CN115820924A - 一种鉴定或者辅助鉴定西瓜果皮硬度的引物对和试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子标记辅助育种技术领域,具体涉及一种鉴定或者辅助鉴定西瓜果皮硬度的引物对和试剂盒及应用。本发明提供了一种鉴定或者辅助鉴定西瓜果皮硬度的引物对,所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的下游引物。采用本发明提供的根据InDel‑P159分子标记设计的引物对,可以准确快速的鉴定西瓜果皮硬度性状。
Description
技术领域
本发明属于分子标记辅助育种技术领域,具体一种鉴定或者辅助鉴定西瓜果皮硬度的引物对和试剂盒及应用。
背景技术
西瓜(Citrulluslanatus)是重要的经济作物之一,我国是西瓜生产与消费第一大国。对西瓜市场及产业发展趋势分析表明,我国西瓜消费量呈波动上升趋势。随着市场需求的增加,对西瓜品种多元化、差异化的需求也相应增加,同时,对优质、耐储运的偏好呈不断增强态势。裂果是降低西瓜商品性的重要因素之一。关于耐裂基因,部分学者进行了分子水平的研究,如Liao等(Liaoetal,Ethylene-responsivefactor4isassociatedwiththedesirablerindhardnesstrait conferringcrackingresistanceinfreshfruitsofwatermelon,Plant Biotechnology,Journal,2020,18:1066-1077)运用高通量测序方法以及KASP分子标记将西瓜耐裂基因精细定位于10号染色体9732bp(2,673,328-2,682,700bp)区间,发现该区间内ClERF4基因可能与西瓜耐裂性相关。基于ClERF4基因序列差异开发KASP标记,该标记可以对104个种质资源进行基因分型,为耐裂材料筛选提供了技术支撑。
研究表明,果皮硬度与耐裂性高度相关,是果实耐贮性的主要内在因素(赵尊练和王鸣,西瓜种质果实耐贮性机理的研究[J],园艺学报,1994,(01):99-100)。通过果皮硬度性状的改良,对于创制优质、高硬度耐裂、耐贮运西瓜新品种意义重大。目前,对西瓜果皮硬度的研究主要集中在生理生化和细胞水平上,发现西瓜果皮硬度由果皮细胞结构和内含物含量等多因素决定(王学征等,西瓜果皮硬度相关性状分析[J],东北农业大学学报,2020,51(02):35-44)。果皮特性主要由果皮厚度、表皮角质层厚度、外果皮细胞层数及石细胞群尺寸等决定(满艳萍和张建农,不同贮运性西瓜果皮显微结构的差异[J].,甘肃农业大学学报,2006,(04):64-67.)。果胶、纤维素和半纤维素是细胞壁物质的主要成分(高磊,西瓜果肉硬度和酸味性状的转录组分析及主效基因的精细定位[D].中国农业科学院,2018)。其中,果皮厚度、果皮韧性和半纤维素含量是与果皮硬度紧密关联的性状(王学征等,西瓜果皮硬度相关性状分析,东北农业大学学报[J].2020,51(02):35-44)。不同西瓜品种间果皮硬度在果皮细胞结构和内含物含量上相差较大。张敬敬等(张敬敬等,不同硬度西瓜果皮的转录组测序及相关基因表达分析[J].华北农学报,2022,37(03):44-52.)对果皮硬度差异显著的两份材料进行转录组测序分析,鉴定到19个与果皮硬度相关的差异表达基因,这些基因均富集于苯丙烷代谢通路。目前从分子水平对西瓜果皮硬度性状鉴定的研究相对较少,用于鉴定西瓜果皮硬度性状的InDel分子标记还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鉴定或者辅助鉴定西瓜果皮硬度的引物对,应用该引物对可以准确快速的鉴定西瓜果皮硬度性状。
本发明提供了一种鉴定或者辅助鉴定西瓜果皮硬度的引物对,所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的下游引物。
优选的,所述引物对以InDel-P159分子标记作为检测靶标。
优选的,所述InDel-P159分子标记位于西瓜6号染色体第25282282bp位碱基处,InDel分子标记的长度为199bp和/或220bp,即多态性表现为21bp,,参照基因组Watermelon(97103)v2.5Genome确定。
本发明提供了一种鉴定或者辅助鉴定西瓜果皮硬度的试剂盒,包括上述技术方案所述的引物对和PCR扩增用试剂。
优选的,所述引物对中的上游引物浓度为9~11μmol/L,下游引物浓度为9~11μmol/L。
本发明提供了上述技术方案所述的引物对或上述技术方案所述的试剂盒在鉴定或者辅助鉴定西瓜果皮硬度中的应用。
本发明提供了一种鉴定或者辅助鉴定西瓜果皮硬度的方法,包括以下步骤:
1)提取待鉴定西瓜基因组DNA;
2)以所述待鉴定西瓜基因组DNA为模板,采用上述技术方案所述引物对进行PCR扩增,获得PCR扩增产物;
3)对所述PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,若扩增出1条条带且PCR扩增产物的分子量为220bp则判定为高硬度耐裂西瓜,若扩增出1条条带且PCR扩增产物的分子量为199bp则判定为低硬度易裂西瓜。
优选的,所述PCR扩增的体系以15μL计,包括:7.5μL2×T5PCRMix、4.5μLddH2O、正反引物1μL、反向引物1μL和DNA模板1μL。
优选的,所述PCR扩增的程序为:98℃预变性2min;98℃变性10s,58℃退火10s,72℃延伸10s,35个循环;72℃延伸5min,12℃保存。
优选的,所述高硬度耐裂西瓜为果皮硬度值大于或等于9.0N的西瓜;所述低硬度易裂西瓜为果皮硬度值小于9.0N的西瓜。
本发明的有益效果:本发明提供了一种鉴定或者辅助鉴定西瓜果皮硬度的引物对,所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示的下游引物。采用本发明提供的InDel-P159分子标记设计的引物对,可以准确快速的鉴定西瓜果皮硬度性状。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为西瓜亲本及RILs群体果皮硬度分布;
图2为西瓜果皮硬度基因定位结果;
图3InDel-P159引物在亲本及RILs群体中多态性扩增(部分),泳道1为分子量Marker;泳道2为父本PCR产物;泳道3为母本PCR产物;泳道4~21为RILs群体高硬度耐裂单株的PCR产物;泳道22~35为RILs群体低硬度易裂单株的PCR产物;
图4InDel-P159在自然群体中的扩增。泳道1为分子量Marker;泳道2为自然群体高硬度耐裂亲本PCR产物;泳道3为自然群体低硬度易裂亲本PCR产物;泳道4~40为37份自然群体材料的PCR产物。
具体实施方式
本发明提供了一种鉴定或者辅助鉴定西瓜果皮硬度的引物对,所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的下游引物。本发明所述鉴定或者辅助鉴定西瓜果皮硬度的引物对可以PCR扩增出InDel-P159分子标记。
表1引物对的核苷酸序列
在本发明中,所述引物对鉴定或者辅助鉴定西瓜果皮硬度时优选以InDel-P159分子标记作为检测靶标,本发明所述InDel-P159分子标记优选位于西瓜6号染色体第25282282bp位碱基处,InDel-P159分子标记的长度为199bp和/或220bp,即多态性表现为21bp,参照基因组Watermelon(97103)v2.5Genome确定。
在本发明中,所述InDel-P159分子标记的设计思路优选为:以西瓜Watermelon(97103)v2.5Genome基因组为参考,对西瓜RIL遗传分离群体(2个亲本和69个子代)进行重测序,利用R/qtl软件对RILs群体西瓜果皮硬度进行性状关联,将目标基因定位在西瓜6号染色体的24650194~25285524bp的635.33kb的区间内。针对区间内InDel位点设计InDel分子标记,在父、母本及RIL群体中验证InDel基因位点,获得与西瓜果皮硬度基因连锁的InDel-P159分子标记。该标记位于西瓜6号染色体第25282282bp位碱基处,InDel分子标记的长度为199bp和/或220bp,即多态性表现为21bp。
本发明提供了与西瓜果皮硬度基因紧密连锁的InDel-P159分子标记,本发明的InDel-P159分子标记操作简单、快捷,仅一次PCR扩增即可实现苗期准确快速的鉴定西瓜果皮硬度。现有技术中关于西瓜果皮硬度性状的研究相对较少,开发与果皮硬度性状相关的分子标记应用于果皮硬度性状改良的初期筛选,在西瓜幼苗期对西瓜果皮硬度性状进行快速筛选,加速西瓜果皮硬度性状的改良,达到分子标记辅助选择的目的,极大地缩短育种周期提高育种效率。
在本发明中,所述InDel-P159分子标记的获得方法优选包括以下步骤:以低硬度易裂西瓜品种为母本与高硬度耐裂西瓜品种为父本杂交得到杂种F1代、F1代自交得到RILs群体;以RILs群体为实验材料测定西瓜果皮硬度,对RILs群体西瓜果皮硬度进行性状关联QTL定位;确定QTL候选区间内的InDel位点,InDel位点进行引物设计,多态性验证后得到InDel分子标记。
本发明以低硬度易裂西瓜品种为母本与高硬度耐裂西瓜品种为父本杂交,得到杂种F1代。由杂种F1代自交多代得到RILs群体。本发明所述母本优选的为低硬度易裂西瓜品种K3,所述父本优选为高硬度耐裂品种西瓜品种PI189225。在本发明对所述杂交的方法无其他特殊要求,采用本领域常规的杂交方法即可。本发明在获得杂种F1代后,由F1代自交多代得到RILs群体,本发明中所述F1代自交的方法采用本领域常规的自交方法即可。
本发明优选以RILs群体为实验材料测定西瓜果皮硬度,将RILs群体划分为高硬度耐裂西瓜材料和低硬度易裂西瓜材料。对所述RILs群体果皮硬度进行性状关联,进行QTL定位。本发明所述QTL定位优选利用Rqtl软件和CIM区间作图法,本发明优选在西瓜6号染色体上检测到主效QTL,其贡献率为41.31%。该主效QTL优选位于24650194~25285524bp物理距离635.33kb的区段。
本发明优选确定QTL候选区间内的InDel位点,对InDel位点进行引物设计,多态性验证后得到InDel分子标记。本发明所述InDel-P159分子标记的长度优选为199bp和/或220bp,即多态性表现为21bp。在本发明中,所述多态性筛选的方法采用本领域常规的引物多态性筛选的方法即可。
本发明还提供了一种鉴定或者辅助鉴定西瓜果皮硬度性状的试剂盒,包括上述技术方案所述的引物对和PCR扩增用试剂。
在本发明中,所述试剂盒中引物对的上游引物的使用浓度优选为9~11μmol/L,下游引物的使用浓度优选为9~11μmol/L,更优选为引物对的上游引物的使用浓度为10μmol/L,下游引物的使用浓度为10μmol/L。本发明所述上游引物使用浓度和下游引物的使用浓度优选为引物自身的使用浓度。
本发明对所述试剂盒中的PCR扩增用试剂各组分组成和放置量没有特殊限定,采用常规试剂盒的组分组成和放置量即可。
本发明提供了上述技术方案所述的引物对或上述技术方案所述的试剂盒在鉴定在鉴定或者辅助鉴定西瓜果皮硬度中的应用。
本发明提供了一种鉴定或者辅助鉴定西瓜果皮硬度的方法,包括以下步骤:
1)提取待鉴定西瓜样品基因组DNA;
2)以所述待鉴定西瓜基因组DNA为模板,采用上述技术方案所述引物对进行PCR扩增,获得PCR扩增产物;
3)将所述PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,若扩增出1条条带且PCR扩增产物的分子量为220bp则判定为高硬度耐裂西瓜,若扩增出1条条带且PCR扩增产物的分子量为199bp则判定为低硬度易裂西瓜。
本发明所述高硬度耐裂西瓜优选为果皮硬度值大于或等于9.0N的西瓜;所述低硬度易裂西瓜优选为果皮硬度值小于9.0N的西瓜。
本发明首先提取西瓜样品的DNA。本发明对提取西瓜样品的DNA的方法没有特殊限定,采用常规的方法即可。在本发明具体实施过程中,本发明优选利用品牌为北京金沙生物科技有限公司的DNA提取试剂盒,根据说明书进行西瓜样品的DNA的提取。本发明优选提取西瓜样品叶片的DNA进行西瓜果皮硬度性状鉴定。
得到西瓜样品的DNA后,本发明以所述西瓜样品的DNA为模板,采用上述技术方案所述的InDel-P159分子标记引物对进行PCR扩增,获得PCR扩增产物。
在本发明中,所述PCR扩增使用的体系每15μL优选包括:7.5μL2×T5PCR Mix、4.5μLddH2O、上游引物1μL(引物浓度为10μmol/L)、下游引物1μL(引物浓度为10μmol/L)和DNA模板1μL(DNA浓度为10ng/μL)。
在本发明中,所述PCR扩增的程序优选包括:98℃预变性2min;98℃变性10s,58℃退火10s,72℃延伸10s,35个循环;72℃延伸5min,12℃保存。
本发明优选对所述PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,PCR扩增西瓜样品的特异性条带即判断品种为高硬度耐裂西瓜或低硬度易裂西瓜。本发明所述电泳鉴定时优选利用8%聚丙烯酰胺凝胶。本发明所述PCR扩增出1条条带且PCR扩增产物的分子量为220bp则判定为高硬度耐裂西瓜,PCR扩增出1条条带且PCR扩增产物的分子量为199bp则判定为低硬度易裂西瓜。
本发明所述高硬度耐裂西瓜优选为果皮硬度值大于或等于9.0N的西瓜;所述低硬度易裂西瓜优选为果皮硬度值小于9.0N的西瓜。
为了进一步说明本发明,下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述,但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1鉴定西瓜果皮硬度的InDel分子标记的开发
1.西瓜RILs群体单株果皮硬度测定
以母本西瓜K3(低硬度易裂品种)和父本西瓜PI189225(高硬度耐裂品种)杂交获得F1代,F1代再自交多代获得RILs群体,共69个单株。以该RILs群体为实验材料进行果皮硬度的测定。采用TMS-Touch质构仪(FTC,美国)测定亲本和RILs群体材料的果皮硬度,3次生物学重复,取平均值作为样品的果皮硬度值。果皮硬度值大于或等于9.0N的西瓜为高硬度耐裂西瓜材料,果皮硬度值小于9.0N的西瓜为低硬度易裂西瓜材料。2个亲本和69个RILs群体果皮硬度分布如图1和表2所示。
表2亲本和RILs群体果皮硬度值
2.西瓜果皮硬度基因的QTL定位
利用R/qtl软件对RILs群体西瓜果皮硬度进行性状关联,通过CIM区间作图法进行果皮硬度定位,用PT检验1000次进行阈值设定,以0.99置信度对应的LOD阈值(LOD=5.825)为定位区间。分析结果表明,在6号染色体上检测到主效QTL,其贡献率为41.31%,该主效QTL位于24650194~25285524bp物理距离635.33kb的区段。定位结果如图2所示。
3.西瓜果皮硬度相关InDel分子标记的开发
基于bcftools子程序vcfutils.pl(varFilter-w5-W10)筛选6号染色体西瓜果皮硬度主效QTL候选区间内的InDel位点,过滤InDel附近5bp内的SNP以及相邻InDel在10bp内位点,利用Primer3_core软件设计50对InDel引物,并在两个亲本间进行多态性筛选。获得1对可明显区分高硬度耐裂和低硬度易裂性状的InDel分子标记InDel-P159。InDel-P159在高硬度耐裂亲本中扩增出220bp的条带,在低硬度易裂亲本中扩增出199bp的条带。
实施例2:InDel-P159分子标记在RIL群体中的验证
(1)利用FlaPurePlantDNAExtractionKit(北京金沙生物科技有限公司)分别提取母本西瓜K3(低硬度易裂)、父本西瓜PI189225(高硬度耐裂)及69个RILs单株叶片总DNA。
(2)以步骤(1)提取的两个亲本和RIL群体DNA为模板,采用InDel-P159引物进行PCR扩增。PCR反应体系和程序:PCR反应体系共15μL,组成成分如下:2×T5PCRMix7.5μL,正向引物1μL(引物浓度10μmol/L),反向引物1μL(引物浓度10μmol/L),西瓜叶片DNA(10ng/μL)1μL,ddH2O4.5μL。
PCR反应程序为:98℃预变性2min;98℃变性10s,58℃退火10s,72℃延伸10s,共35个循环;72℃再延伸5min,12℃保存至取出。
(3)取2μL步骤(2)PCR产物,利用8%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测。图3为InDel-P159引物在父本、母本及部分RILs单株中的扩增结果。其中,泳道1为分子量Marker;泳道2为父本PCR产物;泳道3为母本PCR产物;泳道4-21为高硬度耐裂单株的PCR产物;泳道22-35为低硬度易裂单株的PCR产物。结果表明:InDel-P159标记在父本和高硬度耐裂单株中可以扩增出大小为220bp大小的片段;在母本和低硬度易裂单株中可以扩增出大小为199bp大小的片段。图3为使用SDS-PAGE胶鉴定结果。
在RIL群体中,25个高硬度耐裂单株中有22个单株基因型与表型相符,该引物对RILs群体果皮硬度的鉴定准确率为88.0%。本发明只分析了优势性状即高硬度耐裂单株。
实施例3:InDel-P159在自然群体中的验证
利用37份自然群体材料进一步验证InDel-P159分子标记与西瓜果皮硬度性状的连锁关系,具体步骤如下:
(1)基因组DNA提取。利用FlaPurePlantDNAExtractionKit(北京金沙生物科技有限公司)分别提取37份自然群体西瓜叶片总DNA,37份自然群体西瓜的硬度性状见表3。
表3自然群体西瓜材料及表型
(2)PCR反应体系和程序。以步骤(1)提取的自然群体DNA为模板,采用InDel-P159引物进行PCR扩增。PCR反应体系共15μl,组成成分如下:2×T5PCRMix7.5μl,正向引物1μl(引物浓度10μmol/L),反向引物1μl(引物浓度10μmol/L),西瓜叶片DNA(10ng/μl)1μl,ddH2O4.5μl。
PCR反应程序为:98℃预变性2min;98℃变性10s,58℃退火10s,72℃延伸10s,共35个循环;72℃再延伸5min,12℃保存至取出。
(3)取2μl上述PCR产物,利用8%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测。图4为37份自然群体材料InDel-P159引物检测结果。图4为使用SDS-PAGE胶鉴定结果。其中,M为分子量Marker;P1为实施例1中的高硬度耐裂亲本西瓜PI189225的PCR产物;P2为实施例1中的低硬度易裂亲本母本西瓜K3的PCR产物;1-37为37份自然群体材料的PCR产物。结果表明:InDel-P159标记在高硬度耐裂亲本和自然群体单株中可以扩增出大小为220bp大小的片段;InDel-P159标记在低硬度易裂亲本和自然群体单株中可以扩增出大小为199bp大小的片段。在37份自然群体材料中,11个高硬度耐裂单株中有9个单株基因型与表型相符,InDel-P159引物对自然群体果皮硬度的鉴定准确率为81.82%。本发明只分析了优势性状即高硬度耐裂单株。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述,但它仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部实施例,人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例,这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种鉴定或者辅助鉴定西瓜果皮硬度的引物对,其特征在于,所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的下游引物。
2.根据权利要求1所述的引物对,其特征在于,所述引物对以InDel-P159分子标记作为检测靶标。
3.根据权利要求2所述的引物对,其特征在于,所述InDel-P159分子标记位于西瓜6号染色体第25282282bp位碱基处,InDel分子标记的长度为199bp和/或220bp,即多态性表现为21bp,参照基因组Watermelon(97103)v2.5 Genome确定。
4.一种鉴定或者辅助鉴定西瓜果皮硬度的试剂盒,其特征在于,包括权利要求1~3任一项所述的引物对和PCR扩增用试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述引物对中的上游引物浓度为9~11μmol/L,下游引物浓度为9~11μmol/L。
6.权利要求1~3任一项所述的引物对或权利要求4或5所述的试剂盒在鉴定或者辅助鉴定西瓜果皮硬度中的应用。
7.一种鉴定或者辅助鉴定西瓜果皮硬度的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)提取待鉴定西瓜基因组DNA;
2)以所述待鉴定西瓜基因组DNA为模板,采用权利要求1~3所述引物对进行PCR扩增,获得PCR扩增产物;
3)对所述PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,若扩增出1条条带且PCR扩增产物的分子量为220bp则判定为高硬度耐裂西瓜,若扩增出1条条带且PCR扩增产物的分子量为199bp则判定为低硬度易裂西瓜。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述PCR扩增的体系以15μL计,包括:7.5μL2×T5 PCR Mix、4.5μL ddH2O、正反引物1μL、反向引物1μL和DNA模板1μL。
9.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述PCR扩增的程序为:98℃预变性2min;98℃变性10s,58℃退火10s,72℃延伸10s,35个循环;72℃延伸5min,12℃保存。
10.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述高硬度耐裂西瓜为果皮硬度值大于或等于9.0N的西瓜;所述低硬度易裂西瓜为果皮硬度值小于9.0N的西瓜。
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