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JP2024073630A - 新規転写アクチベーター - Google Patents

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JP2024073630A
JP2024073630A JP2024044035A JP2024044035A JP2024073630A JP 2024073630 A JP2024073630 A JP 2024073630A JP 2024044035 A JP2024044035 A JP 2024044035A JP 2024044035 A JP2024044035 A JP 2024044035A JP 2024073630 A JP2024073630 A JP 2024073630A
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哲也 山形
Tetsuya Yamagata
ユアンバウ シン
Yuanbo Qin
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Modalis Therapeutics Corp
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Abstract

【課題】ＡＡＶベクターに搭載可能なサイズであり、かつ転写活性化能を十分に発揮できる転写アクチベーターを提供する。【解決手段】本発明は、２００個以下のアミノ酸配列からなり、ＶＰ６４とＲＴＡの転写活性化部位とを含む、転写アクチベーターを提供する。本発明はまた、二本鎖ＤＮＡ中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、転写アクチベーターとの複合体を提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、ＶＰ６４とＲトランスアクチベーター（ＲＴＡ）の転写活性化部位とを含む、新規な転写アクチベーターに関する。さらに、本発明は、二本鎖ＤＮＡ中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、前記転写アクチベーターとの複合体に関する。
近年、様々な種において目的の遺伝子及びゲノム領域を改変する技術として、ゲノム編集が注目されている。例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと非特異的なＤＮＡ切断ドメインとが連結された、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を用いることによって、宿主としての植物細胞又は昆虫細胞におけるＤＮＡ中の標的化された遺伝子座において組換えを行う方法（特許文献１）や、植物病原菌キサントモナス属が有するＤＮＡ結合モジュールである転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターと、ＤＮＡエンドヌクレアーゼとが連結されたＴＡＬＥＮを用いることによって、特定のヌクレオチド配列内又はそれに隣接する部位で、標的遺伝子を切断又は改変する方法（特許文献２）が報告されている。さらに、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）由来のＣａｓ９ヌクレアーゼは、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）の修復経路を有する真核生物において、強力なゲノム編集ツールとして広く使用されている（例えば、特許文献３、非特許文献１、２）。
ゲノム編集技術を応用することによって、部位特異的な転写調節のための技術も開発されている。例えば、ＺＦ若しくはＴＡＬＥ、又は二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を切断する能力を欠いたＣａｓ９（ｄＣａｓ９）システムに転写活性化ドメイン又は転写抑制ドメイン（一般的に、活性化にはＶＰ６４が用いられ、抑制にはＫＲＡＢが用いられる）を融合させたタンパク質や複合体を、目的の遺伝子のプロモーター又はエンハンサー配列に結合させることを含む、標的化された遺伝子を活性化又は抑制する方法が報告されている（例えば、非特許文献３）。
しかしながら、ＶＰ６４を用いることによる転写活性化は、単に１つのＶＰ６４分子を用いることによっては十分な転写活性化能が達成されず、１つの遺伝子に対して複数のＴＡＬＥ－ＶＰ６４及びｄＣａｓ９－ＶＰ６４／ｓｇＲＮＡ複合体を結合させる必要があるとの問題を有する（例えば、非特許文献３）。この点を克服するために、例えば、ＶＰ６４に他の転写活性化因子（ｐ６５及びＲＴＡ）を結合させた転写アクチベーターを用いる方法（例えば、非特許文献４）が報告されている。
ＷＯ０３／０８７３４１Ａ２ ＷＯ２０１１／０７２２４６Ａ２ ＷＯ２０１３／１７６７７２Ａ１
Mali P, et al., Science 339: 823-827 (2013) Cong L, et al., Science 339: 819-823 (2013) Hu J, et al., Nucleic Acids Res, 42: 4375-4390 (2014) Chavez A, et al., Nat Methods, 12: 326-328 (2015)
しかしながら、ＶＰ６４にｐ６５及びＲＴＡを結合させた場合には、その総分子量が大きくなる。それゆえ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムと、転写アクチベーターとの複合体をコードする核酸は、サイズに関する制約があり、一体型の（all-in-one）核酸としては、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに搭載できないとの問題が生じる。従って、ＡＡＶ媒介送達に関する課題の１つは、ＡＡＶベクターに搭載可能なサイズであり、かつ転写活性化能を十分に発揮できる転写アクチベーターを提供することである。
本発明者らは、転写活性化能を有することが知られている複数のタンパク質に着目し、そのようなタンパク質を適宜組み合わせることによって、上記課題を解決できるアクチベーターを作製し得るとの発明的着想を得た。この着想に基づき鋭意研究を重ね、ＶＰ６４とＲＴＡとを組み合わせることによって、タンパク質サイズを低下させることと、十分な転写活性化能を保持することの両方を達成できることを見出した。この知見に基づき、さらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
それゆえ、本発明は以下を提供する。
［１］２００個以下のアミノ酸からなり、ＶＰ６４とＲＴＡの転写活性化部位とを含む、転写アクチベーター。
［２］前記ＶＰ６４が、
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列、
（２）（１）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
（３）（１）のアミノ酸配列と９０％以上同一なアミノ酸配列、
を含む、［１］に記載の転写アクチベーター。
［３］前記ＲＴＡの転写活性化部位が、
（４）配列番号２で示される配列、
（５）配列番号３で示される配列、
（６）（４）又は（５）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
（７）（４）又は（５）のアミノ酸配列と９０％以上同一なアミノ酸配列、
を含む、［１］又は［２］に記載の転写アクチベーター。
［４］互いに結合した、二本鎖ＤＮＡ中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、［１］～［３］のいずれかに記載の転写アクチベーターとを含み、該ＤＮＡ中の標的化された遺伝子の転写を活性化する、複合体。
［５］前記核酸配列認識モジュールが、二本鎖ＤＮＡの少なくとも一方の鎖を切断する能力を欠いたＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を含む、［４］に記載の複合体。
［６］前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を切断する能力を欠いている、［５］に記載の複合体。
［７］前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が、スタフィロコッカス・アウレウス又はカンピロバクター・ジェジュニに由来する、［５］又は［６］に記載の複合体。
［８］［１］～［３］のいずれかに記載の転写アクチベーターをコードする核酸。
［９］［４］～［７］のいずれかに記載の複合体をコードする核酸。
［１０］［８］又は［９］に記載の核酸を含むベクター。
［１１］前記ベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである、［１０］に記載のベクター。
［１２］細胞における標的化された遺伝子の転写を活性化する方法であって、［４］～［７］のいずれかに記載の複合体、［８］若しくは［９］に記載の核酸、又は［１０］若しくは［１１］に記載のベクターを該細胞へ導入する工程を含む、方法。
［１３］前記細胞が哺乳類動物細胞である、［１２］に記載の方法。
［１４］前記哺乳動物がヒトである、［１３］に記載の方法。
本発明によれば、ＡＡＶベクターに搭載可能なサイズを有し、かつ転写活性化能を十分に発揮できる新規な転写アクチベーターが提供される。さらに、二本鎖ＤＮＡ中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、前記転写アクチベーターとの複合体、並びに該複合体を用いることによる、標的化された遺伝子の転写を活性化する方法が提供される。
図１は、ｄＳａＣａｓ９をＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質として使用する場合の、ＡＡＶベクターの構造及び１０個の活性化部分を示す。図中の塩基数は、ストップコドンを含めた長さによって示されている。 図２は、９個の活性化部分によるＭＹＤ８８遺伝子活性化を示す。それぞれのｇＲＮＡにおいて、各棒グラフは、左からこの順に、ｓｇＲＮＡのみ、ＶＰ６４、ＶＰ１６０、ＶＭ（ＶＰ６４－ＭｙｏＤ）、ＶＨ（ＶＰ６４－ＨＳＦ１）、Ｖ３２ｐ６５（ＶＰ３２－ｐ６５）、ＶＲ（ＶＰ６４－ｍｉｎｉＲＴＡ）、Ｖ６４Ｐ６５（ＶＰ６４－ｐ６５）、ＶＰＨ及びＶＰＲの結果を示す。
図３は、９個の活性化部分によるＦＧＦ２１遺伝子活性化を示す。それぞれのｇＲＮＡにおいて、各棒グラフは、左からこの順に、ｓｇＲＮＡのみ、ＶＰ６４、ＶＰ１６０、ＶＭ（ＶＰ６４－ＭｙｏＤ）、ＶＨ（ＶＰ６４－ＨＳＦ１）、Ｖ３２ｐ６５（ＶＰ３２－ｐ６５）、ＶＲ（ＶＰ６４－ｍｉｎｉＲＴＡ）、Ｖ６４Ｐ６５（ＶＰ６４－ｐ６５）、ＶＰＨ及びＶＰＲの結果を示す。
図４は、９個の活性化部分によるＧＣＧ遺伝子活性化を示す。それぞれのｇＲＮＡにおいて、各棒グラフは、左からこの順に、ｓｇＲＮＡのみ、ＶＰ６４、ＶＰ１６０、ＶＭ（ＶＰ６４－ＭｙｏＤ）、ＶＨ（ＶＰ６４－ＨＳＦ１）、Ｖ３２ｐ６５（ＶＰ３２－ｐ６５）、ＶＲ（ＶＰ６４－ｍｉｎｉＲＴＡ）、Ｖ６４Ｐ６５（ＶＰ６４－ｐ６５）、ＶＰＨ及びＶＰＲの結果を示す。
図５は、ＶＰ６４－ｍｉｎｉＲＴＡ及びＶＰ６４－ｍｉｃｒｏＲＴＡによるＭｙＤ８８遺伝子活性化を示す。
本明細書において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、「のみ」、「単一」及び／又は「１つ」などの単語を用いて語が別段明示的に示されない限り、単数形及び複数形の両方を含むことが意図される。本明細書において使用する場合、用語「
含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含む（includes）」及び／又は「含
む（including）」は、記述される特徴、工程、操作、要素、着想、及び／又は成分の存
在を特定するが、それ自体が、１つ以上の他の特徴、工程、操作、要素、成分、着想、及び／又はその群の存在又は付加を除外しないことがさらに理解される。
本発明は、ＶＰ６４と、エプスタイン・バーウイルスのＲトランスアクチベーター（ＲＴＡ）の転写活性化部位とを含む、新規な転写アクチベーター（以下「本発明のアクチベーター」と称することがある）を提供する。本発明の転写アクチベーターにより、標的化された遺伝子の転写が活性化され得る。
本発明において、ＶＰ６４は、グリシン及びセリン（ＧＳ）からなるペプチドリンカーを伴なう、単純ヘルペスウイルスに由来するＶＰ１６の４３７～４４７番目のアミノ酸残基からなるドメイン（ＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬ；配列番号２１）の、タンデムな４回の繰り返しからなるペプチド（［ＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬ］－ＧＳ－［ＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬ］－ＧＳ－［ＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬ］－ＧＳ－［ＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬ］；配列番号１）（Beerli RR, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 95(25):14628-33 (1998)）又は
転写活性能を有するその改変体を意味する。かかる改変体としては、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個（例えば、２個、３個、４個、５個又はそれ以上）のアミノ酸が欠失、置換及び／若しくは付加されたアミノ酸配列が挙げられる。具体的な例としては、リンカー部分が、他のリンカー（例えば、Ｇ、Ｓ、ＧＧ、ＳＧ、ＧＧＧ、ＧＳＧ、ＧＳＧＳ（配列番号２２）、ＧＳＳＧ（配列番号２３）、ＧＧＧＧＳ（配列番号２４）、ＧＧＧＡＲ（配列番号２５）、ＧＳＧＳＧＳ（配列番号２６）又はＳＧＱＧＧＧＧＳＧ（配列番号２７）からなるペプチドリンカー等）によって置換された改変体が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、前記改変体として、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上）同一なアミノ酸配列からなるペプチドを挙げることができる。さらに、上記ドメイン（ＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬ；配列番号２１）の、タンデムな１０回の繰り返しからなるペプチド（［ＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬ］－ＧＳ－［ＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬ］－ＧＳ－［ＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬ］－ＧＳ－［ＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬ］－ＧＳ－［ＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬ］－ＧＳ－［ＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬ］－ＧＳ－［ＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬ］－ＧＳ－［ＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬ］－ＧＳ－［ＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬ］－ＧＳ－［ＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬ］；配列番号４４）をＶＰ１６０と称する。
ＲＴＡは、６０５個のアミノ酸残基からなり、転写活性化能を有するタンパク質であり（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＣＥＱ３３０１７）（配列番号４）、そのＣ末端のドメインが転写活性化に重要であることが知られている（Hardwick JM, J Virol, 66(9):5500-8, 1992）。前記ドメインとして、具体的には、ＲＴＡの４９３番目～６０５番目のアミノ酸配列からなる領域（配列番号２）を挙げることができる。中でも、５２０番目～６０５番目のアミノ酸配列からなる領域（配列番号３）が重要であることが知られている。従って、本発明のアクチベーターに含まれるＲＴＡは、配列番号２又は配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む転写活性化部位、又は転写活性化能を有するその改変体であることが好ましい。かかる改変体としては、例えば、配列番号２又は３で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個（例えば、２個、３個、４個、５個又はそれ以上）のアミノ酸が欠失、置換及び／若しくは付加されたアミノ酸配列が挙げられる。具体的には、ＲＴＡにおける５６４番目のロイシン残基、５６６番目のロイシン残基、５７０番目のロイシン残基、５７８番目のロイシン残基、５８１番目のフェニルアラニン残基及び５８２番目のロイシン残基が転写活性化能に重要であることが知られているので、これらのアミノ酸残基以外のアミノ酸残基が欠失、置換等した改変体などを挙げることができるが、これらの改変に限定するものではない。あるいは、前記改変体として、配列番号２又は３で
示されるアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上）同一なアミノ酸配列からなるペプチドを挙げることができる。本明細書中、配列番号２で示される配列からなるペプチドを「ｍｉｎｉＲＴＡ」と、配列番号３で示される配列からなるものを「ｍｉｃｒｏＲＴＡ」と称することがある。
本発明のアクチベーターは、ＶＰ６４とＲＴＡの転写活性化部位とを含む。ＶＰ６４とＲＴＡとは、リンカー（例えば、前述したペプチドリンカー）を介して結合されてもよく、又はリンカーを介さずに直接結合されてもよい。ＶＰ６４とＲＴＡの転写活性化部位とは、Ｎ末端からＣ末端にこの順に配置されてもよく、又は反対の順番で配置されてもよい。本発明のアクチベーターの具体的な例としては、配列番号６若しくは８で示されるアミノ酸配列、又は配列番号６若しくは８で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個（例えば、２個、３個、４個、５個又はそれ以上）のアミノ酸が欠失、置換及び／若しくは付加されたアミノ酸配列、及び配列番号６若しくは８で示されるアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上）同一なアミノ酸配列を含むアクチベーターが挙げられる。
アミノ酸配列の同一性は、以下の条件下（expectancy=10；gap allowed；matrix=BLOSUM62；filtering=OFF）で、相同性計算アルゴリズムのＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）を用いて計算することができる。同一性を決定す
るために、その全長にわたる本発明の配列が、別の配列と比較されることが理解される。言い換えれば、本発明における同一性は、本発明の配列の短いフラグメント（例えば１～３アミノ酸）を別の配列と比較すること、又はその逆を除外する。
本発明のアクチベーターは、それが標的化された遺伝子の転写を活性化できる限り特に制限されない。小型化のために、２００個以下（例えば、２００個、１９０個、１８０個、１７０個、１６９個、１６８個、１６７個又はそれ以下）のアミノ酸配列からなることが好ましく、１１０個以上（例えば、１１０個、１２０個、１３０個、１３５個、１３６個、１３７個、１３８個、１３９個、１４０個又はそれ以上）のアミノ酸配列からなることが好ましい。好ましい実施態様において、約１４０個又は約１６７個のアミノ酸からなるアクチベーターが用いられる。
別の実施態様において、核酸配列認識モジュールと、本発明のアクチベーターとが結合した複合体（以下「本発明の複合体」と称することがある）が提供される。
本発明において、「核酸配列認識モジュール」は、ＤＮＡ鎖上の特定のヌクレオチド配列（即ち、標的ヌクレオチド配列）を特異的に認識し、それに結合する能力を有する分子又は分子複合体を意味する。核酸配列認識モジュールが標的ヌクレオチド配列に結合することにより、該モジュールに連結された本発明のアクチベーターが二本鎖ＤＮＡの標的化された部位に特異的に作用することが可能になる。
本発明の複合体には、複数の分子で構成されるものだけでなく、融合タンパク質のように、核酸配列認識モジュールと本発明のアクチベーターとを単一の分子中に有するものも包含される。
本発明の複合体中の核酸配列認識モジュールによって認識される、二本鎖ＤＮＡ中の標的ヌクレオチド配列は、該モジュールが特異的に結合する限り特に制限されず、二本鎖ＤＮＡ中の任意の配列であってよい。標的ヌクレオチド配列の長さは、核酸配列認識モジュールの特異的結合のために十分である必要があるのみである。例えば、哺乳動物のゲノム
ＤＮＡを標的とする場合、配列は、ゲノムサイズに応じて、１２ヌクレオチド以上（例えば、１２ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド又はそれ以上）であることが好ましく、２５ヌクレオチド以下（例えば、２５ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２２ヌクレオチド又はそれ以下）であることが好ましい。
本発明の複合体の核酸配列認識モジュールとしては、例えば、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が、二本鎖ＤＮＡの少なくとも一方の鎖（好ましくは両方の鎖）を切断する能力を欠いているＣＲＩＳＰＲ－ＧＮＤＭシステム、ジンクフィンガーモチーフ、ＴＡＬエフェクター、ＰＰＲモチーフ等、並びに、制限酵素、転写因子、ＲＮＡポリメラーゼ等のようなＤＮＡと特異的に結合し得るタンパク質のＤＮＡ結合ドメインを含むフラグメント等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましいのは、ＣＲＩＳＰＲ－ＧＮＤＭシステム、ジンクフィンガーモチーフ、ＴＡＬエフェクター、ＰＰＲモチーフ等であり、中でも、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を切断する能力を欠いているＣＲＩＳＰＲ－ＧＮＤＭシステムが特に好ましい。
ジンクフィンガーモチーフは、３～６個の異なるＣｙｓ２Ｈｉｓ２型ジンクフィンガーユニット（１フィンガーが約３塩基を認識する）の連結によって構成され、９～１８塩基の標的ヌクレオチド配列を認識することができる。ジンクフィンガーモチーフは、モジュラーアセンブリー法（Nat Biotechnol (2002) 20: 135-141）、ＯＰＥＮ法（Mol Cell (2008) 31: 294-301）、ＣｏＤＡ法（Nat Methods (2011) 8: 67-69）、大腸菌ワン－ハイ
ブリッド法（Nat Biotechnol (2008) 26:695-701）等の公知の手法によって作製することができる。ジンクフィンガーモチーフの作製の詳細については、上記の特許文献１を参照することができる。
ＴＡＬエフェクターは、約３４個のアミノ酸を単位としたモジュール繰り返し構造を有しており、１つのモジュールの１２番目及び１３番目のアミノ酸残基（ＲＶＤと称する）によって、結合安定性及び塩基特異性が決定される。各モジュールは独立性が高いので、単にモジュールを連結することによって、標的ヌクレオチド配列に特異的なＴＡＬエフェクターを作製することが可能である。ＴＡＬエフェクターについて、オープンリソースを利用した作製方法（ＲＥＡＬ法（Curr Protoc Mol Biol (2012) Chapter 12: Unit 12.15）、ＦＬＡＳＨ法（Nat Biotechnol (2012) 30: 460-465）、及びＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔ
ｅ法（Nucleic Acids Res (2011) 39： e82）等）が確立されており、標的ヌクレオチド
配列に対するＴＡＬエフェクターを比較的簡便に設計することができる。ＴＡＬエフェクターの作製の詳細については、上記の特許文献２を参照することができる。
ＰＰＲモチーフは、各々が３５個のアミノ酸からなり、１つの核酸塩基を認識するＰＰＲモチーフの連続によって、特定のヌクレオチド配列が認識されるように構成されており、各モチーフの１、４及びｉｉ（－２）番目のアミノ酸のみによって標的塩基を認識する。モチーフ構成に依存性はなく、両側のモチーフの干渉はない。それゆえ、ＴＡＬエフェクターと同様に、単にＰＰＲモチーフを連結することによって、標的ヌクレオチド配列に特異的なＰＰＲタンパク質を作製することが可能である。ＰＰＲモチーフの作製の詳細については、ＷＯ２０１１／１１１８２９Ａ１を参照することができる。
制限酵素、転写因子、ＲＮＡポリメラーゼ等のフラグメントを用いる場合、これらのタンパク質のＤＮＡ結合ドメインは周知であるので、該ドメインを含み、かつＤＮＡ二重鎖切断能を有しないフラグメントを容易に設計し、構築することができる。
ジンクフィンガーモチーフについては、標的ヌクレオチド配列に特異的に結合するジンクフィンガーの作製効率が高くなく、高い結合特異性を有するジンクフィンガーの選別が
煩雑なため、多くの実際に機能可能なジンクフィンガーモチーフを作製することは容易でない。ＴＡＬエフェクター及びＰＰＲモチーフは、ジンクフィンガーモチーフに比較して高い標的核酸配列認識の自由度を有するが、標的ヌクレオチド配列に応じて大きなタンパク質をその都度設計及び構築する必要があるので、効率における問題が残る。これに対し、ＣＲＩＳＰＲ－ＧＮＤＭシステムは、標的ヌクレオチド配列に対して相補的なガイドヌクレオチドによって目的の二本鎖ＤＮＡの配列を認識するので、単に標的ヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成し得るオリゴヌクレオチドを合成することによって、任意の配列を標的化することができる。従って、本発明のより好ましい実施態様においては、核酸配列認識モジュールとして、ＣＲＩＳＰＲ－ＧＮＤＭシステムが用いられる。
本発明のＣＲＩＳＰＲ－ＧＮＤＭシステムを用いる場合、二本鎖ＤＮＡの少なくとも一方の鎖（好ましくは両方の鎖）を切断する能力を欠いた変異型ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（以下では、単に「ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質」ともいう）をリクルートさせることによって、標的化された遺伝子の転写を十分に活性化し得る。標的化された遺伝子の転写調節領域は、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質及びそれに結合した本発明のアクチベーターをリクルートさせることによって、該遺伝子の転写が活性化され得る限り、該遺伝子の任意の領域であってよい。かかる領域としては、例えば、標的化された遺伝子のプロモーター領域及びエンハンサー領域、イントロン、エクソンなどが挙げられる。
本明細書において、「ＣＲＩＳＰＲ－ＧＮＤＭシステム」は、（ａ）クラス２ ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ｄＣａｓ９若しくはｄＣｐｆ１）、又は該ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と本発明の転写アクチベーターとの複合体、及び（ｂ）ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質及それに結合した転写レギュレーターを標的遺伝子の転写調節領域にリクルートさせることを可能とする、標的遺伝子の転写調節領域の配列に相補的なガイドヌクレオチド（ｇＮ）を含むシステムを意味する。前記システムを用いて、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に結合した本発明のアクチベーターを介して、該遺伝子の転写活性化が可能となる。
本発明において用いられる「ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質」は、ｇＮと複合体を形成し、目的遺伝子中の標的ヌクレオチド配列及びそれに隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（protospacer adjacent motif）（ＰＡＭ）を認識し、それに結合する限り特に制限はない。好ましくはＣａｓ９若しくはＣｐｆ１又はそれらの改変体である。Ｃａｓ９としては、例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）由来のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９；ＰＡＭ配列ＮＧＧ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ又はＣ。以下同じ））、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）由来のＣａｓ９（ＳｔＣａｓ９；ＰＡＭ配列ＮＮＡＧＡＡＷ）、ナイセリア・メニンギチジス（Neisseria meningitidis）由来のＣａｓ９（ＮｍＣａｓ９；ＰＡＭ配列ＮＮＮＮＧＡＴＴ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）由来のＣａｓ９（ＳａＣａｓ９；
ＰＡＭ配列：ＮＮＧＲＲＴ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）由来のＣａｓ９（ＣｊＣａｓ９；ＰＡＭ配列：ＮＮＮＶＲＹＭ（ＶはＡ、Ｇ又はＣ；ＲはＡ又はＧ；ＹはＴ又はＣ；ＭはＡ又はＣ））が挙げられるが、これらに限定されない。サイズの観点からは、好ましくは、Ｃａｓ９はＳａＣａｓ９若しくはＣｊＣａｓ９又はそれらの改変体である。Ｃｐｆ１としては、例えば、フランシセラ・ノヴィシダ（Francisella novicida）由来のＣｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１；ＰＡＭ配列ＮＴＴ）、アシダミノコッカス
ｓｐ．（Acidaminococcus sp．）由来のＣｐｆ１（ＡｓＣｐｆ１；ＰＡＭ配列ＮＴＴＴ）、ラクノスピラ科細菌（Lachnospiraceae bacterium）由来のＣｐｆ１（ＬｂＣｐｆ１
；ＰＡＭ配列ＮＴＴＴ）等が挙げられるが、それらに限定されない。本発明において用いられるＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質として、二本鎖ＤＮＡの少なくとも一方の鎖（好ましくは両方の鎖）を切断するＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の能力が失活さ
れたタンパク質が用いられる。例えば、ＳｐＣａｓ９の場合、１０番目のＡｓｐ残基をＡｌａ残基に変換し、そして／又は、８４０番目のＨｉｓ残基をＡｌａ残基に変換した改変体（二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を切断する能力を欠いた改変体を「ｄＳｐＣａｓ９」と称することがある）を用いることができる。あるいは、ＳａＣａｓ９の場合、１０番目のＡｓｐ残基をＡｌａ残基に変換し、そして／又は５５６番目のＡｓｐ残基、５５７番目のＨｉｓ残基及び／又は５８０番目のＡｓｎ残基をＡｌａ残基に変換した改変体（二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を切断する能力を欠いた改変体を「ｄＳａＣａｓ９」と称することがある）を用いることができる。ＣｊＣａｓ９の場合、８番目のＡｓｐ残基をＡｌａ残基に変換し、そして／又は、５５９番目のＨｉｓ残基をＡｌａ残基に変換した改変体（二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を切断する能力を欠いた改変体を「ｄＣｊＣａｓ９」と称することがある）を用いることができる。ＦｎＣｐｆ１の場合、９１７番目のＡｓｐ残基をＡｌａ残基に変換し、そして／又は、１００６番目のＧｌｕ残基をＡｌａ残基に変換した改変体を用いることができる。さらに、標的ヌクレオチド配列への結合能を維持し得る限り、これらのタンパク質のアミノ酸の一部を改変させた改変体を用いてもよい。改変体としては、例えば、アミノ酸配列の一部を欠失させた短縮型の改変体が挙げられる。かかる改変体の例としては、具体的には、７２１番目～７４５番目のアミノ酸を欠失したｄＳａＣａｓ９（該欠失部分は、上述したペプチドリンカー等で置換されていてもよい）などが挙げられる。
本発明のＣＲＩＳＰＲ－ＧＮＤＭシステムの第２の要素は、標的化された遺伝子の転写調節領域における、標的鎖（targeted strand）のＰＡＭに隣接するヌクレオチド配列に
相補的なヌクレオチド配列（以下「ターゲッティング配列（targeting sequence）」ともいう）を含むガイドヌクレオチド（ｇＮ）である。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質がｄＣａｓ９の場合、ｇＮはトランケートされたｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとのキメラヌクレオチド（即ち、単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ））として、又は別個のｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの組み合わせとして提供される。ｇＮは、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡキメラの形態で提供されてもよい。従って、技術的に可能な限り、以下では、「ｓｇＲＮＡ」、「ｃｒＲＮＡ」及び「ｔｒａｃｒＲＮＡ」という用語は、本発明の文脈において、対応するＤＮＡ及びＤＮＡ／ＲＮＡキメラも含むものとしても用いられる。
ここで「標的鎖」は、標的ヌクレオチド配列のｃｒＲＮＡとハイブリッド形成する方の鎖を意味し、標的鎖とｃｒＲＮＡとのハイブリダイゼーションによって一本鎖状になるその反対鎖を、「非標的鎖（non-targeted strand）」と称する。標的ヌクレオチド配列が
鎖の一方によって表現される場合（例えば、ＰＡＭ配列を表記する場合、標的ヌクレオチド配列とＰＡＭとの位置関係を示す場合等）、非標的鎖の配列によって代表される。
ターゲッティング配列は、標的化された遺伝子の転写調節領域において標的鎖と特異的にハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質及びそれに結合した本発明のアクチベーターを転写調節領域にリクルートし得る限り限定されない。例えば、ｄＳａＣａｓ９をＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質として用いる場合、表１に列挙されるターゲッティング配列が例示される。表１において、２１個のヌクレオチドからなるターゲッティング配列が記載されているが、該ターゲッティング配列の長さは、１２ヌクレオチド以上（例えば、１２ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド又はそれ以上）であることが好ましく、２５ヌクレオチド以下（例えば、２５ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２２ヌクレオチド又はそれ以下）であることが好ましい。好ましい実施態様においては、２１ヌクレオチドである。
ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としてＣａｓ９を用いる場合、ターゲッティング配列は、例えば、公開されているガイドヌクレオチド設計ウェブサイト（CRISPR Design
Tool、CRISPRdirect等）を用いて、目的遺伝子のＣＤＳ配列から３’側に隣接するＰＡＭ（例えば、ＳａＣａｓ９の場合、ＮＮＧＲＲＴ）を有する２１ｍｅｒの配列をリストアップすることによって設計ことができる。宿主ゲノム中のオフターゲットサイト数が少ない候補配列をターゲッティング配列として用いることができる。使用するガイドヌクレオチド設計ソフトウェアに宿主ゲノムのオフターゲットサイトを検索する機能がない場合、例えば、候補配列の３’側の８～１２ヌクレオチド（標的ヌクレオチド配列の識別能の高いｓｅｅｄ配列）について、宿主ゲノムに対してＢｌａｓｔ検索をかけることによって、オフターゲットサイトを検索することができる。異なるＰＡＭを認識するＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を用いる場合であっても、ターゲッティング配列は、同様の方法で設計及び作製することができる。特に断らない限り、本明細書において、ターゲッティング配列をＤＮＡ配列として示す。ＲＮＡをｇＮとして用いる場合には、各配列における「Ｔ」は「Ｕ」に読み替えるものとする。
上記いずれかの核酸配列認識モジュールは、上記本発明のアクチベーターとの融合タンパク質として提供することができ、又は、ＳＨ３ドメイン、ＰＤＺドメイン、ＧＫドメイン、ＧＢドメイン等のようなタンパク質結合ドメインとそれらの結合パートナーとを、核酸配列認識モジュールと、本発明のアクチベーターとにそれぞれ融合させ、該ドメインとその結合パートナーとの相互作用を介してタンパク質複合体として提供してもよい。あるいは、核酸配列認識モジュールと、本発明のアクチベーターとにそれぞれインテイン（intein）を融合させ、タンパク質合成後のライゲーションにより、両者を連結することができる。
核酸配列認識モジュールと本発明のアクチベーターとが結合した複合体（融合タンパク質を含む）を含む本発明の複合体を、無細胞系における酵素反応として、二本鎖ＤＮＡと接触させてもよい。本発明の主たる目的に沿えば、前記複合体をコードする核酸を、目的の二本鎖ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）を有する細胞に導入することが望ましい。従って、核酸配列認識モジュールと、本発明のアクチベーターとは、それらの融合タンパク質をコードする核酸として、又は、結合ドメイン、インテイン等を利用することによってタンパク質に翻訳した後、宿主細胞中で複合体形成し得るような形態で、それらをそれぞれコードする核酸として調製することが好ましい。ここで核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。ＤＮＡの場合は、好ましくは二本鎖ＤＮＡであり、宿主細胞中で機能的なプロモーターの制御下に配置した発現ベクターの形態で提供される。ＲＮＡの場合は、好ましくは一本鎖ＲＮＡである。
核酸配列認識モジュールと本発明のアクチベーターとが結合した本発明の複合体は、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を伴わないため、本発明の複合体を用いた方法は広範な生物材料に適用することができる。従って、核酸配列認識モジュール及び／又は本発明のアクチベーターをコードする核酸が導入される細胞は、原核生物である大腸菌などの細菌や下等真核生物である酵母などの微生物の細胞から、ヒト等の哺乳動物を含む脊椎動物の細胞、昆虫、植物など高等真核生物の細胞まで、任意の種の細胞を包含し得る。
ジンクフィンガーモチーフ、ＴＡＬエフェクター、ＰＰＲモチーフ、ＣＲＩＳＰＲ－ＧＮＤＭシステム等の核酸配列認識モジュールをコードするＤＮＡは、各モジュールについて上記したいずれかの方法により取得することができる。制限酵素、転写因子、ＲＮＡポリメラーゼ等の配列認識モジュールをコードするＤＮＡは、例えば、それらのｃＤＮＡ配列情報に基づいて、当該タンパク質の所望の部分（ＤＮＡ結合ドメインを含む部分）をコードする領域をカバーするオリゴＤＮＡプライマーを合成し、当該タンパク質を産生する細胞より調製した全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ画分を鋳型として用い、ＲＴ－ＰＣＲ法によって増幅することにより、クローニングすることができる。
変異型ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、クローン化されたＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードするＤＮＡに、ＤＮＡ切断活性に重要な部位のアミノ酸残基（例えば、ＳｐＣａｓ９の場合、１０番目のＡｓｐ残基や８４０番目のＨｉｓ残基、ＳａＣａｓ９の場合、１０番目のＡｓｐ残基、５５６番目のＡｓｐ残基、５５７番目のＨｉｓ残基、５８０番目のＡｓｎ残基、ＣｊＣａｓ９の場合、８番目のＡＳＰ残基、５５９番目のＨｉｓ残基、ＦｎＣｐｆ１の場合、９１７番目のＡｓｐ残基や１００６番目のＧｌｕ残基等が挙げられるが、これらに限定されない）を他のアミノ酸に変換する変異を導入することにより、取得することができる。
クローン化されたＤＮＡは、直接、又は所望により制限酵素で消化した後、又は適当なリンカー（例えば、上述したペプチドリンカー等）、タグ（例えば、ＨＡタグ、ｍｙｃタグ、ＭＢＰタグ、ＦＬＡＧタグ等）及び／又は核移行シグナル（目的の二本鎖ＤＮＡがミトコンドリアや葉緑体ＤＮＡの場合は、各オルガネラ移行シグナル）を付加した後に、核酸配列認識モジュールをコードするＤＮＡとライゲーションして、融合タンパク質をコードするＤＮＡを調製することができる。あるいは、核酸配列認識モジュールをコードするＤＮＡと、本発明のアクチベーターをコードするＤＮＡに、それぞれ結合ドメインもしくはその結合パートナーをコードするＤＮＡを融合させるか、又は両ＤＮＡに分離インテインをコードするＤＮＡを融合させることにより、核酸配列認識モジュールと本発明のアクチベーターとが宿主細胞内で翻訳されて、複合体を形成できるようにしてもよい。これらの場合、所望により一方もしくは両方のＤＮＡの適当な位置に、リンカー及び／又は核移行シグナルを連結することができる。また、本発明の複合体を融合タンパク質として発現させる場合には、本発明のアクチベーターは、核酸配列認識モジュール又はその構成成分（例えば、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質）のＮ末端及びＣ末端のいずれに融合させてもよい。
核酸配列認識モジュール及び／又は本発明のアクチベーターをコードするＤＮＡは、化学的にＤＮＡ鎖を合成するか、もしくは合成した一部オーバーラップするオリゴＤＮＡ短鎖を、ＰＣＲ法やＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法を利用して接続することにより、その全長をコードするＤＮＡを構築することによって得ることができる。化学合成又はＰＣＲ法もしくはＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法との組み合わせで全長ＤＮＡを構築することの利点は、該ＤＮＡを導入する宿主に合わせて使用コドンをＣＤＳ全長にわたり設計できる点にある。異種ＤＮＡの発現に際し、そのＤＮＡ配列を宿主生物において使用頻度の高いコドンに変換することで、タンパク質発現量の増大が期待できる。使用する宿主におけるコドン使用頻度のデータは、例えば（公益財団法人）かずさＤＮＡ研究所のホーム
ページに公開されている遺伝暗号使用頻度データベース（http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html）を用いることができ、又は各宿主におけるコドン使用頻度を示した文献を参照してもよい。入手したデータと導入しようとするＤＮＡ配列を参照し、該ＤＮＡ配列に用いられているコドンの中で宿主において使用頻度の低いものを、同一のアミノ酸をコードし使用頻度の高いコドンに変換すればよい。
核酸配列認識モジュール及び／又は本発明のアクチベーターをコードするＲＮＡは、例えば、該モジュール及び／又は該アクチベーターをコードするＤＮＡを含むベクターを作製し、これを鋳型として、自体公知のインビトロ転写系にてｍＲＮＡに転写することにより調製することができる。あるいは、化学的にＲＮＡを合成することもできる。
本発明のアクチベーター又は本発明の複合体をコードするＤＮＡを含む発現ベクターは、例えば、該ＤＮＡを適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより作製することができる。
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３）；枯草菌由来のプラスミド（例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）；酵母由来プラスミド（例えば、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）；昆虫細胞発現プラスミド（例えば、ｐＦａｓｔ－Ｂａｃ）；動物細胞発現プラスミド（例えば、ｐＡ１－１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ）；λファージなどのバクテリオファージ；バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター（例えば、ＢｍＮＰＶ、ＡｃＮＰＶ）；レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などの動物ウイルスベクターなどが用いられる。遺伝子治療における利用を考慮すれば、導入遺伝子を長期にわたり発現させられる点や非病原性ウイルス由来で安全性の点からは、ＡＡＶベクターが好適に用いられる。
ＡＡＶベクターは、力価や感染効率が十分に担保される限り特に制限はないが、約５ｋｂ以下（例えば、約５ｋｂ、約４．９５ｋｂ、約４．９０ｋｂ、約４．８５ｋｂ、約４．８０ｋｂ、約４．７５ｋｂ、約４．７０ｋｂ又はそれ以下）であることが好ましい。本発明のアクチベーターのアミノ酸長は、好ましくは２００アミノ酸以下である。従って、本発明の複合体をコードする核酸とガイドヌクレオチドをコードする核酸の合計塩基長を、このサイズリミットを下回るように設計することが容易である。従って、本発明のアクチベーターは、本発明の複合体をコードする核酸と、ガイドヌクレオチドをコードする核酸とを、別々のＡＡＶベクターに搭載する必要がないとの利点を有する。
ウイルスベクターを発現ベクターとして用いる場合には、目的とする組織や臓器への感染に適した血清型に由来するベクターを用いることが好ましい。ＡＡＶベクターの例を挙げれば、中枢神経系や網膜を標的とする場合には、ＡＡＶ１、２、３、４、５、７、８、９又は１０をベースとしたベクター、心臓を標的とする場合には、ＡＡＶ１、３、４、６又は９をベースとしたベクター、肺を標的とする場合には、ＡＡＶ１、５、６、９又は１０をベースとしたベクター、肝臓を標的とする場合には、ＡＡＶ２、３、６、７、８、又は９をベースとしたベクター、骨格筋を標的とする場合には、ＡＡＶ１、２、６、７、８、９をベースとしたベクターを用いることが好ましい。がん治療のためには、ＡＡＶ２を用いることが好ましい。ＡＡＶの血清型に関しては、例えば、ＷＯ２００５／０３３３２１Ａ２などを参照することができる。
核酸配列認識モジュール及び／又は本発明のアクチベーターをコードするＲＮＡの宿主細胞への導入は、マイクロインジェクション法、リポフェクション法等により行うことができる。ＲＮＡ導入は１回もしくは適当な間隔をおいて複数回（例えば、２～５回）繰り返して行うことができる。
また、全く異なる位置の複数のＤＮＡ領域を標的としてもよい。従って、本発明の一実施態様において、異なる標的ヌクレオチド配列（１つの目的遺伝子内であってもよいし、異なる２以上の目的遺伝子内にあってもよく、これらの目的遺伝子は同一染色体上にあってもよいし、別個の染色体上に位置していてもよい）と特異的に結合する、２種以上の核酸配列認識モジュールを用いることができる。この場合、これらの核酸配列認識モジュールの各々１つと、本発明のアクチベーターとが、複合体を形成する。ここで、本発明のアクチベーターは共通のものを使用することができる。例えば、核酸配列認識モジュールとしてＣＲＩＳＰＲ－ＧＮＤＭシステムを用いる場合、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と本発明のアクチベーターとの複合体（融合タンパク質を含む）は共通のものを用い、ｇＮとして、異なる標的ヌクレオチド配列とそれぞれ相補鎖を形成する、２以上のｃｒＲＮＡ又は２以上のｃｒＲＮＡの各々とｔｒａｃｒＲＮＡとのキメラＲＮＡを２種以上作製して用いることができる。一方、核酸配列認識モジュールとしてジンクフィンガーモチーフやＴＡＬエフェクターなどを用いる場合には、例えば、異なる標的ヌクレオチドと特異的に結合する核酸配列認識モジュールに、本発明のアクチベーターを融合させることができる。
ｇＮをコードするＤＮＡは、その配列情報に基づいて、ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いて化学的に合成することができる。例えば、ＳａＣａｓ９用のｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、標的化された遺伝子の転写調節領域に相補的なターゲッティング配列、及び生来のＳａｃｒＲＮＡの少なくとも一部の「リピート」領域（例えば、ＧＵＵＵＵＡＧＵＡＣＵＣＵＧ；配列番号３１）を含むｃｒＲＮＡをコードするデオキシリボヌクレオチド配列、並びに、必要に応じてテトラループ（例えば、ＧＡＡＡ）を介して結合される、該ｃｒＲＮＡのリピート領域に相補的な少なくとも一部の「アンチリピート」領域（例えば、ＣＡＧＡＡＵＣＵＡＣＵＡＡＡＡＣ；配列番号３２）、及び、それに続く生来のＳａｔｒａｃｒＲＮＡのステムループ１領域、リンカー領域、及びステムループ２領域（ＡＡＧＧＣＡＡＡＡＵＧＣＣＧＵＧＵＵＵＡＵＣＡＣＧＵＣＡＡＣＵＵＧＵＵＧＧＣＧＡＧＡＵＵＵＵＵＵＵ；配列番号３３）を有するｔｒａｃｒＲＮＡをコードするデオキシリボヌクレオチド配列を有する。一方、ｄＣｐｆ１用のｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、標的化された遺伝子の転写調節領域に相補的なターゲッティング配列と、それに先行する５’ハンドル（例えば、ＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＣＵＵＧＵＡＧＡＵ；配列版後３４）とを含むｃｒＲＮＡのみをコードするデオキシリボヌクレオチド配列を有する。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質として、ＳａＣａｓ９及びＣｐｆ１以外のタンパク質を用いる場合には、公知の配列等に基づいて、使用するタンパク質用のｔｒａｃｒＲＮＡを適宜設計することができる。本発明のアクチベーターをコードするＤＮＡが連結されたＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードするＤＮＡは、該ＤＮＡが目的の宿主細胞中で機能するプロモーターの制御下に位置するように発現ベクターにサブクローニングすることができる。
ｇＮ（例えば、ｃｒＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡキメラ）をコードするＤＮＡは、宿主に応じて、上記と同様の方法により宿主細胞に導入することができる。
あるいは、ＣＲＩＳＰＲエフェクター分子を送達するために、ＤＮＡの代わりにＲＮＡを使用してもよい。一実施態様において、（ａ）本発明の複合体、及び（ｂ）ターゲッティング配列を含むｇＮ、を含む本発明のＣＲＩＳＰＲ－ＧＮＤＭシステムは、上記の（ａ）及び（ｂ）をコードするＲＮＡの形態で、目的の細胞や生物に導入することができる。
上記のエフェクター分子をコードするＲＮＡは、例えば、インビトロ転写を介して作製することができ、作製されたｍＲＮＡは、インビボ送達のために精製されてもよい。簡潔に説明すれば、エフェクター分子のＣＤＳ領域を含むＤＮＡフラグメントを、インビトロ転写を駆動するバクテリオファージに由来する人工プロモーター（例えば、Ｔ７、Ｔ３又
はＳＰ６プロモーター）の下流にクローニングすることができる。ＲＮＡは、Ｔ７ポリメラーゼ、ＮＴＰ及びＩＶＴ緩衝液などのインビトロでの転写に必要な成分を添加することにより、プロモーターから転写され得る。必要に応じて、免疫刺激を減少させ、翻訳及びヌクレアーゼ安定性を増強させるため、ＲＮＡを修飾してもよい（例えば、５ｍＣＡＰ（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャッピング、ＡＲＣＡ；アンチリバースキャップアナログ（３’Ｏ－Ｍｅ－Ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ）、５－メチルシチジン及びシュードウリジン修飾、３’ポリＡテイル）。
あるいは、エフェクタータンパク質と、ｇＮとの複合体（以下「核タンパク質（ＮＰ）」という）（例えば、デオキシリボ核タンパク質（ＤＮＰ）、リボ核タンパク質（ＲＮＰ））を用いて、ＣＲＩＳＰＲエフェクター分子とｇＮを送達することができる。簡潔に説明すれば、インビトロで作製されたＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質及びインビトロで転写された、又は化学的に合成されたｇＮを適切な比率で混合し、次いで脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）にカプセル化する。カプセル化されたＬＮＰを罹患動物又は患者に送達し、ＮＰ複合体を標的細胞や器官に直接送達することができる。
ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を、細菌において発現させ、そしてアフィニティカラムを介して精製することができる。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の細菌コドン最適化ｃＤＮＡ配列を、LifeSensorsからのｐＥ－ＳＵＭＯベクターのような細菌発現
プラスミド中にクローニングすることができる。ｃＤＮＡフラグメントに、Ｎ末端又はＣ末端のいずれかで、ＨＡ、６ｘＨｉｓ、Ｍｙｃ、又はＦＬＡＧペプチドのような低分子ペプチド配列でタグ付加することができる。プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ Ｂ８３４（ＤＥ３）のようなタンパク質発現細菌株中に導入することができる。導入後、タンパク質を、Ｎｉ－ＮＴＡカラム又は抗ＦＬＡＧアフィニティカラムのような、低分子ペプチドタグ配列に結合するアフィニティカラムを使用して精製することができる。結合したタグペプチドを、ＴＥＶプロテアーゼ処理によって除去することができる。タンパク質を、ＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６０カラム（GE Health-care）上でのクロマトグラフィーによってさらに精製することができる。
あるいは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、及びＨｅｌａ細胞のような哺乳動物細胞株において発現させることができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲタンパク質のヒトコドン最適化ｃＤＮＡ配列を哺乳動物発現プラスミド（例えば、ｐＡ１－１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ、ｐＳＲａ）；レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等のような動物ウイルス由来ベクターなどを使用してクローニングすることができる。ｃＤＮＡフラグメントに、Ｎ末端又はＣ末端のいずれかで、ＨＡ、６ｘＨｉｓ、Ｍｙｃ、又はＦＬＡＧペプチドのような低分子ペプチド配列でタグ付加することができる。プラスミドを、タンパク質発現哺乳動物細胞株中に導入することができる。トランスフェクションの２～３日後に、トランスフェクトされた細胞を収集し、そして発現されたＣＲＩＳＰＲタンパク質を、上記の低分子ペプチドタグ配列へのアフィニティカラム結合を使用して精製することができる。
本発明のアクチベーターも、上記の方法と同様の方法により得ることができる。
本発明は、本発明の例示的な非限定的な実施態様を提供する以下の実施例を参照することにより、より十分に理解される。
本発明者らは、既存の活性化部分に匹敵するか又は既存の活性化部分より良好な転写活性化能さえ持ちながら、ｄＳａＣａｓ９との融合及び５ｋｂのＡＡＶベクターサイズ限界
への適合に十分に小さな、新たな活性化部分を設計及び構築した。（図１）。既存の活性化部分は、ＶＰ６４（５０ａ．ａ．）、ＶＰ１６０（１３０ａ．ａ．）、ＶＰＲ（５２０ａ．ａ．）、及びＰ３００（６１７ａ．ａ．）を含む（PMID:27214048/ 25730490に記載
されている）。これらの活性化部分のうち、ＶＰ６４及びＶＰ１６０のみが、ｄＳａＣａｓ９と融合させた場合にＡＡＶベクターのサイズ限界を満たす。
それゆえ、本発明者らは、ｄＳａＣａｓ９と融合させた以下の７個の新たな活性化部分を構築及び試験し、そしてそのトランス活性化能を既存の３個の部分（ＶＰ６４、ＶＰ１６０及びＶＰＲ）と比較した。
生成した活性化部分のアミノ酸及びヌクレオチド配列
１．ＶＰ６４－ｍｉｎｉＭＹＯＤ（１５４ａ．ａ．）は、Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｓリンカー（下線）によって連結されたＶＰ６４（斜字）及びヒトＭＹＯＤ１由来の１～１００ａ．ａ．（太字、PMID: 9710631）からなる；
２．ＶＰ６４－ｍｉｎｉＨＳＦ１（１５４ａ．ａ．）は、Ｇ－Ｓ－Ｓ－Ｇリンカー（下線）によって連結されたＶＰ６４（斜字）及びヒトＨＳＦ１由来の４３０～５２９ａ．ａ．（太字、PMID:7760831）からなる；
３．ＶＰ３２－ｍｉｎｉＰ６５（１６０ａ．ａ．）は、Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｓリンカー（下線）によって連結されたＶＰ３２（斜字）及びヒトＰ６５由来の４１５～５４６ａ．ａ．（太字、PMID:1732726）からなる；
４．ＶＰ６４－ｍｉｎｉＲＴＡ（１６７ａ．ａ．）は、Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｓリンカー（下線）によって連結されたＶＰ６４（斜字）及びエプスタイン・バーウイルス複製及び転写アクチベーター由来の４９３～６０５ａ．ａ．（太字、ＲＴＡ；PMID:1323708）からなる；
５．ＶＰ６４－ｍｉｎｉＰ６５（１８６ａ．ａ．）は、Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｓリンカー（下線）によって連結されたＶＰ６４（斜字）及びヒトＰ６５由来の４１５～５４６ａ．ａ．（太字、PMID:1732726）からなる；
６．ＶＰＨ（３７６ａ．ａ．）は、ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ）（配列番号４５）及び／又はＳ－Ｇ－Ｑ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇリンカー（下線）によって連結されたＶＰ６４（斜字）、マウスＰ６５由来の３６９～５４９ａ．ａ．（太字）及びヒトＨＳＦ１由来の４０７～５２９ａ．ａ．（下線、太字）、PMID:25494202）からなる；
７．ＶＰＲ（５１０ａ．ａ．）は、ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ）及び／又はＧ－Ｓ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｓリンカー（下線）によって連結されたＶＰ６４（斜字）、ヒトＰ６５由来の２８４～５４３ａ．ａ．（太字、PMID:5970）及びエプスタイン・バーウイルス複製及び転
写アクチベーター由来の４１６～６０５ａ．ａ．（下線、太字、ＲＴＡ；PMID:1323708）からなる
８．ＶＰ６４－ｍｉｃｒｏＲＴＡ（１４０ａ．ａ．）は、Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｓリンカー（下線）によって連結されたＶＰ６４（斜字）及びエプスタイン・バーウイルス複製及び転写アクチベーター由来の５２０～６０５ａ．ａ．（太字、ＲＴＡ；PMID:1323708）からなる；
プラスミドクローニング
新たな活性化部分（ＡＭ）をＩＤＴによって合成し、そしてＮＵＣ９－ｄＳａＣａｓ９ベクター中にクローニングした。融合タンパク質はＥＦＳプロモーターから発現された。
使用したｓｇＲＮＡ配列：
細胞トランスフェクション
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、ウェル当たり７５，０００細胞で、２４ウェルプレートにプレーティングした。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を製造業者の説明書に従って使用して、２５０ｎｇの融合タンパク質発現プラスミドＮＵＣ９－ｄｓａＣａｓ９－ＡＭを、ｓｇＲＮＡ発現プラスミドＬｖＳＧ０３と同時トランスフェクトした。２４時間後、トランスフェクトした細胞をピューロマイシン選択に供し、そして翌日に収集した。
ｄＳａＣａｓ９ヌクレオチド配列；
ｔｒａｃｒＲＮＡ配列；
ＲＮＡ単離及び遺伝子発現分析
遺伝子発現分析のために、トランスフェクトした細胞を、トランスフェクション後４８～７２時間で収集し、ＲＮｅａｓｙキット（Qiagen）を使用して、ＲＬＴバッファー中で溶解して、全ＲＮＡを抽出した。
Ｔａｑｍａｎ分析のために、１μｇの全ＲＮＡを使用して、１０μｌの体積中でＴａｑＭａｎ（商標）Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ Ｋｉｔ（Applied Biosystems）を使用してｃＤＮＡを生成した。生成されたｃＤＮＡを１０倍希釈し、そしてＴａｑｍａｎ反応（反応当たり１０μｌの総体積）当たり３．３３μｌを使用した。Ｔａｑｍａｎ反応を、Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ９６又はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０中でＴａｑｍａｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ThermoFisher）を使用して実行し、そしてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ９６分析ソフトウェアを使用して分析した。
Ｔａｑｍａｎプローブ産物ＩＤ：
ＭＹＤ８８；Ｈｓ０１５７３８３７＿ｇ１（ＦＡＭ）
ＦＧＦ２１：Ｈｓ００１７３９２７＿ｍ１
ＧＣＧ：Ｈｓ０１０３１５３６＿ｍ１
ＨＰＲＴ：Ｈｓ９９９９９９０９＿ｍ１（ＶＩＣ ＰＬ）
Ｔａｑｍａｎ ＱＰＣＲ条件：
工程１；９５℃ １０分
工程２；９５℃ １５秒
工程３；６０℃ ３０秒
工程２及び３の繰り返し；４０回
結果
図１．ＡＡＶベクターの構造及び１０個の活性化部分
本発明者らのＡＡＶベクターは、下記のダイアグラムに示す活性化部分と融合されたｄＳａＣａｓ９を含む。融合タンパク質はＥＦＳプロモーターによって発現され、そしてｓｇＲＮＡはＵ６プロモーターから発現される。７個の新たな活性化部分を作製した；ＶＰ６４－ＭｙｏＤ、ＶＰ６４－ＨＳＦ１、ＶＰ３２－ｐ６５、ＶＰ６４－ｍｉｎｉＲＴＡ、ＶＰ６４－ｍｉｃｒｏＲＴＡ、ＶＰ６４－ｐ６５及びＶＰＨ。また、報告された活性化部分（ＶＰ６４、ＶＰ１６０及びＶＰＲ）を比較のために試験した。ＡＡＶベクターのサイズ限界は５ｋｂであり、そしてコンポーネントの合計は４．４５ｋｂである。これは、融合される活性化部分のために約５５０ｂｐの余地を残す。従って、以下の７個の活性化部分が、ベクターサイズ限界内に適合する；ＶＰ６４、Ｖｐ１６０、ＶＰ６４－ＭｙｏＤ、ＶＰ６４－ＨＳＦ１、ＶＰ３２－ｐ６５、ＶＰ６４－ｍｉｎｉＲＴＡ及びＶＰ６４－ｍｉｃｒｏＲＴＡ。
図２．９個の活性化部分によるＭＹＤ８８遺伝子活性化
６個の新たな活性化部分の活性化機能を、ヒトＭＹＤ８８プロモーター領域を標的化する３個の異なるｓｇＲＮＡ（ＭＹＤ８８－１、－２及び－３）を用いて試験した。また、３個の活性化部分、ＶＰ６４、ＶＰ１６０及びＶＰＲを比較のために試験した。試験した３個のｓｇＲＮＡの全てにおいて、ＶＰ６４－ＲＴＡは、ＡＡＶベクターサイズ限界内に適合する６個の部分の最良の遺伝子活性化を示した。
図３．９個の活性化部分によるＦＧＦ２１遺伝子活性化
６個の新たな活性化部分の活性化機能を、ヒトＦＧＦ２１プロモーター領域を標的化する３個の異なるｓｇＲＮＡ（ＦＧＦ－１、－２及び－３）を用いて試験した。また、３個の活性化部分、ＶＰ６４、ＶＰ１６０及びＶＰＲを比較のために試験した。試験した３個のｓｇＲＮＡの全てにおいて、ＶＰ６４－ＲＴＡは、ＡＡＶベクターサイズ限界内に適合する６個の部分の最良の遺伝子活性化を示した。
図４．９個の活性化部分によるＧＣＧ遺伝子活性化
６個の新たな活性化部分の活性化機能を、ヒトＧＣＧプロモーター領域を標的化する３個の異なるｓｇＲＮＡ（ＧＣＧ－１、－２及び－３）を用いて試験した。また、３個の活性化部分、ＶＰ６４、ＶＰ１６０及びＶＰＲを比較のために試験した。試験した３個のｓｇＲＮＡの全てにおいて、ＶＰ６４－ＲＴＡは、ＡＡＶベクターサイズ限界内に適合する６個の部分の最良の遺伝子活性化を示した。
図５．ＶＰ６４－ｍｉｎｉＲＴＡ及びＶＰ６４－ｍｉｃｒｏＲＴＡによるＭｙＤ８８遺伝子活性化
ＶＰ６４－ｍｉｎｉＲＴＡ（１６４ａ．ａ．）及びＶＰ６４－ｍｉｃｒｏＲＴＡ（１４０ａ．ａ．）の活性化機能を、ヒトＭＹＤ８８プロモーターにおいて比較した。ＶＰ６４－ｍｉｃｒｏＲＴＡは、ＶＰ６４－ｍｉｎｉＲＴＡと同様のレベルの活性化を示した。ｇＭＹＤ８８＿２を使用した。
結論
本発明者らのＶＰ６４－ｍｉｎｉＲＴＡ（ｍｉｎｉＶＲ；１６７ａ．ａ．、５０１ｂｐ）およびＶＰ６４－ｍｉｃｒｏＲＴＡ（ｍｉｃｒｏＶＲ；１４０ａ．ａ．、４２０ｂｐ）は、Ｃａｓ９、ｓｇＲＮＡ及びプロモーターのような他の要素の存在下で、ＡＡＶベクターのサイズ限界（５ｋｂ）内に適合するために十分に小さい。
従って、ＶＰ６４－ｍｉｎｉＲＴＡ及びＶＰ６４－ｍｉｃｒｏＲＴＡは、ＣＲＩＳＰＲ技術およびＡＡＶ送達システムでの使用のための強力な部分である。
本出願は、米国仮特許出願第６２／７１５，４３２号（出願日：２０１８年８月７日）（その内容の全体は参照により本明細書に組み込まれる）に基づく。

Claims (14)

  1. ２００個以下のアミノ酸からなり、ＶＰ６４とＲＴＡの転写活性化部位とを含む、転写アクチベーター。
  2. 前記ＶＰ６４が、
    （１）配列番号１で示されるアミノ酸配列、
    （２）（１）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
    （３）（１）のアミノ酸配列と９０％以上同一なアミノ酸配列、
    を含む、請求項１に記載の転写アクチベーター。
  3. 前記ＲＴＡの転写活性化部位が、
    （４）配列番号２で示される配列、
    （５）配列番号３で示される配列、
    （６）（４）若しくは（５）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
    （７）（４）若しくは（５）のアミノ酸配列と９０％以上同一なアミノ酸配列、
    を含む、請求項１又は２に記載の転写アクチベーター。
  4. 互いに結合した、二本鎖ＤＮＡ中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、請求項１～３のいずれか１項に記載の転写アクチベーターとを含み、該ＤＮＡ中の標的化された遺伝子の転写を活性化する、複合体。
  5. 前記核酸配列認識モジュールが、二本鎖ＤＮＡの少なくとも一方の鎖を切断する能力を欠いたＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を含む、請求項４に記載の複合体。
  6. 前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を切断する能力を欠いている、請求項５に記載の複合体。
  7. 前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が、スタフィロコッカス・アウレウス又はカンピロバクター・ジェジェニに由来する、請求項５又は６に記載の複合体。
  8. 請求項１～３のいずれか１項に記載の転写アクチベーターをコードする核酸。
  9. 請求項４～７のいずれか１項に記載の複合体をコードする核酸。
  10. 請求項８又は９に記載の核酸を含むベクター。
  11. 前記ベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項１０に記載のベクター。
  12. 細胞における標的化された遺伝子の転写を活性化する方法であって、請求項４～７のいずれか１項に記載の複合体、請求項８若しくは９に記載の核酸、又は請求項１０若しくは１１に記載のベクターを該細胞へ導入する工程を含む、方法。
  13. 前記細胞が哺乳類動物細胞である、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記哺乳動物がヒトである、請求項１３に記載の方法。
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