CN116200528A - 与小麦抗条锈病基因QYr.sicau.-2BL连锁的SNP分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了与小麦抗条锈病基因QYr.sicau.‑2BL连锁的SNP分子标记及应用，属于分子育种技术领域。所述SNP分子标记利用如SEQ ID NO.1～3所示特异性引物组扩增得到；所述SNP分子标记与小麦抗条锈病QTL QYr.sicau.‑2BL共定位于小麦2B染色体长臂上，多态性为T/C。该分子标记能准确跟踪所述小麦抗条锈病基因QYr.sicau‑2BL，预测小麦的抗条锈病特性，进而方便进行分子设计育种。本发明还提供鉴定小麦抗条锈病的方法，能够加强抗条锈病预测的准确性，便于快速筛选出抗条锈病的小麦品种或品系，大大加快小麦高产量品种的选育进程。
Description
技术领域
本发明涉及分子育种技术领域，特别是涉及与小麦抗条锈病基因QYr.sicau.-2BL连锁的SNP分子标记及应用。
背景技术
小麦是世界主要粮食作物，其安全生产对保障全球粮食安全具有重要意义。由条形柄锈菌小麦专化型(Puccinia striiformis Westend.f.sp.tritici Erikss.,Pst)引起的小麦条锈病是世界性重要病害。条锈病具有发生频率高、流行范围广、危害程度大等特点。条锈菌为活体寄生菌，主要侵染小麦叶片，亦也可侵染茎秆、穗部、叶鞘和颖壳等部位，从小麦细胞吸收营养，破坏叶组织，降低光合作用，最终造成小麦减产甚至绝收。发掘抗病基因，培育抗条锈病品种是防治条锈病危害的最有效措施。
目前，从小麦及其近缘物种中报道了84个(Yr1-Yr84)正式命名和大批暂命名的抗条锈病基因。由于条锈菌致病性变异频繁，新毒性生理小种的流行，导致生产上单一抗源为主的品种，在大面积推广3-5年后便“丧失”对条锈病的抗性。小麦中报道的抗条锈病基因，大多数已丧失了对新毒性小种的抗性。因此，亟需发掘新型条锈病抗源以及开发育种选择分子标记。
近年来，基于生物个体间基因组序列单碱基多态性(Single nucleotidepolymorphism，SNP)标记被成功开发。SNP标记位点广泛存在于基因组中，具有较高的稳定性，可以实现高通量检测。以SNP为基础的第三代KASP(Kompetitive allele specificPCR)分子标记基于引物末端碱基的特异匹配，对SNP分型以及检测InDels，可以快速、经济、高效、灵活地实现SNP分子标记检测，在基因定位及分子标记辅助选择育种等方面发挥了重要作用。基于此，开发与抗条锈病位点紧密连锁的高通量KASP分子标记，对于实现抗条锈病位点的快速检测、自动化分子育种，加快抗条锈病小麦新品种的培育具有重要的价值和意义。
发明内容
本发明的目的是提供与小麦抗条锈病基因QYr.sicau.-2BL连锁的SNP分子标记及应用，以解决上述现有技术存在的问题，该SNP分子标记与抗条锈病基因QYr.sicau.-2BL紧密连锁，能够准确鉴别出抗小麦条锈病植株，对于小麦种质资源改良、小麦抗条锈病材料创制或小麦分子辅助育种具有重要意义。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供与小麦抗条锈病基因QYr.sicau.-2BL连锁的SNP分子标记，所述SNP分子标记利用如SEQ ID NO.1～3所示特异性引物组扩增得到。
优选的是，如SEQ ID NO：1-2所示的上游引物5’端分别修饰不同的荧光基团。
优选的是，所述SNP分子标记与小麦抗条锈病QTL QYr.sicau.-2BL共定位于小麦2B染色体长臂上，多态性为T/C。
本发明还提供用于检测所述的SNP分子标记的特异性引物组，所述特异性引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示。
本发明还提供用于检测所述的SNP分子标记的试剂盒，包含所述的特异性引物组。
本发明还提供一种鉴定小麦抗条锈病的方法，包括：
1)提取待测植株的基因组DNA；
2)以待测植株的基因组DNA为模板，利用扩增SNP分子标记(KASP-2BL1)的引物，在仪器CFX96Real-Time System，进行PCR扩增反应并读取荧光值；
3)检测PCR扩增产物荧光，如果能够读取引物SEQ ID NO.2是荧光，则待测植株为具有抗条锈病性状的小麦资源。
优选的是，用于扩增所述SNP分子标记的反应体系为：1.4μL混合引物、0.5μL DNA模板、3.1μL ddH2O以及5μLHiGeno 2×Probe Mix B；所述混合引物为0.168μL SEQ IDNO.1所示上游引物、0.168μL SEQ ID NO.2所示上游引物、0.42μL SEQ ID NO.3所示下游引物以及0.644μL ddH2O；
用于扩增所述SNP分子标记的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性20s，61～55℃退火延伸40s，10个循环，每个循环退火延伸低0.6℃；95℃变性20s，55℃退火延伸60s，30个循环。
本发明还提供所述的SNP分子标记、所述的特异性引物组或者所述的试剂盒在小麦种质资源改良、小麦抗条锈病材料创制或者小麦分子辅助育种中的应用。
本发明还提供所述的SNP分子标记、所述的特异性引物组或者所述的试剂盒在鉴定抗条锈病小麦中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
(1)本发明公开了位于小麦2B染色体上的与小麦抗条锈病连锁的分子标记KASP-2BL1，该分子标记是小麦2B染色体长臂上抗条锈病QTL QYr.sicau.-2BL的侧翼标记，连锁度高。该标记可用来检测小麦2B染色体上的抗条锈病QTL，快速筛选具有该位点的植株，进而方便进行高抗小麦的分子辅助育种。本发明提供的分子标记KASP-2BL1与小麦2B上的抗条锈病QTL QYr.sicau.-2BL紧密连锁，可用来对小麦抗条锈病这一性状进行定位，从而在育种过程中淘汰感病的植株，提高育种工作效率，并为小麦抗条锈病基因的研究提供基础。
(2)本发明首次公开了来自小麦‘AS286’的抗条锈病QTL QYr.sicau.-2BL，其位于小麦2B染色体长臂上，显著增加小麦抗条锈性。该QTL在小麦抗病性(抗条锈性)育种中具有较高的利用价值。
(3)本发明首次公开了基于荧光定量PCR平台精确检测小麦‘AS286’的抗条锈病QTL QYr.sicau.-2BL的分子标记KASP-2BL1，且为共显性标记，检测准确高效、扩增方便稳定。
(4)本发明公开的分子标记KASP-2BL1与抗条锈病QTL QYr.sicau.-2BL极显著相关，呈现共分离标记特征，用于分子标记辅助选择的准确性高，提高适应不同环境的小麦抗条锈病品种的选择鉴定效率，且成功率高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中小麦抗条锈病QTL QYr.sicau.-2BL在2B染色体上的定位区段；
图2为本发明实施例1中‘Langdon’בAS286’的重组自交系株系植株分子标记KASP-2BL1检测的荧光读值结果；其中，HEX(蓝色，‘AS286’)荧光为抗条锈病的株系，FAM(橙色，‘Langdon’)荧光为感病株系；绿色荧光为杂合株系；黑色荧光为空白对照。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例所用小麦‘Langdon’、‘AS286’均保藏在四川农业大学小麦研究所，并在申请日前已在下述文献公开“Frequent occurrence of unreduced gametes inTriticumturgidum–Aegilops tauschii hybrids，Zhang et al.2010,Euphytica,172:285–294”，并且申请人承诺申请日起20年内向公众开放。
实施例1小麦抗条锈病基因QYr.sicau.-2BL及其分子标记KASP-2BL1的获得
1、供试材料
利用四川农业大学小麦研究所保存的高感条锈病硬粒小麦‘Langdon’为母本、高抗条锈病四倍体小麦品种‘AS286’为父本杂交，得到杂种F1，F1代单株自交获得F2，从F2使用单穗传法，一直到F7代，获得含有102个系的重组自交系，构成遗传作图群体。
2、条锈病抗性鉴定
条锈病抗性鉴定使用小种，为我国当前流行条锈菌生理小种(CYR32、CYR33、CYR34、Zhong4和HY46)和单小种CYR34，均由甘肃省农科院植保所提供。田间条锈菌接种方法为：将条锈菌混合小种与滑石粉采用1:20的质量比混合，通过涂抹法接种诱发材料。具体操作方法如下：戴上手套，用大拇指和食指将菌混合物涂抹在指拇肚上，再轻轻掐取诱发材料刚长出的幼叶，将菌混合物接种在幼叶伤口处。待诱发完全发病时，进行条锈抗性鉴定，每周一次，共调查三次，参考0-9级鉴定标准(Line and Qayoum,1992,Virulence,aggressiveness,evolution,and distribution of races of Puccinia striiformis(the cause of stripe rust of wheat)in North America,1968-87.TechnicalBulletin-USDA)。鉴定抗性表型记为QYr.sicau.-2BL的形态标记数据，进行QTL分析。这样在连锁图上定位到的位置就是QYr.sicau.-2BL基因所在位置。
3、基因组DNA提取
采用CTAB(Cetyltrimethylammonium Bromide，十六烷基三甲基溴化铵)法提取亲本Langdon、AS286、F2分离群体以及RIL群体植株叶片基因组DNA(Rogers and Bendich1985,Plant Mol.Biol.,1985,5:69-76)。
4、55K SNP芯片分析
使用超微量分光光度计对提取的DNA进行质量检测，合格DNA送北京中玉金标记有限公司(http://www.cgmb.com.cn/)公司进行55K SNP芯片分型，利用IciMapping V4.2构建遗传图谱。用QTL IciMapping V4.2中的完备区间作图法(Inclusive CompositeInterval Mapping-ADD，ICIM-ADD)，设置阀值LOD≥2.5，利用2020-2022两年共3个生态点的条锈病抗性表型及3个生态点条锈病的BLUP(最佳线性无偏预测，Best Linear UnbiasedPrediction)值来检测QTL，定位出小麦抗条锈病QTL QYr.sicau.-2BL，并计算QYr.sicau.-2BL的位置和分子标记之间的遗传距离。
结果显示：小麦抗条锈病位点QYr.sicau.-2BL，来自父本‘AS286’，该QTL位于小麦染色体2B长臂，对应于中国春参考基因组RefSeqv1.0的物理距离约8Mb(792Mb-800Mb)(见图1)。
5、混池转录组测序分析(BSR-Seq)
从‘Langdon’בAS286’的F2群体中，筛选极端抗病单株30个和极端感病单株30个分别构建抗感池，与亲本‘AS286’和‘Langdon’共四个样进行BSR-seq测序。将BSR-Seq获得的SNP数据，去除双亲中表现杂合的SNP和在双亲及抗感池中的质量低于10％的SNP后，共获得27143个高质量SNP。通过计算抗感池中的等位基因差异变异频率(ΔSNP-index)，获得ΔSNP-index≥0.8的SNP共计77个。
6、抗条锈病基因QYr.sicau.-2BL连锁标记开发
对获得的77个SNP进行染色体数量分布和滑窗作图，发现其中的27个位于2B染色体，其中有20个富集于2BL端部的2Mb区间，结合QTL QYr.sicau.-2BL区间，根据关联区域和ΔSNP-index值在抗感双亲、抗感池鉴定到1个高可信度SNP位于野生二粒小麦参考基因组V2版本2B染色体的824787436位碱基。提取该SNP的前后100碱基序列设计KASP标记，利用小麦族多组学数据网站(http://202.194.139.32/)预测引物特异性。利用该KASP标记对抗病亲本‘AS286’、抗病池和感病亲本‘Langdon’、感病池及后代群体的基因组DNA进行KASP扩增反应。其中，KASP-2BL1的KASP分子标记扩增引物组包括3条引物，分别为：SEQ ID NO.1、SEQID NO.2和SEQ ID NO.3。如下所示：
FAM标签上引物：(下划线部分为FAM标签序列)
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATCAGGCTTTCCGCCGCC-3’(SEQ ID NO.1)；
HEX标签上引物：(下划线部分为HEX标签序列)
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATCAGGCTTTCCGCCGCT-3’(SEQ ID NO.2)；
通用下游引物：
5’-CGTAGTCGAGGAGGAGCAAC-3’(SEQ ID NO.3)。
上述PCR扩增的扩增体系为：5μL HiGeno 2×Probe Mix B；3.1μL ddH2O；1.4μL混合引物[将0.168μL FAM标签上引物(10mM/μL)、0.168μL HEX标签上引物(10mM/μL)、0.42μL通用下游引物(10mM/μL)和0.644μL ddH2O混合]，0.5μL模板DNA(100ng/μL)。同时，需添加至少3个独立的以双蒸水代替DNA模板的空白。
PCR扩增程序，具体如下：
(1)95℃预变性10min；
(2)95℃变性20s，61～55℃退火延伸40s，10个循环，每个循降退火延伸低0.6℃；
(3)95℃变性20s，55℃退火延伸60s，30个循环。
PCR扩增结果，基因分型具体如下：
(1)若检测到SEQ ID NO.2对应的碱基T，则判断待测小麦材料含有纯合QYr.sicau.-2BL基因；
(2)若检测到SEQ ID NO.1对应的碱基C，则判断待测小麦材料不含QYr.sicau.-2BL基因；
(3)若SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2同时检测到C和T，则判断待测材料含有杂合的QYr.sicau.-2BL基因。
如图1所示，结果显示：抗感材料成功分型，将该KASP分子标记命名为KASP-2BL1，该分子标记与小麦抗条-锈病QTL QYr.sicau.-2BL共定位于小麦2B长臂上，遗传连锁分析表明KASP-2BL1与抗条锈病基因QYr.sicau.-2BL紧密连锁，且与QYr.sicau.-2BL之间的遗传距离小于1.5cM。所述KASP分子标记的多态性为T/C。该SNP分子标记平均LOD值为6.30，可解释31.43％的表型变异。
实施例2分子标记KASP-2BL1在选择抗条锈病QTL QYr.sicau.-2BL上的应用
1、利用感条锈病的四倍体小麦品系‘Langdon’为母本，抗条锈病的硬粒小麦品系‘AS286’为父本，构建重组自交系，在重组自交系中随机选择64个株系。
2、对所获得的64个株系进行KASP-2BL1标记检测，具体方法为：提取64个株系的DNA；将其作为模板，以分子标记KASP-2BL1的特异性引物对为引物进行PCR扩增并进行荧光读值，所述标记KASP-2BL1引物为：
FAM标签上引物：(下划线部分为FAM标签序列)
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATCAGGCTTTCCGCCGCC-3’(SEQ ID NO.1)；
HEX标签上引物：(下划线部分为HEX标签序列)
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATCAGGCTTTCCGCCGCT-3’(SEQ ID NO.2)；
通用下游引物：
5’-CGTAGTCGAGGAGGAGCAAC-3’(SEQ ID NO.3)。
利用上述实施例1中的PCR扩增体系和扩增程序完成荧光读值。
如图2所示，为荧光读值结果，将检测到与‘AS286’一致的HEX(蓝色)荧光的植株基因型记为A，为抗条锈病株系，同‘Langdon’一样表现为FAM(橙色)荧光的植株基因型记为B，为感病型株系。各个株系基因型与4个生态点条锈病的BLUP值如表1所示。在标记KASP-2BL1中与含有抗条锈病QTL QYr.sicau.-2BL的‘AS286’类型相同的植株平均条锈侵染型IT＝1.65，极显著低于与‘Langdon’类型的植株的平均条锈侵染型IT＝7.0。实际结果与预期结果一致，说明本发明的抗条锈病QTL QYr.sicau.-2BL确实有显著增高抗条锈病的作用；同时本发明的分子标记KASP-2BL1可以用与跟踪鉴定抗条锈病QTL QYr.sicau.-2BL。
表1‘Langdon’בAS286’F7重组自交系KASP-2BL1基因型与表型对应结果
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.与小麦抗条锈病基因QYr.sicau.-2BL连锁的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记利用如SEQ ID NO.1～3所示特异性引物组扩增得到。
2.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，如SEQ ID NO：1-2所示的上游引物5’端分别修饰不同的荧光基团。
3.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记与小麦抗条锈病QTL QYr.sicau.-2BL共定位于小麦2B染色体长臂上，多态性为T/C。
4.用于检测权利要求1所述的SNP分子标记的特异性引物组，其特征在于，所述特异性引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示。
5.用于检测权利要求1所述的SNP分子标记的试剂盒，其特征在于，包含权利要求4所述的特异性引物组。
6.一种鉴定小麦抗条锈病的方法，其特征在于，包括以待测植物样品DNA为模板，扩增权利要求1-3任一项所述的SNP分子标记，根据扩增产物的荧光判断待测植株是否抗条锈病。
7.根据权利要求6所述的鉴定小麦抗条锈病的方法，其特征在于，用于扩增所述SNP分子标记的反应体系为：1.4μL混合引物、0.5μL DNA模板、3.1μL ddH2O以及5μLHiGeno 2×Probe Mix B；所述混合引物为0.168μL SEQ ID NO.1所示上游引物、0.168μL SEQ ID NO.2所示上游引物、0.42μL SEQ ID NO.3所示下游引物以及0.644μLddH2O；
用于扩增所述SNP分子标记的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性20s，61～55℃退火延伸40s，10个循环，每个循环退火延伸低0.6℃；95℃变性20s，55℃退火延伸60s，30个循环。
8.根据权利要求6所述的鉴定小麦抗条锈病的方法，其特征在于，所述扩增产物若能读取出如SEQ ID NO.2所示引物修饰后的荧光，则待测植株为抗条锈病植株。
9.根据权利要求1-3任一项所述的SNP分子标记、权利要求4所述的特异性引物组或者权利要求5所述的试剂盒在小麦种质资源改良、小麦抗条锈病材料创制或者小麦分子辅助育种中的应用。
10.根据权利要求1-3任一项所述的SNP分子标记、权利要求4所述的特异性引物组或者权利要求5所述的试剂盒在鉴定抗条锈病小麦中的应用。
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| CN111793712A (zh) * | 2020-07-28 | 2020-10-20 | 湖北省农业科学院粮食作物研究所 | 小麦snp iwa586位点的单核苷酸多态性的物质的用途 |
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