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BR112020000310A2 - variantes de crispr alvo específicas - Google Patents

variantes de crispr alvo específicas Download PDF

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BR112020000310A2
BR112020000310A2 BR112020000310-7A BR112020000310A BR112020000310A2 BR 112020000310 A2 BR112020000310 A2 BR 112020000310A2 BR 112020000310 A BR112020000310 A BR 112020000310A BR 112020000310 A2 BR112020000310 A2 BR 112020000310A2
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BR
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spcas9
amino acids
wild
amino acid
Prior art date
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BR112020000310-7A
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Inventor
Young-Hoon Kim
Min Hee JUNG
Joonsun LEE
Eunji Shin
Kang In LEE
Seokjoong Kim
JeongJoon LEE
Original Assignee
Toolgen Incorporated
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Publication date
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    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
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Abstract

A presente invenção refere-se a um sistema CRISPR/Cas9 artificialmente modificado. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a uma enzima CRISPR artificialmente manipulada tendo especificidade de alvo melhorada e um uso de um sistema CRISPR/Cas9 artificialmente modificado incluindo a mesma enzima na manipulação ou modificação de genoma e/ou epigenoma, alvejamento de genoma, edição de genoma e diagnóstico in vitro, etc.

Description

“VARIANTES DE CRISPR ALVO ESPECÍFICAS” [CAMPO TÉCNICO]
[0001] A presente invenção refere-se a um sistema CRISPR/Cas9 artificialmente modificado. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a uma enzima CRISPR artificialmente manipulada tendo especificidade de alvo melhorada e um uso para manipulação ou modificação de genoma e/ou epigenoma, alvejamento de genoma, edição de genoma e diagnósticos in vitro, etc. usando um sistema CRISPR/Cas9 artificialmente modificado incluindo a enzima CRISPR.
[FUNDAMENTOS DA TÉCNICA]
[0002] O sistema CRISPR-Cas consiste em um RNA guia (gRNA) tendo uma sequência complementar para um gene ou ácido nucleico alvo e uma enzima CRISPR que é uma nuclease que pode clivar um gene ou ácido nucleico alvo, em que o gRNA e a enzima CRISPR formam um complexo CRISPR, e o gene ou o ácido nucleico alvo é clivado ou modificado pelo complexo CRISPR formado.
[0003] Entretanto, além do efeito de modificação de um gene ou ácido nucleico alvo, a modificação de um gene ou o ácido nucleico não alvo indesejado ainda não foi resolvida. O gene ou o ácido nucleico não alvo é um sítio gênico tendo uma sequência parcialmente complementar com gRNA e pode formar ligações parcialmente complementares com o gRNA, em que, devido à ligação complementar parcial, o complexo CRISPR pode clivar ou modificar um sítio gênico correspondente, que é um gene ou o ácido nucleico não alvo que não é submetido à modificação.
[0004] Portanto, ao aumentar a eficiência de modificar especificamente um gene ou ácido nucleico alvo usando o sistema CRISPR-Cas, ou resolver um problema tal como a ligação genética que pode causar a modificação de um gene ou do ácido nucleico não alvo, é importante aumentar a especificidade de alvo do sistema CRISPR-Cas. Para aumentar a especificidade de alvo do sistema CRISPR-Cas, uma variedade de pesquisas em seleção de gRNA com uma baixa quantidade de genes não alvo candidatos e ajuste de atividade e/ou especificidade da enzima CRISPR foram experimentadas.
DOCUMENTOS DE TÉCNICA ANTERIOR DOCUMENTO NÃO PATENTEADO
[0005] (Documento não patenteado 0001) Kim, D. et al. Nat Methods 12, 237-243, 231 p following 243 (2015)
[0006] (Documento não patenteado 0002) Tsai, S.Q.
et al. Nat Biotechnol 33, 187-197 (2015)
[0007] (Documento não patenteado 0003) Kim, S., Kim, D., Cho, S.W., Kim, J. & Kim, J.S. Genome Res 24, 1012-1019 (2014)
[0008] (Documento não patenteado 0004) Cho, S.W.
et al. Genome Res 24, 132-141 (2014)
[0009] (Documento não patenteado 0005) Mali, P. et al. Nat Biotechnol 31, 833-838 (2013)
[0010] (Documento não patenteado 0006) Ran, F.A.
et al. Cell 154, 1380-1389 (2013)
[0011] (Documento não patenteado 0007) Fu, Y.,
Sander, J.D., Reyon, D., Cascio, V.M. & Joung, J.K. Nat Biotechnol 32, 279-284 (2014)
[0012] (Documento não patenteado 0008) Nishimasu, H. et al. Cell 156, 935-949 (2014)
[0013] (Documento não patenteado 0009) Kleinstiver, B.P. et al. Nature 529, 490-495 (2016)
[0014] (Documento não patenteado 0010) Slaymaker, I.M. et al. Science 351, 84-88 (2016)
[0015] (Documento não patenteado 0011) Chen, J.S.
et al. Nature (2017)
[0016] (Documento não patenteado 0012) Kleinstiver, B.P. et al. Nat Biotechnol 33, 1293-1298 (2015)
[0017] (Documento não patenteado 0013) Kleinstiver, B.P. et al. Nature 523, 481-485 (2015)
[0018] (Documento não patenteado 0014) Chen, Z. & Zhao, H. Nucleic Acids Res 33, e154 (2005)
[0019] (Documento não patenteado 0015) Hsu, P.D.
et al. Nat Biotechnol 31, 827-832 (2013)
[0020] (Documento não patenteado 0016) McKenzie, G.J. & Craig, N.L. BMC Microbiol 6, 39 (2006)
[0021] (Documento não patenteado 0017) Kulcsar, P.I. et al. Genome Biol 18, 190 (2017)
[0022] (Documento não patenteado 0018) Zhang, D.
et al. Genome Biol 18, 191 (2017)
[0023] (Documento não patenteado 0019) Komor, A.C., Kim, Y.B., Packer, M.S., Zuris, J.A. & Liu, D.R.
Nature 533, 420-424 (2016)
[0024] (Documento não patenteado 0020) Kim, D., Kim, S., Park, J. & Kim, J.S. Genome Res 26, 406-415 (2016)
[0025] (Documento não patenteado 0021) Geissmann, Q. PLoS One 8, e54072 [DIVULGAÇÃO] [PROBLEMA TÉCNICO]
[0026] Em um aspecto, a presente invenção é direcionada a fornecer uma enzima CRISPR artificialmente manipulada tendo especificidade de alvo melhorada.
[SOLUÇÃO TÉCNICA]
[0027] Para resolver o problema, a presente invenção refere-se a uma enzima CRISPR artificialmente manipulada. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a uma Cas9 tendo especificidade de alvo melhorada para um gene ou ácido nucleico alvo e um sistema CRISPR/Cas9 usando a mesma.
[0028] A presente invenção fornece uma enzima CRISPR artificialmente manipulada para um propósito específico.
[0029] Em um aspecto, a enzima CRISPR artificialmente manipulada pode ser uma variante da SpCas9 (mutante) com especificidade de alvo melhorada compreendendo uma manipulação artificial, em que a manipulação artificial pode compreender uma manipulação artificial (modificação) de um ou mais aminoácidos presentes em uma ou mais regiões selecionadas de uma primeira região, uma segunda região, uma terceira região e uma quarta região de uma Cas9 de Streptococcus pyogenes do tipo selvagem (SpCas9).
[0030] A primeira região da SpCas9 do tipo selvagem pode ser uma ou mais partes selecionadas do grupo consistindo em uma parte da SpCas9 do tipo selvagem interagindo com um gRNA, uma parte da SpCas9 do tipo selvagem interagindo com uma sequência alvo, uma parte da SpCas9 do tipo selvagem interagindo com um heteroduplex da sequência alvo de gRNA, e uma parte da SpCas9 do tipo selvagem interagindo com a extremidade distal do PAM (motivo adjacente ao Protoespaçador) do heteroduplex da sequência alvo de gRNA.
[0031] Aqui, a extremidade distal do PAM do heteroduplex da sequência alvo de gRNA pode ter de 6 a 10 pares de base na extremidade do heteroduplex da sequência alvo de gRNA distante da localização do PAM.
[0032] Aqui, o PAM pode ser 5’-NGG-3’.
[0033] A segunda região da SpCas9 do tipo selvagem pode ser uma parte da SpCas9 do tipo selvagem que realiza uma função de clivar um ácido nucleico.
[0034] A terceira região da SpCas9 do tipo selvagem pode ser uma parte da SpCas9 do tipo selvagem que realiza uma função de clivar um ácido nucleico.
[0035] A quarta região da SpCas9 do tipo selvagem pode ser uma ou mais partes selecionadas do grupo consistindo em uma parte da SpCas9 do tipo selvagem que reconhece ou interage com uma sequência do PAM em um gene ou ácido nucleico alvo e uma parte da SpCas9 do tipo selvagem interagindo com uma parte de uma sequência nucleotídica de um gRNA.
[0036] A primeira região da SpCas9 do tipo selvagem pode ser uma ou mais regiões selecionadas do grupo consistindo em uma região localizada em um lobo de REC da SpCas9 do tipo selvagem, um domínio de REC total da SpCas9 do tipo selvagem e uma parte de um domínio de REC da SpCas9 do tipo selvagem.
[0037] A segunda região da SpCas9 do tipo selvagem pode ser uma ou mais regiões selecionadas do grupo consistindo em uma região localizada em um lobo de NUC da SpCas9 do tipo selvagem, um domínio de RuvC total da SpCas9 do tipo selvagem, uma parte de um domínio de RuvC da SpCas9 do tipo selvagem e uma parte incluindo uma região de clivagem de ácido nucleico dependente de metal de um domínio de RuvC da SpCas9 do tipo selvagem.
[0038] Aqui, a região de clivagem de ácido nucleico dependente de metal do domínio de RuvC pode ser uma região capaz de clivar uma ligação entre ácidos nucleicos na localização do alvo interagindo com um metal no domínio de RuvC.
[0039] A terceira região da SpCas9 do tipo selvagem pode ser uma ou mais regiões selecionadas do grupo consistindo em uma região localizada em um lobo de NUC da SpCas9 do tipo selvagem, um domínio de HNH total da SpCas9 do tipo selvagem, uma parte de um domínio de HNH da SpCas9 do tipo selvagem e uma parte incluindo uma região de clivagem de ácido nucleico dependente de metal de um domínio de HNH da SpCas9 do tipo selvagem.
[0040] Aqui, a região de clivagem de ácido nucleico dependente de metal do domínio de HNH pode ser uma região capaz de clivar uma ligação entre ácidos nucleicos na localização do alvo interagindo com um metal no domínio de HNH.
[0041] A quarta região da SpCas9 do tipo selvagem pode ser uma ou mais regiões selecionadas do grupo consistindo em uma região localizada em um lobo de NUC da SpCas9 do tipo selvagem, um domínio de PI total da SpCas9 do tipo selvagem e uma parte de um domínio de PI da SpCas9 do tipo selvagem.
[0042] A primeira região pode compreender uma ou mais regiões selecionadas do grupo consistindo em uma região 1-1 composta de uma sequência de aminoácidos de fenilalanina na 196a posição (F196) a isoleucina na 282a posição (I282) da SpCas9 do tipo selvagem, uma região 1-2 composta de uma sequência de aminoácidos de prolina na 316a posição (P316) a asparagina na 394a posição (N394) da SpCas9 do tipo selvagem, uma região 1-3 composta de uma sequência de aminoácidos de lisina na 510a posição (K510) a asparagina na 612a posição (N612) da SpCas9 do tipo selvagem e uma região 1-4 composta de uma sequência de aminoácidos de treonina na 678a posição (T678) a histidina na 698a posição (H698) da SpCas9 do tipo selvagem.
[0043] A primeira região pode compreender N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247,
L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 e I697 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0044] Aqui, a segunda região pode compreender uma ou mais regiões selecionadas do grupo consistindo em uma região 2-1 composta de uma sequência de aminoácidos de metionina na 1a posição (M1) a treonina na 22a posição (T22) da SpCas9 do tipo selvagem, uma região 2-2 composta de uma sequência de aminoácidos de prolina na 731a posição (P731) a treonina na 770a posição (T770) da SpCas9 do tipo selvagem e uma região 2-3 composta de uma sequência de aminoácidos de glutamina na 926a posição (Q926) a serina na 1040a posição (S1040) da SpCas9 do tipo selvagem.
[0045] A segunda região pode compreender I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987,
Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 e Y1039 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0046] Aqui, a terceira região pode compreender uma região 3-1 composta de uma sequência de aminoácidos de lisina na 775a posição (K775) a leucina na 900a posição (L900) da SpCas9 do tipo selvagem.
[0047] A terceira região pode compreender K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896 e D898 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0048] Aqui, a quarta região pode compreender uma região 4-1 composta de uma sequência de aminoácidos de ácido glutâmico na 1099a posição (E1099) a valina na 1139a posição (V1139) da SpCas9 do tipo selvagem.
[0049] A quarta região pode compreender T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0050] Em uma modalidade exemplificativa, o um ou mais aminoácidos presentes em uma ou mais regiões selecionadas da primeira região, da segunda região, da terceira região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem pode ser um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18,
A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208,
A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227,
Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242,
A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262,
L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282,
P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338,
V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363,
G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383,
G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524,
V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547,
I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572,
C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592,
L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683,
G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733,
G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751,
G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779,
R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799,
E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835,
D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861,
K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884,
K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939,
L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966,
F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993,
G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011,
V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032,
A1034, F1037, F1038, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117,
D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0051] Em uma modalidade exemplificativa, o um ou mais aminoácidos presentes em uma ou mais regiões selecionadas da primeira região, da segunda região, da terceira região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem pode ser um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em A203, N277, G366, F539, I601, M763, K890, D965, F1038, T1102 e D1127 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0052] A manipulação artificial pode ser uma deleção de um ou mais aminoácidos presentes em uma ou mais regiões selecionadas da primeira região, da segunda região, da terceira região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0053] A manipulação artificial pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos presentes em uma ou mais regiões selecionadas da primeira região, da segunda região, da terceira região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido diferente.
[0054] Aqui, o aminoácido diferente pode ser um aminoácido tendo um grupo funcional menor que um ou mais aminoácidos presentes em uma ou mais regiões selecionadas da primeira região, da segunda região, da terceira região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0055] Aqui, o aminoácido diferente pode ser um aminoácido tendo um grupo funcional maior que um ou mais aminoácidos presentes em uma ou mais regiões selecionadas da primeira região, da segunda região, da terceira região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0056] Aqui, o aminoácido diferente pode ser um aminoácido tendo um índice de hidropatia maior que um ou mais aminoácidos presentes em uma ou mais regiões selecionadas da primeira região, da segunda região, da terceira região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0057] Aqui, o aminoácido diferente pode ser um aminoácido tendo um índice de hidropatia menor que um ou mais aminoácidos presentes em uma ou mais regiões selecionadas da primeira região, da segunda região, da terceira região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0058] Em um aspecto, a variante da SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 alvo específica (TS-SpCas9) compreendendo uma manipulação artificial de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em A203, N277, G366, F539, I601, M763, K890, D965, F1038, T1102 e D1127 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0059] A manipulação artificial pode ser uma deleção ou uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em A203, N277, G366, F539, I601, M763, K890, D965, F1038, T1102 e D1127 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido diferente.
[0060] Aqui, o aminoácido diferente pode ser um aminoácido tendo um grupo funcional maior ou menor que um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em A203, N277, G366, F539, I601, M763, K890, D965, F1038, T1102 e D1127 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0061] Aqui, o aminoácido diferente pode ser um aminoácido tendo um índice de hidropatia maior ou menor que um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em A203, N277, G366, F539, I601, M763, K890, D965, F1038, T1102 e D1127 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0062] A variante de TS-SpCas9 pode compreender uma manipulação artificial de F539 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0063] A variante de TS-SpCas9 pode compreender uma manipulação artificial de M763 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0064] A variante de TS-SpCas9 pode compreender uma manipulação artificial de K890 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0065] A variante de TS-SpCas9 pode compreender uma manipulação artificial de F539/M763(F539 e M763), F539/K890 ou M763/K890 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0066] A variante de TS-SpCas9 pode compreender uma manipulação artificial de F539, M763 e K890 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0067] Em um aspecto, a enzima CRISPR artificialmente manipulada pode ser uma proteína de fusão compreendendo a variante de TS-SpCas9.
[0068] A proteína de fusão pode compreender um ou mais domínios funcionais.
[0069] Aqui, o domínio funcional pode ser um ou mais domínios selecionados do grupo consistindo em um domínio tendo atividade de metilase, atividade de desmetilase, atividade de ativação de transcrição, atividade de repressão de transcrição, atividade de fator de liberação de transcrição, atividade de modificação de histona, atividade de clivagem de RNA ou atividade de ligação de ácido nucleico, um marcador para isolamento e purificação de uma proteína (incluindo um peptídeo), um gene repórter, uma NLS(sequência ou sinal de localização nuclear), uma NES(sequência ou sinal de exportação nuclear) e uma desaminase.
[0070] Em um aspecto, a enzima CRISPR artificialmente manipulada pode ser uma forma de um ácido nucleico que codifica a variante da SpCas9, a variante de TS-SpCas9 e/ou a proteína de fusão.
[0071] Em um aspecto, o ácido nucleico pode ser incluído em um vetor.
[0072] Em um aspecto, o ácido nucleico que codifica a variante da SpCas9, a variante de TS-SpCas9 e/ou a proteína de fusão; e/ou o vetor pode ser introduzido em uma célula.
[0073] Em um aspecto, um genoma de uma célula pode ser artificialmente manipulado usando a variante da SpCas9, a variante de TS-SpCas9 e/ou a proteína de fusão, com um gRNA.
[0074] O gRNA pode ser um ácido nucleico compreendendo uma ligação complementar de sequência nucleotídica a uma sequência alvo de um gene alvo presente no genoma da célula.
[EFEITOS VANTAJOSOS]
[0075] De acordo com a presente invenção, um sistema CRISPR-Cas tendo especificidade de alvo melhorada usando uma enzima CRISPR artificialmente manipulada pode ser usado em manipulação ou modificação de genoma e/ou epigenoma, alvejamento de genoma, edição de genoma e diagnósticos in vitro.
[BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS]
[0076] A FIG. 1 é um gráfico que mostra as frequências de indel (inserção e deleção) (%), que representa o efeito da manipulação de um gene alvo (gene DMD) pelas variantes da primeira região da SpCas9.
[0077] A FIG. 2 é um gráfico que mostra as frequências de indel (%), que representa o efeito da manipulação de um gene alvo (gene EMX) pelas variantes da primeira região da SpCas9.
[0078] A FIG. 3 é um gráfico que mostra as frequências de indel (%), que representa o efeito da manipulação de um gene alvo (gene VEGFA) pelas variantes da primeira região da SpCas9.
[0079] As FIGS. 4 e 5 são gráficos mostrando as frequências de indel (%), que representa o efeito da manipulação de um gene alvo (gene DMD) pelas variantes da segunda região da SpCas9.
[0080] As FIGS. 6 e 7 são gráficos mostrando frequências de indel (%), que representa o efeito da manipulação de um gene alvo (gene EMX) pelas variantes da segunda região da SpCas9.
[0081] A FIG. 8 é um gráfico que mostra as frequências de indel (%), que representa o efeito da manipulação de um gene alvo (gene VEGFA) pelas variantes da segunda região da SpCas9.
[0082] A FIG. 9 é um gráfico que mostra as frequências de indel (%), que representa o efeito da manipulação de um gene alvo (gene HBB03) pelas variantes da segunda região da SpCas9.
[0083] A FIG. 10 é um gráfico que mostra as frequências de indel (%), que representa o efeito da manipulação de um gene alvo (gene HBB04) pelas variantes da segunda região da SpCas9.
[0084] A FIG. 11 é um gráfico que mostra as frequências de indel (%), que representa o efeito da manipulação de um gene alvo (gene DMD) pelas variantes da terceira região da SpCas9.
[0085] A FIG. 12 é um gráfico que mostra as frequências de indel (%), que representa o efeito da manipulação de um gene alvo (gene DMD) pelas variantes da quarta região da SpCas9.
[0086] A FIG. 13 é um gráfico que mostra as frequências de indel (%), que representa o efeito da manipulação de um gene alvo (gene EMX) pelas variantes da quarta região da SpCas9.
[0087] A FIG. 14 é um gráfico que mostra as frequências de indel (%), que representa o efeito da manipulação de um gene alvo (gene DMD) pelas variantes da SpCas9 tendo mutações em duas regiões das quatro regiões da SpCas9.
[0088] A FIG. 15 é um gráfico que mostra as frequências de indel (%), que representa o efeito da manipulação de um gene alvo (gene EMX) pelas variantes da SpCas9 tendo mutações em duas regiões das quatro regiões da SpCas9.
[0089] A FIG. 16 é um gráfico que mostra as frequências de indel (%), que representa o efeito da manipulação de um gene alvo (gene VEGFA) pelas variantes da SpCas9 tendo mutações em duas regiões das quatro regiões da SpCas9.
[0090] A FIG. 17 é um gráfico que mostra as frequências de indel (%), que representa o efeito da manipulação de um gene alvo (gene HBB03) pelas variantes da SpCas9 tendo mutações em duas regiões das quatro regiões da SpCas9.
[0091] A FIG. 18 é um gráfico que mostra as frequências de indel (%), que representa o efeito da manipulação de um gene alvo (gene HBB04) pelas variantes da SpCas9 tendo mutações em duas regiões das quatro regiões da SpCas9.
[0092] A FIG. 19 é um gráfico que mostra as frequências de indel (%), que representa o efeito da manipulação de um gene alvo (gene DMD) pelas variantes da SpCas9 tendo mutações em três regiões das quatro regiões da SpCas9.
[0093] A FIG. 20 é um gráfico que mostra as frequências de indel (%), que representa o efeito da manipulação de um gene alvo (gene VEGFA) pelas variantes da
SpCas9 tendo mutações em três regiões das quatro regiões da SpCas9.
[0094] A FIG. 21 é um gráfico que mostra as frequências de indel (%), que representa o efeito da manipulação de um gene alvo (gene HBB03) pelas variantes da SpCas9 tendo mutações em três regiões das quatro regiões da SpCas9.
[0095] A FIG. 22 é um gráfico que mostra as frequências de indel (%), que representa o efeito da manipulação de um gene alvo (gene HBB04) pelas variantes da SpCas9 tendo mutações em três regiões das quatro regiões da SpCas9.
[0096] A FIG. 23 é um gráfico que mostra as frequências de indel (%), que representa o efeito da manipulação de um gene alvo (gene DMD) pelas variantes da SpCas9 tendo mutações em três regiões das quatro regiões da SpCas9.
[MODALIDADES DA INVENÇÃO]
[0097] A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados na especificação têm os mesmos significados como convencionalmente entendidos por aqueles com habilidade comum na técnica à qual a presente invenção pertence. Embora os métodos e materiais semelhantes ou idênticos àqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências mencionadas aqui são incorporados por referência em sua totalidade. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são meramente ilustrativos, mas não estão intencionados a serem limitativos.
[0098] Um aspecto da divulgação aqui divulgada refere-se a uma enzima CRISPR.
[0099] A “enzima CRISPR” é um componente importante da proteína de um sistema de proteína (Cas) associada a repetições palindrômicas curtas interespaçadas regularmente agrupadas (CRISPR)-CRISPR, e forma um complexo com um RNA guia (gRNA), formando assim um sistema CRISPR- Cas.
[0100] O “gRNA” refere-se a um RNA capaz de alvejar especificamente um complexo CRISPR, isto é, um complexo enzimático gRNA-CRISPR, com respeito a um gene ou ácido nucleico alvo. O gRNA é um RNA específico para uma sequência alvo, que pode se ligar à enzima CRISPR e guiar a enzima CRISPR para o gene ou o ácido nucleico alvo. Aqui, a “sequência alvo” é uma sequência nucleotídica presente em um gene ou ácido nucleico alvo, e especificamente, uma sequência nucleotídica parcial de uma região alvo no gene ou o ácido nucleico alvo. A “região alvo” usada aqui é um sítio que pode ser modificado por uma proteína editora de ácido nucleico guia no gene ou no ácido nucleico alvo.
[0101] O gRNA pode incluir múltiplos domínios.
Devido a cada domínio, interações podem ocorrer em uma fita ou entre fitas de uma estrutura tridimensional ou uma forma ativa do gRNA.
[0102] O gRNA pode ser chamado de gRNA de fita simples (molécula de RNA simples; gRNA simples; sgRNA); ou gRNA de fita dupla (incluindo mais de uma, geralmente duas moléculas de RNA distintas).
[0103] Em uma modalidade exemplificativa, o gRNA de fita simples pode incluir um domínio guia, isto é, um domínio incluindo uma sequência guia capaz de formar uma ligação complementar com um gene ou ácido nucleico alvo; um primeiro domínio complementar; um domínio conector; um segundo domínio complementar que tem uma sequência complementar à primeira sequência de domínio complementar e pode formar com a primeira sequência de domínio complementar; um domínio proximal; e, opcionalmente, um domínio de cauda na direção de 5’ para 3’.
[0104] Em uma outra modalidade, o gRNA de fita dupla pode incluir uma primeira fita que inclui um domínio guia, isto é, um domínio incluindo uma sequência guia capaz de formar uma ligação complementar com um gene ou ácido nucleico alvo, e um primeiro domínio complementar; e uma segunda fita que inclui um segundo domínio complementar, que tem uma sequência complementar à primeira sequência de domínio complementar e pode formar com a primeira sequência de domínio complementar, um domínio proximal e, opcionalmente, um domínio de cauda na direção de 5’ para 3’.
[0105] Aqui, a primeira fita pode ser referida como crRNA, e a segunda fita pode ser referida como tracrRNA. A crRNA pode incluir um domínio guia e um primeiro domínio complementar, e a tracrRNA pode incluir um segundo domínio complementar, um domínio proximal e, opcionalmente, um domínio de cauda.
[0106] Em ainda uma outra modalidade, o gRNA de fita simples pode incluir um domínio guia, isto é, um domínio incluindo uma sequência guia capaz de formar uma ligação complementar com um gene ou ácido nucleico alvo; um primeiro domínio complementar; e um segundo domínio complementar, que tem uma sequência complementar à primeira sequência de domínio complementar e pode formar com a primeira sequência de domínio complementar, na direção de 5’ para 3’.
[0107] A enzima CRISPR é um ácido nucleico ou polipeptídeo (ou uma proteína) tendo uma sequência que codifica a enzima CRISPR e, representativamente, uma enzima CRISPR Tipo II ou enzima CRISPR Tipo V é amplamente usada.
[0108] A enzima CRISPR pode ser uma enzima CRISPR Tipo II.
[0109] A enzima CRISPR Tipo II pode ser uma Cas9.
[0110] Aqui, a Cas9 pode ser derivada de vários micro-organismos tais como Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus, Streptococcus sp., Staphylococcus aureus, Nocardiopsis dassonvillei, Streptomyces pristinaespiralis, Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces viridochromogenes, Streptosporangium roseum, Streptosporangium roseum, AlicyclobacHlus acidocaldarius, Bacillus pseudomycoides, Bacillus selenitireducens, Exiguobacterium sibiricum, Lactobacilo delbrueckii, Lactobacilo salivarius,
Microscilla marina, Burkholderiales bacterium, Polaromonas naftalenivorans, Polaromonas sp., Crocosphaera watsonii, Cyanothece sp., Microcystis aeruginosa, Synechococcus sp., Acetohalobium arabaticum, Ammonifex degensii, Caldicelulosiruptor bescii, Candidatus Desulforudis, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Finegoldia magna, Natranaerobius thermophilus, Pelotomaculum thermopropionicum, Acidithiobacillus caldus, Acidithiobacillus ferrooxidans, Allochromatium vinosum, Marinobacter sp., Nitrosococcus halophilus, Nitrosococcus watsoni, Pseudoalteromonas haloplanktis, Ktedonobacter racemifer, Methanohalobium evestigatum, Anabaena variabilis, Nodularia spumigena, Nostoc sp., Arthrospira maxima, Arthrospira platensis, Arthrospira sp., Lyngbya sp., Microcoleus chthonoplastes, Oscillatoria sp., Petrotoga mobilis, Thermosipho africanus e Acaryochloris marina, etc.
[0111] Aqui, a Cas9 pode ser isolada de um micro- organismo de ocorrência natural ou produzido não naturalmente por um método recombinante ou método sintético.
[0112] A estrutura cristalina da enzima CRISPR Tipo II foi determinada de acordo com estudos em dois ou mais tipos de moléculas de enzima CRISPR Tipo II microbianas naturais (Jinek et al., Science, 343(6176):1247997, 2014) e estudos em Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas9) complexado com gRNA (Nishimasu et al., Cell, 156:935 - 949, 2014; e Anders et al., Nature, 2014,
doi: 10,1038/nature13579).
[0113] A enzima CRISPR Tipo II inclui dois lobos, isto é, lobos de reconhecimento (REC) e nuclease (NUC), e cada lobo inclui vários domínios.
[0114] O lobo de REC inclui um domínio de hélice (BH) em ponte rico em arginina, um domínio REC1 e um domínio REC2.
[0115] Aqui, o domínio BH é uma região em hélice Į longa e rica em arginina, e o domínio REC1 e domínio REC2 desempenham um papel importante no reconhecimento de uma fita dupla formada no gRNA, por exemplo, gRNA de fita simples, gRNA de fita dupla ou tracrRNA.
[0116] O lobo de NUC inclui um domínio de RuvC, um domínio de HNH e um domínio de interação com o PAM (PI).
Aqui, o domínio de RuvC abrange domínios do tipo RuvC, e o domínio de HNH abrange domínios do tipo HNH.
[0117] Aqui, o domínio de RuvC compartilha similaridade estrutural com os membros da família de micro- organismos existente na natureza tendo a enzima CRISPR Tipo II, e cliva uma fita simples, por exemplo, uma fita não complementar de um gene ou ácido nucleico alvo, isto é, uma fita que não forma uma ligação complementar com gRNA. O domínio de RuvC é algumas vezes referido como um domínio de RuvCI, domínio de RuvCII ou domínio de RuvCIII na técnica, e geralmente chamado de RuvC I, RuvCII ou RuvCIII.
[0118] O domínio de HNH compartilha similaridade estrutural com a endonuclease HNH, e cliva uma fita simples, por exemplo, uma fita complementar de uma molécula ácido nucleico alvo, isto é, uma fita que forma uma ligação complementar com gRNA. O domínio de HNH está localizado entre RuvC II motivo e RuvC III motivo.
[0119] O domínio de PI reconhece uma sequência nucleotídica específica em um gene ou ácido nucleico alvo, isto é, um motivo adjacente ao protoespaçador (PAM) ou interage com PAM. Aqui, o PAM pode variar de acordo com a origem da enzima CRISPR Tipo II. Por exemplo, quando a enzima CRISPR é SpCas9, o PAM pode ser 5’-NGG-3’, quando a enzima CRISPR é Streptococcus thermophilus Cas9 (StCas9), o PAM pode ser 5’-NNAGAAW-3’ (W = A ou T), quando a enzima CRISPR é Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9), o PAM pode ser 5’-NNGRR-3’ (R = A ou G), quando a enzima CRISPR é Neisseria meningitides Cas9 (NmCas9), o PAM pode ser 5’- NNNNGATT-3’, e quando a enzima CRISPR é Campylobacter jejuni Cas9 (CjCas9), o PAM pode ser 5’-NNNVRYAC-3’ (V = G, C ou A, R = A ou G, Y = C ou T), onde o N pode ser A, T, G ou C; ou A, U, G ou C. Embora seja geralmente entendido que PAM é determinado de acordo com a origem da enzima acima descrita, de acordo com a progressão de pesquisas em mutantes da enzima derivada das origens acima descritas, o PAM pode variar.
[0120] A enzima CRISPR pode ser uma nuclease ou enzima de restrição que tem uma função de clivar as fitas duplas de um gene ou ácido nucleico alvo.
[0121] A enzima CRISPR pode ser uma enzima CRISPR completamente ativa.
[0122] O “completamente ativa” refere-se a ter a mesma função como a função de uma enzima CRISPR do tipo selvagem, e a enzima CRISPR nesse estado é chamada de enzima CRISPR completamente ativa. Aqui, a “função de uma enzima CRISPR do tipo selvagem” refere-se ao estado de uma enzima CRISPR do tipo selvagem tendo funções de clivar as fitas duplas de DNA, isto é, uma primeira função de clivar a primeira fita das fitas duplas de DNA e uma segunda função de clivar a segunda fita do mesmo.
[0123] A enzima CRISPR completamente ativa pode ser uma enzima CRISPR do tipo selvagem que cliva as fitas duplas de DNA.
[0124] A enzima CRISPR completamente ativa pode ser uma variante da enzima CRISPR formada pela modificação ou manipulação de uma enzima CRISPR do tipo selvagem que cliva as fitas duplas de DNA.
[0125] A variante da enzima CRISPR pode ser uma enzima formada substituindo-se um ou mais aminoácidos por aminoácidos diferentes, ou removendo-se um ou mais aminoácidos na sequência de aminoácidos da enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0126] A variante da enzima CRISPR pode ser uma enzima produzida adicionando-se um ou mais aminoácidos à sequência de aminoácidos da enzima CRISPR do tipo selvagem.
Aqui, a adição de aminoácido pode estar localizada no N- terminal ou C-terminal da enzima do tipo selvagem, ou na sequência de aminoácidos da mesma.
[0127] A variante da enzima CRISPR pode ser uma enzima completamente ativa tendo uma função melhorada em comparação com a enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0128] Por exemplo, uma forma especificamente modificada ou geneticamente modificada da enzima CRISPR do tipo selvagem, isto é, uma variante da enzima CRISPR pode clivar um DNA de fita dupla em um estado que não se liga ao DNA de fita dupla a ser clivado ou mantenha uma distância constante do mesmo. Neste caso, a forma modificada ou geneticamente modificada pode ser uma enzima CRISPR completamente ativa tendo uma atividade funcional melhorada, em comparação com a enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0129] A variante da enzima CRISPR pode ser uma enzima CRISPR completamente ativa tendo uma função reduzida em comparação com a enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0130] Por exemplo, uma forma especificamente modificada ou geneticamente modificada da enzima CRISPR do tipo selvagem, isto é, uma variante da enzima CRISPR pode clivar um DNA de fita dupla em um estado que está próximo a uma certa distância de ou está formando uma ligação específica com o DNA de fita dupla a ser clivado. Aqui, a ligação específica pode ser, por exemplo, uma ligação entre um aminoácido em um sítio específico da variante da enzima CRISPR e uma sequência nucleotídica de DNA em um sítio de clivagem. Neste caso, a forma modificada ou geneticamente modificada pode ser uma enzima CRISPR completamente ativa tendo uma atividade funcional reduzida, em comparação com a enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0131] A enzima CRISPR pode ser uma enzima CRISPR incompleta ou parcialmente ativa.
[0132] O termo “incompleta ou parcialmente ativa” significa um estado tendo uma selecionada das funções da enzima CRISPR do tipo selvagem, isto é, uma primeira função de clivar a primeira fita das fitas duplas de DNA e uma segunda função de clivar a segunda fita das fitas duplas de DNA. A enzima CRISPR nesse estado é referida como uma enzima CRISPR incompleta ou parcialmente ativa. Além disso, a enzima CRISPR incompleta ou parcialmente ativa pode ser referida como uma nickase.
[0133] O termo “nickase” refere-se a uma enzima CRISPR geneticamente modificada ou modificada para clivar apenas uma fita da fita dupla do gene ou do ácido nucleico alvo, e a nickase tem atividade de nuclease de clivar uma fita simples, por exemplo, uma fita que é não complementar ou complementar ao gRNA do gene ou do ácido nucleico alvo.
Portanto, para clivar a fita dupla, atividade de nuclease das duas nickases é necessária.
[0134] A nickase pode ter uma atividade de nuclease causada por um domínio de RuvC da enzima CRISPR.
Isto é, a nickase pode não incluir uma atividade de nuclease causada por um domínio de HNH da enzima CRISPR e, para esse fim, o domínio de HNH pode ser manipulado ou modificado.
[0135] Em um exemplo, quando a enzima CRISPR é uma enzima CRISPR Tipo II, a nickase pode ser uma enzima CRISPR Tipo II incluindo um domínio de HNH modificado.
[0136] Por exemplo, quando a enzima CRISPR Tipo II é SpCas9 do tipo selvagem, a nickase pode ser uma variante da SpCas9 tendo uma atividade inativada de nuclease do domínio de HNH devido a uma mutação de histidina para alanina na posição 840 na sequência de aminoácidos da SpCas9 do tipo selvagem. Visto que a nickase produzida desse modo, isto é, a variante da SpCas9 tem uma atividade de nuclease causada por um domínio de RuvC, uma fita não complementar de um gene ou ácido nucleico alvo, isto é, uma fita que não se liga complementarmente com gRNA pode ser clivada.
[0137] Para um outro exemplo, quando a enzima CRISPR Tipo II é CjCas9 do tipo selvagem, a nickase pode ser uma variante de CjCas9 tendo uma atividade inativada de nuclease de um domínio de HNH devido a uma mutação de histidina para alanina na posição 559 na sequência de aminoácidos de CjCas9 do tipo selvagem. Visto que a nickase produzida desse modo, isto é, a variante de CjCas9 tem uma atividade de nuclease causada por um domínio de RuvC, uma fita não complementar de um gene ou ácido nucleico alvo, isto é, uma fita que não se liga complementarmente com gRNA pode ser clivada.
[0138] Além disso, a nickase pode ter uma atividade de nuclease causada pelo domínio de HNH da enzima CRISPR. Isto é, a nickase pode não incluir uma atividade de nuclease causada pelo domínio de RuvC da enzima CRISPR e, para esse fim, o domínio de RuvC pode ser manipulado ou modificado.
[0139] Em um exemplo, quando a enzima CRISPR é uma enzima CRISPR Tipo II, a nickase pode ser uma enzima CRISPR Tipo II incluindo o domínio de RuvC modificado.
[0140] Por exemplo, quando a enzima CRISPR Tipo II é SpCas9 do tipo selvagem, a nickase pode ser uma variante da SpCas9 tendo uma atividade inativada de nuclease do domínio de RuvC devido a uma mutação de ácido aspártico para alanina na posição 10 na sequência de aminoácidos da SpCas9 do tipo selvagem. Visto que a nickase produzida desse modo, isto é, a variante da SpCas9 tem uma atividade de nuclease causada por um domínio de HNH, uma fita complementar de um gene ou ácido nucleico alvo, isto é, uma fita que se liga complementarmente ao gRNA pode ser clivada.
[0141] Para um outro exemplo, quando a enzima CRISPR Tipo II é CjCas9 do tipo selvagem, a nickase pode ser uma variante de CjCas9 tendo uma atividade inativada de nuclease do domínio de RuvC devido a uma mutação de ácido aspártico para alanina na posição 8 na sequência de aminoácidos de CjCas9 do tipo selvagem. Visto que a nickase produzida desse modo, isto é, a variante de CjCas9, tem uma atividade de nuclease causada por um domínio de HNH, uma fita complementar de um gene ou ácido nucleico alvo, isto é, uma fita que se liga complementarmente ao gRNA pode ser clivada.
[0142] A enzima CRISPR pode ser uma enzima CRISPR inativa.
[0143] O termo “inativa” pode significar um estado de perda de funções da enzima CRISPR do tipo selvagem, isto é, de uma primeira função de clivar a primeira fita do DNA de fita dupla e uma segunda função de clivar a segunda fita do DNA de fita dupla. A enzima CRISPR nesse estado é referida como uma enzima CRISPR inativa.
[0144] A enzima CRISPR inativa pode ter inatividade de nuclease devido a uma mutação em um domínio tendo uma atividade de nuclease da enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0145] A enzima CRISPR inativa pode ter inatividade de nuclease devido a mutações no domínio de RuvC e o domínio de HNH. Isto é, a enzima CRISPR inativa pode não incluir uma atividade de nuclease causada pelo domínio de RuvC e o domínio de HNH da enzima CRISPR e, para esse fim, o domínio de RuvC e o domínio de HNH podem ser manipulados ou modificados.
[0146] Em um exemplo, quando a enzima CRISPR é uma enzima CRISPR Tipo II, a enzima CRISPR inativa pode ser uma enzima CRISPR Tipo II incluindo o domínio de RuvC modificado e o domínio de HNH modificado.
[0147] Por exemplo, quando a enzima CRISPR Tipo II é uma SpCas9 do tipo selvagem, a enzima CRISPR inativa pode ser uma variante da SpCas9 tendo uma atividade inativada de nuclease do domínio de RuvC e do domínio de HNH por mutações de alanina de ácido aspártico na posição 10 e histidina na posição 840 na sequência de aminoácidos da SpCas9 do tipo selvagem. Visto que a enzima CRISPR inativa produzida desse modo, isto é, a variante da SpCas9 tem uma atividade inativada de nuclease do domínio de RuvC e do domínio de HNH, nenhuma das fitas duplas do gene ou do ácido nucleico alvo podem ser clivadas.
[0148] Para um outro exemplo, quando a enzima CRISPR Tipo II é CjCas9 do tipo selvagem, a enzima CRISPR inativa pode ser uma variante de CjCas9 tendo uma atividade inativada de nuclease do domínio de RuvC e do domínio de HNH por mutações de alanina de ácido aspártico na posição 8 e histidina na posição 559 na sequência de aminoácidos de CjCas9 do tipo selvagem. Visto que a enzima CRISPR inativa produzida desse modo, isto é, a variante de CjCas9 tem uma atividade inativada de nuclease do domínio de RuvC e do domínio de HNH, nenhuma das fitas duplas do gene ou do ácido nucleico alvo podem ser clivadas.
[0149] A enzima CRISPR pode ter uma atividade de helicase, isto é, uma função de desenrolar a estrutura helicoidal de um ácido nucleico de fita dupla, além da atividade de nuclease acima descrita.
[0150] Além disso, a enzima CRISPR pode ser modificada para ter uma atividade de helicase completamente ativa, incompleta ou parcialmente ativa ou inativa.
[0151] De acordo com uma modalidade exemplificativa da divulgação do relatório descritivo, a enzima CRISPR pode ser uma enzima CRISPR artificialmente manipulada.
[0152] O termo “artificialmente modificada (artificialmente modificada ou manipulada)” significa um estado formado por modificação artificial, não um estado de ocorrência natural. Aqui, a modificação artificial pode ocorrer em um ácido nucleico que codifica a enzima CRISPR, e/ou proteína da mesma. Além disso, a modificação artificial inclui todas as modificações que são manipulações artificiais possíveis que ocorrem em um processo de produção de uma proteína a partir de um ácido nucleico que codifica a enzima CRISPR, isto é, todo o processo incluindo transcrição, modificação pós- transcricional, tradução e modificação pós-traducional. Em seguida, uma enzima CRISPR não natural, artificialmente modificada ou modificada pode ser usada permutavelmente com uma enzima CRISPR artificial ou variante da enzima CRISPR (enzima CRISPR mutante).
[0153] A enzima CRISPR artificialmente manipulada pode ser uma variante da enzima CRISPR tendo funções modificadas da enzima CRISPR do tipo selvagem, isto é, uma primeira função de clivar uma primeira fita do DNA de fita dupla e/ou uma segunda função de clivar uma segunda fita do DNA de fita dupla.
[0154] Por exemplo, a variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma em que a primeira função das funções da enzima CRISPR do tipo selvagem é perdida.
[0155] Alternativamente, a variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma em que a primeira função das funções da enzima CRISPR do tipo selvagem é melhorada.
[0156] Por exemplo, a variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma em que a segunda função das funções da enzima CRISPR do tipo selvagem é perdida.
[0157] Alternativamente, a variante da enzima
CRISPR pode estar em uma forma em que a segunda função das funções da enzima CRISPR do tipo selvagem é melhorada.
[0158] Por exemplo, a variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma em que todas as funções, isto é, a primeira e a segunda funções, da enzima CRISPR do tipo selvagem são perdidas.
[0159] Alternativamente, a variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma em que todas as funções, isto é, a primeira e a segunda funções, da enzima CRISPR do tipo selvagem são melhoradas.
[0160] Alternativamente, a variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma em que, dentre as funções da enzima CRISPR do tipo selvagem, a primeira função é perdida e a segunda função é melhorada.
[0161] Alternativamente, a variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma em que, dentre as funções da enzima CRISPR do tipo selvagem, a primeira função é melhorada e a segunda função é perdida.
[0162] A enzima CRISPR artificialmente manipulada pode formar um complexo enzimático gRNA-CRISPR por uma interação com gRNA.
[0163] Aqui, a enzima CRISPR artificialmente manipulada pode ser uma variante da enzima CRISPR modificada em função da interação com o gRNA da enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0164] Por exemplo, a variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma com interação reduzida com gRNA, em comparação com a enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0165] Alternativamente, a variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma com interação aumentada com gRNA, em comparação com a enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0166] Por exemplo, a variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma com interação reduzida com gRNA enquanto tem uma primeira função da enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0167] Alternativamente, a variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma com interação aumentada com gRNA enquanto tem uma primeira função da enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0168] Por exemplo, a variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma com interação reduzida com gRNA enquanto tem uma segunda função da enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0169] Alternativamente, a variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma com interação aumentada com gRNA enquanto tem uma segunda função da enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0170] Por exemplo, a variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma com interação reduzida com gRNA enquanto não tem uma primeira função e uma segunda função da enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0171] Alternativamente, a variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma com interação aumentada com gRNA enquanto não tem uma primeira função e uma segunda função da enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0172] Aqui, vários complexos enzimáticos gRNA-
CRISPRs podem ser formados de acordo com a força de interação entre o gRNA e uma variante da enzima CRISPR, e têm uma diferença em função de acessar ou clivar uma sequência alvo de acordo com a variante da enzima CRISPR.
[0173] Por exemplo, somente quando o complexo enzimático gRNA-CRISPR formado pela variante da enzima CRISPR tendo uma interação reduzida com gRNA se torna muito próximo ou localizado a uma sequência alvo de ligação complementar completa ao gRNA, as fitas duplas ou simples da sequência alvo podem ser clivadas.
[0174] A enzima CRISPR artificialmente manipulada aqui divulgada pode ser uma variante da enzima CRISPR formada pela modificação de pelo menos um aminoácido da sequência de aminoácidos da enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0175] A variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma em que pelo menos um aminoácido é removido da sequência de aminoácidos da enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0176] Em um exemplo, a variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma em que um ou mais aminoácidos são removidos dos aminoácidos carregados positivamente da enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0177] Em um outro exemplo, a variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma em que um ou mais aminoácidos são removidos dos aminoácidos carregados negativamente da enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0178] Em ainda um outro exemplo, a variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma em que um ou mais aminoácidos são removidos dos aminoácidos não carregados
(ou aminoácidos não carregados) da enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0179] Ainda em um outro exemplo, a variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma em que um ou mais aminoácidos são removidos dos aminoácidos positivamente carregados, dos aminoácidos negativamente carregados dos e aminoácidos não carregados da enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0180] A variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma em que pelo menos um aminoácido selecionado da sequência de aminoácidos da enzima CRISPR do tipo selvagem é substituído por um aminoácido diferente.
[0181] Aqui, o aminoácido diferente, isto é, o aminoácido substituído pode ser um aminoácido selecionado de alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina.
[0182] Aqui, a alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina podem ser usados como propriamente ditos ou como formas quimicamente modificadas dos mesmos incluindo metilação, acetilação e fosforilação.
[0183] Em um exemplo, a variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma em que um ou mais aminoácidos selecionados dos aminoácidos positivamente carregados da enzima CRISPR do tipo selvagem são substituídos por um aminoácido diferente. Aqui, o aminoácido diferente pode ser um ou mais aminoácidos selecionados de estereoisômeros de um ou mais aminoácidos selecionados, outros aminoácidos positivamente carregados, aminoácidos negativamente carregados e aminoácidos não carregados.
[0184] Em um outro exemplo, a variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma em que um ou mais aminoácidos dos aminoácidos negativamente carregados da enzima CRISPR do tipo selvagem são substituídos por um aminoácido diferente. Aqui, o aminoácido diferente pode ser um ou mais aminoácidos selecionados de estereoisômeros de um ou mais aminoácidos selecionados, aminoácidos positivamente carregados, outros aminoácidos negativamente carregados e aminoácidos não carregados.
[0185] Em ainda um outro exemplo, a variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma em que um ou mais aminoácidos dos aminoácidos não carregados da enzima CRISPR do tipo selvagem são substituídos por um aminoácido diferente. Aqui, o aminoácido diferente pode ser um ou mais aminoácidos selecionados de estereoisômeros de um ou mais aminoácidos selecionados, outros aminoácidos não carregados, aminoácidos positivamente carregados e aminoácidos negativamente carregados.
[0186] Ainda em um outro exemplo, a variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma em que um ou mais aminoácidos dos aminoácidos positivamente carregados, negativamente carregados e não carregados da enzima CRISPR do tipo selvagem são substituídos por um aminoácido diferente. Aqui, o aminoácido diferente pode ser um ou mais aminoácidos selecionados de estereoisômeros de um ou mais aminoácidos selecionados, aminoácidos positivamente carregados, aminoácidos negativamente carregados e aminoácidos não carregados.
[0187] A variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma em que pelo menos um aminoácido é substituído ou removido da sequência de aminoácidos da enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0188] A enzima CRISPR artificialmente manipulada aqui divulgado pode ser uma variante da enzima CRISPR formada pela adição de pelo menos um aminoácido à sequência de aminoácidos da enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0189] A variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma em que pelo menos um aminoácido é adicionado, em comparação com a sequência de aminoácidos da enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0190] Alternativamente, a variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma em que pelo menos um domínio funcional é adicionado à sequência de aminoácidos da enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0191] Aqui, o domínio funcional pode consistir de um ou mais aminoácidos, e pode ser um peptídeo ou polipeptídeo.
[0192] Aqui, o domínio funcional pode ser um domínio tendo uma função adicional, além das funções originais da enzima CRISPR do tipo selvagem, tais como a primeira função de clivar a primeira fita do DNA de fita dupla e a segunda função de clivar a segunda fita do mesmo.
[0193] Alternativamente, o domínio funcional pode ser um domínio tendo uma função semelhante às funções originais da enzima CRISPR do tipo selvagem, tais como a primeira função de clivar a primeira fita do DNA de fita dupla e a segunda função de clivar a segunda fita do mesmo.
[0194] Em um exemplo, o domínio funcional pode ser um domínio tendo atividade de metilase, atividade de desmetilase, atividade de ativação de transcrição, atividade de repressão de transcrição, atividade de fator de liberação de transcrição, atividade de modificação de histona, atividade de clivagem de RNA ou atividade de ligação de ácido nucleico.
[0195] Em um outro exemplo, o domínio funcional pode ser um marcador ou gene repórter para isolamento e purificação de uma proteína (incluindo um peptídeo). Aqui, o marcador inclui um marcador de histidina (His), um marcador V5, um marcador FLAG, um marcador hemaglutinina influenza (HA), um marcador Myc, um marcador VSV-G e um marcador de tioredoxina (Trx), etc., e o gene repórter inclui glutationa-S-transferase (GST), peroxidase de raiz forte (HRP), cloranfenicol acetiltransferase (CAT), ȕ- galactosidase, ȕ-glucoronidase, luciferase, proteínas autofluorescente incluindo a proteína verde fluorescente (GFP), HcRed, DsRed, proteína ciano fluorescente (CFP), proteína amarelo fluorescente (YFP) e proteína azul fluorescente (BFP), mas a presente invenção não está limitada a estas.
[0196] Em ainda um outro exemplo, o domínio funcional pode ser uma desaminase.
[0197] Por exemplo, uma enzima CRISPR incompleta ou parcial pode adicionalmente incluir uma citidina desaminase como um domínio funcional. Alternativamente, uma enzima CRISPR incompleta ou parcial pode adicionalmente incluir uma adenina desaminase como um domínio funcional.
[0198] Ainda em um outro exemplo, o domínio funcional pode ser uma sequência ou sinal de localização nuclear (NLS) ou uma sequência ou sinal de exportação nuclear (NES).
[0199] Por exemplo, a enzima CRISPR pode incluir uma ou mais NLSs. Aqui, uma ou mais NLSs podem ser incluídas em um N-terminal da enzima CRISPR ou na proximidade do mesmo; um C-terminal da enzima CRISPR ou na proximidade do mesmo; ou uma combinação dos mesmos. A NLS pode ser uma sequência NLS derivada das seguintes NLSs, mas a presente invenção não está limitada a estas: NLS de um antígeno T grande do vírus SV40 tendo a sequência de aminoácidos PKKKRKV (SEQ ID NO: 12); NLS de nucleoplasmina (e.g., NLS bipartida de nucleoplasmina tendo a sequência KRPAATKKAGQAKKKK (SEQ ID NO: 13)); NLS de c-myc tendo a sequência de aminoácidos PAAKRVKLD (SEQ ID NO: 14) ou RQRRNELKRSP (SEQ ID NO: 15); NLS de hRNPA1 M9 tendo a sequência NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY (SEQ ID NO: 16); a sequência RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV (SEQ ID NO: 17)
do domínio IBB da importina-Į; as sequências VSRKRPRP (SEQ ID NO: 18) e PPKKARED (SEQ ID NO: 19) de uma proteína T de mioma; a sequência PQPKKKPL (SEQ ID NO: 20) de p53 humana; a sequência SALIKKKKKMAP (SEQ ID NO: 21) de c-abl IV de camundongo; as sequências DRLRR (SEQ ID NO: 22) e PKQKKRK (SEQ ID NO: 23) NS1 do vírus influenza; a sequência RKLKKKIKKL (SEQ ID NO: 24) de um antígeno do vírus da hepatite delta; a sequência REKKKFLKRR (SEQ ID NO: 25) de uma proteína Mx1 de camundongo; a sequência KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK (SEQ ID NO: 26) de uma polimerase poli(ADP-ribose) humana; ou a sequência RKCLQAGMNLEARKTKK (SEQ ID NO: 27) de um glucocorticoide receptor (humano)do hormônio esteroide.
[0200] A enzima CRISPR artificialmente manipulada pode ser uma variante da enzima CRISPR formada pela modificação de pelo menos um aminoácido na sequência de aminoácidos de uma região específica da enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0201] A enzima CRISPR artificialmente manipulada pode ser uma variante da enzima CRISPR formada pela adição de um ou mais aminoácidos a uma região específica da enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0202] Aqui, a região específica da enzima CRISPR do tipo selvagem pode ser uma ou mais regiões selecionadas de uma primeira região, uma segunda região, uma terceira região e uma quarta região.
[0203] A primeira região pode ser uma parte da enzima CRISPR do tipo selvagem interagindo com um gRNA.
[0204] A primeira região pode ser uma parte da enzima CRISPR do tipo selvagem interagindo com uma sequência alvo.
[0205] A primeira região pode ser uma parte da enzima CRISPR do tipo selvagem interagindo com um heteroduplex da sequência alvo de gRNA.
[0206] A primeira região pode ser uma parte da enzima CRISPR do tipo selvagem interagindo com uma extremidade distal do PAM do heteroduplex da sequência alvo de gRNA.
[0207] Aqui, a extremidade distal do PAM do heteroduplex da sequência alvo de gRNA pode significar 6 a 10 pares de base na extremidade do heteroduplex da sequência alvo de gRNA distante da localização do PAM, que é uma sequência de 6 a 10 bases do gRNA e uma sequência de 6 a 10 bases da sequência alvo que se liga complementarmente a ela.
[0208] A primeira região pode ser uma região localizada em um lobo de REC da enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0209] A primeira região pode ser toda ou uma parte de um domínio de REC da enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0210] A segunda região pode ser uma parte da enzima CRISPR do tipo selvagem tendo a primeira função ou a segunda função da enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0211] A segunda região pode ser uma região localizada em um lobo de NUC da enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0212] A segunda região pode ser toda ou uma parte de um domínio de RuvC do tipo selvagem da enzima CRISPR.
[0213] A segunda região pode ser uma parte de um domínio de RuvC incluindo uma região de clivagem de ácido nucleico dependente de metal do domínio de RuvC do tipo selvagem da enzima CRISPR.
[0214] Aqui, a região de clivagem de ácido nucleico dependente de metal do domínio de RuvC pode significar uma região capaz de clivar a ligação entre ácidos nucleicos em uma localização alvo interagindo-se com o metal no domínio de RuvC.
[0215] A região de clivagem de ácido nucleico dependente de metal pode consistir em uma parte interagindo com um metal e uma parte capaz de clivar a ligação entre ácidos nucleicos em uma localização alvo.
[0216] A terceira região pode ser uma parte da enzima CRISPR do tipo selvagem tendo a primeira função ou a segunda função da enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0217] A terceira região pode ser uma região localizada em um lobo de NUC da enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0218] A terceira região pode ser toda ou uma parte de um domínio de HNH da enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0219] A terceira região pode ser uma parte de um domínio de HNH incluindo uma região de clivagem de ácido nucleico dependente de metal do domínio de HNH da enzima
CRISPR do tipo selvagem.
[0220] Aqui, a região de clivagem de ácido nucleico dependente de metal do domínio de HNH pode significar uma região capaz de clivar a ligação entre ácidos nucleicos em uma localização alvo interagindo com um metal no domínio de HNH.
[0221] A quarta região pode ser uma parte da enzima CRISPR do tipo selvagem que pode reconhecer uma sequência nucleotídica específica, isto é, um motivo adjacente ao Protoespaçador (PAM), em um gene ou ácido nucleico alvo.
[0222] A quarta região pode ser uma parte da enzima CRISPR do tipo selvagem, que interage com uma sequência nucleotídica específica, isto é, PAM, em um gene ou ácido nucleico alvo.
[0223] A quarta região pode ser uma parte da enzima CRISPR do tipo selvagem, que interage com uma parte da sequência nucleotídica do gRNA.
[0224] A quarta região pode ser uma região localizada em um lobo de NUC da enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0225] A quarta região pode ser todo ou uma parte de um domínio de PI da enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0226] A enzima CRISPR artificialmente manipulada pode ser uma variante da enzima CRISPR formada pela modificação de pelo menos um aminoácido na sequência de aminoácidos de uma ou mais regiões selecionadas da primeira região, da segunda região, da terceira região e da quarta região da enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0227] A variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma em que pelo menos um aminoácido na sequência de aminoácidos da primeira região da enzima CRISPR do tipo selvagem é modificado.
[0228] A variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma em que pelo menos um aminoácido na sequência de aminoácidos da segunda região da enzima CRISPR do tipo selvagem é modificado.
[0229] A variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma em que pelo menos um aminoácido na sequência de aminoácidos da terceira região da enzima CRISPR do tipo selvagem é modificado.
[0230] A variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma em que pelo menos um aminoácido na sequência de aminoácidos da quarta região da enzima CRISPR do tipo selvagem é modificado.
[0231] A variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma em que pelo menos dois aminoácidos nas sequências de aminoácidos da primeira região e da segunda região da enzima CRISPR do tipo selvagem são modificados. Aqui, dois ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0232] A variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma em que pelo menos dois aminoácidos nas sequências de aminoácidos da primeira região e da terceira região da enzima CRISPR do tipo selvagem são modificados. Aqui, dois ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0233] A variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma em que pelo menos dois aminoácidos nas sequências de aminoácidos da primeira região e da quarta região da enzima CRISPR do tipo selvagem são modificados. Aqui, dois ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente
[0234] A variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma em que pelo menos dois aminoácidos nas sequências de aminoácidos da segunda região e da terceira região da enzima CRISPR do tipo selvagem são modificados. Aqui, dois ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0235] A variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma em que pelo menos dois aminoácidos nas sequências de aminoácidos da segunda região e da quarta região da enzima CRISPR do tipo selvagem. Aqui, os dois ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0236] A variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma em que pelo menos dois aminoácidos nas sequências de aminoácidos da terceira região e da quarta região da enzima CRISPR do tipo selvagem são modificados. Aqui, os dois ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0237] A variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma em que pelo menos três aminoácidos nas sequências de aminoácidos da primeira região, da segunda região e da terceira região da enzima CRISPR do tipo selvagem são modificados. Aqui, os três ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0238] A variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma em que pelo menos três aminoácidos nas sequências de aminoácidos da primeira região, da segunda região e da quarta região da enzima CRISPR do tipo selvagem são modificados. Aqui, os três ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0239] A variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma em que pelo menos três aminoácidos nas sequências de aminoácidos da primeira região, da terceira região e da quarta região da enzima CRISPR do tipo selvagem são modificados. Aqui, os três ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0240] A variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma em que pelo menos três aminoácidos nas sequências de aminoácidos da segunda região, da terceira região e da quarta região da enzima CRISPR do tipo selvagem são modificados. Aqui, os três ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0241] A variante da enzima CRISPR pode estar em uma forma em que pelo menos quatro aminoácidos nas sequências de aminoácidos da primeira região, da segunda região, da terceira região e da quarta região da enzima CRISPR do tipo selvagem são modificados. Aqui, os quatro ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0242] A variante da enzima CRISPR pode incluir a modificação de pelo menos um aminoácido selecionado de uma ou mais regiões.
[0243] Aqui, a modificação pode ser uma deleção de um ou mais aminoácidos selecionados.
[0244] Aqui, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados por aminoácidos diferentes.
[0245] Em um exemplo, o aminoácido diferente pode ser um estereoisômero do aminoácido selecionado.
[0246] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de L-glutamina localizada na primeira região da enzima CRISPR do tipo selvagem, com D-glutamina.
[0247] Em um outro exemplo, o aminoácido diferente pode ser um aminoácido tendo um índice de hidropatia menor que do aminoácido selecionado.
[0248] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de fenilalanina (índice de hidropatia: 2,8) localizada na segunda região da enzima CRISPR do tipo selvagem, por glicina tendo um índice de hidropatia menor (-0,4).
[0249] Em ainda um outro exemplo, o aminoácido diferente pode ser um aminoácido tendo um índice de hidropatia maior que do aminoácido selecionado.
[0250] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de serina (índice de hidropatia: -0,8) localizada na primeira região da enzima CRISPR do tipo selvagem, por leucina tendo um índice de hidropatia maior
(3,8).
[0251] Em um exemplo, o aminoácido diferente pode ser um aminoácido tendo um grupo funcional menor que do aminoácido selecionado.
[0252] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de valina localizada na terceira região da enzima CRISPR do tipo selvagem, por alanina tendo um grupo funcional menor que da valina.
[0253] Em um outro exemplo, o aminoácido diferente pode ser um aminoácido tendo um grupo funcional maior que do aminoácido selecionado.
[0254] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de glicina localizada na segunda região da enzima CRISPR do tipo selvagem, por histidina tendo um grupo funcional maior que da glicina.
[0255] Em um exemplo, o aminoácido diferente pode ser um aminoácido tendo hidrofobicidade maior que do aminoácido selecionado.
[0256] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de asparagina (hidrofobicidade de Kyte- Doolittle: -3,5) localizada na primeira região da enzima CRISPR do tipo selvagem, por treonina (hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: -0,7).
[0257] Em um outro exemplo, o aminoácido diferente pode ser um aminoácido tendo hidrofobicidade menor que do aminoácido selecionado.
[0258] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de cisteína (hidrofobicidade de Kyte-
Doolittle: 2,5) localizada na quarta região da enzima CRISPR do tipo selvagem, por prolina (hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: -1,6).
[0259] Em um exemplo, o aminoácido diferente pode ser um aminoácido maior que o aminoácido selecionado.
[0260] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de lisina (peso molecular (p.m.): 146,189) localizada na terceira região da enzima CRISPR do tipo selvagem, por triptofano (p.m.: 204,228).
[0261] Em um outro exemplo, o aminoácido diferente pode ser um aminoácido menor que o aminoácido selecionado.
[0262] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de fenilalanina (p.m.: 165,192) localizada na segunda região da enzima CRISPR do tipo selvagem, por ácido glutâmico (p.m.: 147,131).
[0263] A modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados pelo mesmo número de outros aminoácidos.
[0264] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de uma alanina localizada na primeira região da enzima CRISPR do tipo selvagem, por uma glicina.
Alternativamente, a modificação pode ser uma substituição de uma arginina localizada na primeira região e uma histidina localizada na quarta região da enzima CRISPR do tipo selvagem, por uma leucina (da primeira região) e uma serina (da quarta região), respectivamente.
Alternativamente, a modificação pode ser uma substituição de uma arginina e uma valina localizada na segunda região e uma leucina localizada na terceira região da enzima CRISPR do tipo selvagem, por, respectivamente, uma fenilalanina, isto é, um total de três fenilalaninas.
[0265] A modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados com um número diferente de outros aminoácidos.
[0266] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de uma leucina localizada na segunda região da enzima CRISPR do tipo selvagem por cisteína-alanina- alanina, isto é, um total de três aminoácidos.
Alternativamente, a modificação pode ser uma substituição de uma histidina localizada na primeira região e dois aminoácidos contíguos, alanina-glutamina, localizadas na terceira região da enzima CRISPR do tipo selvagem, por metionina-valina (da primeira região) e prolina (da terceira região), respectivamente. Alternativamente, a modificação pode ser uma substituição de um ácido glutâmico localizado na primeira região, três aminoácidos contíguos, alanina-leucina-histidina, localizadas na segunda região e dois aminoácidos contíguos, triptofano-serina, localizados na terceira região da enzima CRISPR do tipo selvagem, por alanina (da primeira região), metionina-prolina (da segunda região) e cisteína-alanina-treonina-valina (da terceira região), respectivamente.
[0267] A enzima CRISPR artificialmente manipulada pode ser uma variante da enzima CRISPR formada pela adição de pelo menos um aminoácido em uma ou mais regiões selecionadas da primeira região, da segunda região, da terceira região e da quarta região da enzima CRISPR do tipo selvagem.
[0268] Aqui, a adição pode ser uma adição de um ou mais aminoácidos às posições N-terminal e/ou C-terminal de um ou mais aminoácidos presentes em uma ou mais regiões selecionadas.
[0269] Em um exemplo, a adição pode ser uma adição de um ou mais aminoácidos tendo uma carga positiva nas posições N-terminal e/ou C-terminal de um ou mais aminoácidos presentes em uma ou mais regiões selecionadas.
[0270] Por exemplo, a adição pode ser para adicionar uma arginina ao C-terminal de uma alanina selecionada localizada na primeira região.
Alternativamente, a adição pode ser para adicionar dois aminoácidos, histidina-lisina, ao N-terminal do ácido glutâmico selecionado localizado na terceira região.
[0271] Em um outro exemplo, a adição pode ser uma adição de um ou mais aminoácidos tendo uma carga negativa nas posições N-terminal e/ou C-terminal de um ou mais aminoácidos presentes em uma ou mais regiões selecionadas.
[0272] Por exemplo, a adição pode ser para adicionar um ácido aspártico ao N-terminal de uma treonina selecionada localizada na segunda região. Alternativamente, a adição pode ser para adicionar três aminoácidos, ácido glutâmico-ácido aspártico-ácido glutâmico, ao C-terminal da histidina selecionada localizada na quarta região.
[0273] Em ainda um outro exemplo, a adição pode ser uma adição de um ou mais aminoácidos não tendo nenhuma carga nas posições N-terminal e/ou C-terminal de um ou mais aminoácidos selecionados presentes em uma ou mais regiões.
[0274] Por exemplo, a adição pode ser para adicionar dois aminoácidos, serina-valina, ao C-terminal de uma cisteína selecionada localizada na segunda região.
Alternativamente, a adição pode ser para adicionar cinco aminoácidos, glicina-prolina-glutamina-fenilalanina- leucina, ao N-terminal da lisina selecionada localizada na terceira região.
[0275] Em um outro exemplo, a adição pode ser uma adição de um ou mais aminoácidos selecionados de aminoácidos carregados positivamente, aminoácidos carregados negativamente e aminoácidos não carregados nas posições N-terminal e/ou C-terminal de um ou mais aminoácidos presentes em uma ou mais regiões selecionadas.
[0276] Por exemplo, a adição pode ser para adicionar seis aminoácidos, histidina-arginina-glicina- serina-alanina-ácido glutâmico, ao C-terminal de uma arginina selecionada localizada na primeira região.
Alternativamente, a adição pode ser para adicionar dez aminoácidos, lisina-lisina-alanina-fenilalanina-glutamina- treonina-metionina-cisteína-ácido aspártico-serina, ao N- terminal de uma glicina selecionada localizada na quarta região.
[0277] A adição pode ser uma adição de um ou mais domínios funcionais nas posições N-terminal e/ou C-terminal de um ou mais aminoácidos presentes em uma ou mais regiões selecionadas.
[0278] Aqui, o domínio funcional pode ser um domínio tendo uma função adicional, além das funções originais da enzima CRISPR do tipo selvagem, que são a primeira função de clivar a primeira fita do DNA de fita dupla e a segunda função de clivar a segunda fita do mesmo.
[0279] Alternativamente, o domínio funcional pode ser um domínio tendo uma função semelhante às funções originais da enzima CRISPR do tipo selvagem, tais como a primeira função de clivar a primeira fita do DNA de fita dupla e a segunda função de clivar a segunda fita do mesmo.
[0280] Em um exemplo, o domínio funcional pode ser um domínio tendo atividade de metilase, atividade de desmetilase, atividade de ativação de transcrição, atividade de repressão de transcrição, atividade de fator de liberação de transcrição, atividade de modificação de histona, atividade de clivagem de RNA ou atividade de ligação de ácido nucleico.
[0281] Em um outro exemplo, o domínio funcional pode ser um marcador ou um gene repórter para isolamento e purificação de uma proteína (incluindo um peptídeo). Aqui, o marcador inclui um marcador de histidina (His), um marcador V5, um marcador FLAG, um marcador hemaglutinina influenza (HA), um marcador Myc, um marcador VSV-G e um marcador de tioredoxina (Trx), etc., e o gene repórter inclui glutationa-S-transferase (GST), peroxidase de raiz forte (HRP), cloranfenicol acetiltransferase (CAT), beta- galactosidase, beta-glucuronidase, luciferase e proteínas autofluorescente incluindo uma proteína verde fluorescente
(GFP), HcRed, DsRed, uma proteína ciano fluorescente (CFP), uma proteína amarelo fluorescente (YFP) e uma proteína azul fluorescente (BFP), mas a presente invenção não está limitada a estas.
[0282] Em ainda um outro exemplo, o domínio funcional pode ser uma desaminase. Aqui, a desaminase pode ser uma adenina desaminase e/ou uma citidina desaminase.
[0283] Em um outro exemplo, o domínio funcional pode ser uma sequência ou sinal de localização nuclear (NLS) ou uma sequência ou sinal de exportação nuclear (NES).
[0284] Em uma modalidade exemplificativa da divulgação aqui divulgada, a enzima CRISPR artificialmente manipulada pode ser uma Cas9 artificialmente modificada.
[0285] A Cas9 artificialmente modificada pode ser uma variante de Cas9 formada pela modificação de pelo menos um aminoácido na sequência de aminoácidos de uma região específica da Cas9 do tipo selvagem.
[0286] A Cas9 artificialmente modificada pode ser uma variante de Cas9 formada pela adição de pelo menos um aminoácido em uma região específica da Cas9 do tipo selvagem.
[0287] Aqui, a região específica da Cas9 do tipo selvagem pode ser uma ou mais regiões selecionadas de uma primeira região, uma segunda região, uma terceira região e uma quarta região.
[0288] A primeira região pode ser uma parte da Cas9 do tipo selvagem interagindo com um gRNA.
[0289] A primeira região pode ser uma parte da Cas9 do tipo selvagem interagindo com uma sequência alvo.
[0290] A primeira região pode ser uma parte da Cas9 do tipo selvagem interagindo com um heteroduplex da sequência alvo de gRNA.
[0291] A primeira região pode ser uma parte da Cas9 do tipo selvagem interagindo com uma extremidade distal do PAM do heteroduplex da sequência alvo de gRNA.
[0292] Aqui, a extremidade distal do PAM do heteroduplex da sequência alvo de gRNA pode significar 6 a 10 pares de base na extremidade do heteroduplex da sequência alvo de gRNA distante da localização do PAM, que é uma sequência de 6 a 10 bases do gRNA e uma sequência de 6 a 10 bases de uma sequência alvo que se liga complementarmente a ela.
[0293] A primeira região pode ser uma região localizada em um lobo de REC da Cas9 do tipo selvagem.
[0294] A primeira região pode ser toda ou uma parte de um domínio de REC da Cas9 do tipo selvagem.
[0295] A primeira região pode ser uma região que consiste em 300 aminoácidos no C-terminal do domínio de REC da Cas9 do tipo selvagem.
[0296] A primeira região pode ser uma região que consiste em 220 aminoácidos no N-terminal do domínio de REC da Cas9 do tipo selvagem.
[0297] Em um exemplo, quando a Cas9 do tipo selvagem é SpCas9 do tipo selvagem (SEQ ID NO: 1),
[0298] a primeira região pode ser toda ou uma parte da sequência de aminoácidos de ácido aspártico na 94a posição (D94) a glicina na 717a posição (G717) da SpCas9 do tipo selvagem.
[0299] Em uma modalidade exemplificativa, a primeira região pode ser a sequência de aminoácidos (região 1-1, SEQ ID NO: 2) de fenilalanina na 196a posição (F196) a isoleucina na 282a posição (I282) da SpCas9 do tipo selvagem.
[0300] Em uma outra modalidade exemplificativa, a primeira região pode ser a sequência de aminoácidos (região 1-2, SEQ ID NO: 3) de prolina na 316a posição (P316) a asparagina na 394a posição (N394) da SpCas9 do tipo selvagem.
[0301] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a primeira região pode ser a sequência de aminoácidos (região 1-3, SEQ ID NO: 4) de lisina na 510a posição (K510) a asparagina na 612a posição (N612) da SpCas9 do tipo selvagem.
[0302] Ainda em uma outra modalidade exemplificativa, a primeira região pode ser a sequência de aminoácidos (região 1-4, SEQ ID NO: 5) de treonina na 678a posição (T678) a histidina na 698a posição (H698) da SpCas9 do tipo selvagem.
[0303] Em uma modalidade exemplificativa, a primeira região pode ser duas regiões selecionadas da sequência de aminoácidos de fenilalanina na 196a posição (F196) a isoleucina na 282a posição (I282) da SpCas9 do tipo selvagem (região 1-1), a sequência de aminoácidos de prolina na 316a posição (P316) a asparagina na 394a posição (N394) da SpCas9 do tipo selvagem (região 1-2), a sequência de aminoácidos de lisina na 510a posição (K510) a asparagina na 612a posição (N612) da SpCas9 do tipo selvagem (região 1-3) e a sequência de aminoácidos de treonina na 678a posição (T678) a histidina na 698a posição (H698) da SpCas9 do tipo selvagem (região 1-4).
[0304] Em uma outra modalidade exemplificativa, a primeira região pode ser três regiões selecionadas da sequência de aminoácidos de fenilalanina na 196a posição (F196) a isoleucina na 282a posição (I282) da SpCas9 do tipo selvagem (região 1-1), a sequência de aminoácidos de prolina na 316a posição (P316) a asparagina na 394a posição (N394) da SpCas9 do tipo selvagem (região 1-2), a sequência de aminoácidos de lisina na 510a posição (K510) a asparagina na 612a posição (N612) da SpCas9 do tipo selvagem (região 1-3) e a sequência de aminoácidos de treonina na 678a posição (T678) a histidina na 698a posição (H698) da SpCas9 do tipo selvagem (região 1-4).
[0305] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a primeira região pode ser a sequência de aminoácidos de fenilalanina na 196a posição (F196) a isoleucina na 282a posição (I282) da SpCas9 do tipo selvagem (região 1-1), a sequência de aminoácidos de prolina na 316a posição (P316) a asparagina na 394a posição (N394) da SpCas9 do tipo selvagem (região 1-2), a sequência de aminoácidos de lisina na 510a posição (K510) a asparagina na 612a posição (N612) da SpCas9 do tipo selvagem (região 1-3) e a sequência de aminoácidos de treonina na 678a posição (T678) a histidina na 698a posição (H698) da SpCas9 do tipo selvagem (região 1-4).
[0306] Em um outro exemplo, quando a Cas9 do tipo selvagem é SaCas9 do tipo selvagem,
[0307] a primeira região pode ser toda ou uma parte da sequência de aminoácidos de asparagina na 75a posição (N75) a lisina na 426a posição (K426) da SaCas9 do tipo selvagem.
[0308] Em uma modalidade exemplificativa, a primeira região pode ser a sequência de aminoácidos de treonina na 207a posição (T207) a lisina na 426a posição (K426) da SaCas9 do tipo selvagem.
[0309] A segunda região pode ser uma parte da Cas9 do tipo selvagem tendo a primeira função ou a segunda função da Cas9 do tipo selvagem.
[0310] A segunda região pode ser uma região localizada em um lobo de NUC da Cas9 do tipo selvagem.
[0311] A segunda região pode ser toda ou uma parte de um domínio de RuvC da Cas9 do tipo selvagem.
[0312] A segunda região pode ser uma parte do domínio de RuvC incluindo uma região de clivagem de ácido nucleico dependente de metal da Cas9 do tipo selvagem.
[0313] Aqui, a região de clivagem de ácido nucleico dependente de metal do domínio de RuvC pode significar uma região capaz de clivar a ligação entre ácidos nucleicos em uma localização alvo interagindo com um metal no domínio de RuvC.
[0314] A região de clivagem de ácido nucleico dependente de metal pode consistir em uma parte interagindo com um metal e uma parte de clivar a ligação entre ácidos nucleicos em uma localização alvo.
[0315] Em um exemplo, quando a Cas9 do tipo selvagem é SpCas9 do tipo selvagem,
[0316] a segunda região pode ser toda ou uma parte da sequência de aminoácidos (região de RuvC I) de metionina na 1a posição (M1) a alanina na 59a posição (A59) da SpCas9 do tipo selvagem.
[0317] A segunda região pode ser toda ou uma parte da sequência de aminoácidos (região de RuvC II) de ácido aspártico na 718a posição (D718) a glutamina na 774a posição (Q774) da SpCas9 do tipo selvagem.
[0318] A segunda região pode ser toda ou uma parte da sequência de aminoácidos (região de RuvC III) de serina na 909a posição (S909) a treonina na 1098a posição (T1098) da SpCas9 do tipo selvagem.
[0319] A segunda região pode ser a região de RuvC I, a região de RuvC II e/ou a região de RuvC III da SpCas9 do tipo selvagem.
[0320] Em uma modalidade exemplificativa, a segunda região pode ser a sequência de aminoácidos (região 2-1, SEQ ID NO: 6) de metionina na 1a posição (M1) a treonina na 22a posição (T22) da SpCas9 do tipo selvagem.
[0321] Em uma outra modalidade exemplificativa, a segunda região pode ser a sequência de aminoácidos (região 2-2, SEQ ID NO: 7) de prolina na 731a posição (P731) a treonina na 770a posição (T770) da SpCas9 do tipo selvagem.
[0322] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a segunda região pode ser a sequência de aminoácidos (região 2-3, SEQ ID NO: 8) de glutamina na 926a posição (Q926) a serina na 1040a posição (S1040) da SpCas9 do tipo selvagem.
[0323] Na modalidade exemplificativa, a segunda região pode ser a sequência de aminoácidos de metionina na 1a posição (M1) a treonina na 22a posição (T22) da SpCas9 do tipo selvagem (região 2-1) e a sequência de aminoácidos de prolina na 731a posição (P731) a treonina na 770a posição (T770) da SpCas9 do tipo selvagem (região 2-2).
[0324] Em uma outra modalidade exemplificativa, a segunda região pode ser a sequência de aminoácidos de metionina na 1a posição (M1) a treonina na 22a posição (T22) da SpCas9 do tipo selvagem (região 2-1) e a sequência de aminoácidos de glutamina na 926a posição (Q926) a serina na 1040a posição (S1040) da SpCas9 do tipo selvagem (região 2-3).
[0325] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a segunda região pode ser a sequência de aminoácidos de prolina na 731a posição (P731) a treonina na 770a posição (T770) da SpCas9 do tipo selvagem (região 2-2) e a sequência de aminoácidos de glutamina na 926a posição (Q926) a serina na 1040a posição (S1040) da SpCas9 do tipo selvagem (região 2-3).
[0326] Ainda em uma outra modalidade exemplificativa, a segunda região pode ser a sequência de aminoácidos de metionina na 1a posição (M1) a treonina na 22a posição (T22) da SpCas9 do tipo selvagem (região 2-1), a sequência de aminoácidos de prolina na 731a posição (P731) a treonina na 770a posição (T770) da SpCas9 do tipo selvagem (região 2-2) e a sequência de aminoácidos de glutamina na 926a posição (Q926) a serina na 1040a posição (S1040) da SpCas9 do tipo selvagem (região 2-3).
[0327] Em um outro exemplo, quando a Cas9 do tipo selvagem é uma SaCas9 do tipo selvagem,
[0328] a segunda região pode ser toda ou uma parte da sequência de aminoácidos (região de RuvC I) de metionina na 1a posição (M1) a valina na 41a posição (V41) da SaCas9 do tipo selvagem.
[0329] A segunda região pode ser toda ou uma parte da sequência de aminoácidos (região de RuvC II) de isoleucina na 436a posição (I436) a ácido glutâmico na 481a posição (E481) da SaCas9 do tipo selvagem.
[0330] A segunda região pode ser toda ou uma parte da sequência de aminoácidos (região de RuvC III) de tirosina na 651a posição (Y651) a valina na 775a posição (V775) da SaCas9 do tipo selvagem.
[0331] A segunda região pode ser a região de RuvC I, a região de RuvC II e/ou a região de RuvC III da SaCas9 do tipo selvagem.
[0332] Em uma modalidade exemplificativa, a segunda região pode ser a sequência de aminoácidos (região 2-1) de metionina na 1a posição (M1) a treonina na 25a posição (T25) da SaCas9 do tipo selvagem.
[0333] Em uma outra modalidade exemplificativa, a segunda região pode ser a sequência de aminoácidos (região 2-2) de prolina na 471a posição (P471) a ácido glutâmico na 481a posição (E481) da sequência de aminoácidos da SaCas9 do tipo selvagem.
[0334] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a segunda região pode ser a sequência de aminoácidos (região 2-3) de asparagina na 667a posição (N667) a serina na 740a posição (S740) da SaCas9 do tipo selvagem.
[0335] A terceira região pode ser uma parte da Cas9 do tipo selvagem tendo a primeira função ou a segunda função da mesma.
[0336] A terceira região pode ser uma região localizada em um lobo de NUC da Cas9 do tipo selvagem.
[0337] A terceira região pode ser toda ou uma parte de um domínio de HNH da Cas9 do tipo selvagem.
[0338] A terceira região pode ser toda ou uma parte de um domínio de HNH incluindo uma região de clivagem de ácido nucleico dependente de metal da Cas9 do tipo selvagem.
[0339] Aqui, a região de clivagem de ácido nucleico dependente de metal do domínio de HNH pode significar uma região que pode clivar ácidos nucleicos em uma localização alvo interagindo com um metal no domínio de HNH.
[0340] Em um exemplo, quando a Cas9 do tipo selvagem é uma SpCas9 do tipo selvagem,
[0341] a terceira região pode ser toda ou uma parte da sequência de aminoácidos de lisina na 775a posição (K775) a leucina na 908a posição (L908) da SpCas9 do tipo selvagem.
[0342] Em uma modalidade exemplificativa, a terceira região pode ser a sequência de aminoácidos (região 3-1, SEQ ID NO: 9) de lisina na 775a posição (K775) a leucina na 900a posição (L900) da SpCas9 do tipo selvagem.
[0343] Em um outro exemplo, quando a Cas9 do tipo selvagem é uma SaCas9 do tipo selvagem,
[0344] a terceira região pode ser toda ou uma parte da sequência de aminoácidos de isoleucina na 521a posição (I521) a ácido glutâmico na 629a posição (E629) da SaCas9 do tipo selvagem.
[0345] Em uma modalidade exemplificativa, a terceira região pode ser a sequência de aminoácidos (região 3-1) de lisina na 523a posição (K523) a leucina na 627a posição (L627) da SaCas9 do tipo selvagem.
[0346] A quarta região pode ser uma parte da Cas9 do tipo selvagem que pode reconhecer uma sequência nucleotídica específica, isto é, PAM, em um gene ou ácido nucleico alvo.
[0347] A quarta região pode ser uma parte da Cas9 do tipo selvagem interagindo com uma sequência nucleotídica específica, isto é, PAM, em um gene ou ácido nucleico alvo.
[0348] A quarta região pode ser uma parte da Cas9 do tipo selvagem interagindo com uma parte da sequência nucleotídica do gRNA.
[0349] A quarta região pode ser uma região localizada em um lobo de NUC da Cas9 do tipo selvagem.
[0350] A quarta região pode ser todo ou uma parte de um domínio de PI da Cas9 do tipo selvagem.
[0351] Em um exemplo, quando a Cas9 do tipo selvagem é uma SpCas9 do tipo selvagem,
[0352] a quarta região pode ser toda ou uma parte da sequência de aminoácidos de ácido glutâmico na 1099a posição (E1099) a ácido aspártico na 1368a posição (D1368) da SpCas9 do tipo selvagem.
[0353] Em uma modalidade exemplificativa, a quarta região pode ser a sequência de aminoácidos (região 4-1, SEQ ID NO: 10) de ácido glutâmico na 1099a posição (E1099) a valina na 1139a posição (V1139) da SpCas9 do tipo selvagem.
[0354] Em um outro exemplo, quando a Cas9 do tipo selvagem é uma SaCas9 do tipo selvagem,
[0355] a quarta região pode ser toda ou uma parte da sequência de aminoácidos de lisina na 910a posição (K910) a glicina na 1053a posição (G1053) da SaCas9 do tipo selvagem.
[0356] Em uma modalidade exemplificativa, a quarta região pode ser a sequência de aminoácidos (região 4-1) de lisina na 910a posição (K910) a ácido aspártico na 970a posição (D970) da SaCas9 do tipo selvagem.
[0357] A Cas9 artificialmente modificada pode ser uma variante de Cas9 formada pela modificação de pelo menos um aminoácido na sequência de aminoácidos de uma ou mais regiões selecionadas da primeira região, da segunda região,
da terceira região e da quarta região da Cas9 do tipo selvagem.
[0358] A variante de Cas9 pode estar em uma forma em que um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da primeira região da Cas9 do tipo selvagem são modificados.
[0359] Em um exemplo, quando a Cas9 do tipo selvagem é uma SpCas9 do tipo selvagem,
[0360] uma variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da primeira região da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0361] Em uma modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-1 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0362] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com uma modificação de um ou mais aminoácidos selecionados de N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281 e I282 que são aminoácidos tendo um grupo funcional alifático ou com base em amida da região 1-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0363] Em uma outra modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-2 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0364] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com uma modificação de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391 e L393 que são aminoácidos não polares da região 1-2 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0365] Em uma modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0366] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com uma modificação de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588 e I601 da região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0367] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com uma modificação de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606 e L607 que são aminoácidos não polares da região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0368] Em uma outra modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0369] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com uma modificação de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N692, M694, Q695 e H698 da região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0370] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com uma modificação de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em aminoácidos não polares, isto é, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 e I697 da região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0371] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados das sequências de aminoácidos da região 1-1, da região 1-2, da região 1-3 e da região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados. Aqui, os dois ou mais aminoácidos selecionados podem estar localizados em diferentes regiões, respectivamente. Alternativamente, os dois ou mais aminoácidos selecionados podem estar localizados na mesma região.
[0372] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com uma modificação de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237,
G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 e I697 da região 1-1, da região 1-2, da região 1-3 e da região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0373] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com uma modificação de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 e H698 da região 1-1, da região 1-2, da região 1-3 e da região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0374] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com uma modificação de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 e H698 da região 1-3 e da região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0375] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com uma modificação de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em aminoácidos não polares, isto é, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530,
G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 e I697 da região 1-3 e da região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0376] Em uma outra modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que três ou mais aminoácidos selecionados das sequências de aminoácidos da região 1-1, da região 1-2, da região 1-3 e da região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados. Aqui, os três ou mais aminoácidos selecionados podem estar localizados em diferentes regiões, respectivamente. Alternativamente, os três ou mais aminoácidos selecionados podem estar localizados na mesma região. Alternativamente, os três ou mais aminoácidos selecionados podem estar localizados na mesma ou em diferentes regiões, respectivamente.
[0377] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com uma modificação de três ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513,
L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 e I697 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0378] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com uma modificação de três ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 e H698 da região 1-1, da região 1-2, da região 1-3 e da região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0379] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com uma modificação de três ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em A203, N277, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 e H698 da região 1-1, da região 1-3 e da região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0380] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com uma modificação de três ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 e H698 da região 1-2, da região 1-3 e da região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0381] A variante de Cas9 pode estar em uma forma em que um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da segunda região da Cas9 do tipo selvagem são modificados.
[0382] Em um exemplo, quando a Cas9 do tipo selvagem é uma SpCas9 do tipo selvagem,
[0383] uma variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da segunda região da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0384] Em uma modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 2-1 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0385] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com uma modificação de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11 e G12 da região 2-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0386] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com uma modificação de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em aminoácidos não polares, isto é, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20 e I21 da região 2-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0387] Em uma outra modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0388] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com uma modificação de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I761, E762, M763, R765, E766 e N767 da região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0389] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com uma modificação de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em aminoácidos não polares, isto é, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763 e A764 na região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0390] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0391] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com uma modificação de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038 e Y1039 da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0392] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com uma modificação de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em aminoácidos não polares, isto é, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 e F1038 da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0393] Em uma modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados das sequências de aminoácidos da região 2-1 e da região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados. Aqui, os dois ou mais aminoácidos selecionados podem estar localizados na região 2-1 e na região 2-2, respectivamente.
[0394] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766 e N767 da região 2-1 e da região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0395] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em aminoácidos não polares, isto é, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763 e A764 da região 2-1 e da região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0396] Em uma outra modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 2-1 e da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados. Aqui, os dois ou mais aminoácidos selecionados podem estar localizados na região 2-1 e na região 2-3, respectivamente.
[0397] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ser uma forma incluindo modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038 e Y1039 da região 2-1 e da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0398] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em aminoácidos não polares, isto é, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 e F1038 da região 2-1 e da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0399] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados das sequências de aminoácidos das regiões 2-2 e 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados. Aqui, os dois ou mais aminoácidos selecionados podem estar localizados na região 2-2 e na região 2-3, respectivamente.
[0400] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038 e Y1039 da região 2-2 e da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0401] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ser uma forma incluindo modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em aminoácidos não polares, isto é, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 e F1038 da região 2-2 e da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0402] Em uma outra modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que três ou mais aminoácidos selecionados das sequências de aminoácidos da região 2-1, da região 2-2 e da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados. Aqui, os três ou mais aminoácidos selecionados podem estar localizados na região 2-1, na região 2-2 e na região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem, respectivamente.
[0403] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de três ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038 e Y1039 da região 2-1, da região 2-2 e da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0404] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ser uma forma incluindo modificações de três ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em aminoácidos não polares, isto é, I7, G8, L9, I11, G12, V16,
G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 e F1038 da região 2-1, da região 2-2 e da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0405] A variante de Cas9 pode estar em uma forma em que pelo menos um aminoácido da sequência de aminoácidos da terceira região da Cas9 do tipo selvagem é modificado.
[0406] Em um exemplo, quando a Cas9 do tipo selvagem é uma SpCas9 do tipo selvagem,
[0407] uma variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos na terceira região da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0408] Em uma modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0409] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ser uma forma incluindo uma modificação de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 e L891 da região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0410] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com uma modificação de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em aminoácidos carregados, isto é, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 e D898 na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0411] A variante de Cas9 pode estar em uma forma em que um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da quarta região da Cas9 do tipo selvagem são modificados.
[0412] Em um exemplo, quando a Cas9 do tipo selvagem é uma SpCas9 do tipo selvagem,
[0413] uma variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0414] Em uma modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0415] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com uma modificação de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0416] A variante de Cas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos na primeira região e na segunda região da Cas9 do tipo selvagem são modificados. Aqui, os dois ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0417] Em um exemplo, quando a Cas9 do tipo selvagem é uma SpCas9 do tipo selvagem,
[0418] uma variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos na primeira região e na segunda região da SpCas9 do tipo selvagem são modificados. Aqui, os dois ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0419] Em uma modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-1 e da região 2-1 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0420] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281 e I282 da região 1-1 e da região 2-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0421] Em uma outra modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-1 e da região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0422] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ser uma forma incluindo modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, I761, E762, M763, R765, E766 e N767 da região 1-1 e da região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0423] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-1 e da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0424] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038 e Y1039 da região 1-1 e da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0425] Em uma modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-2 e da região 2-1 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0426] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391 e L393 da região 1-2 e da região 2-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0427] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ser uma forma incluindo modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em aminoácidos não polares, isto é, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391 e L393 da região 1-2 e da região 2-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0428] Em uma outra modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-2 e da região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0429] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, I761, E762, M763, R765, E766 e N767 da região 1-2 e da região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0430] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-2 e da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0431] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038 e Y1039 da região 1-2 e da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0432] Em uma modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-3 e da região 2-1 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0433] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ser uma forma incluindo modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588 e I601 da região 1-3 e da região 2-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0434] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em aminoácidos não polares, isto é, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606 e L607 da região 1-3 e da região 2-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0435] Em uma outra modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-3 e da região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0436] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, I761, E762, M763, R765, E766 e N767 da região 1-3 e da região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0437] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ser uma forma incluindo modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em aminoácidos não polares, isto é, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763 e A764 da região 1-3 e da região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0438] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-3 e da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0439] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038 e Y1039 da região 1-3 e da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0440] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ser uma forma incluindo modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em aminoácidos não polares, isto é, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I927, V931, A932,
I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 e F1038 da região 1-3 e da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0441] Em uma modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-4 e da região 2-1 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0442] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ser uma forma incluindo modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, N692, M694, Q695 e H698 da região 1-4 e da região 2-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0443] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em aminoácidos não polares, isto é, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 e I697 da região 1-4 e da região 2-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0444] Em uma outra modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-4 e da região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0445] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ser uma forma incluindo modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766 e N767 da região 1-4 e da região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0446] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em aminoácidos não polares, isto é, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763 e A764 da região 1-4 e da região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0447] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-4 e da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0448] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ser uma forma incluindo modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N692, M694, Q695, H698, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038 e Y1039 da região 1-4 e da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0449] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em aminoácidos não polares, isto é, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689,
F693, M694, L696, I697, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 e F1038 da região 1-4 e da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0450] Em uma modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da primeira região e da segunda região da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0451] Aqui, a primeira região pode ser a região 1-1, a região 1-2, a região 1-3 e a região 1-4.
[0452] Aqui, a segunda região pode ser a região 2- 1, a região 2-2 e a região 2-3.
[0453] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038 e Y1039 da primeira região e da segunda região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0454] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205,
V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 e F1038 da primeira região e da segunda região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0455] A variante de Cas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da primeira região e da terceira região da Cas9 do tipo selvagem são modificados. Aqui, os dois ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0456] Em um exemplo, quando a Cas9 do tipo selvagem é uma SpCas9 do tipo selvagem,
[0457] uma variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da primeira região e da terceira região da SpCas9 do tipo selvagem são modificados. Aqui, os dois ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0458] Em uma modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-1 e da região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0459] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 e L891 da região 1-1 e da região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0460] Em uma modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-2 e da região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0461] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em aminoácidos não polares, isto é, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391 e L393 da região 1-2 da SpCas9 do tipo selvagem; e aminoácidos carregados, isto é, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 e D898 da região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0462] Em uma modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-3 e da região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0463] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 e L891 da região 1-3 e da região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0464] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em aminoácidos não polares, isto é, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606 e L607 da região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem; e os aminoácidos carregados, isto é, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 e D898 da região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0465] Em uma outra modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-4 e da região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0466] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N692, M694, Q695, H698, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 e L891 da região 1-4 e da região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0467] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em aminoácidos não polares, isto é, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 e I697 da região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem; e os aminoácidos carregados, isto é, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 e D898 da região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0468] Em uma modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da primeira região e da terceira região da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0469] Aqui, a primeira região pode ser a região 1-1, a região 1-2, a região 1-3 e a região 1-4.
[0470] Aqui, a terceira região pode ser a região 3-1.
[0471] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 e L891 da primeira região e da terceira região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0472] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237,
G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 e D898 da primeira região e da terceira região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0473] A variante de Cas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da primeira região e da quarta região da Cas9 do tipo selvagem são modificados. Aqui, os dois ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0474] Em um exemplo, quando a Cas9 do tipo selvagem é uma SpCas9 do tipo selvagem,
[0475] uma variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da primeira região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem são modificados. Aqui, os dois ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0476] Em uma modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-1 e da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0477] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da região 1-1 e da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0478] Em uma modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-2 e da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0479] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367,
F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da região 1-2 e da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0480] Em uma modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-3 e da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0481] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da região 1-3 e da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0482] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em aminoácidos não polares, isto é, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606 e L607 da região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem; e T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0483] Em uma outra modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-4 e da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0484] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N692, M694, Q695, H698, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da região 1-4 e da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0485] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em aminoácidos não polares, isto é, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 e I697 das regiões 1 - 4 da SpCas9 do tipo selvagem; e T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0486] Em uma modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da primeira região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0487] Aqui, a primeira região pode ser a região 1-1, a região 1-2, a região 1-3 e a região 1-4.
[0488] Aqui, a quarta região pode ser a região 4-
1.
[0489] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da primeira região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0490] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da primeira região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0491] A variante de Cas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da segunda região e da terceira região da Cas9 do tipo selvagem são modificados. Aqui, os dois ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0492] Em um exemplo, quando a Cas9 do tipo selvagem é uma SpCas9 do tipo selvagem,
[0493] uma variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da segunda região e da terceira região da SpCas9 do tipo selvagem são modificados. Aqui, os dois ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0494] Em uma modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 2-1 e da região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0495] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 e L891 da região 2-1 e da região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0496] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em aminoácidos não polares, isto é, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20 e I21 da região 2-1 da SpCas9 do tipo selvagem; e aminoácidos carregados, isto é, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802,
E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 e D898 da região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0497] Em uma outra modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 2-2 e da região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0498] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 e L891 da região 2-2 e da região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0499] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em aminoácidos não polares, isto é, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763 e A764 da região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem; e os aminoácidos carregados, isto é, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 e D898 da região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0500] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 2-3 e da região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0501] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038 e Y1039 da região 2-3 e da região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0502] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em aminoácidos não polares, isto é, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 e F1038 da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem; e aminoácidos carregados, isto é, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 e D898 da região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0503] Em uma modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da segunda região e da terceira região da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0504] Aqui, a segunda região pode ser a região 2- 1, a região 2-2 e a região 2-3.
[0505] Aqui, a terceira região pode ser a região 3-1.
[0506] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, Y981, H982, H983, A984, H985, D965, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038 e Y1039 da segunda região e da terceira região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0507] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972,
V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 e F1038 da segunda região e da terceira região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0508] A variante de Cas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da segunda região e da quarta região da Cas9 do tipo selvagem são modificados. Aqui, os dois ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0509] Em um exemplo, quando a Cas9 do tipo selvagem é uma SpCas9 do tipo selvagem,
[0510] uma variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da segunda região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem são modificados. Aqui, os dois ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0511] Em uma modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 2-1 e da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0512] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127,
D1135, S1136 e T1138 da região 2-1 e da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0513] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em aminoácidos não polares, isto é, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20 e I21 da região 2-1 da SpCas9 do tipo selvagem; e T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0514] Em uma outra modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 2-2 e da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0515] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I761, E762, M763, R765, E766, N767, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da região 2-2 e da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0516] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em aminoácidos não polares, isto é, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763 e A764 da região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem; e T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0517] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 2-3 e da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0518] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da região 2-3 e da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0519] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em aminoácidos não polares, isto é, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 e F1038 da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem; e T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0520] Em uma modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da segunda região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0521] Aqui, a segunda região pode ser a região 2- 1, a região 2-2 e a região 2-3.
[0522] Aqui, a quarta região pode ser a região 4-
1.
[0523] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da segunda região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0524] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1038, Y1039, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da segunda região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0525] A variante de Cas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da terceira região e da quarta região da
Cas9 do tipo selvagem são modificados. Aqui, os dois ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0526] Em um exemplo, quando a Cas9 do tipo selvagem é uma SpCas9 do tipo selvagem,
[0527] uma variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da terceira região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem são modificados. Aqui, os dois ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0528] Em uma modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 3-1 e da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0529] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 na região 3-1 e na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0530] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em os aminoácidos carregados, isto é, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810,
R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 e D898 na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem; e T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0531] A variante de Cas9 pode estar em uma forma em que três ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da primeira região, da segunda região, da terceira região e/ou da quarta região da Cas9 do tipo selvagem são modificados. Aqui, os três ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0532] Em um exemplo, quando a Cas9 do tipo selvagem é uma SpCas9 do tipo selvagem,
[0533] uma variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que três ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da primeira região, da segunda região, da terceira região e/ou da quarta região da Cas9 do tipo selvagem são modificados. Aqui, os três ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0534] Em uma modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que três ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da primeira região, da segunda região e da terceira região da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0535] Aqui, a primeira região pode ser a região
1-1, a região 1-2, a região 1-3 e a região 1-4.
[0536] Aqui, a segunda região pode ser a região 2- 1, a região 2-2 e a região 2-3.
[0537] Aqui, a terceira região pode ser a região 3-1.
[0538] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de três ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038 e Y1039 da primeira região, da segunda região e da terceira região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0539] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de três ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540,
G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 e F1038 da primeira região, da segunda região e da terceira região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0540] Em uma outra modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que três ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da primeira região, da segunda região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0541] Aqui, a primeira região pode ser a região 1-1, a região 1-2, a região 1-3 e a região 1-4.
[0542] Aqui, a segunda região pode ser a região 2- 1, a região 2-2 e a região 2-3.
[0543] Aqui, a quarta região pode ser a região 4-
1.
[0544] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de três ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 e D1127 da primeira região, da segunda região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0545] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de três ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748,
V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037, F1038, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da primeira região, da segunda região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0546] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que três ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da primeira região, da terceira região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0547] Aqui, a primeira região pode ser a região 1-1, a região 1-2, a região 1-3 e a região 1-4.
[0548] Aqui, a terceira região pode ser a região 3-1.
[0549] Aqui, a quarta região pode ser a região 4-
1.
[0550] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de três ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, T1102 e D1127 da primeira região, da terceira região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0551] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de três ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da primeira região, da terceira região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0552] Em uma outra modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que três ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da segunda região, da terceira região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0553] Aqui, a segunda região pode ser a região 2- 1, a região 2-2 e a região 2-3.
[0554] Aqui, a terceira região pode ser a região 3-1.
[0555] Aqui, a quarta região pode ser a região 4-
1.
[0556] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de três ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 e D1127 da segunda região, da terceira região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0557] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de três ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950,
V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037, F1038, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da segunda região, da terceira região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0558] A variante de Cas9 pode estar em uma forma em que quatro ou mais aminoácidos selecionados das sequências de aminoácidos da primeira região, da segunda região, da terceira região e da quarta região da Cas9 do tipo selvagem são modificados. Aqui, os quatro ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0559] Em um exemplo, quando a Cas9 do tipo selvagem é uma SpCas9 do tipo selvagem,
[0560] uma variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que quatro ou mais aminoácidos selecionados das sequências de aminoácidos da primeira região, da segunda região, da terceira região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem são modificados. Aqui, os quatro ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0561] Em uma modalidade exemplificativa, a variante da SpCas9 pode estar em uma forma em que três ou mais aminoácidos selecionados das sequências de aminoácidos da primeira região, da segunda região, da terceira região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem são modificados.
[0562] Aqui, a primeira região pode ser a região 1-1, a região 1-2, a região 1-3 e a região 1-4.
[0563] Aqui, a segunda região pode ser a região 2- 1, a região 2-2 e a região 2-3.
[0564] Aqui, a terceira região pode ser a região 3-1.
[0565] Aqui, a quarta região pode ser a região 4-
1.
[0566] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de três ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 e D1127 da primeira região, da segunda região, da terceira região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0567] Por exemplo, a variante da SpCas9 pode ter uma forma com modificações de três ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335,
A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037, F1038, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da primeira região, da segunda região, da terceira região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0568] A variante de Cas9 pode incluir uma modificação de pelo menos um aminoácido selecionado de uma ou mais regiões.
[0569] Aqui, a modificação pode ser uma deleção do um ou mais aminoácidos selecionados.
[0570] Em um exemplo, quando a Cas9 do tipo selvagem é uma SpCas9 do tipo selvagem,
[0571] a modificação pode ser uma deleção de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da primeira região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0572] Em uma modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma deleção de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-1, da região 1-2, da região 1-3 e/ou da região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0573] Por exemplo, a modificação pode ser uma deleção de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 e I697 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0574] A modificação pode ser uma deleção de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da segunda região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0575] Em uma modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma deleção de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos na região 2-1, na região 2-2 e/ou na região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0576] Por exemplo, a modificação pode ser uma deleção de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 e F1038 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0577] A modificação pode ser uma deleção de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da terceira região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0578] Em uma modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma deleção de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0579] Por exemplo, a modificação pode ser uma deleção de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820,
D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 e D898 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0580] A modificação pode ser uma deleção de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0581] Em uma modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma deleção de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0582] Por exemplo, a modificação pode ser uma deleção de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0583] A modificação pode ser uma deleção de dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da primeira região, da segunda região, da terceira região e/ou da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0584] Em uma modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma deleção de dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos na região 1-1, na região 1-2, na região 1-3, na região 1-4, na região 2-1, na região 2-2, na região 2-3, na região 3-1 e/ou na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0585] Por exemplo, a modificação pode ser uma deleção de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18,
A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208,
A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227,
Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242,
A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262,
L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282,
P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338,
V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363,
G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383,
G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524,
V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547,
I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572,
C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592,
L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683,
G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733,
G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751,
G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779,
R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799,
E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835,
D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861,
K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884,
K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939,
L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966,
F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993,
G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011,
V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032,
A1034, F1037, F1038, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117,
D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0586] Aqui, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados por aminoácidos diferentes.
[0587] Em um exemplo, quando a Cas9 do tipo selvagem é uma SpCas9 do tipo selvagem,
[0588] a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da primeira região da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácidos diferentes.
[0589] Em uma modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-1, da região 1-2, da região 1-3 e/ou da região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem por estereoisômero(s).
[0590] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 e H698 da SpCas9 do tipo selvagem por estereoisômero(s). Por exemplo, quando a lisina na 510a posição (K510) da SpCas9 do tipo selvagem é L-lisina, a modificação pode ser para substituir a lisina na 510a posição (K510) da SpCas9 do tipo selvagem por D-lisina.
[0591] Em uma modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-1, da região 1-2, da região 1-3 e/ou da região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo um índice de hidropatia relativamente baixo.
[0592] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 e I697 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo um índice de hidropatia relativamente baixo. Por exemplo, a modificação pode ser para substituir fenilalanina na 539a posição (F539, índice de hidropatia: 2,8) da SpCas9 do tipo selvagem por serina (índice de hidropatia: -0,8) tendo um índice de hidropatia relativamente baixo. Alternativamente, a modificação pode ser para substituir isoleucina na 601a posição (I601, índice de hidropatia: 4,5) da SpCas9 do tipo selvagem por asparagina (índice de hidropatia: -3,5) tendo um índice de hidropatia relativamente baixo.
[0593] Em uma outra modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-1, da região 1-2, da região 1-3 e/ou da região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo um índice de hidropatia relativamente alto.
[0594] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 e H698 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente alto. Por exemplo, a modificação pode ser para substituir asparagina na 277a posição (N277, índice de hidropatia: -3,5) da SpCas9 do tipo selvagem por histidina (índice de hidropatia: -3,2) tendo um índice de hidropatia relativamente alto.
[0595] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-1, da região 1-2, da região 1-3 e/ou da região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo um índice de hidropatia relativamente alto ou baixo.
[0596] Em uma modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-1, da região 1-2, da região 1-3 e/ou da região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo um grupo funcional relativamente pequeno.
[0597] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 e H698 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido tendo um grupo funcional relativamente pequeno. Por exemplo, a modificação pode ser para substituir fenilalanina na 539a posição (F539) da SpCas9 do tipo selvagem por serina tendo um grupo funcional relativamente pequeno.
[0598] Em uma outra modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-1, da região 1-2, da região 1-3 e/ou da região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo um grupo funcional relativamente grande.
[0599] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520,
L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 e I697 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido tendo um grupo funcional relativamente grande. Por exemplo, a modificação pode ser para substituir alanina na 203a posição (A203) da SpCas9 do tipo selvagem por ácido aspártico tendo um grupo funcional relativamente grande. Por exemplo, a modificação pode ser para substituir glicina na 366a posição (G366) da SpCas9 do tipo selvagem por serina tendo um grupo funcional relativamente grande.
[0600] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-1, da região 1-2, da região 1-3 e/ou da região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo um grupo funcional relativamente grande ou pequeno.
[0601] Em uma modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-1, da região 1-2, da região 1-3 e/ou da região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo hidrofobicidade relativamente baixa.
[0602] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 e I697 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido tendo hidrofobicidade relativamente baixa. Por exemplo, a modificação pode ser para substituir fenilalanina na 539a posição (F539, hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: 2,8) e isoleucina na 601a posição (I601, hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: 4,5) da SpCas9 do tipo selvagem por serina (hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: -0,8) e asparagina (hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: -3,5), que têm hidrofobicidade relativamente mais baixa, respectivamente.
[0603] Em uma outra modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-1, da região 1-2, da região 1-3 e/ou da região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo hidrofobicidade relativamente alta.
[0604] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 e I697 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido tendo hidrofobicidade relativamente alta. Por exemplo, a modificação pode ser para substituir asparagina na 277a posição (N277, hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: -3,5) e fenilalanina na 682a posição (F682, hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: 2,8) da SpCas9 do tipo selvagem por histidina (hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: -3,2) e valina (hidrofobicidade de Kyte- Doolittle: 4,2), que têm hidrofobicidade relativamente alta, respectivamente.
[0605] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-1, da região 1-2, da região 1-3 e/ou da região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo hidrofobicidade relativamente baixa ou alta.
[0606] A modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da segunda região da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácidos diferentes.
[0607] Em uma modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 2-1, da região 2-2 e/ou da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem por estereoisômero(s).
[0608] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038 e Y1039 da SpCas9 do tipo selvagem por estereoisômero(s). Por exemplo, quando glicina na 12a posição (G12) da SpCas9 do tipo selvagem é L-glicina, a modificação pode ser para substituir glicina na 12a posição (G12) da SpCas9 do tipo selvagem por D- glicina.
[0609] Em uma modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 2-1, da região 2-2 e/ou da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo um índice de hidropatia relativamente baixo.
[0610] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 e F1038 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente baixo. Por exemplo, a modificação pode ser para substituir fenilalanina na 1038a posição (F1038, índice de hidropatia: 2,8) da SpCas9 do tipo selvagem por tirosina (índice de hidropatia: -1,3) tendo um índice de hidropatia relativamente baixo.
[0611] Em uma outra modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 2-1, da região 2-2 e/ou da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo um índice de hidropatia relativamente alto.
[0612] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18,
A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 e F1038 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente alto. Por exemplo, a modificação pode ser para substituir metionina na 763a posição (M763, índice de hidropatia: 1,9) da SpCas9 do tipo selvagem por isoleucina (índice de hidropatia: 4,5) tendo um índice de hidropatia relativamente alto. Por exemplo, a modificação pode ser para substituir ácido aspártico na 965a posição (D965, índice de hidropatia: - 3,5) da SpCas9 do tipo selvagem por tirosina (índice de hidropatia: -1,3) tendo um índice de hidropatia relativamente alto.
[0613] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 2-1, da região 2-2 e/ou da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo um índice de hidropatia relativamente alto ou baixo.
[0614] Em uma modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 2-1, da região 2-2 e/ou da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo um grupo funcional relativamente pequeno.
[0615] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038 e Y1039 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido tendo um grupo funcional relativamente pequeno. Por exemplo, a modificação pode ser para substituir metionina na 763a posição (M763) da SpCas9 do tipo selvagem por isoleucina tendo um grupo funcional relativamente pequeno.
[0616] Em uma outra modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 2-1, da região 2-2 e/ou da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo um grupo funcional relativamente grande.
[0617] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038 e Y1039 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido tendo um grupo funcional relativamente grande. Por exemplo, a modificação pode ser para substituir fenilalanina na 1038a posição (F1038) da SpCas9 do tipo selvagem por tirosina tendo um grupo funcional relativamente grande.
[0618] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 2-1, da região 2-2 e/ou da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo um grupo funcional relativamente grande ou pequeno.
[0619] Em uma modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 2-1, da região 2-2 e/ou da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo hidrofobicidade relativamente baixa.
[0620] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 e F1038 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido tendo hidrofobicidade relativamente baixa. Por exemplo, a modificação pode ser para substituir isoleucina na 761a posição (I761, hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: 4,5) e fenilalanina na 1038a posição (F1038, hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: 2,8) da SpCas9 do tipo selvagem por metionina (hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: 1,9) e tirosina (hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: -1,3), que têm hidrofobicidade relativamente baixa, respectivamente.
[0621] Em uma outra modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 2-1, da região 2-2 e/ou da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo hidrofobicidade relativamente alta.
[0622] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 e F1038 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido tendo hidrofobicidade relativamente alta. Por exemplo, a modificação pode ser para substituir metionina na 763a posição (M763, hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: 1,9) e alanina na 932a posição (A932, hidrofobicidade de Kyte- Doolittle: 1,8) da SpCas9 do tipo selvagem por isoleucina (hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: 4,5) e cisteína (hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: 2,5), que têm hidrofobicidade relativamente alta, respectivamente.
[0623] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 2-1, da região 2-2 e/ou da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo hidrofobicidade relativamente baixa ou alta.
[0624] A modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da terceira região da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido diferente.
[0625] Em uma modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem por estereoisômero(s).
[0626] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 e L891 da SpCas9 do tipo selvagem por um estereoisômero. Por exemplo, quando ácido aspártico na 853a posição (D853) da SpCas9 do tipo selvagem é L-ácido aspártico, a modificação pode ser para substituir ácido aspártico na 853a posição (D853) da SpCas9 do tipo selvagem por D-ácido aspártico.
[0627] Em uma modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente baixo.
[0628] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 e L891 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente baixo. Por exemplo, a modificação pode ser para substituir lisina na 862a posição (K862, índice de hidropatia: -3,9) da SpCas9 do tipo selvagem por arginina (índice de hidropatia: -4,5) tendo um índice de hidropatia relativamente baixo.
[0629] Em uma outra modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente alto.
[0630] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 e L891 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente alto. Por exemplo, a modificação pode ser para substituir lisina na 890a posição (K890, índice de hidropatia: -3,9) da SpCas9 do tipo selvagem por asparagina (índice de hidropatia: -3,5) tendo um índice de hidropatia relativamente alto.
[0631] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo um índice de hidropatia relativamente alto ou baixo.
[0632] Em uma modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo um grupo funcional relativamente pequeno.
[0633] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 e L891 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido tendo um grupo funcional relativamente pequeno. Por exemplo, a modificação pode ser para substituir lisina na 890a posição (K890) da SpCas9 do tipo selvagem por asparagina tendo um grupo funcional relativamente pequeno.
[0634] Em uma outra modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo um grupo funcional relativamente grande.
[0635] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 e L891 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido tendo um grupo funcional relativamente grande. Por exemplo, a modificação pode ser para substituir asparagina na 863a posição (N863) da SpCas9 do tipo selvagem por arginina tendo um grupo funcional relativamente grande.
[0636] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo um grupo funcional relativamente grande ou pequeno.
[0637] Em uma modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo hidrofobicidade relativamente baixa.
[0638] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 e D898 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido tendo hidrofobicidade relativamente baixa. Por exemplo, a modificação pode ser para substituir ácido glutâmico na 779a posição (E779, hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: - 3,5) e lisina na 862a posição (K862, hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: -3,9) da SpCas9 do tipo selvagem por lisina
(hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: -3,9) e arginina (hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: -4,5), que têm hidrofobicidade relativamente baixa, respectivamente.
[0639] Em uma outra modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo hidrofobicidade relativamente alta.
[0640] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 e D898 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido tendo hidrofobicidade relativamente alta. Por exemplo, a modificação pode ser para substituir ácido glutâmico na 827a posição (E827, hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: - 3,5) e lisina na 890a posição (K890, hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: -3,9) da SpCas9 do tipo selvagem por metionina (hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: 1,9) e asparagina (hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: -3,5), que têm hidrofobicidade relativamente alta, respectivamente.
[0641] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo hidrofobicidade relativamente baixa ou alta.
[0642] A modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido diferente.
[0643] Em uma modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem por estereoisômero(s).
[0644] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da SpCas9 do tipo selvagem por um estereoisômero. Por exemplo, quando ácido aspártico na 1127a posição (D1127) da SpCas9 do tipo selvagem é L-ácido aspártico, a modificação pode ser para substituir ácido aspártico na 1127a posição (D1127) da SpCas9 do tipo selvagem por D-ácido aspártico.
[0645] Em uma modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo um índice de hidropatia relativamente baixo.
[0646] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em T1102, S1106, E1108, S1116, D1117,
D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente baixo. Por exemplo, a modificação pode ser para substituir treonina na 1102a posição (T1102, índice de hidropatia: -0,7) da SpCas9 do tipo selvagem por prolina (índice de hidropatia: -1,6) tendo um índice de hidropatia relativamente baixo.
[0647] Em uma outra modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo um índice de hidropatia relativamente alto.
[0648] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente alto. Por exemplo, a modificação pode ser para substituir serina na 1106a posição (S1106, índice de hidropatia: -0,8) da SpCas9 do tipo selvagem por glicina (índice de hidropatia: -0,4) tendo um índice de hidropatia relativamente alto.
[0649] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo um índice de hidropatia relativamente alto ou baixo.
[0650] Em uma modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo um grupo funcional relativamente pequeno.
[0651] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido tendo um grupo funcional relativamente pequeno. Por exemplo, a modificação pode ser para substituir treonina na 1102a posição (T1102) da SpCas9 do tipo selvagem por prolina tendo um grupo funcional relativamente pequeno.
[0652] Em uma outra modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo um grupo funcional relativamente grande.
[0653] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido tendo um grupo funcional relativamente grande. Por exemplo, a modificação pode ser para substituir ácido aspártico na 1127a posição (D1127) da SpCas9 do tipo selvagem por ácido glutâmico tendo um grupo funcional relativamente grande.
[0654] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo um grupo funcional relativamente grande ou pequeno.
[0655] Em uma modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo hidrofobicidade relativamente baixa.
[0656] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido tendo um hidrofobicidade relativamente baixa. Por exemplo, a modificação pode ser para substituir treonina na 1102a posição (T1102, hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: -0,7) da SpCas9 do tipo selvagem por prolina (hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: - 1,6) tendo hidrofobicidade relativamente baixa.
[0657] Em uma outra modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo hidrofobicidade relativamente alta.
[0658] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido tendo hidrofobicidade relativamente alta. Por exemplo, a modificação pode ser para substituir ácido glutâmico na 1108a posição (E1108, hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: -3,5) da SpCas9 do tipo selvagem por metionina (hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: 1,9) tendo um hidrofobicidade relativamente alta.
[0659] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo hidrofobicidade relativamente baixa ou alta.
[0660] A modificação pode ser uma substituição de dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos na primeira região, na segunda região, na terceira região e/ou na quarta região da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácidos diferentes.
[0661] Em uma modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-1, da região 1-2, da região 1-3, da região 1-4, da região 2-1, da região 2-2, da região 2-3, da região 3-1 e/ou da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem por estereoisômeros, respectivamente.
[0662] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 e D1127 da SpCas9 do tipo selvagem por estereoisômeros, respectivamente. Por exemplo, quando glicina na 8a posição (G8) da SpCas9 do tipo selvagem é L-glicina, e asparagina na 767a posição (N767) é L-asparagina, a modificação pode ser para substituir glicina na 8a posição (G8) e asparagina na 767a posição (N767) da SpCas9 do tipo selvagem por D-glicina e D-asparagina, respectivamente.
[0663] Em uma modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-1, da região 1-2, da região 1-3, da região 1-4, da região 2-1, da região 2-2, da região 2-3, da região 3-1 e/ou da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácidos tendo um relativamente pequeno índice de hidropatia, respectivamente.
[0664] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987,
Y988, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 e D1127 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácidos tendo um relativamente pequeno índice de hidropatia, respectivamente. Por exemplo, a modificação pode ser para substituir alanina na 203a posição (A203, índice de hidropatia: 1,8) e fenilalanina na 539a posição (F539, índice de hidropatia: 2,8) da SpCas9 do tipo selvagem por ácido aspártico (índice de hidropatia: - 3,5) e serina (índice de hidropatia: -0,8), que têm um índice de hidropatia relativamente baixo, respectivamente.
[0665] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779,
R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037, F1038, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácidos tendo um relativamente pequeno índice de hidropatia, respectivamente. Por exemplo, a modificação pode ser para substituir isoleucina na 601a posição (I601, índice de hidropatia: 4,5) e treonina na 1102a posição (T1102, índice de hidropatia: -0,7) da SpCas9 do tipo selvagem por asparagina (índice de hidropatia: - 3,5) e prolina (índice de hidropatia: -1,6), que têm um índice de hidropatia relativamente baixo, respectivamente.
[0666] Em uma outra modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-1, da região 1-2, da região 1-3, da região 1-4, da região 2-1, da região 2-2, da região 2-3, da região 3-1 e/ou da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente alto, respectivamente.
[0667] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 e D1127 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente alto, respectivamente. Por exemplo, a modificação pode ser para substituir asparagina na 277a posição (N277, índice de hidropatia: -3,5) e histidina na 840a posição (H840, índice de hidropatia: - 3,2) da SpCas9 do tipo selvagem por histidina (índice de hidropatia: -3,2) e alanina (índice de hidropatia: 1,8), que têm um índice de hidropatia relativamente alto, respectivamente.
[0668] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524,
V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037, F1038, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente alto, respectivamente. Por exemplo, a modificação pode ser para substituir metionina na 763a posição (M763, índice de hidropatia: 1,9) e lisina na 890a posição (K890, índice de hidropatia: -3,9) da SpCas9 do tipo selvagem por isoleucina (índice de hidropatia: 4,5) e asparagina (índice de hidropatia: -3,5), que têm um índice de hidropatia relativamente alto, respectivamente.
[0669] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-1, da região 1-2, da região 1-3, da região 1-4, da região 2-1, da região 2-2, da região 2-3, da região 3-1 e/ou da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente alto ou baixo, respectivamente.
[0670] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 e D1127 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente alto ou baixo, respectivamente.
Por exemplo, a modificação pode ser para substituir ácido aspártico na 10a posição (D10, índice de hidropatia: -3,5) e histidina na 840a posição (H840, índice de hidropatia: - 3,2) da SpCas9 do tipo selvagem por alanina (índice de hidropatia: 1,8) tendo um índice de hidropatia relativamente alto, respectivamente, e para substituir fenilalanina na 539a posição (F539, índice de hidropatia: 2,8) da SpCas9 do tipo selvagem por serina (índice de hidropatia: -0,8) tendo um relativamente pequeno índice de hidropatia.
[0671] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18,
A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208,
A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227,
Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242,
A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262,
L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282,
P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338,
V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363,
G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383,
G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524,
V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547,
I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572,
C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592,
L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683,
G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733,
G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751,
G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779,
R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799,
E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835,
D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861,
K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884,
K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939,
L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966,
F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993,
G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011,
V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032,
A1034, F1037, F1038, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117,
D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente alto ou baixo, respectivamente. Por exemplo, a modificação pode ser para substituir metionina na 763a posição (M763, índice de hidropatia: 1,9) e lisina na 890a posição (K890, índice de hidropatia: -3,9) da SpCas9 do tipo selvagem por isoleucina (índice de hidropatia: 4,5) e asparagina (índice de hidropatia: -3,5), que têm um índice de hidropatia relativamente alto, respectivamente, e para substituir fenilalanina na 539a posição (F539, índice de hidropatia: 2,8) da SpCas9 do tipo selvagem por serina (índice de hidropatia: -0,8) tendo um índice de hidropatia relativamente baixo.
[0672] Em uma modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-1, da região 1-2, da região 1-3, da região 1-4, da região 2-1, da região 2-2, da região 2-3, da região 3-1 e/ou da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácidos tendo um grupo funcional relativamente pequeno, respectivamente.
[0673] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 e D1127 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácidos tendo um grupo funcional relativamente pequeno, respectivamente. Por exemplo, a modificação pode ser para substituir fenilalanina na 539a posição (F539), metionina na 763a posição (M763) e treonina na 1102a posição (T1102) da SpCas9 do tipo selvagem por serina, isoleucina e prolina, que têm um grupo funcional relativamente pequeno, respectivamente.
[0674] Em outra modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-1, da região 1-2, da região 1-3, da região 1-4, da região 2-1, da região 2-2, da região 2-3, da região 3-1 e/ou da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácidos tendo um grupo funcional relativamente grande, respectivamente.
[0675] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547,
I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037, F1038, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácidos tendo um grupo funcional relativamente grande, respectivamente. Por exemplo, a modificação pode ser para substituir isoleucina na 601a posição (I601), fenilalanina na 1038a posição (F1038) e ácido aspártico na 1127a posição (D1127) da SpCas9 do tipo selvagem por asparagina, tirosina e ácido glutâmico, que têm um grupo funcional relativamente grande, respectivamente.
[0676] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-1, da região 1-2, da região 1-3, da região 1-4, da região 2-1, da região 2-2, da região 2-3, da região 3-1 e/ou da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácidos tendo um grupo funcional relativamente grande ou pequeno, respectivamente.
[0677] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884,
K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037, F1038, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácidos tendo um grupo funcional relativamente grande ou pequeno. Por exemplo, a modificação pode ser para substituir fenilalanina na 539a posição (F539), metionina na 763th posição (M763) e lisina na 890a posição (K890) da SpCas9 do tipo selvagem por serina, isoleucina e asparagina tendo um grupo funcional relativamente pequeno, respectivamente, e para substituir isoleucina na 601a posição (I601) e fenilalanina na 1038a posição (F1038) por asparagina e tirosina, que têm um grupo funcional relativamente grande.
[0678] Em uma modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-1, da região 1-2, da região 1-3, da região 1-4, da região 2-1, da região 2-2, da região 2-3, da região 3-1 e/ou da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácidos tendo hidrofobicidade relativamente baixa, respectivamente.
[0679] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18,
A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208,
A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227,
Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242,
A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262,
L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282,
P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338,
V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363,
G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383,
G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524,
V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547,
I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572,
C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592,
L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683,
G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733,
G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751,
G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779,
R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799,
E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835,
D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861,
K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884,
K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939,
L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966,
F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993,
G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011,
V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032,
A1034, F1037, F1038, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117,
D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácidos tendo hidrofobicidade relativamente baixa, respectivamente. Por exemplo, a modificação pode ser para substituir fenilalanina na 539a posição (F539, hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: 2,8), isoleucina na 601a posição (I601, hidrofobicidade de Kyte- Doolittle: 4,5) e treonina na 1102a posição (T1102, hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: -0,7) da SpCas9 do tipo selvagem por serina (hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: - 0,8), asparagina (hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: -3,5) e prolina (hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: -1,6), que têm hidrofobicidade relativamente baixa, respectivamente.
[0680] Em uma outra modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-1, da região 1-2, da região 1-3, da região 1-4, da região 2-1, da região 2-2, da região 2-3, da região 3-1 e/ou da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácidos tendo hidrofobicidade relativamente alta, respectivamente.
[0681] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363,
G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383,
G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524,
V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547,
I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572,
C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592,
L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683,
G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733,
G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751,
G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779,
R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799,
E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835,
D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861,
K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884,
K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939,
L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966,
F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993,
G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011,
V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032,
A1034, F1037, F1038, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117,
D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácidos tendo hidrofobicidade relativamente alta, respectivamente.
Por exemplo, a modificação pode ser para substituir ácido aspártico na 10a posição (D10, hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: -3,5),
metionina na 763a posição (M763, hidrofobicidade de Kyte-
Doolittle: 1,9), histidina na 840a posição (H840,
hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: -3,2) e lisina na 890a posição (K890, hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: -3,9) da
SpCas9 do tipo selvagem por alanina (hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: 1,8), isoleucina (hidrofobicidade de Kyte- Doolittle: 4,5), alanina (hidrofobicidade de Kyte- Doolittle: 1,8) e asparagina (hidrofobicidade de Kyte- Doolittle: -3,5), que têm hidrofobicidade relativamente alta, respectivamente.
[0682] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a modificação pode ser uma substituição de dois ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-1, da região 1-2, da região 1-3, da região 1-4, da região 2-1, da região 2-2, da região 2-3, da região 3-1 e/ou da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácidos tendo hidrofobicidade relativamente baixa ou alta, respectivamente.
[0683] Por exemplo, a modificação pode ser uma substituição de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572,
C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592,
L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683,
G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733,
G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751,
G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779,
R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799,
E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835,
D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861,
K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884,
K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939,
L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966,
F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993,
G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011,
V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032,
A1034, F1037, F1038, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117,
D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácidos tendo hidrofobicidade relativamente baixa ou alta, respectivamente.
Por exemplo,
a modificação pode ser para substituir metionina na 763a posição (M763, hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: 1,9) e lisina na 890a posição (K890, hidrofobicidade de Kyte-
Doolittle: -3,9) da SpCas9 do tipo selvagem por isoleucina
(hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: 4,5) e asparagina
(hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: -3,5), que têm hidrofobicidade relativamente alta, respectivamente, e para substituir fenilalanina na 539a posição (F539,
hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: 2,8) da SpCas9 do tipo selvagem por serina (hidrofobicidade de Kyte-Doolittle: -
0,8) tendo hidrofobicidade relativamente baixa.
[0684] A modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados pelo mesmo número de outros aminoácidos.
[0685] Por exemplo, a modificação pode ser para substituir uma isoleucina localizada na primeira região da SpCas9 do tipo selvagem por uma asparagina.
Alternativamente, a modificação pode ser para substituir uma fenilalanina localizada na primeira região da SpCas9 do tipo selvagem e uma lisina localizada na terceira região por uma serina (primeira região) e uma asparagina (terceira região), respectivamente. Alternativamente, a modificação pode ser para substituir uma metionina e uma fenilalanina, que estão localizadas na segunda região, e uma lisina localizada na terceira região da SpCas9 do tipo selvagem, por uma isoleucina, uma tirosina (segunda região) e uma asparagina (terceira região), respectivamente.
[0686] A modificação pode ser uma substituição de um ou mais aminoácidos selecionados com um número diferente de outros aminoácidos.
[0687] Por exemplo, a modificação pode ser para substituir uma treonina localizada na segunda região da SpCas9 do tipo selvagem por cisteína-alanina-alanina, isto é, um total de três aminoácidos. Alternativamente, a modificação pode ser para substituir uma glutamina localizada na primeira região e dois aminoácidos contíguos, glicina-serina, localizadas na terceira região da SpCas9 do tipo selvagem por metionina-valina (primeira região) e prolina (terceira região), respectivamente.
Alternativamente, a modificação pode ser para substituir uma serina localizada na primeira região, três aminoácidos contíguos, lisina-lisina-tirosina, localizados na segunda região e dois aminoácidos contíguos, serina-isoleucina, localizados na terceira região da SpCas9 do tipo selvagem por alanina (primeira região), metionina-prolina (segunda região) e cisteína-alanina-treonina-valina (terceira região), respectivamente.
[0688] A Cas9 artificialmente modificada pode ser uma variante de Cas9 com uma adição de pelo menos um aminoácido a uma ou mais regiões selecionadas da primeira região, da segunda região, da terceira região e da quarta região da Cas9 do tipo selvagem.
[0689] Aqui, a adição pode ser a adição de um ou mais aminoácidos às posições N-terminal e/ou C-terminal de um ou mais aminoácidos presentes em uma ou mais regiões selecionadas.
[0690] Em um exemplo, quando a Cas9 do tipo selvagem é uma SpCas9 do tipo selvagem,
[0691] a adição pode ser a adição de um ou mais aminoácidos às posições N-terminal e/ou C-terminal presentes na primeira região, na segunda região, na terceira região e/ou na quarta região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0692] Em uma modalidade exemplificativa, a adição pode ser a adição de um ou mais aminoácidos positivamente carregados nas posições N-terminal e/ou C-terminal de um ou mais aminoácidos presentes na primeira região, na segunda região, na terceira região e/ou na quarta região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0693] Por exemplo, a adição pode ser para adicionar uma arginina ao C-terminal de uma alanina selecionada localizada na região 1-1 da SpCas9 do tipo selvagem. Alternativamente, a adição pode ser para adicionar dois aminoácidos, arginina-lisina, ao N-terminal do ácido glutâmico selecionado localizado na região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem. Alternativamente, a adição pode ser para adicionar dois aminoácidos, arginina-histidina, ao N-terminal da leucina selecionada localizada na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem. Alternativamente, a adição pode ser para adicionar dois aminoácidos, lisina-histidina, ao C-terminal da leucina selecionada localizada na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem, e para adicionar uma lisina ao C-terminal da tirosina selecionada localizada na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0694] Em uma outra modalidade exemplificativa, a adição pode ser a adição de um ou mais aminoácidos carregados negativamente às posições N-terminal e/ou C- terminal de um ou mais aminoácidos presentes na primeira região, na segunda região, na terceira região e/ou na quarta região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0695] Por exemplo, a adição pode ser para adicionar um ácido aspártico ao N-terminal de uma glicina selecionada localizada na região 1-2 da SpCas9 do tipo selvagem. Alternativamente, a adição pode ser para adicionar três aminoácidos, ácido glutâmico-ácido aspártico-ácido glutâmico, ao C-terminal da metionina selecionada localizada na região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem. Alternativamente, a adição pode ser para adicionar dois aminoácidos, ácido glutâmico-ácido glutâmico, ao N-terminal da isoleucina selecionada localizada na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
Alternativamente, a adição pode ser para adicionar dois aminoácidos, ácido glutâmico-ácido aspártico, ao C-terminal da fenilalanina selecionada localizada na região 1-1 da SpCas9 do tipo selvagem, e para adicionar um ácido aspártico ao N-terminal da glutamina selecionada localizada na região 2-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0696] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a adição pode ser a adição de um ou mais aminoácidos não carregados nas posições N-terminal e/ou C- terminal presentes na primeira região, na segunda região, na terceira região e/ou na quarta região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0697] Por exemplo, a adição pode ser para adicionar dois aminoácidos, serina-valina, ao C-terminal de uma fenilalanina selecionada localizada na região 1-1 da SpCas9 do tipo selvagem. Alternativamente, a adição pode ser para adicionar cinco aminoácidos, glicina-prolina- glutamina-fenilalanina-leucina, ao N-terminal da histidina selecionada localizada na região 2-1 da SpCas9 do tipo selvagem. Alternativamente, a adição pode ser para adicionar dois aminoácidos, alanina-alanina, ao N-terminal da asparagina selecionada localizada na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem. Alternativamente, a adição pode ser para adicionar dois aminoácidos, fenilalanina-leucina, ao C-terminal de ácido aspártico selecionado localizado na região 1-1 da SpCas9 do tipo selvagem, e para adicionar uma serina ao N-terminal da glutamina selecionada localizada na região 1-2 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0698] Em uma outra modalidade exemplificativa, a adição pode ser a adição de um ou mais aminoácidos selecionados de aminoácidos carregados positivamente, aminoácidos carregados negativamente e aminoácidos não carregados nas posições N-terminal e/ou C-terminal de um ou mais aminoácidos presentes na primeira região, na segunda região, na terceira região e/ou na quarta região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0699] Por exemplo, a adição pode ser para adicionar seis aminoácidos, histidina-arginina-glicina- serina-alanina-ácido glutâmico, ao C-terminal de uma arginina selecionada localizada na região 1-2 da SpCas9 do tipo selvagem. Alternativamente, a adição pode ser para adicionar dez aminoácidos, lisina-lisina-alanina- fenilalanina-glutamina-treonina-metionina-cisteína-ácido aspártico-serina, ao N-terminal de uma glicina selecionada localizada na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
Alternativamente, a adição pode ser para adicionar dois aminoácidos, fenilalanina-histidina, ao C-terminal da metionina selecionada localizada na região 2-1 da SpCas9 do tipo selvagem, e para adicionar uma lisina ao N-terminal da glutamina selecionada localizada na região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem. Alternativamente, a adição pode ser para adicionar dois aminoácidos, ácido aspártico-serina, ao C- terminal da lisina selecionada localizada na região 1-1, para adicionar seis aminoácidos, glutamina-treonina- metionina-cisteína-ácido aspártico-lisina, ao N-terminal da treonina selecionada localizada na região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem e para adicionar dois aminoácidos, arginina- glicina, ao C-terminal da glutamina selecionada localizada na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0700] Aqui, a adição pode ser a adição de um ou mais domínios funcionais nas posições N-terminal e/ou C- terminal de um ou mais aminoácidos presentes em uma ou mais regiões selecionadas.
[0701] O domínio funcional pode ser um domínio tendo uma função adicional, além das funções originais da Cas9 do tipo selvagem, isto é, uma primeira função de clivar uma primeira fita de DNA de fita dupla e uma segunda função de clivar uma segunda fita do DNA de fita dupla.
[0702] Alternativamente, o domínio funcional pode ser um domínio tendo uma função semelhante às funções originais da Cas9 do tipo selvagem, isto é, uma primeira função de clivar uma primeira fita de DNA de fita dupla e/ou uma segunda função de clivar uma segunda fita do DNA de fita dupla.
[0703] As descrições relacionadas ao domínio funcional são as mesmas como descritas acima.
[0704] Em um exemplo, quando a Cas9 do tipo selvagem é uma SpCas9 do tipo selvagem,
[0705] a adição pode ser a adição de um ou mais domínios funcionais nas posições N-terminal e/ou C-terminal de um ou mais aminoácidos presentes na primeira região, na segunda região, na terceira região e/ou na quarta região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0706] Em uma modalidade exemplificativa da divulgação aqui divulgada, a Cas9 artificialmente modificada pode ser Cas9 alvo específica.
[0707] A “Cas9 alvo específica (TS-Cas9)” refere- se a uma variante de Cas9 produzida por meio de manipulação artificial para aumentar relativamente a especificidade de alvo, em comparação com a Cas9 do tipo selvagem.
[0708] Aqui, a “especificidade de alvo” significa que a Cas9 forma um complexo gRNA-Cas9 através da interação com gRNA tal que Cas9 atua especificamente em uma sequência alvo que se liga complementarmente ao gRNA quando o complexo gRNA-Cas9 se aproxima ou está localizado em um gene ou ácido nucleico alvo, isto é, um sujeito (ácido nucleico) a ser manipulado usando Cas9. Aqui, uma sequência alvo de ligação complementar completa (100 %) com gRNA é chamada de “alvo-relacionado”, e uma sequência alvo tendo ligação complementar incompleta (inferior a 100 %), isto é, uma ou mais ligações não complementares, com o gRNA é chamada de “extra-alvo”.
[0709] A especificidade de alvo pode variar de acordo com o grau de ligação complementar entre o gRNA e a sequência alvo.
[0710] Em um exemplo, no caso em que uma sequência alvo que se liga complementarmente ao gRNA é um alvo- relacionado, isto é, a ligação complementar entre o gRNA e a sequência alvo é uma ligação complementar completa (100 %), a especificidade de alvo está no nível mais alto.
[0711] Em um outro exemplo, no caso em que a sequência alvo que se liga complementarmente ao gRNA é um extra-alvo, isto é, a ligação complementar entre o gRNA e a sequência alvo é inferior a 100 % e inclui uma ou mais ligações não complementares entre eles, a especificidade de alvo pode ser menor que o alvo-relacionado, e quanto maior o número de ligações não complementares, menor a especificidade de alvo.
[0712] Por exemplo, quando a ligação complementar entre o gRNA e a sequência alvo é uma ligação complementar completa (100 %), a especificidade de alvo pode ser 100 %, e quando existe uma ligação não complementar entre o gRNA e a sequência alvo, isto é, a ligação complementar entre o gRNA e a sequência alvo é uma ligação complementar incompleta (95 %), a especificidade de alvo pode ser de 95 %. Além disso, quando existem quatro ligações não complementares entre o gRNA e a sequência alvo, isto é, a ligação complementar entre o gRNA e a sequência alvo é uma ligação complementar incompleta (80 %), a especificidade de alvo pode ser 80 %.
[0713] Em ainda um outro exemplo, quando a sequência alvo que se liga complementarmente ao gRNA é um extra-alvo, isto é, o grau de ligação complementar entre o gRNA e a sequência alvo é inferior a 100 %, isto é, existem uma ou mais ligações não complementares, a especificidade de alvo pode variar de acordo com a localização da ligação não complementar.
[0714] Por exemplo, quando existe uma ligação não complementar entre o gRNA e a sequência alvo, e a ligação não complementar se aproxima do PAM adjacente à sequência alvo, a especificidade de alvo pode ser menor que quando a ligação não complementar está distante do PAM.
[0715] A especificidade de alvo pode variar de acordo com o grau de interação do gRNA que se liga complementarmente à sequência alvo, e Cas9.
[0716] Em um exemplo, quando a interação do gRNA que se liga complementarmente à sequência alvo, e a Cas9 pode ser reduzida, quanto menor o número de ligações não complementares entre o gRNA e a sequência alvo, maior a especificidade de alvo.
[0717] Por exemplo, quando a interação do gRNA que se liga complementarmente à sequência alvo, e a Cas9 é reduzida, a especificidade de alvo quando existe uma ligação não complementar entre o gRNA e a sequência alvo pode ser maior que quando existem três ligações não complementares entre o gRNA e a sequência alvo.
[0718] Em um outro exemplo, quando a interação do gRNA que se liga complementarmente à sequência alvo, e a Cas9 é reduzida, a Cas9 pode ter especificidade de alvo somente quando a ligação complementar entre o gRNA e a sequência alvo é uma ligação complementar completa (100 %).
[0719] Por exemplo, no caso em que a interação do gRNA que se liga complementarmente à sequência alvo e à Cas9 é reduzida, somente quando a sequência alvo é um alvo- relacionado, a Cas9 pode ter especificidade de alvo.
[0720] A especificidade de alvo pode variar de acordo com o grau de interação entre a sequência alvo que se liga complementarmente ao gRNA e à Cas9.
[0721] Em um exemplo, quando a interação entre uma sequência alvo que se liga complementarmente ao gRNA e à Cas9 é reduzida, quanto menor o número de ligações não complementares entre o gRNA e a sequência alvo, maior a especificidade de alvo.
[0722] Por exemplo, quando a interação entre uma sequência alvo que se liga complementarmente ao gRNA e à Cas9 é reduzida, em comparação com o caso em que existem quatro ligações não complementares entre o gRNA e a sequência alvo, no caso em que existem duas ligações não complementares entre eles, a especificidade de alvo pode aumentar relativamente.
[0723] Em um outro exemplo, quando a interação entre uma sequência alvo que se liga complementarmente ao gRNA e à Cas9 é reduzida, apenas no caso em que a ligação complementar entre o gRNA e a sequência alvo é uma ligação complementar completa (100 %), a Cas9 pode ter especificidade de alvo.
[0724] Por exemplo, quando a interação entre uma sequência alvo que se liga complementarmente ao gRNA e à Cas9 é reduzida, somente quando a sequência alvo é um alvo-
relacionado, a Cas9 pode ter especificidade de alvo.
[0725] A Cas9 alvo específica pode ser uma variante de Cas9 que manipula um alvo-relacionado.
[0726] Aqui, a manipulação pode ser para clivar a sequência nucleotídica do alvo-relacionado usando a variante de Cas9, ou para modificar a sequência nucleotídica de um alvo-relacionado tal que um ou mais nucleotídeos possam ser suprimidos de e/ou inseridos na sequência nucleotídica do alvo-relacionado.
[0727] A Cas9 alvo específica pode ser uma variante de Cas9 que tem uma especificidade de alvo para alvo-relacionado, que é a mesma como ou maior que da Cas9 do tipo selvagem.
[0728] A Cas9 alvo específica pode ser uma variante de Cas9 que não manipula um extra-alvo.
[0729] Aqui, a manipulação pode ser para clivar a sequência nucleotídica do extra-alvo usando a variante de Cas9, ou para modificar a sequência nucleotídica do extra- alvo tal que um ou mais nucleotídeos podem ser suprimidos e/ou inseridos na sequência nucleotídica do extra-alvo.
[0730] A Cas9 alvo específica pode ser uma variante de Cas9 que é diminuída em especificidade de alvo para alvo-relacionado, comparada à Cas9 do tipo selvagem.
[0731] A Cas9 alvo específica pode ser uma variante de Cas9 que tem a mesma especificidade de alvo para alvo-relacionado e menor especificidade de alvo para extra-alvo, comparada à Cas9 do tipo selvagem.
[0732] A Cas9 alvo específica pode ser uma variante de Cas9 que tem a mesma especificidade de alvo para extra-alvo e maior especificidade de alvo para alvo- relacionado, comparada à Cas9 do tipo selvagem.
[0733] A Cas9 alvo específica pode ser uma variante de Cas9 que tem maior especificidade de alvo para alvo-relacionado e menor especificidade de alvo para extra- alvo, comparada à Cas9 do tipo selvagem.
[0734] A Cas9 alvo específica pode ser uma variante de Cas9 que tem menor especificidade de alvo para alvo-relacionado e menor especificidade de alvo para extra- alvo, comparada à Cas9 do tipo selvagem.
[0735] Em uma modalidade exemplificativa da divulgação aqui divulgada, a Cas9 alvo específica pode ser uma SpCas9 alvo específica.
[0736] A “SpCas9 alvo específica (TS-SpCas9)” refere-se a uma variante da SpCas9 produzida por manipulação artificial para aumentar relativamente a especificidade de alvo, em comparação com a SpCas9 do tipo selvagem.
[0737] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 que manipula o alvo-relacionado.
[0738] Aqui, a manipulação pode ser para clivar a sequência nucleotídica do alvo-relacionado usando a variante da SpCas9, ou para modificar a sequência nucleotídica do alvo-relacionado tal que um ou mais nucleotídeos podem ser suprimidos e/ou inseridos na sequência nucleotídica do alvo-relacionado.
[0739] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 que tem a mesma ou maior especificidade de alvo para alvo- relacionado, em comparação com a SpCas9 do tipo selvagem.
[0740] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 que não manipula o extra-alvo.
[0741] Aqui, a manipulação pode ser para clivar a sequência nucleotídica do extra-alvo usando a variante da SpCas9, ou para modificar a sequência nucleotídica do extra-alvo tal que um ou mais nucleotídeos podem ser suprimidos e/ou inseridos na sequência nucleotídica do extra-alvo.
[0742] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 tendo especificidade de alvo reduzida para extra-alvo, em comparação com a SpCas9 do tipo selvagem.
[0743] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 que tem a mesma especificidade de alvo para alvo- relacionado e menor especificidade de alvo para extra-alvo, em comparação com a SpCas9 do tipo selvagem.
[0744] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 que tem a mesma especificidade de alvo para extra-alvo e maior especificidade de alvo para alvo-relacionado, em comparação com a SpCas9 do tipo selvagem.
[0745] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 que tem maior especificidade de alvo para alvo-relacionado e menor especificidade de alvo para extra-alvo, em comparação com a SpCas9 do tipo selvagem.
[0746] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 que tem menor especificidade de alvo para alvo-relacionado e menor especificidade de alvo para extra-alvo, em comparação com a SpCas9 do tipo selvagem.
[0747] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 em que pelo menos um aminoácido na sequência de aminoácidos de uma ou mais regiões selecionadas da primeira região, da segunda região, da terceira região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem é modificado.
[0748] A primeira região pode ser a sequência de aminoácidos (região 1-1) de fenilalanina na 196a posição (F196) a isoleucina na 282a posição (I282) da SpCas9 do tipo selvagem.
[0749] A primeira região pode ser a sequência de aminoácidos (região 1-2) de prolina na 316a posição (P316) a asparagina na 394a posição (N394) da SpCas9 do tipo selvagem.
[0750] A primeira região pode ser a sequência de aminoácidos (região 1-3) de lisina na 510a posição (K510) a asparagina na 612a posição (N612) da SpCas9 do tipo selvagem.
[0751] A primeira região pode ser a sequência de aminoácidos (região 1-4) de treonina na 678a posição (T678) a histidina na 698a posição (H698) da SpCas9 do tipo selvagem.
[0752] A primeira região pode ser duas regiões selecionadas da sequência de aminoácidos (região 1-1) de fenilalanina na 196a posição (F196) a isoleucina na 282a posição (I282), a sequência de aminoácidos (região 1-2) de prolina na 316a posição (P316) a asparagina na 394a posição (N394), a sequência de aminoácidos (região 1-3) de lisina na 510a posição (K510) a asparagina na 612a posição (N612) e a sequência de aminoácidos (região 1-4) de treonina na 678a posição (T678) a histidina na 698a posição (H698) da SpCas9 do tipo selvagem.
[0753] A primeira região pode ser três regiões selecionadas da sequência de aminoácidos (região 1-1) de fenilalanina na 196a posição (F196) a isoleucina na 282a posição (I282), a sequência de aminoácidos (região 1-2) de prolina na 316a posição (P316) a asparagina na 394a posição (N394), a sequência de aminoácidos (região 1-3) de lisina na 510a posição (K510) a asparagina na 612a posição (N612) e a sequência de aminoácidos (região 1-4) de treonina na 678a posição (T678) a histidina na 698a posição (H698) da SpCas9 do tipo selvagem.
[0754] A primeira região pode ser a sequência de aminoácidos (região 1-1) de fenilalanina na 196a posição (F196) a isoleucina na 282a posição (I282), a sequência de aminoácidos (região 1-2) de prolina na 316a posição (P316) a asparagina na 394a posição (N394), a sequência de aminoácidos (região 1-3) de lisina na 510a posição (K510) a asparagina na 612a posição (N612) e a sequência de aminoácidos (região 1-4) de treonina na 678a posição (T678) a histidina na 698a posição (H698) da SpCas9 do tipo selvagem.
[0755] A segunda região pode ser a sequência de aminoácidos (região 2-1) de metionina na 1a posição (M1) a treonina na 22a posição (T22) da SpCas9 do tipo selvagem.
[0756] A segunda região pode ser a sequência de aminoácidos (região 2-2) de prolina na 731a posição (P731) a treonina na 770a posição (T770) da SpCas9 do tipo selvagem.
[0757] A segunda região pode ser a sequência de aminoácidos (região 2-3) de glutamina na 926a posição (Q926) a serina na 1040a posição (S1040) da SpCas9 do tipo selvagem.
[0758] A segunda região pode ser a sequência de aminoácidos (região 2-1) de metionina na 1a posição (M1) a treonina na 22a posição (T22) e a sequência de aminoácidos (região 2-2) de prolina na 731a posição (P731) a treonina na 770a posição (T770) da SpCas9 do tipo selvagem.
[0759] A segunda região pode ser a sequência de aminoácidos (região 2-1) de metionina na 1a posição (M1) a treonina na 22a posição (T22) e a sequência de aminoácidos (região 2-3) de glutamina na 926a posição (Q926) a serina na 1040a posição (S1040) da SpCas9 do tipo selvagem.
[0760] A segunda região pode ser a sequência de aminoácidos (região 2-2) de prolina na 731a posição (P731) a treonina na 770a posição (T770) e a sequência de aminoácidos (região 2-3) de glutamina na 926a posição (Q926) a serina na 1040a posição (S1040) da SpCas9 do tipo selvagem.
[0761] A segunda região pode ser a sequência de aminoácidos (região 2-1) de metionina na 1a posição (M1) a treonina na 22a posição (T22), a sequência de aminoácidos (região 2-2) de prolina na 731a posição (P731) a treonina na 770a posição (T770) e a sequência de aminoácidos (região
2-3) de glutamina na 926a posição (Q926) a serina na 1040a posição (S1040) da SpCas9 do tipo selvagem.
[0762] A terceira região pode ser a sequência de aminoácidos (região 3-1) de lisina na 775a posição (K775) a leucina na 900a posição (L900) da SpCas9 do tipo selvagem.
[0763] A quarta região pode ser a sequência de aminoácidos (região 4-1) de ácido glutâmico na 1099a posição (E1099) a valina na 1139a posição (V1139) da SpCas9 do tipo selvagem.
[0764] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da primeira região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0765] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0766] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281 e I282 na região 1-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0767] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-2 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0768] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391 e L393 na região 1-2 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0769] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0770] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados de K510, L513, L514, Y515, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, E584, D585, F587, N588, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606 e L607 na região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0771] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0772] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I679, L680, F682,
L683, G687, F688, A689, N692, F693, M694, Q695, L696, I697 e H698 na região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0773] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de dois ou mais aminoácidos selecionados das sequências de aminoácidos da região 1-1 e da região 1-2 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0774] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391 e L393 na região 1-1 e na região 1-2 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0775] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de dois ou mais aminoácidos selecionados das sequências de aminoácidos da região 1-1 e da região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0776] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251,
N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, K510, L513, L514, Y515, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, E584, D585, F587, N588, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606 e L607 na região 1-1 e na região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0777] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de dois ou mais aminoácidos selecionados das sequências de aminoácidos da região 1-1 e da região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0778] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, N692, F693, M694, Q695, L696, I697 e H698 na região 1-1 e na região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0779] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de dois ou mais aminoácidos selecionados das sequências de aminoácidos da região 1-2 e da região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0780] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em P316, L317, A319,
M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, K510, L513, L514, Y515, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, E584, D585, F587, N588, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606 e L607 na região 1-2 e a região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0781] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de dois ou mais aminoácidos selecionados das sequências de aminoácidos da região 1-2 e da região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0782] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, N692, F693, M694, Q695, L696, I697 e H698 na região 1-2 e a região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0783] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de dois ou mais aminoácidos selecionados das sequências de aminoácidos da região 1-3 e da região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0784] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em K510, L513, L514, Y515, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, E584, D585, F587, N588, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, N692, F693, M694, Q695, L696, I697 e H698 na região 1-3 e na região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0785] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de três ou mais aminoácidos selecionados das sequências de aminoácidos da região 1-1, da região 1-2 e da região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0786] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de três ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, K510, L513, L514, Y515, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, E584, D585, F587, N588, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606 e L607 na região 1-1, na região 1-2 e na região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0787] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de três ou mais aminoácidos selecionados das sequências de aminoácidos da região 1-1, da região 1-2 e da região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0788] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de três ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, N692, F693, M694, Q695, L696, I697 e H698 na região 1-1, na região 1-2 e na região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0789] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de três ou mais aminoácidos selecionados das sequências de aminoácidos da região 1-1, da região 1-3 e da região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0790] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de três ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237,
G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, K510, L513, L514, Y515, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, E584, D585, F587, N588, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, N692, F693, M694, Q695, L696, I697 e H698 na região 1-1, na região 1-3 e na região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0791] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de três ou mais aminoácidos selecionados das sequências de aminoácidos da região 1-2, da região 1-3 e da região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0792] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de três ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, K510, L513, L514, Y515, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, E584, D585, F587, N588, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, N692, F693, M694, Q695, L696, I697 e H698 na região 1-2, na região 1-3 e na região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0793] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de quatro ou mais aminoácidos selecionados das sequências de aminoácidos da região 1-1, da região 1-2, da região 1-3 e da região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0794] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de quatro ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, K510, L513, L514, Y515, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, E584, D585, F587, N588, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, N692, F693, M694, Q695, L696, I697 e H698 na região 1-1, na região 1-2, na região 1-3 e na região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0795] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203; N277; G366; F539; ou I601 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0796] Em uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/N277 (A203 e N277); A203/G366; A203/F539; ou A203/I601 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0797] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de N277/G366; N277/F539; ou N277/I601 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0798] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de G366/F539; G366/I601; ou F539/I601 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0799] Em uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/N277/G366; A203/N277/F539; A203/N277/I601; A203/G366/F539; A203/G366/I601; A203/F539/I601; N277/G366/F539; N277/G366/I601; ou G366/F539/I601 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0800] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/N277/G366/F539; A203/N277/G366/I601; A203/N277/F539/I601; A203/G366/F539/I601; ou N277/G366/F539/I601 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0801] Ainda em uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/N277/G366/F539/I601 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0802] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da segunda região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0803] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 2-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0804] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20 e I21 na região 2-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0805] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0806] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766 e N767 na região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0807] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0808] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 e Y1039 na região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0809] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de dois ou mais aminoácidos selecionados das sequências de aminoácidos da região 2-1 e da região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0810] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766 e N767 na região 2-1 e na região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0811] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de dois ou mais aminoácidos selecionados das sequências de aminoácidos da região 2-1 e da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0812] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, I927, V931, A932, I934,
L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 e Y1039 na região 2-1 e na região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0813] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de dois ou mais aminoácidos selecionados das sequências de aminoácidos da região 2-2 e da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0814] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 e Y1039 na região 2-2 e na região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0815] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de três ou mais aminoácidos selecionados das sequências de aminoácidos da região 2-1, da região 2-2 e da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0816] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de três ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 e Y1039 na região 2-1, na região 2-2 e na região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0817] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de M763; D965; ou F1038 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0818] Em uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de M763/D965; M763/F1038; ou D965/F1038 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0819] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de M763/D965/F1038 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0820] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da terceira região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0821] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0822] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896 e D898 na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0823] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de K890 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0824] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0825] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0826] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em T1102, S1106, E1108,
S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138in a região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0827] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de T1102 ou D1127 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0828] Em uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de T1102/D1127 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0829] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de dois ou mais aminoácidos selecionados das sequências de aminoácidos da primeira região e da segunda região da SpCas9 do tipo selvagem.
Aqui, os dois ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0830] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-1, da região 1-2, da região 1-3 e/ou da região 1-4; e um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 2-1, da região 2-2 e/ou da região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0831] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278,
L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 e I697 na região 1-1, na região 1-2, na região 1-3 e/ou na região 1-4; e um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 e Y1039 na região 2-1, na região 2-2 ou na região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem, respectivamente.
[0832] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/M763; A203/D965; A203/F1038; A203/M763/D965; A203/M763/F1038; A203/D965/F1038; A203/M763/D965/F1038; N277/M763; N277/D965; N277/F1038; N277/M763/D965; N277/M763/F1038; N277/D965/F1038;
N277/M763/D965/F1038; G366/M763; G366/D965; G366/F1038; G366/M763/D965; G366/M763/F1038; G366/D965/F1038; G366/M763/D965/F1038; F539/M763; F539/D965; F539/F1038; F539/M763/D965; F539/M763/F1038; F539/D965/F1038; F539/M763/D965/F1038; I601/M763; I601/D965; I601/F1038; I601/M763/D965; I601/M763/F1038; I601/D965/F1038; ou I601/M763/D965/F1038 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0833] Em uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/N277/M763; A203/N277/D965; A203/N277/F1038; A203/N277/M763/D965; A203/N277/M763/F1038; A203/N277/D965/F1038; A203/N277/M763/D965/F1038; A203/G366/M763; A203/G366/D965; A203/G366/F1038; A203/G366/M763/D965; A203/G366/M763/F1038; A203/G366/D965/F1038; A203/G366/M763/D965/F1038; A203/F539/M763; A203/F539/D965; A203/F539/F1038; A203/F539/M763/D965; A203/F539/M763/F1038; A203/F539/D965/F1038; A203/F539/M763/D965/F1038; A203/I601/M763; A203/I601/D965; A203/I601/F1038; A203/I601/M763/D965; A203/I601/M763/F1038; A203/I601/D965/F1038; A203/I601/M763/D965/F1038; N277/G366/M763; N277/G366/D965; N277/G366/F1038; N277/G366/M763/D965; N277/G366/M763/F1038; N277/G366/D965/F1038; N277/G366/M763/D965/F1038; N277/F539/M763; N277/F539/D965; N277/F539/F1038; N277/F539/M763/D965; N277/F539/M763/F1038; N277/F539/D965/F1038; N277/F539/M763/D965/F1038; N277/I601/M763; N277/I601/D965; N277/I601/F1038;
N277/I601/M763/D965; N277/I601/M763/F1038; N277/I601/D965/F1038; N277/I601/M763/D965/F1038; G366/F539/M763; G366/F539/D965; G366/F539/F1038; G366/F539/M763/D965; G366/F539/M763/F1038; G366/F539/D965/F1038; G366/F539/M763/D965/F1038; G366/I601/M763; G366/I601/D965; G366/I601/F1038; G366/I601/M763/D965; G366/I601/M763/F1038; G366/I601/D965/F1038; G366/I601/M763/D965/F1038; F539/I601/M763; F539/I601/D965; F539/I601/F1038; F539/I601/M763/D965; F539/I601/M763/F1038; F539/I601/D965/F1038; ou F539/I601/M763/D965/F1038 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0834] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/N277/G366/M763; A203/N277/G366/D965; A203/N277/G366/F1038; A203/N277/G366/M763/D965; A203/N277/G366/M763/F1038; A203/N277/G366/D965/F1038; A203/N277/G366/M763/D965/F1038; A203/N277/F539/M763; A203/N277/F539/D965; A203/N277/F539/F1038; A203/N277/F539/M763/D965; A203/N277/F539/M763/F1038; A203/N277/F539/D965/F1038; A203/N277/F539/M763/D965/F1038; A203/N277/I601/M763; A203/N277/I601/D965; A203/N277/I601/F1038; A203/N277/I601/M763/D965; A203/N277/I601/M763/F1038; A203/N277/I601/D965/F1038; A203/N277/I601/M763/D965/F1038; A203/G366/F539/M763; A203/G366/F539/D965; A203/G366/F539/F1038; A203/G366/F539/M763/D965; A203/G366/F539/M763/F1038; A203/G366/F539/D965/F1038;
A203/G366/F539/M763/D965/F1038; A203/G366/I601/M763; A203/G366/I601/D965; A203/G366/I601/F1038; A203/G366/I601/M763/D965; A203/G366/I601/M763/F1038; A203/G366/I601/D965/F1038; A203/G366/I601/M763/D965/F1038; A203/F539/I601/M763; A203/F539/I601/D965; A203/F539/I601/F1038; A203/F539/I601/M763/D965; A203/F539/I601/M763/F1038; A203/F539/I601/D965/F1038; A203/F539/I601/M763/D965/F1038; N277/G366/F539/M763; N277/G366/F539/D965; N277/G366/F539/F1038; N277/G366/F539/M763/D965; N277/G366/F539/M763/F1038; N277/G366/F539/D965/F1038; N277/G366/F539/M763/D965/F1038; N277/G366/I601/M763; N277/G366/I601/D965; N277/G366/I601/F1038; N277/G366/I601/M763/D965; N277/G366/I601/M763/F1038; N277/G366/I601/D965/F1038; N277/G366/I601/M763/D965/F1038; G366/F539/I601/M763; G366/F539/I601/D965; G366/F539/I601/F1038; G366/F539/I601/M763/D965; G366/F539/I601/M763/F1038; G366/F539/I601/D965/F1038; ou G366/F539/I601/M763/D965/F1038 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0835] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/N277/G366/F539/M763; A203/N277/G366/F539/D965; A203/N277/G366/F539/F1038; A203/N277/G366/F539/M763/D965; A203/N277/G366/F539/M763/F1038; A203/N277/G366/F539/D965/F1038; A203/N277/G366/F539/M763/D965/F1038; A203/N277/G366/I601/M763; A203/N277/G366/I601/D965;
A203/N277/G366/I601/F1038; A203/N277/G366/I601/M763/D965; A203/N277/G366/I601/M763/F1038; A203/N277/G366/I601/D965/F1038; A203/N277/G366/I601/M763/D965/F1038; N277/G366/F539/I601/M763; N277/G366/F539/I601/D965; N277/G366/F539/I601/F1038; N277/G366/F539/I601/M763/D965; N277/G366/F539/I601/M763/F1038; N277/G366/F539/I601/D965/F1038; N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/M763; A203/N277/G366/F539/I601/D965; A203/N277/G366/F539/I601/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965; A203/N277/G366/F539/I601/M763/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/D965/F1038; ou A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0836] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de dois ou mais aminoácidos selecionados das sequências de aminoácidos da primeira região e da terceira região da SpCas9 do tipo selvagem.
Aqui, os dois ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0837] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-1, da região 1-2, da região 1-3 e/ou da região 1-4; e um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0838] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 e I697 na região 1-1, na região 1-2, na região 1-3 e/ou na região 1-4; e um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896 e D898 na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0839] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/K890; N277/K890; G366/K890; F539/K890; ou I601/K890 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0840] Em uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/N277/K890; A203/G366/K890; A203/F539/K890; A203/I601/K890; N277/G366/K890; N277/F539/K890; N277/I601/K890; G366/F539/K890; G366/I601/K890; ou F539/I601/K890 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0841] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/N277/G366/K890; A203/N277/F539/K890; A203/N277/I601/K890; A203/G366/F539/K890; A203/G366/I601/K890; A203/F539/I601/K890; N277/G366/F539/K890; N277/G366/I601/K890; ou G366/F539/I601/K890 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0842] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/N277/G366/F539/K890; A203/N277/G366/I601/K890; ou N277/G366/F539/I601/K890 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0843] Em uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/N277/G366/F539/I601/K890 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0844] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de dois ou mais aminoácidos selecionados das sequências de aminoácidos da primeira região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem. Aqui, os dois ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0845] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-1, da região 1-2, da região 1-3 e/ou da região 1-4; e um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0846] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 e I697 na região 1-1, na região 1-2, na região 1-3 e/ou na região 1-4; e um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0847] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/T1102; N277/T1102; G366/T1102; F539/T1102; I601/T1102; A203/D1127; N277/D1127; G366/D1127; F539/D1127; I601/D1127; A203/T1102/D1127; N277/T1102/D1127; G366/T1102/D1127; F539/T1102/D1127; ou I601/T1102/D1127 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0848] Em uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/N277/T1102; A203/G366/T1102; A203/F539/T1102; A203/I601/T1102; N277/G366/T1102; N277/F539/T1102; N277/I601/T1102; G366/F539/T1102; G366/I601/T1102; F539/I601/T1102; A203/N277/D1127; A203/G366/D1127; A203/F539/D1127; A203/I601/D1127; N277/G366/D1127; N277/F539/D1127; N277/I601/D1127; G366/F539/D1127; G366/I601/D1127; F539/I601/D1127; A203/N277/T1102/D1127; A203/G366/T1102/D1127; A203/F539/T1102/D1127; A203/I601/T1102/D1127; N277/G366/T1102/D1127; N277/F539/T1102/D1127; N277/I601/T1102/D1127; G366/F539/T1102/D1127; G366/I601/T1102/D1127; ou F539/I601/T1102/D1127 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0849] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/N277/G366/T1102;
A203/N277/F539/T1102; A203/N277/I601/T1102; A203/G366/F539/T1102; A203/G366/I601/T1102; A203/F539/I601/T1102; N277/G366/F539/T1102; N277/G366/I601/T1102; G366/F539/I601/T1102; A203/N277/G366/D1127; A203/N277/F539/D1127; A203/N277/I601/D1127; A203/G366/F539/D1127; A203/G366/I601/D1127; A203/F539/I601/D1127; N277/G366/F539/D1127; N277/G366/I601/D1127; G366/F539/I601/D1127; A203/N277/G366/T1102/D1127; A203/N277/F539/T1102/D1127; A203/N277/I601/T1102/D1127; A203/G366/F539/T1102/D1127; A203/G366/I601/T1102/D1127; A203/F539/I601/T1102/D1127; N277/G366/F539/T1102/D1127; N277/G366/I601/T1102/D1127; ou G366/F539/I601/T1102/D1127 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0850] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/N277/G366/F539/T1102; A203/N277/G366/I601/T1102; N277/G366/F539/I601/T1102; A203/N277/G366/F539/D1127; A203/N277/G366/I601/D1127; N277/G366/F539/I601/D1127; A203/N277/G366/F539/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/T1102/D1127; ou N277/G366/F539/I601/T1102/D1127 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0851] Em uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/N277/G366/F539/I601/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/D1127; ou A203/N277/G366/F539/I601/T1102/D1127 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0852] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de dois ou mais aminoácidos selecionados das sequências de aminoácidos da segunda região e da terceira região da SpCas9 do tipo selvagem.
Aqui, os dois ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0853] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados das sequências de aminoácidos da região 2-1, da região 2-2 e/ou da região 2-3; e um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0854] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 e Y1039 na região 2-1, na região 2-2 e/ou na região 2-3; e um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829,
R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896 e D898 na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0855] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de M763/K890; K890/D965; ou K890/F1038 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0856] Em uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de M763/K890/D965; M763/K890/F1038; ou K890/D965/F1038 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0857] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de M763/K890/D965/F1038 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0858] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de dois ou mais aminoácidos selecionados das sequências de aminoácidos da segunda região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem. Aqui, os dois ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0859] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 2-1, da região 2-2 e/ou da região 2-3; e um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0860] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 e Y1039 na região 2-1, na região 2-2 e/ou na região 2-3; e um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0861] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de M763/T1102; D965/T1102; F1038/T1102; M763/D1127; D965/D1127; F1038/D1127; M763/T1102/D1127; D965/T1102/D1127; ou F1038/T1102/D1127 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0862] Em uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de M763/D965/T1102; M763/F1038/T1102; D965/F1038/T1102; M763/D965/D1127; M763/F1038/D1127; D965/F1038/D1127; M763/D965/T1102/D1127; M763/F1038/T1102/D1127; ou D965/F1038/T1102/D1127 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0863] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de M763/D965/F1038/T1102; M763/D965/F1038/D1127; ou M763/D965/F1038/T1102/D1127 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0864] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de dois ou mais aminoácidos selecionados das sequências de aminoácidos da terceira região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem. Aqui, os dois ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0865] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos na região 3-1; e um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0866] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 e D898 na região 3-1; e um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0867] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de K890/T1102; K890/D1127; ou K890/T1102/D1127 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0868] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de três ou mais aminoácidos selecionados das sequências de aminoácidos da primeira região, da segunda região e da terceira região da SpCas9 do tipo selvagem. Aqui, os três ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0869] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-1, da região 1-2, da região 1-3 e/ou da região 1-4; um ou mais aminoácidos selecionados das sequências de aminoácidos da região 2-1, da região 2-2 e/ou da região 2-3; e um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0870] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376,
P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 e I697 na região 1-1, na região 1-2, na região 1-3 e/ou na região 1-4; um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 e Y1039 na região 2-1, na região 2-2 e/ou na região 2-3; e um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896 e D898 na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0871] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/M763/K890; A203/K890/D965; A203/K890/F1038; A203/M763/K890/D965; A203/M763/K890/F1038; A203/K890/D965/F1038; A203/M763/K890/D965/F1038; N277/M763/K890; N277/K890/D965; N277/K890/F1038; N277/M763/K890/D965; N277/M763/K890/F1038; N277/K890/D965/F1038; N277/M763//K890D965/F1038; G366/M763/K890; G366/K890/D965; G366/K890/F1038; G366/M763/K890/D965; G366/M763/K890/F1038; G366/K890/D965/F1038; G366/M763/K890/D965/F1038; F539/M763/K890; F539/K890/D965; F539/K890/F1038; F539/M763/K890/D965; F539/M763/K890/F1038; F539/K890/D965/F1038; F539/M763/K890/D965/F1038; I601/M763/K890; I601/K890/D965; I601/K890/F1038; I601/M763/K890/D965; I601/M763/K890/F1038; I601/K890/D965/F1038; ou I601/M763/K890/D965/F1038 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0872] Em uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/N277/M763/K890; A203/N277/K890/D965; A203/N277/K890/F1038; A203/N277/M763/K890/D965; A203/N277/M763/K890/F1038; A203/N277/K890/D965/F1038; A203/N277/M763/K890/D965/F1038; A203/G366/M763/K890; A203/G366/K890/D965; A203/G366/K890/F1038; A203/G366/M763/K890/D965; A203/G366/M763/K890/F1038; A203/G366/K890/D965/F1038; A203/G366/M763/K890/D965/F1038; A203/F539/M763/K890; A203/F539/K890/D965; A203/F539/K890/F1038; A203/F539/M763/K890/D965; A203/F539/M763/K890/F1038; A203/F539/K890/D965/F1038;
A203/F539/M763/K890/D965/F1038; A203/I601/M763/K890; A203/I601/K890/D965; A203/I601/K890/F1038; A203/I601/M763/K890/D965; A203/I601/M763/K890/F1038; A203/I601/K890/D965/F1038; A203/I601/M763/K890/D965/F1038; N277/G366/M763/K890; N277/G366/K890/D965; N277/G366/K890/F1038; N277/G366/M763/K890/D965; N277/G366/M763/K890/F1038; N277/G366/K890/D965/F1038; N277/G366/M763/K890/D965/F1038; N277/F539/M763/K890; N277/F539/K890/D965; N277/F539/K890/F1038; N277/F539/M763/K890/D965; N277/F539/M763/K890/F1038; N277/F539/K890/D965/F1038; N277/F539/M763/K890/D965/F1038; N277/I601/M763/K890; N277/I601/K890/D965; N277/I601/K890/F1038; N277/I601/M763/K890/D965; N277/I601/M763/K890/F1038; N277/I601/K890/D965/F1038; N277/I601/M763/K890/D965/F1038; G366/F539/M763/K890; G366/F539/K890/D965; G366/F539/K890/F1038; G366/F539/M763/K890/D965; G366/F539/M763/K890/F1038; G366/F539/K890/D965/F1038; G366/F539/M763/K890/D965/F1038; G366/I601/M763/K890; G366/I601/K890/D965; G366/I601/K890/F1038; G366/I601/M763/K890/D965; G366/I601/M763/K890/F1038; G366/I601/K890/D965/F1038; G366/I601/M763/K890/D965/F1038; F539/I601/M763/K890; F539/I601/K890/D965; F539/I601/K890/F1038; F539/I601/M763/K890/D965; F539/I601/M763/K890/F1038; F539/I601/K890/D965/F1038; ou F539/I601/M763/K890/D965/F1038 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0873] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da
SpCas9 formada pela modificação de
A203/N277/G366/M763/K890; A203/N277/G366/K890/D965;
A203/N277/G366/K890/F1038; A203/N277/G366/M763/K890/D965;
A203/N277/G366/M763/K890/F1038;
A203/N277/G366/K890/D965/F1038;
A203/N277/G366/M763/K890/D965/F1038;
A203/N277/F539/M763/K890; A203/N277/F539/K890/D965;
A203/N277/F539/K890/F1038; A203/N277/F539/M763/K890/D965;
A203/N277/F539/M763/K890/F1038;
A203/N277/F539/K890/D965/F1038;
A203/N277/F539/M763/K890/D965/F1038;
A203/N277/I601/M763/K890; A203/N277/I601/K890/D965;
A203/N277/I601/K890/F1038; A203/N277/I601/M763/K890/D965;
A203/N277/I601/M763/K890/F1038;
A203/N277/I601/K890/D965/F1038;
A203/N277/I601/M763/K890/D965/F1038;
A203/G366/F539/M763/K890; A203/G366/F539/K890/D965;
A203/G366/F539/K890/F1038; A203/G366/F539/M763/K890/D965;
A203/G366/F539/M763/K890/F1038;
A203/G366/F539/K890/D965/F1038;
A203/G366/F539/M763/K890/D965/F1038;
A203/G366/I601/M763/K890; A203/G366/I601/K890/D965;
A203/G366/I601/K890/F1038; A203/G366/I601/M763/K890/D965;
A203/G366/I601/M763/K890/F1038;
A203/G366/I601/K890/D965/F1038;
A203/G366/I601/M763/K890/D965/F1038;
A203/F539/I601/M763/K890; A203/F539/I601/K890/D965;
A203/F539/I601/K890/F1038; A203/F539/I601/M763/K890/D965;
A203/F539/I601/M763/K890/F1038; A203/F539/I601/K890/D965/F1038; A203/F539/I601/M763/K890/D965/F1038; N277/G366/F539/M763/K890; N277/G366/F539/K890/D965; N277/G366/F539/K890/F1038; N277/G366/F539/M763/K890/D965; N277/G366/F539/M763/K890/F1038; N277/G366/F539/K890/D965/F1038; N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038; N277/G366/I601/M763/K890; N277/G366/I601/K890/D965; N277/G366/I601/K890/F1038; N277/G366/I601/M763/K890/D965; N277/G366/I601/M763/K890/F1038; N277/G366/I601/K890/D965/F1038; N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038; G366/F539/I601/M763/K890; G366/F539/I601/K890/D965; G366/F539/I601/K890/F1038; G366/F539/I601/M763/K890/D965; G366/F539/I601/M763/K890/F1038; G366/F539/I601/K890/D965/F1038; ou G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0874] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/N277/G366/F539/M763/K890; A203/N277/G366/F539/K890/D965; A203/N277/G366/F539/K890/F1038; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965; A203/N277/G366/F539/M763/K890/F1038; A203/N277/G366/F539/K890/D965/F1038; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038;
A203/N277/G366/I601/M763/K890; A203/N277/G366/I601/K890/D965; A203/N277/G366/I601/K890/F1038; A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965; A203/N277/G366/I601/M763/K890/F1038; A203/N277/G366/I601/K890/D965/F1038; A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038; N277/G366/F539/I601/M763/K890; N277/G366/F539/I601/K890/D965; N277/G366/F539/I601/K890/F1038; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965; N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038; N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965; A203/N277/G366/F539/I601/K890/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038; ou A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0875] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de três ou mais aminoácidos selecionados de sequências de aminoácidos da primeira região, da segunda região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem. Aqui, os três ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0876] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 1-1, da região 1-2, da região 1-3 e/ou da região 1-4; um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 2-1, da região 2-2 e/ou da região 2-3; e um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0877] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 e I697 na região 1-1, na região 1-2, na região 1-3 e/ou na região 1-4; um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741,
V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 e Y1039 na região 2-1, na região 2-2 e/ou na região 2-3; e um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0878] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/M763/T1102; A203//D965T1102; A203//F1038T1102; A203/M763/D965/T1102; A203/M763/F1038/T1102; A203/D965/F1038/T1102; A203/M763/D965/F1038/T1102; N277/M763/T1102; N277/D965/T1102; N277/F1038/T1102; N277/M763/D965/T1102; N277/M763/F1038/T1102; N277/D965/F1038/T1102; N277/M763/D965/F1038/T1102; G366/M763/T1102; G366/D965/T1102; G366/F1038/T1102; G366/M763/D965/T1102; G366/M763/F1038/T1102; G366/D965/F1038/T1102; G366/M763/D965/F1038/T1102; F539/M763/T1102; F539/D965/T1102; F539/F1038/T1102; F539/M763/D965/T1102; F539/M763/F1038/T1102; F539/D965/F1038/T1102; F539/M763/D965/F1038/T1102; I601/M763/T1102; I601/D965/T1102; I601/F1038/T1102; I601/M763/D965/T1102;
I601/M763/F1038/T1102; I601/D965/F1038/T1102; I601/M763/D965/F1038/T1102; A203/M763/D1127; A203/D965/D1127; A203/F1038/D1127; A203/M763/D965/D1127; A203/M763/F1038/D1127; A203/D965/F1038/D1127; A203/M763/D965/F1038/D1127; N277/M763/D1127; N277/D965/D1127; N277/F1038/D1127; N277/M763/D965/D1127; N277/M763/F1038/D1127; N277/D965/F1038/D1127; N277/M763/D965/F1038/D1127; G366/M763/D1127; G366/D965/D1127; G366/F1038/D1127; G366/M763/D965/D1127; G366/M763/F1038/D1127; G366/D965/F1038/D1127; G366/M763/D965/F1038/D1127; F539/M763/D1127; F539/D965/D1127; F539/F1038/D1127; F539/M763/D965/D1127; F539/M763/F1038/D1127; F539/D965/F1038/D1127; F539/M763/D965/F1038/D1127; I601/M763/D1127; I601/D965/D1127; I601/F1038/D1127; I601/M763/D965/D1127; I601/M763/F1038D1127; I601/D965/F1038/D1127; ou I601/M763/D965/F1038/D1127 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0879] Em uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/M763/T1102/D1127; A203/D965/T1102/D1127; A203/F1038/T1102/D1127; A203/M763/D965/T1102/D1127; A203/M763/F1038/T1102/D1127; A203/D965/F1038/T1102/D1127; A203/M763/D965/F1038/T1102/D1127; N277/M763/T1102/D1127; N277/D965/T1102/D1127; N277/F1038/T1102/D1127; N277/M763/D965/T1102/D1127; N277/M763/F1038/T1102/D1127; N277/D965/F1038/T1102/D1127; N277/M763/D965/F1038/T1102/D1127; G366/M763/T1102/D1127;
G366/D965/T1102/D1127; G366/F1038/T1102/D1127; G366/M763/D965/T1102/D1127; G366/M763/F1038/T1102/D1127; G366/D965/F1038/T1102/D1127; G366/M763/D965/F1038/T1102/D1127; F539/M763/T1102/D1127; F539/D965/T1102/D1127; F539/F1038/T1102/D1127; F539/M763/D965/T1102/D1127; F539/M763/F1038/T1102/D1127; F539/D965/F1038/T1102/D1127; F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127; I601/M763/T1102/D1127; I601/D965/T1102/D1127; I601/F1038/T1102/D1127; I601/M763/D965/T1102/D1127; I601/M763/F1038T1102/D1127; I601/D965/F1038/T1102/D1127; ou I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0880] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/N277/M763/T1102; A203/N277/D965/T1102; A203/N277/F1038/T1102; A203/N277/M763/D965/T1102; A203/N277/M763/F1038/T1102; A203/N277/D965/F1038/T1102; A203/N277/M763/D965/F1038/T1102; A203/G366/M763/T1102; A203/G366/D965/T1102; A203/G366/F1038/T1102; A203/G366/M763/D965/T1102; A203/G366/M763/F1038/T1102; A203/G366/D965/F1038/T1102; A203/G366/M763/D965/F1038/T1102; A203/F539/M763/T1102; A203/F539/D965/T1102; A203/F539/F1038/T1102; A203/F539/M763/D965/T1102; A203/F539/M763/F1038/T1102; A203/F539/D965/F1038/T1102; A203/F539/M763/D965/F1038/T1102; A203/I601/M763/T1102; A203/I601/D965/T1102; A203/I601/F1038/T1102;
A203/I601/M763/D965/T1102; A203/I601/M763/F1038/T1102;
A203/I601/D965/F1038/T1102;
A203/I601/M763/D965/F1038/T1102; N277/G366/M763/T1102;
N277/G366/D965/T1102; N277/G366/F1038/T1102;
N277/G366/M763/D965/T1102; N277/G366/M763/F1038/T1102;
N277/G366/D965/F1038/T1102;
N277/G366/M763/D965/F1038/T1102; N277/F539/M763/T1102;
N277/F539/D965/T1102; N277/F539/F1038/T1102;
N277/F539/M763/D965/T1102; N277/F539/M763/F1038/T1102;
N277/F539/D965/F1038/T1102;
N277/F539/M763/D965/F1038/T1102; N277/I601/M763/T1102;
N277/I601/D965/T1102; N277/I601/F1038/T1102;
N277/I601/M763/D965/T1102; N277/I601/M763/F1038/T1102;
N277/I601/D965/F1038/T1102;
N277/I601/M763/D965/F1038/T1102; G366/F539/M763/T1102;
G366/F539/D965/T1102; G366/F539/F1038/T1102;
G366/F539/M763/D965/T1102; G366/F539/M763/F1038/T1102;
G366/F539/D965/F1038/T1102;
G366/F539/M763/D965/F1038/T1102; G366/I601/M763/T1102;
G366/I601/D965/T1102; G366/I601/F1038/T1102;
G366/I601/M763/D965/T1102; G366/I601/M763/F1038/T1102;
G366/I601/D965/F1038/T1102;
G366/I601/M763/D965/F1038/T1102; F539/I601/M763/T1102;
F539/I601/D965/T1102; F539/I601/F1038/T1102;
F539/I601/M763/D965/T1102; F539/I601/M763/F1038/T1102;
F539/I601/D965/F1038/T1102;
F539/I601/M763/D965/F1038/T1102; A203/N277/M763/D1127;
A203/N277/D965/D1127; A203/N277/F1038/D1127;
A203/N277/M763/D965/D1127; A203/N277/M763/F1038/D1127;
A203/N277/D965/F1038/D1127;
A203/N277/M763/D965/F1038/D1127; A203/G366/M763/D1127;
A203/G366/D965/D1127; A203/G366/F1038/D1127;
A203/G366/M763/D965/D1127; A203/G366/M763/F1038/D1127;
A203/G366/D965/F1038/D1127;
A203/G366/M763/D965/F1038/D1127; A203/F539/M763/D1127;
A203/F539/D965/D1127; A203/F539/F1038/D1127;
A203/F539/M763/D965/D1127; A203/F539/M763/F1038/D1127;
A203/F539/D965/F1038/D1127;
A203/F539/M763/D965/F1038/D1127; A203/I601/M763/D1127;
A203/I601/D965/D1127; A203/I601/F1038/D1127;
A203/I601/M763/D965/D1127; A203/I601/M763/F1038/D1127;
A203/I601/D965/F1038/D1127;
A203/I601/M763/D965/F1038/D1127; N277/G366/M763/D1127;
N277/G366/D965/D1127; N277/G366/F1038/D1127;
N277/G366/M763/D965/D1127; N277/G366/M763/F1038/D1127;
N277/G366/D965/F1038/D1127;
N277/G366/M763/D965/F1038/D1127; N277/F539/M763/D1127;
N277/F539/D965/D1127; N277/F539/F1038/D1127;
N277/F539/M763/D965/D1127; N277/F539/M763/F1038/D1127;
N277/F539/D965/F1038/D1127;
N277/F539/M763/D965/F1038/D1127; N277/I601/M763/D1127;
N277/I601/D965/D1127; N277/I601/F1038/D1127;
N277/I601/M763/D965/D1127; N277/I601/M763/F1038/D1127;
N277/I601/D965/F1038/D1127;
N277/I601/M763/D965/F1038/D1127; G366/F539/M763/D1127;
G366/F539/D965/D1127; G366/F539/F1038/D1127;
G366/F539/M763/D965/D1127; G366/F539/M763/F1038/D1127; G366/F539/D965/F1038/D1127; G366/F539/M763/D965/F1038/D1127; G366/I601/M763/D1127; G366/I601/D965/D1127; G366/I601/F1038/D1127; G366/I601/M763/D965/D1127; G366/I601/M763/F1038/D1127; G366/I601/D965/F1038/D1127; G366/I601/M763/D965/F1038/D1127; F539/I601/M763/D1127; F539/I601/D965/D1127; F539/I601/F1038/D1127; F539/I601/M763/D965/D1127; F539/I601/M763/F1038/D1127; F539/I601/D965/F1038/D1127; ou F539/I601/M763/D965/F1038/D1127 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0881] Em uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/N277/M763/T1102/D1127; A203/N277/D965/T1102/D1127; A203/N277/F1038/T1102/D1127; A203/N277/M763/D965/T1102/D1127; A203/N277/M763/F1038/T1102/D1127; A203/N277/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/M763/T1102/D1127; A203/G366/D965/T1102/D1127; A203/G366/F1038/T1102/D1127; A203/G366/M763/D965/T1102/D1127; A203/G366/M763/F1038/T1102/D1127; A203/G366/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/F539/M763/T1102/D1127; A203/F539/D965/T1102/D1127; A203/F539/F1038/T1102/D1127; A203/F539/M763/D965/T1102/D1127;
A203/F539/M763/F1038/T1102/D1127;
A203/F539/D965/F1038/T1102/D1127;
A203/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127;
A203/I601/M763/T1102/D1127; A203/I601/D965/T1102/D1127;
A203/I601/F1038/T1102/D1127;
A203/I601/M763/D965/T1102/D1127;
A203/I601/M763/F1038/T1102/D1127;
A203/I601/D965/F1038/T1102/D1127;
A203/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127;
N277/G366/M763/T1102/D1127; N277/G366/D965/T1102/D1127;
N277/G366/F1038/T1102/D1127;
N277/G366/M763/D965/T1102/D1127;
N277/G366/M763/F1038/T1102/D1127;
N277/G366/D965/F1038/T1102/D1127;
N277/G366/M763/D965/F1038/T1102/D1127;
N277/F539/M763/T1102/D1127; N277/F539/D965/T1102/D1127;
N277/F539/F1038/T1102/D1127;
N277/F539/M763/D965/T1102/D1127;
N277/F539/M763/F1038/T1102/D1127;
N277/F539/D965/F1038/T1102/D1127;
N277/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127;
N277/I601/M763/T1102/D1127; N277/I601/D965/T1102/D1127;
N277/I601/F1038/T1102/D1127;
N277/I601/M763/D965/T1102/D1127;
N277/I601/M763/F1038/T1102/D1127;
N277/I601/D965/F1038/T1102/D1127;
N277/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127;
G366/F539/M763/T1102/D1127; G366/F539/D965/T1102/D1127;
G366/F539/F1038/T1102/D1127; G366/F539/M763/D965/T1102/D1127; G366/F539/M763/F1038/T1102/D1127; G366/F539/D965/F1038/T1102/D1127; G366/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127; G366/I601/M763/T1102/D1127; G366/I601/D965/T1102/D1127; G366/I601/F1038/T1102/D1127; G366/I601/M763/D965/T1102/D1127; G366/I601/M763/F1038/T1102/D1127; G366/I601/D965/F1038/T1102/D1127; G366/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; F539/I601/M763/T1102/D1127; F539/I601/D965/T1102/D1127; F539/I601/F1038/T1102/D1127; F539/I601/M763/D965/T1102/D1127; F539/I601/M763/F1038/T1102/D1127; F539/I601/D965/F1038/T1102/D1127; ou F539/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0882] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/N277/G366/M763/T1102; A203/N277/G366/D965/T1102; A203/N277/G366/F1038/T1102; A203/N277/G366/M763/D965/T1102; A203/N277/G366/M763/F1038/T1102; A203/N277/G366/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/M763/D965/F1038/T1102; A203/N277/F539/M763/T1102; A203/N277/F539/D965/T1102; A203/N277/F539/F1038/T1102; A203/N277/F539/M763/D965/T1102;
A203/N277/F539/M763/F1038/T1102;
A203/N277/F539/D965/F1038/T1102;
A203/N277/F539/M763/D965/F1038/T1102;
A203/N277/I601/M763/T1102; A203/N277/I601/D965/T1102;
A203/N277/I601/F1038/T1102; A203/N277/I601/M763/D965/T1102;
A203/N277/I601/M763/F1038/T1102;
A203/N277/I601/D965/F1038/T1102;
A203/N277/I601/M763/D965/F1038/T1102;
A203/G366/F539/M763/T1102; A203/G366/F539/D965/T1102;
A203/G366/F539/F1038/T1102; A203/G366/F539/M763/D965/T1102;
A203/G366/F539/M763/F1038/T1102;
A203/G366/F539/D965/F1038/T1102;
A203/G366/F539/M763/D965/F1038/T1102;
A203/G366/I601/M763/T1102; A203/G366/I601/D965/T1102;
A203/G366/I601/F1038/T1102; A203/G366/I601/M763/D965/T1102;
A203/G366/I601/M763/F1038/T1102;
A203/G366/I601/D965/F1038/T1102;
A203/G366/I601/M763/D965/F1038/T1102;
A203/F539/I601/M763/T1102; A203/F539/I601/D965/T1102;
A203/F539/I601/F1038/T1102; A203/F539/I601/M763/D965/T1102;
A203/F539/I601/M763/F1038/T1102;
A203/F539/I601/D965/F1038/T1102;
A203/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102;
N277/G366/F539/M763/T1102; N277/G366/F539/D965/T1102;
N277/G366/F539/F1038/T1102; N277/G366/F539/M763/D965/T1102;
N277/G366/F539/M763/F1038/T1102;
N277/G366/F539/D965/F1038/T1102;
N277/G366/F539/M763/D965/F1038/T1102;
N277/G366/I601/M763/T1102; N277/G366/I601/D965/T1102;
N277/G366/I601/F1038/T1102; N277/G366/I601/M763/D965/T1102;
N277/G366/I601/M763/F1038/T1102;
N277/G366/I601/D965/F1038/T1102;
N277/G366/I601/M763/D965/F1038/T1102;
G366/F539/I601/M763/T1102; G366/F539/I601/D965/T1102;
G366/F539/I601/F1038/T1102; G366/F539/I601/M763/D965/T1102;
G366/F539/I601/M763/F1038/T1102;
G366/F539/I601/D965/F1038/T1102;
G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102;
A203/N277/G366/M763/D1127; A203/N277/G366/D965/D1127;
A203/N277/G366/F1038/D1127; A203/N277/G366/M763/D965/D1127;
A203/N277/G366/M763/F1038/D1127;
A203/N277/G366/D965/F1038/D1127;
A203/N277/G366/M763/D965/F1038/D1127;
A203/N277/F539/M763/D1127; A203/N277/F539/D965/D1127;
A203/N277/F539/F1038/D1127; A203/N277/F539/M763/D965/D1127;
A203/N277/F539/M763/F1038/D1127;
A203/N277/F539/D965/F1038/D1127;
A203/N277/F539/M763/D965/F1038/D1127;
A203/N277/I601/M763/D1127; A203/N277/I601/D965/D1127;
A203/N277/I601/F1038/D1127; A203/N277/I601/M763/D965/D1127;
A203/N277/I601/M763/F1038/D1127;
A203/N277/I601/D965/F1038/D1127;
A203/N277/I601/M763/D965/F1038/D1127;
A203/G366/F539/M763/D1127; A203/G366/F539/D965/D1127;
A203/G366/F539/F1038/D1127; A203/G366/F539/M763/D965/D1127;
A203/G366/F539/M763/F1038/D1127;
A203/G366/F539/D965/F1038/D1127;
A203/G366/F539/M763/D965/F1038/D1127;
A203/G366/I601/M763/D1127; A203/G366/I601/D965/D1127;
A203/G366/I601/F1038/D1127; A203/G366/I601/M763/D965/D1127;
A203/G366/I601/M763/F1038/D1127;
A203/G366/I601/D965/F1038/D1127;
A203/G366/I601/M763/D965/F1038/D1127;
A203/F539/I601/M763/D1127; A203/F539/I601/D965/D1127;
A203/F539/I601/F1038/D1127; A203/F539/I601/M763/D965/D1127;
A203/F539/I601/M763/F1038/D1127;
A203/F539/I601/D965/F1038/D1127;
A203/F539/I601/M763/D965/F1038/D1127;
N277/G366/F539/M763/D1127; N277/G366/F539/D965/D1127;
N277/G366/F539/F1038/D1127; N277/G366/F539/M763/D965/D1127;
N277/G366/F539/M763/F1038/D1127;
N277/G366/F539/D965/F1038/D1127;
N277/G366/F539/M763/D965/F1038/D1127;
N277/G366/I601/M763/D1127; N277/G366/I601/D965/D1127;
N277/G366/I601/F1038/D1127; N277/G366/I601/M763/D965/D1127;
N277/G366/I601/M763/F1038/D1127;
N277/G366/I601/D965/F1038/D1127;
N277/G366/I601/M763/D965/F1038/D1127;
G366/F539/I601/M763/D1127; G366/F539/I601/D965/D1127;
G366/F539/I601/F1038/D1127; G366/F539/I601/M763/D965/D1127;
G366/F539/I601/M763/F1038/D1127;
G366/F539/I601/D965/F1038/D1127; ou
G366/F539/I601/M763/D965/F1038/D1127 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0883] Em uma outra modalidade exemplificativa, a
TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/N277/G366/M763/T1102/D1127;
A203/N277/G366/D965/T1102/D1127;
A203/N277/G366/F1038/T1102/D1127;
A203/N277/G366/M763/D965/T1102/D1127;
A203/N277/G366/M763/F1038/T1102/D1127;
A203/N277/G366/D965/F1038/T1102/D1127;
A203/N277/G366/M763/D965/F1038/T1102/D1127;
A203/N277/F539/M763/T1102/D1127;
A203/N277/F539/D965/T1102/D1127;
A203/N277/F539/F1038/T1102/D1127;
A203/N277/F539/M763/D965/T1102/D1127;
A203/N277/F539/M763/F1038/T1102/D1127;
A203/N277/F539/D965/F1038/T1102/D1127;
A203/N277/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127;
A203/N277/I601/M763/T1102/D1127;
A203/N277/I601/D965/T1102/D1127;
A203/N277/I601/F1038/T1102/D1127;
A203/N277/I601/M763/D965/T1102/D1127;
A203/N277/I601/M763/F1038/T1102/D1127;
A203/N277/I601/D965/F1038/T1102/D1127;
A203/N277/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127;
A203/G366/F539/M763/T1102/D1127;
A203/G366/F539/D965/T1102/D1127;
A203/G366/F539/F1038/T1102/D1127;
A203/G366/F539/M763/D965/T1102/D1127;
A203/G366/F539/M763/F1038/T1102/D1127;
A203/G366/F539/D965/F1038/T1102/D1127;
A203/G366/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127;
A203/G366/I601/M763/T1102/D1127;
A203/G366/I601/D965/T1102/D1127;
A203/G366/I601/F1038/T1102/D1127;
A203/G366/I601/M763/D965/T1102/D1127;
A203/G366/I601/M763/F1038/T1102/D1127;
A203/G366/I601/D965/F1038/T1102/D1127;
A203/G366/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127;
A203/F539/I601/M763/T1102/D1127;
A203/F539/I601/D965/T1102/D1127;
A203/F539/I601/F1038/T1102/D1127;
A203/F539/I601/M763/D965/T1102/D1127;
A203/F539/I601/M763/F1038/T1102/D1127;
A203/F539/I601/D965/F1038/T1102/D1127;
A203/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127;
N277/G366/F539/M763/T1102/D1127;
N277/G366/F539/D965/T1102/D1127;
N277/G366/F539/F1038/T1102/D1127;
N277/G366/F539/M763/D965/T1102/D1127;
N277/G366/F539/M763/F1038/T1102/D1127;
N277/G366/F539/D965/F1038/T1102/D1127;
N277/G366/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127;
N277/G366/I601/M763/T1102/D1127;
N277/G366/I601/D965/T1102/D1127;
N277/G366/I601/F1038/T1102/D1127;
N277/G366/I601/M763/D965/T1102/D1127;
N277/G366/I601/M763/F1038/T1102/D1127;
N277/G366/I601/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/T1102/D1127; G366/F539/I601/D965/T1102/D1127; G366/F539/I601/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/D965/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/D965/F1038/T1102/D1127; ou G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0884] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/N277/G366/F539/M763/T1102; A203/N277/G366/F539/D965/T1102; A203/N277/G366/F539/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/D965/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/T1102; A203/N277/G366/I601/D965/T1102; A203/N277/G366/I601/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/D965/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/D965/F1038/T1102; N277/G366/F539/I601/M763/T1102; N277/G366/F539/I601/D965/T1102;
N277/G366/F539/I601/F1038/T1102;
N277/G366/F539/I601/M763/D965/T1102;
N277/G366/F539/I601/M763/F1038/T1102;
N277/G366/F539/I601/D965/F1038/T1102;
N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102;
A203/N277/G366/F539/I601/M763/T1102;
A203/N277/G366/F539/I601/D965/T1102;
A203/N277/G366/F539/I601/F1038/T1102;
A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/T1102;
A203/N277/G366/F539/I601/M763/F1038/T1102;
A203/N277/G366/F539/I601/D965/F1038/T1102;
A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102;
A203/N277/G366/F539/M763/D1127;
A203/N277/G366/F539/D965/D1127;
A203/N277/G366/F539/F1038/D1127;
A203/N277/G366/F539/M763/D965/D1127;
A203/N277/G366/F539/M763/F1038/D1127;
A203/N277/G366/F539/D965/F1038/D1127;
A203/N277/G366/F539/M763/D965/F1038/D1127;
A203/N277/G366/I601/M763/D1127;
A203/N277/G366/I601/D965/D1127;
A203/N277/G366/I601/F1038/D1127;
A203/N277/G366/I601/M763/D965/D1127;
A203/N277/G366/I601/M763/F1038/D1127;
A203/N277/G366/I601/D965/F1038/D1127;
A203/N277/G366/I601/M763/D965/F1038/D1127;
N277/G366/F539/I601/M763/D1127;
N277/G366/F539/I601/D965/D1127;
N277/G366/F539/I601/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/D965/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/D965/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/D965/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/D965/F1038/D1127; ou A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/D1127 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0885] Em uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/N277/G366/F539/M763/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/D965/F1038/T1102/D1127;
A203/N277/G366/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/D965/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/D965/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/D965/F1038/T1102/D1127; ou A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0886] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de três ou mais aminoácidos selecionados das sequências de aminoácidos da segunda região, da terceira região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem. Aqui, os três ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0887] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 2-1, da região 2-2 e/ou da região 2-3; um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 3-1; e um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0888] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 e Y1039 na região 2-1, na região 2-2 e/ou na região 2-3; um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 e D898 na região 3-1; e um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0889] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de M763/K890/T1102; K890/D965/T1102; K890/F1038/T1102; M763/K890/D1127; K890/D965/D1127; K890/F1038/D1127; M763/K890/T1102/D1127;
K890/D965/T1102/D1127; ou K890/F1038/T1102/D1127 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0890] Em uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de M763/K890/D965/T1102; M763/K890/F1038/T1102; K890/D965/F1038/T1102; M763/K890/D965/D1127; M763/K890/F1038/D1127; K890/D965/F1038/D1127; M763/K890/D965/T1102/D1127; M763/K890/F1038/T1102/D1127; ou K890/D965/F1038/T1102/D1127 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0891] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de M763/K890/D965/F1038/T1102; M763/K890/D965/F1038/D1127 ou M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0892] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de três ou mais aminoácidos selecionados das sequências de aminoácidos da primeira região, da segunda região, da terceira região e da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem. Aqui, os três ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0893] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 2-1, da região 2-2 e/ou da região 2-3; um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 3-1; e um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0894] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 e I697 na região 1-1, na região 1-2, na região 1-3 e/ou na região 1-4; um ou mais aminoácidos I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 e Y1039 na região
2-1, na região 2-2 e/ou na região 2-3; um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 e D898 na região 3-1; e um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0895] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/M763/K890/T1102; A203/K890/D965/T1102; A203/K890/F1038/T1102; A203/M763/K890/D965/T1102; A203/M763/K890/F1038/T1102; A203/K890/D965/F1038/T1102; A203/M763/K890/D965/F1038/T1102; N277/M763/K890/T1102; N277/K890/D965/T1102; N277/K890/F1038/T1102; N277/M763/K890/D965/T1102; N277/M763/K890/F1038/T1102; N277/K890/D965/F1038/T1102; N277/M763//K890D965/F1038/T1102; G366/M763/K890/T1102; G366/K890/D965/T1102; G366/K890/F1038/T1102; G366/M763/K890/D965/T1102; G366/M763/K890/F1038/T1102; G366/K890/D965/F1038/T1102; G366/M763/K890/D965/F1038/T1102; F539/M763/K890/T1102; F539/K890/D965/T1102; F539/K890/F1038/T1102; F539/M763/K890/D965/T1102; F539/M763/K890/F1038/T1102; F539/K890/D965/F1038/T1102; F539/M763/K890/D965/F1038/T1102; I601/M763/K890/T1102;
I601/K890/D965/T1102; I601/K890/F1038/T1102; I601/M763/K890/D965/T1102; I601/M763/K890/F1038/T1102; I601/K890/D965/F1038/T1102; I601/M763/K890/D965/F1038/T1102; A203/M763/K890/D1127; A203/K890/D965/D1127; A203/K890/F1038/D1127; A203/M763/K890/D965/D1127; A203/M763/K890/F1038/D1127; A203/K890/D965/F1038/D1127; A203/M763/K890/D965/F1038/D1127; N277/M763/K890/D1127; N277/K890/D965/D1127; N277/K890/F1038/D1127; N277/M763/K890/D965/D1127; N277/M763/K890/F1038/D1127; N277/K890/D965/F1038/D1127; N277/M763//K890D965/F1038/D1127; G366/M763/K890/D1127; G366/K890/D965/D1127; G366/K890/F1038/D1127; G366/M763/K890/D965/D1127; G366/M763/K890/F1038/D1127; G366/K890/D965/F1038/D1127; G366/M763/K890/D965/F1038/D1127; F539/M763/K890/D1127; F539/K890/D965/D1127; F539/K890/F1038/D1127; F539/M763/K890/D965/D1127; F539/M763/K890/F1038/D1127; F539/K890/D965/F1038/D1127; F539/M763/K890/D965/F1038/D1127; I601/M763/K890/D1127; I601/K890/D965/D1127; I601/K890/F1038/D1127; I601/M763/K890/D965/D1127; I601/M763/K890/F1038/D1127; I601/K890/D965/F1038/D1127; ou I601/M763/K890/D965/F1038/D1127 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0896] Em uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/M763/K890/T1102/D1127; A203/K890/D965/T1102/D1127; A203/K890/F1038/T1102/D1127;
A203/M763/K890/D965/T1102/D1127;
A203/M763/K890/F1038/T1102/D1127;
A203/K890/D965/F1038/T1102/D1127;
A203/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127;
N277/M763/K890/T1102/D1127; N277/K890/D965/T1102/D1127;
N277/K890/F1038/T1102/D1127;
N277/M763/K890/D965/T1102/D1127;
N277/M763/K890/F1038/T1102/D1127;
N277/K890/D965/F1038/T1102/D1127;
N277/M763//K890D965/F1038/T1102/D1127;
G366/M763/K890/T1102/D1127; G366/K890/D965/T1102/D1127;
G366/K890/F1038/T1102/D1127;
G366/M763/K890/D965/T1102/D1127;
G366/M763/K890/F1038/T1102/D1127;
G366/K890/D965/F1038/T1102/D1127;
G366/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127;
F539/M763/K890/T1102/D1127; F539/K890/D965/T1102/D1127;
F539/K890/F1038/T1102/D1127;
F539/M763/K890/D965/T1102/D1127;
F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127;
F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127;
F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127;
I601/M763/K890/T1102/D1127; I601/K890/D965/T1102/D1127;
I601/K890/F1038/T1102/D1127;
I601/M763/K890/D965/T1102/D1127;
I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127;
I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; ou
I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0897] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/N277/M763/K890/T1102; A203/N277/K890/D965/T1102; A203/N277/K890/F1038/T1102; A203/N277/M763/K890/D965/T1102; A203/N277/M763/K890/F1038/T1102; A203/N277/K890/D965/F1038/T1102; A203/N277/M763/K890/D965/F1038/T1102; A203/G366/M763/K890/T1102; A203/G366/K890/D965/T1102; A203/G366/K890/F1038/T1102; A203/G366/M763/K890/D965/T1102; A203/G366/M763/K890/F1038/T1102; A203/G366/K890/D965/F1038/T1102; A203/G366/M763/K890/D965/F1038/T1102; A203/F539/M763/K890/T1102; A203/F539/K890/D965/T1102; A203/F539/K890/F1038/T1102; A203/F539/M763/K890/D965/T1102; A203/F539/M763/K890/F1038/T1102; A203/F539/K890/D965/F1038/T1102; A203/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102; A203/I601/M763/K890/T1102; A203/I601/K890/D965/T1102; A203/I601/K890/F1038/T1102; A203/I601/M763/K890/D965/T1102; A203/I601/M763/K890/F1038/T1102; A203/I601/K890/D965/F1038/T1102; A203/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102; N277/G366/M763/K890/T1102; N277/G366/K890/D965/T1102; N277/G366/K890/F1038/T1102; N277/G366/M763/K890/D965/T1102; N277/G366/M763/K890/F1038/T1102; N277/G366/K890/D965/F1038/T1102;
N277/G366/M763/K890/D965/F1038/T1102;
N277/F539/M763/K890/T1102; N277/F539/K890/D965/T1102;
N277/F539/K890/F1038/T1102; N277/F539/M763/K890/D965/T1102;
N277/F539/M763/K890/F1038/T1102;
N277/F539/K890/D965/F1038/T1102;
N277/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102;
N277/I601/M763/K890/T1102; N277/I601/K890/D965/T1102;
N277/I601/K890/F1038/T1102; N277/I601/M763/K890/D965/T1102;
N277/I601/M763/K890/F1038/T1102;
N277/I601/K890/D965/F1038/T1102;
N277/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102;
G366/F539/M763/K890/T1102; G366/F539/K890/D965/T1102;
G366/F539/K890/F1038/T1102; G366/F539/M763/K890/D965/T1102;
G366/F539/M763/K890/F1038/T1102;
G366/F539/K890/D965/F1038/T1102;
G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102;
G366/I601/M763/K890/T1102; G366/I601/K890/D965/T1102;
G366/I601/K890/F1038/T1102; G366/I601/M763/K890/D965/T1102;
G366/I601/M763/K890/F1038/T1102;
G366/I601/K890/D965/F1038/T1102;
G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102;
F539/I601/M763/K890/T1102; F539/I601/K890/D965/T1102;
F539/I601/K890/F1038/T1102; F539/I601/M763/K890/D965/T1102;
F539/I601/M763/K890/F1038/T1102;
F539/I601/K890/D965/F1038/T1102;
F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102;
A203/N277/M763/K890/D1127; A203/N277/K890/D965/D1127;
A203/N277/K890/F1038/D1127; A203/N277/M763/K890/D965/D1127;
A203/N277/M763/K890/F1038/D1127;
A203/N277/K890/D965/F1038/D1127;
A203/N277/M763/K890/D965/F1038/D1127;
A203/G366/M763/K890/D1127; A203/G366/K890/D965/D1127;
A203/G366/K890/F1038/D1127; A203/G366/M763/K890/D965/D1127;
A203/G366/M763/K890/F1038/D1127;
A203/G366/K890/D965/F1038/D1127;
A203/G366/M763/K890/D965/F1038/D1127;
A203/F539/M763/K890/D1127; A203/F539/K890/D965/D1127;
A203/F539/K890/F1038/D1127; A203/F539/M763/K890/D965/D1127;
A203/F539/M763/K890/F1038/D1127;
A203/F539/K890/D965/F1038/D1127;
A203/F539/M763/K890/D965/F1038/D1127;
A203/I601/M763/K890/D1127; A203/I601/K890/D965/D1127;
A203/I601/K890/F1038/D1127; A203/I601/M763/K890/D965/D1127;
A203/I601/M763/K890/F1038/D1127;
A203/I601/K890/D965/F1038/D1127;
A203/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127;
N277/G366/M763/K890/D1127; N277/G366/K890/D965/D1127;
N277/G366/K890/F1038/D1127; N277/G366/M763/K890/D965/D1127;
N277/G366/M763/K890/F1038/D1127;
N277/G366/K890/D965/F1038/D1127;
N277/G366/M763/K890/D965/F1038/D1127;
N277/F539/M763/K890/D1127; N277/F539/K890/D965/D1127;
N277/F539/K890/F1038/D1127; N277/F539/M763/K890/D965/D1127;
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N277/I601/M763/K890/D1127; N277/I601/K890/D965/D1127; N277/I601/K890/F1038/D1127; N277/I601/M763/K890/D965/D1127; N277/I601/M763/K890/F1038/D1127; N277/I601/K890/D965/F1038/D1127; N277/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127; G366/F539/M763/K890/D1127; G366/F539/K890/D965/D1127; G366/F539/K890/F1038/D1127; G366/F539/M763/K890/D965/D1127; G366/F539/M763/K890/F1038/D1127; G366/F539/K890/D965/F1038/D1127; G366/F539/M763/K890/D965/F1038/D1127; G366/I601/M763/K890/D1127; G366/I601/K890/D965/D1127; G366/I601/K890/F1038/D1127; G366/I601/M763/K890/D965/D1127; G366/I601/M763/K890/F1038/D1127; G366/I601/K890/D965/F1038/D1127; G366/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127; F539/I601/M763/K890/D1127; F539/I601/K890/D965/D1127; F539/I601/K890/F1038/D1127; F539/I601/M763/K890/D965/D1127; F539/I601/M763/K890/F1038/D1127; F539/I601/K890/D965/F1038/D1127; ou F539/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0898] Em uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/N277/M763/K890/T1102/D1127; A203/N277/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/M763/K890/F1038/T1102/D1127;
A203/N277/K890/D965/F1038/T1102/D1127;
A203/N277/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127;
A203/G366/M763/K890/T1102/D1127;
A203/G366/K890/D965/T1102/D1127;
A203/G366/K890/F1038/T1102/D1127;
A203/G366/M763/K890/D965/T1102/D1127;
A203/G366/M763/K890/F1038/T1102/D1127;
A203/G366/K890/D965/F1038/T1102/D1127;
A203/G366/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127;
A203/F539/M763/K890/T1102/D1127;
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G366/F539/K890/F1038/T1102/D1127;
G366/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127;
G366/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127;
G366/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127;
G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127;
G366/I601/M763/K890/T1102/D1127;
G366/I601/K890/D965/T1102/D1127;
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G366/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127;
G366/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127;
G366/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; F539/I601/M763/K890/T1102/D1127; F539/I601/K890/D965/T1102/D1127; F539/I601/K890/F1038/T1102/D1127; F539/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; F539/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; F539/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; ou F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0899] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/N277/G366/M763/K890/T1102; A203/N277/G366/K890/D965/T1102; A203/N277/G366/K890/F1038/T1102; A203/N277/G366/M763/K890/D965/T1102; A203/N277/G366/M763/K890/F1038/T1102; A203/N277/G366/K890/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/M763/K890/D965/F1038/T1102; A203/N277/F539/M763/K890/T1102; A203/N277/F539/K890/D965/T1102; A203/N277/F539/K890/F1038/T1102; A203/N277/F539/M763/K890/D965/T1102; A203/N277/F539/M763/K890/F1038/T1102; A203/N277/F539/K890/D965/F1038/T1102; A203/N277/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102; A203/N277/I601/M763/K890/T1102; A203/N277/I601/K890/D965/T1102;
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A203/N277/F539/K890/D965/D1127;
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A203/F539/I601/M763/K890/D1127;
A203/F539/I601/K890/D965/D1127;
A203/F539/I601/K890/F1038/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/D965/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/F1038/D1127; A203/F539/I601/K890/D965/F1038/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/D1127; N277/G366/F539/K890/D965/D1127; N277/G366/F539/K890/F1038/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/D965/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/F1038/D1127; N277/G366/F539/K890/D965/F1038/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/D1127; N277/G366/I601/K890/D965/D1127; N277/G366/I601/K890/F1038/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/D965/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/F1038/D1127; N277/G366/I601/K890/D965/F1038/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/D1127; G366/F539/I601/K890/D965/D1127; G366/F539/I601/K890/F1038/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/D965/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/F1038/D1127; G366/F539/I601/K890/D965/F1038/D1127; ou G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0900] Em uma outra modalidade exemplificativa, a
TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/N277/G366/M763/K890/T1102/D1127;
A203/N277/G366/K890/D965/T1102/D1127;
A203/N277/G366/K890/F1038/T1102/D1127;
A203/N277/G366/M763/K890/D965/T1102/D1127;
A203/N277/G366/M763/K890/F1038/T1102/D1127;
A203/N277/G366/K890/D965/F1038/T1102/D1127;
A203/N277/G366/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127;
A203/N277/F539/M763/K890/T1102/D1127;
A203/N277/F539/K890/D965/T1102/D1127;
A203/N277/F539/K890/F1038/T1102/D1127;
A203/N277/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127;
A203/N277/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127;
A203/N277/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127;
A203/N277/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127;
A203/N277/I601/M763/K890/T1102/D1127;
A203/N277/I601/K890/D965/T1102/D1127;
A203/N277/I601/K890/F1038/T1102/D1127;
A203/N277/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127;
A203/N277/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127;
A203/N277/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127;
A203/N277/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127;
A203/G366/F539/M763/K890/T1102/D1127;
A203/G366/F539/K890/D965/T1102/D1127;
A203/G366/F539/K890/F1038/T1102/D1127;
A203/G366/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127;
A203/G366/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127;
A203/G366/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127;
A203/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127;
A203/G366/I601/M763/K890/T1102/D1127;
A203/G366/I601/K890/D965/T1102/D1127;
A203/G366/I601/K890/F1038/T1102/D1127;
A203/G366/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127;
A203/G366/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127;
A203/G366/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127;
A203/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127;
A203/F539/I601/M763/K890/T1102/D1127;
A203/F539/I601/K890/D965/T1102/D1127;
A203/F539/I601/K890/F1038/T1102/D1127;
A203/F539/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127;
A203/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127;
A203/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127;
A203/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127;
N277/G366/F539/M763/K890/T1102/D1127;
N277/G366/F539/K890/D965/T1102/D1127;
N277/G366/F539/K890/F1038/T1102/D1127;
N277/G366/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127;
N277/G366/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127;
N277/G366/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127;
N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127;
N277/G366/I601/M763/K890/T1102/D1127;
N277/G366/I601/K890/D965/T1102/D1127;
N277/G366/I601/K890/F1038/T1102/D1127;
N277/G366/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127;
N277/G366/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127;
N277/G366/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127;
N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/T1102/D1127; G366/F539/I601/K890/D965/T1102/D1127; G366/F539/I601/K890/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; ou G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0901] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/N277/G366/F539/M763/K890/T1102; A203/N277/G366/F539/K890/D965/T1102; A203/N277/G366/F539/K890/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/K890/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/K890/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/K890/T1102; A203/N277/G366/I601/K890/D965/T1102; A203/N277/G366/I601/K890/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/K890/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/K890/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102; N277/G366/F539/I601/M763/K890/T1102; N277/G366/F539/I601/K890/D965/T1102; N277/G366/F539/I601/K890/F1038/T1102;
N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/T1102;
N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102;
N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102;
N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102;
A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/T1102;
A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/T1102;
A203/N277/G366/F539/I601/K890/F1038/T1102;
A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/T1102;
A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102;
A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102;
A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102;
A203/N277/G366/F539/M763/K890/D1127;
A203/N277/G366/F539/K890/D965/D1127;
A203/N277/G366/F539/K890/F1038/D1127;
A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/D1127;
A203/N277/G366/F539/M763/K890/F1038/D1127;
A203/N277/G366/F539/K890/D965/F1038/D1127;
A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/D1127;
A203/N277/G366/I601/M763/K890/D1127;
A203/N277/G366/I601/K890/D965/D1127;
A203/N277/G366/I601/K890/F1038/D1127;
A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/D1127;
A203/N277/G366/I601/M763/K890/F1038/D1127;
A203/N277/G366/I601/K890/D965/F1038/D1127;
A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127;
N277/G366/F539/I601/M763/K890/D1127;
N277/G366/F539/I601/K890/D965/D1127;
N277/G366/F539/I601/K890/F1038/D1127;
N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/D1127; ou A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0902] Em uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada pela modificação de A203/N277/G366/F539/M763/K890/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/K890/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127;
N277/G366/F539/I601/M763/K890/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/D965/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; ou A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127 da SpCas9 do tipo selvagem.
[0903] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada por remover um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da primeira região, da segunda região, da terceira região e/ou da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0904] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada por remover um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337,
L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 e I697 na primeira região; I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 e Y1039 na segunda região; K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896 e D898 na terceira região; e/ou T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 na quarta região da SpCas9 do tipo selvagem.
[0905] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da primeira região, da segunda região, da terceira região e/ou da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácidos diferentes.
[0906] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da primeira região da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácidos diferentes.
[0907] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se um ou mais aminoácidos selecionados de N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 e I697 na região 1-1, na região 1-2, na região 1-3 e/ou na região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo um índice de hidropatia relativamente baixo.
[0908] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se A203 (índice de hidropatia: 1,8) na região 1-1 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido selecionado do grupo consistindo em aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente baixo, tal como arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, lisina, prolina, serina, treonina, triptofano e tirosina.
[0909] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se A203 (índice de hidropatia: 1,8) na região 1-1 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente baixo, tal como ácido aspártico (índice de hidropatia: -3,5).
[0910] Em uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se G366 (índice de hidropatia: -0,4) na região 1-2 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido selecionado do grupo consistindo em aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente baixo, tal como arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutâmico, glutamina, histidina, lisina, prolina, serina, treonina, triptofano e tirosina.
[0911] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se G366 (índice de hidropatia: -0,4) na região 1-2 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente baixo, tal como serina (índice de hidropatia: -0,8).
[0912] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se F539 (índice de hidropatia: 2,8) na região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido selecionado do grupo consistindo em aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente baixo, tal como alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, lisina, metionina, prolina, serina, treonina, triptofano e tirosina.
[0913] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se F539 (índice de hidropatia: 2,8) na região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente baixo, tal como serina (índice de hidropatia: -0,8).
[0914] Em uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se I601 (índice de hidropatia: 4,5) na região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido selecionado do grupo consistindo em aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente baixo, tal como alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina.
[0915] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se I601 (índice de hidropatia: 4,5) na região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente baixo, tal como asparagina (índice de hidropatia: -3,5).
[0916] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se A203 (índice de hidropatia: 1,8), G366 (índice de hidropatia: -0,4), F539 (índice de hidropatia: 2,8) e I601 (índice de hidropatia: 4,5) na região 1-1, na região 1-2, na região 1-3 e/ou na região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente baixo, respectivamente.
[0917] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se A203(índice de hidropatia: 1,8) na região 1-1 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente baixo, tal como ácido aspártico (índice de hidropatia: -3,5), substituindo-se G366 (índice de hidropatia: -0,4) na região 1-2 da mesma por um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente baixo, tal como serina (índice de hidropatia: -0,8), substituindo-se F539 (índice de hidropatia: 2,8) na região 1-3 da mesma por um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente baixo, tal como serina (índice de hidropatia: -0,8), e substituindo-se I601 (índice de hidropatia: 4,5) na região 1-3 da mesma por um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente baixo, tal como asparagina (índice de hidropatia: -3,5).
[0918] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 e I697 na região 1-1, na região 1-2, na região 1-3 e/ou na região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo um índice de hidropatia relativamente alto.
[0919] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se N277 (índice de hidropatia: -3,5) na região 1-1 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido selecionado do grupo consistindo em aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente alto, tal como alanina, cisteína, glicina, histidina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina.
[0920] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se N277 (índice de hidropatia: -3,5) na região 1-1 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente alto, tal como histidina (índice de hidropatia: -3,2).
[0921] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 e I697 na região 1-1, na região 1-2, na região 1-3 e/ou na região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente baixo ou alto.
[0922] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se A203 (índice de hidropatia: 1,8), N277
(índice de hidropatia: -3,5), G366 (índice de hidropatia: - 0,4), F539 (índice de hidropatia: 2,8) e I601 (índice de hidropatia: 4,5) na região 1-1, na região 1-2, na região 1- 3 e/ou na região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente baixo ou alto, respectivamente.
[0923] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se A203 (índice de hidropatia: 1,8) na região 1-1 da SpCas9 do tipo selvagem por ácido aspártico (índice de hidropatia: -3,5), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente baixo, substituindo-se N277 (índice de hidropatia: -3,5) na região 1-1 da SpCas9 do tipo selvagem por histidina (índice de hidropatia: -3,2), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente alto, substituindo-se G366 (índice de hidropatia: -0,4) na região 1-2 por serina (índice de hidropatia: -0,8), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente baixo, substituindo-se F539 (índice de hidropatia: 2,8) na região 1-3 por serina (índice de hidropatia: -0,8), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente baixo, e substituindo-se I601 (índice de hidropatia: 4,5) na região 1-3 por asparagina (índice de hidropatia: -3,5), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente baixo.
[0924] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N199, I201, N202, A203, G205, V206,
A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 e I697 na região 1-1, na região 1-2, na região 1-3 e/ou na região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo um grupo funcional relativamente pequeno.
[0925] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se F539 na região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido selecionado do grupo consistindo em alanina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, prolina, serina, treonina e valina, que são aminoácidos tendo um grupo funcional relativamente pequeno.
[0926] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se F539 na região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem por asparagina, que é um aminoácido tendo um grupo funcional relativamente pequeno.
[0927] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 e I697 na região 1-1, na região 1-2, na região 1-3 e/ou na região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo um grupo funcional relativamente grande.
[0928] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se A203 na região 1-1 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido selecionado do grupo consistindo em arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina, que são aminoácidos tendo um grupo funcional relativamente grande.
[0929] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se A203 na região 1-1 da SpCas9 do tipo selvagem por ácido aspártico, que é um aminoácido tendo um grupo funcional relativamente grande.
[0930] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 e I697 na região 1-1, na região 1-2, na região 1-3 e/ou na região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo um grupo funcional relativamente pequeno ou grande.
[0931] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se A203, N277, G366, F539 e I601 na região 1-
1, na região 1-2, na região 1-3 e/ou na região 1-4 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácidos tendo um grupo funcional relativamente pequeno ou grande.
[0932] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se A203 e N277 na região 1-1, G366 na região 1-2, e I601 na região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem por ácido aspártico, histidina, serina e asparagina, que são aminoácidos tendo um grupo funcional relativamente grande, respectivamente, e substituindo-se F539 na região 1-3 por serina, que tem um grupo funcional relativamente pequeno.
[0933] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da segunda região da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácidos diferentes.
[0934] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 e Y1039 na região 2-1, na região 2-2 e/ou na região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo um índice de hidropatia relativamente alto.
[0935] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se M763 (índice de hidropatia: 1,9) na região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido selecionado do grupo consistindo em cisteína, isoleucina, leucina, fenilalanina e valina, que são aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente alto.
[0936] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se M763 (índice de hidropatia: 1,9) na região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem por isoleucina (índice de hidropatia: 4,5), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente alto.
[0937] Em uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se D965 (índice de hidropatia: -3,5) na região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido selecionado do grupo consistindo em alanina, cisteína, glicina, histidina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina, que são aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente alto.
[0938] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se D965 (índice de hidropatia: -3,5) na região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem por tirosina (índice de hidropatia: -1,3), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente alto.
[0939] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se M763 (índice de hidropatia: 1,9) e D965 (índice de hidropatia: -3,5) na região 2-1, na região 2-2 e/ou na região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo um índice de hidropatia relativamente alto.
[0940] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se M763 (índice de hidropatia: 1,9) na região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem por isoleucina (índice de hidropatia: 4,5), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente alto, e substituindo-se D965 (índice de hidropatia: -3,5) na região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem por tirosina (índice de hidropatia: -1,3), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente alto.
[0941] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009,
G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 e Y1039 na região 2-1, na região 2-2 e/ou na região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente baixo.
[0942] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se F1037 e/ou F1038 na região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido selecionado do grupo consistindo em arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, lisina, metionina, prolina, serina, treonina, triptofano e tirosina, que são aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente baixo.
[0943] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se F1038 (índice de hidropatia: 2,8) na região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem por tirosina (índice de hidropatia: -1,3), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente baixo.
[0944] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se F1037 (índice de hidropatia: 2,8) na região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem por arginina (índice de hidropatia: -4,5), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente baixo.
[0945] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 e Y1039 na região 2-1, na região 2-2 e/ou na região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo um índice de hidropatia relativamente baixo ou alto.
[0946] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se M763 (índice de hidropatia: 1,9), D965 (índice de hidropatia: -3,5) e F1038 (índice de hidropatia: 2,8) na região 2-1, na região 2-2 e/ou na região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente baixo ou alto.
[0947] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se M763 (índice de hidropatia: 1,9) na região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem por isoleucina (índice de hidropatia: 4,5), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente alto, substituindo-se D965 (índice de hidropatia: -3,5) na região 2-3 por tirosina (índice de hidropatia: -1,3), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente alto, e substituindo-se F1038 (índice de hidropatia: 2,8) na região 2-3 por tirosina (índice de hidropatia: -1,3), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente baixo.
[0948] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da terceira região da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido diferente.
[0949] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896 e D898 na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo um índice de hidropatia relativamente alto.
[0950] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se K890 (índice de hidropatia: -3,9) na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido selecionado do grupo consistindo em alanina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina, que são aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente alto.
[0951] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se K890 (índice de hidropatia: -3,9) na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem por asparagina (índice de hidropatia: -3,5), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente alto.
[0952] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896 e D898 na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) não carregado(s).
[0953] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se K890 na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem por um aminoácido selecionado do grupo consistindo em alanina, asparagina, cisteína, glutamina, glicina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina, que são aminoácidos não carregados.
[0954] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se K890 na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem com glutamina, que é um aminoácido não carregado.
[0955] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se K890 na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem por asparagina, que é um aminoácido não carregado.
[0956] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896 e D898 na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem por aminoácido(s) tendo um grupo funcional relativamente pequeno.
[0957] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se K890 e/ou K896 na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em alanina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glicina, isoleucina, leucina, prolina, serina, treonina e valina, que são aminoácidos tendo um grupo funcional relativamente pequeno.
[0958] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se K890 na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem com ácido aspártico, que é um aminoácido tendo um grupo funcional relativamente pequeno.
[0959] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se K896 na região
3-1 da SpCas9 do tipo selvagem com asparagina, que é um aminoácido tendo um grupo funcional relativamente pequeno.
[0960] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos na quarta região da SpCas9 do tipo selvagem com aminoácidos diferentes.
[0961] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com aminoácido(s) tendo um índice de hidropatia relativamente baixo.
[0962] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se T1102 na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutâmico, glutamina, lisina, prolina, serina, triptofano e tirosina, que são aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente baixo.
[0963] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se T1102 (índice de hidropatia: -0,7) na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com prolina (índice de hidropatia: -1,6) tendo um índice de hidropatia relativamente baixo.
[0964] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em T1102, S1106, E1108, S1116, D1117,
D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com aminoácido(s) tendo um índice de hidropatia relativamente alto.
[0965] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se S1106 na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em alanina, cisteína, glicina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, treonina e valina, que são aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente alto.
[0966] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se S1106 (índice de hidropatia: -0,8) na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com glicina (índice de hidropatia: -0,4), que tem um índice de hidropatia relativamente alto.
[0967] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente baixo ou alto.
[0968] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se T1102 e S1136 na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente baixo ou alto.
[0969] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se T1102 (índice de hidropatia: -0,7) na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com prolina (índice de hidropatia: -1,6), que tem um índice de hidropatia relativamente baixo, e substituindo-se S1106 (índice de hidropatia: -0,8) da SpCas9 do tipo selvagem com glicina (índice de hidropatia: -0,4) tendo um índice de hidropatia relativamente alto.
[0970] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com aminoácido(s) tendo um grupo funcional relativamente pequeno.
[0971] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se T1102 na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido tendo um grupo funcional relativamente pequeno.
[0972] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se T1102 na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com prolina tendo um grupo funcional relativamente pequeno.
[0973] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido tendo um grupo funcional relativamente grande.
[0974] Em uma modalidade exemplificativa, a TS-
SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se D1127 na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido tendo um grupo funcional relativamente grande.
[0975] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se D1127 na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com ácido glutâmico tendo um grupo funcional relativamente grande.
[0976] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 e T1138 na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com aminoácidos tendo um grupo funcional relativamente pequeno ou grande.
[0977] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se T1102 e D1127 na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com aminoácidos tendo um grupo funcional relativamente pequeno ou grande.
[0978] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se T1102 na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com prolina tendo um grupo funcional relativamente pequeno, e substituindo-se D1127 na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com ácido glutâmico tendo um grupo funcional relativamente grande.
[0979] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se dois ou mais aminoácidos selecionados de as sequências de aminoácidos da primeira região, da segunda região, da terceira região e/ou a quarta região da SpCas9 do tipo selvagem com aminoácidos diferentes. Aqui, os dois ou mais aminoácidos podem estar presentes em diferentes regiões, respectivamente.
[0980] Aqui, a descrições na substituição de um ou mais aminoácidos selecionados nas diferentes regiões são as mesmas como descrito acima.
[0981] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da primeira região; e um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da segunda região da SpCas9 do tipo selvagem com aminoácidos diferentes, respectivamente.
[0982] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se F539 (índice de hidropatia: 2,8) na região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, lisina, metionina, prolina, serina, treonina, triptofano e tirosina, que são aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente baixo; e substituindo-se M763 (índice de hidropatia: 1,9) e/ou A764 (índice de hidropatia: 1,8) na região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em cisteína, isoleucina, leucina, fenilalanina e valina, que são aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente alto.
[0983] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se F539 (índice de hidropatia: 2,8) na região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem com serina (índice de hidropatia: -0,8), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente baixo, e substituindo-se M763 (índice de hidropatia: 1,9) na região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem com isoleucina (índice de hidropatia: 4,5) tendo um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente alto.
[0984] Em uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se I601 (índice de hidropatia: 4,5) na região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina, que são aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente baixo; e substituindo-se D965 (índice de hidropatia: -3,5) na região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em alanina, cisteína, glicina, histidina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina, que são aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente alto.
[0985] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se I601 (índice de hidropatia: 4,5) na região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem com asparagina (índice de hidropatia: -3,5), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente baixo, e substituindo-se D965 (índice de hidropatia: -3,5) na região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem com tirosina (índice de hidropatia: -1,3), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente alto.
[0986] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se A203 (índice de hidropatia: 1,8) na região 1-1 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, lisina, prolina, serina, treonina, triptofano e tirosina, que são aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente baixo; e substituindo-se M763 (índice de hidropatia: 1,9) e/ou A764 (índice de hidropatia: 1,8) na região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em cisteína, isoleucina, leucina, fenilalanina e valina, que são aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente alto.
[0987] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se A203 (índice de hidropatia: 1,8) na região 1-1 da SpCas9 do tipo selvagem com ácido aspártico (índice de hidropatia: -3,5), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente baixo, e M763 (índice de hidropatia: 1,9) na região 2-2 da
SpCas9 do tipo selvagem com isoleucina (índice de hidropatia: 4,5), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente alto.
[0988] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da primeira região da SpCas9 do tipo selvagem; e um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da terceira região da SpCas9 do tipo selvagem com aminoácidos diferentes, respectivamente.
[0989] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se F539 (índice de hidropatia: 2,8) na região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, lisina, metionina, prolina, serina, treonina, triptofano e tirosina, que são aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente baixo; e substituindo-se K890 na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em alanina, asparagina, cisteína, glutamina, glicina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina, que são aminoácidos não carregados.
[0990] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se F539 (índice de hidropatia: 2,8) na região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem com serina (índice de hidropatia: -0,8), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente baixo, e substituindo-se K890 na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem com asparagina, que é um aminoácido não carregado.
[0991] Em uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se F539 e/ou I601 na região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutâmico, glutamina, histidina, lisina, serina, treonina e tirosina, que são aminoácidos polares; e substituindo-se K890 (índice de hidropatia: -3,9) na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em alanina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina, que são aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente alto.
[0992] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se F539 e I601 na região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem com treonina e ácido glutâmico, que são aminoácidos polares, respectivamente, e substituindo-se K890 (índice de hidropatia: -3,9) na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem com asparagina (índice de hidropatia: -3,5), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente alto.
[0993] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos na primeira região da SpCas9 do tipo selvagem e um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos na quarta região da SpCas9 do tipo selvagem com aminoácidos diferentes, respectivamente.
[0994] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se A203 (índice de hidropatia: 1,8) na região 1-1 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, lisina, prolina, serina, treonina, triptofano e tirosina, que são aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente baixo; e substituindo-se T1102 na região 4-1 com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutâmico, glutamina, lisina, prolina, serina, triptofano e tirosina, que são aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente baixo.
[0995] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se A203 (índice de hidropatia: 1,8) na região 1-1 da SpCas9 do tipo selvagem com ácido aspártico (índice de hidropatia: -3,5), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente baixo, e substituindo-se T1102 (índice de hidropatia: -0,7) na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com prolina (índice de hidropatia: -1,6) tendo um índice de hidropatia relativamente baixo.
[0996] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se F539 (índice de hidropatia: 2,8) na região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, lisina, metionina, prolina, serina, treonina, triptofano e tirosina, que são aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente baixo; e substituindo-se D1127 na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido tendo um grupo funcional relativamente grande.
[0997] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se F539 (índice de hidropatia: 2,8) na região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem com serina (índice de hidropatia: -0,8), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente baixo, e substituindo-se D1127 na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com ácido glutâmico tendo um grupo funcional relativamente grande.
[0998] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos na segunda região da SpCas9 do tipo selvagem; e um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos na terceira região da SpCas9 do tipo selvagem com aminoácidos diferentes, respectivamente.
[0999] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se M763 (índice de hidropatia: 1,9) e/ou A764 (índice de hidropatia: 1,8) na região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em cisteína, isoleucina, leucina, fenilalanina e valina, que são aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente alto; e substituindo-se K890 na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em alanina, asparagina, cisteína, glutamina, glicina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina, que são aminoácidos não carregados.
[1000] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se M763 (índice de hidropatia: 1,9) na região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem com isoleucina (índice de hidropatia: 4,5), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente alto, e substituindo-se K890 na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem com asparagina, que é um aminoácido não carregado.
[1001] Em uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se F1037 e/ou F1038 na região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutâmico, glutamina, histidina, lisina, serina, treonina e tirosina, que são aminoácidos polares; e substituindo-se K890 (índice de hidropatia: -3,9) na região 3-1 com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em alanina,
asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina, que são aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente alto.
[1002] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se F1038 na região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem com tirosina, que é um aminoácido polar, e substituindo-se K890 (índice de hidropatia: -3,9) na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem com asparagina (índice de hidropatia: -3,5), que é um aminoácido tendo um high índice de hidropatia.
[1003] Em uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se M763 (índice de hidropatia: 1,9) e/ou A764 (índice de hidropatia: 1,8) na região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em cisteína, isoleucina, leucina, fenilalanina e valina, que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente alto; substituindo-se F1037 e/ou F1038 na região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutâmico, glutamina, histidina, lisina, serina, treonina e tirosina, que são aminoácidos polares; e substituindo-se K890 na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em alanina, asparagina, cisteína, glutamina, glicina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina,
prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina, que são aminoácidos não carregados.
[1004] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se M763 (índice de hidropatia: 1,9) na região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem com isoleucina (índice de hidropatia: 4,5), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente alto, substituindo-se F1038 na região 2-3 com tirosina, que é um aminoácido polar, e substituindo-se K890 na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem com asparagina, que é um aminoácido não carregado.
[1005] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da segunda região da SpCas9 do tipo selvagem; e um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da quarta região da SpCas9 do tipo selvagem com aminoácidos diferentes, respectivamente.
[1006] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se M763 (índice de hidropatia: 1,9) e/ou A764 (índice de hidropatia: 1,8) na região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em cisteína, isoleucina, leucina, fenilalanina e valina, que são aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente alto; e substituindo-se T1102 na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutâmico, glutamina, lisina, prolina, serina,
triptofano e tirosina, que são aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente baixo.
[1007] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se M763 (índice de hidropatia: 1,9) na região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem com isoleucina (índice de hidropatia: 4,5), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente alto, e substituindo-se T1102 (índice de hidropatia: -0,7) na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com prolina (índice de hidropatia: -1,6) tendo um índice de hidropatia relativamente baixo.
[1008] Em uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se F1037 e/ou F1038 na região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutâmico, glutamina, histidina, lisina, serina, treonina e tirosina, que são aminoácidos polares; e substituindo-se D1127 na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido tendo um grupo funcional relativamente grande.
[1009] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se F1038 na região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem com tirosina, que é um aminoácido polar, e substituindo-se D1127 na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com ácido glutâmico tendo um grupo funcional relativamente grande.
[1010] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da terceira região da SpCas9 do tipo selvagem; e um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da quarta região com aminoácidos diferentes, respectivamente.
[1011] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se K890 na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em alanina, asparagina, cisteína, glutamina, glicina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina, que são aminoácidos não carregados; e substituindo-se T1102 na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutâmico, glutamina, lisina, prolina, serina, triptofano e tirosina, que são aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente baixo.
[1012] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se K890 na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem com asparagina, que é um aminoácido não carregado, e substituindo-se T1102(índice de hidropatia: -0,7) na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com prolina (índice de hidropatia: -1,6) tendo um índice de hidropatia relativamente baixo.
[1013] Em uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se K890 (índice de hidropatia: -3,9) na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em alanina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina, que são aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente alto; e substituindo-se D1127 na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido tendo um grupo funcional relativamente grande.
[1014] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se K890 (índice de hidropatia: -3,9) na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem com asparagina (índice de hidropatia: -3,5), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente alto, e substituindo-se D1127 na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com ácido glutâmico tendo um grupo funcional relativamente grande.
[1015] A TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se um ou mais aminoácidos selecionados da sequência de aminoácidos da primeira região da SpCas9 do tipo selvagem; um ou mais aminoácidos selecionados na sequência de aminoácidos da segunda região da SpCas9 do tipo selvagem; e/ou um ou mais aminoácidos selecionados na sequência de aminoácidos da terceira região da SpCas9 do tipo selvagem com aminoácidos diferentes, respectivamente.
[1016] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se F539 (índice de hidropatia: 2,8) na região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, lisina, metionina, prolina, serina, treonina, triptofano e tirosina, que são aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente baixo; substituindo-se M763 (índice de hidropatia: 1,9) e/ou A764(índice de hidropatia: 1,8) na região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em cisteína, isoleucina, leucina, fenilalanina e valina, que são aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente alto; e substituindo-se K890 (índice de hidropatia: -3,9) na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em alanina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina, que são aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente alto.
[1017] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se F539 (índice de hidropatia: 2,8) na região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem com serina (índice de hidropatia: -0,8), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente baixo, substituindo-se M763 (índice de hidropatia: 1,9) na região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem com isoleucina (índice de hidropatia: 4,5), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente alto, e substituindo-se
K890 (índice de hidropatia: -3,9) na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem com asparagina (índice de hidropatia: - 3,5), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente alto.
[1018] Em uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se F539 e/ou I601 na região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem; e F1037 e/ou F1038 na região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutâmico, glutamina, histidina, lisina, serina, treonina e tirosina, que são aminoácidos polares, respectivamente; substituindo-se K890 na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em alanina, asparagina, cisteína, glutamina, glicina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina, que são aminoácidos não carregados; e substituindo-se T1102 na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutâmico, glutamina, lisina, prolina, serina, triptofano e tirosina, que são aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente baixo.
[1019] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se F539 na região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem com serina, que é um aminoácido polar, substituindo-se F1038 na região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem com tirosina, que é um aminoácido polar, substituindo-se K890 na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem com asparagina, que é um aminoácido não carregado, e substituindo-se T1102 na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com prolina (índice de hidropatia: -1,6), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente baixo.
[1020] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se I601 na região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem com ácido glutâmico, que é um aminoácido polar, substituindo-se F1038 na região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem com tirosina, que é um aminoácido polar, K890 na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem com asparagina, que é um aminoácido não carregado, e substituindo-se T1102 na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com prolina (índice de hidropatia: -1,6), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente baixo.
[1021] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se F539 e I601 na região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem com serina e asparagina, que são aminoácidos polares, respectivamente, substituindo-se F1038 na região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem com tirosina, que é um aminoácido polar, substituindo-se K890 na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem com asparagina, que é um aminoácido não carregado, e substituindo-se T1102 na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com prolina (índice de hidropatia: -1,6), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente baixo.
[1022] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se F539 e/ou I601 na região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutâmico, glutamina, histidina, lisina, serina, treonina e tirosina, que são aminoácidos polares, respectivamente; substituindo-se M763 (índice de hidropatia: 1,9) e/ou A764 (índice de hidropatia: 1,8) na região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em cisteína, isoleucina, leucina, fenilalanina e valina, que são aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente alto; e substituindo- se K890 na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em alanina, asparagina, cisteína, glutamina, glicina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina, que são aminoácidos não carregados.
[1023] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se I601 na região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem com asparagina, que é um aminoácido polar, substituindo-se M763 (índice de hidropatia: 1,9) na região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem com isoleucina (índice de hidropatia: 4,5), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente alto, e substituindo-se K890 na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem com asparagina, que é um aminoácido não carregado.
[1024] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se F539 e I601 na região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem com serina e asparagina, que são aminoácidos polares, respectivamente, substituindo-se M763 (índice de hidropatia: 1,9) na região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem com isoleucina (índice de hidropatia: 4,5), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente alto, e substituindo-se K890 na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem com asparagina, que é um aminoácido não carregado.
[1025] Em uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se A203 (índice de hidropatia: 1,8) na região 1-1 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, lisina, prolina, serina, treonina, triptofano e tirosina, que são aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente baixo; substituindo-se M763 (índice de hidropatia: 1,9) e/ou A764 (índice de hidropatia: 1,8) na região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em cisteína, isoleucina, leucina, fenilalanina e valina, que são aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente alto; e substituindo- se K890 na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em alanina,
asparagina, cisteína, glutamina, glicina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina, que são aminoácidos não carregados.
[1026] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se A203 (índice de hidropatia: 1,8) na região 1-1 da SpCas9 do tipo selvagem com ácido aspártico (índice de hidropatia: -3,5), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente baixo, substituindo-se M763 (índice de hidropatia: 1,9) na região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem com isoleucina (índice de hidropatia: 4,5), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente alto, substituindo-se F1038 na região 2-3 com tirosina, que é um aminoácido polar, e substituindo-se K890 na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem com asparagina, que é um aminoácido não carregado.
[1027] Ainda em uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se I601 (índice de hidropatia: 4,5) na região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina, que são aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente baixo; substituindo-se D965 (índice de hidropatia: -3,5) na região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em alanina, cisteína, glicina, histidina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina, que são aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente alto; e substituindo-se T1102 na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutâmico, glutamina, lisina, prolina, serina, triptofano e tirosina, que são aminoácidos tendo um índice de hidropatia relativamente baixo.
[1028] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se I601 (índice de hidropatia: 4,5) na região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem com asparagina (índice de hidropatia: -3,5), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente baixo, substituindo-se M763 (índice de hidropatia: 1,9) na região 2-2 da SpCas9 do tipo selvagem com isoleucina (índice de hidropatia: 4,5), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente alto, substituindo-se D965 (índice de hidropatia: -3,5) na região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem com tirosina (índice de hidropatia: -1,3), que é um aminoácido tendo um índice de hidropatia relativamente alto, e substituindo-se T1102 (índice de hidropatia: -0,7) na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com prolina (índice de hidropatia: -1,6) tendo um índice de hidropatia relativamente baixo.
[1029] Em uma modalidade exemplificativa, a TS-
SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em A203 e N277 na região 1-1, G366 na região 1-2, e F539 e I601 na região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem com aminoácido(s) tendo um grupo funcional relativamente pequeno ou grande; substituindo-se um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em M763 na região 2-2 e D956 e F1038 na região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem com aminoácido(s) tendo um grupo funcional relativamente pequeno ou grande; substituindo-se K890 na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido não carregado; e substituindo-se um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em T1102 e D1127 na região 4-1 da SpCas9 do tipo selvagem com aminoácido(s) tendo um grupo funcional relativamente pequeno ou grande.
[1030] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se G366 na região 1-2, e F539 e I601 na região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem com serina (aminoácido tendo um grupo funcional relativamente grande), serina (aminoácido tendo um grupo funcional relativamente pequeno) e asparagina (aminoácido tendo um grupo funcional relativamente grande), respectivamente, substituindo-se M763 na região 2-2 e F1038 na região 2-3 com isoleucina (aminoácido tendo um grupo funcional relativamente pequeno) e tirosina (aminoácido tendo um grupo funcional relativamente grande), respectivamente, substituindo-se K890 na região 3-1 com asparagina não carregada, e substituindo-se D1127 na região
4-1 com ácido glutâmico tendo um grupo funcional relativamente grande.
[1031] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se A203 e N277 na região 1-1, G366 na região 1-2, e F539 e I601 na região 1-3 da SpCas9 do tipo selvagem com ácido aspártico (aminoácido tendo um grupo funcional relativamente grande), histidina (aminoácido tendo um grupo funcional relativamente grande), serina (aminoácido tendo um grupo funcional relativamente grande), serina (aminoácido tendo um grupo funcional relativamente pequeno) e asparagina (aminoácido tendo um grupo funcional relativamente grande), respectivamente, substituindo-se M763 na região 2-2 e D956 e F1038 na região 2-3 da SpCas9 do tipo selvagem com isoleucina (aminoácido tendo um grupo funcional relativamente pequeno), tirosina (aminoácido tendo um grupo funcional relativamente grande) e tirosina (aminoácido tendo um grupo funcional relativamente grande), respectivamente, substituindo-se K890 na região 3-1 da SpCas9 do tipo selvagem com asparagina não carregada, e substituindo-se T1102 e D1127 na região 4-1 com prolina (aminoácido tendo um grupo funcional relativamente pequeno) e ácido glutâmico (aminoácido tendo um grupo funcional relativamente grande), respectivamente.
[1032] Como um exemplo da TS-SpCas9 aqui divulgado, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se F539, M763 e/ou K890 da SpCas9 do tipo selvagem com aminoácidos diferentes.
[1033] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se F539 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, lisina, metionina, prolina, serina, treonina, triptofano e tirosina.
[1034] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se F539 da SpCas9 do tipo selvagem com serina. Aqui, a TS-SpCas9 (F539S) formada substituindo-se F539 com serina pode ser uma variante da SpCas9 em que a interação entre o domínio de REC da SpCas9 (F539S) e uma sequência alvo e/ou a extremidade distal do PAM do gRNA pode ser alterada, comparada à SpCas9 do tipo selvagem.
[1035] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se M763 da SpCas9 do tipo selvagem com um aminoácido selecionado do grupo consistindo em cisteína, isoleucina, leucina, fenilalanina e valina.
[1036] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se M763 da SpCas9 do tipo selvagem com isoleucina. Aqui, a TS-SpCas9 (F539S) formada substituindo-se M763 com isoleucina pode ser uma variante da SpCas9 em que a interação entre o domínio de RuvC da SpCas9(M763I) e um metal pode ser alterada, comparada à SpCas9 do tipo selvagem.
[1037] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se K890 da SpCas9 do tipo selvagem com alanina, asparagina, cisteína, glutamina, glicina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina.
[1038] Por exemplo, a SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se K890 da SpCas9 do tipo selvagem com asparagina. Aqui, a TS-SpCas9 (K890N) formada substituindo-se K890 com asparagina pode ser uma variante da SpCas9 em que a interação entre o domínio de HNH da SpCas9 (K890N) e um metal é alterada, comparada à SpCas9 do tipo selvagem.
[1039] Em uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se F539 e M763 da SpCas9 do tipo selvagem com aminoácidos diferentes dos originais, respectivamente.
[1040] Aqui, os aminoácidos diferentes dos originais podem ser aminoácidos selecionados do grupo consistindo em alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, lisina, metionina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina, isoleucina, leucina, fenilalanina e valina.
[1041] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se F539 e M763 da SpCas9 do tipo selvagem com serina e isoleucina, respectivamente. Aqui, a TS-SpCas9 (F539S, M763I) em que as
F539 e M763 são substituídas por serina e isoleucina, respectivamente, podem ser uma variante da SpCas9 em que a interação entre o domínio de REC da SpCas9 (F539S, M763I) e uma sequência alvo e/ou a extremidade distal do PAM do gRNA e a interação entre o domínio de RuvC da SpCas9 (F539S, M763I) e um metal são alteradas, comparadas à SpCas9 do tipo selvagem.
[1042] Em ainda uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se F539 e K890 da SpCas9 do tipo selvagem com aminoácidos diferentes dos aminoácidos originais.
[1043] Aqui, os aminoácidos diferentes dos aminoácidos originais podem ser aminoácidos selecionados do grupo consistindo em alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, lisina, metionina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina, isoleucina, leucina, fenilalanina e valina.
[1044] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se F539 e K890 da SpCas9 do tipo selvagem com serina e asparagina, respectivamente. Aqui, a TS-SpCas9 (F539S, K890N) formada substituindo-se F539 e K890 com serina e asparagina, respectivamente, pode ser uma variante da SpCas9 em que a interação entre o domínio de REC da SpCas9 (F539S, K890N) e uma sequência alvo e/ou a extremidade distal do PAM do gRNA, e a interação entre o domínio de HNH da SpCas9
(F539S, K890N) e um metal são alteradas, comparadas à SpCas9 do tipo selvagem.
[1045] Em uma outra modalidade exemplificativa, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se M763 e K890 da SpCas9 do tipo selvagem com aminoácidos diferentes dos originais.
[1046] Aqui, os aminoácidos diferentes dos originais podem ser aminoácidos selecionados do grupo consistindo em alanina, asparagina, cisteína, glutamina, glicina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina.
[1047] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se M763 e K890 da SpCas9 do tipo selvagem com isoleucina e asparagina, respectivamente. Aqui, TS-SpCas9 (M763I, K890N) formada substituindo-se as M763 e K890 com isoleucina e asparagina, respectivamente, pode ser uma variante da SpCas9 em que a interação entre o domínio de RuvC da SpCas9 (M763I, K890N) e um metal, e a interação entre o domínio de HNH da SpCas9 (M763I, K890N) e um metal são alteradas, comparadas à SpCas9 do tipo selvagem.
[1048] Em uma modalidade exemplificativa, a TS- SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se F539, M763 e K890 da SpCas9 do tipo selvagem com aminoácidos diferentes dos originais.
[1049] Aqui, os aminoácidos diferentes dos originais podem ser aminoácidos selecionados do grupo consistindo em alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, lisina, metionina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina, isoleucina, leucina, fenilalanina e valina.
[1050] Por exemplo, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 (SEQ ID NO: 11) formada substituindo-se F539, M763 e K890 da SpCas9 do tipo selvagem com serina, isoleucina e asparagina. Aqui, a TS-SpCas9 (F539S, M763I, K890N) formada substituindo-se F539, M763 e K890 com serina, isoleucina e asparagina, respectivamente, pode ser uma variante da SpCas9 em que a interação entre o domínio de REC da SpCas9 (F539S, M763I, K890N) e uma sequência alvo e/ou a extremidade distal do PAM do gRNA, e a interação entre o domínio de RuvC da SpCas9 (F539S, M763I, K890N) e um metal, e a interação entre o domínio de HNH da SpCas9 (F539S, M763I, K890N) e um metal são alteradas, comparadas à SpCas9 do tipo selvagem.
[1051] Em uma modalidade exemplificativa da divulgação aqui divulgada, a Cas9 artificialmente modificada pode ser uma proteína de fusão.
[1052] A proteína de fusão pode ser uma proteína artificialmente produzida incluindo Cas9 alvo específica e um ou mais domínios funcionais.
[1053] As descrições da Cas9 alvo específica foram fornecidas acima.
[1054] As descrições dos domínios funcionais foram fornecidas acima.
[1055] Por exemplo, a proteína de fusão pode ser uma proteína artificialmente produzida incluindo TS-SpCas9 e uma desaminase.
[1056] Aqui, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se D10, F539, M763 e K890 da SpCas9 do tipo selvagem com aminoácidos diferentes dos originais, respectivamente.
[1057] Alternativamente, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se F539, M763, H840 e K890 da SpCas9 do tipo selvagem com aminoácidos diferentes dos originais, respectivamente.
[1058] Alternativamente, a TS-SpCas9 pode ser uma variante da SpCas9 formada substituindo-se D10, F539, M763, H840 e K890 da SpCas9 do tipo selvagem com aminoácidos diferentes dos originais, respectivamente.
[1059] Aqui, a desaminase pode ser uma adenina desaminase e/ou uma citidina desaminase.
[1060] Aqui, a proteína de fusão pode ser uma proteína artificialmente produzida na forma em que uma desaminase é fundida ao N-terminal da TS-SpCas9.
[1061] Alternativamente, a proteína de fusão pode ser uma proteína artificialmente produzida na forma em que uma desaminase é fundida ao C-terminal da TS-SpCas9.
[1062] Alternativamente, a proteína de fusão pode ser uma proteína artificialmente produzida na forma em que as mesmas ou diferentes desaminases são fundidas ao N- terminal e ao C-terminal da TS-SpCas9, respectivamente.
[1063] Uma enzima CRISPR, enzima CRISPR artificialmente manipulada, variante da enzima CRISPR,
Cas9, Cas9 artificialmente modificada, variante da Cas9 ou Cas9 alvo específica aqui divulgadas podem ser um polipeptídeo ou proteína.
[1064] Uma enzima CRISPR, enzima CRISPR artificialmente manipulada, variante da enzima CRISPR, Cas9, Cas9 artificialmente modificada, variante da Cas9 ou Cas9 alvo específica aqui divulgadas podem ser um ácido nucleico tendo uma sequência nucleotídica que codifica o polipeptídeo ou proteína.
[1065] A enzima CRISPR, enzima CRISPR artificialmente manipulada, variante da enzima CRISPR, Cas9, Cas9 artificialmente modificada, variante da Cas9 ou Cas9 alvo específica podem ser otimizadas por códon para um sujeito a ser introduzido.
[1066] O termo “otimização por códon” refere-se a um processo de modificação de uma sequência de ácidos nucleicos mantendo-se uma sequência de aminoácidos nativa ao substituir pelo menos um códon da sequência nativa com um códon mais frequentemente ou o mais frequentemente usado em células hospedeiras de modo a melhorar a expressão nas células hospedeiras. Uma variedade de espécie tem uma tendência específica para um códon específico de um aminoácido específico, e a tendência do códon (a diferença em códon usado entre organismos) é frequentemente correlacionada com a eficiência da tradução de mRNA, que é considerada ser dependente da característica de um códon traduzido e da disponibilidade de uma molécula de tRNA específica. A dominância de tRNA selecionado de células geralmente reflete códons mais frequentemente usados na síntese de peptídeo. Portanto, um gene pode ser personalizado pela expressão ótima do gene em um determinado organismo com base na otimização por códon.
[1067] O ácido nucleico tendo a sequência nucleotídica que codifica o polipeptídeo ou proteína pode ser uma forma de um não vetor.
[1068] O não vetor pode ser DNA simples, um DNA ou mRNA complexo.
[1069] O ácido nucleico tendo a sequência nucleotídica que codifica o polipeptídeo ou proteína pode ser incluído em um vetor.
[1070] Aqui, o ácido nucleico tendo a sequência nucleotídica que codifica o polipeptídeo ou proteína pode ser incluído em um vetor, ou dividido e incluído em vários vetores.
[1071] O vetor pode ser um plasmídeo.
[1072] O vetor pode ser um vetor viral ou um vetor não viral.
[1073] O vetor pode incluir um ou mais componentes reguladores/controle.
[1074] Aqui, os componentes reguladores/controle podem incluir um promotor, um realçador, um íntron, um sinal de poliadenilação, uma sequência consenso Kozak, um sítio interno de entrada do ribossomo (IRES), um aceitante de emenda e/ou uma sequência 2A.
[1075] O promotor pode ser um promotor reconhecido por RNA polimerase II.
[1076] O promotor pode ser um promotor reconhecido por RNA polimerase III.
[1077] O promotor pode ser um promotor induzível.
[1078] O promotor pode ser um promotor específico de sujeito.
[1079] O promotor pode ser um promotor viral ou não viral.
[1080] O promotor pode usar um promotor adequado de acordo com uma região controle (isto é, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um ácido nucleico guia ou proteína editora).
[1081] Por exemplo, um promotor útil para a enzima CRISPR pode ser um promotor CMV, EF-1a, EFS, MSCV, PGK ou CAG.
[1082] O vetor pode ser um vetor viral ou vetor viral recombinante.
[1083] O vírus pode ser um vírus de DNA ou um vírus de RNA.
[1084] Aqui, o vírus de DNA pode ser um vírus de DNA de fita dupla (dsDNA) ou vírus de DNA de fita simples (ssDNA).
[1085] Aqui, o vírus de RNA pode ser um vírus de RNA de fita simples (ssRNA).
[1086] O vírus pode ser um retrovírus, um lentivírus, um adenovírus, vírus adeno-associado (AAV), vírus vaccinia, um poxvírus ou um vírus do herpes simples, mas a presente invenção não está limitada a estes.
[1087] Geralmente, o vírus pode infetar um hospedeiro (e.g., células), desse modo introduzindo um ácido nucleico que codifica a informação genética do vírus no hospedeiro ou inserindo um ácido nucleico que codifica a informação genética no genoma do hospedeiro. O ácido nucleico guia e/ou proteína editora podem ser introduzidos em um sujeito usando um vírus tendo tal característica. O ácido nucleico guia e/ou proteína editora introduzidos usando o vírus podem ser temporariamente expressados no sujeito (e.g., células). Alternativamente, o ácido nucleico guia e/ou proteína editora introduzidos usando o vírus podem ser continuamente expressados em um sujeito (e.g., células) por um longo tempo (e.g., 1, 2 ou 3 semanas, 1, 2, 3, 6 ou 9 meses, 1 ou 2 anos, ou permanentemente).
[1088] A capacidade de empacotamento de um vírus pode variar de pelo menos 2 a 50 kb dependendo do tipo de vírus. De acordo com a capacidade de empacotamento, um vetor viral apenas incluindo uma enzima CRISPR ou um vetor viral incluindo uma enzima CRISPR e gRNA pode ser projetado. Alternativamente, um vetor viral incluindo uma enzima CRISPR, gRNA e um componente adicional podem ser projetados.
[1089] Em um exemplo, um ácido nucleico que codifica uma enzima CRISPR pode ser incluído em um vetor de lentivírus recombinante.
[1090] Em um outro exemplo, o ácido nucleico que codifica uma enzima CRISPR pode ser incluído em um vetor de adenovírus recombinante.
[1091] Em ainda um outro exemplo, o ácido nucleico que codifica uma enzima CRISPR pode ser incluído em um vetor de AAV recombinante.
[1092] Ainda em um outro exemplo, o ácido nucleico que codifica uma enzima CRISPR pode ser incluído em um vetor híbrido, por exemplo, um ou mais vetores híbridos entre os vírus aqui divulgados.
[1093] Em uma modalidade exemplificativa aqui divulgada, um ácido nucleico que codifica uma variante da enzima CRISPR e/ou uma variante da Cas9 podem ser expressadas para usar a variante da enzima CRISPR e/ou a variante da Cas9. A expressão pode ser realizada em vários métodos. Por exemplo, o ácido nucleico que codifica a variante da enzima CRISPR e/ou a variante da Cas9 pode ser clonado em um vírus intermediário para transdução em células procarióticas ou eucarióticas para a clonagem e/ou expressão. Para o armazenamento ou manipulação do ácido nucleico que codifica a variante da enzima CRISPR e/ou a variante da Cas9 para produzir a variante da enzima CRISPR e/ou a variante da Cas9, o vetor intermediário é, tipicamente, um vetor procariótico tal como um plasmídeo, um vetor de transporte ou um vetor de inseto. Além disso, o ácido nucleico da variante da enzima CRISPR e/ou da variante da Cas9 pode ser clonado em um vetor de expressão para a introdução em células vegetais, células animais, preferivelmente, células de mamíferos ou células humanas, células fúngicas, células bacterianas ou células protozoárias.
[1094] Para realizar a expressão, tipicamente, uma sequência que codifica uma variante da enzima CRISPR e/ou uma variante da Cas9 é subclonada em um vetor de expressão contendo um promotor que direciona a transcrição. Um sistema de expressão de bactérias para expressar uma proteína geneticamente modificada pode ser obtido de, por exemplo, E. coli, Bacillus sp. e Salmonella sp. Um kit para o sistema de expressão é comercialmente disponível. Um sistema expressa célula eucariótica para células de mamífero, levedura e inseto são amplamente conhecidas na técnica, e também comercialmente disponíveis.
[1095] Um promotor usado para direcionas a expressão de ácido nucleico depende de uma aplicação específica. Por exemplo, um promotor constitutivo tipicamente forte é usado para expressar e proliferar uma proteína de fusão. Ao contrário, quando uma variante da enzima CRISPR e/ou uma variante da Cas9 são introduzidas em um organismo vivo para a regulação do gene, um promotor constitutivo ou induzível pode ser usado de acordo com uma aplicação específica da variante da enzima CRISPR e/ou da variante da Cas9. Além disso, um promotor preferível para introduzir a variante da enzima CRISPR e/ou a variante da Cas9 pode ser um promotor fraco, por exemplo, HSV TK ou um promotor tendo uma atividade semelhante. O promotor também pode incluir elementos de resposta por ativação de transcrição, por exemplo, um elemento de resposta por hipoxia, um elemento de resposta por Gal4, um elemento de resposta por inibidor de lac e sistemas controlados por molécula pequena, por exemplo, um sistema regulado por tetraciclina e um sistema RU-486.
[1096] Além do promotor, tipicamente, um vetor de expressão inclui uma unidade de transcrição ou cassete de expressão contendo elementos adicionais necessários para a expressão de ácido nucleico em células hospedeiras, tais como células procarióticas ou eucarióticas. Portanto, o cassete de expressão típico pode incluir, por exemplo, um promotor operativamente ligado a uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma variante da enzima CRISPR e/ou uma variante da Cas9, e um sinal aleatório necessário para, por exemplo, poliadenilação eficaz de um transcrito, terminação de transcrição, sítios de ligação ao ribossomo, ou terminação de tradução. Elementos adicionais do cassete podem incluir, por exemplo, um realçador e sinais de íntron heterólogo unidos.
[1097] Um vetor de expressão específico para transferir informação genética às células é selecionado em relação a um uso desejado de uma variante da enzima CRISPR e/ou uma variante da Cas9, por exemplo, expressão em plantas, animais, bactérias, fungos, protozoários ou semelhantes. Vetores de expressão de bactérias padrão incluem plasmídeos, por exemplo, um plasmídeo com base em pBR322, pSKF e pET23D, e sistemas de expressão fundidos por marcador comercialmente disponíveis, por exemplo, GST e LacZ.
[1098] Um vetor de expressão contendo um elemento regulador derivado de um vírus de célula eucariótica é frequentemente usado em um vetor de expressão eucariótico,
por exemplo, um vetor de SV40, um vetor de papiloma vírus, ou um vetor derivado do vírus Epstein-Barr. Outros vetores eucarióticos exemplificativos incluem pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, baculovírus, pDSVE, e outros vetores que permitem a expressão de proteína sob a direção do promotor precoce SV40, promotor tardio SV40, promotor metalotioneína, promotor do vírus de tumor mamário murino, promotor do vírus de sarcoma de Rous, promotor de poliedrina, ou outros promotores mostrados eficazes para a expressão em células eucarióticas.
[1099] Um vetor para expressar uma variante da enzima CRISPR e/ou uma variante da Cas9 pode incluir o promotor de RNA Pol III para induzir a expressão de RNA guia, por exemplo, o promotor H1, U6 ou 7SK. Tal promotor humano permite a expressão de uma variante da enzima CRISPR e/ou uma variante da Cas9 em células de mamíferos depois da transfecção do plasmídeo.
[1100] Alguns sistemas de expressão têm marcadores para selecionar uma linhagem de células estavelmente transfectada, por exemplo, timidina cinase, higromicina B fosfotransferase e di-hidrofolato redutase. Um sistema de expressão de alto rendimento, por exemplo, usando um vetor de baculovírus além de uma sequência codificadora de gRNA sob a direção de um promotor de poliedrina ou outros promotores de baculovírus fortes em células de inseto também é adequado.
[1101] Elementos tipicamente incluídos em um vetor de expressão também incluem um replicão que funciona em E.
coli, um gene que codifica a resistência a antibiótico para permitir a seleção de bactérias contendo um plasmídeo recombinante, e um sítio de restrição único na região não essencial de um plasmídeo para permitir a inserção de uma sequência recombinante.
[1102] Uma linhagem de células bacteriana, de mamífero, levedura ou inseto que expressa uma grande quantidade de proteínas é produzida usando um método de transfecção padrão, e purificada usando uma técnica padrão (por exemplo, refere-se a Colley et al., 1989, J. Biol.
Chem., 264:17619-22; Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)). A transformação de células eucarióticas e procarióticas é realizada de acordo com uma técnica padrão (por exemplo, refere-se a Morrison, 1977, J. Bacteriol. 132:349-351; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds, 1983)).
[1103] Quaisquer procedimentos conhecidos para introduzir uma sequência nucleotídica estranha em células hospedeiras podem ser usados. Estes procedimentos incluem transfecção de fosfato de cálcio, polibreno, fusão de protoplasto, eletroporação, nucleofecção, lipossomas, microinjeção, DNA simples, um vetor de plasmídeo, um vetor viral, vetores epissomais e integrativos, e outros métodos amplamente conhecidos para introduzir o genoma clonado de DNA, cDNA, DNA sintético ou outros materiais genéticos estranhos em células hospedeiras. Os procedimentos de manipulação de gene específicos aqui usados devem introduzir com sucesso pelo menos um gene em células hospedeiras capazes de expressar uma variante da enzima CRISPR e/ou uma variante da Cas9.
[1104] Em uma modalidade exemplificativa aqui divulgada, um vetor capaz de expressar uma variante da enzima CRISPR e/ou uma variante da Cas9 e células incluindo o vetor pode ser fornecido.
[EXEMPLOS]
[1105] A seguir, a presente invenção será descrita em detalhes com referência aos exemplos.
[1106] Os exemplos são meramente fornecidos para descrever a presente invenção em mais detalhes, e pode ser óbvio para os versados na técnica que o escopo da presente invenção não está limitado aos exemplos a seguir.
EXEMPLO 1. VARIANTE DA CAS9
1. BIBLIOTECAS DE VARIANTES DA CAS9
[1107] As bibliotecas de variantes da SpCas9 foram construídas usando três protocolos independentes. Para a primeira biblioteca, uma biblioteca de plasmídeo de Cas9 foi transformada em células competentes vermelhas XL1 (Agilent), que foram cultivadas de acordo com as instruções no manual do fornecedor. Para a segunda e terceira bibliotecas, a PCR propensa a erros foi realizada em toda WT-SpCas9 das sequências de plasmídeos da biblioteca de Cas9 usando kits de mutagênese aleatória de PCR Genemorph II (Agilent) e Diversify (Clontech) sob a condição de uma baixa taxa de erro (0 a 5 mutações/kb) com iniciadores projetados para Montagem de Gibson. Posteriormente, os produtos de PCR foram purificados em gel. A biblioteca mutagenizada aleatoriamente purificada e a estrutura principal do plasmídeo da biblioteca de Cas9 foram montadas em Gibson. As bibliotecas montadas foram transformadas em células eletrocompetentes EnduraTM (Lucigen) e incubadas em placas LB de cloranfenicol (12,5 ȝg/mL) a 37 °C durante a noite. Após as células transformadas serem cultivadas, cada biblioteca foi isolada e purificada usando um kit de preparação Midi (NucleoBond Xtra Midi EF, Macherey-Nagel).
As bibliotecas obtidas foram rastreadas usando um método de triagem de Cas9 alvo específica (WO 2017217768) com um sistema de múltiplos alvos, selecionando assim variantes da Cas9 alvo específicas.
2-1. PLASMÍDEOS QUE CODIFICAM VARIANTES DA CAS9 ALVO ESPECÍFICAS
[1108] Os plasmídeos que codificam SpCas9 do tipo selvagem (p3s-Cas9HC; plasmídeo Addgene #43945) foram adquiridos e usados para produzir variantes da SpCas9 alvo específicas. Construtos para as variantes da SpCas9 alvo específicas foram produzidas por Montagem de Gibson de uma sequência de ácidos nucleicos incluindo mutações no sítio desejado e a estrutura principal do plasmídeo p3s-Cas9HC.
Todos os construtos foram confirmados pelo sequenciamento de Sanger.
2-2. PLASMÍDEOS QUE CODIFICAM VARIANTES DA CAS9 ALVO ESPECÍFICAS
[1109] Os plasmídeos que codificam SpCas9 do tipo selvagem (p3s-Cas9HC; plasmídeo Addgene #43945) foram adquiridos e usados para produzir variantes da SpCas9 alvo específicas. Para produzir variantes da SpCas9 alvo específicas, foram produzidos construtos incluindo mutações no sítio em plasmídeos codificados por SpCas9 do tipo selvagem usando um kit de mutagênese direcionada ao sítio.
Todos os construtos foram confirmados pelo sequenciamento de Sanger.
EXEMPLO 2. EFEITO DE MANIPULAÇÃO DO GENE ALVO DE VARIANTE DA CAS9
MÉTODOS EXPERIMENTAIS
1. CULTURA CELULAR E CONDIÇÕES DE
TRANSFECÇÃO
[1110] As células HEK293T (ATCC, CRL-11268) foram mantidas em meio DMEM suplementado com 10 % de SFB (soro fetal bovino) e 1% de antibióticos. Para manipulação genética pelas variantes da Cas9, as células HEK293T foram semeadas em placas de 48 poços até 70 a 80 % de confluência antes da transfecção. As células foram transfectadas com plasmídeos de expressão de variante da Cas9 (250 ng) e plasmídeos de expressão de sgRNA (250 ng) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). O DNA genômico foi isolado e extraído usando um DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) 72 horas após a transfecção.
2. CLIVAGEM IN VITRO DE DNA GENÔMICO
[1111] O DNA genômico foi purificado a partir de células HEK293T usando um kit DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen). O DNA genômico (10 µg) foi incubado com proteína Cas9 ou Sniper1 (100 nM) e 4 sgRNAs (75 nM cada) em um volume de reação de 1 mL por 8 h a 37 °Cem um tampão (NaCl 100 mM, Tris-HCl 50 mM, MgCl2 10 mM, 100 µg/mL de BSA, a pH 7,9). O DNA genômico digerido foi tratado com RNase A (50 µg/mL) para degradar sgRNAs e purificado novamente com DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen).
3. SEQUENCIAMENTO COMPLETO DO GENOMA E DO
DIGENOMA
[1112] O DNA genômico (1 µg) foi fragmentado em uma faixa de 400 a 500 pb usando o sistema Covaris (Life Technologies), e ambas as extremidades dos fragmentos foram terminadas sem corte usando End Repair Mix (Thermo Fischer). Para construir as bibliotecas, o DNA fragmentado foi ligado a um adaptador e, em seguida, submetido a sequenciamento completo do genoma usando um HiSeq X Ten Sequencer (Illumina) na Macrogen. O sequenciamento completo do genoma foi realizado a uma profundidade de sequenciamento de 30 a 40×. Os sítios de clivagem do DNA foram identificados usando os programas Digenome 1.0.
4. SEQUENCIAMENTO PROFUNDO ALVEJADO
[1113] Os sítios alvo e sítos extra-alvo potenciais foram analisados por sequenciamento profundo alvejado. As bibliotecas de sequenciamento profundo foram geradas por PCR. Os iniciadores TruSeq HT Dual Index foram usados para marcar cada amostra. As bibliotecas agrupadas foram submetidas a sequenciação de extremidade emparelhada usando MiniSeq.
RESULTADOS EXPERIMENTAIS
[1114] Neste exemplo, para confirmar um efeito de manipulação do gene alvo das variantes da SpCas9, o efeito de indel (%) das variantes da SpCas9 de acordo com o gene alvo foi confirmado com vários genes usados como alvo.
Aqui, o efeito das variantes da SpCas9 foi confirmado para cada região.
1. VARIANTES DA PRIMEIRA REGIÃO DA SPCAS9
[1115] Um total de cinco variantes da SpCas9 (A203D, N277H, G366S, F539S e I601N) formadas substituindo- se A203, N277, G366, F539 e I601 na primeira região da SpCas9 por diferentes aminoácidos, respectivamente, foram usadas no experimento.
[1116] Como resultado, quando um gene DMD foi usado como gene alvo (sequência alvo: CTTTCTACCTACTGAGTCTG (SEQ ID NO: 28)/sequência não alvo: CTTTCTACCTACcGAGTCTG (SEQ ID NO: 29), uma sequência diferente da sequência alvo é apresentada em letras minúsculas), em todas as variantes da SpCas9, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem, as frequências de indel no sítio extra-alvo aumentaram, as frequências de indel no sítio extra-alvo diminuíram, pois a razão da frequência de indel no sítio extra-alvo com base no valor do sítio extra-alvo foi baixa (Fig. 1).
Particularmente, foi confirmado que, para A203D, F539S e I601N, as frequências de indel nos sítios alvo-relacionado são semelhantes às do SpCas9 do tipo selvagem, mas as frequências de indel nos sítios extra-alvo são reduzidas abaixo de um certo nível em comparação com SpCas9 do tipo selvagem.
[1117] Além disso, quando um gene EMX foi usado como gene alvo (sequência alvo: GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA (SEQ ID NO: 30)/sequência não alvo: GAGTtaGAGCAGAAGAAGAA (SEQ ID NO: 31)), para todas as variantes da SpCas9, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem, as frequências de indel aumentaram no sítio extra-alvo e diminuíram no sítio extra- alvo, pois a razão de frequência de indel no sítio extra- alvo com base no valor do sítio alvo-relacionado foi baixa (Fig. 2). Particularmente, para G366S, foi confirmado que, as frequências de indel no sítio extra-alvo são semelhantes àquelas de SpCas9 do tipo selvagem, mas as frequências de indel no sítio extra-alvo são mais altas do que as de SpCas9 do tipo selvagem. Além disso, para F539S e I601N, foi confirmado que, as frequências de indel no sítio extra- alvo quase não são exibidas ou são reduzidas para metade daquelas de SpCas9 do tipo selvagem.
[1118] Quando um gene VEGFA foi usado como um gene alvo (sequência alvo: GGTGAGTGAGTGTGTGCGTG (SEQ ID NO: 32)/sequência não alvo: GGTGAGTGAGTGTGTGtGTG (SEQ ID NO: 33)), para todas as variantes SpCas9, em comparação com as de SpCas9 do tipo selvagem, as frequências de indel no sítio extra-alvo aumentaram, ou foram semelhantes as de SpCas9 do tipo selvagem (Fig. 3). Particularmente, para F539S, as frequências de indel no sítio extra-alvo foram semelhantes as de SpCas9 do tipo selvagem, mas as frequências de indel no sítio extra-alvo foram 10 % ou mais elevadas do que aquelas de SpCas9 do tipo selvagem.
[1119] A partir dos resultados acima mencionados, foi confirmado que, um total de cinco variantes da SpCas9 formadas substituindo-se A203, N277, G366, F539 e I601 na primeira região da SpCas9 com diferentes aminoácidos são melhoradas na especificidade do alvo, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem.
2. VARIANTES DA SEGUNDA REGIÃO DA SpCas9
[1120] Três variantes da SpCas9 (M763I, D965Y e F1038Y) formadas substituindo-se M763, D965 e F1038 na segunda região da SpCas9 por aminoácidos diferentes e duas variantes da SpCas9 (M763I/F1038Y e D965Y/F1038Y) formadas substituindo-se M763/F1038 e D965/F1038 na segunda região da SpCas9 com diferentes aminoácidos foram usadas em um experimento.
[1121] Como resultado, quando um gene DMD foi usado como gene alvo (sequência alvo: CTTTCTACCTACTGAGTCTG (SEQ ID NO: 28)/sequência não alvo: CTTTCTACCTACcGAGTCTG (SEQ ID NO: 29)), para todos as variantes da SpCas9, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem, as frequências de indel no sítio extra-alvo aumentaram, as frequências de indel no sítio extra-alvo diminuíram, ou as frequências de indel no sítio extra-alvo foram mais baixas do que aquelas no sítio extra-alvo (FIG. 4). Particularmente, para M763I, foi confirmado que, as frequências de indel no sítio extra- alvo foram semelhantes as de SpCas9 do tipo selvagem, mas as frequências de indel no sítio extra-alvo foram mais altas do que as de SpCas9 do tipo selvagem. Além disso, para M763I/F1038Y e D965Y/F1038Y, foi confirmado que, as frequências de indel no sítio extra-alvo são ligeiramente mais baixas do que as de SpCas9 do tipo selvagem, mas as frequências de indel no sítio extra-alvo quase não são mostradas e, assim, a razão de frequência de indel no sítio extra-alvo com base no valor do sítio alvo-relacionado foi menor do que a de SpCas9 do tipo selvagem. Portanto, foi confirmado que, as variantes da SpCas9 têm especificidade de alvo, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem (FIG.
5).
[1122] Além disso, quando um gene EMX foi usado como gene alvo (sequência alvo: GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA (SEQ ID NO: 30)/sequência não alvo: GAGTtaGAGCAGAAGAAGAA (SEQ ID NO: 31)), para M763I, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem, as frequências de indel no sítio extra-alvo foram ligeiramente reduzidas, mas as frequências de indel no sítio extra-alvo quase não foram mostradas e, assim, a razão de frequência de indel no sítio extra-alvo com base no valor do sítio alvo-relacionado foi baixa. Portanto, M763I tem especificidade de alvo, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem (FIG. 6). Além disso, para M763I/F1038Y e D965Y/F1038Y, as frequências de indel no sítio extra-alvo quase não foram mostradas, e as frequências de indel no sítio extra-alvo foram semelhantes ou significativamente mais altas, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem (FIG 7).
[1123] Quando um gene VEGFA foi usado como um gene alvo (sequência alvo: GGTGAGTGAGTGTGTGCGTG (SEQ ID NO: 32)/sequência não alvo: GGTGAGTGAGTGTGTGtGTG (SEQ ID NO: 33)), para M763I, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem, as frequências de indel no sítio extra-alvo foram semelhantes, mas as frequências de indel no sítio extra- alvo quase não foram mostradas e, portanto, pode ser confirmado que, para M763I, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem, que é a razão de frequência de indel no sítio extra-alvo com base no valor do sítio alvo- relacionado foi baixa e, assim, M763I tem especificidade de alvo, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem (FIG. 8).
[1124] Quando um gene HBB03 foi usado como gene alvo (sequência alvo: CACGTTCACCTTGCCCCACA (SEQ ID NO: 34)/sequência não alvo: CACGTTCACtTTGCCCCACA (SEQ ID NO: 35)), foi confirmado que, para M763I/F1038Y e D965Y/F1038Y, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem, frequências de indel no sítio extra-alvo diminuíram pela metade ou menos, mas as frequências de indel sítio extra-alvo pelo aumentaram ou diminuíram ligeiramente (Fig. 9).
[1125] Quando um gene HBB04 foi usado como gene alvo (sequência alvo: CCACGTTCACCTTGCCCCAC (SEQ ID NO: 36)/sequência não alvo: CCACaTTCACCTTGCCCCAC (SEQ ID NO: 37)), foi confirmado que, para M763I/F1038Y e D965Y/F1038Y, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem, as frequências de indel no sítio extra-alvo quase não são mostradas, e as frequências de indel no sítio extra-alvo aumentaram ou semelhantes (Fig. 10).
[1126] A partir dos resultados acima mencionados, foi confirmado que, as três variantes da SpCas9 (M763I, D965Y e F1038Y) formadas substituindo-se M763, D965 e F1038 na segunda região da SpCas9 por aminoácidos diferentes e duas variantes da SpCas9 (M763I/F1038Y e D965Y/F1038Y)
formadas substituindo-se M763/F1038 e D965/F1038 na segunda região da SpCas9 por diferentes aminoácidos foram melhoradas na especificidade do alvo, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem.
3. VARIANTES DA TERCEIRA REGIÃO DA SpCas9
[1127] Uma variante da SpCas9 (K890N) formada substituindo-se K890 na terceira região da SpCas9 por diferentes aminoácidos foi usada no experimento.
[1128] Como resultado, quando um gene DMD foi usado como gene alvo (sequência alvo: CTTTCTACCTACTGAGTCTG (SEQ ID NO: 28)/sequência não alvo: CTTTCTACCTACcGAGTCTG (SEQ ID NO: 29)), foi confirmado que, para K890N, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem, as frequências de indel no sítio extra-alvo são semelhantes, mas as frequências de indel no sítio extra-alvo diminuíram ligeiramente (Fig. 11).
[1129] A partir dos resultados acima mencionados, foi confirmado que, a variante da SpCas9 (K890N) formada substituindo-se K890 na terceira região da SpCas9 por um aminoácido diferente mostra especificidade de alvo semelhante ou aumentada ligeiramente, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem.
4. VARIANTES DA QUARTA REGIÃO DA SpCas9
[1130] As variantes da SpCas9 (T1102P e D1127E) formadas substituindo-se T1102 e D1127 na quarta região da SpCas9 por diferentes aminoácidos foram usadas no experimento.
[1131] Como resultado, quando um gene DMD foi usado como gene alvo (sequência alvo: CTTTCTACCTACTGAGTCTG (SEQ ID NO: 28)/sequência não alvo: CTTTCTACCTACcGAGTCTG (SEQ ID NO: 29)), foi confirmado que, para T1102P, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem, quase não há frequências de indel no sítio extra-alvo mostradas, e por D1127E, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem, as frequências de indel no sítio extra-alvo são semelhantes, mas as frequências de indel no sítio extra-alvo diminuíram(Fig. 12).
[1132] Além disso, quando um gene EMX foi usado como gene alvo (sequência alvo: GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA (SEQ ID NO: 30)/sequência não alvo: GAGTtaGAGCAGAAGAAGAA (SEQ ID NO: 31)), T1102 e D1127 mostram as frequências de indel semelhantes no sítio alvo-relacionado, mas as frequências quase nenhuma indel no sítio extra-alvo, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem (Fig. 13).
[1133] A partir dos resultados acima mencionados, foi confirmado que, as variantes da SpCas9 (T1102P e D1127E) formadas substituindo-se T1102 e D1127 na quarta região da SpCas9 por aminoácidos diferentes apresentam especificidade de alvo semelhante ou aumentada ligeiramente, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem.
5. VARIANTES DE SpCas9 COM MUTAÇÕES EM DUAS
REGIÕES
[1134] As variantes da SpCas9 com mutações em duas regiões das quatro regiões da SpCas9 são usadas em um experimento. Aqui, F539S/F1038Y, F539S/M763I, I601N/D965Y e F539S/M763I/F1038Y tendo mutações na primeira e na segunda regiões; F539S/K890N com mutações na primeira e terceira regiões; e M763I/K890N com mutações na segunda e terceira regiões foram usadas como variantes da SpCas9.
[1135] Como resultado, quando um gene DMD foi usado como gene alvo (sequência alvo: CTTTCTACCTACTGAGTCTG (SEQ ID NO: 28)/sequência não alvo: CTTTCTACCTACcGAGTCTG (SEQ ID NO: 29)), foi confirmado que, para F539S/F1038Y e F539S/M763I/F1038Y, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem, as frequências de indel no sítio alvo-relacionado diminuíram, mas as frequências de indel no sítio extra-alvo diminuíram por aproximadamente 70 a 80 % e, assim, a razão de frequência de indel no sítio extra-alvo com base no valor do sítio alvo-relacionado foi baixa. Portanto, foi confirmado que, F539S/F1038Y e F539S/M763I/F1038Y têm especificidade de alvo, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem (FIG. 14).
[1136] Além disso, quando um gene EMX foi usado como gene alvo (sequência alvo: GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA (SEQ ID NO: 30)/sequência não alvo: GAGTtaGAGCAGAAGAAGAA (SEQ ID NO: 31)), para F539S/F1038Y, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem, as frequências de indel no sítio alvo- relacionado diminuíram ligeiramente, mas as frequências de indel no sítio extra-alvo quase não foram mostradas e, assim, a razão de frequência de indel no sítio extra-alvo com base no valor do sítio alvo-relacionado e foi baixa.
Portanto, foi confirmado que, F539S/F1038Y tem especificidade de alvo, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem (FIG. 15).
[1137] Quando um gene VEGFA foi usado como um gene alvo (sequência alvo: GGTGAGTGAGTGTGTGCGTG (SEQ ID NO: 32)/sequência não alvo: GGTGAGTGAGTGTGTGtGTG (SEQ ID NO: 33)), foi confirmado que, para F539S/M763I, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem, as frequências de indel no sítio extra-alvo são semelhantes, mas as frequências de indel no sítio extra-alvo aumentaram significativamente (Fig. 16).
[1138] Quando um gene HBB03 foi usado como gene alvo (sequência alvo: CACGTTCACCTTGCCCCACA (SEQ ID NO: 34)/sequência não alvo: CACGTTCACtTTGCCCCACA (SEQ ID NO: 35)), foi confirmado que, para F539S/K890N e F539S/M763I/F1038Y, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem, as frequências de indel no sítio extra-alvo ligeiramente diminuíram, mas as frequências de indel no sítio extra-alvo diminuíram 70 % ou mais e, assim, a razão de frequência de indel com o sítio extra-alvo com base no valor do sítio alvo-relacionado foi baixa. Portanto, foi confirmado que, F539S/K890N e F539S/M763I/F1038Y têm especificidade de alvo, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem (FIG. 17). Além disso, foi confirmado que, para M763I/K890N, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem, as frequências de indel no sítio extra-alvo aumentaram ligeiramente, mas as frequências de indel no sítio alvo- relacionado aumentaram aproximadamente 30 a 40 % e, assim, a razão de frequência de indel no sítio extra-alvo com base no valor do sítio alvo-relacionado foi baixa. Portanto, foi confirmado que, M763I/K890N tem especificidade de alvo, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem (FIG. 17).
[1139] Quando um gene HBB04 foi usado como gene alvo (sequência alvo: CCACGTTCACCTTGCCCCAC (SEQ ID NO: 36)/sequência não alvo: CCACaTTCACCTTGCCCCAC (SEQ ID NO: 37)), foi confirmado que, para F539S/K890N e F539S/F1038Y, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem, as frequências de indel no sítio extra-alvo são semelhantes ou aumentaram, e as frequências de indel no sítio extra-alvo quase não foram mostradas (Fig. 18). Além disso, foi confirmado que, para M763I/K890N, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem, as frequências de indel no sítio extra-alvo aumentaram ligeiramente, e as frequências de indel no sítio extra-alvo diminuíram aproximadamente 30 % (Fig. 18)
[1140] A partir dos resultados acima mencionados, foi confirmado que, as variantes da SpCas9 (F539S/K890N, F539S/F1038Y, F539S/M763I, I601N/D965Y, M763I/K890N e F539S/M763I/F1038Y) apresentando mutações em duas regiões das quatro regiões do SpCas9 são melhoradas na especificidade do alvo, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem.
6. VARIANTES DE SpCas9 COM MUTAÇÕES EM TRÊS
OU MAIS REGIÕES
[1141] As variantes da SpCas9 com mutações em três ou mais regiões das quatro regiões da SpCas9 foram usadas no experimento. Aqui, F539S/M763I/K890N, F539S/M763I/D965Y/K890N e F539S/M763I/K890N/F1038Y tendo mutações na primeira, segunda e terceira regiões; e A203D/N277H/G366S/M763I/F1038Y/T1102P/D1127E com mutações na primeira, segunda e quarta regiões foram usadas como variantes da SpCas9.
[1142] Como resultado, quando um gene DMD foi usado como gene alvo (sequência alvo: CTTTCTACCTACTGAGTCTG (SEQ ID NO: 28)/sequência não alvo: CTTTCTACCTACcGAGTCTG (SEQ ID NO: 29)), foi confirmado que, para F539S/M763I/K890N e F539S/M763I/K890N/F1038Y, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem, as frequências de indel no sítio extra-alvo ligeiramente diminuíram, mas as frequências de indel no sítio extra-alvo diminuíram pela metade ou menos e, assim, a razão de frequência de indel no sítio extra-alvo com base no valor do sítio alvo- relacionado foi baixa. Portanto, foi confirmado que, para F539S/M763I/K890N e F539S/M763I/K890N/F1038Y têm especificidade de alvo, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem (FIG. 19). Além disso, para A203D/N277H/G366S/M763I/F1038Y/T1102P/D1127E, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem, as frequências de indel no sítio extra-alvo diminuíram ligeiramente, mas as frequências de indel no sítio extra-alvo diminuíram aproximadamente 60 a 70 % e, assim, a razão de frequência de indel no sítio extra-alvo com base no valor do sítio alvo-relacionado foi baixa. Portanto, foi confirmado que, A203D/N277H/G366S/M763I/F1038Y/T1102P/D1127E tem especificidade de alvo, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem (FIG. 23).
[1143] Quando um gene VEGFA foi usado como um gene alvo (sequência alvo: GGTGAGTGAGTGTGTGCGTG (SEQ ID NO:
32)/sequência não alvo: GGTGAGTGAGTGTGTGtGTG (SEQ ID NO: 33)), foi confirmado que, para F539S/M763I/K890N, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem, as frequências de indel no sítio extra-alvo diminuíram ligeiramente, mas as frequências de indel no sítio extra-alvo diminuíram pela metade e, assim, a razão de frequência de indel no sítio extra-alvo com base no valor do sítio alvo-relacionado e foi baixa. Portanto, foi confirmado que, o F539S/M763I/K890N tem especificidade de alvo, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem (FIG. 20).
[1144] Quando um gene HBB03 foi usado como gene alvo (sequência alvo: CACGTTCACCTTGCCCCACA (SEQ ID NO: 34)/sequência não alvo: CACGTTCACtTTGCCCCACA (SEQ ID NO: 35)), foi confirmado que, para F539S/M763I/K890N, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem, as frequências de indel no sítio alvo-relacionado aumentaram, mas as frequências de indel no sítio extra-alvo diminuíram, para F539S/M763I/K890N/F1038Y, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem, as frequências de indel no sítio extra-alvo diminuíram ligeiramente, mas as frequências de indel no sítio extra-alvo diminuíram aproximadamente 70 % ou mais e, assim, a razão de frequência de indel no sítio extra-alvo com base no valor do sítio extra-alvo foi baixa. Portanto, foi confirmado que, F539S/M763I/K890N e F539S/M763I/K890N/F1038Y têm especificidade de alvo, em comparação com os SpCas9 do tipo selvagem (FIG. 21). Além disso, foi confirmado que, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem, para F539S/M763I/D965Y/K890N, as frequências de indel no sítio extra-alvo aumentaram ligeiramente, mas as frequências de indel no sítio alvo-relacionado aumentaram aproximadamente 10 a 20 % e, assim, a razão de frequência de indel no sítio extra-alvo com base no valor do sítio alvo-relacionado foi baixa. Portanto, pode ser confirmado que, F539S/M763I/D965Y/K890N têm especificidade de alvo, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem (Fig. 21).
[1145] Quando um gene HBB04 foi usado como um gene alvo (sequência alvo: CCACGTTCACCTTGCCCCAC (SEQ ID NO: 36)/sequência não alvo: CCACaTTCACCTTGCCCCAC (SEQ ID NO: 37)), foi confirmado que, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem, para F539S/M763I/K890N, as frequências de indel no sítio extra-alvo aumentaram, as frequências de indel no sítio extra-alvo diminuíram significativamente, e para F539S/M763I/D965Y/K890N, as frequências de indel no sítio extra-alvo são semelhantes, mas as frequências de indel no sítio extra-alvo diminuíram aproximadamente 10 a 20 % (FIG.
22). Além disso, foi confirmado que, para F539S/M763I/K890N/F1038Y, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem, as frequências de indel no sítio alvo-relacionado diminuíram aproximadamente 40 %, as frequências de indel no sítio extra-alvo quase não foram mostradas e, assim, a razão de frequência de indel no sítio extra-alvo com base no valor do sítio alvo-relacionado foi menor em comparação com SpCas9 do tipo selvagem. Portanto, foi confirmado que, o F539S/M763I/K890N tem especificidade de alvo, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem (FIG. 22).
[1146] A partir dos resultados acima mencionados,
foi confirmado que, as variantes da SpCas9 (F539S/M763I/K890N, F539S/M763I/D965Y/K890N, F539S/M763I/K890N/F1038Y e A203D/N277H/G366S/M763I/F1038Y/T1102P/D1127E) com mutações em três ou mais regiões das quatro regiões da SpCas9 são melhoradas na especificidade do alvo, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem.
[1147] A partir dos resultados acima mencionados, foi confirmado que, as variantes da SpCas9 com mutações em um ou mais aminoácidos selecionados das quatro regiões da SpCas9 foram melhoradas na especificidade do alvo, em comparação com SpCas9 do tipo selvagem.
[APLICABILIDADE INDUSTRIAL]
[1148] Na presente invenção, um sistema de CRISPR- Cas melhorado na especificidade alvo usando uma enzima CRISPR artificialmente manipulada pode ser usada na manipulação ou modificação de genoma e/ou epigenoma, alvejamento de genoma, edição de genoma e diagnóstico in vitro, etc.
[TEXTO LIVRE DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS]
[1149] A Sequência de aminoácidos de SpCas9 do tipo selvagem, sequência de aminoácidos de cada região e sequência de aminoácidos da variante da SpCas9 alvo específica, de acordo com uma modalidade exemplificativa.

Claims (20)

REIVINDICAÇÕES
1. Variante de SpCas9 (Streptococcus pyogenes Cas9) ou um ácido nucleico que codifica a mesma, sendo que a variante de SpCas9 é caracterizada por compreender uma manipulação artificial de um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo que consiste em A203, N277, G366, F539, I601, M763, K890, D965, F1038, T1102 e D1127 em um SpCas9 do tipo selvagem, em que a manipulação artificial é uma deleção ou uma substituição por um ou mais aminoácidos diferentes, em que a variante de SpCas9 tem uma especificidade-alvo aprimorada.
2. Variante de SpCas9, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo aminoácido diferente ser um aminoácido que tem um grupo funcional maior ou menor em tamanho do que o um ou mais aminoácidos selecionados.
3. Variante de SpCas9, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo aminoácido diferente ser um aminoácido tendo um índice de hidropatia maior que um ou mais aminoácidos selecionados.
4. Variante de SpCas9, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela variante de SpCas9 compreender uma manipulação artificial de F539/M763 (F539 e M763), F539/K890, F539/F1038, I601/D965, M763/K890,
M763/F1038, D965/F1038, F539/M763/F1038, F539/M763/K890/D965, F539/M763/K890/F1038 ou A203/N277/G366/M763/F1038/T1102/D1127 na SpCas9 do tipo selvagem.
5. Variante de SpCas9, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela variante de SpCas9 comprender uma manipulação artificial de F539/M763/K890 na SpCas9 do tipo selvagem.
6. Variante de SpCas9, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pela manipulação artificial de F539/M763/K890 ser uma substituição por serina, isoleucina e asparagina, respectivamente, desse modo, a variante de SpCas9 compreende serina na 539ª posição, isoleucina na 763ª posição e asparagina na 890ª posição em uma sequência de aminoácidos da variante de SpCas9.
7. Variante de SpCas9, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela variante de SpCas9 compreender adicionalmente uma manipulação artificial de D10, H840 ou ambas na SpCas9 do tipo selvagem.
8. Variante de SpCas9, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela variante de SpCas9 compreender adicionalmente um ou mais domínios funcionais.
9. Variante de SpCas9, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo domínio funcional ser um ou mais domínios selecionados do grupo consistindo em um domínio tendo atividade de metilase, atividade de desmetilase, atividade de ativação de transcrição, atividade de repressão de transcrição, atividade de fator de liberação de transcrição, atividade de modificação de histona, atividade de clivagem de RNA ou atividade de ligação de ácido nucleico.
10. Variante de SpCas9, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo domínio funcional ser um marcador para isolamento e purificação, uma proteína repórter, uma NLS(sequência ou sinal de localização nuclear), uma NES(sequência ou sinal de exportação nuclear) ou uma desaminase.
11. Composição para modificação de gene, caracterizada por compreender uma Cas9 ou um ácido nucleico que codifica a mesma, e um RNA-guia ou ácido nucleico que codifica o mesmo, em que o Cas9 é uma variante de Streptococcus pyogenes Cas9(SpCas9), em que a variante de SpCas9 compreende uma manipulação artificial de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em A203, N277, G366, F539, I601, M763, K890, D965, F1038, T1102 e D1127 em uma SpCas9 do tipo selvagem, em que a manipulação artificial é uma deleção, ou uma substituição por um ou mais aminoácidos diferentes, em que o RNA-guia compreende uma sequência- guia capaz de formar uma ligação complementar com um gene- alvo.
12. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo aminoácido diferente ser um aminoácido tendo um grupo funcional maior ou menor em tamanho do que o um ou mais aminoácidos selecionados.
13. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo aminoácido diferente ser um aminoácido tendo um índice de hidropatia maior que um ou mais aminoácidos selecionados.
14. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pela variante de SpCas9 compreender uma manipulação artificial de F539/M763 (F539 and M763), F539/K890, F539/F1038, I601/D965, M763/K890, M763/F1038, D965/F1038, F539/M763/F1038, F539/M763/K890/D965, F539/M763/K890/F1038 ou A203/N277/G366/M763/F1038/T1102/D1127 na SpCas9 do tipo selvagem.
15. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pela variante de SpCas9 compreender uma manipulação artificial de F539/M763/K890 em uma SpCas9 do tipo selvagem.
16. Composição, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pela manipulação artificial de F539/M763/K890 ser uma substituição por serina, isoleucina e asparagina, respectivamente, desse modo, a variante de SpCas9 compreende serina na 539ª posição, isoleucina na 763ª posição e asparagina na 890ª posição em uma sequência de aminoácidos da variante de SpCas9.
17. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo ácido nucleico que codifica a Cas9 e o ácido nucleico que codifica o RNA-guia estarem incluídos em um vetor ou cada vetor.
18. Composição, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo vetor ser um plasmídeo ou um vetor viral, em que o vetor viral é um ou mais vetores selecionados de um vetor retroviral, um vetor lentiviral, um vetor adenoviral, vetor viral adeno-associado (AAV), vetor viral de vaccinia, um vetor viral pox e um vetor do vírus do herpes simples.
19. Composição, de acordo com a reivindicação 11, sendo que a composição é caracterizada por compreender uma ribonucleoproteína (RNP) que é um complexo do RNA-guia e da Cas9.
20. Composição, de acordo com a reivindicação 11, sendo que a composição é caracterizada por compreender um ácido nucleico doador que incluir nucleotídeos que codificam um gene de intereste.
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