M694，Q695，H698，T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由非极性氨基酸(即野生型SpCas9的区域1-4的I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696和I697)以及野生型SpCas9的区域4-1的T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式。
在一个示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的第一区域和第四区域的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。
此处，第一区域可为区域1-1、区域1-2、区域1-3和区域1-4。
此处，第四区域可为区域4-1。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的第一区域和第四区域的A203，N277，G366，K510，Y515，F539，G582，V583，E584，D585，N588，I601，N692，M694，Q695，H698，T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的第一区域和第四区域的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，1376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696，I697，T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。
Cas9变体可处于其中选自于野生型Cas9的第二区域和第三区域的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。此处，两个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
在一个实例中，当野生型Cas9为野生型SpCas9时，
SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的第二区域和第三区域的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。此处，两个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
在一个示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域2-1和区域3-1的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域2-1和区域3-1的I7，G8，L9，D10，I11，G12，V838，D839，H840，D853，N854，K855，K862，N863，R864，A889，K890和L891。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由非极性氨基酸(即野生型SpCas9的区域2-1的I7，G8，L9，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20和I21)以及带电荷的氨基酸(即野生型SpCas9的区域3-1的K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，D839，H840，K848，D849，D850，D853，K855，R859，D861，K862，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，K890，R895，K896和D898)所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式。
在另一示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域2-2和区域3-1的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域2-2和区域3-1的I761，E762，M763，R765，E766，N767，V838，D839，H840，D853，N854，K855，K862，N863，R864，A889，K890和L891。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由非极性氨基酸(即野生型SpCas9的区域2-2的P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，M763和A764)和带电荷的氨基酸(即野生型SpCas9的区域3-1的K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，D839，H840，K848，D849，D850，D853，K855，R859，D861，K862，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，K890，R895，K896和D898)所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式。
在另一示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域2-3和区域3-1的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域2-3和区域3-1的V838，D839，H840，D853，N854，K855，K862，N863，R864，A889，K890，L891，D965，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，Y1036，F1037，F1038和Y1039。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由非极性氨基酸(即野生型SpCas9的区域2-3的I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，F966，F970，F972，V975，U978，A984，A987，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，F1037和F1038)和带电荷的氨基酸(即野生型SpCas9的区域3-1的K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，D839，H840，K848，D849，D850，D853，K855，R859，D861，K862，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，K890，R895，K896和D898)所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式。
在一个示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的第二区域和第三区域的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。
此处，第二区域可为区域2-1、区域2-2和区域2-3。
此处，第三区域可为区域3-1。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的第二区域和第三区域的I7、G8，L9，D10，I11，G12，I761，E762，M763，R765，E766，N767，V838，D839，H840，D853，N854，K855，K862，N863，R864，A889，K890，L891，Y981，H982，H983，A984，H985，D965，D986，A987，Y988，Y1036，F1037，F1038和Y1039。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的第二区域和第三区域的I7、G8，L9，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，M763，A764，K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，D839，H840，K848，D849，D850，D853，K855，R859，D861，K862，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，K890，R895，K896，D898，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，A984，A987，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，F1037和F1038。
Cas9变体可处于其中选自于野生型Cas9的第二区域和第四区域的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。此处，两个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
在一个实例中，当野生型Cas9为野生型SpCas9时，
SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的第二区域和第四区域的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。此处，两个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
在一个示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域2-1和区域4-1的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域2-1和区域4-1的I7，G8，L9，D10，111，G12，T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由非极性氨基酸(即野生型SpCas9的区域2-1的I7，G8，L9，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20和I21)以及野生型SpCas9的区域4-1的T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式。
在另一示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域2-2和区域4-1的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域2-2和区域4-1的I761，E762，M763，R765，E766，N767，T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由非极性氨基酸(即野生型SpCas9的区域2-2的P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，M763和A764)和野生型SpCas9的区域4-1的T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式。
在又一示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域2-3和区域4-1的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域2-3和区域4-1的D965，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，Y1036，F1037，F1038，Y1039，T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由非极性氨基酸(即野生型SpCas9的区域2-3的I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，F966，F970，F972，V975，U978，A984，A987，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，F1037和F1038)以及野生型SpCas9的区域4-1的T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式。
在一个示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的第二区域和第四区域的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。
此处，第二区域可为区域2-1、区域2-2和区域2-3。
此处，第四区域可为区域4-1。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的第二区域和第四区域的I7、G8，L9，D10，I11，G12，I761，E762，M763，R765，E766，N767，D965，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，Y1036，F1037，F1038，Y1039，T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的第二区域和第四区域的I7、G8，L9，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，M763，A764，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，A984，A987，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，F1038，Y1039，T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。
Cas9变体可处于其中选自于野生型Cas9的第三区域和第四区域的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。此处，两个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
在一个实例中，当野生型Cas9为野生型SpCas9时，
SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的第三区域和第四区域的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。此处，两个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
在一个示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的区域3-1和区域4-1的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸被修饰的形式。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的区域3-1和区域4-1的V838，D839，H840，D853，N854，K855，K862，N863，R864，A889，K890，L891，T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由带电荷的氨基酸(即野生型SpCas9的区域3-1的K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，D839，H840，K848，D849，D850，D853，K855，R859，D861，K862，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，K890，R895，K896和D898)以及野生型SpCas9的区域4-1的T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138所组成的组中的两个或更多个氨基酸的修饰的形式。
Cas9变体可处于其中选自于野生型Cas9的第一区域、第二区域、第三区域和/或第四区域的氨基酸序列中的三个或更多个氨基酸被修饰的形式。此处，三个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
在一个实例中，当野生型Cas9为野生型SpCas9时，
SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的第一区域、第二区域、第三区域和/或第四区域的氨基酸序列中的三个或更多个氨基酸被修饰的形式。此处，三个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
在一个示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的第一区域、第二区域和第三区域的氨基酸序列中的三个或更多个氨基酸被修饰的形式。
此处，第一区域可为区域1-1、区域1-2、区域1-3和区域1-4。
此处，第二区域可为区域2-1、区域2-2和区域2-3。
此处，第三区域可为区域3-1。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的三个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的第一区域、第二区域和第三区域的I7，G8，L9，D10，I11，G12，A203，N277，G366，K510，Y515，F539，G582，V583，E584，D585，N588，I601，N692，M694，Q695，H698，I761，E762，M763，R765，E766，N767，V838，D839，H840，D853，N854，K855，K862，N863，R864，A889，K890，L891，D965，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，Y1036，F1037，F1038和Y1039。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的三个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的第一区域、第二区域和第三区域的I7，G8，L9，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696，I697，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，M763，A764，K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，D839，H840，K848，D849，D850，D853，K855，R859，D861，K862，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，K890，R895，K896，D898，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，A984，A987，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，F1037和F1038。
在另一示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的第一区域、第二区域和第四区域的氨基酸序列中的三个或更多个氨基酸被修饰的形式。
此处，第一区域可为区域1-1、区域1-2、区域1-3和区域1-4。
此处，第二区域可为区域2-1、区域2-2和区域2-3。
此处，第四区域可为区域4-1。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的三个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的第一区域、第二区域和第四区域的I7，G8，L9，D10，I11，G12，A203，N277，G366，K510，Y515，F539，G582，V583，E584，D585，N588，I601，N692，M694，Q695，H698，I761，E762，M763，R765，E766，N767，D965，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，Y1036，F1037，F1038，Y1039，T1102和D1127。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的三个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的第一区域、第二区域和第四区域的I7，G8，L9，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L55l，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696，I697，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，M763，A764，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，A984，A987，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，11029，G1030，A1032，A1034，F1037，F1038，T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。
在又一示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的第一区域、第三区域和第四区域的氨基酸序列中的三个或更多个氨基酸被修饰的形式。
此处，第一区域可为区域1-1、区域1-2、区域1-3和区域1-4。
此处，第三区域可为区域3-1。
此处，第四区域可为区域4-1。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的三个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的第一区域、第三区域和第四区域的A203，N277，G366，K510，Y515，F539，G582，V583，E584，D585，N588，I601，N692，M694，Q695，H698，V838，D839，H840，D853，N854，K855，K862，N863，R864，A889，K890，L891，T1102和D1127。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的三个或更多个氨基酸的修饰的形式；野生型SpCas9的第一区域、第三区域和第四区域的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696，I697，K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，D839，H840，K848，D849，D850，D853，K855，R859，D861，K862，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，K890，R895，K896，D898，T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。
在另一示例性实施方式中，SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的第二区域、第三区域和第四区域的氨基酸序列中的三个或更多个氨基酸被修饰的形式。
此处，第二区域可为区域2-1、区域2-2和区域2-3。
此处，第三区域可为区域3-1。
此处，第四区域可为区域4-1。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的三个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的第二区域、第三区域和第四区域的I7，G8，L9，D10，I11，G12，I761，E762，M763，R765，E766，N767，V838，D839，H840，D853，N854，K855，K862，N863，R864，A889，K890，L891，D965，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，Y1036，F1037，F1038，Y1039，T1102和D1127。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的三个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的第二区域、第三区域和第四区域的I7，G8，L9，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，M763，A764，K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，D839，H840，K848，D849，D850，D853，K855，R859，D861，K862，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，K890，R895，K896，D898，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，A984，A987，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，F1037，F1038，T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。
Cas9变体可处于其中选自于野生型Cas9的第一区域、第二区域、第三区域和第四区域的氨基酸序列中的四个或更多个氨基酸被修饰的形式。此处，四个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
在一个实例中，当野生型Cas9为野生型SpCas9时，
SpCas9变体可处于其中选自于野生型SpCas9的第一区域、第二区域、第三区域和第四区域的氨基酸序列中的四个或更多个氨基酸被修饰的形式。此处，四个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
在一个示例性实施方式中，SpCas9变体可为其中选自于野生型SpCas9的第一区域、第二区域、第三区域和第四区域的氨基酸序列中的三个或更多个氨基酸被修饰的形式。
此处，第一区域可为区域1-1、区域1-2、区域1-3和区域1-4。
此处，第二区域可为区域2-1、区域2-2和区域2-3。
此处，第三区域可为区域3-1。
此处，第四区域可为区域4-1。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的三个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的第一区域、第二区域、第三区域和第四区域的I7，G8，L9，D10，I11，G12，A203，N277，G366，K510，Y515，F539，G582，V583，E584，D585，N588，I601，N692，M694，Q695，H698，I761，E762，M763，R765，E766，N767，V838，D839，H840，D853，N854，K855，K862，N863，R864，A889，K890，L891，D965，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，Y1036，F1037，F1038，Y1039，T1102和D1127。
例如，SpCas9变体可为具有选自于由以下氨基酸所组成的组中的三个或更多个氨基酸的修饰的形式：野生型SpCas9的第一区域、第二区域、第三区域和第四区域的I7，G8，L9，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696，I697，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，M763，A764，K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，D839，H840，K848，D849，D850，D853，K855，R859，D861，K862，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，K890，R895，K896，D898，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，A984，A987，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，11022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，F1037，F1038，T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。
Cas9变体可包含选自于一个或多个区域中的至少一个氨基酸的修饰。
此处，修饰可为所选择的一个或多个氨基酸的删除。
在一个实例中，当野生型Cas9为野生型SpCas9时，
修饰可为选自于野生型SpCas9的第一区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的删除。
在一个示例性实施方式中，修饰可为选自于野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和/或区域1-4的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的删除。
例如，修饰可为选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸的删除：野生型SpCas9的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，1679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696和I697。
修饰可为选自于野生型SpCas9的第二区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的删除。
在一个示例性实施方式中，修饰可为选自于野生型SpCas9的区域2-1、区域2-2和/或区域2-3的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的删除。
例如，修饰可为选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸的删除：野生型SpCas9的I7，G8，L9，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，M763，A764，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，A984，A987，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，F1037和F1038。
修饰可为选自于野生型SpCas9的第三区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的删除。
在一个示例性实施方式中，修饰可为选自于野生型SpCas9的区域3-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的删除。
例如，修饰可为选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸的删除：野生型SpCas9的K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，D839，H840，K848，D849，D850，D853，K855，R859，D861，K862，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，K890，R895，K896和D898。
修饰可为选自于野生型SpCas9的第四区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的删除。
在一个示例性实施方式中，修饰可为选自于野生型SpCas9的区域4-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的删除。
例如，修饰可为选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸的删除：野生型SpCas9的区域4-1的T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。
修饰可为选自于野生型SpCas9的第一区域、第二区域、第三区域和/或第四区域的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸的删除。
在一个示例性实施方式中，修饰可为选自于野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3、区域1-4、区域2-1、区域2-2、区域2-3、区域3-1和/或区域4-1的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸的删除。
例如，修饰可为选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸的删除：野生型SpCas9的I7，G8，L9，D10，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696，I697，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，M763，A764，K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，D839，H840，K848，D849，D850，D853，K855，R859，D861，K862，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，K890，R895，K896，D898，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，A984，A987，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，F1037，F1038，T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。
此处，修饰可为用不同的氨基酸置换所选择的一个或多个氨基酸。
在一个实例中，当野生型Cas9为野生型SpCas9时，
修饰可为用不同的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的第一区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
在一个示例性实施方式中，修饰可为用立体异构体(stereoisomer(s))置换选自于野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和/或区域1-4的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
例如，修饰可为用立体异构体置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸：野生型SpCas9的A203，N277，G366，K510，Y515，F539，G582，V583，E584，D585，N588，I601，N692，M694，Q695和H698。例如，当野生型SpCas9的第510位的赖氨酸(K510)为L-赖氨酸时，修饰可为用D-赖氨酸置换野生型SpCas9的第510位的赖氨酸(K510)。
在一个示例性实施方式中，修饰可为用具有相对低的亲水指数的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和/或区域1-4的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
例如，修饰可为用具有相对低的亲水指数的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸：野生型SpCas9的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696和I697。例如，修饰可为用具有相对低的亲水指数的丝氨酸(亲水指数：-0.8)置换野生型SpCas9的第539位的苯丙氨酸(F539，亲水指数：2.8)。或者，修饰可为用具有相对低的亲水指数的天冬酰胺(亲水指数；-3.5)置换野生型SpCas9的第601位的异亮氨酸(I601，亲水指数：4.5)。
在另一示例性实施方式中，修饰可为用具有相对高的亲水指数的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和/或区域1-4的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
例如，修饰可为用具有相对高的亲水指数的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸：野生型SpCas9的A203，N277，G366，K510，Y515，F539，G582，V583，E584，D585，N588，I601，N692，M694，Q695和H698。例如，修饰可为用具有相对高的亲水指数的组氨酸(亲水指数：-3.2)置换野生型SpCas9的第277位的天冬酰胺(N277，亲水指数：-3.5)。
在又一示例性实施方式中，修饰可为用具有相对高或相对低的亲水指数的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和/或区域1-4的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
在一个示例性实施方式中，修饰可为用具有相对小的功能性基团的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和/或区域1-4的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
例如，修饰可为用具有相对小的功能性基团的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸；野生型SpCas9的A203，N277，G366，K510，Y515，F539，G582，V583，E584，D585，N588，I601，N692，M694，Q695和H698。例如，修饰可为用具有相对小的功能性基团的丝氨酸置换野生型SpCas9的第539位的苯丙氨酸(F539)。
在另一示例性实施方式中，修饰可为用具有相对大的功能性基团的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和/或区域1-4的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
例如，修饰可为用具有相对大的功能性基团的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸：野生型SpCas9的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696和I697。例如，修饰可为用具有相对大的功能性基团的天冬氨酸置换野生型SpCas9的第203位的丙氨酸(A203)。例如，修饰可为用具有相对大的功能性基团的丝氨酸置换野生型SpCas9的第366位的甘氨酸(G366)。
在又一示例性实施方式中，修饰可为用具有相对大或相对小的功能性基团的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和/或区域1-4的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
在一个示例性实施方式中，修饰可为用具有相对低的疏水性的氨基酸置换选自于野生型SDCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和/或区域1-4的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
例如，修饰可为用具有相对低的疏水性的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸：野生型SpCas9的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696和I697。例如，修饰可为用具有相对更低的疏水性的丝氨酸(Kyte-Doolittle疏水性：-0.8)和天冬酰胺(Kyte-Doolittle疏水性：-3.5)分别置换野生型SpCas9的第539位的苯丙氨酸(F539，Kyte-Doolittle疏水性：2.8)和第601位的异亮氨酸(I601，Kyte-Doolittle疏水性：4.5)。
在另一示例性实施方式中，修饰可为用具有相对高的疏水性的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和/或区域1-4的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
例如，修饰可为用具有相对高的疏水性的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸：野生型SpCas9的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696和I697。例如，修饰可为用具有相对高的疏水性的组氨酸(Kyte-Doolittle疏水性：-3.2)和缬氨酸(Kyte-Doolittle疏水性：4.2)置换野生型SpCas9的第277位的天冬酰胺(N277，Kyte-Doolittle疏水性：-3.5)和第682位的苯丙氨酸(F682，Kyte-Doolittle疏水性：2.8)。
在又一示例性实施方式中，修饰可为用具有相对低或相对高的疏水性的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和/或区域1-4的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
修饰可为用不同的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的第二区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
在一个示例性实施方式中，修饰可为用立体异构体置换选自于野生型SpCas9的区域2-1、区域2-2和/或区域2-3的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
例如，修饰可为用立体异构体置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸：野生型SpCas9的I7，G8，L9，D10，I11，G12，I761，E762，M763，R765，E766，N767，D965，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，Y1036，F1037，F1038和Y1039。例如，当野生型SpCas9的第12位的甘氨酸(G12)为L-甘氨酸时，修饰可为用D-甘氨酸置换野生型SpCas9的第12位的甘氨酸(G12)。
在一个示例性实施方式中，修饰可为用具有相对低的亲水指数的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的区域2-1、区域2-2和/或区域2-3的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
例如，修饰可为用具有相对低的亲水指数的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸：野生型SpCas9的I7，G8，L9，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，M763，A764，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，A984，A987，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，F1037和F1038。例如，修饰可为用具有相对低的亲水指数的酪氨酸(亲水指数：-1.3)置换野生型SpCas9的第1038位的苯丙氨酸(F1038，亲水指数：2.8)。
在另一示例性实施方式中，修饰可为用具有相对高的亲水指数的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的区域2-1、区域2-2和/或区域2-3的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
例如，修饰可为用具有相对高的亲水指数的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸：野生型SpCas9的I7，G8，L9，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，M763，A764，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，A984，A987，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，F1037和F1038。例如，修饰可为用具有相对高的亲水指数的异亮氨酸(亲水指数：4.5)置换野生型SpCas9的第763位的蛋氨酸(M763，亲水指数：1.9)。例如，修饰可为用具有相对高的亲水指数的酪氨酸(亲水指数：-1.3)置换野生型SpCas9的第965位的天冬氨酸(D965，亲水指数：-3.5)。
在另一示例性实施方式中，修饰可为用具有相对高或相对低的亲水指数的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的区域2-1、区域2-2和/或区域2-3的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
在一个示例性实施方式中，修饰可为用具有相对小的功能性基团的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的区域2-1、区域2-2和/或区域2-3的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
例如，修饰可为用具有相对小的功能性基团的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸：野生型SpCas9的I7，G8，L9，D10，I11，G12，I761，E762，M763，R765，E766，N767，D965，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，Y1036，F1037，F1038和Y1039。例如，修饰可为用具有相对小的功能性基团的异亮氨酸置换野生型SpCas9的第763位的蛋氨酸(M763)。
在另一示例性实施方式中，修饰可为用具有相对大的功能性基团的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的区域2-1、区域2-2和/或区域2-3的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
例如，修饰可为用具有相对大的功能性基团的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸：野生型SpCas9的I7，G8，L9，D10，I11，G12，I761，E762，M763，R765，E766，N767，D965，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，Y1036，F1037，F1038和Y1039。例如，修饰可为用具有相对大的功能性基团的酪氨酸置换野生型SpCas9的第1038位的苯丙氨酸(F1038)。
在另一示例性实施方式中，修饰可为用具有相对大或相对小的功能性基团的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的区域2-1、区域2-2和/或区域2-3的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
在一个示例性实施方式中，修饰可为用具有相对低的疏水性的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的区域2-1、区域2-2和/或区域2-3的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
例如，修饰可为用具有相对低的疏水性的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸：野生型SpCas9的I7，G8，L9，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，M763，A764，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，A984，A987，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，F1037和F1038。例如，修饰可为用具有相对低的疏水性的蛋氨酸(Kyte-Doolittle疏水性：1.9)和酪氨酸(Kyte-Doolittle疏水性：-1.3)分别置换野生型SpCas9的第761位的异亮氨酸(I761，Kyte-Doolittle疏水性：4.5)和第1038位的苯丙氨酸(F1038，Kyte-Doolittle疏水性：2.8)。
在另一示例性实施方式中，修饰可为用具有相对高的疏水性的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的区域2-1、区域2-2和/或区域2-3的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
例如，修饰可为用具有相对高的疏水性的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸：野生型SpCas9的I7，G8，L9，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，M763，A764，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，A984，A987，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，F1037和F1038。例如，修饰可为用具有相对高的疏水性的异亮氨酸(Kyte-Doolittle疏水性：4.5)和半胱氨酸(Kyte-Doolittle疏水性：2.5)置换野生型SpCas9的第763位的蛋氨酸(M763，Kyte-Doolittle疏水性：1.9)和第932位的丙氨酸(A932，Kyte-Doolittle疏水性：1.8)。
在另一示例性实施方式中，修饰可为用具有相对低或相对高的疏水性的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的区域2-1、区域2-2和/或区域2-3的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
修饰可为用不同的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的第三区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
在一个示例性实施方式中，修饰可为用立体异构体置换选自于野生型SpCas9的区域3-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
例如，修饰可为用立体异构体置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸：野生型SpCas9的V838，D839，H840，D853，N854，K855，K862，N863，R864，A889，K890和L891。例如，当野生型SpCas9的第853位的天冬氨酸(D853)为L-天冬氨酸时，修饰可为用D-天冬氨酸置换野生型SpCas9的第853位的天冬氨酸(D853)。
在一个示例性实施方式中，修饰可为用具有相对低的亲水指数的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的区域3-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
例如，修饰可为用具有相对低的亲水指数的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸：野生型SpCas9的V838，D839，H840，D853，N854，K855，K862，N863，R864，A889，K890和L891。例如，修饰可为用具有相对低的亲水指数的精氨酸(亲水指数：-4.5)置换野生型SpCas9的第862位的赖氨酸(K862，亲水指数：-3.9)。
在另一示例性实施方式中，修饰可为用具有相对高的亲水指数的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的区域3-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
例如，修饰可为用具有相对高的亲水指数的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸：野生型SpCas9的V838，D839，H840，D853，N854，K855，K862，N863，R864，A889，K890和L891。例如，修饰可为用具有相对高的亲水指数的天冬酰胺(亲水指数：-3.5)置换野生型SpCas9的第890位的赖氨酸(K890，亲水指数：-3.9)。
在又一示例性实施方式中，修饰可为用具有相对高或相对低的亲水指数的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的区域3-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
在一个示例性实施方式中，修饰可为用具有相对小的功能性基团的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的区域3-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
例如，修饰可为用具有相对小的功能性基团的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸：野生型SpCas9的V838，D839，H840，D853，N854，K855，K862，N863，R864，A889，K890和L891。例如，修饰可为用具有相对小的功能性基团的天冬酰胺置换野生型SpCas9的第890位的赖氨酸(K890)。
在另一示例性实施方式中，修饰可为用具有相对大的功能性基团的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的区域3-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
例如，修饰可为用具有相对大的功能性基团的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸：野生型SpCas9的V838，D839，H840，D853，N854，K855，K862，N863，R864，A889，K890和L891。例如，修饰可为用具有相对大的功能性基团的精氨酸置换野生型SpCas9的第863位的天冬酰胺(N863)。
在又一示例性实施方式中，修饰可为用具有相对大或相对小的功能性基团的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的区域3-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
在一个示例性实施方式中，修饰可为用具有相对低的疏水性的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的区域3-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
例如，修饰可为用具有相对低的疏水性的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸：野生型SpCas9的K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，D839，H840，K848，D849，D850，D853，K855，R859，D861，K862，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，K890，R895，K896和D898。例如，修饰可为用具有相对低的疏水性的赖氨酸(Kyte-Doolittle疏水性：-3.9)和精氨酸(Kyte-Doolittle疏水性：-4.5)分别置换野生型SpCas9的第779位的谷氨酸(E779，Kyte-Doolittle疏水性：-3.5)和第862位的赖氨酸(K862，Kyte-Doolittle疏水性：-3.9)。
在另一示例性实施方式中，修饰可为用具有相对高的疏水性的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的区域3-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
例如，修饰可为用具有相对高的疏水性的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸：野生型SpCas9的K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，D839，H840，K848，D849，D850，D853，K855，R859，D861，K862，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，K890，R895，K896和D898。例如，修饰可为用具有相对高的疏水性的蛋氨酸(Kyte-Doolittle疏水性：1.9)和天冬酰胺(Kyte-Doolittle疏水性：-3.5)分别置换野生型SpCas9的第827位的谷氨酸(E827，Kyte-Doolittle疏水性：-3.5)和第890位的赖氨酸(K890，Kyte-Doolittle疏水性：-3.9)。
在又一示例性实施方式中，修饰可为用具有相对低或相对高的疏水性的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的区域3-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
修饰可为用不同的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的第四区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
在一个示例性实施方式中，修饰可为用立体异构体置换选自于野生型SpCas9的区域4-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
例如，修饰可为用立体异构体置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸：野生型SpCas9的T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。例如，当野生型SpCas9的第1127位的天冬氨酸(D1127)为L-天冬氨酸时，修饰可为用D-天冬氨酸置换野生型SpCas9的第1127位的天冬氨酸(D1127)。
在一个示例性实施方式中，修饰可为用具有相对低的亲水指数的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的区域4-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
例如，修饰可为用具有相对低的亲水指数的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸：野生型SpCas9的T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。例如，修饰可为用具有相对低的亲水指数的脯氨酸(亲水指数：-1.6)置换野生型SpCas9的第1102位的苏氨酸(T1102，亲水指数：-0.7)。
在另一示例性实施方式中，修饰可为用具有相对高的亲水指数的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的区域4-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
例如，修饰可为用具有相对高的亲水指数的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸：野生型SpCas9的T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。例如，修饰可为用具有相对高的亲水指数的甘氨酸(亲水指数：-0.4)置换野生型SpCas9的第1106位的丝氨酸(S1106，亲水指数；-0.8)。
在又一示例性实施方式中，修饰可为用具有相对高或相对低的亲水指数的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的区域4-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
在一个示例性实施方式中，修饰可为用具有相对小的功能性基团的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的区域4-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
例如，修饰可为用具有相对小的功能性基团的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸：野生型SpCas9的T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。例如，修饰可为用具有相对小的功能性基团的脯氨酸置换野生型SpCas9的第1102位的苏氨酸(T1102)。
在另一示例性实施方式中，修饰可为用具有相对大的功能性基团的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的区域4-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
例如，修饰可为用具有相对大的功能性基团的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸：野生型SpCas9的T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。例如，修饰可为用具有相对大的功能性基团的谷氨酸置换野生型SpCas9的第1127位的天冬氨酸(D1127)。
在又一示例性实施方式中，修饰可为用具有相对大或相对小的功能性基团的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的区域4-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
在一个示例性实施方式中，修饰可为用具有相对低的疏水性的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的区域4-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
例如，修饰可为用具有相对低的疏水性的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸：野生型SpCas9的T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。例如，修饰可为用具有相对低的疏水性的脯氨酸(Kvte-Doolittle疏水性：-1.6)置换野生型SpCas9的第1102位的苏氨酸(T1102，Kyte-Doolittle疏水性：-0.7)。
在另一示例性实施方式中，修饰可为用具有相对高的疏水性的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的区域4-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
例如，修饰可为用具有相对高的疏水性的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸：野生型SpCas9的T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。例如，修饰可为用具有相对高的疏水性的蛋氨酸(Kyte-Doolittle疏水性：1.9)置换野生型SpCas9的第1108位的谷氨酸(E1108，Kyte-Doolittle疏水性：-3.5)。
在又一示例性实施方式中，修饰可为用具有相对低或相对高的疏水性的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的区域4-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
修饰可为用不同的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的第一区域、第二区域、第三区域和/或第四区域的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸。
在一个示例性实施方式中，修饰可为用立体异构体分别置换选自于野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3、区域1-4、区域2-1、区域2-2、区域2-3、区域3-1和/或区域4-1的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸。
例如，修饰可为用立体异构体分别置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸：野生型SpCas9的I7，G8，L9，D10，I11，G12，A203，N277，G366，K510，Y515，F539，G582，V583，E584，D585，N588，I601，N692，M694，Q695，H698，I761，E762，M763，R765，E766，N767，V838，D839，H840，D853，N854，K855，K862，N863，R864，A889，K890，L891，D965，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，Y1036，F1037，F1038，Y1039，T1102和D1127。例如，当野生型SpCas9的第8位的甘氨酸(G8)为L-甘氨酸并且第767位的天冬酰胺(N767)为L-天冬酰胺时，修饰可为用D-甘氨酸和D-天冬酰胺分别置换野生型SpCas9的第8位的甘氨酸(G8)和第767位的天冬酰胺(N767)。
在一个示例性实施方式中，修饰可为用具有相对低的亲水指数的氨基酸分别置换选自于野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3、区域1-4、区域2-1、区域2-2、区域2-3、区域3-1和/或区域4-1的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸。
例如，修饰可为用具有相对低的亲水指数的氨基酸分别置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸：野生型SpCas9的I7，G8，L9，D10，I11，G12，A203，N277，G366，K510，Y515，F539，G582，V583，E584，D585，N588，I601，N692，M694，Q695，H698，I761，E762，M763，R765，E766，N767，V838，D839，H840，D853，N854，K855，K862，N863，R864，A889，K890，L891，D965，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，Y1036，F1037，F1038，Y1039，T1102和D1127。例如，修饰可为用具有相对低的亲水指数的天冬氨酸(亲水指数：-3.5)和丝氨酸(亲水指数：-0.8)分别置换野生型SpCas9的第203位的丙氨酸(A203，亲水指数：1.8)和第539位的苯丙氨酸(F539，亲水指数：2.8)。
例如，修饰可为用具有相对低的亲水指数的氨基酸分别置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸：野生型SpCas9的I7，G8，L9，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696，I697，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，M763，A764，K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，D839，H840，K848，D849，D850，D853，K855，R859，D861，K862，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，K890，R895，K896，D898，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，A984，A987，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，F1037，F1038，T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。例如，修饰可为用具有相对低的亲水指数的天冬酰胺(亲水指数：-3.5)和脯氨酸(亲水指数：-1.6)分别置换野生型SpCas9的第601位的异亮氨酸(I601，亲水指数：4.5)和第1102位的苏氨酸(T1102，亲水指数：-0.7)。
在另一示例性实施方式中，修饰可为用具有相对高的亲水指数的氨基酸分别置换选自于野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3、区域1-4、区域2-1、区域2-2、区域2-3、区域3-1和/或区域4-1的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸。
例如，修饰可为用具有相对高的亲水指数的氨基酸分别置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸：野生型SpCas9的I7，G8，L9，D10，I11，G12，A203，N277，G366，K510，Y515，F539，G582，V583，E584，D585，N588，I601，N692，M694，Q695，H698，I761，E762，M763，R765，E766，N767，V838，D839，H840，D853，N854，K855，K862，N863，R864，A889，K890，L891，D965，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，Y1036，F1037，F1038，Y1039，T1102和D1127。例如，修饰可为用具有相对高的亲水指数的组氨酸(亲水指数：-3.2)和丙氨酸(亲水指数：1.8)分别置换野生型SpCas9的第277位的天冬酰胺(N277，亲水指数：-3.5)和第840位的组氨酸(H840，亲水指数：-3.2)。
例如，修饰可为用具有相对高的亲水指数的氨基酸分别置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸：野生型SpCas9的I7，G8，L9，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696，I697，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，M763，A764，K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，D839，H840，K848，D849，D850，D853，K855，R859，D861，K862，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，K890，R895，K896，D898，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，A984，A987，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，F1037，F1038，T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。例如，修饰可为用具有相对高的亲水指数的异亮氨酸(亲水指数：4.5)和天冬酰胺(亲水指数：-3.5)分别置换野生型SpCas9的第763位的蛋氨酸(M763，亲水指数：1.9)和第890位的赖氨酸(K890，亲水指数：-3.9)。
在又一示例性实施方式中，修饰可为用具有相对高或相对低的亲水指数的氨基酸分别置换选自于野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3、区域1-4、区域2-1、区域2-2、区域2-3、区域3-1和/或区域4-1的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸。
例如，修饰可为用具有相对高或相对低的亲水指数的氨基酸分别置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸：野生型SpCas9的I7，G8，L9，D10，I11，G12，A203，N277，G366，K510，Y515，F539，G582，V583，E584，D585，N588，I601，N692，M694，Q695，H698，I761，E762，M763，R765，E766，N767，V838，D839，H840，D853，N854，K855，K862，N863，R864，A889，K890，L891，D965，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，Y1036，F1037，F1038，Y1039，T1102和D1127。例如，修饰可为用具有相对高的亲水指数的丙氨酸(亲水指数：1.8)分别置换野生型SpCas9的第10位的天冬氨酸(D10，亲水指数：-3.5)和第840位的组氨酸(H840，亲水指数：-3.2)以及用具有相对低的亲水指数的丝氨酸(亲水指数：-0.8)置换野生型SpCas9的第539位的苯丙氨酸(F539，亲水指数：2.8)。
例如，修饰可为用具有相对高或相对低的亲水指数的氨基酸分别置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸：野生型SpCas9的I7，G8，L9，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696，I697，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，M763，A764，K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797.E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，D839，H840，K848，D849，D850，D853，K855，R859，D861，K862，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，K890，R895，K896，D898，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，A984，A987，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，F1037，F1038，T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。例如，修饰可为用具有相对高的亲水指数的异亮氨酸(亲水指数：4.5)和天冬酰胺(亲水指数：-3.5)分别置换野生型SpCas9的第763位的蛋氨酸(M763，亲水指数：1.9)和第890位的赖氨酸(K890，亲水指数：-3.9)以及用具有相对低的亲水指数的丝氨酸(亲水指数：-0.8)置换野生型SpCas9的第539位的苯丙氨酸(F539，亲水指数：2.8)。
在一个示例性实施方式中，修饰可为用具有相对小的功能性基团的氨基酸分别置换选自于野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3、区域1-4、区域2-1、区域2-2、区域2-3、区域3-1和/或区域4-1的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸。
例如，修饰可为用具有相对小的功能性基团的氨基酸分别置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸：野生型SpCas9的I7，G8，L9，D10，I11，G12，A203，N277，G366，K510，Y515，F539，G582，V583，E584，D585，N588，I601，N692，M694，Q695，H698，I761，E762，M763，R765，E766，N767，V838，D839，H840，D853，N854，K855，K862，N863，R864，A889，K890，L891，D965，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，Y1036，F1037，F1038，Y1039，T1102和D1127。例如，修饰可为用具有相对小的功能性基团的丝氨酸、异亮氨酸和脯氨酸分别置换野生型SpCas9的第539位的苯丙氨酸(F539)、第763位的蛋氨酸(M763)和第1102位的苏氨酸(T1102)。
在另一示例性实施方式中，修饰可为用具有相对大的功能性基团的氨基酸分别置换选自于野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3、区域1-4、区域2-1、区域2-2、区域2-3、区域3-1和/或区域4-1的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸。
例如，修饰可为用具有相对大的功能性基团的氨基酸分别置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸：野生型SpCas9的I7，G8，L9，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696，I697，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，M763，A764，K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，D839，H840，K848，D849，D850，D853，K855，R859，D861，K862，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，K890，R895，K896，D898，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，A984，A987，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，F1037，F1038，T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。例如，修饰可为用具有相对大的功能性基团的天冬酰胺、酪氨酸和谷氨酸分别置换野生型SpCas9的第601位的异亮氨酸(I601)、第1038位的苯丙氨酸(F1038)和第1127位的天冬氨酸(D1127)。
在又一示例性实施方式中，修饰可为用具有相对大或相对小的功能性基团的氨基酸分别置换选自于野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3、区域1-4、区域2-1、区域2-2、区域2-3、区域3-1和/或区域4-1的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸。
例如，修饰可为用具有相对大或相对小的功能性基团的氨基酸分别置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸：野生型SpCas9的I7，G8，L9，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，N199，I201，N202，A203，G3205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L24 1，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696，I697，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，M763，A764，K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，D839，H840，K848，D849，D850，D853，K855，R859，D861，K862，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，K890，R895，K896，D898，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，A984，A987，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，F1037，F1038，T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。例如，修饰可为用具有相对小的功能性基团的丝氨酸、异亮氨酸和天冬酰胺分别置换野生型SpCas9的第539位的苯丙氨酸(F539)、第763位的蛋氨酸(M763)和第890位的赖氨酸(K890)以及用具有相对大的功能性基团的天冬酰胺和酪氨酸分别置换野生型SpCas9的第601位的异亮氨酸(I601)和第1038位的苯丙氨酸(F1038)。
在一个示例性实施方式中，修饰可为用具有相对低的疏水性的氨基酸分别置换选自于野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3、区域1-4、区域2-1、区域2-2、区域2-3、区域3-1和/或区域4-1的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸。
例如，修饰可为用具有相对低的疏水性的氨基酸分别置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸：野生型SpCas9的I7，G8，L9，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696，I697，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，M763，A764，K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，D839，H840，K848，D849，D850，D853，K855，R859，D861，K862，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，K890，R895，K896，D898，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，A984，A987，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，F1037，F1038，T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。例如，修饰可为用具有相对低的疏水性的丝氨酸(Kyte-Doolittle疏水性：-0.8)、天冬酰胺(Kvte-Doolittle疏水性：-3.5)和脯氨酸(Kyte-Doolittle疏水性：-1.6)分别置换野生型SpCas9的第539位的苯丙氨酸(F539，Kvte-Doolittle疏水性：2.8)、第601位的异亮氨酸(I601，Kyte-Doolittle疏水性：4.5)和第1102位的苏氨酸(T1102，Kvte-Doolittle疏水性：-0.7)。
在另一示例性实施方式中，修饰可为用具有相对高的疏水性的氨基酸分别置换选自于野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3、区域1-4、区域2-1、区域2-2、区域2-3、区域3-1和/或区域4-1的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸。
例如，修饰可为用具有相对高的疏水性的氨基酸分别置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸：野生型SpCas9的I7，G8，L9，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，1580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696，I697，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，M763，A764，K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，D839，H840，K848，D849，D850，D853，K855，R859，D861，K862，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，K890，R895，K896，D898，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，A984，A987，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，F1037，F1038，T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。例如，修饰可为用具有相对高的疏水性的丙氨酸(Kyte-Doolittle疏水性：1.8)、异亮氨酸(Kyte-Doolittle疏水性：4.5)、丙氨酸(Kyte-Doolittle疏水性：1.8)和天冬酰胺(Kyte-Doolittle疏水性：-3.5)分别置换野生型SpCas9的第10位的天冬氨酸(D10，Kyte-Doolittle疏水性：-3.5)、第763位的蛋氨酸(M763，Kyte-Doolittle疏水性：1.9)、第840位的组氨酸(H840，Kyte-Doolittle疏水性：-3.2)和第890位的赖氨酸(K890，Kyte-Doolittle疏水性：-3.9)。
在又一示例性实施方式中，修饰可为用具有相对低或相对高的疏水性的氨基酸分别置换选自于野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3、区域1-4、区域2-1、区域2-2、区域2-3、区域3-1和/或区域4-1的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸。
例如，修饰可为用具有相对低或相对高的疏水性的氨基酸分别置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸：野生型SpCas9的I7，G8，L9，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，6542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696，I697，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，M763，A764，K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，D839，H840，K848，D849，D850，D853，K855，R859，D861，K862，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，K890，R895，K896，D898，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，A984，A987，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，F1037，F1038，T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。例如，修饰可为用具有相对高的疏水性的异亮氨酸(Kyte-Doolittle疏水性：4.5)和天冬酰胺(Kyte-Doolittle疏水性：-3.5)分别置换野生型SpCas9的第763位的蛋氨酸(M763，Kyte-Doolittle疏水性：1.9)和第890位的赖氨酸(K890，Kyte-Doolittle疏水性：-3.9)以及用具有相对低的疏水性的丝氨酸(Kyte-Doolittle疏水性：-0.8)置换野生型SpCas9的第539位的苯丙氨酸(F539，Kyte-Doolittle疏水性：2.8)。
修饰可为用相同数目的其它氨基酸置换所选择的一个或多个氨基酸。
例如，修饰可为用一个天冬酰胺置换位于野生型SpCas9的第一区域中的一个异亮氨酸。或者，修饰可为用一个丝氨酸(第一区域)和一个天冬酰胺(第三区域)分别置换位于野生型SpCas9的第一区域中的一个苯丙氨酸以及位于野生型SpCas9的第三区域中的一个赖氨酸。或者，修饰可为用一个异亮氨酸、一个酪氨酸(第二区域)和一个天冬酰胺(第三区域)分别置换位于野生型SpCas9的第二区域中的一个蛋氨酸和一个苯丙氨酸以及位于野生型SpCas9的第三区域中的一个赖氨酸。
修饰可为用不同数目的其它氨基酸置换所选择的一个或多个氨基酸。
例如，修饰可为用半胱氨酸-丙氨酸-丙氨酸(即总计三个氨基酸)置换位于野生型SpCas9的第二区域中的一个苏氨酸。或者，修饰可为用蛋氨酸-缬氨酸(第一区域)和脯氨酸(第三区域)分别置换位于野生型SpCas9的第一区域中的一个谷氨酰胺以及位于野生型SpCas9的第三区域中的两个连续氨基酸(甘氨酸-丝氨酸)。或者，修饰可为用丙氨酸(第一区域)、蛋氨酸-脯氨酸(第二区域)以及半胱氨酸-丙氨酸-苏氨酸-缬氨酸(第三区域)分别置换位于野生型SpCas9的第一区域中的一个丝氨酸、位于野生型SpCas9的第二区域中的三个连续氨基酸(赖氨酸-赖氨酸-酪氨酸)以及位于野生型SpCas9的第三区域中的两个连续氨基酸(丝氨酸-异亮氨酸)。
人工工程化Cas9可为将至少一个氨基酸添加至选自于野生型Cas9的第一区域、第二区域、第三区域和第四区域中的一个或多个区域的Cas9变体。
此处，添加可为将一个或多个氨基酸添加至存在于所选择的一个或多个区域中的一个或多个氨基酸的N-末端和/或C-末端位置。
在一个实例中，当野生型Cas9为野生型SpCas9时，
添加可为将一个或多个氨基酸添加至存在于野生型SpCas9的第一区域、第二区域、第三区域和/或第四区域中的一个或多个氨基酸的N-末端和/或C-末端位置。
在一个示例性实施方式中，添加可为将一个或多个带正电荷的氨基酸添加至存在于野生型SpCas9的第一区域、第二区域、第三区域和/或第四区域中的一个或多个氨基酸的N-末端和/或C-末端位置。
例如，添加可为将一个精氨酸添加至所选择的位于野生型SpCas9的区域1-1中的一个丙氨酸的C-末端。或者，添加可为将两个氨基酸(精氨酸-赖氨酸)添加至所选择的位于野生型SpCas9的区域2-2中的谷氨酸的N-末端。或者，添加可为将两个氨基酸(精氨酸-组氨酸)添加至所选择的位于野生型SpCas9的区域3-1中的亮氨酸的N-末端。或者，添加可为将两个氨基酸(赖氨酸-组氨酸)添加至所选择的位于野生型SpCas9的区域3-1中的亮氨酸的C-末端以及将一个赖氨酸添加至所选择的位于野生型SpCas9的区域4-1中的酪氨酸的C-末端。
在另一示例性实施方式中，添加可为将一个或多个带负电荷的氨基酸添加至存在于野生型SpCas9的第一区域、第二区域、第三区域和/或第四区域中的一个或多个氨基酸的N-末端和/或C-末端位置。
例如，添加可为将一个天冬氨酸添加至所选择的位于野生型SpCas9的区域1-2中的一个甘氨酸的N-末端。或者，添加可为将三个氨基酸(谷氨酸-天冬氨酸-谷氨酸)添加至所选择的位于野生型SpCas9的区域2-3中的蛋氨酸的C-末端。或者，添加可为将两个氨基酸(谷氨酸-谷氨酸)添加至所选择的位于野生型SpCas9的区域3-1中的异亮氨酸的N-末端。或者，添加可为将两个氨基酸(谷氨酸-天冬氨酸)添加至所选择的位于野生型SpCas9的区域1-1中的苯丙氨酸的C-末端以及将一个天冬氨酸添加至所选择的位于野生型SpCas9的区域2-1中的谷氨酰胺的N-末端。
在又一示例性实施方式中，添加可为将一个或多个非带电荷的氨基酸添加至存在于野生型SpCas9的第一区域、第二区域、第三区域和/或第四区域中的一个或多个氨基酸的N-末端和/或C-末端位置。
例如，添加可为将两个氨基酸(丝氨酸-缬氨酸)添加至所选择的位于野生型SpCas9的区域1-1中的一个苯丙氨酸的C-末端。或者，添加可为将5个氨基酸(甘氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺-苯丙氨酸-亮氨酸)添加至所选择的位于野生型SpCas9的区域2-1中的组氨酸的N-末端。或者，添加可为将两个氨基酸(丙氨酸-丙氨酸)添加至所选择的位于野生型SpCas9的区域3-1中的天冬酰胺的N-末端。或者，添加可为将两个氨基酸(苯丙氨酸-亮氨酸)添加至所选择的位于野生型SpCas9的区域1-1中的天冬氨酸的C-末端以及将一个丝氨酸添加至所选择的位于野生型SpCas9的区域1-2中的谷氨酰胺的N-末端。
在另一示例性实施方式中，添加可为将选自于带正电荷的氨基酸、带负电荷的氨基酸和非带电荷的氨基酸中的一个或多个氨基酸添加至存在于野生型SpCas9的第一区域、第二区域、第三区域和/或第四区域中的一个或多个氨基酸的N-末端和/或C-末端位置。
例如，添加可为将6个氨基酸(组氨酸-精氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丙氨酸-谷氨酸)添加至所选择的位于野生型SpCas9的区域1-2中的一个精氨酸的C-末端。或者，添加可为将10个氨基酸(赖氨酸-赖氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-谷氨酰胺-苏氨酸-蛋氨酸-半胱氨酸-天冬氨酸-丝氨酸)添加至所选择的位于野生型SpCas9的区域3-1中的一个甘氨酸的N-末端。或者，添加可为将两个氨基酸(苯丙氨酸-组氨酸)添加至所选择的位于野生型SpCas9的区域2-1中的蛋氨酸的C-末端以及将一个赖氨酸添加至所选择的位于野生型SpCas9的区域2-3中的谷氨酰胺的N-末端。或者，添加可为将两个氨基酸(天冬氨酸-丝氨酸)添加至所选择的位于野生型SpCas9的区域1-1中的赖氨酸的C-末端、将6个氨基酸(谷氨酰胺-苏氨酸-蛋氨酸-半胱氨酸-天冬氨酸-赖氨酸)添加至所选择的位于野生型SpCas9的区域2-2中的苏氨酸的N-末端以及将两个氨基酸(精氨酸-甘氨酸)添加至所选择的位于野生型SpCas9的区域4-1中的谷氨酰胺的C-末端。
此处，添加可为将一个或多个功能性结构域添加至存在于所选择的一个或多个区域中的一个或多个氨基酸的N-末端和/或C-末端位置。
功能性结构域可为除野生型Cas9的原始功能(即切割双链DNA的第一链的第一功能以及切割双链DNA的第二链的第二功能)外还具有额外功能的结构域。
或者，功能性结构域可为具有与野生型Cas9的原始功能(即切割双链DNA的第一链的第一功能和/或切割双链DNA的第二链的第二功能)相似的功能的结构域。
与功能性结构域有关的描述与上文所描述的相同。
在一个实例中，当野生型Cas9为野生型SpCas9时，
添加可为将一个或多个功能性结构域添加至存在于野生型SpCas9的第一区域、第二区域、第三区域和/或第四区域中的一个或多个氨基酸的N-末端和/或C-末端位置。
在本文公开的公开内容的一个示例性实施方式中，人工工程化Cas9可为靶特异性Cas9。
“靶特异性Cas9(TS-Cas9)”是指通过人工操纵来相比于野生型Cas9而言相对提高靶特异性而产生的Cas9变体。
此处，“靶特异性”意为Cas9通过与gRNA的相互作用形成gRNA-Cas9复合体，使得当gRNA-Cas9复合体接近或定位于靶基因或核酸(即，待使用Cas9进行操纵的对象(核酸))时，Cas9特异性地作用于互补结合至gRNA的靶序列。此处，与gRNA完全互补结合(100％)的靶序列称作“中靶靶标(on-target)”，而与gRNA具有不完全互补结合(小于100％；即，具有一个或多个非互补结合)的靶序列称作“脱靶靶标(off-target)”。
靶特异性可根据gRNA和靶序列之间的互补结合程度而变化。
在一个实例中，在其中互补结合至gRNA的靶序列为中靶靶标(即gRNA与靶序列之间的互补结合为完全互补结合(100％))的情况下，靶特异性处于最高水平。
在另一实例中，在其中互补结合至gRNA的靶序列为脱靶靶标(即gRNA与靶序列之间的互补结合小于100％，并且在它们之间包含一个或多个非互补结合)的情况下，靶特异性可低于中靶靶标的靶特异性，并且非互补结合的数目越高，靶特异性越低。
例如，当gRNA与靶序列之间的互补结合为完全互补结合(100％)时，靶特异性可为100％；当gRNA与靶序列之间存在一个非互补结合(即gRNA与靶序列之间的互补结合为不完全互补结合(95％))时，靶特异性可为95％。此外，当gRNA与靶序列之间存在4个非互补结合(即gRNA与靶序列之间的互补结合为不完全互补结合(80％))时，靶特异性可为80％。
在又一实例中，当互补结合至gRNA的靶序列为脱靶靶标(即gRNA与靶序列之间的互补结合程度小于100％，即存在一个或多个非互补结合)时，靶特异性可根据非互补结合的位置而变化。
例如，当gRNA与靶序列之间存在一个非互补结合时，在所述非互补结合更接近于与靶序列相邻的PAM的情况下，靶特异性可低于在所述非互补结合远离PAM的情况下的靶特异性。
靶特异性可根据互补结合至靶序列的gRNA与Cas9之间的相互作用的程度而变化。
在一个实例中，当互补结合至靶序列的gRNA与Cas9之间的相互作用降低时，gRNA与靶序列之间的非互补结合的数目越小，靶特异性越高。
例如，当互补结合至靶序列的gRNA与Cas9之间的相互作用降低时，gRNA与靶序列之间存在一个非互补结合时的靶特异性可高于gRNA与靶序列之间存在3个非互补结合时的靶特异性。
在另一实例中，当互补结合至靶序列的gRNA与Cas9之间的相互作用降低时，仅当gRNA与靶序列之间的互补结合为完全互补结合(100％)时，Cas9可具有靶特异性。
例如，当互补结合至靶序列的gRNA与Cas9之间的相互作用降低时，仅当靶序列为中靶靶标时，Cas9可具有靶特异性。
靶特异性可根据互补结合至gRNA的靶序列与Cas9之间的相互作用的程度而变化。
在一个实例中，当互补结合至gRNA的靶序列与Cas9之间的相互作用降低时，gRNA与靶序列之间的非互补结合的数目越低，靶特异性越高。
例如，当互补结合至gRNA的靶序列与Cas9之间的相互作用降低时，相比于gRNA与靶序列之间存在4个非互补结合的情况，gRNA与靶序列之间存在2个非互补结合时的靶特异性可相对增加。
在另一实例中，当互补结合至gRNA的靶序列与Cas9之间的相互作用降低时，仅在gRNA与靶序列之间的互补结合为完全互补结合(100％)的情况下，Cas9可具有靶特异性。
例如，当互补结合至gRNA的靶序列与Cas9之间的相互作用降低时，仅当靶序列为中靶靶标时，Cas9可具有靶特异性。
靶特异性Cas9可为操纵中靶靶标的Cas9变体。
此处，操纵可为使用Cas9变体切割中靶靶标的核苷酸序列或修饰中靶靶标的核苷酸序列，使得可将一个或多个核苷酸从中靶靶标的核苷酸序列中删除和/或插入中靶靶标的核苷酸序列中。
靶特异性Cas9可为具有与野生型Cas9相同或更高的针对中靶靶标的靶特异性的Cas9变体。
靶特异性Cas9可为不操纵脱靶靶标的Cas9变体。
此处，操纵可为使用Cas9变体切割脱靶靶标的核苷酸序列或修饰脱靶靶标的核苷酸序列，使得可将一个或多个核苷酸从脱靶靶标的核苷酸序列中删除和/或插入脱靶靶标的核苷酸序列中。
靶特异性Cas9可为与野生型Cas9相比针对中靶靶标的靶特异性降低的Cas9变体。
靶特异性Cas9可为与野生型Cas9相比具有相同的针对中靶靶标的靶特异性以及更低的针对脱靶靶标的靶特异性的Cas9变体。
靶特异性Cas9可为与野生型Cas9相比具有相同的针对脱靶靶标的靶特异性以及更高的针对中靶靶标的靶特异性的Cas9变体。
靶特异性Cas9可为与野生型Cas9相比具有更高的针对中靶靶标的靶特异性以及更低的针对脱靶靶标的靶特异性的Cas9变体。
靶特异性Cas9可为与野生型Cas9相比具有更低的针对中靶靶标的靶特异性以及更低的针对脱靶靶标的靶特异性的Cas9变体。
在本文公开的公开内容的一个示例性实施方式中，靶特异性Cas9可为靶特异性SpCas9。
“靶特异性SpCas9(TS-SpCas9)”是指通过人工操纵来相比于野生型SpCas9而言相对提高靶特异性而产生的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为操纵中靶靶标的SpCas9变体。
此处，操纵可为使用SpCas9变体切割中靶靶标的核苷酸序列或修饰中靶靶标的核苷酸序列，使得可将一个或多个核苷酸从中靶靶标的核苷酸序列中删除和/或插入中靶靶标的核苷酸序列中。
TS-SpCas9可为具有与野生型SpCas9相同或更高的针对中靶靶标的靶特异性的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为不操纵脱靶靶标的SpCas9变体。
此处，操纵可为使用SpCas9变体切割脱靶靶标的核苷酸序列或修饰脱靶靶标的核苷酸序列，使得可将一个或多个核苷酸从脱靶靶标的核苷酸序列中删除和/或插入脱靶靶标的核苷酸序列中。
TS-SpCas9可为与野生型SpCas9相比具有降低的针对脱靶靶标的靶特异性的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为与野生型SpCas9相比具有相同的针对中靶靶标的靶特异性以及更低的针对脱靶靶标的靶特异性的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为与野生型SpCas9相比具有相同的针对脱靶靶标的靶特异性以及更高的针对中靶靶标的靶特异性的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为与野生型SpCas9相比具有更高的针对中靶靶标的靶特异性以及更低的针对脱靶靶标的靶特异性的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为与野生型SpCas9相比具有更低的针对中靶靶标的靶特异性以及更低的针对脱靶靶标的靶特异性的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为其中选自于野生型SpCas9的第一区域、第二区域、第三区域和第四区域中的一个或多个区域的氨基酸序列中的至少一个氨基酸被修饰的SpCas9变体。
第一区域可为野生型SpCas9的第196位的苯丙氨酸(F196)至第282位的异亮氨酸(I282)的氨基酸序列(区域1-1)。
第一区域可为野生型SpCas9的第316位的脯氨酸(P316)至第394位的天冬酰胺(N394)的氨基酸序列(区域1-2)。
第一区域可为野生型SpCas9的第510位的赖氨酸(K510)至第612位的天冬酰胺(N612)的氨基酸序列(区域1-3)。
第一区域可为野生型SpCas9的第678位的苏氨酸(T678)至第698位的组氨酸(H698)的氨基酸序列(区域1-4)。
第一区域可为选自于以下氨基酸序列中的两个区域：野生型SpCas9的第196位的苯丙氨酸(F196)至第282位的异亮氨酸(I282)的氨基酸序列(区域1-1)、野生型SpCas9的第316位的脯氨酸(P316)至第394位的天冬酰胺(N394)的氨基酸序列(区域1-2)、野生型SpCas9的第510位的赖氨酸(K510)至第612位的天冬酰胺(N612)的氨基酸序列(区域1-3)以及野生型SpCas9的第678位的苏氨酸(T678)至第698位的组氨酸(H698)的氨基酸序列(区域1-4)。
第一区域可为选自于以下氨基酸序列中的三个区域：野生型SpCas9的第196位的苯丙氨酸(F196)至第282位的异亮氨酸(I282)的氨基酸序列(区域1-1)、野生型SpCas9的第316位的脯氨酸(P316)至第394位的天冬酰胺(N394)的氨基酸序列(区域1-2)、野生型SpCas9的第510位的赖氨酸(K510)至第612位的天冬酰胺(N612)的氨基酸序列(区域1-3)以及野生型SpCas9的第678位的苏氨酸(T678)至第698位的组氨酸(H698)的氨基酸序列(区域1-4)。
第一区域可为以下氨基酸序列：野生型SpCas9的第196位的苯丙氨酸(F196)至第282位的异亮氨酸(I282)的氨基酸序列(区域1-1)、野生型SpCas9的第316位的脯氨酸(P316)至第394位的天冬酰胺(N394)的氨基酸序列(区域1-2)、野生型SpCas9的第510位的赖氨酸(K510)至第612位的天冬酰胺(N612)的氨基酸序列(区域1-3)以及野生型SpCas9的第678位的苏氨酸(T678)至第698位的组氨酸(H698)的氨基酸序列(区域1-4)。
第二区域可为野生型SpCas9的第1位的蛋氨酸(M1)至第22位的苏氨酸(T22)的氨基酸序列(区域2-1)。
第二区域可为野生型SpCas9的第731位的脯氨酸(P731)至第770位的苏氨酸(T770)的氨基酸序列(区域2-2)。
第二区域可为野生型SpCas9的第926位的谷氨酰胺(Q926)至第1040位的丝氨酸(S1040)的氨基酸序列(区域2-3)。
第二区域可为野生型SpCas9的第1位的蛋氨酸(M1)至第22位的苏氨酸(T22)的氨基酸序列(区域2-1)以及野生型SpCas9的第731位的脯氨酸(P731)至第770位的苏氨酸(T770)的氨基酸序列(区域2-2)。
第二区域可为野生型SpCas9的第1位的蛋氨酸(M1)至第22位的苏氨酸(T22)的氨基酸序列(区域2-1)以及野生型SpCas9的第926位的谷氨酰胺(Q926)至第1040位的丝氨酸(S1040)的氨基酸序列(区域2-3)。
第二区域可为野生型SpCas9的第731位的脯氨酸(P731)至第770位的苏氨酸(T770)的氨基酸序列(区域2-2)以及野生型SpCas9的第926位的谷氨酰胺(Q926)至第1040位的丝氨酸(S1040)的氨基酸序列(区域2-3)。
第二区域可为野生型SpCas9的第1位的蛋氨酸(M1)至第22位的苏氨酸(T22)的氨基酸序列(区域2-1)、野生型SpCas9的第731位的脯氨酸(P731)至第770位的苏氨酸(T770)的氨基酸序列(区域2-2)以及野生型SpCas9的第926位的谷氨酰胺(Q926)至第1040位的丝氨酸(S1040)的氨基酸序列(区域2-3)。
第三区域可为野生型SpCas9的第775位的赖氨酸(K775)至第900位的亮氨酸(L900)的氨基酸序列(区域3-1)。
第四区域可为野生型SpCas9的第1099位的谷氨酸(E1099)至第1139位的缬氨酸(V1139)的氨基酸序列(区域4-1)。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的第一区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的区域1-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域1-1的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281和I282。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的区域1-2的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域1-2的P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391和L393。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的区域1-3的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域1-3的K510，L513，L514，Y515，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，E584，D585，F587，N588，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606和L607。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的区域1-4的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域1-4的I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，N692，F693，M694，Q695，L696，I697和H698。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的区域1-1和区域1-2的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域1-1和区域1-2的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391和L393。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的区域1-1和区域1-3的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域1-1和区域1-3的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，K510，L513，L514，Y515，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，E584，D585，F587，N588，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606和L607。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的区域1-1和区域1-4的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域1-1和区域1-4的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，N692，F693，M694，Q695，L696，I697和H698。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的区域1-2和区域1-3的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域1-2和区域1-3的P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，K510，L513，L514，Y515，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，E584，D585，F587，N588，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606和L607。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的区域1-2和区域1-4的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域1-2和区域1-4的P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，N692，F693，M694，Q695，L696，I697和H698。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的区域1-3和区域1-4的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域1-3和区域1-4的K510，L513，L514，Y515，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，E584，D585，F587，N588，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，N692，F693，M694，Q695，L696，I697和H698。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2和区域1-3的氨基酸序列中的三个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于由以下氨基酸所组成的组中的三个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2和区域1-3的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，K510，L513，L514，Y515，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，1580，G582，V583，E584，D585，F587，N588，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606和L607。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2和区域1-4的氨基酸序列中的三个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于由以下氨基酸所组成的组中的三个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2和区域1-4的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，N692，F693，M694，Q695，L696，I697和H698。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的区域1-1、区域1-3和区域1-4的氨基酸序列中的三个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于由以下氨基酸所组成的组中的三个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域1-1、区域1-3和区域1-4的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，K510，L513，L514，Y515，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，E584，D585，F587，N588，A589，L59l，G592，L597，L598，I600，I60l，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，N692，F693，M694，Q695，L696，I697和H698。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的区域1-2、区域1-3和区域1-4的氨基酸序列中的三个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于由以下氨基酸所组成的组中的三个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域1-2、区域1-3和区域1-4的P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，K510，L513，L514，Y515，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，E584，D585，F587，N588，A589，L591，G592，L597，L598，I600，1601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，N692，F693，M694，Q695，L696，I697和H698。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和区域1-4的氨基酸序列中的四个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于由以下氨基酸所组成的组中的四个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体；野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和区域1-4的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，K510，L513，L514，Y515，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，E584，D585，F587，N588，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，N692，F693，M694，Q695，L696，I697和H698。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的A203；N277；G366；F539；或I601。
在另一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的A203/N277(A203和N277)；A203/G366；A203/F539；或A203/I601。
在又一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的N277/G366；N277/F539；或N277/I601。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的G366/F539；G366/I601；或F539/I601。
在另一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的A203/N277/G366；A203/N277/F539；A203/N277/I601；A203/G366/F539；A203/G366/I601；A203/F539/I601；N277/G366/F539；N277/G366/I601；或G366/F539/I601。
在又一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的A203/N277/G366/F539；A203/N277/G366/I601；A203/N277/F539/I601；A203/G366/F539/I601；或N277/G366/F539/I601。
在又一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰野生型SpCas9的A203/N277/G366/F539/I601而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的第二区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的区域2-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域2-1的I7，G8，L9，D10，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20和I21。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的区域2-2的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域2-2的P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，E762，M763，A764，R765，E766和N767。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的区域2-3的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域2-3的I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，Y1036，F1037，F1038和Y1039。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的区域2-1和区域2-2的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域2-1和区域2-2的I7，G8，L9，D10，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，E762，M763，A764，R765，E766和N767。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的区域2-1和区域2-3的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域2-1和区域2-3的I7，G8，L9，D10，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，Y1036，F1037，F1038和Y1039。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的区域2-2和区域2-3的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域2-2和区域2-3的P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，E762，M763，A764，R765，E766，N767，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，Y1036，F1037，F1038和Y1039。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的区域2-1、区域2-2和区域2-3的氨基酸序列中的三个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于由以下氨基酸所组成的组中的三个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域2-1、区域2-2和区域2-3的I7，G8，L9，D10，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，E762，M763，A764，R765，E766，N767，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，Y1036，F1037，F1038和Y1039。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰野生型SpCas9的M763；D965；或F1038而形成的SpCas9变体。
在另一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰野生型SpCas9的M763/D965；M763/F1038；或D965/F1038而形成的SpCas9变体。
在另一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰野生型SpCas9的M763/D965/F1038而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的第三区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的区域3-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域3-1的K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，V838，D839，H840，K848，D849，D850，D853，N854，K855，R859，D861，K862，N863，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，A889，K890，L891，R895，K896和D898。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰野生型SpCas9的K890而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的第四区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的区域4-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域4-1的T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰野生型SpCas9的T1102或D1127而形成的SpCas9变体。
在另一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰野生型SpCas9的T1102/D1127而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的第一区域和第二区域的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体。此处，两个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和/或区域1-4的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸以及选自于野生型SpCas9的区域2-1、区域2-2和/或区域2-3的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：分别选自于由野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和/或区域1-4的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696和I697所组成的组中的一个或多个氨基酸以及选自于由野生型SpCas9的区域2-1、区域2-2和/或区域2-3的I7，G8，L9，D10，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，E762，M763，A764，R765，E766，N767，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，Y1036，F1037，F1038和Y1039所组成的组中的一个或多个氨基酸。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的A203/M763；A203/D965；A203/F1038；A203/M763/D965；A203/M763/F1038；A203/D965/F1038；A203/M763/D965/F1038；N277/M763；N277/D965；N277/F1038；N277/M763/D965；N277/M763/F1038；N277/D965/F1038；N277/M763/D965/F1038；G366/M763；G366/D965；G366/F1038；G366/M763/D965；G366/M763/F1038；G366/D965/F1038；G366/M763/D965/F1038；F539/M763；F539/D965；F539/F1038；F539/M763/D965；F539/M763/F1038；F539/D965/F1038；F539/M763/D965/F1038；I601/M763；I601/D965；I601/F1038；I601/M763/D965；I601/M763/F1038；I601/D965/F1038；或I601/M763/D965/F1038。
在另一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的A203/N277/M763；A203/N277/D965；A203/N277/F1038；A203/N277/M763/D965；A203/N277/M763/F1038；A203/N277/D965/F1038；A203/N277/M763/D965/F1038；A203/G366/M763；A203/G366/D965；A203/G366/F1038；A203/G366/M763/D965；A203/G366/M763/F1038；A203/G366/D965/F1038；A203/G366/M763/D965/F1038；A203/F539/M763；A203/F539/D965；A203/F539/F1038；A203/F539/M763/D965；A203/F539/M763/F1038；A203/F539/D965/F1038；A203/F539/M763/D965/F1038；A203/I601/M763；A203/I601/D965；A203/I601/F1038；A203/I601/M763/D965；A203/I601/M763/F1038；A203/I601/D965/F1038；A203/I601/M763/D965/F1038；N277/G366/M763；N277/G366/D965；N277/G366/F1038；N277/G366/M763/D965；N277/G366/M763/F1038；N277/G366/D965/F1038；N277/G366/M763/D965/F1038；N277/F539/M763；N277/F539/D965；N277/F539/F1038；N277/F539/M763/D965；N277/F539/M763/F1038；N277/F539/D965/F1038；N277/F539/M763/D965/F1038；N277/I601/M763；N277/I601/D965；N277/I601/F1038；N277/I601/M763/D965；N277/I601/M763/F1038；N277/I601/D965/F1038；N277/I601/M763/D965/F1038；G366/F539/M763；G366/F539/D965；G366/F539/F1038；G366/F539/M763/D965；G366/F539/M763/F1038；G366/F539/D965/F1038；G366/F539/M763/D965/F1038；G366/I601/M763；G366/I601/D965；G366/I601/F1038；G366/I601/M763/D965；G366/I601/M763/F1038；G366/I601/D965/F1038；G366/I601/M763/D965/F1038；F539/I601/M763；F539/I601/D965；F539/I601/F1038；F539/I601/M763/D965；F539/I601/M763/F1038；F539/I601/D965/F1038；或F539/I601/M763/D965/F1038。
在又一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体；野生型SpCas9的A203/N277/G366/M763；A203/N277/G366/D965；A203/N277/G366/F1038；A203/N277/G366/M763/D965；A203/N277/G366/M763/F1038；A203/N277/G366/D965/F1038；A203/N277/G366/M763/D965/F1038；A203/N277/F539/M763；A203/N277/F539/D965；A203/N277/F539/F1038；A203/N277/F539/M763/D965；A203/N277/F539/M763/F1038；A203/N277/F539/D965/F1038；A203/N277/F539/M763/D965/F1038；A203/N277/I601/M763；A203/N277/I601/D965；A203/N277/I601/F1038；A203/N277/I601/M763/D965；A203/N277/I601/M763/F1038；A203/N277/I601/D965/F1038；A203/N277/I601/M763/D965/F1038；A203/G366/F539/M763；A203/G366/F539/D965；A203/G366/F539/F1038；A203/G366/F539/M763/D965；A203/G366/F539/M763/F1038；A203/G366/F539/D965/F1038；A203/G366/F539/M763/D965/F1038；A203/G366/I601/M763；A203/G366/I601/D965；A203/G366/I601/F1038；A203/G366/I601/M763/D965；A203/G366/I601/M763/F1038；A203/G366/I601/D965/F1038；A203/G366/I601/M763/D965/F1038；A203/F539/I601/M763；A203/F539/I601/D965；A203/F539/I601/F1038；A203/F539/I601/M763/D965；A203/F539/I601/M763/F1038；A203/F539/I601/D965/F1038；A203/F539/I601/M763/D965/F1038；N277/G366/F539/M763；N277/G366/F539/D965；N277/G366/F539/F1038；N277/G366/F539/M763/D965；N277/G366/F539/M763/F1038；N277/G366/F539/D965/F1038；N277/G366/F539/M763/D965/F1038；N277/G366/I601/M763；N277/G366/I601/D965；N277/G366/I601/F1038；N277/G366/I601/M763/D965；N277/G366/I601/M763/F1038；N277/G366/I601/D965/F1038；N277/G366/I601/M763/D965/F1038；G366/F539/I601/M763；G366/F539/I601/D965；G366/F539/I601/F1038；G366/F539/I601/M763/D965；G366/F539/I601/M763/F1038；G366/F539/I601/D965/F1038；或G366/F539/I601/M763/D965/F1038。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的A203/N277/G366/F539/M763；A203/N277/G366/F539/D965；A203/N277/G366/F539/F1038；A203/N277/G366/F539/M763/D965；A203/N277/G366/F539/M763/F1038；A203/N277/G366/F539/D965/F1038；A203/N277/G366/F539/M763/D965/F1038；A203/N277/G366/I601/M763；A203/N277/G366/I601/D965；A203/N277/G366/I601/F1038；A203/N277/G366/I601/M763/D965；A203/N277/G366/I601/M763/F1038；A203/N277/G366/I601/D965/F1038；A203/N277/G366/I601/M763/D965/F1038；N277/G366/F539/I601/M763；N277/G366/F539/I601/D965；N277/G366/F539/I601/F1038；N277/G366/F539/I601/M763/D965；N277/G366/F539/I601/M763/F1038；N277/G366/F539/I601/D965/F1038；N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038；A203/N277/G366/F539/I601/M763；A203/N277/G366/F539/I601/D965；A203/N277/G366/F539/I601/F1038；A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965；A203/N277/G366/F539/I601/M763/F1038；A203/N277/G366/F539/I601/D965/F1038；或A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的第一区域和第三区域的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体。此处，两个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和/或区域1-4的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸以及选自于野生型SpCas9的区域3-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：选自于由野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和/或区域1-4的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696和I697所组成的组中的一个或多个氨基酸以及选自于由野生型SpCas9的区域3-1的K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，V838，D839，H840，K848，D849，D850，D853，N854，K855，R859，D861，K862，N863，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，A889，K890，L891，R895，K896和D898所组成的组中的一个或多个氨基酸。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的A203/K890；N277/K890；G366/K890；F539/K890；或I601/K890。
在另一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的A203/N277/K890；A203/G366/K890；A203/F539/K890；A203/I601/K890；N277/G366/K890；N277/F539/K890；N277/I601/K890；G366/F539/K890；G366/I601/K890；或F539/I601/K890。
在又一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的A203/N277/G366/K890；A203/N277/F539/K890；A203/N277/I601/K890；A203/G366/F539/K890；A203/G366/I601/K890；A203/F539/I601/K890；N277/G366/F539/K890；N277/G366/I601/K890；或G366/F539/I601/K890。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的A203/N277/G366/F539/K890；A203/N277/G366/I601/K890；或N277/G366/F539/I601/K890。
在另一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰野生型SpCas9的A203/N277/G366/F539/I601/K890而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的第一区域和第四区域的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体。此处，两个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和/或区域1-4的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸以及选自于野生型SpCas9的区域4-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：选自于由野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和/或区域1-4的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696和I697所组成的组中的一个或多个氨基酸以及选自于由野生型SpCas9的区域4-1的T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138所组成的组中的一个或多个氨基酸。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的A203/T1102；N277/T1102；G366/T1102；F539/T1102；I601/T1102；A203/D1127；N277/D1127；G366/D1127；F539/D1127；I601/D1127；A203/T1102/D1127；N277/T1102/D1127；G366/T1102/D1127；F539/T1102/D1127；或I601/T1102/D1127。
在另一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的A203/N277/T1102；A203/G366/T1102；A203/F539/T1102；A203/I601/T1102；N277/G366/T1102；N277/F539/T1102；N277/I601/T1102；G366/F539/T1102；G366/I601/T1102；F539/I601/T1102；A203/N277/D1127；A203/G366/D1127；A203/F539/D1127；A203/I601/D1127；N277/G366/D1127；N277/F539/D1127；N277/I601/D1127；G366/F539/D1127；G366/I601/D1127；F539/I601/D1127；A203/N277/T1102/D1127；A203/G366/T1102/D1127；A203/F539/T1102/D1127；A203/I601/T1102/D1127；N277/G366/T1102/D1127；N277/F539/T1102/D1127；N277/I601/T1102/D1127；G366/F539/T1102/D1127；G366/I601/T1102/D1127；或F539/I601/T1102/D1127。
在又一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的A203/N277/G366/T1102；A203/N277/F539/I1102；A203/N277/I601/T1102；A203/G366/F539/T1102；A203/G366/I601/T1102；A203/F539/I601/T1102；N277/G366/F539/T1102；N277/G366/I601/T1102；G366/F539/I601/T1102；A203/N277/G366/D1127；A203/N277/F539/D1127；A203/N277/I601/D1127；A203/G366/F539/D1127；A203/G366/I601/D1127；A203/F539/I601/D1127；N277/G366/F539/D1127；N277/G366/I601/D1127；G366/F539/I601/D1127；A203/N277/G366/T1102/D1127；A203/N277/F539/T1102/D1127；A203/N277/I601/T1102/D1127；A203/G366/F539/T1102/D1127；A203/G366/I601/T1102/D1127；A203/F539/I601/T1102/D1127；N277/G366/F539/T1102/D1127；N277/G366/I601/T1102/D1127；或G366/F539/I601/T1102/D1127。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的A203/N277/G366/F539/T1102；A203/N277/G366/I601/T1102；N277/G366/F539/I601/T1102；A203/N277/G366/F539/D1127；A203/N277/G366/I601/D1127；N277/G366/F539/I601/D1127；A203/N277/G366/F539/T1102/D1127；A203/N277/G366/I601/T1102/D1127；或N277/G366/F539/I601/T1102/D1127。
在另一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的A203/N277/G366/F539/I601/T1102；A203/N277/G366/F539/I601/D1127；或A203/N277/G366/F539/I601/T1102/D1127
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的第二区域和第三区域的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体。此处，两个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的区域2-1、区域2-2和/或区域2-3的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸以及选自于野生型SpCas9的区域3-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：选自于由野生型SpCas9的区域2-1、区域2-2和/或区域2-3的I7，G8，L9，D10，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，E762，M763，A764，R765，E766，N767，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，Y1036，F1037，F1038和Y1039所组成的组中的一个或多个氨基酸以及选自于由野生型SpCas9的区域3-1的K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，V838，D839，H840，K848，D849，D850，D853，N854，K855，R859，D861，K862，N863，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，A889，K890，L891，R895，K896和D898所组成的组中的一个或多个氨基酸。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的M763/K890、K890/D965或K890/F1038。
在另一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的M763/K890/D965、M763/K890/F1038或K890/D965/F1038。
在另一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰野生型SpCas9的M763/K890/D965/F1038而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的第二区域和第四区域的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体。此处，两个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的区域2-1、区域2-2和/或区域2-3的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸以及选自于野生型SpCas9的区域4-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：选自于由野生型SpCas9的区域2-1、区域2-2和/或区域2-3的I7，G8，L9，D10，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，E762，M763，A764，R765，E766，N767，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，Y1036，F1037，F1038和Y1039所组成的组中的一个或多个氨基酸以及选自于由野生型SpCas9的区域4-1的T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138所组成的组中的一个或多个氨基酸。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的M763/T1102；D965/T1102；F1038/T1102；M763/D1127；D965/D1127；F1038/D1127；M763/T1102/D1127；D965/T1102/D1127；或F1038/T1102/D1127。
在另一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的M763/D965/T1102；M763/F1038/T1102；D965/F1038/T1102；M763/D965/D1127；M763/F1038/D1127；D965/F1038/D1127；M763/D965/T1102/D1127；M763/F1038/T1102/D1127；或D965/F1038/T1102/D1127。
在又一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的M763/D965/F1038/T1102；M763/D965/F1038/D1127；或M763/D965/F1038/T1102/D1127。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的第三区域和第四区域的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体。此处，两个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的区域3-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸以及选自于野生型SpCas9的区域4-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：选自于由野生型SpCas9的区域3-1的K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，D839，H840，K848，D849，D850，D853，K855，R859，D861，K862，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，K890，R895，K896和D898所组成的组中的一个或多个氨基酸以及选自于由野生型SpCas9的区域4-1的T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138所组成的组中的一个或多个氨基酸。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰野生型SpCas9的K890/T1102、K890/D1127或K890/T1102/D1127而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的第一区域、第二区域和第三区域的氨基酸序列中的三个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体。此处，三个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和/或区域1-4的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸；选自于野生型SpCas9的区域2-1、区域2-2和/或区域2-3的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸；以及选自于野生型SpCas9的区域3-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：选自于由野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和/或区域1-4的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，1350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696和I697所组成的组中的一个或多个氨基酸；选自于由野生型SpCas9的区域2-1、区域2-2和/或区域2-3的I7，G8，L9，D10，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，E762，M763，A764，R765，E766，N767，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，Y1036，F1037，F1038和Y1039所组成的组中的一个或多个氨基酸；以及选自于由野生型SpCas9的区域3-1的K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，V838，D839，H840，K848，D849，D850，D853，N854，K855，R859，D861，K862，N863，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，A889，K890，L891，R895，K896和D898所组成的组中的一个或多个氨基酸。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的A203/M763/K890；A203/K890/D965；A203/K890/F1038；A203/M763/K890/D965；A203/M763/K890/F1038；A203/K890/D965/F1038；A203/M763/K890/D965/F1038；N277/M763/K890；N277/K890/D965；N277/K890/F1038；N277/M763/K890/D965；N277/M763/K890/F1038；N277/K890/D965/F1038；N277/M763//K890D965/F1038；G366/M763/K890；G366/K890/D965；G366/K890/F1038；G366/M763/K890/D965；G366/M763/K890/F1038；G366/K890/D965/F1038；G366/M763/K890/D965/F1038；F539/M763/K890；F539/K890/D965；F539/K890/F1038；F539/M763/K890/D965；F539/M763/K890/F1038；F539/K890/D965/F1038；F539/M763/K890/D965/F1038；I601/M763/K890；I601/K890/D965；I601/K890/F1038；I601/M763/K890/D965；I601/M763/K890/F1038；I601/K890/D965/F1038；或I601/M763/K890/D965/F1038。
在另一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的A203/N277/M763/K890；A203/N277/K890/D965；A203/N277/K890/F1038；A203/N277/M763/K890/D965；A203/N277/M763/K890/F1038；A203/N277/K890/D965/F1038；A203/N277/M763/K890/D965/F1038；A203/G366/M763/K890；A203/G366/K890/D965；A203/G366/K890/F1038；A203/G366/M763/K890/D965；A203/G366/M763/K890/F1038；A203/G366/K890/D965/F1038；A203/G366/M763/K890/D965/F1038；A203/F539/M763/K890；A203/F539/K890/D965；A203/F539/K890/F1038；A203/F539/M763/K890/D965；A203/F539/M763/K890/F1038；A203/F539/K890/D965/F1038；A203/F539/M763/K890/D965/F1038；A203/I601/M763/K890；A203/I601/K890/D965；A203/I601/K890/F1038；A203/I601/M763/K890/D965；A203/I601/M763/K890/F1038；A203/I601/K890/D965/F1038；A203/I601/M763/K890/D965/F1038；N277/G366/M763/K890；N277/G366/K890/D965；N277/G366/K890/F1038；N277/G366/M763/K890/D965；N277/G366/M763/K890/F1038；N277/G366/K890/D965/F1038；N277/G366/M763/K890/D965/F1038；N277/F539/M763/K890；N277/F539/K890/D965；N277/F539/K890/F1038；N277/F539/M763/K890/D965；N277/F539/M763/K890/F1038；N277/F539/K890/D965/F1038；N277/F539/M763/K890/D965/F1038；N277/I601/M763/K890；N277/I601/K890/D965；N277/I601/K890/F1038；N277/I601/M763/K890/D965；N277/I601/M763/K890/F1038；N277/I601/K890/D965/F1038；N277/I601/M763/K890/D965/F1038；G366/F539/M763/K890；G366/F539/K890/D965；G366/F539/K890/F1038；G366/F539/M763/K890/D965；G366/F539/M763/K890/F1038；G366/F539/K890/D965/F1038；G366/F539/M763/K890/D965/F1038；G366/I601/M763/K890；G366/I601/K890/D965；G366/I601/K890/F1038；G366/I601/M763/K890/D965；G366/I601/M763/K890/F1038；G366/I601/K890/D965/F1038；G366/I601/M763/K890/D965/F1038；F539/I601/M763/K890；F539/I601/K890/D965；F539/I601/K890/F1038；F539/I601/M763/K890/D965；F539/I601/M763/K890/F1038；F539/I601/K890/D965/F1038；或F539/I601/M763/K890/D965/F1038。
在又一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的A203/N277/G366/M763/K890；A203/N277/G366/K890/D965；A203/N277/G366/K890/F1038；A203/N277/G366/M763/K890/D965；A203/N277/G366/M763/K890/F1038；A203/N277/G366/K890/D965/F1038；A203/N277/G366/M763/K890/D965/F1038；A203/N277/F539/M763/K890；A203/N277/F539/K890/D965；A203/N277/F539/K890/F1038；A203/N277/F539/M763/K890/D965；A203/N277/F539/M763/K890/F1038；A203/N277/F539/K890/D965/F1038；A203/N277/F539/M763/K890/D965/F1038；A203/N277/I601/M763/K890；A203/N277/I601/K890/D965；A203/N277/I601/K890/F1038；A203/N277/I601/M763/K890/D965；A203/N277/I601/M763/K890/F1038；A203/N277/I601/K890/D965/F1038；A203/N277/I601/M763/K890/D965/F1038；A203/G366/F539/M763/K890；A203/G366/F539/K890/D965；A203/G366/F539/K890/F1038；A203/G366/F539/M763/K890/D965；A203/G366/F539/M763/K890/F1038；A203/G366/F539/K890/D965/F1038；A203/G366/F539/M763/K890/D965/F1038；A203/G366/1601/M763/K890；A203/G366/I601/K890/D965；A203/G366/I601/K890/F1038；A203/G366/I601/M763/K890/D965；A203/G366/I601/M763/K890/F1038；A203/G366/I601/K890/D965/F1038；A203/G366/I601/M763/K890/D965/F1038；A203/F539/I601/M763/K890；A203/F539/I601/K890/D965；A203/F539/I601/K890/F1038；A203/F539/I601/M763/K890/D965；A203/F539/I601/M763/K890/F1038；A203/F539/I601/K890/D965/F1038；A203/F539/I601/M763/K890/D965/F1038；N277/G366/F539/M763/K890；N277/G366/F539/K890/D965；N277/G366/F539/K890/F1038；N277/G366/F539/M763/K890/D965；N277/G366/F539/M763/K890/F1038；N277/G366/F539/K890/D965/F1038；N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038；N277/G366/I601/M763/K890；N277/G366/I601/K890/D965；N277/G366/I601/K890/F1038；N277/G366/I601/M763/K890/D965；N277/G366/I601/M763/K890/F1038；N277/G366/I601/K890/D965/F1038；N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038；G366/F539/I601/M763/K890；G366/F539/I601/K890/D965；G366/F539/I601/K890/F1038；G366/F539/I601/M763/K890/D965；G366/F539/I601/M763/K890/F1038；G366/F539/I601/K890/D965/F1038；或G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的A203/N277/G366/F539/M763/K890；A203/N277/G366/F539/K890/D965；A203/N277/G366/F539/K890/F1038；A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965；A203/N277/G366/F539/M763/K890/F1038；A203/N277/G366/F539/K890/D965/F1038；A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038；A203/N277/G366/I601/M763/K890；A203/N277/G366/I601/K890/D965；A203/N277/G366/I601/K890/F1038；A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965；A203/N277/G366/I601/M763/K890/F1038；A203/N277/G366/I601/K890/D965/F1038；A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038；N277/G366/F539/I601/M763/K890；N277/G366/F539/I601/K890/D965；N277/G366/F539/I601/K890/F1038；N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965；N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038；N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038；N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038；A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890；A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965；A203/N277/G366/F539/I601/K890/F1038；A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965；A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038；A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038；或A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的第一区域、第二区域和第四区域的氨基酸序列中的三个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体。此处，三个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和/或区域1-4的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸；选自于野生型SpCas9的区域2-1、区域2-2和/或区域2-3的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸；以及选自于野生型SpCas9的区域4-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：选自于由野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和/或区域1-4的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696和I697所组成的组中的一个或多个氨基酸；选自于由野生型SpCas9的区域2-1、区域2-2和/或区域2-3的I7，G8，L9，D10，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，E762，M763，A764，R765，E766，N767，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，Y1036，F1037，F1038和Y1039所组成的组中的一个或多个氨基酸；以及选自于由野生型SpCas9的区域4-1的T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138所组成的组中的一个或多个氨基酸。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的A203/M763/T1102；A203//D965T1102；A203//F1038T1102；A203/M763/D965/T1102；A203/M763/F1038/T1102；A203/D965/F1038/T1102；A203/M763/D965/F1038/T1102；N277/M763/T1102；N277/D965/T1102；N277/F1038/T1102；N277/M763/D965/T1102；N277/M763/F1038/T1102；N277/D965/F1038/T1102；N277/M763/D965/F1038/T1102；G366/M763/T1102；G366/D965/T1102；G366/F1038/T1102；G366/M763/D965/T1102；G366/M763/F1038/T1102；G366/D965/F1038/T1102；G366/M763/D965/F1038/T1102；F539/M763/T1102；F539/D965/T1102；F539/F1038/T1102；F539/M763/D965/T1102；F539/M763/F1038/T1102；F539/D965/F1038/T1102；F539/M763/D965/F1038/T1102；I601/M763/T1102；I601/D965/T1102；I601/F1038/T1102；I601/M763/D965/T1102；I601/M763/F1038/T1102；I601/D965/F1038/T1102；I601/M763/D965/F1038/T1102；A203/M763/D1127；A203/D965/D1127；A203/F1038/D1127；A203/M763/D965/D1127；A203/M763/F1038/D1127；A203/D965/F1038/D1127；A203/M763/D965/F1038/D1127；N277/M763/D1127；N277/D965/D1127；N277/F1038/D1127；N277/M763/D965/D1127；N277/M763/F1038/D1127；N277/D965/F1038/D1127；N277/M763/D965/F1038/D1127；G366/M763/D1127；G366/D965/D1127；G366/F1038/D1127；G366/M763/D965/D1127；G366/M763/F1038/D1127；G366/D965/F1038/D1127；G366/M763/D965/F1038/D1127；F539/M763/D1127；F539/D965/D1127；F539/F1038/D1127；F539/M763/D965/D1127；F539/M763/F1038/D1127；F539/D965/F1038/D1127；F539/M763/D965/F1038/D1127；I601/M763/D1127；I601/D965/D1127；I601/F1038/D1127；I601/M763/D965/D1127；I601/M763/F1038D1127；I601/D965/F1038/D1127；或I601/M763/D965/F1038/D1127。
在另一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的A203/M763/T1102/D1127；A203/D965/T1102/D1127；A203/F1038/T1102/D1127；A203/M763/D965/T1102/D1127；A203/M763/F1038/T1102/D1127；A203/D965/F1038/T1102/D1127；A203/M763/D965/F1038/T1102/D1127；N277/M763/T1102/D1127；N277/D965/T1102/D1127；N277/F1038/T1102/D1127；N277/M763/D965/T1102/D1127；N277/M763/F1038/T1102/D1127；N277/D965/F1038/T1102/D1127；N277/M763/D965/F1038/T1102/D1127；G366/M763/T1102/D1127；G366/D965/T1102/D1127；G366/F1038/T1102/D1127；G366/M763/D965/T1102/D1127；G366/M763/F1038/T1102/D1127；G366/D965/F1038/T1102/D1127；G366/M763/D965/F1038/T1102/D1127；F539/M763/T1102/D1127；F539/D965/T1102/D1127；F539/F1038/T1102/D1127；F539/M763/D965/T1102/D1127；F539/M763/F1038/T1102/D1127；F539/D965/F1038/T1102/D1127；F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127；I601/M763/T1102/D1127；I601/D965/T1102/D1127；I601/F1038/T1102/D1127；I601/M763/D965/T1102/D1127；I601/M763/F1038T1102/D1127；I601/D965/F1038/T1102/D1127；或I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的A203/N277/M763/T1102；A203/N277/D965/T1102；A203/N277/F1038/T1102；A203/N277/M763/D965/T1102；A203/N277/M763/F1038/T1102；A203/N277/D965/F1038/T1102；A203/N277/M763/D965/F1038/T1102；A203/G366/M763/T1102；A203/G366/D965/T1102；A203/G366/F1038/T1102；A203/G366/M763/D965/T1102；A203/G366/M763/F1038/T1102；A203/G366/D965/F1038/T1102；A203/G366/M763/D965/F1038/T1102；A203/F539/M763/T1102；A203/F539/D965/T1102；A203/F539/F1038/T1102；A203/F539/M763/D965/T1102；A203/F539/M763/F1038/T1102；A203/F539/D965/F1038/T1102；A203/F539/M763/D965/F1038/T1102；A203/I601/M763/T1102；A203/I601/D965/T1102；A203/I601/F1038/T1102；A203/I601/M763/D965/T1102；A203/I601/M763/F1038/T1102；A203/I601/D965/F1038/T1102；A203/I601/M763/D965/F1038/T1102；N277/G366/M763/T1102；N277/G366/D965/T1102；N277/G366/F1038/T1102；N277/G366/M763/D965/T1102；N277/G366/M763/F1038/T1102；N277/G366/D965/F1038/T1102；N277/G366/M763/D965/F1038/T1102；N277/F539/M763/T1102；N277/F539/D965/T1102；N277/F539/F1038/T1102；N277/F539/M763/D965/T1102；N277/F539/M763/F1038/T1102；N277/F539/D965/F1038/T1102；N277/F539/M763/D965/F1038/T1102；N277/I601/M763/T1102；N277/I601/D965/T1102；N277/I601/F1038/T1102；N277/I601/M763/D965/T1102；N277/I601/M763/F1038/T1102；N277/I601/D965/F1038/T1102；N277/I601/M763/D965/F1038/T1102；G366/F539/M763/T1102；G366/F539/D965/T1102；G366/F539/F1038/T1102；G366/F539/M763/D965/T1102；G366/F539/M763/F1038/T1102；G366/F539/D965/F1038/T1102；G366/F539/M763/D965/F1038/T1102；G366/1601/M763/T1102；G366/I601/D965/T1102；G366/1601/F1038/T1102；G366/I601/M763/D965/T1102；G366/I601/M763/F1038/T1102；G366/I601/D965/F1038/T1102；G366/I601/M763/D965/F1038/T1102；F539/I601/M763/T1102；F539/I601/D965/T1102；F539/I601/F1038/T1102；F539/I601/M763/D965/T1102；F539/I601/M763/F1038/T1102；F539/I601/D965/F1038/T1102；F539/I601/M763/D965/F1038/T1102；A203/N277/M763/D1127；A203/N277/D965/D1127；A203/N277/F1038/D1127；A203/N277/M763/D965/D1127；A203/N277/M763/F1038/D1127；A203/N277/D965/F1038/D1127；A203/N277/M763/D965/F1038/D1127；A203/G366/M763/D1127；A203/G366/D965/D1127；A203/G366/F1038/D1127；A203/G366/M763/D965/D1127；A203/G366/M763/F1038/D1127；A203/G366/D965/F1038/D1127；A203/G366/M763/D965/F1038/D1127；A203/F539/M763/D1127；A203/F539/D965/D1127；A203/F539/F1038/D1127；A203/F539/M763/D965/D1127；A203/F539/M763/F1038/D1127；A203/F539/D965/F1038/D1127；A203/F539/M763/D965/F1038/D1127；A203/I601/M763/D1127；A203/I601/D965/D1127；A203/I601/F1038/D1127；A203/I601/M763/D965/D1127；A203/I601/M763/F1038/D1127；A203/I601/D965/F1038/D1127；A203/I601/M763/D965/F1038/D1127；N277/G366/M763/D1127；N277/G366/D965/D1127；N277/G366/F1038/D1127；N277/G366/M763/D965/D1127；N277/G366/M763/F1038/D1127；N277/G366/D965/F1038/D1127；N277/G366/M763/D965/F1038/D1127；N277/F539/M763/D1127；N277/F539/D965/D1127；N277/F539/F1038/D1127；N277/F539/M763/D965/D1127；N277/F539/M763/F1038/D1127；N277/F539/D965/F1038/D1127；N277/F539/M763/D965/F1038/D1127；N277/I601/M763/D1127；N277/I601/D965/D1127；N277/I601/F1038/D1127；N277/I601/M763/D965/D1127；N277/I601/M763/F1038/D1127；N277/I601/D965/F1038/D1127；N277/I601/M763/D965/F1038/D1127；G366/F539/M763/D1127；G366/F539/D965/D1127；G366/F539/F1038/D1127；G366/F539/M763/D965/D1127；G366/F539/M763/F1038/D1127；G366/F539/D965/F1038/D1127；G366/F539/M763/D965/F1038/D1127；G366/I601/M763/D1127；G366/I601/D965/D1127；G366/I601/F1038/D1127；G366/I601/M763/D965/D1127；G366/I601/M763/F1038/D1127；G366/I601/D965/F1038/D1127；G366/I601/M763/D965/F1038/D1127；F539/I601/M763/D1127；F539/I601/D965/D1127；F539/I601/F1038/D1127；F539/I601/M763/D965/D1127；F539/I601/M763/F1038/D1127；F539/I601/D965/F1038/D1127；或F539/I601/M763/D965/F1038/D1127。
在另一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体；野生型SpCas9的A203/N277/M763/T1102/D1127；A203/N277/D965/T1102/D1127；A203/N277/F1038/T1102/D1127；A203/N277/M763/D965/T1102/D1127；A203/N277/M763/F1038/T1102/D1127；A203/N277/D965/F1038/T1102/D1127；A203/N277/M763/D965/F1038/T1102/D1127；A203/G366/M763/T1102/D1127；A203/G366/D965/T1102/D1127；A203/G366/F1038/T1102/D1127；A203/G366/M763/D965/T1102/D1127；A203/G366/M763/F1038/T1102/D1127；A203/G366/D965/F1038/T1102/D1127；A203/G366/M763/D965/F1038/T1102/D1127；A203/F539/M763/T1102/D1127；A203/F539/D965/T1102/D1127；A203/F539/F1038/T1102/D1127；A203/F539/M763/D965/T1102/D1127；A203/F539/M763/F1038/T1102/D1127；A203/F539/D965/F1038/T1102/D1127；A203/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127；A203/I601/M763/T1102/D1127；A203/I601/D965/T1102/D1127；A203/I601/F1038/T1102/D1127；A203/I601/M763/D965/T1102/D1127；A203/I601/M763/F1038/T1102/D1127；A203/I601/D965/F1038/T1102/D1127；A203/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127；N277/G366/M763/T1102/D1127；N277/G366/D965/T1102/D1127；N277/G366/F1038/T1102/D1127；N277/G366/M763/D965/T1102/D1127；N277/G366/M763/F1038/T1102/D1127；N277/G366/D965/F1038/T1102/D1127；N277/G366/M763/D965/F1038/T1102/D1127；N277/F539/M763/T1102/D1127；N277/F539/D965/T1102/D1127；N277/F539/F1038/T1102/D1127；N277/F539/M763/D965/T1102/D1127；N277/F539/M763/F1038/T1102/D1127；N277/F539/D965/F1038/T1102/D1127；N277/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127；N277/I601/M763/T1102/D1127；N277/I601/D965/T1102/D1127；N277/I601/F1038/T1102/D1127；N277/I601/M763/D965/T1102/D1127；N277/I601/M763/F1038/T1102/D1127；N277/I601/D965/F1038/T1102/D1127；N277/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127；G366/F539/M763/T1102/D1127；G366/F539/D965/T1102/D1127；G366/F539/F1038/T1102/D1127；G366/F539/M763/D965/T1102/D1127；G366/F539/M763/F1038/T1102/D1127；G366/F539/D965/F1038/T1102/D1127；G366/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127；G366/I601/M763/T1102/D1127；G366/I601/D965/T1102/D1127；G366/I601/F1038/T1102/D1127；G366/I601/M763/D965/T1102/D1127；G366/I601/M763/F1038/T1102/D1127；G366/I601/D965/F1038/T1102/D1127；G366/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127；F539/I601/M763/T1102/D1127；F539/I601/D965/T1102/D1127；F539/I601/F1038/T1102/D1127；F539/I601/M763/D965/T1102/D1127；F539/I601/M763/F1038/T1102/D1127；F539/I601/D965/F1038/T1102/D1127：或F539/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的A203/N277/G366/M763/T1102；A203/N277/G366/D965/T1102；A203/N277/G366/F1038/T1102；A203/N277/G366/M763/D965/T1102；A203/N277/G366/M763/F1038/T1102；A203/N277/G366/D965/F1038/T1102；A203/N277/G366/M763/D965/F1038/T1102；A203/N277/F539/M763/T1102；A203/N277/F539/D965/T1102；A203/N277/F539/F1038/T1102；A203/N277/F539/M763/D965/T1102；A203/N277/F539/M763/F1038/T1102；A203/N277/F539/D965/F1038/T1102；A203/N277/F539/M763/D965/F1038/T1102；A203/N277/I601/M763/T1102；A203/N277/I601/D965/T1102；A203/N277/I601/F1038/T1102；A203/N277/I601/M763/D965/T1102；A203/N277/I601/M763/F1038/T1102；A203/N277/I601/D965/F1038/T1102；A203/N277/I601/M763/D965/F1038/T1102；A203/G366/F539/M763/T1102；A203/G366/F539/D965/T1102；A203/G366/F539/F1038/T1102；A203/G366/F539/M763/D965/T1102；A203/G366/F539/M763/F1038/T1102；A203/G366/F539/D965/F1038/T1102；A203/G366/F539/M763/D965/F1038/T1102；A203/G366/I601/M763/T1102；A203/G366/I601/D965/T1102；A203/G366/I601/F1038/T1102；A203/G366/I601/M763/D965/T1102；A203/G366/I601/M763/F1038/T1102；A203/G366/I601/D965/F1038/T1102；A203/G366/I601/M763/D965/F1038/T1102；A203/F539/I601/M763/T1102；A203/F539/I601/D965/T1102；A203/F539/I601/F1038/T1102；A203/F539/I601/M763/D965/T1102；A203/F539/I601/M763/F1038/T1102；A203/F539/I601/D965/F1038/T1102；A203/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102；N277/G366/F539/M763/T1102；N277/G366/F539/D965/T1102；N277/G366/F539/F1038/T1102；N277/G366/F539/M763/D965/T1102；N277/G366/F539/M763/F1038/T1102；N277/G366/F539/D965/F1038/T1102；N277/G366/F539/M763/D965/F1038/T1102；N277/G366/I601/M763/T1102；N277/G366/I601/D965/T1102；N277/G366/I601/F1038/T1102；N277/G366/I601/M763/D965/T1102；N277/G366/I601/M763/F1038/T1102；N277/G366/I601/D965/F1038/T1102；N277/G366/I601/M763/D965/F1038/T1102；G366/F539/I601/M763/T1102；G366/F539/I601/D965/T1102；G366/F539/I601/F1038/T1102；G366/F539/I601/M763/D965/T1102；G366/F539/I601/M763/F1038/T1102；G366/F539/I601/D965/F1038/T1102；G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102；A203/N277/G366/M763/D1127；A203/N277/G366/D965/D1127；A203/N277/G366/F1038/D1127；A203/N277/G366/M763/D965/D1127；A203/N277/G366/M763/F1038/D1127；A203/N277/G366/D965/F1038/D1127；A203/N277/G366/M763/D965/F1038/D1127；A203/N277/F539/M763/D1127；A203/N277/F539/D965/D1127；A203/N277/F539/F1038/D1127；A203/N277/F539/M763/D965/D1127；A203/N277/F539/M763/F1038/D1127；A203/N277/F539/D965/F1038/D1127；A203/N277/F539/M763/D965/F1038/D1127；A203/N277/I601/M763/D1127；A203/N277/I601/D965/D1127；A203/N277/I601/F1038/D1127；A203/N277/I601/M763/D965/D1127；A203/N277/I601/M763/F1038/D1127；A203/N277/I601/D965/F1038/D1127；A203/N277/I601/M763/D965/F1038/D1127；A203/G366/F539/M763/D1127；A203/G366/F539/D965/D1127；A203/G366/F539/F1038/D1127；A203/G366/F539/M763/D965/D1127；A203/G366/F539/M763/F1038/D1127；A203/G366/F539/D965/F1038/D1127；A203/G366/F539/M763/D965/F1038/D1127；A203/G366/I601/M763/D1127；A203/G366/I601/D965/D1127；A203/G366/I601/F1038/D1127；A203/G366/I601/M763/D965/D1127；A203/G366/I601/M763/F1038/D1127；A203/G366/I601/D965/F1038/D1127；A203/G366/I601/M763/D965/F1038/D1127；A203/F539/I601/M763/D1127；A203/F539/I601/D965/D1127；A203/F539/I601/F1038/D1127；A203/F539/I601/M763/D965/D1127；A203/F539/I601/M763/F1038/D1127；A203/F539/I601/D965/F1038/D1127；A203/F539/I601/M763/D965/F1038/D1127；N277/G366/F539/M763/D1127；N277/G366/F539/D965/D1127；N277/G366/F539/F1038/D1127；N277/G366/F539/M763/D965/D1127；N277/G366/F539/M763/F1038/D1127；N277/G366/F539/D965/F1038/D1127；N277/G366/F539/M763/D965/F1038/D1127；N277/G366/I601/M763/D1127；N277/G366/I601/D965/D1127；N277/G366/I601/F1038/D1127；N277/G366/I601/M763/D965/D1127；N277/G366/I601/M763/F1038/D1127；N277/G366/I601/D965/F1038/D1127；N277/G366/I601/M763/D965/F1038/D1127；G366/F539/I601/M763/D1127；G366/F539/I601/D965/D1127；G366/F539/I601/F1038/D1127；G366/F539/I601/M763/D965/D1127；G366/F539/1601/M763/F1038/D1127；G366/F539/I601/D965/F1038/D1127；或G366/F539/I601/M763/D965/F1038/D1127。
在另一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的A203/N277/G366/M763/T1102/D1127；A203/N277/G366/D965/T1102/D1127；A203/N277/G366/F1038/T1102/D1127；A203/N277/G366/M763/D965/T1102/D1127；A203/N277/G366/M763/F1038/T1102/D1127；A203/N277/G366/D965/F1038/T1102/D1127；A203/N277/G366/M763/D965/F1038/T1102/D1127；A203/N277/F539/M763/T1102/D1127；A203/N277/F539/D965/T1102/D1127；A203/N277/F539/F1038/T1102/D1127；A203/N277/F539/M763/D965/T1102/D1127；A203/N277/F539/M763/F1038/T1102/D1127；A203/N277/F539/D965/F1038/T1102/D1127；A203/N277/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127；A203/N277/I601/M763/T1102/D1127；A203/N277/I601/D965/T1102/D1127；A203/N277/I601/F1038/T1102/D1127；A203/N277/I601/M763/D965/T1102/D1127；A203/N277/I601/M763/F1038/T1102/D1127；A203/N277/I601/D965/F1038/T1102/D1127；A203/N277/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127；A203/G366/F539/M763/T1102/D1127；A203/G366/F539/D965/T1102/D1127；A203/G366/F539/F1038/T1102/D1127；A203/G366/F539/M763/D965/T1102/D1127；A203/G366/F539/M763/F1038/T1102/D1127；A203/G366/F539/D965/F1038/T1102/D1127；A203/G366/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127；A203/G366/I601/M763/T1102/D1127；A203/G366/I601/D965/T1102/D1127；A203/G366/I601/F1038/T1102/D1127；A203/G366/I601/M763/D965/T1102/D1127；A203/G366/I601/M763/F1038/T1102/D1127；A203/G366/I601/D965/F1038/T1102/D1127；A203/G366/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127；A203/F539/I601/M763/T1102/D1127；A203/F539/I601/D965/T1102/D1127；A203/F539/I601/F1038/T1102/D1127；A203/F539/I601/M763/D965/T1102/D1127；A203/F539/I601/M763/F1038/T1102/D1127；A203/F539/I601/D965/F1038/T1102/D1127；A203/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127；N277/G366/F539/M763/T1102/D1127；N277/G366/F539/D965/T1102/D1127；N277/G366/F539/F1038/T1102/D1127；N277/G366/F539/M763/D965/T1102/D1127；N277/G366/F539/M763/F1038/T1102/D1127；N277/G366/F539/D965/F1038/T1102/D1127；N277/G366/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127；N277/G366/I601/M763/T1102/D1127；N277/G366/I601/D965/T1102/D1127；N277/G366/I601/F1038/T1102/D1127；N277/G366/I601/M763/D965/T1102/D1127；N277/G366/I601/M763/F1038/T1102/D1127；N277/G366/I601/D965/F1038/T1102/D1127；N277/G366/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127；G366/F539/I601/M763/T1102/D1127；G366/F539/I601/D965/T1102/D1127；G366/F539/I601/F1038/T1102/D1127；G366/F539/I601/M763/D965/T1102/D1127；G366/F539/I601/M763/F1038/T1102/D1127；G366/F539/I601/D965/F1038/T1102/D1127；或G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的A203/N277/G366/F539/M763/T1102；A203/N277/G366/F539/D965/T1102；A203/N277/G366/F539/F1038/T1102；A203/N277/G366/F539/M763/D965/T1102；A203/N277/G366/F539/M763/F1038/T1102；A203/N277/G366/F539/D965/F1038/T1102；A203/N277/G366/F539/M763/D965/F1038/T1102；A203/N277/G366/I601/M763/T1102；A203/N277/G366/I601/D965/T1102；A203/N277/G366/I601/F1038/T1102；A203/N277/G366/I601/M763/D965/T1102；A203/N277/G366/I601/M763/F1038/T1102；A203/N277/G366/I601/D965/F1038/T1102；A203/N277/G366/I601/M763/D965/F1038/T1102；N277/G366/F539/I601/M763/T1102；N277/G366/F539/I601/D965/T1102；N277/G366/F539/I601/F1038/T1102；N277/G366/F539/I601/M763/D965/T1102；N277/G366/F539/I601/M763/F1038/T1102；N277/G366/F539/I601/D965/F1038/T1102；N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102；A203/N277/G366/F539/I601/M763/T1102；A203/N277/G366/F539/I601/D965/T1102；A203/N277/G366/F539/I601/F1038/T1102；A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/T1102；A203/N277/G366/F539/I601/M763/F1038/T1102；A203/N277/G366/F539/I601/D965/F1038/T1102；A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102；A203/N277/G366/F539/M763/D1127；A203/N277/G366/F539/D965/D1127；A203/N277/G366/F539/F1038/D1127；A203/N277/G366/F539/M763/D965/D1127A203/N277/G366/F539/M763/F1038/D1127；A203/N277/G366/F539/D965/F1038/D1127；A203/N277/G366/F539/M763/D965/F1038/D1127；A203/N277/G366/I601/M763/D1127；A203/N277/G366/I601/D965/D1127；A203/N277/G366/I601/F1038/D1127；A203/N277/G366/I601/M763/D965/D1127；A203/N277/G366/I601/M763/F1038/D1127；A203/N277/G366/I601/D965/F1038/D1127；A203/N277/G366/I601/M763/D965/F1038/D1127；N277/G366/F539/I601/M763/D1127；N277/G366/F539/I601/D965/D1127；N277/G366/F539/I601/F1038/D1127；N277/G366/F539/I601/M763/D965/D1127；N277/G366/F539/I601/M763/F1038/D1127；N277/G366/F539/I601/D965/F1038/D1127；N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/D1127；A203/N277/G366/F539/I601/M763/D1127；A203/N277/G366/F539/I601/D965/D1127；A203/N277/G366/F539/I601/F1038/D1127；A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/D1127；A203/N277/G366/F539/I601/M763/F1038/D1127；A203/N277/G366/F539/I601/D965/F1038/D1127；或A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/D1127。
在另一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的A203/N277/G366/F539/M763/T1102/D1127；A203/N277/G366/F539/D965/T1102/D1127；A203/N277/G366/F539/F1038/T1102/D1127；A203/N277/G366/F539/M763/D965/T1102/D1127；A203/N277/G366/F539/M763/F1038/T1102/D1127；A203/N277/G366/F539/D965/F1038/T1102/D1127；A203/N277/G366/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127；A203/N277/G366/I601/M763/T1102/D1127；A203/N277/G366/I601/D965/T1102/D1127；A203/N277/G366/I601/F1038/T1102/D1127；A203/N277/G366/I601/M763/D965/T1102/D1127；A203/N277/G366/I601/M763/F1038/T1102/D1127；A203/N277/G366/I601/D965/F1038/T1102/D1127；A203/N277/G366/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127；N277/G366/F539/I601/M763/T1102/D1127；N277/G366/F539/I601/D965/T1102/D1127；N277/G366/F539/I601/F1038/T1102/D1127；N277/G366/F539/I601/M763/D965/T1102/D1127；N277/G366/F539/I601/M763/F1038/T1102/D1127；N277/G366/F539/I601/D965/F1038/T1102/D1127；N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127；A203/N277/G366/F539/I601/M763/T1102/D1127；A203/N277/G366/F539/I601/D965/T1102/D1127；A203/N277/G366/F539/I601/F1038/T1102/D1127；A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/T1102/D1127；A203/N277/G366/F539/I601/M763/F1038/T1102/D1127；A203/N277/G366/F539/I601/D965/F1038/T1102/D1127；或A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的第二区域、第三区域和第四区域的氨基酸序列中的三个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体。此处，三个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的区域2-1、区域2-2和/或区域2-3的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸；选自于野生型SpCas9的区域3-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸；以及选自于野生型SpCas9的区域4-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：选自于由野生型SpCas9的区域2-1、区域2-2和/或区域2-3的I7，G8，L9，D10，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，E762，M763，A764，R765，E766，N767，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，Y1036，F1037，F1038和Y1039所组成的组中的一个或多个氨基酸；选自于由野生型SpCas9的区域3-1的K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，D839，H840，K848，D849，D850，D853，K855，R859，D861，K862，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，K890，R895，K896和D898所组成的组中的一个或多个氨基酸；以及选自于由野生型SpCas9的区域4-1的T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138所组成的组中的一个或多个氨基酸。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的M763/K890/T1102、K890/D965/T1102；K890/F1038/T1102；M763/K890/D1127；K890/D965/D1127；K890/F1038/D1127；M763/K890/T1102/D1127；K890/D965/T1102/D1127；或K890/F1038/T1102/D1127。
在另一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的M763/K890/D965/T1102；M763/K890/F1038/T1102；K890/D965/F1038/T1102；M763/K890/D965/D1127；M763/K890/F1038/D1127；K890/D965/F1038/D1127；M763/K890/D965/T1102/D1127；M763/K890/F1038/T1102/D1127；或K890/D965/F1038/T1102/D1127。
在又一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的M763/K890/D965/F1038/T1102；M763/K890/D965/F1038/D1127；或M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的第一区域、第二区域、第三区域和第四区域的氨基酸序列中的三个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体。此处，三个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
TS-SpCas9可为通过修饰选自于野生型SpCas9的区域2-1、区域2-2和/或区域2-3的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸；选自于野生型SpCas9的区域3-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸；以及选自于野生型SpCas9的区域4-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：选自于由野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和/或区域1-4的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696和I697所组成的组中的一个或多个氨基酸；选自于由野生型SpCas9的区域2-1、区域2-2和/或区域2-3的I7，G8，L9，D10，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，E762，M763，A764，R765，E766，N767，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，Y1036，F1037，F1038和Y1039所组成的组中的一个或多个氨基酸；选自于由野生型SpCas9的区域3-1的K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，D839，H840，K848，D849，D850，D853，K855，R859，D861，K862，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，K890，R895，K896和D898所组成的组中的一个或多个氨基酸；以及选自于由野生型SpCas9的区域4-1的T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138所组成的组中的一个或多个氨基酸。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的A203/M763/K890/T1102；A203/K890/D965/T1102；A203/K890/F1038/T1102；A203/M763/K890/D965/T1102；A203/M763/K890/F1038/T1102；A203/K890/D965/F1038/T1102；A203/M763/K890/D965/F1038/T1102；N277/M763/K890/T1102；N277/K890/D965/T1102；N277/K890/F1038/T1102；N277/M763/K890/D965/T1102；N277/M763/K890/F1038/T1102；N277/K890/D965/F1038/T1102；N277/M763//K890D965/F1038/T1102；G366/M763/K890/T1102；G366/K890/D965/T1102；G366/K890/F1038/T1102；G366/M763/K890/D965/T1102；G366/M763/K890/F1038/T1102；G366/K890/D965/F1038/T1102；G366/M763/K890/D965/F1038/T1102；F539/M763/K890/T1102；F539/K890/D965/T1102；F539/K890/F1038/T1102；F539/M763/K890/D965/T1102；F539/M763/K890/F1038/T1102；F539/K890/D965/F1038/T1102；F539/M763/K890/D965/F1038/T1102；I601/M763/K890/T1102；I601/K890/D965/T1102；I601/K890/F1038/T1102；I601/M763/K890/D965/T1102；I601/M763/K890/F1038/T1102；I601/K890/D965/F1038/T1102；I601/M763/K890/D965/F1038/T1102；A203/M763/K890/D1127；A203/K890/D965/D1127；A203/K890/F1038/D1127；A203/M763/K890/D965/D1127；A203/M763/K890/F1038/D1127；A203/K890/D965/F1038/D1127；A203/M763/K890/D965/F1038/D1127；N277/M763/K890/D1127；N277/K890/D965/D1127；N277/K890/F1038/D1127；N277/M763/K890/D965/D1127；N277/M763/K890/F1038/D1127；N277/K890/D965/F1038/D1127；N277/M763//K890D965/F1038/D1127；G366/M763/K890/D1127；G366/K890/D965/D1127；G366/K890/F1038/D1127；G366/M763/K890/D965/D1127；G366/M763/K890/F1038/D1127；G366/K890/D965/F1038/D1127；G366/M763/K890/D965/F1038/D1127；F539/M763/K890/D1127；F539/K890/D965/D1127；F539/K890/F1038/D1127；F539/M763/K890/D965/D1127；F539/M763/K890/F1038/D1127；F539/K890/D965/F1038/D1127；F539/M763/K890/D965/F1038/D1127；I601/M763/K890/D1127；I601/K890/D965/D1127；I601/K890/F1038/D1127；I601/M763/K890/D965/D1127；I601/M763/K890/F1038/D1127；I601/K890/D965/F1038/D1127；或I601/M763/K890/D965/F1038/D1127。
在另一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的A203/M763/K890/T1102/D1127；A203/K890/D965/T1102/D1127；A203/K890/F1038/T1102/D1127；A203/M763/K890/D965/T1102/D1127；A203/M763/K890/F1038/T1102/D1127；A203/K890/D965/F1038/T1102/D1127；A203/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127；N277/M763/K890/T1102/D1127；N277/K890/D965/T1102/D1127；N277/K890/F1038/T1102/D1127；N277/M763/K890/D965/T1102/D1127；N277/M763/K890/F1038/T1102/D1127；N277/K890/D965/F1038/T1102/D1127；N277/M763//K890D965/F1038/T1102/D1127；G366/M763/K890/T1102/D1127；G366/K890/D965/T1102/D1127；G366/K890/F1038/T1102/D1127；G366/M763/K890/D965/T1102/D1127；G366/M763/K890/F1038/T1102/D1127；G366/K890/D965/F1038/T1102/D1127；G366/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127；F539/M763/K890/T1102/D1127；F539/K890/D965/T1102/D1127；F539/K890/F1038/T1102/D1127；F539/M763/K890/D965/T1102/D1127；F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127；F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127；F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127；I601/M763/K890/T1102/D1127；I601/K890/D965/T1102/D1127；I601/K890/F1038/T1102/D1127；I601/M763/K890/D965/T1102/D1127；I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127；I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127；或I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的A203/N277/M763/K890/T1102；A203/N277/K890/D965/T1102；A203/N277/K890/F1038/T1102；A203/N277/M763/K890/D965/T1102；A203/N277/M763/K890/F1038/T1102；A203/N277/K890/D965/F1038/T1102；A203/N277/M763/K890/D965/F1038/T1102；A203/G366/M763/K890/T1102；A203/G366/K890/D965/T1102；A203/G366/K890/F1038/T1102；A203/G366/M763/K890/D965/T1102；A203/G366/M763/K890/F1038/T1102；A203/G366/K890/D965/F1038/T1102；A203/G366/M763/K890/D965/F1038/T1102；A203/F539/M763/K890/T1102；A203/F539/K890/D965/T1102；A203/F539/K890/F1038/T1102；A203/F539/M763/K890/D965/T1102；A203/F539/M763/K890/F1038/T1102；A203/F539/K890/D965/F1038/T1102；A203/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102；A203/I601/M763/K890/T1102；A203/I601/K890/D965/T1102；A203/I601/K890/F1038/T1102；A203/I601/M763/K890/D965/T1102；A203/I601/M763/K890/F1038/T1102；A203/I601/K890/D965/F1038/T1102；A203/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102；N277/G366/M763/K890/T1102；N277/G366/K890/D965/T1102；N277/G366/K890/F1038/T1102；N277/G366/M763/K890/D965/T1102；N277/G366/M763/K890/F1038/T1102；N277/G366/K890/D965/F1038/T1102；N277/G366/M763/K890/D965/F1038/T1102；N277/F539/M763/K890/T1102；N277/F539/K890/D965/T1102；N277/F539/K890/F1038/T1102；N277/F539/M763/K890/D965/T1102；N277/F539/M763/K890/F1038/T1102；N277/F539/K890/D965/F1038/T1102；N277/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102；N277/I601/M763/K890/T1102；N277/I601/K890/D965/T1102；N277/I601/K890/F1038/T1102；N277/I601/M763/K890/D965/T1102；N277/I601/M763/K890/F1038/T1102；N277/I601/K890/D965/F1038/T1102；N277/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102；G366/F539/M763/K890/T1102；G366/F539/K890/D965/T1102；G366/F539/K890/F1038/T1102；G366/F539/M763/K890/D965/T1102；G366/F539/M763/K890/F1038/T1102；G366/F539/K890/D965/F1038/T1102；G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102；G366/I601/M763/K890/T1102；G366/I601/K890/D965/T1102；G366/I601/K890/F1038/T1102；G366/I601/M763/K890/D965/T1102；G366/I601/M763/K890/F1038/T1102；G366/I601/K890/D965/F1038/T1102；G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102；F539/I601/M763/K890/T1102；F539/I601/K890/D965/T1102；F539/I601/K890/F1038/T1102；F539/I601/M763/K890/D965/T1102；F539/I601/M763/K890/F1038/T1102；F539/I601/K890/D965/F1038/T1102；F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102；A203/N277/M763/K890/D1127；A203/N277/K890/D965/D1127；A203/N277/K890/F1038/D1127；A203/N277/M763/K890/D965/D1127；A203/N277/M763/K890/F1038/D1127；A203/N277/K890/D965/F1038/D1127；A203/N277/M763/K890/D965/F1038/D1127；A203/G366/M763/K890/D1127；A203/G366/K890/D965/D1127；A203/G366/K890/F1038/D1127；A203/G366/M763/K890/D965/D1127；A203/G366/M763/K890/F1038/D1127；A203/G366/K890/D965/F1038/D1127；A203/G366/M763/K890/D965/F1038/D1127；A203/F539/M763/K890/D1127；A203/F539/K890/D965/D1127；A203/F539/K890/F1038/D1127；A203/F539/M763/K890/D965/D1127；A203/F539/M763/K890/F1038/D1127；A203/F539/K890/D965/F1038/D1127；A203/F539/M763/K890/D965/F1038/D1127；A203/I601/M763/K890/D1127；A203/I601/K890/D965/D1127；A203/I601/K890/F1038/D1127；A203/I601/M763/K890/D965/D1127；A203/I601/M763/K890/F1038/D1127；A203/I601/K890/D965/F1038/D1127；A203/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127；N277/G366/M763/K890/D1127；N277/G366/K890/D965/D1127；N277/G366/K890/F1038/D1127；N277/G366/M763/K890/D965/D1127；N277/G366/M763/K890/F1038/D1127；N277/G366/K890/D965/F1038/D1127；N277/G366/M763/K890/D965/F1038/D1127；N277/F539/M763/K890/D1127；N277/F539/K890/D965/D1127；N277/F539/K890/F1038/D1127；N277/F539/M763/K890/D965/D1127；N277/F539/M763/K890/F1038/D1127；N277/F539/K890/D965/F1038/D1127；N277/F539/M763/K890/D965/F1038/D1127；N277/I601/M763/K890/D1127；N277/I601/K890/D965/D1127；N277/I601/K890/F1038/D1127；N277/I601/M763/K890/D965/D1127；N277/I601/M763/K890/F1038/D1127；N277/I601/K890/D965/F1038/D1127；N277/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127；G366/F539/M763/K890/D1127；G366/F539/K890/D965/D1127；G366/F539/K890/F1038/D1127；G366/F539/M763/K890/D965/D1127；G366/F539/M763/K890/F1038/D1127；G366/F539/K890/D965/F1038/D1127；G366/F539/M763/K890/D965/F1038/D1127；G366/I601/M763/K890/D1127；G366/I601/K890/D965/D1127；G366/I601/K890/F1038/D1127；G366/I601/M763/K890/D965/D1127；G366/I601/M763/K890/F1038/D1127；G366/I601/K890/D965/F1038/D1127；G366/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127；F539/I601/M763/K890/D1127；F539/I601/K890/D965/D1127；F539/I601/K890/F1038/D1127；F539/I601/M763/K890/D965/D1127；F539/I601/M763/K890/F1038/D1127；F539/I601/K890/D965/F1038/D1127；或F539/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127。
在另一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的A203/N277/M763/K890/T1102/D1127；A203/N277/K890/D965/T1102/D1127；A203/N277/K890/F1038/T1102/D1127；A203/N277/M763/K890/D965/T1102/D1127；A203/N277/M763/K890/F1038/T1102/D1127；A203/N277/K890/D965/F1038/T1102/D1127；A203/N277/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127；A203/G366/M763/K890/T1102/D1127；A203/G366/K890/D965/T1102/D1127；A203/G366/K890/F1038/T1102/D1127；A203/G366/M763/K890/D965/T1102/D1127；A203/G366/M763/K890/F1038/T1102/D1127；A203/G366/K890/D965/F1038/T1102/D1127；A203/G366/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127；A203/F539/M763/K890/T1102/D1127；A203/F539/K890/D965/T1102/D1127；A203/F539/K890/F1038/T1102/D1127；A203/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127；A203/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127；A203/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127；A203/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127；A203/I601/M763/K890/T1102/D1127；A203/I601/K890/D965/T1102/D1127；A203/I601/K890/F1038/T1102/D1127；A203/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127；A203/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127；A203/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127；A203/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127；N277/G366/M763/K890/T1102/D1127；N277/G366/K890/D965/T1102/D1127；N277/G366/K890/F1038/T1102/D1127；N277/G366/M763/K890/D965/T1102/D1127；N277/G366/M763/K890/F1038/T1102/D1127；N277/G366/K890/D965/F1038/T1102/D1127；N277/G366/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127；N277/F539/M763/K890/T1102/D1127；N277/F539/K890/D965/T1102/D1127；N277/F539/K890/F1038/T1102/D1127；N277/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127；N277/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127；N277/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127；N277/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127；N277/I601/M763/K890/T1102/D1127；N277/I601/K890/D965/T1102/D1127；N277/I601/K890/F1038/T1102/D1127；N277/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127；N277/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127；N277/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127；N277/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127；G366/F539/M763/K890/T1102/D1127；G366/F539/K890/D965/T1102/D1127；G366/F539/K890/F1038/T1102/D1127；G366/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127；G366/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127；G366/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127；G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127；G366/I601/M763/K890/T1102/D1127；G366/I601/K890/D965/T1102/D1127；G366/I601/K890/F1038/T1102/D1127；G366/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127；G366/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127；G366/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127；G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127；F539/I601/M763/K890/T1102/D1127；F539/I601/K890/D965/T1102/D1127；F539/I601/K890/F1038/T1102/D1127；F539/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127；F539/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127；F539/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127；或F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的A203/N277/G366/M763/K890/T1102；A203/N277/G366/K890/D965/T1102；A203/N277/G366/K890/F1038/T1102；A203/N277/G366/M763/K890/D965/T1102；A203/N277/G366/M763/K890/F1038/T1102；A203/N277/G366/K890/D965/F1038/T1102；A203/N277/G366/M763/K890/D965/F1038/T1102；A203/N277/F539/M763/K890/T1102；A203/N277/F539/K890/D965/T1102；A203/N277/F539/K890/F1038/T1102；A203/N277/F539/M763/K890/D965/T1102；A203/N277/F539/M763/K890/F1038/T1102；A203/N277/F539/K890/D965/F1038/T1102；A203/N277/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102；A203/N277/I601/M763/K890/T1102；A203/N277/I601/K890/D965/T1102；A203/N277/I601/K890/F1038/T1102；A203/N277/I601/M763/K890/D965/T1102；A203/N277/I601/M763/K890/F1038/T1102；A203/N277/I601/K890/D965/F1038/T1102；A203/N277/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102；A203/G366/F539/M763/K890/T1102；A203/G366/F539/K890/D965/T1102；A203/G366/F539/K890/F1038/T1102；A203/G366/F539/M763/K890/D965/T1102；A203/G366/F539/M763/K890/F1038/T1102；A203/G366/F539/K890/D965/F1038/T1102；A203/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102；A203/G366/I601/M763/K890/T1102；A203/G366/I601/K890/D965/T1102；A203/G366/I601/K890/F1038/T1102；A203/G366/I601/M763/K890/D965/T1102；A203/G366/I601/M763/K890/F1038/T1102；A203/G366/I601/K890/D965/F1038/T1102；A203/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102；A203/F539/I601/M763/K890/T1102；A203/F539/I601/K890/D965/T1102；A203/F539/I601/K890/F1038/T1102；A203/F539/I601/M763/K890/D965/T1102；A203/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102；A203/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102；A203/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102；N277/G366/F539/M763/K890/T1102；N277/G366/F539/K890/D965/T1102；N277/G366/F539/K890/F1038/T1102；N277/G366/F539/M763/K890/D965/T1102；N277/G366/F539/M763/K890/F1038/T1102；N277/G366/F539/K890/D965/F1038/T1102；N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102；N277/G366/I601/M763/K890/T1102；N277/G366/I601/K890/D965/T1102；N277/G366/I601/K890/F1038/T1102；N277/G366/I601/M763/K890/D965/T1102；N277/G366/I601/M763/K890/F1038/T1102；N277/G366/I601/K890/D965/F1038/T1102；N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102；G366/F539/I601/M763/K890/T1102；G366/F539/I601/K890/D965/T1102；G366/F539/I601/K890/F1038/T1102；G366/F539/I601/M763/K890/D965/T1102；G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102；G366/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102；G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102；A203/N277/G366/M763/K890/D1127；A203/N277/G366/K890/D965/D1127；A203/N277/G366/K890/F1038/D1127；A203/N277/G366/M763/K890/D965/D1127；A203/N277/G366/M763/K890/F1038/D1127；A203/N277/G366/K890/D965/F1038/D1127；A203/N277/G366/M763/K890/D965/F1038/D1127；A203/N277/F539/M763/K890/D1127；A203/N277/F539/K890/D965/D1127；A203/N277/F539/K890/F1038/D1127；A203/N277/F539/M763/K890/D965/D1127A203/N277/F539/M763/K890/F1038/D1127；A203/N277/F539/K890/D965/F1038/D1127；A203/N277/F539/M763/K890/D965/F1038/D1127；A203/N277/I601/M763/K890/D1127；A203/N277/I601/K890/D965/D1127；A203/N277/I601/K890/F1038/D1127；A203/N277/I601/M763/K890/D965/D1127；A203/N277/I601/M763/K890/F1038/D1127；A203/N277/I601/K890/D965/F1038/D1127；A203/N277/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127；A203/G366/F539/M763/K890/D1127；A203/G366/F539/K890/D965/D1127；A203/G366/F539/K890/F1038/D1127；A203/G366/F539/M763/K890/D965/D1127A203/G366/F539/M763/K890/F1038/D1127；A203/G366/F539/K890/D965/F1038/D1127；A203/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/D1127；A203/G366/I601/M763/K890/D1127；A203/G366/I601/K890/D965/D1127；A203/G366/I601/K890/F1038/D1127；A203/G366/I601/M763/K890/D965/D1127；A203/G366/I601/M763/K890/F1038/D1127；A203/G366/I601/K890/D965/F1038/D1127；A203/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127；A203/F539/I601/M763/K890/D1127；A203/F539/I601/K890/D965/D1127；A203/F539/I601/K890/F1038/D1127；A203/F539/I601/M763/K890/D965/D1127；A203/F539/I601/M763/K890/F1038/D1127；A203/F539/I601/K890/D965/F1038/D1127；A203/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127；N277/G366/F539/M763/K890/D1127；N277/G366/F539/K890/D965/D1127；N277/G366/F539/K890/F1038/D1127；N277/G366/F539/M763/K890/D965/D1127N277/G366/F539/M763/K890/F1038/D1127；N277/G366/F539/K890/D965/F1038/D1127；N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/D1127；N277/G366/I601/M763/K890/D1127；N277/G366/I601/K890/D965/D1127；N277/G366/I601/K890/F1038/D1127；N277/G366/I601/M763/K890/D965/D1127；N277/G366/I601/M763/K890/F1038/D1127；N277/G366/I601/K890/D965/F1038/D1127；N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127；G366/F539/I601/M763/K890/D1127；G366/F539/I601/K890/D965/D1127；G366/F539/I601/K890/F1038/D1127；G366/F539/I601/M763/K890/D965/D1127；G366/F539/I601/M763/K890/F1038/D1127；G366/F539/I601/K890/D965/F1038/D1127；或G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127。
在另一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的A203/N277/G366/M763/K890/T1102/D1127；A203/N277/G366/K890/D965/T1102/D1127；A203/N277/G366/K890/F1038/T1102/D1127；A203/N277/G366/M763/K890/D965/T1102/D1127；A203/N277/G366/M763/K890/F1038/T1102/D1127；A203/N277/G366/K890/D965/F1038/T1102/D1127；A203/N277/G366/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127；A203/N277/F539/M763/K890/T1102/D1127；A203/N277/F539/K890/D965/T1102/D1127；A203/N277/F539/K890/F1038/T1102/D1127；A203/N277/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127；A203/N277/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127；A203/N277/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127；A203/N277/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127；A203/N277/I601/M763/K890/T1102/D1127；A203/N277/I601/K890/D965/T1102/D1127；A203/N277/I601/K890/F1038/T1102/D1127；A203/N277/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127；A203/N277/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127；A203/N277/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127；A203/N277/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127；A203/G366/F539/M763/K890/T1102/D1127；A203/G366/F539/K890/D965/T1102/D1127；A203/G366/F539/K890/F1038/T1102/D1127；A203/G366/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127；A203/G366/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127；A203/G366/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127；A203/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127；A203/G366/I601/M763/K890/T1102/D1127；A203/G366/I601/K890/D965/T1102/D1127；A203/G366/I601/K890/F1038/T1102/D1127；A203/G366/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127；A203/G366/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127；A203/G366/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127；A203/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127；A203/F539/I601/M763/K890/T1102/D1127；A203/F539/I601/K890/D965/T1102/D1127；A203/F539/I601/K890/F1038/T1102/D1127；A203/F539/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127；A203/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127；A203/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127；A203/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127；N277/G366/F539/M763/K890/T1102/D1127；N277/G366/F539/K890/D965/T1102/D1127；N277/G366/F539/K890/F1038/T1102/D1127；N277/G366/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127；N277/G366/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127；N277/G366/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127；N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127；N277/G366/I601/M763/K890/T1102/D1127；N277/G366/I601/K890/D965/T1102/D1127；N277/G366/I601/K890/F1038/T1102/D1127；N277/G366/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127；N277/G366/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127；N277/G366/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127；N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127；G366/F539/I601/M763/K890/T1102/D1127；G366/F539/I601/K890/D965/T1102/D1127；G366/F539/I601/K890/F1038/T1102/D1127；G366/F539/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127；G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127；G366/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127；或G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的A203/N277/G366/F539/M763/K890/T1102；A203/N277/G366/F539/K890/D965/T1102；A203/N277/G366/F539/K890/F1038/T1102；A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/T1102；A203/N277/G366/F539/M763/K890/F1038/T1102；A203/N277/G366/F539/K890/D965/F1038/T1102；A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102；A203/N277/G366/I601/M763/K890/T1102；A203/N277/G366/I601/K890/D965/T1102；A203/N277/G366/I601/K890/F1038/T1102；A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/T1102；A203/N277/G366/I601/M763/K890/F1038/T1102；A203/N277/G366/I601/K890/D965/F1038/T1102；A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102；N277/G366/F539/I601/M763/K890/T1102；N277/G366/F539/I601/K890/D965/T1102；N277/G366/F539/I601/K890/F1038/T1102；N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/T1102；N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102；N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102；N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102；A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/T1102；A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/T1102；A203/N277/G366/F539/I601/K890/F1038/T1102；A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/T1102；A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102；A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102；A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T110A203/N277/G366/F539/M763/K890/D1127；A203/N277/G366/F539/K890/D965/D1127；A203/N277/G366/F539/K890/F1038/D1127；A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/D1127；A203/N277/G366/F539/M763/K890/F1038/D1127；A203/N277/G366/F539/K890/D965/F1038/D1127；A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/D1127；A203/N277/G366/I601/M763/K890/D1127；A203/N277/G366/I601/K890/D965/D1127；A203/N277/G366/I601/K890/F1038/D1127；A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/D1127；A203/N277/G366/I601/M763/K890/F1038/D1127；A203/N277/G366/I601/K890/D965/F1038/D1127；A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127；N277/G366/F539/I601/M763/K890/D1127；N277/G366/F539/I601/K890/D965/D1127；N277/G366/F539/I601/K890/F1038/D1127；N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/D1127；N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/D1127；N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/D1127；N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127；A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D1127；A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/D1127；A203/N277/G366/F539/I601/K890/F1038/D1127；A203/N277/G366/F539/1601/M763/K890/D965/D1127；A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/D1127；A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/D1127；或A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127。
在另一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过修饰以下氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的A203/N277/G366/F539/M763/K890/T1102/D1127；A203/N277/G366/F539/K890/D965/T1102/D1127；A203/N277/G366/F539/K890/F1038/T1102/D1127；A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127；A203/N277/G366/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127；A203/N277/G366/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127；A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127；A203/N277/G366/I601/M763/K890/T1102/D1127；A203/N277/G366/I601/K890/D965/T1102/D1127；A203/N277/G366/I601/K890/F1038/T1102/D1127；A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127；A203/N277/G366/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127；A203/N277/G366/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127；A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127；N277/G366/F539/I601/M763/K890/T1102/D1127；N277/G366/F539/I601/K890/D965/T1102/D1127；N277/G366/F539/I601/K890/F1038/T1102/D1127；N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127；N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127；N277/G366/F539/I601/K890/D965/FI038/T1102/D1127；N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127；A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/T1102/D1127；A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/T1102/D1127；A203/N277/G366/F539/I601/K890/F1038/T1102/D1127；A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127；A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127；A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127；或A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127。
TS-SpCas9可为通过去除选自于野生型SpCas9的第一区域、第二区域、第三区域和/或第四区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过去除选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的第一区域的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696和I697；野生型SpCas9的第二区域的I7，G8，L9，D10，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，E762，M763，A764，R765，E766，N767，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，Y1036，F1037，F1038，和Y1039；野生型SpCas9的第三区域的K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，V838，D839，H840，K848，D849，D850，D853，N854，K855，R859，D861，K862，N863，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，A889，K890，L891，R895，K896和D898；和/或野生型SpCas9的第四区域的T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。
TS-SpCas9可为通过用不同的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的第一区域、第二区域、第三区域和/或第四区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过用不同的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的第一区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过用具有相对低的亲水指数的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和/或区域1-4的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696和I697中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用选自于由具有相对低的亲水指数的氨基酸(例如精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸和酪氨酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域1-1的A203(亲水指数：1.8)而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用具有相对低的亲水指数的氨基酸(例如天冬氨酸，亲水指数：-3.5)置换野生型SpCas9的区域1-1的A203(亲水指数：1.8)而形成的SpCas9变体。
在另一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用选自于由具有相对低的亲水指数的氨基酸(例如精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸和酪氨酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域1-2的G366(亲水指数：-0.4)而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用具有相对低的亲水指数的氨基酸(例如丝氨酸，亲水指数：-0.8)置换野生型SpCas9的区域1-2的G366(亲水指数：-0.4)而形成的SpCas9变体。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用选自于由具有相对低的亲水指数的氨基酸(例如丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸和酪氨酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域1-3的F539(亲水指数：2.8)而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用具有相对低的亲水指数的氨基酸(例如丝氨酸，亲水指数：-0.8)置换野生型SpCas9的区域1-3的F539(亲水指数；2.8)而形成的SpCas9变体。
在又一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用选自于由具有相对低的亲水指数的氨基酸(例如丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域1-3的I601(亲水指数：4.5)而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用具有相对低的亲水指数的氨基酸(例如天冬酰胺，亲水指数：-3.5)置换野生型SpCas9的区域1-3的1601(亲水指数：4.5)而形成的SpCas9变体。
在又一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用具有相对低的亲水指数的氨基酸分别置换野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和/或区域1-4的A203(亲水指数：1.8)、G366(亲水指数：-0.4)、F539(亲水指数：2.8)和I601(亲水指数：4.5)而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用具有相对低的亲水指数的氨基酸(例如天冬氨酸，亲水指数：-3.5)置换野生型SpCas9的区域1-1的A203(亲水指数：1.8)；用具有相对低的亲水指数的氨基酸(例如丝氨酸，亲水指数：-0.8)置换野生型SpCas9的区域1-2的G366(亲水指数：-0.4)；用具有相对低的亲水指数的氨基酸(例如丝氨酸，亲水指数：-0.8)置换野生型SpCas9的区域1-3的F539(亲水指数：2.8)；以及用具有相对低的亲水指数的氨基酸(例如天冬酰胺，亲水指数：-3.5)置换野生型SpCas9的区域1-3的I601(亲水指数：4.5)而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过用具有相对高的亲水指数的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和/或区域1-4的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696和I697。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用选自于由具有相对高的亲水指数的氨基酸(例如丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域1-1的N277(亲水指数：-3.5)而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用具有相对高的亲水指数的氨基酸(例如组氨酸，亲水指数：-3.2)置换野生型SpCas9的区域1-1的N277(亲水指数：-3.5)而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过用具有相对低或相对高的亲水指数的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和/或区域1-4的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696和I697。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用具有相对低或相对高的亲水指数的氨基酸分别置换野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和/或区域1-4的A203(亲水指数：1.8)、N277(亲水指数；-3.5)、G366(亲水指数：-0.4)、F539(亲水指数：2.8)和I601(亲水指数：4.5)而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用天冬氨酸(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸，亲水指数：-3.5)置换野生型SpCas9的区域1-1的A203(亲水指数：1.8)；用组氨酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸，亲水指数：-3.2)置换野生型SpCas9的区域1-1的N277(亲水指数：-3.5)；用丝氨酸(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸，亲水指数：-0.8)置换野生型SpCas9的区域1-2的G366(亲水指数：-0.4)；用丝氨酸(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸，亲水指数：-0.8)置换野生型SpCas9的区域1-3的F539(亲水指数：2.8)；以及用天冬酰胺(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸，亲水指数：-3.5)置换野生型SpCas9的区域1-3的I601(亲水指数：4.5)而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过用具有相对小的功能性基团的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体；野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和/或区域1-4的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696和I697。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用选自于由以下氨基酸(其为具有相对小的功能性基团的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域1-3的F539而形成的SpCas9变体：丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸。
例如，TS-SpCas9可为通过用天冬酰胺(其为具有相对小的功能性基团的氨基酸)置换野生型SpCas9的区域1-3的F539而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过用具有相对大的功能性基团的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和/或区域1-4的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696和I697。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用选自于由以下氨基酸(其为具有相对大的功能性基团的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域1-1的A203而形成的SpCas9变体：精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
例如，TS-SpCas9可为通过用天冬氨酸(其为具有相对大的功能性基团的氨基酸)置换野生型SpCas9的区域1-1的A203而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过用具有相对小或相对大的功能性基团的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和/或区域1-4的N199，I201，N202，A203，G205，V206，A208，A210，I211，L212，A214，L216，L222，N224，L225，I226，A227，Q228，L229，G231，N235，G236，L237，G239，N240，L241，I242，A243，L244，L246，G247，L248，N251，N255，L258，A259，A262，L264，Q265，L266，L275，N277，L278，L279，A280，Q281，I282，P316，L317，A319，M321，I322，L332，L334，L335，A337，L338，V339，L343，P344，I350，F351，F352，G358，A360，G361，I363，G365，G366，A367，F372，F375，I376，P378，I379，L380，M383，G385，L389，L390，V391，L393，L513，L514，F518，V520，L524，V527，V530，G533，M534，P537，A538，F539，L540，G542，A547，I548，V549，L551，L552，F553，V559，V561，L564，F569，I572，C574，F575，V578，I580，G582，V583，F587，A589，L591，G592，L597，L598，I600，I601，F606，L607，I679，L680，F682，L683，G687，F688，A689，F693，M694，L696和I697。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用具有相对小或相对大的功能性基团的氨基酸置换野生型SpCas9的区域1-1、区域1-2、区域1-3和/或区域1-4的A203，N277，G366，F539和I601而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用天冬氨酸、组氨酸、丝氨酸和天冬酰胺(其为具有相对大的功能性基团的氨基酸)分别置换野生型SpCas9的区域1-1的A203和N277、区域1-2的G366以及区域1-3的I601；以及用丝氨酸(其具有相对小的功能性基团)置换野生型SpCas9的区域1-3的F539而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过用不同的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的第二区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过用具有相对高的亲水指数的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域2-1、区域2-2和/或区域2-3的I7，G8，L9，D10，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，E762，M763，A764，R765，E766，N767，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，Y1036，F1037，F1038和Y1039。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用选自于由以下氨基酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域2-2的M763(亲水指数：1.9)而形成的SpCas9变体：半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸。
例如，TS-SpCas9可为通过用异亮氨酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸，亲水指数：4.5)置换野生型SpCas9的区域2-2的M763(亲水指数：1.9)而形成的SpCas9变体。
在另一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用选自于由以下氨基酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域2-3的D965(亲水指数：-3.5)而形成的SpCas9变体：丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
例如，TS-SpCas9可为通过用酪氨酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸，亲水指数：-1.3)置换野生型SpCas9的区域2-3的D965(亲水指数：-3.5)而形成的SpCas9变体。
在另一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用具有相对高的亲水指数的氨基酸置换野生型SpCas9的区域2-1、区域2-2和/或区域2-3的M763(亲水指数：1.9)和D965(亲水指数：-3.5)而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用异亮氨酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸，亲水指数：4.5)置换野生型SpCas9的区域2-2的M763(亲水指数：1.9)以及用酪氨酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸，亲水指数：-1.3)置换野生型SpCas9的区域2-3的D965(亲水指数：-3.5)而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过用具有相对低的亲水指数的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域2-1、区域2-2和/或区域2-3的I7，G8，L9，D10，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，E762，M763，A764，R765，E766，N767，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，Y1036，F1037，F1038和Y1039。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用选自于由以下氨基酸(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域2-3的F1037和/或F1038而形成的SpCas9变体：精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸和酪氨酸。
例如，TS-SpCas9可为通过用酪氨酸(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸，亲水指数：-1.3)置换野生型SpCas9的区域2-3的F1038(亲水指数：2.8)而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用精氨酸(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸，亲水指数：-4.5)置换野生型SpCas9的区域2-3的F1037(亲水指数；2.8)而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过用具有相对低或相对高的亲水指数的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域2-1、区域2-2和/或区域2-3的I7，G8，L9，D10，I11，G12，V16，G17，W18，A19，V20，I21，P731，A732，I733，G736，I737，L738，V741，V743，V744，L747，V748，V750，M751，G752，P756，I759，V760，I761，E762，M763，A764，R765，E766，N767，I927，V931，A932，I934，L935，M939，L949，I950，V953，V955，I956，L958，L962，V963，D965，F966，F970，F972，V975，U978，Y981，H982，H983，A984，H985，D986，A987，Y988，L989，A991，V992，V993，G994，A996，L997，I998，P1002，L1004，F1008，V1009，G1011，V1015，V1018，M1021，I1022，A1023，I1029，G1030，A1032，A1034，Y1036，F1037，F1038和Y1039。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用具有相对低或相对高的亲水指数的氨基酸置换野生型SpCas9的区域2-1、区域2-2和/或区域2-3的M763(亲水指数：1.9)、D965(亲水指数：-3.5)和F1038(亲水指数：2.8)而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用异亮氨酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸，亲水指数：4.5)置换野生型SpCas9的区域2-2的M763(亲水指数：1.9)；用酪氨酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸，亲水指数：-1.3)置换野生型SpCas9的区域2-3的D965(亲水指数：-3.5)；以及用酪氨酸(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸，亲水指数：-1.3)置换野生型SpCas9的区域2-3的F1038(亲水指数：2.8)而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过用不同的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的第三区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过用具有相对高的亲水指数的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域3-1的K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，V838，D839，H840，K848，D849，D850，D853，N854，K855，R859，D861，K862，N863，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，A889，K890，L891，R895，K896和D898。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用选自于由以下氨基酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域3-1的K890(亲水指数：-3.9)而形成的SpCas9变体：丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
例如，TS-SpCas9可为通过用天冬酰胺(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸，亲水指数：-3.5)置换野生型SpCas9的区域3-1的K890(亲水指数：-3.9)而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过用不带电荷的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域3-1的K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，V838，D839，H840，K848，D849，D850，D853，N854，K855，R859，D861，K862，N863，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，A889，K890，L891，R895，K896和D898。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用选自于由以下氨基酸(其为不带电荷的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域3-1的K890而形成的SpCas9变体：丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
例如，TS-SpCas9可为通过用谷氨酰胺(其为不带电荷的氨基酸)置换野生型SpCas9的区域3-1的K890而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用天冬酰胺(其为不带电荷的氨基酸)置换野生型SpCas9的区域3-1的K890而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过用具有相对小的功能性基团的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域3-1的K775，R778，E779，R780，K782，R783，E785，E786，K789，E790，K797，E798，H799，E802，E809，K810，R820，D821，D825，E827，D829，R832，D835，D837，V838，D839，H840，K848，D849，D850，D853，N854，K855，R859，D861，K862，N863，R864，K866，D868，E873，E874，K877，K878，K880，R884，A889，K890，L891，R895，K896和D898。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用选自于由以下氨基酸(其为具有相对小的功能性基团的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域3-1的K890和/或K896而形成的SpCas9变体：丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸。
例如，TS-SpCas9可为通过用天冬氨酸(其为具有相对小的功能性基团的氨基酸)置换野生型SpCas9的区域3-1的K890而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用天冬酰胺(其为具有相对小的功能性基团的氨基酸)置换野生型SpCas9的区域3-1的K896而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过用不同的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的第四区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过用具有相对低的亲水指数的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域4-1的T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用选自于由以下氨基酸(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域4-1的T1102而形成的SpCas9变体：精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、色氨酸和酪氨酸。
例如，TS-SpCas9可为通过用具有相对低的亲水指数的脯氨酸(亲水指数：-1.6)置换野生型SpCas9的区域4-1的T1102(亲水指数：-0.7)而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过用具有相对高的亲水指数的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域4-1的T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用选自于由以下氨基酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域4-1的S1106而形成的SpCas9变体：丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸和缬氨酸。
例如，TS-SpCas9可为通过用甘氨酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸，亲水指数：-0.4)置换野生型SpCas9的区域4-1的S1106(亲水指数：-0.8)而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过用具有相对低或相对高的亲水指数的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域4-1的T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。
例如，TS-SpCas9可为通过用具有相对低或相对高的亲水指数的氨基酸置换野生型SpCas9的区域4-1的T1102和S1136而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用具有相对低的亲水指数的脯氨酸(亲水指数：-1.6)置换野生型SpCas9的区域4-1的T1102(亲水指数：-0.7)以及用具有相对高的亲水指数的甘氨酸(亲水指数：-0.4)置换野生型SpCas9的S1106(亲水指数：-0.8)而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过用具有相对小的功能性基团的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域4-1的T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用具有相对小的功能性基团的氨基酸置换野生型SpCas9的区域4-1的T1102而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用具有相对小的功能性基团的脯氨酸置换野生型SpCas9的区域4-1的T1102而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过用具有相对大的功能性基团的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域4-1的T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用具有相对大的功能性基团的氨基酸置换野生型SpCas9的区域4-1的D1127而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用具有相对大的功能性基团的谷氨酸置换野生型SpCas9的区域4-1的D1127而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过用具有相对小或相对大的功能性基团的氨基酸置换选自于由以下氨基酸所组成的组中的两个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体：野生型SpCas9的区域4-1的T1102，S1106，E1108，S1116，D1117，D1125，D1127，D1135，S1136和T1138。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用具有相对小或相对大的功能性基团的氨基酸置换野生型SpCas9的区域4-1的T1102和D1127而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用具有相对小的功能性基团的脯氨酸置换野生型SpCas9的区域4-1的T1102以及用具有相对大的功能性基团的谷氨酸置换野生型SpCas9的区域4-1的D1127而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过用不同的氨基酸置换选自于野生型SpCas9的第一区域、第二区域、第三区域和/或第四区域的氨基酸序列中的两个或更多个氨基酸而形成的SpCas9变体。此处，两个或更多个氨基酸可分别存在于不同的区域中。
此处，关于在不同的区域中所选择的一个或多个氨基酸的置换的描述与上文所描述的相同。
TS-SpCas9可为通过用不同的氨基酸分别置换选自于野生型SpCas9的第一区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸以及选自于野生型SpCas9的第二区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用选自于由丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸和酪氨酸(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域1-3的F539(亲水指数：2.8)；以及用选自于由半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域2-2的M763(亲水指数：1.9)和/或A764(亲水指数：1.8)而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用丝氨酸(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸，亲水指数：-0.8)置换野生型SpCas9的区域1-3的F539(亲水指数：2.8)以及用异亮氨酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸，亲水指数：4.5)置换野生型SpCas9的区域2-2的M763(亲水指数：1.9)而形成的SpCas9变体。
在另一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用选自于由丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域1-3的I601(亲水指数：4.5)；以及用选自于由丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域2-3的D965(亲水指数：-3.5)而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用天冬酰胺(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸，亲水指数：-3.5)置换野生型SpCas9的区域1-3的I601(亲水指数：4.5)以及用酪氨酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸，亲水指数：-1.3)置换野生型SpCas9的区域2-3的D965(亲水指数：-3.5)而形成的SpCas9变体。
在又一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用选自于由精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸和酪氨酸(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域1-1的A203(亲水指数：1.8)；以及用选自于由半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域2-2的M763(亲水指数：1.9)和/或A764(亲水指数：1.8)而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用天冬氨酸(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸，亲水指数：-3.5)置换野生型SpCas9的区域1-1的A203(亲水指数：1.8)以及用异亮氨酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸，亲水指数：4.5)置换野生型SpCas9的区域2-2的M763(亲水指数：1.9)而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过用不同的氨基酸分别置换选自于野生型SpCas9的第一区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸以及选自于野生型SpCas9的第三区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用选自于由丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸和酪氨酸(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域1-3的F539(亲水指数：2.8)；以及用选自于由丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸(其为不带电荷的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域3-1的K890而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用丝氨酸(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸，亲水指数：-0.8)置换野生型SpCas9的区域1-3的F539(亲水指数：2.8)以及用天冬酰胺(其为不带电荷的氨基酸)置换野生型SpCas9的区域3-1的K890而形成的SpCas9变体。
在另一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用选自于由精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸(其为极性氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域1-3的F539和/或I601；以及用选自于由丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域3-1的K890(亲水指数：-3.9)而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用苏氨酸和谷氨酸(其为极性氨基酸)分别置换野生型SpCas9的区域1-3的F539和I601以及用天冬酰胺(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸，亲水指数：-3.5)置换野生型SpCas9的区域3-1的K890(亲水指数：-3.9)而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过用不同的氨基酸分别置换选自于野生型SpCas9的第一区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸以及选自于野生型SpCas9的第四区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用选自于由精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸和酪氨酸(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域1-1的A203(亲水指数：1.8)；以及用选自于由精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、色氨酸和酪氨酸(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域4-1的T1102而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用天冬氨酸(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸，亲水指数：-3.5)置换野生型SpCas9的区域1-1的A203(亲水指数：1.8)以及用脯氨酸(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸，亲水指数：-1.6)置换野生型SpCas9的区域4-1的T1102(亲水指数：-0.7)而形成的SpCas9变体。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用选自于由丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸和酪氨酸(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域1-3的F539(亲水指数：2.8)以及用具有相对大的功能性基团的氨基酸置换野生型SpCas9的区域4-1的D1127而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用丝氨酸(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸，亲水指数：-0.8)置换野生型SpCas9的区域1-3的F539(亲水指数：2.8)以及用具有相对大的功能性基团的谷氨酸置换野生型SpCas9的区域4-1的D1127而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过用不同的氨基酸分别置换选自于野生型SpCas9的第二区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸以及选自于野生型SpCas9的第三区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用选自于由半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域2-2的M763(亲水指数：1.9)和/或A764(亲水指数：1.8)；以及用选自于由丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸(其为不带电荷的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域3-1的K890而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用异亮氨酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸，亲水指数：4.5)置换野生型SpCas9的区域2-2的M763(亲水指数：1.9)以及用天冬酰胺(其为不带电荷的氨基酸)置换野生型SpCas9的区域3-1的K890而形成的SpCas9变体。
在另一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用选自于由精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸(其为极性氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域2-3的F1037和/或F1038以及用选自于由丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域3-1的K890(亲水指数：-3.9)而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用酪氨酸(其为极性氨基酸)置换野生型SpCas9的区域2-3的F1038以及用天冬酰胺(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸，亲水指数：-3.5)置换野生型SpCas9的区域3-1的K890(亲水指数：-3.9)而形成的SpCas9变体。
在另一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用选自于由半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域2-2的M763(亲水指数：1.9)和/或A764(亲水指数：1.8)；用选自于由精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸(其为极性氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域2-3的F1037和/或F1038；以及用选自于由丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸(其为不带电荷的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域3-1的K890而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用异亮氨酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸，亲水指数：4.5)置换野生型SpCas9的区域2-2的M763(亲水指数：1.9)；用酪氨酸(其为极性氨基酸)置换野生型SpCas9的区域2-3的F1038；以及用天冬酰胺(其为不带电荷的氨基酸)置换野生型SpCas9的区域3-1的K890而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过用不同的氨基酸分别置换选自于野生型SpCas9的第二区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸以及选自于野生型SpCas9的第四区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用选自于由半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域2-2的M763(亲水指数：1.9)和/或A764(亲水指数：1.8)；以及用选自于由精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、色氨酸和酪氨酸(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域4-1的T1102而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用异亮氨酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸，亲水指数：4.5)置换野生型SpCas9的区域2-2的M763(亲水指数：1.9)以及用脯氨酸(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸，亲水指数：-1.6)置换野生型SpCas9的区域4-1的T1102(亲水指数：-0.7)而形成的SpCas9变体。
在另一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用选自于由精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸(其为极性氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域2-3的F1037和/或F1038以及用具有相对大的功能性基团的氨基酸置换野生型SpCas9的区域4-1的D1127而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用酪氨酸(其为极性氨基酸)置换野生型SpCas9的区域2-3的F1038以及用具有相对大的功能性基团的谷氨酸置换野生型SpCas9的区域4-1的D1127而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过用不同的氨基酸分别置换选自于野生型SpCas9的第三区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸以及选自于野生型SpCas9的第四区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用选自于由丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸(其为不带电荷的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域3-1的K890以及用选自于由精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、色氨酸和酪氨酸(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域4-1的T1102而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用天冬酰胺(其为不带电荷的氨基酸)置换野生型SpCas9的区域3-1的K890以及用脯氨酸(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸，亲水指数：-1.6)置换野生型SpCas9的区域4-1的T1102(亲水指数：-0.7)而形成的SpCas9变体。
在另一示例性实施方式中、TS-SpCas9可为通过用选自于由丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域3-1的K890(亲水指数：-3.9)以及用具有相对大的功能性基团的氨基酸置换野生型SpCas9的区域4-1的D1127而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用天冬酰胺(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸，亲水指数：-3.5)置换野生型SpCas9的区域3-1的K890(亲水指数：-3.9)以及用具有相对大的功能性基团的谷氨酸置换野生型SpCas9的区域4-1的D1127而形成的SpCas9变体。
TS-SpCas9可为通过用不同的氨基酸分别置换选自于野生型SpCas9的第一区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸；选自于野生型SpCas9的第二区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸；和/或选自于野生型SpCas9的第三区域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用选自于由丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸和酪氨酸(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域1-3的F539(亲水指数：2.8)；用选自于由半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域2-2的M763(亲水指数：1.9)和/或A764(亲水指数：1.8)；以及用选自于由丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域3-1的K890(亲水指数：-3.9)而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用丝氨酸(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸，亲水指数：-0.8)置换野生型SpCas9的区域1-3的F539(亲水指数：2.8)；用异亮氨酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸，亲水指数：4.5)置换野生型SpCas9的区域2-2的M763(亲水指数：1.9)；以及用天冬酰胺(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸，亲水指数：-3.5)置换野生型SpCas9的区域3-1的K890(亲水指数：-3.9)而形成的SpCas9变体。
在另一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用选自于由精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸(其为极性氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸分别置换野生型SpCas9的区域1-3的F539和/或I601以及野生型SpCas9的区域2-3的F1037和/或F1038；用选自于由丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸(其为不带电荷的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域3-1的K890；以及用选自于由精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、色氨酸和酪氨酸(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域4-1的T1102而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用丝氨酸(其为极性氨基酸)置换野生型SpCas9的区域1-3的F539；用酪氨酸(其为极性氨基酸)置换野生型SpCas9的区域2-3的F1038；用天冬酰胺(其为不带电荷的氨基酸)置换野生型SpCas9的区域3-1的K890；以及用脯氨酸(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸，亲水指数：-1.6)置换野生型SpCas9的区域4-1的T1102而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用谷氨酸(其为极性氨基酸)置换野生型SpCas9的区域1-3的I601；用酪氨酸(其为极性氨基酸)置换野生型SpCas9的区域2-3的F1038；用天冬酰胺(其为不带电荷的氨基酸)置换野生型SpCas9的区域3-1的K890；以及用脯氨酸(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸，亲水指数：-1.6)置换野生型SpCas9的区域4-1的T1102而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用丝氨酸和天冬酰胺(其为极性氨基酸)分别置换野生型SpCas9的区域1-3的F539和I601；用酪氨酸(其为极性氨基酸)置换野生型SpCas9的区域2-3的F1038；用天冬酰胺(其为不带电荷的氨基酸)置换野生型SpCas9的区域3-1的K890；以及用脯氨酸(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸，亲水指数：-1.6)置换野生型SpCas9的区域4-1的T1102而形成的SpCas9变体。
在又一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用选自于由精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸(其为极性氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸分别置换野生型SpCas9的区域1-3的F539和/或I601；用选自于由半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域2-2的M763(亲水指数：1.9)和/或A764(亲水指数：1.8)；以及用选自于由丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸(其为不带电荷的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域3-1的K890而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用天冬酰胺(其为极性氨基酸)置换野生型SpCas9的区域1-3的I601；用异亮氨酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸，亲水指数：4.5)置换野生型SpCas9的区域2-2的M763(亲水指数：1.9)；以及用天冬酰胺(其为不带电荷的氨基酸)置换野生型SpCas9的区域3-1的K890而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用丝氨酸和天冬酰胺(其为极性氨基酸)分别置换野生型SpCas9的区域1-3的F539和I601；用异亮氨酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸，亲水指数：4.5)置换野生型SpCas9的区域2-2的M763(亲水指数：1.9)；以及用天冬酰胺(其为不带电荷的氨基酸)置换野生型SpCas9的区域3-1的K890而形成的SpCas9变体。
在另一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用选自于由精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸和酪氨酸(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域1-1的A203(亲水指数：1.8)；用选自于由半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域2-2的M763(亲水指数：1.9)和/或A764(亲水指数：1.8)；以及用选自于由丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸(其为不带电荷的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域3-1的K890而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用天冬氨酸(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸，亲水指数；-3.5)置换野生型SpCas9的区域1-1的A203(亲水指数：1.8)；用异亮氨酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸，亲水指数：4.5)置换野生型SpCas9的区域2-2的M763(亲水指数：1.9)；用酪氨酸(其为极性氨基酸)置换野生型SpCas9的区域2-3的F1038；以及用天冬酰胺(其为不带电荷的氨基酸)置换野生型SpCas9的区域3-1的K890而形成的SpCas9变体。
在又一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用选自于由丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域1-3的I601(亲水指数：4.5)；用选自于由丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域2-3的D965(亲水指数：-3.5)；以及用选自于由精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、色氨酸和酪氨酸(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸)所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的区域4-1的T1102而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用天冬酰胺(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸，亲水指数：-3.5)置换野生型SpCas9的区域1-3的I601(亲水指数：4.5)；用异亮氨酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸，亲水指数：4.5)置换野生型SpCas9的区域2-2的M763(亲水指数：1.9)；用酪氨酸(其为具有相对高的亲水指数的氨基酸，亲水指数：-1.3)置换野生型SpCas9的区域2-3的D965(亲水指数：-3.5)；以及用脯氨酸(其为具有相对低的亲水指数的氨基酸，亲水指数：-1.6)置换野生型SpCas9的区域4-1的T1102(亲水指数：-0.7)而形成的SpCas9变体。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用具有相对小或相对大的功能性基团的氨基酸置换选自于由野生型SpCas9的区域1-1的A203和N277、区域1-2的G366以及区域1-3的F539和I601所组成的组中的一个或多个氨基酸；用具有相对小或相对大的功能性基团的氨基酸置换选自于由野生型SpCas9的区域2-2的M763以及区域2-3的D956和F1038所组成的组中的一个或多个氨基酸；用不带电荷的氨基酸置换野生型SpCas9的区域3-1的K890；以及用具有相对小或相对大的功能性基团的氨基酸置换选自于由野生型SpCas9的区域4-1的T1102和D1127所组成的组中的一个或多个氨基酸而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用丝氨酸(具有相对大的功能性基团的氨基酸)、丝氨酸(具有相对小的功能性基团的氨基酸)和天冬酰胺(具有相对大的功能性基团的氨基酸)分别置换野生型SpCas9的区域1-2的G366以及区域1-3的F539和I601；用异亮氨酸(具有相对小的功能性基团的氨基酸)和酪氨酸(具有相对大的功能性基团的氨基酸)分别置换野生型SpCas9的区域2-2的M763和区域2-3的F1038；用不带电荷的天冬酰胺置换野生型SpCas9的区域3-1的K890；以及用具有相对大的功能性基团的谷氨酸置换野生型SpCas9的区域4-1的D1127而形成的SpCas9变体。
例如，TS-SpCas9可为通过用天冬氨酸(具有相对大的功能性基团的氨基酸)、组氨酸(具有相对大的功能性基团的氨基酸)、丝氨酸(具有相对大的功能性基团的氨基酸)、丝氨酸(具有相对小的功能性基团的氨基酸)和天冬酰胺(具有相对大的功能性基团的氨基酸)分别置换野生型SpCas9的区域1-1的A203和N277、区域1-2的G366以及区域1-3的F539和I601；用异亮氨酸(具有相对小的功能性基团的氨基酸)、酪氨酸(具有相对大的功能性基团的氨基酸)和酪氨酸(具有相对大的功能性基团的氨基酸)分别置换野生型SpCas9的区域2-2的M763以及区域2-3的D956和F1038；用不带电荷的天冬酰胺置换野生型SpCas9的区域3-1的K890；以及用脯氨酸(具有相对小的功能性基团的氨基酸)和谷氨酸(具有相对大的功能性基团的氨基酸)分别置换野生型SpCas9的区域4-1的T1102和D1127而形成的SpCas9变体。
作为本文公开的TS-SpCas9的实例，TS-SpCas9可为通过用不同的氨基酸置换野生型SpCas9的F539、M763和/或K890而形成的SpCas9变体。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的F539而形成的SpCas9变体：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸和酪氨酸。
例如，TS-SpCas9可为通过用丝氨酸置换野生型SpCas9的F539而形成的SpCas9变体。此处，通过用丝氨酸置换F539而形成的TS-SpCas9(F539S)可为与野生型SpCas9相比，其中SpCas9(F539S)的REC结构域与gRNA的PAM远端和/或靶序列之间的相互作用可被改变的SpCas9变体。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用选自于由以下氨基酸所组成的组中的一个氨基酸置换野生型SpCas9的M763而形成的SpCas9变体：半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸。
例如，TS-SpCas9可为通过用异亮氨酸置换野生型SpCas9的M763而形成的SpCas9变体。此处，通过用异亮氨酸置换M763而形成的TS-SpCas9(M763I)可为与野生型SpCas9相比，其中SpCas9(M763I)的RuvC结构域与金属之间的相互作用可被改变的SpCas9变体。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸置换野生型SpCas9的K890而形成的SpCas9变体。
例如，SpCas9可为通过用天冬酰胺置换野生型SpCas9的K890而形成的SpCas9变体。此处，通过用天冬酰胺置换K890而形成的TS-SpCas9(K890N)可为与野生型SpCas9相比，其中SpCas9(K890N)的HNH结构域与金属之间的相互作用被改变的SpCas9变体。
在另一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用与原始氨基酸不同的氨基酸分别置换野生型SpCas9的F539和M763而形成的SpCas9变体。
此处，与原始氨基酸不同的氨基酸可为选自于由以下氨基酸所组成的组中的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸。
例如，TS-SpCas9可为通过用丝氨酸和异亮氨酸分别置换野生型SpCas9的F539和M763而形成的SpCas9变体。此处，其中F539和M763分别被丝氨酸和异亮氨酸置换的TS-SpCas9(F539S，M763I)可为与野生型SpCas9相比，其中SpCas9(F539S，M763I)的REC结构域与gRNA的PAM远端和/或靶序列之间的相互作用以及SpCas9(F539S，M763I)的RuvC结构域与金属之间的相互作用被改变的SpCas9变体。
在又一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用与原始氨基酸不同的氨基酸置换野生型SpCas9的F539和K890而形成的SpCas9变体。
此处，与原始氨基酸不同的氨基酸可为选自于由以下氨基酸所组成的组中的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸。
例如，TS-SpCas9可为通过用丝氨酸和天冬酰胺分别置换野生型SpCas9的F539和K890而形成的SpCas9变体。此处，通过用丝氨酸和天冬酰胺分别置换F539和K890而形成的TS-SpCas9(F539S，K890N)可为与野生型SpCas9相比，其中SpCas9(F539S，K890N)的REC结构域与gRNA的PAM远端和/或靶序列之间的相互作用以及SpCas9(F539S，K890N)的HNH结构域与金属之间的相互作用被改变的SpCas9变体。
在另一示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用与原始氨基酸不同的氨基酸置换野生型SpCas9的M763和K890而形成的SpCas9变体。
此处，与原始氨基酸不同的氨基酸可为选自于由以下氨基酸所组成的组中的氨基酸：丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
例如，TS-SpCas9可为通过用异亮氨酸和天冬酰胺分别置换野生型SpCas9的M763和K890而形成的SpCas9变体。此处，通过用异亮氨酸和天冬酰胺分别置换M763和K890而形成的TS-SpCas9(M763I，K890N)可为与野生型SpCas9相比，其中SpCas9(M763I，K890N)的RuvC结构域与金属之间的相互作用以及SpCas9(M763I，K890N)的HNH结构域与金属之间的相互作用被改变的SpCas9变体。
在一个示例性实施方式中，TS-SpCas9可为通过用与原始氨基酸不同的氨基酸置换野生型SpCas9的F539、M763和K890而形成的SpCas9变体。
此处，与原始氨基酸不同的氨基酸可为选自于由以下氨基酸所组成的组中的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸。
例如，TS-SpCas9可为通过用丝氨酸、异亮氨酸和天冬酰胺置换野生型SpCas9的F539、M763和K890而形成的SpCas9变体(SEQ ID NO：11)。此处，通过用丝氨酸、异亮氨酸和天冬酰胺分别置换F539、M763和K890而形成的TS-SpCas9(F539S，M763I，K890N)可为与野生型SpCas9相比，其中SpCas9(F539S，M763I，K890N)的REC结构域与gRNA的PAM远端和/或靶序列之间的相互作用、SpCas9(F539S，M763I，K890N)的RuvC结构域与金属之间的相互作用以及SpCas9(F539S，M763I，K890N)的HNH结构域与金属之间的相互作用被改变的SpCas9变体。
在本文公开的公开内容的一个示例性实施方式中，人工工程化Cas9可为融合蛋白。
融合蛋白可为包含靶特异性Cas9以及一个或多个功能性结构域的人工产生的蛋白。
上文已经提供了靶特异性Cas9的描述。
上文已经提供了功能性结构域的描述。
例如，融合蛋白可为包含TS-SpCas9和脱氨酶的人工产生的蛋白。
此处，TS-SpCas9可为通过用与原始氨基酸不同的氨基酸分别置换野生型SpCas9的D10、F539、M763和K890而形成的SpCas9变体。
或者，TS-SpCas9可为通过用与原始氨基酸不同的氨基酸分别置换野生型SpCas9的F539、M763、H840和K890而形成的SpCas9变体。
或者，TS-SpCas9可为通过用与原始氨基酸不同的氨基酸分别置换野生型SpCas9的D10、F539、M763、H840和K890而形成的SpCas9变体。
此处，脱氨酶可为腺嘌呤脱氨酶和/或胞苷脱氨酶。
此处，融合蛋白可为处于脱氨酶融合至TS-SpCas9的N-末端的形式的人工产生的蛋白。
或者，融合蛋白可为处于脱氨酶融合至TS-SpCas9的C-末端的形式的人工产生的蛋白。
或者，融合蛋白可为处于相同或不同的脱氨酶分别融合至TS-SpCas9的N-末端和C-末端的形式的人工产生的蛋白。
本文公开的CRISPR酶、人工工程化CRISPR酶、CRISPR酶变体、Cas9、人工工程化Cas9、Cas9变体或靶特异性Cas9可为多肽或蛋白质。
本文公开的CRISPR酶、人工工程化CRISPR酶、CRISPR酶变体、Cas9、人工工程化Cas9、Cas9变体或靶特异性Cas9可为具有编码多肽或蛋白质的核苷酸序列的核酸。
可将CRISPR酶、人工工程化CRISPR酶、CRISPR酶变体、Cas9、人工工程化Cas9、Cas9变体或靶特异性Cas9针对待导入的受试者进行密码子优化。
术语“密码子优化”是指通过在维持天然氨基酸序列的同时用宿主细胞中更频繁或最频繁使用的密码子代替天然序列的至少一个密码子来修饰核酸序列，以改善在宿主细胞中的表达的过程。多种物种对特定氨基酸的特定密码子具有特定偏好，并且密码子偏好(生物体之间密码子使用中的差异)通常与mRNA的翻译效率(其被认为取决于翻译的密码子的特征和特定tRNA分子的利用度)相关。在细胞中所选择的tRNA的优势通常反映了肽合成中最常使用的密码子。因此，可基于密码子优化通过给定生物体中的最佳基因表达来对基因进行定制。
具有编码多肽或蛋白质的核苷酸序列的核酸可为非载体的形式。
非载体可为裸DNA、DNA复合物或mRNA。
具有编码多肽或蛋白质的核苷酸序列的核酸可包含在载体中。
此处，具有编码多肽或蛋白质的核苷酸序列的核酸可包含在一个载体中，或者也可被分割并包含在数个载体中。
载体可为质粒。
载体可为病毒载体或非病毒载体。
载体可包含一个或多个调节/控制成分。
此处，调节/控制成分可包含启动子、增强子、内含子、聚腺苷酸化信号、Kozak共有序列、内部核糖体进入位点(IRES)、剪接受体和/或2A序列。
启动子可为由RNA聚合酶II识别的启动子。
启动子可为由RNA聚合酶III识别的启动子。
启动子可为诱导型启动子。
启动子可为受试者特异性启动子。
启动子可为病毒或非病毒启动子。
启动子可根据控制区域(即，编码引导核酸或编辑蛋白的核酸序列)使用合适的启动子。
例如，可用于CRISPR酶的启动子可为CMV、EF-1a、EFS、MSCV、PGK或CAG启动子。
载体可为病毒载体或重组病毒载体。
病毒可为DNA病毒或RNA病毒。
此处，DNA病毒可为双链DNA(dsDNA)病毒或单链DNA(ssDNA)病毒。
此处，RNA病毒可为单链RNA(ssRNA)病毒。
病毒可为逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、牛痘病毒(vacciniavirus)、痘病毒(poxvirus)或单纯疱疹病毒，但本发明不限于此。
通常，病毒可感染宿主(例如细胞)，从而将编码病毒遗传信息的核酸导入宿主或将编码遗传信息的核酸插入宿主基因组。可使用具有此种特性的病毒将引导核酸和/或编辑蛋白导入受试者。使用病毒导入的引导核酸和/或编辑蛋白可在受试者(例如细胞)中瞬时表达。或者，使用病毒导入的引导核酸和/或编辑蛋白可在受试者(例如细胞)中长时间(例如1周、2周或3周，1个月、2个月、3个月、6个月或9个月，1年或2年，或永久)持续表达。
取决于病毒类型，病毒的包装能力可为至少2kb-50kb。根据包装能力，可设计仅包含CRISPR酶的病毒载体或包含CRISPR酶和gRNA的病毒载体。或者，可设计包含CRISPR酶、gRNA以及其它成分的病毒载体。
在一个实例中，编码CRISPR酶的核酸可包含在重组慢病毒载体中。
在另一实例中，编码CRISPR酶的核酸可包含在重组腺病毒载体中。
在另一实例中，编码CRISPR酶的核酸可包含在重组AAV载体中。
在又一实例中，编码CRISPR酶的核酸可包含在嵌合载体(hybrid vector)(例如本文公开的病毒中的一种或多种嵌合载体)中。
在本文公开的一个示例性实施方式中，可表达编码CRISPR酶变体和/或Cas9变体的核酸，以使用CRISPR酶变体和/或Cas9变体。表达可通过各种方法进行。例如，可将编码CRISPR酶变体和/或Cas9变体的核酸克隆至中间病毒中，以转导至原核或真核细胞中以进行克隆和/或表达。为储存或操纵编码CRISPR酶变体和/或Cas9变体的核酸以产生CRISPR酶变体和/或Cas9变体，中间载体通常为原核载体(例如质粒)、穿梭载体或昆虫载体。此外，可将CRISPR酶变体和/或Cas9变体的核酸克隆至表达载体中，以导入植物细胞、动物细胞(优选哺乳动物细胞或人细胞)、真菌细胞、细菌细胞或原生动物细胞中。
为完成表达，通常将编码CRISPR酶变体和/或Cas9变体的序列亚克隆至含有引导转录的启动子的表达载体中。用于表达工程化蛋白的细菌表达系统可从例如大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)以及沙门氏菌属(Salmonella sp.)获得。用于表达系统的试剂盒是可商购的。用于哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞的真核细胞表达系统在本领域中是众所周知的，并且也是可商购的。
用于引导核酸表达的启动子取决于特定的应用。例如，典型的强组成型启动子用于表达和扩增融合蛋白。与之相比，当将CRISPR酶变体和/或Cas9变体导入活体以进行基因调节时，可根据CRISPR酶变体和/或Cas9变体的具体应用来使用组成型或诱导型启动子。此外，用于导入CRISPR酶变体和/或Cas9变体的优选启动子可为弱启动子，例如HSV TK或具有相似活性的启动子。启动子还可包含转录活化应答元件，例如缺氧应答元件、Ga14应答元件、1ac抑制剂应答元件以及小分子控制系统(例如四环素调节系统和RU-486系统)。
除启动子外，典型地，表达载体还包含含有在宿主细胞(如原核或真核细胞)中核酸表达所需的额外元件的表达盒或转录单元。因此，典型的表达盒可包含例如可操作地连接至编码CRISPR酶变体和/或Cas9变体的核酸序列的启动子；以及例如转录本的有效聚腺苷酸化、转录终止、核糖体结合位点或翻译终止所需的随机信号。盒的额外元件可包含例如增强子和剪接的异源内含子信号。
针对CRISPR酶变体和/或Cas9变体的期望用途(例如在植物、动物、细菌、真菌、原生动物等中表达)选择用于将遗传信息转移至细胞的特异性表达载体。标准细菌表达载体包括质粒(例如基于pBR322的质粒、pSKF和pET23D)以及可商购的标签融合表达系统(例如GST和LacZ)。
含有衍生自真核细胞病毒的调节元件的表达载体经常用于真核表达载体，例如SV40载体、乳头瘤病毒载体或衍生自Epstein-Barr病毒的载体。其它示例性真核载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒、pDSVE以及允许在以下启动子的引导下进行蛋白质表达的其它载体：SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或其它显示出对于在真核细胞中的表达有效的启动子。
用于表达CRISPR酶变体和/或Cas9变体的载体可包含用于诱导引导RNA表达的RNAPolIII启动子，例如H1、U6或7SK启动子。此类人启动子允许质粒转染后CRISPR酶变体和/或Cas9变体在哺乳动物细胞中表达。
一些表达系统具有用于选择稳定转染细胞系的标记，例如胸苷激酶、潮霉素B磷酸转移酶和二氢叶酸还原酶。例如，在昆虫细胞中除处于多角体蛋白启动子或其它强杆状病毒启动子的引导下的gRNA编码序列外还使用杆状病毒载体的高产量表达系统也是合适的。
通常包含在表达载体中的元件还包括在大肠杆菌中起作用的复制子、用以允许对含有重组质粒的细菌进行选择的编码抗生素抗性的基因以及用以允许插入重组序列的质粒的非必需区域中的独特限制位点。
表达大量蛋白质的细菌、哺乳动物、酵母或昆虫细胞系使用标准转染方法生产并使用标准技术进行纯化(例如参见Methods in Enzymology，vol.182(Deutscher编，1990)中的Colley等，1989，J.Biol.Chem.264：17619-22；Guide to Protein Purification)。真核细胞和原核细胞的转化根据标准技术进行(例如参见Morrison，1977，J.Bacteriol.132：349-351；Clark-Curtiss&Curtiss，Methods in Enzymology 101：347-362(Wu等编，1983))。
可使用将外来核苷酸序列导入宿主细胞的任何已知程序。这些程序包括磷酸钙转染、聚凝胺、原生质体融合、电穿孔、核转染、脂质体、显微注射、裸DNA、质粒载体、病毒载体、游离型和整合型载体以及用于将克隆的基因组DNA、cDNA、合成的DNA或其它外来遗传物质导入宿主细胞的其它众所周知的方法。本文使用的特定基因操纵程序必须成功地将至少一个基因导入能够表达CRISPR酶变体和/或Cas9变体的宿主细胞中。
在本文公开的一个示例性实施方式中，可提供能够表达CRISPR酶变体和/或Cas9变体的载体以及包含所述载体的细胞。
实施例
在下文中，将参考实施例详细描述本发明。
实施例仅为进一步详细地描述本发明而提供，对于本领域普通技术人员显而易见的是，本发明的范围不限于以下实施例。
实施例1.Cas9变体
1.Cas9变体文库
使用3个独立的方案构建SpCas9变体文库。对于第一文库，将Cas9文库质粒转化至XL1-红感受态细胞(Agilent)(按照供应商手册中的说明进行培养)中。对于第二文库和第三文库，使用Genemorph II(Agilent)和Diversify PCR随机诱变试剂盒(Clontech)，在低错误率(0-5突变/kb)的条件下用针对Gibson组装设计的引物对来自Cas9文库质粒序列的整个WT-SpCas9进行易错PCR。随后，对PCR产物进行凝胶纯化。对纯化的随机诱变文库和Cas9文库质粒的骨架进行Gibson组装。将组装的文库转化至EnduraTM电感受态细胞(Lucigen)中，并在氯霉素LB平板(12.5μg/mL)上在37℃下孵育过夜。培养转化细胞后，使用Midi prep试剂盒(NucleoBond Xtra Midi EF，Macherey-Nagel)分离并纯化每个文库。使用多靶标系统通过靶特异性Cas9筛选方法(WO 2017217768)筛选获得的文库，从而选择靶特异性Cas9变体。
2-1.编码靶特异性Cas9变体的质粒
购买编码野生型SpCas9的质粒(p3s-Cas9HC，Addgene质粒#43945)，并将其用于产生靶特异性SpCas9变体。靶特异性SpCas9变体的构建体通过包含期望的位点突变的核酸序列以及p3s-Cas9HC质粒骨架的Gibson组装产生。通过Sanger测序确认所有构建体。
2-2.编码靶特异性Cas9变体的质粒
购买编码野生型SpCas9的质粒(p3s-Cas9HC，Addgene质粒#43945)，并将其用于产生靶特异性SpCas9变体。为产生靶特异性SpCas9变体，使用定点诱变试剂盒在编码野生型SpCas9的质粒中产生包含位点突变的构建体。通过Sanger测序确认所有构建体。
实施例2.Cas9变体的靶基因操纵效果
实验方法
1.细胞培养和转染条件
将HEK293T细胞(ATCC，CRL-11268)保持在补充有10％FBS(胎牛血清)和1％抗生素的DMEM培养基中。为通过Cas9变体进行基因操纵，转染前将HEK293T细胞接种至48孔板中直至达到70％-80％汇合度。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，用Cas9变体表达质粒(250ng)和sgRNA表达质粒(250ng)转染细胞。转染后72小时，使用DNeasy Blood&Tissue试剂盒(Qiagen)分离并提取基因组DNA。
2.基因组DNA的体外切割
使用DNeasy Blood&Tissue试剂盒(Qiagen)从HEK293T细胞纯化基因组DNA。将基因组DNA(10μg)与Cas9或Sniper1蛋白(100nM)以及4种sgRNA(每种75nM)以1mL反应体积在缓冲液(100mM NaCl，50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，100μg/mL BSA，pH7.9)中于37℃下孵育8小时。消化的基因组DNA用RNase A(50μg/mL)进行处理以降解sgRNA，并用DNeasy Blood&Tissue试剂盒(Qiagen)再次纯化。
3.全基因组和消化基因组(digenome)测序
使用Covaris系统(Life Technologies)将基因组DNA(1μg)片段化至400bp-500bp范围，并使用End Repair Mix(Thermo Fischer)使片段两端成为平端。为构建文库，将片段化DNA与接头连接，然后使用Macrogen的HiSeq X Ten测序仪(Illumina)进行全基因组测序。全基因组测序以30-40×的测序深度进行。使用Digenome 1.0程序鉴定DNA切割位点。
4.靶向深度测序
通过靶向深度测序分析靶位点和潜在的脱靶位点。通过PCR生成深度测序文库。使用TruSeq HT DualIndex引物标记每个样品。使用MiniSeq对合并的文库进行配对末端测序。
实验结果
在该实施例中，为确认SpCas9变体的靶基因操纵效果，使用各种基因作为靶标确认了根据靶基因的SpCas9变体的插入缺失(indel)(％)效果。此处，确认了每个区域的SpCas9变体的效果。
1.SpCas9的第一区域变体
实验中使用通过用不同的氨基酸分别置换SpCas9的第一区域的A203、N277、G366、F539和I601而形成的全部5个SpCas9变体(A203D、N277H、G366S、F539S和I601N)。
结果，当DMD基因用作靶基因(靶序列：CTTTCTACCTACTGAGTCTG(SEQ ID NO：28)/非靶序列：CTTTCTACCTACcGAGTCTG(SEQ ID NO：29)，与靶序列不同的序列显示为小写)时，在所有SpCas9变体中，与野生型SpCas9相比，中靶靶标位点处的插入缺失频率增加，脱靶靶标位点处的插入缺失频率降低，即脱靶靶标位点处的插入缺失频率基于中靶靶标位点处的值的比率低(图1)。特别地，确认了对于A203D、F539S和I601N，中靶靶标位点处的插入缺失频率与野生型SpCas9的插入缺失频率相似，但脱靶靶标位点处的插入缺失频率与野生型SpCas9相比降低至一定水平以下。
此外，当EMX基因用作靶基因(靶序列：GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA(SEQ ID NO：30)/非靶序列：GAGTtaGAGCAGAAGAAGAA(SEQID NO：31))时，对于所有SpCas9变体，与野生型SpCas9相比，中靶靶标位点处的插入缺失频率增加并且脱靶靶标位点处的插入缺失频率降低，即脱靶靶标位点处的插入缺失频率基于中靶靶标位点的值的比率低(图2)。特别地，对于G366S，确认了脱靶靶标位点处的插入缺失频率与野生型SpCas9的插入缺失频率相似，但中靶靶标位点处的插入缺失频率高于野生型SpCas9的插入缺失频率。此外，对于F539S和I601N，确认了脱靶靶标位点处的插入缺失频率几乎未显示或降至野生型SpCas9的插入缺失频率的一半。
当VEGFA基因用作靶基因(靶序列：GGTGAGTGAGTGTGTGCGTG(SEQ ID NO：32)/非靶序列：GGTGAGTGAGTGTGTGtGTG(SEQ ID NO：33))时，对于所有SpCas9变体，与野生型SpCas9相比，中靶靶标位点处的插入缺失频率升高或与野生型SpCas9的插入缺失频率相似(图3)。特别地，对于F539S，脱靶靶标位点处的插入缺失频率与野生型SpCas9的插入缺失频率相似，但中靶靶标位点处的插入缺失频率比野生型SpCas9的插入缺失频率高10％。
从上述结果可确认，与野生型SpCas9相比，通过用不同的氨基酸置换SpCas9的第一区域的A203、N277、G366、F539和I601而形成的总计5个SpCas9变体的靶特异性得到改善。
2.SpCas9的第二区域变体
实验中使用通过用不同的氨基酸置换SpCas9的第二区域的M763、D965和F1038而形成的3个SpCas9变体(M763I、D965Y和F1038Y)以及通过用不同的氨基酸置换SpCas9的第二区域的M763/F1038和D965/F1038而形成的两个SpCas9变体(M763I/F1038Y和D965Y/F1038Y)。
结果，当DMD基因用作靶基因(靶序列：CTTTCTACCTACTGAGTCTG(SEQ ID NO：28)/非靶序列：CTTTCTACCTACcGAGTCTG(SEQ ID NO：29))时，对于所有SpCas9变体，与野生型SpCas9相比，中靶靶标位点处的插入缺失频率增加，脱靶靶标位点处的插入缺失频率降低，或脱靶靶标位点处的插入缺失频率低于中靶靶标位点处的插入缺失频率(图4)。特别地，对于M763I，确认了脱靶靶标位点处的插入缺失频率类似于野生型SpCas9的插入缺失频率，但中靶靶标位点处的插入缺失频率高于野生型SpCas9的插入缺失频率。此外，对于M763I/F1038Y和D965Y/F1038Y，确认了中靶靶标位点处的插入缺失频率略低于野生型SpCas9的插入缺失频率，但脱靶靶标位点处的插入缺失频率几乎未显示，从而脱靶靶标位点处的插入缺失频率基于中靶靶标位点的值的比率低于野生型SpCas9的该比率。因此，证实了与野生型SpCas9相比，SpCas9变体具有靶特异性(图5)。
此外，当EMX基因用作靶基因(靶序列：GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA(SEQ ID NO：30)/非靶序列：GAGTtaGAGCAGAAGAAGAA(SEQ ID NO：31))时，对于M763I，与野生型SpCas9相比，中靶靶标位点处的插入缺失频率略有降低，但脱靶靶标位点处的插入缺失频率几乎未显示，从而脱靶靶标位点处的插入缺失频率基于中靶靶标位点的值的比率低。因此，与野生型SpCas9相比，M763I具有靶特异性(图6)。此外，对于M763I/F1038Y和D965Y/F1038Y，与野生型SpCas9相比，脱靶靶标位点处的插入缺失频率几乎未显示，而中靶靶标位点处的插入缺失频率相似或显著更高(图7)
当VEGFA基因用作靶基因(靶序列：GGTGAGTGAGTGTGTGCGTG(SEQ ID NO：32)/非靶序列：GGTGAGTGAGTGTGTGtGTG(SEQ ID NO：33))时，对于M763I，与野生型SpCas9相比，中靶靶标位点处的插入缺失频率相似，但脱靶靶标位点处的插入缺失频率几乎未显示，从而可确认对于M763I，与野生型SpCas9相比，脱靶靶标位点处的插入缺失频率基于中靶靶标位点的值的比率低，从而与野生型SpCas9相比，M763I具有靶特异性(图8)。
当HBB03基因用作靶基因(靶序列：CACGTTCACCTTGCCCCACA(SEQ ID NO：34)/非靶序列：CACGTTCACtTTGCCCCACA(SEQ ID NO：35))时，证实了对于M763I/F1038Y和D965Y/F1038Y，与野生型SpCas9相比，脱靶靶标位点处的插入缺失频率降低一半或更低，但中靶靶标位点处的插入缺失频率增加或略有降低(图9)。
当HBB04基因用作靶基因(靶序列：CCACGTTCACCTTGCCCCAC(SEQ ID NO：36)/非靶序列：CCACaTTCACCTTGCCCCAC(SEQ ID NO：37))时，证实了对于M763I/F1038Y和D965Y/F1038Y，与野生型SpCas9相比，脱靶靶标位点处的插入缺失频率几乎未显示，而中靶靶标位点处的插入缺失频率增加或类似(图10)。
从上述结果可确认，与野生型SpCas9相比，通过用不同的氨基酸置换SpCas9的第二区域的M763、D965和F1038而形成的3个SpCas9变体(M763I、D965Y和F1038Y)以及通过用不同的氨基酸置换SpCas9的第二区域的M763/F1038和D965/F1038而形成的两个SpCas9变体(M763I/F1038Y和D965Y/F1038Y)的靶特异性得到改善。
3.SpCas9的第三区域变体
实验中使用通过用不同的氨基酸置换SpCas9的第三区域的K890而形成的SpCas9变体(K890N)。
结果，当DMD基因用作靶基因(靶序列：CTTTCTACCTACTGAGTCTG(SEQ ID NO：28)/非靶序列：CTTTCTACCTACcGAGTCTG(SEQ ID NO：29))时，证实了对于K890N，与野生型SpCas9相比，中靶靶标位点处的插入缺失频率相似，但脱靶靶标位点处的插入缺失频率略有降低(图11)。
从上述结果可确认，与野生型SpCas9相比，通过用不同的氨基酸置换SpCas9的第三区域的K890而形成的SpCas9变体(K890N)显示出相似或略有增加的靶特异性。
4.SpCas9的第四区域变体
实验中使用通过用不同的氨基酸置换SpCas9的第四区域的T1102和D1127而形成的SpCas9变体(T1102P和D1127E)。
结果，当DMD基因用作靶基因(靶序列：CTTTCTACCTACTGAGTCTG(SEQ ID NO：28)/非靶序列：CTTTCTACCTACcGAGTCTG(SEQ ID NO：29))时，证实了对于T1102P，与野生型SpCas9相比，脱靶靶标位点处的插入缺失频率几乎未显示；并且对于D1127E，与野生型SpCas9相比，中靶靶标位点处的插入缺失频率相似，但脱靶靶标位点处的插入缺失频率降低(图12)。
此外，当EMX基因用作靶基因(靶序列：GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA(SEQ ID NO：30)/非靶序列：GAGTtaGAGCAGAAGAAGAA(SEQ ID NO：31))时，与野生型SpCas9相比，T1102和D1127均显示出相似的中靶靶标位点处的插入缺失频率，但脱靶靶标位点处几乎无插入缺失频率(图13)。
从上述结果可确认，与野生型SpCas9相比，通过用不同的氨基酸置换SpCas9的第四区域的T1102和D1127而形成的SpCas9变体(T1102P和D1127E)显示出相似或略有提高的靶特异性。
5.在两个区域中具有突变的SpCas9变体
实验中使用在SpCas9的四个区域的两个区域中具有突变的SpCas9变体。此处，使用在第一区域和第二区域具有突变的F539S/F1038Y、F539S/M763I、I601N/D965Y和F539S/M763I/F1038Y；在第一区域和第三区域具有突变的F539S/K890N；以及在第二区域和第三区域具有突变的M763I/K890N作为SpCas9变体。
结果，当DMD基因用作靶基因(靶序列：CTTTCTACCTACTGAGTCTG(SEQ ID NO：28)/非靶序列：CTTTCTACCTACcGAGTCTG(SEQ ID NO：29))时，证实了对于F539S/F1038Y和F539S/M763I/F1038Y，与野生型SpCas9相比，中靶靶标位点处的插入缺失频率降低，但脱靶靶标位点处的插入缺失频率降低约70％至80％，从而脱靶靶标位点处的插入缺失频率基于中靶靶标位点的值的比率低。因此，证实了与野生型SpCas9相比，F539S/F1038Y和F539S/M763I/F1038Y具有靶特异性(图14)。
此外，当EMX基因用作靶基因(靶序列：GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA(SEQ ID NO：30)/非靶序列：GAGTtaGAGCAGAAGAAGAA(SEQ ID NO：31))时，对于F539S/F1038Y，与野生型SpCas9相比，中靶靶标位点处的插入缺失频率略有降低，但脱靶靶标位点处的插入缺失频率几乎未显示，从而脱靶靶标位点处的插入缺失频率基于中靶靶标位点的值的比率低。因此，证实了与野生型SpCas9相比，F539S/F1038Y具有靶特异性(图15)。
当VEGFA基因用作靶基因(靶序列：GGTGAGTGAGTGTGTGCGTG(SEQ ID NO：32)/非靶序列：GGTGAGTGAGTGTGTGtGTG(SEQID NO：33))时，证实了对于F539S/M763I，与野生型SpCas9相比，脱靶靶标位点处的插入缺失频率相似，但中靶靶标位点处的插入缺失频率显著增加(图16)。
当HBB03基因用作靶基因(靶序列：CACGTTCACCTTGCCCCACA(SEQ ID NO：34)/非靶序列：CACGTTCACtTTGCCCCACA(SEQ ID NO：35))时，证实了对于F539S/K890N和F539S/M763I/F1038Y，与野生型SpCas9相比，中靶靶标位点处的插入缺失频率略有降低，但脱靶靶标位点处的插入缺失频率降低70％以上，从而脱靶靶标位点处的插入缺失频率基于中靶靶标位点的值的比率低。因此，证实了与野生型SpCas9相比，F539S/K890N和F539S/M763I/F1038Y具有靶特异性(图17)。此外，证实了对于M763I/K890N，与野生型SpCas9相比，脱靶靶标位点处的插入缺失频率略有增加，但中靶靶标位点处的插入缺失频率增加约30％至40％，从而脱靶靶标位点处的插入缺失频率基于中靶靶标位点的值的比率低。因此，证实了与野生型SpCas9相比，M763I/K890N具有靶特异性(图17)。
当HBB04基因用作靶基因(靶序列：CCACGTTCACCTTGCCCCAC(SEQ ID NO：36)/非靶序列：CCACaTTCACCTTGCCCCAC(SEQ ID NO：37))时，证实了对于F539S/K890N和F539S/F1038Y，与野生型SpCas9相比，中靶靶标位点处的插入缺失频率相似或增加，并且脱靶靶标位点处的插入缺失频率几乎未显示(图18)。此外，证实了对于M763I/K890N，与野生型SpCas9相比，中靶靶标位点处的插入缺失频率略有增加，并且脱靶靶标位点处的插入缺失频率降低约30％(图18)。
从上述结果可确认，与野生型SpCas9相比，在SpCas9的四个区域中的两个区域具有突变的SpCas9变体(F539S/K890N、F539S/F1038Y、F539S/M763I、I601N/D965Y、M763I/K890N和F539S/M763I/F1038Y)的靶特异性得到改善。
6.在三个或更多个区域中具有突变的SpCas9变体
实验中使用在SpCas9的四个区域中的三个或更多个区域具有突变的SpCas9变体。此处，使用在第一区域、第二区域和第三区域具有突变的F539S/M763I/K890N、F539S/M763I/D965Y/K890N和F539S/M763I/K890N/F1038Y以及在第一区域、第二区域和第四区域具有突变的A203D/N277H/G366S/M763I/F1038Y/T1102P/D1127E作为SpCas9变体。
结果，当DMD基因用作靶基因(靶序列：CTTTCTACCTACTGAGTCTG(SEQ ID NO：28)/非靶序列：CTTTCTACCTACcGAGTCTG(SEQ ID NO：29))时，证实了对于F539S/M763I/K890N和F539S/M763I/K890N/F1038Y，与野生型SpCas9相比，中靶靶标位点处的插入缺失频率略有降低，但脱靶靶标位点处的插入缺失频率降低一半或更低，从而脱靶靶标位点处的插入缺失频率基于中靶靶标位点的值的比率低。因此，证实了与野生型SpCas9相比，F539S/M763I/K890N和F539S/M763I/K890N/F1038Y具有靶特异性(图19)。此外，对于A203D/N277H/G366S/M763I/F1038Y/T1102P/D1127E，与野生型SpCas9相比，中靶靶标位点处的插入缺失频率略有降低，但脱靶靶标位点处的插入缺失频率降低约60％-70％，从而脱靶靶标位点处的插入缺失频率基于中靶靶标位点的值的比率低。因此，证实了与野生型SpCas9相比，A203D/N277H/G366S/M763I/F1038Y/T1102P/D1127E具有靶特异性(图23)。
当VEGFA基因用作靶基因(靶序列：GGTGAGTGAGTGTGTGCGTG(SEQ ID NO：32)/非靶序列：GGTGAGTGAGTGTGTGtGTG(SEQ ID NO：33))时，证实了对于F539S/M763I/K890N，与野生型SpCas9相比，中靶靶标位点处的插入缺失频率略有降低，但脱靶靶标位点处的插入缺失频率降低一半，从而脱靶靶标位点处的插入缺失频率基于中靶靶标位点的值的比率低。因此，证实了与野生型SpCas9相比，F539S/M763I/K890N具有靶特异性(图20)。
当HBB03基因用作靶基因(靶序列：CACGTTCACCTTGCCCCACA(SEQ ID NO：34)/非靶序列：CACGTTCACtTTGCCCCACA(SEQ ID NO：35))时，证实了对于F539S/M763I/K890N，与野生型SpCas9相比，中靶靶标位点处的插入缺失频率增加，但脱靶靶标位点处的插入缺失频率降低；对于F539S/M763I/K890N/F1038Y，与野生型SpCas9相比，中靶靶标位点处的插入缺失频率略有降低，但脱靶靶标位点处的插入缺失频率降低约70％以上，从而脱靶靶标位点处的插入缺失频率基于中靶靶标位点的值的比率低。因此，确认了与野生型SpCas9相比，F539S/M763I/K890N和F539S/M763I/K890N/F1038Y具有靶特异性(图21)。此外，确认了对于F539S/M763I/D965Y/K890N，与野生型SpCas9相比，脱靶靶标位点处的插入缺失频率略有增加，但中靶靶标位点处的插入缺失频率增加约10％-20％，从而脱靶靶标位点处的插入缺失频率基于中靶靶标位点的值的比率低。因此，可确认与野生型SpCas9相比，F539S/M763I/D965Y/K890N具有靶特异性(图21)。
当HBB04基因用作靶基因(靶序列：CCACGTTCACCTTGCCCCAC(SEQ ID NO：36)/非靶序列：CCACaTTCACCTTGCCCCAC(SEQ ID NO：37))时，证实了对于F539S/M763I/K890N，与野生型SpCas9相比，中靶靶标位点处的插入缺失频率增加，脱靶靶标位点处的插入缺失频率显著降低；并且对于F539S/M763I/D965Y/K890N，中靶靶标位点处的插入缺失频率相似，但脱靶靶标位点处的插入缺失频率降低了约10％-20％(图22)。另外，证实了对于F539S/M763I/K890N/F1038Y，与野生型SpCas9相比，中靶靶标位点处的插入缺失频率降低约40％，脱靶靶标位点处的插入缺失频率几乎未显示，从而与野生型SpCas9相比，脱靶靶标位点处的插入缺失频率基于中靶靶标位点的值的比率更低。因此，证实了与野生型SpCas9相比，F539S/M763I/K890N/F1038Y具有靶特异性(图22)。
从上述结果可确认，与野生型SpCas9相比，在SpCas9的四个区域中的三个或更多个区域具有突变的SpCas9变体(F539S/M763I/K890N、F539S/M763I/D965Y/K890N、F539S/M763I/K890N/F1038Y和A203D/N277H/G366S/M763I/F1038Y/T1102P/D1127E)的靶特异性得到改善。
从上述结果可确认，与野生型SpCas9相比，在选自于SpCas9的四个区域的一个或多个氨基酸中具有突变的SpCas9变体的靶特异性得到改善。
工业实用性
在本发明中，在靶特异性方面得到了改善的使用人工工程化CRISPR酶的CRISPR-Cas系统可用于基因组和/或表观基因组操纵或修饰、基因组靶向、基因组编辑以及体外诊断等。
序列表自由文本
野生型SpCas9的氨基酸序列、每个区域的氨基酸序列以及根据一个示例性实施方式的靶特异性SpCas9变体的氨基酸序列。
Claims (8)
1.一种SpCas9(酿脓链球菌Cas9)变体或编码所述SpCas9变体的核酸，所述SpCas9变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：11的氨基酸序列，
其中，与野生型SpCas9相比，所述SpCas9变体在中靶靶标位点处的插入缺失比率增加；或者在脱靶靶标位点处的插入缺失比率降低。
2.一种用于基因修饰的组合物，所述组合物包含Cas9或编码所述Cas9的核酸以及引导RNA或编码所述引导RNA的核酸，
其中，所述Cas9为如权利要求1所述的酿脓链球菌Cas9(SpCas9)变体，
其中，所述引导RNA能够靶向基因并与所述SpCas9变体复合。
3.如权利要求2所述的组合物，
其中，编码所述Cas9的核酸以及编码所述引导RNA的核酸包含于1个载体中或包含于各自的载体中。
4.如权利要求3所述的组合物，
其中，所述载体为质粒或病毒载体，
其中，所述病毒载体为选自于以下载体中的一种或多种载体：逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、牛痘病毒载体、痘病毒载体以及单纯疱疹病毒载体。
5.如权利要求2所述的组合物，
其中，所述组合物包含作为所述引导RNA和所述SpCas9变体的复合体的核糖核蛋白(RNP)。
6.如权利要求2所述的组合物，
其中，所述组合物还包含供体核酸，所述供体核酸含有感兴趣的基因。
7.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含如权利要求1所述的SpCas9变体以及一个或多个功能性结构域，
其中，所述功能性结构域为选自于由以下结构域所组成的组中的一种或多种结构域：具有甲基化酶活性、去甲基化酶活性、转录活化活性、转录抑制活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA切割活性和核酸结合活性的结构域。
8.如权利要求7所述的融合蛋白，
其中，所述功能性结构域为用于分离和纯化的标签、报告基因、核定位序列或信号、核输出序列或信号或脱氨酶。
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