CN110684675B - 一种三孢布拉氏霉菌发酵方法及其产品 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种三孢布拉氏霉菌发酵方法及其产品，所述方法以菜籽粕为发酵培养基的主要成分，通过三孢布拉霉发酵获得类胡萝卜素。本发明创造性地将量大质优价廉的菜籽粕代替传统培养基成分，利用其对三孢布拉氏霉菌进行发酵生产类胡萝卜素，不仅使菜籽粕这种副产物得到了充分高效的利用，使类胡萝卜素的制造成本降低，提高了类胡萝卜素的生产水平及产品品质，也给类胡萝卜素的生产制造提供了新的策略。

Description

一种三孢布拉氏霉菌发酵方法及其产品

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种三孢布拉氏霉菌发酵方法及其产品。

背景技术

β-胡萝卜素是一种脂溶性不饱和脂肪族碳氢化合物，是类胡萝卜素族的典型代表，也是自然界中最普遍存在最稳定的天然色素，广泛存在于绿色和黄色蔬菜以及水果中。其分子式为C₄₀H₅₆，分子量为536.88，外观呈深红色至暗红色，对氧、热和光不稳定，易发生氧化还原反应，不易溶于水、酸和碱，易溶于氯仿、苯和植物油，微溶于乙醇和乙醚。除了常用作着色剂以外，β-胡萝卜素还具有多种生物活性，是一种与人体健康密切相关的药用有效成分。研究发现，由于β-胡萝卜素的分子式含有2个β-紫罗酮环和4个异戊二烯侧链，中间断裂后即产生两个维生素A分子，在被人体吸收后可以作为维生素A的前体物质；此外，其分子中含有的不饱和结构使它具有较强的抗氧化活性和清除自由基的能力，能够有效的预防、延缓和治疗某些疾病，尤其是癌症，同时也能提高机体的免疫功能。因此，其在食品、药品、化妆品和保健品行业得到了广泛的应用。从来源上有化学合成的β-胡萝卜素和天然β-胡萝卜素两大类。目前大多数β-胡萝卜素(95％以上)是化学合成品，天然来源的β-胡萝卜素主要是以杜氏盐藻或三孢布拉霉为原料发酵获得。

三孢布拉霉属于毛霉目、笄霉科，是单细胞低等真菌，目前已能够实现大规模工业生产，并且它是一种异宗接合菌，包括正菌B.trispora(+)和负j菌B.trispora(-)两种单性菌株。正菌株和负菌株菌丝形态无明显差异，都能独立无性繁殖形成孢子囊和孢囊孢子。目前发酵生产中三孢布拉霉的培养基主要成分为葡萄糖、黄豆饼粉、玉米浆干粉或酵母浸膏、无机盐。目前也已有一些关于制备β-胡萝卜素的报道。

CN104561211A公开了利用有机酸提高三孢布拉氏霉菌生产β-胡萝卜素的方法：1)取三孢布拉氏霉ATCC 14271(+)和14272(-)菌液，涂布于玉米粉琼脂培养基培养；分别从ATCC 14271(+)和14272(-)菌株平板上挑取两环的正、负菌，分别接种到含有种子培养基的锥形瓶中培养，将两种种子液混合，再接入装有发酵培养基的锥形瓶中，加入有机酸，培养，发酵结束后，收获菌体，过滤，清洗，将湿菌体干燥至恒重，得到细胞干重。简单易行、成本低廉、β-胡萝卜素的含量高。

CN101870668A公开了一种从三孢布拉霉菌发酵液制备β-胡萝卜素的方法，包括：过滤三孢布拉霉菌发酵液，得到湿菌丝体；将湿菌丝体真空干燥，得到水分小于10％的干菌丝体；研磨粉碎干菌丝体；用相当于干菌丝体质量15-20倍的二氯甲烷浸提过筛后的干菌丝体，蒸发浓缩浸提液至β-胡萝卜素浓度不低于50000μg/ml后，保温、过滤得到β-胡萝卜素晶体的湿粗品；再用二氯甲烷溶解所述湿粗品，将溶解液过滤、蒸发浓缩至β-胡萝卜素浓度不低于50000μg/ml后，保温、过滤、真空干燥得到β-胡萝卜素晶体。

菜籽粕是油菜籽榨油后的副产物，是非常良好的蛋白来源之一，油菜籽经加工可得约65％油粕，产量巨大。目前菜籽粕主要用于植物肥料或按少量比例添加作反刍动物或淡水鱼养殖饲料，但其应用具有较大的局限性，这主要源于普通菜籽粕中含有较多的抗营养因子、蛋白质变性严重，影响其使用效果。

目前已有利用微生物发酵菜籽饼粕的相关报道，能够在降低抗营养因子的同时提高相对蛋白含量，如CN101434982B公开了一种微生物固态发酵制备菜籽活性肽的方法，将通过压榨或浸出制油工艺得到的菜籽粕粉碎，以具有产蛋白酶能力的单一菌种接入粉碎的菜籽粕进行固态发酵；加水提取固态发酵后的培养基，分离去除残渣，得到菜籽活性肽，是一种低成本、适合工业化大批量制备菜籽活性肽的方法。如CN101492708A公开了一种混菌固态发酵制备生物活性专一的菜籽肽的方法，采用枯草芽孢杆菌、乳酸菌或产朊假丝酵母之一与雅致放射毛霉或宇佐美曲霉复配，制备发酵剂；将该发酵剂接种于粉碎的菜籽粕，进行固态发酵；提取固态发酵后的培养基，得到菜籽肽。上述现有技术提供了提升菜籽粕价值的行之有效的手段，大多数为固态发酵获得的是菜籽粕的发酵产物。

现有技术中关于制备天然β-胡萝卜素的策略还很有限，因此开发出一种低成本、易操作的制备天然β-胡萝卜素的新策略是非常有意义的。

发明内容

菜籽粕目前的应用比较有限，一是由于菜籽粕中纤维素的含量较高，影响了微生物对于蛋白质的利用；二是由于菜籽粕中含有约为2.2％-4.4％的植酸成分，植酸具有很强的螯合阳离子作用，能与金属离子铁、锌、钙、镁、钾等元素以及一些蛋白质形成络合物，大大降低这些元素的生物利用率和蛋白质的生物学效价；另外菜籽粕中含有的硫甙、酚类物质对于微生物的发酵也有不利影响。

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种三孢布拉氏霉菌发酵方法及其产品。该发酵方法创造性地将量大质优价廉的菜籽粕代替酵母浸膏、玉米浆干粉等传统培养基成分，通过三孢布拉氏霉菌进行发酵生产类胡萝卜素，不仅使菜籽粕这种量大质优价廉的副产物得到了充分的利用，使类胡萝卜素的制造成本降低，也给类胡萝卜素的生产制造提供了新的策略。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种三孢布拉氏霉菌发酵方法，所述方法为：以菜籽粕为发酵培养基的主要成分，通过三孢布拉霉发酵获得类胡萝卜素。

通常，利用三孢布拉氏霉菌为原料发酵获得类胡萝卜素时常用的发酵有机氮源主要包括酵母浸膏、玉米浆干粉等传统氮源，而本发明创造性地将量大质优价廉的菜籽粕代替传统培养基成分，通过三孢布拉氏霉菌进行发酵生产类胡萝卜素，不仅使菜籽粕这种副产物得到了充分高效的利用，使类胡萝卜素的制造成本降低，提高了类胡萝卜素的生产水平及产品品质，也给类胡萝卜素的生产制造提供了新的策略。

优选地，所述方法包括如下步骤：

(1)将三孢布拉氏霉菌进行斜面培养；

(2)将步骤(1)得到的三孢布拉氏霉菌在添加有菜籽粕的种子培养基中进行种子培养，得到三孢布拉氏霉菌种子液；

(3)将步骤(2)得到的三孢布拉氏霉菌种子液在添加有菜籽粕的发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵液；

(4)收集步骤(3)得到的发酵液中的菌体，对菌体进行干燥、破壁，经萃取、脱溶处理，得到类胡萝卜素。优选地，所述菜籽粕为经过酶解处理的菜籽粕。

所述将菜籽粕进行酶解后能产生更具有生理活性的肽类，对后期利用菜籽粕对三孢布拉氏霉菌发酵更加有利，因此本发明提供的一种优选技术方案是将菜籽粕进行发酵处理前先经过酶水解预处理。

优选地，所述酶为蛋白酶，蛋白酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶或酸性蛋白酶中的任意一种或至少两种的组合，优选中性蛋白酶。所述至少两种的组合例如碱性蛋白酶和酸性蛋白酶的组合、中性蛋白酶和酸性蛋白酶的组合、中性蛋白酶和碱性蛋白酶的组合等，其他任意可行的组合方式便不在此一一赘述。

优选地，当酸性蛋白酶和碱性蛋白酶联合水解菜籽粕时，加酶顺序为先加碱性蛋白酶后加酸性蛋白酶。

优选地，选用不同类型的蛋白酶根据其性质进行pH调节。

优选地，所述中性蛋白酶的添加量按每克菜籽粕计算为1500-4500U/g，例如1500U/g、2000U/g、2500U/g、3000U/g、3500U/g、4000U/g或4500U/g等。

优选地，所述中性蛋白酶水解菜籽粕的pH值为6-7.5，例如pH＝6、pH＝6.5、pH＝7或pH＝7.5等。

优选地，所述中性蛋白酶水解菜籽粕的温度为30-50℃，例如30℃、35℃、40℃、45℃或50℃等。

优选地，所述中性蛋白酶水解菜籽粕的时间为1-4h，例如1h、2h、3h或4h等。

优选地，在采用蛋白酶处理之前，采用纤维素酶和/或木聚糖酶进行初步酶解，优选纤维素酶。

优选地，木聚糖酶的添加量按每克菜籽粕计算为10-450U/g，最适温度为35-50℃、最适pH为4.5-5.5。

优选地，所述纤维素酶水解菜籽粕的温度为40-60℃，例如40℃、45℃、48℃、50℃、55℃或60℃等。

优选地，所述纤维素酶水解菜籽粕的pH值为3.5-6.0，例如3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0等。

优选地，所述纤维素酶水解菜籽粕的时间为1-2h，例如1h、1.2h、1.5h、1.8h或2h等。

优选地，所述纤维素酶的添加量按每克菜籽粕计算，为10-300U/g，例如10U/g、20U/g、50U/g、80U/g、100U/g、150U/g、180U/g、200U/g、250U/g或300U/g等，优选10-150U/g。

优选地，所述经过酶水解预处理得到的菜籽粕中小肽的质量百分含量为不小于10％，例如10％、15％、20％、25％、30％、40％或50％等。

优选地，所述经过酶水解预处理得到的菜籽粕中小肽的质量百分含量为不少于18％。

所述小肽是指分子量在10000道尔顿以下的小分子蛋白。小肽的溶解度高于粗蛋白，且与菜籽粕中的粗蛋白相比更容易被霉菌所利用。

进行酶解时所限定的上述温度、pH值、时间和添加量都是影响菜籽粕酶解效果的重要因素，只有在上述数值范围的配合下，才能使蛋白酶解的处理效果更佳，最终使得发酵制备类胡萝卜素的含量更高。

优选地，所述菜籽粕为经过植酸酶水解处理的菜籽粕。

由于菜籽粕中存在植酸成分，其中的植酸含量约为2.2％-4.4％，植酸具有很强的螯合阳离子作用，能与金属离子铁、锌、钙、镁、钾等元素以及一些蛋白质形成络合物，大大降低这些元素的生物利用率和蛋白质的生物学效价，因此过量的植酸对于三孢布拉氏霉菌的生长代谢会产生较大影响，阻碍三孢布拉氏霉菌的发酵过程，但是我们发现适量的植酸促进了三孢布拉霉积累类胡萝卜素，可能是植酸能够参与其代谢，所以此处提供的一种优选方案是在菜籽粕进行发酵处理前对菜籽粕中的植酸成分进行降解处理，以促进三孢布拉氏霉菌的发酵。

优选地，所述水解的温度为40-60℃，例如40℃、45℃、48℃、50℃、55℃或60℃等。

优选地，所述水解的pH值为3.5-6.0，例如3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0等。

优选地，所述水解的时间为1-3.5h，例如1h、1.2h、1.5h、1.7h、1.8h、2h或3.5h等。

优选地，所述水解的时间为1-2h，例如1h、1.5h或2h等。

优选地，所述植酸酶的添加量按每克菜籽粕计算，为2-35U/g，例如2U/g、3U/g、5U/g、10U/g、15U/g、20U/g、25U/g、30U/g或35U/g等，优选2-10U/g。

植酸酶进行水解时所限定的上述温度、pH值、时间和添加量都是影响植酸水解效果的重要因素，只有在上述数值范围的配合下，才能使植酸的处理效果更佳，最终使得发酵制备类胡萝卜素的含量更高。

优选地，所述植酸酶的水解处理可与纤维素酶的水解处理同时进行。

优选地，所述植酸酶的添加量按每克菜籽粕计算，为2-10U/g(例如2U/g、3U/g、5U/g或10U/g等)；所述纤维素酶添加量按每克菜籽粕计算，为10-150U/g(例如10U/g、20U/g、50U/g、80U/g、100U/g或150U/g等)。

优选地，所述水解反应pH值为3.5-6.0，例如3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0等。

优选地，所述水解的温度为40-60℃，例如40℃、45℃、48℃、50℃、55℃或60℃等。

优选地，所述水解时间为1-2h，例如1h、1.5h或2h等。

本发明意外地发现使用纤维素酶和植酸酶同时预处理菜籽粕时会对植酸的降解起到更显著的作用，即纤维素酶和植酸酶产生了协同作用，具体表现为，相同条件下能够使菜籽粕中植酸的含量下降更快，还能够促进使得蛋白酶水解后的小肽含量更高，且当纤维素酶的添加量在10-150U/g，植酸酶的添加量为2-10U/g时，具有最佳的协同效果，同时此条件下水解得到的菜籽粕，最益于三孢布拉霉的产物积累。

降低菜籽粕中植酸含量还可以采用以下任一的方式或者与本发明技术方案协同处理：在酸性的条件下对植酸进行萃取；或在萃取之前加EDTA、氯化钠或氯化钙破坏蛋白质和植酸间的络合以进一步降低植酸的含量。当然，本发明还可以采取一些其他处理手段去除菜籽粕中其他的非有利成分，例如用活性炭吸附去硫甙、醇洗沉淀除酚等。

优选地，不同的酶水解步骤间可根据不同酶的性质用pH调节剂如盐酸、氢氧化钠、柠檬酸等将pH调至合适条件。

优选地，酶处理过程中可进行搅拌操作。

优选的，酶处理的体系固液比控制在6-30％，为了突显发明点，本发明实施例中的固液比为20％。

水解完成后的菜籽粕经过干燥即可进行进一步应用，也可以直接将定量的水解液投入发酵培养中使用。

在本发明中，步骤(1)所述将三孢布拉氏霉菌孢子进行斜面培养的方法为：取三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌孢子悬液，分别涂布于PDA斜面培养基上，恒温培养。

所述PDA培养基的配制方式为：将土豆切成1cm方块加入去离子水煮沸30min，冷却后用四层纱布过滤，取过滤后的清液加入葡萄糖和琼脂粉，共包括葡萄糖20g/L，琼脂粉25g/L，去皮土豆200g/L。

优选地，所述恒温培养的温度为20-30℃，例如20℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃等。

优选地，所述恒温培养的时间为5-7天，例如5天、6天或7天。

在本发明中，步骤(2)所述种子培养的方法为：取步骤(1)得到的三孢布拉氏霉菌正菌株和负菌株，分别接种于种子培养基中培养。

优选地，所述种子培养基包括葡萄糖、玉米淀粉、菜籽粕、磷酸二氢钾和硫酸镁。

优选地，所述菜籽粕的浓度为30-50g/L。

优选地，所述种子培养基包括葡萄糖5-15g/L、玉米淀粉25-35g/L、菜籽粕30-50g/L、磷酸二氢钾0.5-2g/L和硫酸镁0.05-0.2g/L。

所述在进行种子培养时菜籽粕的浓度需要特定选择在30-50g/L范围内，低于此浓度，氮源不足，限制菌体生长，生物量偏低，限制了后续的扩培。高于此浓度，氮源过量，对后续细胞产物积累能力造成影响。

所述葡萄糖的浓度可以为5g/L、6g/L、8g/L、9g/L、10g/L、12g/L、13g/L、14g/L或15g/L等。

所述玉米淀粉的浓度可以为25g/L、26g/L、27g/L、28g/L、29g/L、30g/L、31g/L、33g/L或35g/L等。

所述菜籽粕的浓度可以为30g/L、35g/L、36g/L、38g/L、39g/L、40g/L、41g/L、42g/L、44g/L、45g/L或50g/L等。

所述磷酸二氢钾的浓度可以为0.5g/L、0.6g/L、0.8g/L、1.0g/L、1.2g/L、1.5g/L或2g/L等。

所述硫酸镁的浓度可以为0.05g/L、0.1g/L、0.12g/L、0.15g/L或0.2g/L等。

优选地，所述培养的温度为20-30℃，例如20℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃等。

优选地，所述培养的时间为40-50h，例如40h、41h、42h、43h、44h、45h、46h、48h或50h等。

所述培养可以在摇床振摇、种子罐中进行，例如摇床振摇时转速为100-200r/min，例如100r/min、120r/min、150r/min、160r/min、180r/min或200r/min等。

优选地，所述培养环境的pH值为6.5-7.5，例如6.5、6.6、6.8、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5等。

在本发明中，步骤(3)所述发酵培养的方法为：将步骤(2)得到的三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液混合后接种于发酵培养基中培养。

优选地，所述三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液的质量比为1:(0.5-2)，例如1:2、1:1或1:0.5等。

优选地，所述三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液的混合液与发酵培养基的体积比为1:(8-10)，例如1:8、1:8.5、1:9、1:9.5或1:10等。

优选地，所述发酵培养基包括葡萄糖、玉米淀粉、菜籽粕、黄豆饼粉、磷酸二氢钾和硫酸镁。

优选地，所述菜籽粕的浓度为30-60g/L。

优选地，所述发酵培养基包括葡萄糖15-25g/L、玉米淀粉35-45g/L、菜籽粕30-60g/L、黄豆饼粉35-45g/L、磷酸二氢钾0.5-2g/L和硫酸镁0.05-0.2g/L。

所述在进行发酵培养时菜籽粕的浓度需要特定选择在30-60g/L范围内，菜籽粕添加量若低于此浓度范围则会氮源不足，限制菌体生长，高于此浓度范围则会导致氮源过量，抑制菌体代谢，影响产物积累。

所述葡萄糖的浓度可以为15g/L、16g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、24g/L或25g/L等。

所述玉米淀粉的浓度可以为35g/L、36g/L、38g/L、39g/L、40g/L、41g/L、42g/L、44g/L或45g/L等。

所述菜籽粕的浓度可以为30g/L、32g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、52g/L、55g/L或60g/L等。

所述黄豆饼粉的浓度可以为35g/L、36g/L、38g/L、39g/L、40g/L、41g/L、42g/L、44g/L或45g/L等。

所述磷酸二氢钾的浓度可以为0.5g/L、0.6g/L、0.8g/L、1.0g/L、1.2g/L、1.5g/L或2g/L等。

所述硫酸镁的浓度可以为0.05g/L、0.1g/L、0.12g/L、0.15g/L或0.2g/L等。

优选地，所述发酵培养的温度为20-30℃，例如20℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃等。

优选地，所述发酵培养的时间为100-150h，例如100h、110h、115h、120h、125h、130h、135h、140h或150h等。

优选地，所述发酵培养环境的pH值为6.5-7.5，例如6.5、6.6、6.8、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5等。

优选地，所述发酵搅拌转速为100-200r/min，例如100r/min、120r/min、150r/min、160r/min、180r/min或200r/min等。

上述斜面培养、种子培养和发酵培养所涉及的温度、时间等条件都是相互配合作用的，只要在上述各条件的协同配合下，才能使得最终制备得到的类胡萝卜素含量最高。

另外，在本发明中，步骤(4)中所述萃取使用的萃取剂包括乙酸乙酯、乙酸丁酯或乙酸异丁酯。

所述脱溶结束后可对类胡萝卜素进行纯化和结晶。

作为本发明的优选技术方案，所述利用菜籽粕发酵制备类胡萝卜素的方法具体包括如下步骤：

(1)将菜籽粕进行酶解处理，得到菜籽粕处理物，使小肽含量不低于10％；

(2)取三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌孢子悬液，分别涂布于PDA斜面培养基上，在20-30℃下恒温培养5-7天，得到三孢布拉氏霉菌正菌株和三孢布拉氏霉菌负菌株；

(3)取步骤(2)得到的三孢布拉氏霉菌正菌株和负菌株，分别接种于添加有菜籽粕的种子培养基中在20-30℃、pH值为6.5-7.5、培养40-50h，得到三孢布拉氏霉菌正菌种子液和负菌种子液，其中种子培养基中菜籽粕的含量为30-50g/L；

(4)将步骤(3)得到的三孢布拉氏霉菌正菌种子液和负菌种子液以质量比为1:2-1:0.5混合后接种于添加有菜籽粕的发酵培养基中在20-30℃、pH值为6.5-7.5、培养100-150h，得到发酵液，发酵培养基中菜籽粕含量为30-60g/L；

(5)收集步骤(4)得到的发酵液中的菌体后，对菌体进行干燥、破壁，经萃取、脱溶处理，得到类胡萝卜素。

优选地，所述类胡萝卜素为番茄红素和/或β-胡萝卜素。

另一方面，本发明提供一种如上所述的三孢布拉氏霉菌发酵方法制备得到的类胡萝卜素。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明创造性地将量大质优价廉的菜籽粕代替传统培养基成分，利用其对三孢布拉氏霉菌进行发酵生产类胡萝卜素，并建立了完整的三孢布拉氏霉的发酵体系，不仅使菜籽粕这种副产物得到了充分高效的利用，使类胡萝卜素的制造成本降低，提高了类胡萝卜素的生产水平及产品品质，也给类胡萝卜素的生产制造提供了新的策略。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

三孢布拉霉能够生产β-胡萝卜素，也能够通过在发酵过程中添加阻断剂得到产物番茄红素，本发明中为了更好的表现发明目的，所列出的实施例中均以产物β-胡萝卜素为例，但本发明的发明目的并不受限于产物的种类。

本实施例中采用的三孢布拉霉为申请人自行诱变得到的突变菌株，于2014年8月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为：三孢布拉霉BT7251(+)CCTCC M 2014378；三孢布拉霉BT7603(-)CCTCC M 2014379。

实施例1

本实施例提供一种制备β-胡萝卜素的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)取三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌孢子悬液，分别涂布于PDA斜面培养基上，在25℃下恒温培养6天，得到三孢布拉氏霉菌正菌株和三孢布拉氏霉菌负菌株；

(2)取步骤(1)得到的三孢布拉氏霉菌正菌株和负菌株，分别接种于种子培养基中在25℃、pH值为7.0、180r/min摇床振摇下培养48h，得到三孢布拉氏霉菌正菌种子液和负菌种子液；所述种子培养基为：葡萄糖10g/L、玉米淀粉30g/L、菜籽粕40g/L、磷酸二氢钾1g/L和硫酸镁0.1g/L。

(3)将步骤(2)得到的三孢布拉氏霉菌正菌种子液和负菌种子液以质量比为1:1混合后接种于发酵培养基中在25℃、pH值为7.0、培养120h，得到发酵液；所述发酵培养基包括葡萄糖20g/L、玉米淀粉40g/L、菜籽粕50g/L、黄豆饼粉40g/L、磷酸二氢钾1g/L和硫酸镁0.1g/L。

(4)收集步骤(3)得到的发酵液中的菌体后，对菌体进行干燥、破壁，经乙酸乙酯萃取、脱溶处理，得到所述β-胡萝卜素。

实施例2

本实施例提供一种制备β-胡萝卜素的方法，所述方法如下：

(1)将菜籽粕用纤维素酶在50℃下pH值为5的环境中进行水解预处理2h，纤维素添加量为50U/g；再将pH调至7，料液温度降至40℃再加入中性蛋白酶水解2h，其添加量为4000U/g，水解结束后得到处理后的菜籽粕，作为下述各培养基的添加成分；

(2)以下步骤均参照实施例1中的方法，取三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌孢子悬液依次进行斜面培养、种子培养和发酵培养，发酵120h后得到发酵液，然后收集菌体，对菌体进行干燥和破壁，经乙酸乙酯萃取、脱溶处理，得到所述β-胡萝卜素。

实施例3

本实施例提供一种制备β-胡萝卜素的方法，所述方法如下：

(1)将菜籽粕用植酸酶在50℃下pH值为5的环境中进行水解预处理2h，植酸酶的添加量为5U/g，水解结束后得到处理后的菜籽粕，作为下述各培养基的添加成分；

(2)以下步骤均参照实施例1中的方法，取三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌孢子悬液依次进行斜面培养、种子培养和发酵培养，发酵120h后得到发酵液。然后收集菌体，对菌体进行干燥和破壁，经乙酸乙酯萃取、脱溶处理，得到所述β-胡萝卜素。

实施例4

本实施例提供一种制备β-胡萝卜素的方法，所述方法如下：

(1)将菜籽粕用植酸酶、纤维素酶在50℃下pH值为5的环境中进行水解预处理2h，植酸酶的添加量为5U/g，纤维素酶的添加量为50U/g；再调节pH至7，料液温度降至40℃，加入中性蛋白酶进行水解，中性蛋白酶的添加量为4000U/g，水解2h，得到处理后的菜籽粕，作为下述各培养基的添加成分；

(2)取三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌孢子悬液，分别涂布于PDA斜面培养基上，在25℃下恒温培养6天，得到三孢布拉氏霉菌正菌株和三孢布拉氏霉菌负菌株；

(3)以菜籽粕为氮源，取步骤(2)得到的三孢布拉氏霉菌正菌株和负菌株，分别接种于种子培养基中在25℃、pH值为7.0、180r/min摇床振摇下培养48h，得到三孢布拉氏霉菌正菌种子液和负菌种子液；所述种子培养基为：葡萄糖10g/L、玉米淀粉30g/L、菜籽粕40g/L、磷酸二氢钾1g/L和硫酸镁0.1g/L。

(4)以菜籽粕为氮源，将步骤(3)得到的三孢布拉氏霉菌正菌种子液和负菌种子液以质量比为1:1混合后接种于发酵培养基中在25℃、pH值为7.0、培养120h，得到发酵液；所述发酵培养基包括葡萄糖20g/L、玉米淀粉40g/L、菜籽粕50g/L、黄豆饼粉40g/L、磷酸二氢钾1g/L和硫酸镁0.1g/L。

(5)收集步骤(4)得到的发酵液中的菌体后，对菌体进行干燥和破壁，经乙酸乙酯萃取、脱溶处理，得到所述β-胡萝卜素。

实施例5

本实施例提供一种制备β-胡萝卜素的方法，所述方法如下：

(1)将菜籽粕用植酸酶在50℃下pH值为5的环境中进行水解预处理2h，植酸酶的添加量为5U/g；再调节pH至7，料液温度降至40℃，加入中性蛋白酶进行水解，中性蛋白酶的添加量为4000U/g，水解2h，得到处理后的菜籽粕，作为下述各培养基的添加成分；

(2)取三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌孢子悬液，分别涂布于PDA斜面培养基上，在20℃下恒温培养7天，得到三孢布拉氏霉菌正菌株和三孢布拉氏霉菌负菌株；

(3)以菜籽粕为氮源，取步骤(2)得到的三孢布拉氏霉菌正菌株和负菌株，分别接种于种子培养基中在20℃、pH值为7.5、200r/min摇床振摇下培养50h，得到三孢布拉氏霉菌正菌种子液和负菌种子液；所述种子培养基为：葡萄糖5g/L、玉米淀粉25g/L、菜籽粕35g/L、磷酸二氢钾0.5g/L和硫酸镁0.05g/L。

(4)以菜籽粕为氮源，将步骤(3)得到的三孢布拉氏霉菌正菌种子液和负菌种子液以质量比为1:2混合后接种于发酵培养基中在20℃、pH值为7.5、培养120h得到发酵液；所述发酵培养基包括葡萄糖15g/L、玉米淀粉35g/L、菜籽粕45g/L、黄豆饼粉35g/L、磷酸二氢钾0.5g/L和硫酸镁0.05g/L。

(5)收集步骤(4)得到的发酵液中的菌体后，对菌体进行干燥和破壁，经乙酸乙酯萃取、脱溶处理，得到所述β-胡萝卜素。

实施例6

本实施例提供一种制备β-胡萝卜素的方法，所述方法如下：

(1)将菜籽粕用植酸酶、纤维素酶在60℃下pH值为5.5的环境中进行水解预处理1h，植酸酶的添加量为10U/g，纤维素酶的添加量为150U/g；再调节pH至6，料液温度降至30℃，加入中性蛋白酶进行水解，中性蛋白酶的添加量为1500U/g，水解4h，得到处理后的菜籽粕，作为下述各培养基的添加成分；

(2)取三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌孢子悬液，分别涂布于PDA斜面培养基上，在30℃下恒温培养5天，得到三孢布拉氏霉菌正菌株和三孢布拉氏霉菌负菌株；

(3)以菜籽粕为氮源，取步骤(2)得到的三孢布拉氏霉菌正菌株和负菌株，分别接种于种子培养基中在30℃、pH值为6.5、100r/min摇床振摇下培养40h，得到三孢布拉氏霉菌正菌种子液和负菌种子液；所述种子培养基为：葡萄糖15g/L、玉米淀粉35g/L、菜籽粕45g/L、磷酸二氢钾2g/L和硫酸镁0.2g/L。

(4)以菜籽粕为氮源，将步骤(3)得到的三孢布拉氏霉菌正菌种子液和负菌种子液以质量比为2:1混合后接种于发酵培养基中在30℃、pH值为6.5、培养120h得到发酵液；所述发酵培养基包括葡萄糖25g/L、玉米淀粉45g/L、菜籽粕55g/L、黄豆饼粉45g/L、磷酸二氢钾2g/L和硫酸镁0.2g/L。

(5)收集步骤(4)得到的发酵液中的菌体后，对菌体进行干燥、破壁，经乙酸乙酯萃取和脱溶处理，得到所述β-胡萝卜素。

实施例7

(1)将菜籽粕用植酸酶、纤维素酶在40℃下pH值为4.5的环境中进行水解预处理2h，植酸酶的添加量为2U/g，纤维素酶的添加量为10U/g，再调节pH至7.5，料液温度降至45℃，加入中性蛋白酶进行水解，中性蛋白酶的添加量为4500U/g，水解1h，得到处理后的菜籽粕，作为下述各培养基的添加成分；

(2)取三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌孢子悬液，分别涂布于PDA斜面培养基上，在30℃下恒温培养5天，得到三孢布拉氏霉菌正菌株和三孢布拉氏霉菌负菌株；

(3)以菜籽粕为氮源，取步骤(2)得到的三孢布拉氏霉菌正菌株和负菌株，分别接种于种子培养基中在30℃、pH值为6.5、100r/min摇床振摇下培养40h，得到三孢布拉氏霉菌正菌种子液和负菌种子液；所述种子培养基为：葡萄糖15g/L、玉米淀粉35g/L、菜籽粕45g/L、磷酸二氢钾2g/L和硫酸镁0.2g/L。

(4)以菜籽粕为氮源，将步骤(3)得到的三孢布拉氏霉菌正菌种子液和负菌种子液以质量比为2:1混合后接种于发酵培养基中在30℃、pH值为6.5、培养120h，得到发酵液；所述发酵培养基包括葡萄糖25g/L、玉米淀粉45g/L、菜籽粕55g/L、黄豆饼粉45g/L、磷酸二氢钾2g/L和硫酸镁0.2g/L。

(5)收集步骤(4)得到的发酵液中的菌体后，对菌体进行干燥、破壁，经乙酸乙酯萃取和脱溶处理，得到所述β-胡萝卜素。

实施例8

本实施例提供一种制备β-胡萝卜素的方法，所述方法如下：与实施例4的区别仅在于将步骤(3)中“菜籽粕40g/L”替换为“菜籽粕50g/L”；步骤(4)中“菜籽粕50g/L”替换为“菜籽粕60g/L”，其他条件均不变。

实施例9

本实施例提供一种制备β-胡萝卜素的方法，所述方法如下：与实施例4的区别仅在于将步骤(3)中“菜籽粕40g/L”替换为“菜籽粕20g/L”；步骤(4)中“菜籽粕50g/L”替换为“菜籽粕30g/L”，其他条件均不变。

实施例10

本实施例提供一种制备β-胡萝卜素的方法，所述方法与实施例4的区别仅在于步骤(1)中中性蛋白酶的添加量为500U/g，其他条件均不变。

实施例11

本实施例提供一种制备β-胡萝卜素的方法，所述方法与实施例4的区别仅在于步骤(1)中的“纤维素酶”替换为“木聚糖酶”，其他条件均不变。

实施例12

本实施例提供一种制备β-胡萝卜素的方法，所述方法与实施例4的区别为步骤(1)中将菜籽粕用植酸酶、纤维素酶在50℃下pH值为5的环境中进行水解预处理2h，植酸酶的添加量为15U/g，纤维素酶的添加量为50U/g；再调节pH至7，料液温度降至40℃，加入中性蛋白酶进行水解，中性蛋白酶的添加量为4000U/g，水解2h，干燥得到处理后的菜籽粕，作为下述各培养基的添加成分；

其他发酵条件均不变。

对比例1

本对比例提供一种制备β-胡萝卜素的方法，所述方法与实施例4的区别仅在于将步骤(3)(4)中的“菜籽粕”全部替换为“酵母浸膏”，其他条件均不变。

对比例2

本对比例提供一种制备β-胡萝卜素的方法，所述方法与实施例4的区别仅在于将步骤(3)(4)中的“菜籽粕”全部替换为“玉米浆干粉”，其他条件均不变。

评价实验1：

对实施例1-7和实施例10-12中菜籽粕的植酸降解率和小肽的含量进行测定。其中，植酸的测定方法按照GB 17406-1998进行测定；小肽的检测方法采用三氯乙酸酸溶蛋白测定分子量在10000道尔顿以下的小分子蛋白：准确称取样品1.0g(精确至0.001g)，加入15％三氯乙酸(TCA)溶液溶解并定容至50mL，混匀并静置5min，过滤，去除初滤液，滤液作为备用液，然后按照GB/T22492-2008中附录B“肽含量的测定方法”进行测定，即得肽含量。实施例中菜籽粕来源为普通市售未处理的菜籽粕，其中菜籽粕中植酸含量为3.6％，处理后结果如表1所示：

表1

	植酸降解率％	小肽％
			实施例1	-	0.25
实施例2	0.5	10.07
			实施例3	46.8	0.26
实施例4	72.6	24.26
			实施例5	46.5	11.67
实施例6	79.8	18.35
			实施例7	63.4	21.42
实施例10	68.7	8.90
			实施例11	63.2	15.68
实施例12	84.1	22.40

评价实验2：

对上述实施例1-12和对比例1-2制备得到的经过脱溶处理后的发酵液进行菌体中β-胡萝卜素产量和含量的测定。

菌体中β-胡萝卜素含量检测方法：

准确称取样品，破壁后用三氯甲烷反复提取，至样品完全无色，用环己烷定容。

采用紫外分光光度计在455nm处测定吸光度。

β-胡萝卜素含量计算公式如下，计算结果见表1：

其中：A-被测试样品吸光度值；

n-稀释倍数；

m-称取样品重量；

2500-β-胡萝卜素在环己烷中的百分吸光系数

β-胡萝卜素产量测定参考国标GB8821-2011，结果如表2所示(DCW是指每升发酵液中干菌体的质量，通过取样烘干称重得到；BC含量是指β-胡萝卜素在干菌体中的百分比；BC产量是指每升发酵液中β-胡萝卜素的质量)：

表2

根据表1和表2中的数据：实施例1表明直接利用未经预处理的菜籽粕时，三孢布拉氏霉菌就可以利用其作为氮源进行发酵产生β-胡萝卜素，但未经预处理过的菜籽粕作为培养基成分使得三孢布拉氏霉菌生物量和β-胡萝卜素含量都较低。

虽然预处理过的菜籽粕与传统培养基成分相比生物量略有降低，但是其对于β-胡萝卜素产物的积累有促进作用，依然能够使得整体的β-胡萝卜素产量提高10％。并且能够看到菜籽粕中植酸的降解率与其β-胡萝卜素的产量并不成正相关，在降解率为60-80％、植酸的含量约为0.8％-1.31％时，其他条件择优发酵，三孢布拉霉中β-胡萝卜素的累积含量较高。

菜籽粕的含量提高，虽然能够增加生物量，但是并不利于β-胡萝卜素的积累；菜籽粕的含量降低，限制了霉菌的生长，使得生物量偏低。

申请人声明，以上实施例均为摇瓶发酵培养，放大培养时培养基体系依然能够延用，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种三孢布拉氏霉菌发酵方法及其产品，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (27)

1.一种三孢布拉氏霉菌发酵方法，其特征在于，所述方法为：以菜籽粕为发酵培养基的主要成分，通过三孢布拉霉发酵获得类胡萝卜素；

所述菜籽粕为经过中性蛋白酶酶解处理的菜籽粕，且在经过中性蛋白酶酶解处理之前，采用纤维素酶和植酸酶先进行初步水解；

所述纤维素酶的添加量按每克菜籽粕计算，为10-150 U/g；纤维素酶水解菜籽粕的温度为40-60℃，pH值为3.5-6.0，时间为1-2 h；

所述植酸酶的添加量按每克菜籽粕计算，为2-10 U/g；植酸酶水解的温度为40-60℃，pH值为3.5-6.0，时间为1-3.5 h；

所述中性蛋白酶的添加量按每克菜籽粕计算为1500-4500 U/g；中性蛋白酶水解菜籽粕的pH值为6-7.5，温度为30-50℃，时间为1-4 h。

2.如权利要求1所述的三孢布拉氏霉菌发酵方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）将三孢布拉氏霉菌进行斜面培养；

（2）将步骤（1）得到的三孢布拉氏霉菌在添加有菜籽粕的种子培养基中进行种子培养，得到三孢布拉氏霉菌种子液；

（3）将步骤（2）得到的三孢布拉氏霉菌种子液在添加有菜籽粕的发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵液；

（4）收集步骤（3）得到的发酵液中的菌体，对菌体进行干燥、破壁，经萃取、脱溶处理，得到类胡萝卜素。

3.如权利要求1所述的三孢布拉氏霉菌发酵方法，其特征在于，所述经过酶水解预处理得到的菜籽粕中小肽的质量百分含量为不小于10%。

4.如权利要求1所述的三孢布拉氏霉菌发酵方法，其特征在于，所述经过酶水解预处理得到的菜籽粕中小肽的质量百分含量为不少于18%。

5.如权利要求1所述的三孢布拉氏霉菌发酵方法，其特征在于，所述植酸酶水解的时间为1-2 h。

6.如权利要求1所述的三孢布拉氏霉菌发酵方法，其特征在于，所述植酸酶的水解处理与纤维素酶的水解处理同时进行。

7.如权利要求6所述的三孢布拉氏霉菌发酵方法，其特征在于，所述植酸酶的添加量按每克菜籽粕计算，为2-10 U/g；所述纤维素酶添加量按每克菜籽粕计算，为10-150 U/g。

8.如权利要求6所述的三孢布拉氏霉菌发酵方法，其特征在于，所述水解处理的pH值为3.5-6.0。

9.如权利要求6所述的三孢布拉氏霉菌发酵方法，其特征在于，所述水解处理的温度为40-60℃。

10.如权利要求6所述的三孢布拉氏霉菌发酵方法，其特征在于，所述水解处理的时间为1-2 h。

11.如权利要求2所述的三孢布拉氏霉菌发酵方法，其特征在于，步骤（2）所述种子培养的方法为：取步骤（1）得到的三孢布拉氏霉菌正菌株和负菌株，分别接种于种子培养基中培养。

12.如权利要求11所述的三孢布拉氏霉菌发酵方法，其特征在于，所述种子培养基包括葡萄糖、玉米淀粉、菜籽粕、磷酸二氢钾和硫酸镁。

13.如权利要求12所述的三孢布拉氏霉菌发酵方法，其特征在于，所述菜籽粕的浓度为30-50 g/L。

14.如权利要求11所述的三孢布拉氏霉菌发酵方法，其特征在于，所述种子培养基包括葡萄糖5-15 g/L、玉米淀粉25-35 g/L、菜籽粕30-50 g/L、磷酸二氢钾0.5-2 g/L和硫酸镁0.05-0.2 g/L。

15.如权利要求11所述的三孢布拉氏霉菌发酵方法，其特征在于，所述培养的温度为20-30℃。

16.如权利要求11所述的三孢布拉氏霉菌发酵方法，其特征在于，所述培养的时间为40-50 h。

17.如权利要求11所述的三孢布拉氏霉菌发酵方法，其特征在于，所述培养的环境的pH值为6.5-7.5。

18.如权利要求2所述的三孢布拉氏霉菌发酵方法，其特征在于，步骤（3）所述发酵培养的方法为：将步骤（2）得到的三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液混合后接种于发酵培养基中培养。

19.如权利要求18所述的三孢布拉氏霉菌发酵方法，其特征在于，所述三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液的质量比为1:(0.5-2)。

20.如权利要求18所述的三孢布拉氏霉菌发酵方法，其特征在于，所述三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液的混合液与发酵培养基的体积比为1:(8-10)。

21.如权利要求18所述的三孢布拉氏霉菌发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基包括葡萄糖、玉米淀粉、菜籽粕、黄豆饼粉、磷酸二氢钾和硫酸镁。

22.如权利要求21所述的三孢布拉氏霉菌发酵方法，其特征在于，所述菜籽粕的浓度为30-60 g/L。

23.如权利要求18所述的三孢布拉氏霉菌发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基包括葡萄糖15-25 g/L、玉米淀粉35-45 g/L、菜籽粕30-60 g/L、黄豆饼粉35-45 g/L、磷酸二氢钾0.5-2 g/L和硫酸镁0.05-0.2 g/L。

24.如权利要求18所述的三孢布拉氏霉菌发酵方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为20-30℃。

25.如权利要求18所述的三孢布拉氏霉菌发酵方法，其特征在于，所述发酵培养的时间为100-150 h。

26.如权利要求18所述的三孢布拉氏霉菌发酵方法，其特征在于，所述发酵培养的环境的pH值为6.5-7.5。

27.如权利要求2所述的三孢布拉氏霉菌发酵方法，其特征在于，步骤（4）中所述萃取使用的萃取剂包括乙酸乙酯、乙酸丁酯或乙酸异丁酯。