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KR102412793B1 - 국산 밀 품종 판별을 위한 snp 유전자 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

국산 밀 품종 판별을 위한 snp 유전자 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도 Download PDF

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KR102412793B1
KR102412793B1 KR1020200135810A KR20200135810A KR102412793B1 KR 102412793 B1 KR102412793 B1 KR 102412793B1 KR 1020200135810 A KR1020200135810 A KR 1020200135810A KR 20200135810 A KR20200135810 A KR 20200135810A KR 102412793 B1 KR102412793 B1 KR 102412793B1
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primer set
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wheat
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강민영
정은선
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대한민국
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Abstract

국산 밀의 품종 판별을 위한 유전자 마커 (단일염기다형성 (SNP) 및/또는 삽입-결실 (Indel))와 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 상기 유전자 마커와 프라이머 세트를 사용하여 기존의 방법들보다 저비용, 고효율로 국산 밀의 품종을 판별할 수 있다. 이는 종자 품종보호출원, 유통종자의 부정유통 방지 등의 종자 유통 관리 업무에 활용이 가능하고, 이러한 활용은 국산 밀 품종을 판별하는 것을 용이하게 하여 국산 밀 품종의 진위성 규명, 종자분쟁의 중재 등의 분야에도 기여할 수 있다.

Description

국산 밀 품종 판별을 위한 SNP 유전자 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도 {SNP genetic markers and primer sets for discriminating domestic wheat cultivar and uses thereof}
국산 밀 품종 판별을 위한 유전자 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
유전자 마커는 게놈상에서 다형성 여부를 판단할 수 있는 특정 염기서열 단편을 의미한다. 유전자 마커는 작물 육종 분야에서 형질과 연관된 마커의 개발과 이를 이용한 MAS (marker assisted selection), 유전자 지도 작성, 양적형질 유전자좌 분석, 순도 검정, 유전적 다양성 분석, 및 품종 식별 등의 분야에 활용되고 있다. 일반적으로 식물 품종을 식별하는 방법은 크게 재배시험을 통한 형태적 특성 검정과 품종 간 동위효소의 차이를 통한 검정, DNA 분석 방법으로 나뉜다. 이 중 DNA 분석 방법은 표현형에 근거한 식별 방법에 비해 재배환경 및 작물의 생장단계에 영향을 받지 않아 객관적이며 재현성 또한 높다는 장점이 있다.
다양한 연구에서 유전자 수준에서의 염기서열 차이를 이용하여 품종 식별을 위한 분자 마커로 활용할 수 있는 가능성을 제안하고 있다. 구체적으로, 분자 마커 종류 중 품종 간 다형성 정도, 분석의 재현성, 염색체 상의 분포 정도를 고려할 때 작물의 다형성을 가장 잘 표현할 수 있는 단순 서열 반복 (Simple Sequence Repeat, SSR), 단일염기다형성 (Single Nucleotide Polymorphism, SNP), 유전자 삽입-결실 (Indel) 등을 활용하는 것을 제안하고 있다. 대한민국 등록특허 제 0974821 호에서는 시판 고추 F1 품종식별을 위한 SNP 마커에 대하여 개시하고 있다.
이처럼 유전물질을 이용한 개체 간의 차이에 대한 연구가 꾸준히 진행되어 왔고, 최근 분자유전학 및 DNA 분석 기술의 발달로 분자생물학적 수준에서 경제형질 관련 유전자 탐색 및 질병 관련 유전자 발굴 등 SNP를 포함한 유전자 마커의 개발이 활발히 진행되고 있다.
한편, 밀 (wheat)은 세계적으로 재배되는 작물로서, 진맥 (眞麥)이라고도 한다. 세계 곡물 생산량에서 옥수수에 이어 2 위를 차지하는 밀은, 그 낟알을 빻아 밀가루를 만들어 빵, 과자, 국수 등을 만드는 데 이용한다. 또한 밀 낟알은 맥주의 원료가 되기도 한다. 1970년대 이후 국민 1인당 곡물 소비량은 지속적으로 증가하고 있는 추세이나, 1980년대 중반 이후 밀 수요량의 99% 이상이 수입 밀에 의존되고 있다. 이에, 현재 국산 밀 자급률 확보와 생산량 증대를 위한 노력이 지속적으로 이루어지고 있으며, 용도에 맞는 품종이 개발되고 있다. 국립식량과학원에서 개발된 밀 품종들은 용도별로 다양화되었으며, 구체적 예로 빵용으로 금강밀과 탑동밀, 국수용으로 서둔밀과 알찬밀 등이 개발되었다. 이와 같이 국내 밀 품종들이 다양하게 개발되고 있기 때문에, 이들을 구분할 수 있는 분자 마커 개발이 더욱 필요하게 되었다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 신속하고 경제적으로 국산 밀의 품종을 판별할 수 있는 유전자 마커를 발굴하게 되었고, 상기 발굴된 마커는 국산 밀의 품종 판별뿐만 아니라 국내 품종의 보호와 밀의 유전자원 보호 등에도 유용하게 사용할 수 있다.
일 양상은 국산 밀 품종 판별용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 프라이머 세트를 포함하는 국산 밀 품종 판별용 키트를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 프라이머 세트를 이용하여 국산 밀의 품종을 판별하는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
국산 밀의 품종 판별을 위한 유전자분석 시스템을 제공한다. 시스템 개발에 사용한 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP) 마커는 종간 또는 연령간, 성별간, 염색체가 갖고 있는 염기서열 중 개체 또는 품종간의 편차를 나타내는 염기 변이로서, 한 염기쌍 (single base-pare variation)의 차이를 의미하며, DNA 서열의 다형성 중에서 가장 많은 빈도로 존재한다. 시스템 개발에 사용한 삽입-결실 (insert/deletion, Indel) 마커는 하나 이상의 염기가 삽입-결실되는 염기 변이를 의미하며, 삽입은 하나 이상의 염기가 추가되는 변경이고, 결실은 하나 이상의 염기가 제거되는 변경을 의미한다. 이러한 특징을 이용하여, 국산 밀의 품종을 판별하기 위한 유전자 마커를 선별하였고, 선별한 마커들 중에서 변별력이 있고 특이도 및 민감도에서 우수한 결과를 나타낸 마커들을 사용하여 품종 판별에 사용하였다.
일 양상은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 1 프라이머 세트; 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 2 프라이머 세트; 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 3 프라이머 세트; 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 4 프라이머 세트; 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 5 프라이머 세트; 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 6 프라이머 세트; 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 7 프라이머 세트; 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 8 프라이머 세트; 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 9 프라이머 세트; 서열번호 19의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 10 프라이머 세트; 서열번호 21의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 22의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 11 프라이머 세트; 및 서열번호 23의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 24의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 12 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 국산 밀 품종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
용어 "마커 (marker)"는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고적으로 사용되는 염기서열을 의미하며, 상기 용어 "유전자좌"는 분자 마커의 유전자 지도상의 위치를 의미한다.
용어 "프라이머 (primer)"는 카피하려는 핵산 가닥과 혼성복합체 (hybrid-complex)를 형성할 수 있는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 의미하며, 적합한 조건 (예컨대, 4 가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도, 및 적합한 버퍼 하에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용할 수 있다.
상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 하며, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도 (complexity) 뿐만 아니라, 온도 및 이온 강도와 같은 이용 조건, 사용하고자 하는 프라이머의 특성 등에 따라 결정될 수 있다. 예컨대, Guanine 및 Cytosine의 함량 (GC contents), GC 배열, 어닐링 (annealing) 온도, 및 이온 강도 등 여러 조건을 고려하여 프라이머의 구체적인 길이 및 서열을 결정할 수 있다. 구체적으로, 상기 프라이머의 길이는 10 내지 60nt, 15 내지 50nt, 또는 15 내지 30nt인 것일 수 있다. 상기 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만, 주형과 혼성복합체를 형성할 수 있을 정도로 상보적인 것일 수 있다.
상기 국산 밀 품종 판별용 프라이머 세트는 DNA 증폭을 위하여 이용될 수 있으며, 바람직하게는 국산 밀 품종 판별을 위한 유전자 마커의 증폭을 위하여 이용될 수 있다. 따라서, 상기 프라이머 세트는 국산 밀 품종을 판별하기 위해 이용될 수 있다. 구체적으로, 상기 국산 밀 품종 판별용 프라이머 세트는 하기 표 2에 기재된 국산 밀 품종 가운데 하나 이상을 판별할 수 있다.
일 구체예에서, 국산 밀의 품종을 판별하기 위한 유전자 마커를 발굴하였고, 발굴한 마커들 중에서 변별력이 있고 특이도 및 민감도에서 우수한 결과를 나타낸 마커들을 선별하였으며, 상기 선별된 유전자 마커를 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트를 제작하여 품종 판별에 사용하였다.
구체적으로, 상기 프라이머 세트는 하기 표 1에 기재된 세트로 이용될 수 있다. 또한 하나 이상의 프라이머 세트를 조합하여 이용하면 보다 정확하게 국산 밀 품종을 판별할 수 있다.
Figure 112020110784445-pat00001
일 구체예에서, 상기 국산 밀 품종 판별용 프라이머 세트는 상기 제 1 프라이머 세트, 상기 제 2 프라이머 세트, 상기 제 3 프라이머 세트, 상기 제 4 프라이머 세트, 상기 제 5 프라이머 세트, 상기 제 6 프라이머 세트, 상기 제 7 프라이머 세트, 상기 제 8 프라이머 세트, 상기 제 9 프라이머 세트, 및 상기 제 10 프라이머 세트가 조합된 것일 수 있다. 상기 조합의 국산 밀 품종 판별용 프라이머 세트를 이용할 경우, 더욱 효과적으로 하기 표 2의 45 종의 국산 밀 품종을 판별할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 국산 밀 품종 판별용 프라이머 세트는 상기 제 3 프라이머 세트, 상기 제 6 프라이머 세트, 상기 제 8 프라이머 세트, 상기 제 11 프라이머 세트, 및 상기 제 12 프라이머 세트가 조합된 것일 수 있다. 상기 조합의 국산 밀 품종 판별용 프라이머 세트를 이용할 경우, 더욱 정확하고, 효과적으로 하기 표 2의 45 종의 국산 밀 품종 중 보급종인 주요 국산 밀 7 종 (새금강, 백강, 고소, 수안, 백중, 조경, 금강)의 품종을 판별할 수 있다.
상기 국산 밀 품종 판별용 프라이머 세트에 있어서, 상기 제 1 프라이머 세트는 서열번호 27의 22 번째 염기인 단일염기다형성 C와 T를 식별하고, 상기 제 2 프라이머 세트는 서열번호 28의 30 번째 염기인 단일염기다형성 G와 C를 식별하고, 상기 제 3 프라이머 세트는 서열번호 29의 21 번째 염기인 단일염기다형성 C와 A를 식별하고, 상기 제 4 프라이머 세트는 서열번호 30의 26 번째 염기인 단일염기다형성 C와 A를 식별하고, 상기 제 5 프라이머 세트는 서열번호 31의 21 번째 내지 28 번째 염기의 삽입-결실 (Indel)을 식별하고, 상기 제 6 프라이머 세트는 서열번호 32의 27 번째 염기인 단일염기다형성 G와 C를 식별하고, 상기 제 7 프라이머 세트는 서열번호 33의 25 번째 염기인 단일염기다형성 G와 C를 식별하고, 상기 제 8 프라이머 세트는 서열번호 34의 21 번째 염기인 단일염기다형성 G와 A를 식별하고, 상기 제 9 프라이머 세트는 서열번호 35의 28 번째 염기인 단일염기다형성 G와 T를 식별하고, 상기 제 10 프라이머 세트는 서열번호 36의 25 번째 염기인 단일염기다형성 G와 T를 식별하고, 상기 제 11 프라이머 세트는 서열번호 37의 26 번째 염기인 단일염기다형성 C와 T를 식별하고, 상기 제 12 프라이머 세트는 서열번호 38의 25 번째 염기인 단일염기다형성 C와 T를 식별하는 것일 수 있다.
용어 "단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP)"은 염색체가 갖고 있는 염기서열 중 개체 또는 품종 간의 편차를 나타내는 염기 변이를 의미한다. 구체적으로는 특정 염기서열 중 한 염기쌍의 차이를 의미할 수 있다.
용어 "삽입-결실 (Indel)"은 하나 이상의 염기가 삽입 또는 결실되는 염기 변이를 의미하며, 삽입은 하나 이상의 염기가 추가되는 변경이고, 결실은 하나 이상의 염기가 제거되는 변경을 의미할 수 있다.
상기 제 1 프라이머 세트, 상기 제 2 프라이머 세트, 상기 제 3 프라이머 세트, 상기 제 4 프라이머 세트, 상기 제 5 프라이머 세트, 상기 제 6 프라이머 세트, 상기 제 7 프라이머 세트, 상기 제 8 프라이머 세트, 상기 제 9 프라이머 세트, 상기 제 10 프라이머 세트, 상기 제 11 프라이머 세트, 및 상기 제 12 프라이머 세트가 각각 하기 표 2에 기재된 국산 밀 품종 중 하나 이상의 품종을 판별할 수 있는 것은, 각 단일염기다형성 또는 삽입-결실 변이 위치에서의 특정 염기가 하기 표 2에 기재된 국산 밀 품종 중 하나 이상에서 특이적으로 높거나 또는 낮은 빈도로 나타나는 것에 근거한 것이다.
상기 프라이머의 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트, 알킬포스포로티오에이트와 같은 뉴클레오티드 유사체, 펩티드 핵산, 또는 삽입 물질을 포함할 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 형광, 인광, 또는 방사성을 발하는 표지 물질을 더 포함할 수 있다.
상기 표지 물질은 상기 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 표지될 수 있다. 상기 형광 표지 물질은 VIC, NED, FAM, PET, 또는 이들의 조합일 수 있다. 또한, 방사성 표지 물질은, 32P 또는 35S 와 같은 방사성 동위원소가 첨가된 PCR 반응액을 이용한 PCR 반응을 통해 증폭 산물에 혼입될 수 있다.
상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR 또는 대립유전자 특이적 중합효소 연쇄반응 (Allele-specific polymerase chain reaction, AS-PCR)에 의해 생성되는 증폭 산물의 유무 및 크기에 따라 단일염기다형성 유전자형을 구별하거나 또는 삽입/결실 (Indel)을 구별할 수 있다.
다른 양상은 상기 제 1 프라이머 세트, 상기 제 2 프라이머 세트, 상기 제 3 프라이머 세트, 상기 제 4 프라이머 세트, 상기 제 5 프라이머 세트, 상기 제 6 프라이머 세트, 상기 제 7 프라이머 세트, 상기 제 8 프라이머 세트, 상기 제 9 프라이머 세트, 상기 제 10 프라이머 세트, 상기 제 11 프라이머 세트, 및 상기 제 12 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 국산 밀 품종 판별용 프라이머 세트를 포함하는, 국산 밀 품종 판별용 키트를 제공한다.
상기 국산 밀 품종 판별용 키트는 하기 표 2에 기재된 국산 밀 품종 가운데 하나 이상을 판별할 수 있다.
상기 키트는 DNA 중합효소, dNTP 혼합물 (dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP), 및 PCR 완충 용액을 더 포함할 수 있다. 상기 DNA 중합효소는 예를 들면, E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우 (Klenow) 단편", 열 안정성 DNA 중합효소, 또는 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소인 것일 수 있다.
상기 키트는 상기 프라이머 세트 외에, 대조군 마커의 프라이머 세트로서, 밀의 내재 유전자 (예컨대, CCS (cereal centromeric sequence))를 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있다.
상기 PCR 완충 용액은 KCl, Tris-HCl, 및 MgCl2를 함유하는 것일 수 있다. 또한, PCR, 구체적으로 대립유전자 특이적 중합효소 연쇄반응 (Allele-specific polymerase chain reaction, AS-PCR), 또는 증폭 산물의 확인에 필요한 구성 성분이 상기 키트에 추가로 포함될 수 있다.
상기 키트는 안내서를 포함하는 것일 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충 용액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 상기 안내서는 팸플릿 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 상기 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
상기 키트에서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 프라이머 세트에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 상기 프라이머 세트에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
또 다른 양상은 밀로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고 상기 제 1 프라이머 세트, 상기 제 2 프라이머 세트, 상기 제 3 프라이머 세트, 상기 제 4 프라이머 세트, 상기 제 5 프라이머 세트, 상기 제 6 프라이머 세트, 상기 제 7 프라이머 세트, 상기 제 8 프라이머 세트, 상기 제 9 프라이머 세트, 상기 제 10 프라이머 세트, 상기 제 11 프라이머 세트, 및 상기 제 12 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 국산 밀 품종 판별용 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및 얻어진 증폭 산물로부터 하기 표 2에 기재된 국산 밀 품종 가운데 상기 밀의 품종을 결정하는 단계를 포함하는, 국산 밀의 품종을 판별하는 방법을 제공한다.
상기 게놈 DNA는 상기 밀의 잎, 줄기, 열매, 꽃, 뿌리, 또는 그의 조합으로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 게놈 DNA는 식물체로부터 DNA를 채취하는 통상적인 방법을 이용하여 수득된 것일 수 있다.
상기 방법에서, 핵산의 증폭은 PCR, 리가아제 연쇄반응 (ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭 (nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템 (transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭 (strand displacement amplification), 또는 Qβ 복제효소 (replicase)를 통한 증폭, 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법에 의해 수행될 수 있다.
상기 방법에서, 핵산의 증폭은 PCR을 이용하여 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 핵산의 증폭은 대립유전자 특이적 중합효소 연쇄반응 (Allele-specific polymerase chain reaction, AS-PCR) 또는 멀티플렉스 (Multiplex) PCR을 이용하여 수행될 수 있다.
상기 PCR은 중합효소를 이용하여, 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법을 의미할 수 있다. 상기 대립유전자 특이적 중합효소 연쇄반응 (Allele-specific polymerase chain reaction, AS-PCR)은 DNA 염기서열 상의 유전적 변이를 특이적으로 확인하기 위한 PCR 방법으로, 변이를 가지는 대립 유전자 각각에 대하여 특이적인 염기서열을 가지는 프라이머 또는 프라이머 세트를 사용하여 유전적 변이를 포함하는 유전자 영역을 PCR 증폭하는 방법을 의미할 수 있다. 상기 멀티플렉스 (Multiplex) PCR은 복수의 프라이머 세트를 사용하여 동시에 1 개의 반응 튜브 내에서 복수의 유전자 영역을 동시에 PCR 증폭하는 방법을 의미할 수 있다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.
상기 PCR, AS-PCR, 또는 멀티플렉스 PCR은 당업계에 PCR, AS-PCR, 또는 멀티플렉스 PCR 반응에 필요한 것으로 알려진 여러 성분을 포함하는 반응액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 반응액은 예를 들면, 분석하고자 하는 밀로부터 유래된 게놈 DNA, 상기 프라이머 세트, DNA 중합효소 (예를 들면, Taq 폴리머라제), dNTP 혼합물, PCR 완충 용액, 및 물을 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법에서, 핵산의 증폭은 상기 제 1 프라이머 세트, 상기 제 2 프라이머 세트, 상기 제 3 프라이머 세트, 상기 제 4 프라이머 세트, 상기 제 5 프라이머 세트, 상기 제 6 프라이머 세트, 상기 제 7 프라이머 세트, 상기 제 8 프라이머 세트, 상기 제 9 프라이머 세트, 상기 제 10 프라이머 세트, 상기 제 11 프라이머 세트, 및 상기 제 12 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 국산 밀 품종 판별용 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 수행되는 것일 수 있다.
상기 방법은, 얻어진 증폭 산물을, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정, 또는 인광 측정을 통해 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 겔 전기영동을 통해 검출할 경우, 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 형광 측정을 통해 검출할 경우, 형광물질로 표지된 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행한 후 형광 측정기를 이용하여 형광을 측정할 수 있다. 방사성 측정을 통해 검출할 경우, 방사성 물질을 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 가이거 계수기 (Geiger counter) 또는 액체 섬광 계수기 (liquid scintillation counter)와 같은 방사성 측정기를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다. 상기 얻어진 증폭 산물의 검출 또는 분석은 제한 효소 절단, 형광 측정, 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 방법에서, 얻어진 증폭 산물로부터 밀의 품종을 결정하는 단계는, 상기 얻어진 증폭 산물을, 상기 제 1 프라이머 세트, 상기 제 2 프라이머 세트, 상기 제 3 프라이머 세트, 상기 제 4 프라이머 세트, 상기 제 5 프라이머 세트, 상기 제 6 프라이머 세트, 상기 제 7 프라이머 세트, 상기 제 8 프라이머 세트, 상기 제 9 프라이머 세트, 상기 제 10 프라이머 세트, 상기 제 11 프라이머 세트, 및 상기 제 12 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 국산 밀 품종 판별용 프라이머 세트에 의해 하기 표 2에 기재된 국산 밀 품종 가운데 하나 이상의 품종의 핵산을 증폭한 결과와 비교함으로써 수행되는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 얻어진 증폭 산물로부터 밀의 품종을 결정하는 단계는 자동 염기서열 분석기를 이용하여, 증폭 산물 (밴드)의 크기를 컴퓨터 프로그램에 의해 확인함으로써 수행되는 것일 수 있다. 예를 들면, 하기 표 2의 공지된 국산 밀 품종 각각에 대하여 상기 프라이머 세트에 의하여 증폭된 산물 (각 대립유전자에 해당함)의 유무 및/또는 크기를 미리 하나의 표로 정리한다. 구체적으로, 단일염기다형성에 의하여 특정 대립유전자가 존재하는 경우 "1"로 나타내고, 이형 대립유전자가 존재하는 경우 "0"으로 코드화하여 나타낼 수 있다.
즉, 품종을 판별하고자 하는 밀로부터 게놈 DNA를 분리한 후, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭하고 증폭된 산물의 크기를 분석한 다음, 이 분석 결과를, 하기 표 2의 공지된 국산 밀 품종 각각에 대하여 상기 프라이머 세트에 의하여 핵산을 증폭한 후 그 결과를 코드화하는 등의 방식으로 정리한 분석 결과와 통계 프로그램을 등을 이용하여 비교함으로써 밀의 품종을 결정할 수 있다.
상기 방법에서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 프라이머 세트 또는 상기 키트에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 상기 프라이머 세트 또는 상기 키트에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
일 양상에 따른 국산 밀의 품종 판별용 프라이머 세트, 키트, 및 국산 밀의 품종을 판별하는 방법에 의하면, 분자 마커를 이용하여 정확하게 국산 밀의 품종을 판별할 수 있는 방법 및 체계를 확립할 수 있다. 또한, 일 양상에 따른 국산 밀의 품종 판별용 프라이머 세트, 키트, 및 국산 밀의 품종을 판별하는 방법은, 종자 품종보호출원, 유통종자의 부정유통 방지 등의 종자 유통 관리 업무에 활용이 가능하고, 이러한 활용은 국산 밀의 품종을 판별하는 것을 용이하게 하여 품종의 진위성 규명, 종자분쟁의 중재 등의 분야에도 기여할 수 있다.
도 1은 대립유전자 특이적 중합효소 연쇄반응 (AS-PCR)을 수행하기 위한 프라이머의 모식도이다.
도 2는 국산 밀의 품종을 판별하기 위해, 하기 표 4의 유전자 마커 (Wheat_DSom1, Wheat_DSom2, Wheat_DSom3, Wheat_DSom4, Wheat_DSom5, Wheat_DSom6, Wheat_DSom7, Wheat_DSom8, Wheat_DSom9, 및 Wheat_DSom10) 및 이의 10 쌍의 프라이머 세트를 이용하여 AS-PCR을 수행한 결과이다. 밀의 내재 유전자 (CCS) 및 이의 프라이머 세트를 대조군 마커로 사용하였다.
도 3은 하기 표 2의 국산 밀 45 종의 품종 판별에 용이한 10 개의 유전자 마커 (Wheat_DSom1, Wheat_DSom2, Wheat_DSom3, Wheat_DSom4, Wheat_DSom5, Wheat_DSom6, Wheat_DSom7, Wheat_DSom8, Wheat_DSom9, 및 Wheat_DSom10)를 나타낸다.
도 4는 보급종인 주요 국산 밀 7 종 (새금강, 백강, 고소, 수안, 백중, 조경, 금강)의 품종을 판별하기 위해, 하기 표 4의 유전자 마커 (Wheat_DSom3, Wheat_DSom11, Wheat_DSom8, Wheat_DSom6, 및 Wheat_DSom12) 및 이의 5 쌍의 프라이머 세트를 이용하여 다중 (Multiplex) AS-PCR을 수행한 결과이다. 밀의 내재 유전자 (CCS) 및 이의 프라이머 세트를 대조군 마커로 사용하였다.
도 5는 보급종인 주요 국산 밀 7 종 (새금강, 백강, 고소, 수안, 백중, 조경, 금강)에 대하여 품종 판별 효과가 더욱 우수한 5 개의 유전자 마커 (Wheat_DSom3, Wheat_DSom11, Wheat_DSom8, Wheat_DSom6, 및 Wheat_DSom12)를 나타낸다.
도 6은 국산 밀의 품종을 판별하기 위한 하기 표 4의 12 쌍의 프라이머 세트에 의해 분석된 국산 밀 품종 간의 유전적 유사도를 나타낸다.
이하 본 발명을 실험예 및 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실험예 및 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실험예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 명세서에서 특별한 정의가 없으면, 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가질 수 있다.
실시예 1: 국산 밀의 품종 판별을 위한 유전자 분석 시스템의 개발
본 실시예에서는 국산 밀의 품종 판별을 위한 유전자 마커 및 프라이머를 개발하고 평가하였고, 이를 통해, 국산 밀의 품종 판별을 위한 유전자 분석 시스템을 제공할 수 있다.
1. 국산 밀 시료 선정
국산 밀의 유전자 염기서열 분석 및 유전자 변이 발굴을 위한 시료는 2000년 이후 현재까지 국립종자원에서 보관 중인 품종보호출원품종 34 종 및 농촌진흥청 유전자원센터의 국내 육성품종 11 종을 사용하였고, 해당 시료는 표 2에 나타내었다.
연번 품종명 비고 연번 품종명 비고
1 태중 품종보호 24 조경 품종보호, 보급종
2 백찰 생판신고 25 조농 품종보호
3 조중 품종보호 26 신미찰 품종보호
4 새금강 품종보호, 보급종 27 조품 품종보호
5 백강 품종보호, 보급종 28 안백 품종보호
6 조아 품종보호 29 조은 품종보호
7 중모2012 품종보호 30 밀성 품종보호
8 호중 품종보호 31 진품 품종보호
9 중모2004 품종보호 32 금강 품종보호, 보급종
10 중모2008 품종보호 33 고분 품종보호
11 다중 품종보호 34 새올 품종보호
12 고소 품종보호, 보급종 35 내밀 육성품종
13 트랜스 품종보호 36 진광 육성품종
14 중모2003 품종보호 37 남광 육성품종
15 수안 품종보호, 보급종 38 신광 육성품종
16 청우 품종보호 39 그루 육성품종
17 연백 품종보호 40 은파 육성품종
18 수강 품종보호 41 청계 육성품종
19 한백 품종보호 42 올밀 육성품종
20 적중 품종보호 43 탑동 육성품종
21 백중 품종보호, 보급종 44 우리 육성품종
22 다분 품종보호 45 올그루 육성품종
23 신미찰1호 품종보호 총 45 종
2. 국산 밀의 게놈 DNA 분리
국산 밀 게놈 DNA는 NucleoSpin® Plant 게놈 키트 (MN Co. Germany)를 이용하여 분리하였다. 구체적으로, 밀 시료를 분쇄한 후, 분쇄된 밀 시료에 용해 버퍼 (lysis buffer) 300 ㎕를 첨가하고, 60℃에서 3 시간 반응시켰다. 반응이 끝난 시료를 10,000 x g에서 10 분간 원심분리하고, 원심분리한 시료에서 상층액 300 ㎕를 분리하였다. 분리된 상기 상층액 300 ㎕에 침전 버퍼 75 ㎕를 첨가하고, 10,000 x g에서 5 분간 원심분리를 실시하였다. 그 후, 상층액은 제거하고 수집된 침전물에 결합 용액 450 ㎕를 첨가하여 균질하게 혼합한 뒤, 혼합물을 컬럼 (column)에 통과시켜 불순물을 제거하였다. 컬럼을 세척 버퍼 (wash buffer) 600 ㎕로 3 회 세척 (washing)한 후, 멸균 증류수 100 ㎕를 이용하여 컬럼으로부터 게놈 DNA를 회수하였다. 추출된 게놈 DNA는 ND-1000 UV-Vis 분광광도계 (spectrophotometer) (NanoDrop Technologies, USA)를 이용하여 농도와 순도를 측정한 후, 염기서열 분석에 사용하였다.
3. 염기서열 분석 결과를 활용한 국산 밀 품종 판별용 마커 후보군의 발굴
국산 밀의 SNP 염기서열을 확보하기 위해, 먼저 상기 표 2의 품종 중에서 선발된 34 종에 대하여 서열 분석에 의한 유전자형 (Genotype by sequencing, GBS) 분석을 실시하였다. 선발된 34 품종은 하기 표 3에 나타내었다.
연번 품종명 비고 연번 품종명 비고
1 태중 품종보호 18 수강 품종보호
2 백찰 생판신고 19 한백 품종보호
3 조중 품종보호 20 적중 품종보호
4 새금강 품종보호, 보급종 21 백중 품종보호, 보급종
5 백강 품종보호, 보급종 22 다분 품종보호
6 조아 품종보호 23 신미찰1호 품종보호
7 중모2012 품종보호 24 조경 품종보호, 보급종
8 호중 품종보호 25 조농 품종보호
9 중모2004 품종보호 26 신미찰 품종보호
10 중모2008 품종보호 27 조품 품종보호
11 다중 품종보호 28 안백 품종보호
12 고소 품종보호, 보급종 29 조은 품종보호
13 트랜스 품종보호 30 밀성 품종보호
14 중모2003 품종보호 31 진품 품종보호
15 수안 품종보호, 보급종 32 금강 품종보호, 보급종
16 청우 품종보호 33 고분 품종보호
17 연백 품종보호 34 새올 품종보호
구체적으로, 각 시료에 바코드 서열을 결합시키고, 서열 역다중화 (sequence demultiplexing)를 수행하여, 각 시료의 염기서열을 분석하였다. 이어서, 서열 품질 (sequence quality)에 따라, 서열 분석된 원 데이터를 트리밍 (trimming)하여 클린 리드 (clean read)를 확보하였다. 상기 클린 리드를 참조 유전체에 정렬 (alignment)하여, 보존 서열 (consensus sequence)을 작성하고, 원 SNP를 추출하였다. 이어서, 시료 간의 SNP 매트릭스 (matrix)를 작성하고, SNP 필터 과정을 거쳐 대표 SNP를 선발하였다. 각 시료의 리드를 표준 유전체에 정렬 및 비교하여 얻은 원 SNP 위치 (position)를 후보로 선정하고, 상기 후보들의 합집합 리스트를 구축하였다, 이때, SNP 위치가 아닌 빈 영역 (non-SNP loci)은 시료의 보존 서열로 채워 넣었다. SNP 매트릭스를 작성한 후, 시료 간의 SNP를 비교하여 잘못 추출 (mis-calling)된 SNP를 필터하고, SNP를 유형 구분 기준에 따라 분류하여 유의한 SNP 또는 InDel 후보를 선발하였다.
그 결과, 국산 밀의 품종 판별을 위한, 총 37,098 개의 마커 후보군을 발굴하였다.
4. 국산 밀 품종 판별용 마커를 탐색하기 위한 프라이머의 제작 및 유전자 변이의 1차 탐색
상기 발굴된 마커 후보군 중에서 국산 밀의 품종 판별에 적용이 가능한 마커를 탐색하기 위하여, 대립유전자 특이적 중합효소 연쇄반응 (Allele-specific polymerase chain reaction, AS-PCR) 방법을 참조 (Drenkard, E. et al., 2000 Plant Physiol 124, 1483-1492; Kwok, S. et al., 1990 Nucleic Acids Res 18, 999-1005)하여, 26 쌍의 프라이머를 제작하였다. 상기 26 쌍의 프라이머 중 InDel 프라이머는 플랭킹 프라이머 (flanking primer)로 제작하였다.
구체적으로, 프라이머를 제작하기 위해, 도 1에 나타낸 바와 같이, 3` 말단으로부터 2 내지 5번째 위치의 염기 중 어느 하나 또는 두 개의 염기를 변이시킨 변형 서열을 제작하였다. 염기서열에서 3` 말단으로부터 2 내지 5번째 위치의 염기 중 어느 하나가 A, T, G, C 중 어느 하나로 변이된 변형 서열을 국산 밀 품종 판별을 위한 프라이머로 사용한 결과, 특정 대립유전자에 대하여는 PCR 증폭을 방해하지 아니하면서, 다른 특정 대립유전자에 대하여는 PCR 증폭이 방해되어, 품종 간에 판별이 가능한 것을 확인할 수 있었다. 그리하여, 국산 밀 품종 판별을 위한 마커를 개발함에 있어서, SNP 또는 Indel 위치는 3` 말단이고, 3번째 염기에 인위적인 불일치가 유도되도록 정방향 (센스) 프라이머와 역방향 (안티센스) 프라이머를 제작하였다. SNP 마커의 결합 온도는 약 60℃, 증폭 산물의 크기는 약 50 내지 약 800 bp가 되도록 제작하였다.
그 결과, 상기 표 3의 국산 밀 34 품종을 판별하기에 용이한 총 26 쌍의 국산 밀 품종 판별용 프라이머 세트를 1차로 수득하였다.
상기 1차로 수득된 총 26 쌍의 프라이머를 이용하여 상기 표 3의 국산 밀 34 품종 및 주요 국산 밀 7 종 (새금강, 백강, 고소, 수안, 백중, 조경, 금강)에 대하여 PCR을 수행하였고, 염기서열을 재분석하였다. 국산 밀의 품종별 유전자형은 아가로즈 겔 상에서 PCR 산물의 증폭 유무로 결정하였고, 상기 7 종의 품종별 염기서열 분석 결과를 DNASTAR 컴퓨터 프로그램 (www. dnastar.com)을 이용한 ClustalW 방법으로 분석하여, 품종 판별용 마커로서 기능할 수 있는 SNP 또는 InDel의 위치를 찾았다.
그 결과, 상기 표 3의 국산 밀 34 품종 및 주요 국산 밀 7 품종 (새금강, 백강, 고소, 수안, 백중, 조경, 금강)을 판별할 수 있는 유전자 변이로서, 총 26 개의 SNP 및 InDel이 1차적으로 선발되었다.
5. 탐색된 유전자 변이에 대한 염기서열 재분석 (re-sequencing) 및 국산 밀 품종 판별용 유전자 마커의 선별
상기 표 3의 국산 밀 시료 34 종을 대상으로, 상기 1차로 선발된 26 개의 SNP 및 InDel에 대한 염기서열을 재분석 (re-sequencing)하였다.
구체적으로, 염기서열 재분석을 위한 PCR은, 반응 산물이 약 700 bp가 되도록 프라이머를 합성하여 PCR 반응을 수행하고, 반응 산물을 다중-웰 여과 플레이트 (Multi-well filter plate) (Pall Corporation, USA)로 정제한 후 BigDyeⓡ Terminator (v3.1) Cycle 시퀀싱 키트 (squencing Kit) (Applied Biosystems, UK)를 사용하여 수행하였다. 정제한 PCR 산물 2 ㎕에 5X 버퍼 1.75 ㎕, Big Dye 0.5 ㎕, 및 프라이머 5 pmol/㎕를 첨가한 후, 총 10 ㎕가 되도록 멸균 증류수를 첨가하였다. 반응은, 96℃에서 10 초간 가열한 후, 50℃에서 5 초, 60℃에서 4 분간, 34 회 반복하여 수행하였다. PCR 반응 후 에탄올로 정제하고 건조한 뒤, 건조된 시료에 Hi-DiTM 포름아미드 (Formamide) 8 ㎕를 첨가하고, 95℃에서 2 분간 반응시킨 후 염기서열 분석 장비인 ABI 3730xl (Applied Biosystems)을 통해, 각 품종의 염기서열을 결정하였다. Lasergene SeqMan program (DNASTAR, Inc., USA)을 이용하여 염기서열 분석을 통해 얻어진 각 품종의 염기서열에서 SNP 및 Indel을 확인하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 선발된 유전자 마커 중에서, 상기 표 3의 국산 밀 34 종의 품종 판별에 용이한 10 개의 유전자 마커 (Wheat_DSom1, Wheat_DSom2, Wheat_DSom3, Wheat_DSom4, Wheat_DSom5, Wheat_DSom6, Wheat_DSom7, Wheat_DSom8, Wheat_DSom9, 및 Wheat_DSom10)를 최종 선별하였다.
또한, 국산 밀 중 보급종인 주요 국산 밀 7 종 (새금강, 백강, 고소, 수안, 백중, 조경, 금강)에 대하여 품종 판별 효과가 더욱 우수한 5 개의 유전자 마커 (Wheat_DSom3, Wheat_DSom11, Wheat_DSom8, Wheat_DSom6, 및 Wheat_DSom12)를 추가로 선별하였다. 상기 추가 선별된 5 개의 유전자 마커 중 Wheat_DSom3, Wheat_DSom6, 및 Wheat_DSom8은 먼저 선별된 10 개의 유전자 마커 중 선택된 마커이고, 나머지 2 개의 유전자 마커, Wheat_DSom11 및 Wheat_DSom12는 상기 1차로 선발된 유전자 마커 중에서 추가로 선별된 마커이다.
따라서, 총 12 개의 국산 밀 품종 판별용 유전자 마커를 최종적으로 선별하였고, 하기 표 4에 나타내었다.
Figure 112020110784445-pat00002
6. 대립유전자 특이적 중합효소 연쇄반응 (AS-PCR) 방법을 이용한 국산 밀의 품종 판별
국산 밀의 품종 판별을 위하여, 상기 표 4의 품종 판별용 유전자 마커 및 대조군 마커 (곡류의 중심체에 위치한 CCS (cereal centromeric sequence) 유전자로서, 표 2의 국산 밀 모든 품종에 내재되어 있음.)를 이용하여, 대립유전자 특이적 중합효소 연쇄반응 (Allele-Specific Polymerase Chain Reaction, AS-PCR)을 수행하였다.
먼저, 상기 표 2의 국산 밀 45 종의 품종 판별을 위하여, 상기 표 4의 서열번호 1 내지 20의 프라이머 세트 (제 1 프라이머 세트, 제 2 프라이머 세트, 제 3 프라이머 세트, 제 4 프라이머 세트, 제 5 프라이머 세트, 제 6 프라이머 세트, 제 7 프라이머 세트, 제 8 프라이머 세트, 제 9 프라이머 세트, 및 제 10 프라이머 세트) 및 서열번호 25 및 26의 프라이머 세트 (대조군 마커의 프라이머 세트)를 이용하여, 상기 표 4의 1 내지 10 번의 유전자 마커 (Wheat_DSom1, Wheat_DSom2, Wheat_DSom3, Wheat_DSom4, Wheat_DSom5, Wheat_DSom6, Wheat_DSom7, Wheat_DSom8, Wheat_DSom9, 및 Wheat_DSom10)에 대한 개별 분석을 위한 AS-PCR을 수행하였다.
구체적으로, 게놈 DNA 50 ng에 10 x 버퍼 2.5 ㎕, dNTP (각 2.5 mM) 1 ㎕, 10 pmol로 희석한 정방향 및 역방향 프라이머 각 0.5 ㎕와 중합효소 (Taq polymerase, Takara, Japan) 2 U을 첨가한 후, 멸균 증류수로 최종 25 ㎕가 되도록 증액하였다. 유전자의 증폭 반응은 GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, USA)을 이용하였으며, 95℃에서 15 분간 변성 후, 95℃에서 20 초, 60℃에서 40 초, 72℃에서 30 초간 반응시키고, 이를 32 회 반복 수행하였다. PCR 증폭 산물은 3% 아가로즈 겔 (agarose gel) 상에서 전기영동을 통해 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 표 4의 1 내지 10 번의 유전자 마커 (Wheat_DSom1, Wheat_DSom2, Wheat_DSom3, Wheat_DSom4, Wheat_DSom5, Wheat_DSom6, Wheat_DSom7, Wheat_DSom8, Wheat_DSom9, 및 Wheat_DSom10)와 서열번호 1 내지 20의 프라이머 세트를 이용하여, 상기 표 2의 국산 밀 45 종의 품종을 충분히 판별할 수 있음을 확인하였다.
다음으로, 상기 표 2의 국산 밀 45 종 중 보급종인 주요 국산 밀 7 종 (새금강, 백강, 고소, 수안, 백중, 조경, 금강)의 품종을 판별하기 위해, 상기 표 4의 제 3 프라이머 세트 (서열번호 5 및 서열번호 6), 제 11 프라이머 세트 (서열번호 21 및 서열번호 22), 제 8 프라이머 세트 (서열번호 15 및 서열번호 16), 제 6 프라이머 세트 (서열번호 11 및 서열번호 12), 제 12 프라이머 세트 (서열번호 23 및 서열번호 24), 및 대조군 마커의 프라이머 세트 (서열번호 25 및 26)를 이용하여, 상기 표 4의 유전자 마커 (Wheat_DSom3, Wheat_DSom11, Wheat_DSom8, Wheat_DSom6, 및 Wheat_DSom12)에 대한 다중 분석 AS-PCR을 수행하였다.
구체적으로, 다중 (Multiplex) PCR 조건은 50℃에서 5 분간 방치, 95℃에서 15 분간 변성 후, 95℃에서 20 초, 62℃에서 40 초, 72℃에서 62 초간 반응시키고, 이를 32 회 반복 수행하였다. PCR 증폭 산물은 3% 아가로즈 겔 (agarose gel) 상에서 전기영동을 통해 확인하였다.
그 결과, 도 4 및 5에 나타낸 바와 같이, 상기 표 4의 유전자 마커 (Wheat_DSom3, Wheat_DSom11, Wheat_DSom8, Wheat_DSom6, 및 Wheat_DSom12)와 제 3 프라이머 세트 (서열번호 5 및 서열번호 6), 제 11 프라이머 세트 (서열번호 21 및 서열번호 22), 제 8 프라이머 세트 (서열번호 15 및 서열번호 16), 제 6 프라이머 세트 (서열번호 11 및 서열번호 12), 및 제 12 프라이머 세트 (서열번호 23 및 서열번호 24)를 이용하여, 보급종인 주요 국산 밀 7 종 (새금강, 백강, 고소, 수안, 백중, 조경, 금강)의 품종을 더욱 정확하게 판별할 수 있음을 확인하였다.
7. 유전자 마커의 국산 밀 품종 판별 가능성 검정
상기 표 4의 유전자 마커의 국산 밀 품종 판별 가능성을 조사하였다. 하기 식 1을 사용하여 I (Shannon's information index) 값을 산출하였다. 하기 식 1에서, Pi는 i 번째 대립유전자의 빈도수를 나타내며, i는 대립유전자를 나타낸다 (Peakall R et al. 2008).
< 식 1 >
I = - ∑ Pi ln Pi
증폭 산물의 크기 (bp) 및 식 1에 의해 계산된 I (Shannon's information index) 값을 하기 표 5에 나타내었다.
유전자 마커 Band Freq. p q N Na Ne I He UHe
Wheat_DSom1 0.311 0.17 0.83 45 2 1.393 0.456 0.282 0.285
Wheat_DSom2 0.778 0.529 0.471 45 2 1.993 0.692 0.498 0.504
Wheat_DSom3 0.4 0.225 0.775 45 2 1.537 0.534 0.349 0.353
Wheat_DSom4 0.756 0.506 0.494 45 2 2 0.693 0.5 0.506
Wheat_DSom5 0.156 0.081 0.919 45 2 1.175 0.281 0.149 0.151
Wheat_DSom6 0.444 0.255 0.745 45 2 1.612 0.567 0.38 0.384
Wheat_DSom7 0.622 0.385 0.615 45 2 1.9 0.667 0.474 0.479
Wheat_DSom8 0.267 0.144 0.856 45 2 1.326 0.412 0.246 0.249
Wheat_DSom9 0.378 0.211 0.789 45 2 1.5 0.516 0.333 0.337
Wheat_DSom10 0.778 0.529 0.471 45 2 1.993 0.692 0.498 0.504
상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 상기 표 4의 Wheat_DSom1, Wheat_DSom2, Wheat_DSom3, Wheat_DSom4, Wheat_DSom5, Wheat_DSom6, Wheat_DSom7, Wheat_DSom8, Wheat_DSom9, 및 Wheat_DSom10의 10 개 마커의 평균 I 값은 0.551로, 상기 마커를 통해 국산 밀의 품종 판별이 충분히 가능함을 확인하였다. 상기 마커의 대립유전자 (밴드) 유무를 정확하게 판별하기 위하여, 국산 밀의 내재 유전자 (CCS)를 대조군 마커로 사용함으로써 국산 밀 품종을 판별하는데 정확도를 기하였다.
추가하여, 상기 표 2의 국산 밀 45 품종 각각에 대하여 확인된, 상기 표 4의 유전자 마커, 즉, 대립유전자의 유무를 NTSYS pc (version 2.10b) (Rohlf, 2000) 컴퓨터 프로그램에 입력하고 Jaccard's 방법 (Sneath and Sokal, 1973)에 준하여 각 품종 사이에서의 유전적 유사도 값을 계산하였다. 계산된 유전적 유사도를 이용하여 UPGMA (Unweighted Pair-group Method with Arithmetical Average) (Sneath and Sokal, 1973)에 의해 집괴 분석 (cluster analysis)하여 계통도 (dendrogram)를 작성하고 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6은 상기 표 4의 국산 밀 품종 판별용 프라이머 세트에 의해 분석된, 상기 표 2의 국산 밀 품종 사이에서의 유전적 유사도를 나타낸다. 이를 통해, 상기 표 4의 프라이머 세트를 이용하여 국산 밀 품종의 판별이 가능함을 확인하였다.
본 실시예를 통해, 상기 표 4의 유전자 마커의 프라이머 세트를 이용하여 상기 표 2의 국산 밀 45 종의 품종을 정확하게 판별할 수 있음을 확인하였다. 구체적으로, 품종을 판별하고자 하는 밀의 게놈 DNA를 분리한 후, 상기 표 4의 유전자 마커, 즉, 단일염기다형성 마커 및 삽입-결실 마커의 프라이머 세트를 이용하여 AS-PCR을 수행하고, 그 증폭 산물을 도 2, 도 3, 도 4, 또는 도 5의 데이터베이스와 비교함으로써, 품종을 판별할 수 있다.
<110> Korea seed and variety service <120> Genetic markers and primer sets for discriminating domestic wheat cultivar and uses thereof <130> PN136093 <160> 39 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wheat_DSom1 - F <400> 1 ccagcgattc agcgggatag cc 22 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wheat_DSom1 - R <400> 2 ggatacatac agaagtgtga ctg 23 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wheat_DSom2 - F <400> 3 tcgtactact tctgattggt ttgttgttg 29 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wheat_DSom2 - R <400> 4 tgacgccgaa cctgtccaag 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wheat_DSom3 - F <400> 5 cggtcgcgga gtgaagttta c 21 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wheat_DSom3 - R <400> 6 acagatcagt atcaacggat gatgg 25 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wheat_DSom4 - F <400> 7 cacatttgag catttgtacc ttgtac 26 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wheat_DSom4 - R <400> 8 taattaataa agtggttgca catcgtc 27 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wheat_DSom5 - F <400> 9 tccagctagg gagtatttag gcatttag 28 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wheat_DSom5 - R <400> 10 tttaaaacgg tggtgccctt aatgg 25 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wheat_DSom6 - F <400> 11 cactttcact actccgaagg gtcttac 27 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wheat_DSom6 - R <400> 12 acaaaaggct cctatcttcg aacct 25 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wheat_DSom7 - F <400> 13 ttcacataca cctgatcaag cacag 25 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wheat_DSom7 - R <400> 14 atggccgggc acttcgac 18 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wheat_DSom8 - F <400> 15 ccaaaacgcc tgaaagaatc g 21 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wheat_DSom8 - R <400> 16 acacgcagaa gtgaaaacag aatg 24 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wheat_DSom9 - F <400> 17 aatgcaactt gttttgtatt gatacgtg 28 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wheat_DSom9 - R <400> 18 acttgaacag ctgctttagt gatgg 25 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wheat_DSom10 - F <400> 19 ggttccgttg tccattgatt cccag 25 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wheat_DSom10 - R <400> 20 cactttagct gaatacagta tataac 26 <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wheat_DSom11 - F <400> 21 tgtattttcc cattttgtgc tcactc 26 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wheat_DSom11 - R <400> 22 atgttgtgtt gtagattagg atgggtg 27 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wheat_DSom12 - F <400> 23 gcttcttaac tgtgatggca tgacc 25 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wheat_DSom12 - R <400> 24 cgccgagttg ctcacccgac gga 23 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CSS - F <400> 25 aaagatgctg cgccttagca accg 24 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CSS - R <400> 26 tgcttgcagg acaagtgccc tcgt 24 <210> 27 <211> 350 <212> DNA <213> Triticum aestivum <220> <221> variation <222> (22) <223> Wheat_DSom1_SNP : C/T <400> 27 ccagcgattc agcgggatat ccgatgctct tccactctcc tcgtgatggt cagttcacag 60 gggccatcta acttcttgta agatgatgaa ggtattccag cactcccggt tcgtctcttt 120 tttcacgtct tggtggaagc cattcggcac cgtagaagac gctgaagatg tcgcgttcct 180 tgttgttttt tcggttgttc ctacagttga tatagtgcgc gtgtttctgt acgggtatag 240 ccggggtact tgcgagtctc tgaaggttcc ttcttgtgga aagctgcagt ttaattacgt 300 cgctgtgcag atagtgtatt cgcaaatcag tcacacttct gtatgtatcc 350 <210> 28 <211> 165 <212> DNA <213> Triticum aestivum <220> <221> variation <222> (30) <223> Wheat_DSom2_SNP : G/C <400> 28 tcgtactact tctgattggt ttgttggtcg cggatggtgg tggtcgcgca ggtgagctga 60 agaaggcgct ggcgccgagg acggggctgc agccgtcgga gcagctggtg acgtacaagg 120 gccgggagcg gaaaaactcg gagttcttgg acaggttcgg cgtca 165 <210> 29 <211> 399 <212> DNA <213> Triticum aestivum <220> <221> variation <222> (21) <223> Wheat_DSom3_SNP : C/A <400> 29 cggtcgcgga gtgaagttga cgacatgttt cgagagccgg gcttttttcg attccgagaa 60 gaaaggtcat tatcttgatt cttgatgaac agcaattacc tggttttacg ctctggattt 120 gagaatgtca atgctctgat attatcagct aaactgaatg cggttaccac ctgaaacaaa 180 agcacaaggg aatgaaattt ttataaacgt aaagacactg ttctggatgt cagctgtaag 240 ttactagaga tcttgttgtc ctctgttaga atcttctgtc tcaggaagca gggtaaagaa 300 tagtcacctt tttctcagtt tccaaatatt cttcctcgag gtatttacgt gggttcgatt 360 gctttgacag acctccatca tccgttgata ctgatctgt 399 <210> 30 <211> 250 <212> DNA <213> Triticum aestivum <220> <221> variation <222> (26) <223> Wheat_DSom4_SNP : C/A <400> 30 cacatttgag catttgtacc ttggacggat agttagctag ctatatgtcc gggatgatct 60 cattttatgt ttcaggagtg tgcatacgaa ccaatcatat attgcatgca ccgatgttgt 120 aattttgttg gcggcgtcaa caaatacttt gtagtactat atactagttt atggtaaagt 180 cgttttttta gaaatggagg aggaccctcg atctttgcat ctggacgatg tgcaaccact 240 ttattaatta 250 <210> 31 <211> 180 <212> DNA <213> Triticum aestivum <220> <221> variation <222> (21)..(28) <223> Wheat_DSom5_InDEL : GCATTTAG <400> 31 tccagctagg gagtatttag gcatttagct cgagggaact acgtactact ggagtgatga 60 tattttatga tcatgtgatc agtgatcagt tcgccaacct ttgcagaggc agtccagctc 120 gacaccctac cctacggcca aagccctaca ccattaaggg caccaccgtt ttaaaaacgg 180 180 <210> 32 <211> 148 <212> DNA <213> Triticum aestivum <220> <221> variation <222> (27) <223> Wheat_DSom6_SNP : G/C <400> 32 cactttcact actccgaagg gtctgaggac atatgaagga gataatggaa ggctgctgag 60 gatgtatggg agacgtccta ggaagagaag aactaccata ccgaagcccc taggagaagt 120 cctaggttcg aagataggag ccttttgt 148 <210> 33 <211> 319 <212> DNA <213> Triticum aestivum <220> <221> variation <222> (25) <223> Wheat_DSom7_SNP : G/C <400> 33 ttcacataca cctgatcaag caaagaaaag ccgcggcgaa tcaatcaagg aactaggacc 60 gggagtactg gggagcatcg ccgcgccggg cacagagaga aagggaagag gggcgtacgg 120 tgttcttgat ggagtcggtg gcgacgatgg cggagttgtc gtcggaggtg taggatggga 180 ggcagtcgga gacgacgctg acggcgacgc tccactcgac gaagaggtgg ccgccggcat 240 cggcggggcg gcgccagacg cgggagacgc ggacgcggga cttgccatgc ctgccctgga 300 ggtcgaagtg cccggccat 319 <210> 34 <211> 197 <212> DNA <213> Triticum aestivum <220> <221> variation <222> (21) <223> Wheat_DSom8_SNP : G/A <400> 34 ccaaaacgcc tgaaagaagc ggacaggcag tccatcgggg cctgctgcca aggttccagt 60 gaatttttat gatagatcta atcattttca taaaagagta tacagagaaa aatgttgtgc 120 agatgtctag catatgttct gtctcctttt actggatctg ctgcaacact atccattctg 180 ttttcacttc tgcgtgt 197 <210> 35 <211> 447 <212> DNA <213> Triticum aestivum <220> <221> variation <222> (28) <223> Wheat_DSom9_SNP : G/T <400> 35 aatgcaactt gttttgtatt gatacttgtt atatcttaca tttccctcga tgttgattct 60 ggcctgtaca tgtcacttga ttgcaggtaa ttagcaaact ggagcgccgt actgttgctt 120 accatgaagc tgggcatgct gttgccggat ggtttttaga acatgcagag cctcttctga 180 aagttacaat tgttccccgt ggaacagctg ctttaggctt tgcacagtat gtaccaaatg 240 agaatctttt gatgacaaag gagcagctct ttgatatgac atgcatgacg ttaggtggcc 300 gagctgcgga ggaggtatgc cattccctac gtatttttag tgatgcagat ttatgttaag 360 tatcttagat tcatgggcat ctctcaaaat ctgtactatt tagctccatt ggtggattgt 420 ctccatcact aaagcagctg ttcaagt 447 <210> 36 <211> 550 <212> DNA <213> Triticum aestivum <220> <221> variation <222> (25) <223> Wheat_DSom10_SNP : G/T <400> 36 ggttccgttg tccattgatt ccaaggatgg caggataatg ttgagcaccg gaaggaaggt 60 tggtctctac gatccaattg gtaaaacact tgagaggttg tgcgcagtag acgggatgcc 120 tcgttgcacc ggtaaaagga gggaacttcc tagagcttcg gaaggattgc aacgaccaag 180 caaaaggcca cgctcgggcc acaacataca tggatgcatg gaatcggtaa cgggacaaga 240 catactccag gcttcctctt tgaagaaatg cagcaacaat atgtctatgg agaagctaaa 300 tgcagaaatc cctagtgcaa ttatgtctgc agttccgctg ttatacgagg agagcctaac 360 gagttatccg cgtgtgctca aaaagaggtt gttagactga tgtggacatc ctatcagaaa 420 gggaatgaaa gatatcatgt catatctaag ggaatgaagg ctaccatgtc atatctatat 480 tcagactaac aatgctatgt gaagtaatga tgagttgtca acttgttata tactgtattc 540 agctaaagtg 550 <210> 37 <211> 300 <212> DNA <213> Triticum aestivum <220> <221> variation <222> (26) <223> Wheat_DSom11_SNP : C/T <400> 37 tgtattttcc cattttgtgc tcaatcgtta attcgctgta tagcttctca tatgagctta 60 tgttctcgtc gcgaaaacag gcatcatgcc gtcatgtacg aaggtcaagg cggcccggtt 120 cagagtacca gcaaacctaa agtggagata ctgacattgt gcgggaaagt ggtggacatg 180 cttaggcccg acgtgcagca tctcctctcc cacctgaaga ccgaaccaac ctcgtcgatt 240 tacgcggcga cccatccaaa gctagcgcaa caacacccat cctaatctac aacacaacat 300 300 <210> 38 <211> 125 <212> DNA <213> Triticum aestivum <220> <221> variation <222> (25) <223> Wheat_DSom12_SNP : C/T <400> 38 gcttcttaac tgtgatggca tggccatggc aatttggttg cggcggctag cgtcgacatg 60 catagcagcc gtatatttgt gctatacgta caagcaacgc gctccgtcgg gtgagcaact 120 cggcg 125 <210> 39 <211> 123 <212> DNA <213> Triticum aestivum <220> <221> gene <222> (1)..(123) <223> CSS (control marker) <400> 39 caacgcaacg tcttgtatgg ttgtagtcgg atcgtcaacg tttctcccaa atcgtagtta 60 tcacaactca ccgaaagatc gggccaacaa cagccttgag tgtcgagagg aactcagggt 120 tca 123

Claims (11)

  1. 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 1 프라이머 세트;
    서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 2 프라이머 세트;
    서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 3 프라이머 세트;
    서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 4 프라이머 세트;
    서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 5 프라이머 세트;
    서열번호 11의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 6 프라이머 세트;
    서열번호 13의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 7 프라이머 세트;
    서열번호 15의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 8 프라이머 세트;
    서열번호 17의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 9 프라이머 세트; 및
    서열번호 19의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 10 프라이머 세트를 포함하는 국산 밀 품종 판별용 프라이머 세트.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 국산 밀 품종 판별용 프라이머 세트는 하기 표에 기재된 국산 밀 품종 가운데 하나 이상을 판별하는 것인 국산 밀 품종 판별용 프라이머 세트
    [표]
    Figure 112020110784445-pat00003

    .
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 제 1 프라이머 세트는 서열번호 27의 22 번째 염기인 단일염기다형성 C와 T를 식별하고,
    상기 제 2 프라이머 세트는 서열번호 28의 30 번째 염기인 단일염기다형성 G와 C를 식별하고,
    상기 제 3 프라이머 세트는 서열번호 29의 21 번째 염기인 단일염기다형성 C와 A를 식별하고,
    상기 제 4 프라이머 세트는 서열번호 30의 26 번째 염기인 단일염기다형성 C와 A를 식별하고,
    상기 제 5 프라이머 세트는 서열번호 31의 21 번째 내지 28 번째 염기의 삽입-결실 (Indel)을 식별하고,
    상기 제 6 프라이머 세트는 서열번호 32의 27 번째 염기인 단일염기다형성 G와 C를 식별하고,
    상기 제 7 프라이머 세트는 서열번호 33의 25 번째 염기인 단일염기다형성 G와 C를 식별하고,
    상기 제 8 프라이머 세트는 서열번호 34의 21 번째 염기인 단일염기다형성 G와 A를 식별하고,
    상기 제 9 프라이머 세트는 서열번호 35의 28 번째 염기인 단일염기다형성 G와 T를 식별하고,
    상기 제 10 프라이머 세트는 서열번호 36의 25 번째 염기인 단일염기다형성 G와 T를 식별하는 것인, 국산 밀 품종 판별용 프라이머 세트.
  6. 청구항 1의 국산 밀 품종 판별용 프라이머 세트를 포함하고, 하기 표에 기재된 국산 밀 품종 가운데 하나 이상을 판별하는 국산 밀 품종 판별용 키트
    [표]
    Figure 112020110784445-pat00004

    .
  7. 밀로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고 청구항 1의 국산 밀 품종 판별용 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및
    얻어진 증폭 산물로부터 하기 표에 기재된 국산 밀 품종 가운데 상기 밀의 품종을 결정하는 단계를 포함하는 국산 밀의 품종을 판별하는 방법
    [표]
    Figure 112020110784445-pat00005

    .
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 핵산을 증폭하는 단계는 멀티플렉스 (Multiplex) PCR을 이용하는 것인 방법.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 핵산을 증폭하는 단계는 대립유전자 특이적 중합효소 연쇄반응에 의한 것인 방법.
  10. 청구항 7에 있어서, 상기 방법은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정, 및 인광 측정으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방식을 통해 상기 얻어진 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  11. 청구항 7에 있어서, 상기 얻어진 증폭 산물로부터 상기 밀의 품종을 결정하는 단계는, 상기 얻어진 증폭 산물을, 청구항 1의 국산 밀 품종 판별용 프라이머 세트에 의해 하기 표에 기재된 국산 밀 품종 가운데 하나 이상의 품종의 핵산을 증폭한 결과와 비교함으로써 수행되는 것인 방법
    [표]
    Figure 112020110784445-pat00006

    .
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