CN115058543A

CN115058543A - 一组鉴别Delta变异毒株和Omicron变异毒株的引物组和试剂盒

Info

Publication number: CN115058543A
Application number: CN202210747280.7A
Authority: CN
Inventors: 刘红旗; 徐婧雯; 陈双; 鲁帅尧; 丁开云; 杨云; 陈泓宇; 杨程云; 刘建生
Original assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Priority date: 2022-06-28
Filing date: 2022-06-28
Publication date: 2022-09-16
Anticipated expiration: 2042-06-28
Also published as: CN115058543B

Abstract

本发明提供了一组鉴别Delta变异毒株和Omicron变异毒株的引物组和试剂盒，涉及核酸检测技术领域。本发明所述引物组，利用Delta毒株和Omicron毒株相对于新冠病毒的缺失基因分别设计得到，并将所述引物组和探针组合制备试剂盒，应用所述试剂盒检测新冠病毒具有较高的特异性和灵敏度。本发明设计的引物组或试剂盒在鉴定新冠病毒感染的同时提高了对新冠病毒Delta和Omicron变异株的检出效率，为临床医生和患者争取确诊和治疗的先机，同时为诊断共感染提供了检测手段，有利于公共卫生健康。

Description

一组鉴别Delta变异毒株和Omicron变异毒株的引物组和试剂盒

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一组鉴别Delta变异毒株和 Omicron变异毒株的引物组和试剂盒。

背景技术

目前市面上获批的检测试剂盒是基于新冠病毒ORF1ab基因和N基因设计的一步法RT-PCR。然而，由于病毒存在突变特性，导致不停出现新的突变株，给病毒的检测、诊断和控制带来了巨大的挑战。最近清华大学基于数字PCR 技术研发的核酸检测试剂盒灵敏度高达100copies/ml，但该方法不能区别不同的突变体，仍然需要测序来确定突变株，时间成本和金钱成本消耗巨大。因此亟需一种能够鉴定新冠病毒并同时完成不同突变株鉴别的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一组鉴别Delta变异毒株和Omicron 变异毒株的引物组和试剂盒，利用所述引物组和试剂盒，可实现一步法单重或三重qRT-PCR检测新冠病毒以鉴定新冠病毒感染的同时，区分是Delta或 Omicron毒株引起的感染抑或是共感染，特异性好，灵敏度高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一组鉴别Delta变异毒株和Omicron变异毒株的引物组，针对Delta变异毒株设计的正向引物由缺失位点前后的各9个核苷酸组成； Omicron变异毒株设计的正向引物由缺失位点前的8个核苷酸和缺失位点后的6个核苷酸组成；

所述缺失位点为Delta变异毒株和Omicron变异毒株相对于 SARS-CoV-2病毒原型株的缺失位点。

优选的，针对Delta变异毒株设计的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

针对Omicron变异毒株设计的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示。

优选的，针对Delta变异毒株设计的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

针对Omicron变异毒株设计的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4 所示。

本发明还提供了一种鉴别Delta变异毒株和Omicron变异毒株的试剂盒，包括上述引物组。

优选的，还包括分别针对Delta变异毒株和Omicron变异毒株设计的探针。

优选的，针对Delta变异毒株设计的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5 所示；

针对Omicron变异毒株设计的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

优选的，针对Delta变异毒株和Omicron变异毒株设计的探针上包含不同的荧光标记。

优选的，所述荧光标记包括ROX、FAM或Cy5。

优选的，当利用所述试剂盒进行一步法单重qRT-PCR检测时，检测体系以20μL计，包括：10μL 2×One Step RT-PCR Buffer III、0.4μL Takara ExTaq HS、0.4μLPrimeScript RT Enzyme Mix II、200nM的正向引物、200nM 的反向引物、200nM探针、3μL模板和余量的无核酸酶水；

检测程序包括：42℃5min；95℃10s；95℃5s，57℃34s，40个循环。

优选的，当利用所述试剂盒进行一步法三重qRT-PCR检测时，检测体系以20μL计，包括：10μL 2×One Step RT-PCR Buffer III、0.4μL Takara ExTaq HS、0.4μLPrimeScript RT Enzyme Mix II、0.3μL的引物和探针的混合液、3μL模板和余量的无核酸酶水；

检测程序包括：42℃5min；95℃10s；95℃5s，57℃34s，40个循环。

有益效果：本发明提供了一组鉴别Delta变异毒株和Omicron变异毒株的引物组，利用Delta毒株和Omicron毒株相对于新冠病毒的缺失基因分别设计得到。本发明还提供了包含所述引物组和探针的试剂盒，应用所述试剂盒检测新冠状毒具有较高的特异性和灵敏度，可从新冠病毒中特异性区分 Delta毒株和Omicron毒株，针对新冠病毒的最低检测限为3000copies/μL，针对Omicron变异株的最低检测限可达100copies/μL，针对Delta变异株的最低检测限为5000copies/μL。因此，本发明首次设计成功了一个试剂盒，可通过一步法三重qRT-PCR检测新冠病毒以鉴定是否为新冠病毒感染的同时区分是否为Delta或Omicron毒株引起的感染。本发明设计的引物组或试剂盒在鉴定新冠病毒感染的同时提高了对新冠病毒Delta和Omicron变异株的检出效率，为临床医生和患者争取确诊和治疗的先机，同时为诊断共感染提供了检测手段，有利于公共卫生健康。

附图说明

图1为本发明设计的特异性正向引物能够鉴别Delta变异毒株和 Omicron变异毒株的机理图；

图2为本发明构建质粒标准品的目的片段琼脂糖凝胶电泳图，其中M：DNA marker；泳道1：Delta检测靶标目的片段，167bp；泳道2：ORF1ab 检测靶标目的片段，119bp；泳道3：Omicron检测靶标目的片段，132bp；

图3为利用质粒标准品进行检测结果图，其中A为Pan-ORF1ab检测靶标的引物和探针检测T-ORF1ab质粒的扩增曲线和标准曲线；B为Delta-S 检测靶标的引物和探针检测T-Delta质粒的扩增曲线和标准曲线；C为 Omicorn-N检测靶标的引物和探针检测T-Omicron质粒的扩增曲线和标准曲线；

图4为每个检测靶标的引物与探针分别检测病毒RNA的扩增曲线(x 轴：循环数，y轴：荧光强度)；

图5为一步法三重qRT-PCR:A-C:Pan-ORF1ab、Delta-S和Omicorn-N 检测靶标的混合引物与探针分别检测10倍梯度稀释的、T-ORF1ab(A)、 T-Delta(B)和T-Omicron(C)重组质粒的扩增曲线和标准曲线；

图6为Pan-ORF1ab、Delta-S和Omicron-N检测靶标的混合引物与探针分别检测SARS-CoV-2原型株、Delta变异毒株、Omicron变异毒株病毒RNA 的扩增曲线(x轴：循环数，y轴：荧光强度)，第一列图的扩增曲线有每个检测靶标的荧光通道，另外3列图分别展示单独的荧光通道。

具体实施方式

在本发明中，相较于其他SARS-CoV-2病毒而言，Delta变异毒株和 Omicron变异毒株分别在S基因和N基因中出现某些核苷酸的缺失，且这些位置缺失了6个及以上核苷酸数量；因此本发明基于所述缺失位点设计对应的正向引物，并构建实时荧光定量PCR以达到筛查变异毒株的目的。在本发明实施例中，优选Delta变异毒株和Omicron变异毒株中缺失位点前后的核苷酸组成的特异性正向引物：针对Delta变异毒株设计的正向引物由缺失位点前后的各9个核苷酸组成；Omicron变异毒株设计的正向引物由缺失位点前的8个核苷酸和缺失位点后的6个核苷酸组成。针对Delta变异毒株设计的正向引物的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.1所示；针对Omicron变异毒株设计的正向引物的核苷酸序列优选如SEQ IDNO.2所示。且，本发明所述正向引物可以很好的匹配Delta变异毒株和Omicron变异毒株的序列，顺利进行后续PCR扩增，释放荧光，以达到鉴别毒株的目的，而对于其他毒株，所述正向引物由于引物中部缺失较多的核苷酸而不能匹配上病毒模板，因而不能进行正常的PCR扩增(图1)。

本发明还针对Delta变异毒株和Omicron变异毒株设计反向引物，且针对Delta变异毒株设计的反向引物的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.3所示；针对Omicron变异毒株设计的反向引物的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.4 所示。

表1本发明所涉及的引物和探针

注：*由中国病毒病预防控制所提供的用于新冠病毒特异性检测的引物和探针；a，GenBank登记号NC_045512.2；b，GISAID登记号EPI_ISL_5088281；c，GenBank登记号OL672836.1。

本发明所述试剂盒中优选还包括分别针对Delta变异毒株和Omicron变异毒株设计的探针，且在所述探针上优选包含不同的荧光标记和淬灭基团，所述荧光标记优选包括ROX、FAM或Cy5。本发明所述淬灭基团优选包括 BHQ1和BHQ2。

本发明针对Delta变异毒株设计的探针的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.5所示，并携带FAM荧光基团；针对Omicron变异毒株设计的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，并携带Cy5荧光基团。

利用本发明所述试剂盒既可以进行一步法单重qRT-PCR检测，也可以进行一步法三重qRT-PCR检测。如利用所述试剂盒进行一步法单重qRT-PCR 检测时，检测体系以20μL计，优选包括：10μL 2×One Step RT-PCR Buffer III、 0.4μL Takara ExTaq HS、0.4μLPrimeScript RT Enzyme Mix II、200nM的正向引物、200nM的反向引物、200nM探针、3μL模板和余量的无核酸酶水；检测程序优选包括：42℃5min；95℃10s；95℃5s，57℃34s，40个循环。在本发明中，当利用所述试剂盒进行一步法三重qRT-PCR检测时，检测体系以20μL计，优选包括：10μL 2×One Step RT-PCR Buffer III、0.4μL Takara ExTaq HS、0.4μLPrimeScript RT Enzyme Mix II、0.3μL的引物和探针的混合液、3μL模板和余量的无核酸酶水；检测程序优选包括：42℃5min； 95℃10s；95℃5s，57℃34s，40个循环。

本发明所述试剂盒中还可以添加基于新冠病毒ORF1ab基因设计的引物组和探针，其所涉及的引物序列和探针序列优选如表1中所示。在本发明中，所述多重优选为一步法三重qRT-PCR检测，优选如表2所示，其中表2为 Pan-ORF1ab、Delta-S和Omicron-N检测靶标的三重qRT-PCR反应体系。

表2一步法三重qRT-PCR的反应体系

在本发明中，所述qRT-PCR优选在BIO-RAD CFX96仪器上进行，并在每次实验结束后自动确定每个荧光基团的基线和阳性阈值线；Pan-ORF1ab 检测靶标的ROX荧光基线若设置为450，Cq阳性阈值线设置为31，即Cq 值小于或等于31的样本(≤31)被视为阳性，高于31为阴性；Delta-S检测靶标的FAM荧光基线若设置为50，Cq阳性阈值线设置为35，即Cq值小于或等于35的样本(≤35)被视为阳性，高于35为阴性；Omicron-N检测靶标的Cy5荧光基线若设置为150，Cq阳性阈值线设置为36，即Cq值小于或等于36的样本(≤36)被视为阳性，高于36为阴性。

下面结合实施例对本发明提供的一组鉴别Delta变异毒株和Omicron变异毒株的引物组和试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1、引物和探针的设计和合成

针对Delta变异毒株和Omicron变异毒株的特异性引物和探针，分别命名为Delta-S和Omicron-N。同时，选择由中国病毒病预防控制所提供的针对新冠病毒ORF1ab基因检测的通用引物和探针，命名为Pan-ORF1ab检测靶标。3个检测靶标的引物和探针由生工生物工程(上海)有限公司合成(表 1)。所有引物也用于质粒标准品的构建。

结果如图1所示，Delta-S和Omicron-N检测靶标分别在Delta变异毒株和Omicron变异毒株的基因组序列中特异性缺失，具有较好的检测特异性。

2、病毒RNA的获取

SARS-CoV-2原型株(Geographic and Genomic Distribution of SARS-CoV-2Mutations)、Delta变异毒株(Exponential growth,high prevalence ofSARS-CoV-2,andvaccine effectiveness associated with the Delta variant)和 Omicron变异毒株(SARS-CoV-2 Omicron variant recent progress and futureperspectives)的核酸均由中国医学科学院医学生物学研究所高等级安全实验室提供。所有阳性样本均通过中国医学科学院医学生物学研究所等级安全实验支撑部的鉴定。

3、质粒标准品的构建

根据One Step PrimeScript^TMRT-PCR Kit(Takara生物医学科技有限公司) 的说明书，用表1的引物按表3反应体系分别用SARS-CoV-2原型株、Delta 变异毒株和Omicron变异毒株的核酸扩增3个检测靶标的目的片段，使用 Bio-Rad CFX 96实时荧光PCR仪进行以下反应程序：42℃5min；95℃10s； 95℃5s，55℃34s，40个循环，在每个循环结束时自动收集荧光信号。扩增产物用体积分数为2％的琼脂糖凝胶电泳鉴定；胶回收纯化；通过TA克隆将目的基因片段克隆至pMD19-T载体(Takara生物医学科技有限公司) 中，并由生工生物工程(上海)有限公司进行DNA测序鉴定，命名为 T-ORF1ab、T-Delta和T-Omicron。

表3扩增标准品目的片段的反应体系

琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，分别扩增得到约119bp检测ORF1ab 靶标的目的片段；约167bp检测Delta-S靶标的目的片段；及约132bp检测 Omicron-N靶标的目的片段，3个片段大小均与预期相符。将构建好的质粒 T-ORF1ab、T-Delta和T-Omicron送公司测序，显示目的片段序列正确。

4、一步法单重qRT-PCR反应条件的优化

按照表3所示，以病毒核酸为模板，配制一步法单重qRT-PCR的反应体系(20μL)，包括10μL 2×One Step RT-PCR Buffer III、0.4μL Takara ExTaq HS，0.4μL PrimeScriptRT Enzyme Mix II，0.4μL每个靶标的正向和反向引物(10μM)、0.8μL探针(5μM)、3μL模板，再用无核酸酶水补齐剩余的体积。使用Bio-Rad CFX 96实时荧光PCR仪进行以下反应程序：42℃5min； 95℃，10s；95℃5s，60℃～50℃(系统自动设置温度梯度)34s，40个循环，在每个循环结束时自动收集荧光信号。

仪器自动设置50℃～60℃的退火温度梯度为60℃、59.4℃、58.3℃、 56.3℃、53.9℃、52℃、50.7℃和50℃。以Delta变异毒株的核酸为模板进行扩增时，退火温度在60℃、59.4℃和58.3℃均未出现Cq值和扩增曲线，从 56.3℃开始才有Cq值，且53.9℃～50℃之间的Cq值趋于稳定。而其他2个靶标的单重qRT-PCR在所有温度中均有Cq值和扩增曲线(表4)。退火温度在56.3℃附近时能较好的兼顾3个靶标的扩增效果，因此设定57℃为 qRT-PCR的最佳退火温度，以便后续开展三重qRT-PCR检测。

表4一步法单重qRT-PCR检测病毒RNA以优化退火温度

5、一步法单重qRT-PCR检测质粒标准品

将质粒浓度换算为质粒拷贝数[copies/μL＝质粒浓度×(6.02×10²³)× (ng/μl×10^-9)/(DNA碱基数×660)]，并将3种质粒标准品T-ORF1ab、T-Delta 和T-Omicron分别从1×10⁷拷贝/μL稀释至1×10¹拷贝/μL。按照表3配制一步法单重qRT-PCR的反应体系(20μL)，对3种质粒标准品进行检测。使用Bio-Rad CFX 96实时荧光PCR仪进行以下反应程序：42℃5min；95℃10 s；95℃5s，57℃34s，40个循环，在每个循环结束时自动收集荧光信号。最后由Bio-Rad CFX Manager 3.1生成标准曲线和扩增效率(E值)，再用 GraphPad Prism 8.0.2计算标准曲线的标准方程和线性相关系数(R²)。

选择10倍梯度稀释的质粒标准品(1×10⁷～1×10¹拷贝/μL)为模板进行一步法单重qRT-PCR，3个检测靶标的标准曲线显示出较好的E值(扩增效率)和R²(相关系数)如图3所示，Pan-ORF1ab：R²＝0.9959，E值＝94.4％； Delta-S：R²＝0.9927，E值＝100.5％；Omicron-N：R²＝0.9917，E值＝100.7％，表明所述质粒标准品合格，所设计的引物和探针有效。

6、一步法单重qRT-PCR检测病毒RNA

按照表3配制一步法单重qRT-PCR的反应体系(20μL)，对SARS-CoV-2 原型株、Delta变异毒株和Omicron变异毒株的核酸进行检测。使用Bio-Rad CFX 96实时荧光PCR仪进行以下反应程序：42℃5min；95℃10s；95℃ 5s，57℃34s，40个循环，在每个循环结束时自动收集荧光信号。

使用新冠病毒原型株、Delta变异毒株和Omicron变异毒株的病毒核酸分别进行一步法单重qRT-PCR检测。结果如图4所示，新冠病毒原型株、 Delta变异毒株和Omicron变异毒株在Pan-ORF1ab检测靶标的单重qRT-PCR 中均有很好的扩增曲线。只有Delta变异毒株和Omicron变异毒株分别在 Delta-S和Omicron-N检测靶标的单重qRT-PCR反应中才能出现特异性的Cq 值和扩增曲线。说明本发明针对Delta变异毒株和Omicron变异毒株设计的引物和探针具有较好的特异性。

7、一步法三重qRT-PCR检测病毒RNA

如表2所示，Pan-ORF1ab、Delta-S和Omicron-N检测靶标的三重 qRT-PCR反应体系为20μL，分别将3个检测靶标的引物以终浓度为100nM、 200nM和200nM进行混合，同时将探针以终浓度分别为100nM、200nM 和200nM进行了混合，按照以上反应程序进行qRT-PCR，分别检测10倍梯度稀释的质粒标准品(1×10⁷～1×10¹拷贝/μL)和三个新冠病毒核酸。

10倍梯度稀释的质粒标准品(1×10⁷～1×10¹拷贝/μL)为模板进行一步法三重qRT-PCR，3个检测靶标均显示出较好的E值(扩增效率)和R²(相关系数)，如图5所示，Pan-ORF1ab：R²＝0.9996，E值＝100.7％；Delta-S： R²＝0.9968，E值＝103.5％；Omicron-N：R²＝0.9992，E值＝98.2％，说明本发明的一步法三重qRT-PCR检测方法对Pan-ORF1ab、Delta-S和Omicron-N靶标具有很好的检测效果和扩增效果。

一步法三重qRT-PCR检测病毒核酸结果如表5和图6所示，三个毒株核酸在一步法三重qRT-PCR反应中均出现特异性的ROX荧光Cq值和扩增曲线，即Pan-ORF1ab靶标，说明在一步法三重qRT-PCR中能检测到不同新冠病毒毒株，保证了本发明检测新冠病毒的广谱性；同时只有Delta和 Omicron变异毒株核酸分别在一步法三重qRT-PCR反应中出现特异性的FAM和Cy5荧光Cq值和扩增曲线，而原型株没有出现特异性的FAM和Cy5 荧光Cq值和扩增曲线，说明本发明的一步三重qRT-PCR可特异性检测和区别出Delta变异毒株和Omicron变异毒株。

表5一步法三重qRT-PCR检测病毒核酸

9、一步法三重qRT-PCR的灵敏度检测

为了确定一步法三重qRT-PCR检测方法的最低检测限(LOD)，分别以不同浓度的质粒标准品为模板，每个浓度重复23个孔，按照表2配制反应体系进行三重qRT-PCR检测。将23个复孔中符合95％阳性检出率的最低浓度被认为是可靠的LOD。

Pan-ORF1ab、Delta-S和Omicron-N检测靶标的三重qRT-PCR检测中， Pan-ORF1ab靶标的最低检测限为3000拷贝/μL；Delta-S靶标的最低检测限为5000拷贝/μL；Omicron-N靶标的最低检测限为10拷贝/μL(表6)。

表6一步法三重qRT-PCR的灵敏度检测

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国医学科学院医学生物学研究所

<120> 一组鉴别Delta变异毒株和Omicron变异毒株的引物组和试剂盒

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tggaaagtgg agtttatt 18

<210> 2

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccagaatggt gggg 14

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aataggcgtg tgcttagaat 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

attggaacgc cttgtcctcg 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctctcagcct tttcttatgg ac 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcttggttca ccgctctcac 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccctgtgggt tttacactta a 21

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acgattgtgc atcagctga 19

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccgtctgcgg tatgtggaaa ggttatgg 28

Claims

1.一组鉴别Delta变异毒株和Omicron变异毒株的引物组，其特征在于，针对Delta变异毒株设计的正向引物由缺失位点前后的各9个核苷酸组成；Omicron变异毒株设计的正向引物由缺失位点前的8个核苷酸至缺失位点后的6个核苷酸组成；

所述缺失位点为Delta变异毒株和Omicron变异毒株相对于SARS-CoV-2病毒原型株的缺失位点。

2.根据权利要求1所述引物组，其特征在于，针对Delta变异毒株设计的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

针对Omicron变异毒株设计的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1或2所述引物组，其特征在于，针对Delta变异毒株设计的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

针对Omicron变异毒株设计的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.一种鉴别Delta变异毒株和Omicron变异毒株的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述引物组。

5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，还包括分别针对Delta变异毒株和Omicron变异毒株设计的探针。

6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，针对Delta变异毒株设计的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

7.根据权利要求5或6所述试剂盒，其特征在于，针对Delta变异毒株和Omicron变异毒株设计的探针上包含不同的荧光标记。

8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述荧光标记包括ROX、FAM或Cy5。

9.根据权利要求4～8任一项所述试剂盒，其特征在于，当利用所述试剂盒进行一步法单重qRT-PCR检测时，检测体系以20μL计，包括：10μL 2×One Step RT-PCR Buffer III、0.4μL Takara ExTaq HS、0.4μL PrimeScript RT Enzyme Mix II、200nM的正向引物、200nM的反向引物、200nM探针、3μL模板和余量的无核酸酶水；

检测程序包括：42℃5min；95℃10s；95℃5s，57℃34s，40个循环。

10.根据权利要求4～8任一项所述试剂盒，其特征在于，当利用所述试剂盒进行一步法三重qRT-PCR检测时，检测体系以20μL计，包括：10μL 2×One Step RT-PCR Buffer III、0.4μL Takara ExTaq HS、0.4μL PrimeScript RT Enzyme Mix II、0.3μL的引物和探针的混合液、3μL模板和余量的无核酸酶水；

检测程序包括：42℃5min；95℃10s；95℃5s，57℃34s，40个循环。