CN115721722B - 一种治疗egfr-tki耐药的非小细胞肺癌的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗EGFR‑TKI耐药的非小细胞肺癌的药物组合物，属于医药技术领域。所述药物组合物有效成分为奥希替尼和大麻素I型受体反向激动剂，奥希替尼与大麻素I型受体反向激动剂联合，对EGFR‑TKI耐药的NSCLC细胞的抑制率显著高于单独用药，两者联合用药具有协同抑制作用。本发明的实验结果为奥希替尼联合大麻素I型受体反向激动剂的临床联合用药及治疗EGFR‑TKI耐药的NSCLC的有效方案提供了理论依据，在医药学领域有广阔的应用前景。

Description

一种治疗EGFR-TKI耐药的非小细胞肺癌的药物组合物

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种用于治疗表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药的非小细胞肺癌的药物组合物。

背景技术

非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)是除小细胞肺癌(SCLC)以外、所有来源于肺上皮的各种类型癌症的集合体。根据组织结构的不同分为三种主要亚型：鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌。表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)是控制上皮细胞生长和存活的关键因子，其高表达或异常激活与包括非小细胞肺癌(NSCLC)在内的多种癌症的肿瘤进展和治疗耐药有关，因此，常被用于上皮恶性肿瘤的靶向治疗。

表皮生长因子受体抑制剂(EGFRi)是一种小分子抑制剂，通过与ATP竞争EGFR胞内酪氨酸激酶催化位点阻断EGFR的激酶活性，从而抑制肺癌细胞的恶性增殖。然而，大量的临床数据和实验数据表明，经过EGRFi治疗后，多数患者会出现获得性耐药。

研究表明，获得性T790M突变是晚期EGFR突变患者中最常见的耐药原因，多数患者在一线使用EGRFi后出现T790M突变。目前，已有多种EGFR突变选择性EGRFi被开发，以治疗因T790M突变而产生获得性耐药的患者，如奥希替尼。奥希替尼(Osimertinib)为第三代表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂，分子式为C₂₈H₃₃N₇O₂，结构式如下：

然而，接受第三代EGFR-TKI治疗的患者尽管初始反应较好，但是仍会产生获得性耐药。针对第三代EGFR-TKI的耐药性，目前已经发现的继发耐药机制中EGFR基因的次级突变是导致第三代EGRFi(如奥希替尼)耐药的重要原因，目前发现的潜在耐药突变位点有C797S、L718、G796、L792等。另外，旁路通路的代偿性激活会引起继发性耐药，例如，研究发现，MET基因扩增使AKT异常激活，促进下游mTOR通路的激活，从而促进肿瘤细胞的增殖。此外，HER2的异常上调、AXL通路的代偿性激活、IGF1R介导的AKT激活也在第三代EGRFi继发性耐药中发挥重要的作用。虽然多种耐药机制已经被发现，但大约三分之一的病例中产生第三代EGRFi的继发耐药性机制仍不明确。

由于单一用药使人体对特定药物产生耐药性的概率较大，疗效不理想，故临床上常采用抗肿瘤药物与抗体、抑制剂、增敏剂等进行联合化疗，减小化疗药物毒副作用，增加药物抗肿瘤效果。至今为止，没有关于奥希替尼和大麻素I型受体(CNR1)反向激动剂联合用于治疗非小细胞肺癌的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于治疗表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)耐药的非小细胞肺癌的药物组合物，以解决现有技术中存在的非小细胞肺癌患者在治疗过程中出现的疗效欠佳和耐药性等问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了奥希替尼和大麻素I型受体反向激动剂联合在制备治疗表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药的非小细胞肺癌的药物中的应用。

本发明研究表明，大麻素I型受体反向激动剂能够增敏奥希替尼在治疗表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药的非小细胞肺癌中的应用，两者联用增强奥希替尼的疗效，为老药新用提供依据。

进一步的，所述表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药的非小细胞肺癌为奥希替尼耐药的非小细胞肺癌。

优选的，所述大麻素I型受体反向激动剂可以为但不限于利莫那班。利莫那班(Rimonabant)是一种可口服的CNR1反向激动剂，中文名5-(4-氯苯基)-1-(2,4-二氯苯基)-4-甲基-N-(1-哌啶基)-1H-吡唑-3-甲酰胺，分子式为C₂₂H₂₁Cl₃N₄O，结构式如下：

优选的，所述药物中利莫那班与奥希替尼的摩尔比为1～32：1。

进一步优选，所述药物中利莫那班与奥希替尼的摩尔比为3～8：1。

更优选的，所述药物中利莫那班与奥希替尼的摩尔比为4：1。

进一步的，本发明提供了一种药物制剂，包括上述药物有效成分，以及药学上可接受的载体。

优选的，所述药学上可接受的载体为填充剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂或润滑剂。

优选的，所述药物的制剂形式为口服制剂，具体制剂形式可以为但不局限于口服片剂、颗粒剂、注射剂、胶囊。

本发明提供了一种用于治疗表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药的非小细胞肺癌的药物组合物，包括有效剂量的利莫那班和奥希替尼，以及药学上可接受的载体。

与现有技术相比，本发明具备的有益效果：

本发明研究表明，奥希替尼与大麻素I型受体反向激动剂联合，对EGFR-TKI耐药的NSCLC细胞的抑制率显著高于单独用药，两者联合用药对EGFR-TKI耐药的NSCLC细胞具有协同抑制作用。联合用药具有单独用药不可相比的优势，应用较小的药物剂量就能起到单独用药产生的疗效，降低肿瘤细胞的耐药性，降低药物所带来的毒副作用，应用前景更加广阔。

附图说明

图1为不同浓度组合的奥希替尼联合利莫那班对NCI-H1975-OR细胞的增殖抑制率(n＝1)。

图2固定浓度的利莫那班联合不同浓度的奥希替尼对NCI-H1975-OR细胞的增殖抑制率(n＝1)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1奥希替尼联合利莫那班对奥希替尼耐药的肺癌NCI-H1975细胞的增殖抑制作用

1、实验原料

(1)NCI-H1975细胞，由中国科学院干细胞库提供。NCI-H1975奥希替尼耐药细胞(NCI-H1975-OR)，由本实验室根据浓度梯度递增法构建所得。具体操作方法为：通过SRB法测定亲本NCI-H1975细胞的IC₅₀，并选择IC₅₀浓度的一半作为起始浓度对亲本细胞进行处理，处理24h后恢复正常培液进行培养。利用同浓度的药物进行多次处理，直到细胞在该药物浓度处理下能够稳定生长，作为第一代耐药细胞。重复上述步骤，以构建的第20代耐药细胞进行实验。

(2)奥希替尼，购自MedChemExpress(MCE)公司。

(3)利莫那班，购自MedChemExpress(MCE)公司。

2、细胞培养基

将500mL规格的RPMI-1640培养液于超净工作台中将其分装成45mL/份，每份加入5mL胎牛血清，加入1％的青霉素、链霉素混合抗生素，置于4℃冰箱保存，备用。

3、SRB法测定细胞增殖抑制率

取对数生长期的NCI-H1975奥希替尼耐药细胞，96孔板中每孔加入100μL培养液约2×10³个细胞，放入细胞培养箱中培养24h，使96孔板内细胞贴壁。

实验组及对照组设置：

实验组1为加入不同浓度的奥希替尼0.125、0.25、0.5、1、2、4μmol/L(分别为每L细胞体系中含奥希替尼0.125、0.25、0.5、1、2、4μmol)；

实验组2为加入不同浓度的利莫那班2、4、6、8、10、12μmol/L(分别为每L细胞体系中含利莫那班2、4、6、8、10、12μmol)；

实验组3为加入不同浓度的联合用药，0.125μmol/L奥希替尼+2μmol/L利莫那班(每L细胞体系中含奥希替尼0.125μmol和2μmol利莫那班)、0.25μmol/L奥希替尼+4μmol/L利莫那班、0.5μmol/L奥希替尼+6μmol/L利莫那班、1μmol/L奥希替尼+8μmol/L利莫那班、2μmol/L奥希替尼+10μmol/L利莫那班、4μmol/L奥希替尼+12μmol/L利莫那班；

以含DMSO(浓度少于0.1％)的培养基为对照组；培养基作为空白组。

作用72h后，弃去原培养液，每孔加入200μL 10％的三氯乙酸溶液放入4℃冰箱内固定30min。取出用去离子水冲洗5次，室温晾干。待96孔板室温下晾干后，每孔加入0.4％(w/v)的SRB染液(1％的乙酸配制)70μL，染色30min后倒掉染液，用1％(v/v)乙酸冲洗5次，去除未结合的染料，室温晾干。用100μL非缓冲Tris-base碱液(10mM，pH＝10.5)溶解与细胞蛋白结合的染料，水平摇床上振荡20min，采用酶标仪540nm处测定光吸收值(OD值)。细胞增殖的抑制率按如下公式计算：

抑制率＝1-(加药组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100％。

采用Calcusyn软件对合用指数CI进行计算。在软件操作界面中，输入不同药物的梯度浓度、药物单用的抑制率、两种药物的具体配比和药物合用抑制率等信息，利用软件内置的Chou-Talay公式即可计算药物的合用指数。合用指数小于1，认为两种药物之间具有潜在的协同作用。实验结果如表1和图1所示。

表1不同浓度组合的奥希替尼联合利莫那班对NCI-H1975奥希替尼耐药细胞(NCI-H1975-OR)的增殖抑制率(n＝1)

由表1和图1的实验结果可以看出，奥希替尼、利莫那班单独作用于NCI-H1975奥希替尼耐药细胞(NCI-H1975-OR)72h后，随药物浓度的增加，抑制细胞增殖的作用显著增强，对NCI-H1975-OR的增殖抑制作用呈浓度依赖关系。

实施例2

1、实验原料

(1)NCI-H1975细胞，由中国科学院干细胞库提供。NCI-H1975奥希替尼耐药细胞(NCI-H1975-OR)，由本实验室根据浓度梯度递增法构建所得。具体操作方法为：通过SRB法测定亲本NCI-H1975细胞的IC₅₀，并选择IC₅₀浓度的一半作为起始浓度对亲本细胞进行处理，处理24h后恢复正常培液进行培养。利用同浓度的药物进行多次处理，直到细胞在该药物浓度处理下能够稳定生长，作为第一代耐药细胞。重复上述步骤，以构建的第15代耐药细胞进行实验。

(2)奥希替尼、利莫那班，购自MedChemExpress(MCE)公司。

2、细胞培养基

将500mL规格的RPMI-1640培养液于超净工作台中将其分装成45mL/份，每份加入5mL胎牛血清，加入1％的青霉素、链霉素混合抗生素，置于4℃冰箱保存，备用。

3、SRB法测定细胞增殖抑制率

测定方法同实施例1。

实验组设置如下：

选用不同浓度的奥希替尼(0.125μmol/L、0.25μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L)分别与利莫那班4μmol/L联合用药浓度作用于NCI-H1975-OR。

实验结果如表2和图2所示。

表2固定浓度的利莫那班联合不同浓度的奥希替尼对NCI-H1975-OR细胞的增殖抑制率(n＝1)

由表2和图2的实验结果可以看出奥希替尼和利莫那班的联合用药对NCI-H1975奥希替尼耐药细胞的抑制率显著高于单独用药组，奥希替尼单用组的IC₅₀值为1.315μM，联合用药组的奥希替尼IC₅₀值为0.3024μM，即奥希替尼联合利莫那班对NCI-H1975-OR具有协同增效的抑制作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对技术方案做出若干修改或等同替换，这些修改或等同替换也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.奥希替尼和大麻素I型受体反向激动剂联合在制备治疗表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药的非小细胞肺癌的药物中的应用，其特征在于，所述大麻素I型受体反向激动剂为利莫那班，所述表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药的非小细胞肺癌为奥希替尼耐药的肺腺癌。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物中利莫那班与奥希替尼的摩尔比为1～32：1。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物中利莫那班与奥希替尼的摩尔比为3～8：1。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物中利莫那班与奥希替尼的摩尔比为4：1。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体。

6.如权利要求5所述的应用，特征在于，所述药学上可接受的载体为填充剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂或润滑剂。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物的制剂形式为口服片剂、颗粒剂、注射剂或胶囊。