CN112342316A

CN112342316A - 实时荧光rna恒温快速扩增检测发热伴血小板减少综合征病毒的引物探针组和检测方法

Info

Publication number: CN112342316A
Application number: CN202011173909.9A
Authority: CN
Inventors: 李阿茜; 梁米芳; 芜为; 黄晓霞; 李川; 李德新; 李建东
Original assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2020-10-28
Filing date: 2020-10-28
Publication date: 2021-02-09

Abstract

本发明涉及核酸检测技术领域，具体涉及实时荧光RNA恒温快速扩增检测发热伴血小板减少综合征病毒的引物探针组和检测方法。本发明针对发热伴血小板减少综合征病毒提供了适用于实时荧光RNA恒温快速扩增的引物探针组，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2‑4所示，该引物探针组具有较高的特异性和灵敏度。本发明提供的实时荧光RNA恒温快速扩增检测方法可实现特异、灵敏、准确、快速的发热伴血小板减少综合征病毒检测，具有检测时间短、操作简单、不依赖热循环设备等优势，可满足现场检测的需求，具有广阔的应用前景。

Description

实时荧光RNA恒温快速扩增检测发热伴血小板减少综合征病毒的引物探针组和检测方法

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，具体涉及用于检测发热伴血小板减少综合征病毒的靶序列、特异性引物探针组，试剂盒以及利用实时荧光RNA恒温快速扩增技术检测发热伴血小板减少综合征病毒的方法。

背景技术

发热伴血小板减少综合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS)是一种由发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopeniasyndrome virus，SFTSV)感染引起的严重的传染性疾病，主要临床症状为发热，血小板和白细胞减少，胃肠道症状和肝肾功能异常等。发热伴血小板减少综合征主要经蜱叮咬传播，但直接接触病例血液和体液等亦可引起人—人传播，因此对发热伴血小板综合症病毒的早期诊断是疫情防控的关键。病毒核酸检测技术可特异性的检测病毒靶基因，更敏感、快速，极大避免了使用传染性病毒的生物安全风险，在发热伴血小板减少综合征病毒早期感染的检测与诊断方面具有独特的优势，适用于发热伴血小板减少综合征急性期标本的检测。

传统的PCR技术依赖温度变化实现变性、复性、延伸等扩增反应，完成扩增技术需依赖精密而复杂的大型仪器控制，例如温控调节仪器和复杂的样本处理步骤，这些设备体积大、价格贵并且操作复杂，不适合用于疫情爆发时现场应急检测任务。

RNA恒温快速扩增技术是一种新型等温扩增技术，通过一对引物与模板同源区域特异性结合形成重组酶引物复合体，实现链置换作用，并在DNA聚合酶作用下实现延伸，不需要DNA变性即可实现等温扩增。实时荧光RNA恒温快速扩增技术则在RNA恒温快速扩增技术的基础上进一步引入荧光标记的探针，以便于通过检测荧光信号得到检测结果，荧光探针设计的原理示例如图1所示(安普未来RNA恒温快速扩增试剂荧光探针设计原则书)。RNA恒温快速扩增技术在一定温度条件下可实现对目标产物的扩增从而达到检测目的，不需要经历热循环过程，具备快速、操作简单、不需依赖热循环设备等优势，保证了时间的及时性和精确性，具有较好的现场检测应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异、灵敏、快速准确的发热伴血小板减少综合征病毒的检测方法以及用于检测的引物探针组和试剂盒。

为实现上述目的，本发明利用实时荧光RNA恒温快速扩增技术(RT-RPA)以SFTSV的NP基因中如SEQ ID NO.1所示的序列为靶序列进行SFTSV的检测。本发明经过大量的筛选和对比优化，设计了适用于实时荧光RNA恒温快速扩增的特异性引物对和探针，实现了SFTSV的特异、灵敏、准确的检测。

第一方面，本发明提供用于检测发热伴血小板减少综合征病毒的靶序列，其具有SEQ ID NO.1所示的序列或为其特异性片段。

本发明提供上述靶序列在利用实时荧光RNA恒温快速扩增技术检测发热伴血小板减少综合征病毒中的应用。

第二方面，本发明提供用于实时荧光RNA恒温快速扩增技术检测发热伴血小板减少综合征病毒的引物探针组，包含核苷酸序列如SEQ ID NO.2-3所示的特异性引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的探针。

SEQ ID NO.2:SFTSV-S-exo-F2-3-1:5’-TGGCTCCGCGCATCTTCACATTGATAGTCT-3’；

SEQ ID NO.3:SFTSV-S-exo-R1-4:5’-CGAGAATTATCCCCCTGAGATGATGTGCATGG-3’；

SEQ ID NO.4:SFTSV-S-exo-P1-1:5’-CTTCACATTGATAGTCTTGGTGAAGGCATCTTGCCATA AAGAGTAA-3’。

优选地，本发明所述的探针为荧光探针。

所述荧光探针的修饰方式可采用本领域常规的荧光探针修饰方式，例如：在探针中间位置临近的两个T碱基上分别标记荧光基团和淬灭基团。

具体地，所述荧光探针为分别于四氢呋喃(THF)两侧标记荧光基团(dT-荧光基团)和淬灭基团(dT-淬灭基团)，且两基团之间相距约2-4bp。

优选地，本发明所述探针为：5’-CTTCACATTGATAGTCTTG GTGAAGGCA[荧光基团-dT][dSpacer][淬灭基团-dT]TGCCATAAA GAGTAA[C3spacer]-3’。

所述荧光基团为选自FAM、HEX、Texas Red、CY5、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX、LCRED640、LC RED705中的任一种；所述淬灭基团为选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl中的任一种。

作为本发明的优选方案，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为BHQ1。

本发明提供所述引物探针组在制备发热伴血小板减少综合征病毒检测试剂盒中的应用。

第三方面，本发明提供发热伴血小板减少综合征病毒检测试剂盒，其包含所述用于实时荧光RNA恒温快速扩增技术检测发热伴血小板减少综合征病毒的引物探针组。

优选地，所述试剂盒还包含逆转录酶、重组酶，聚合酶、单链结合蛋白、核酸外切酶、再水化缓冲液、RNA酶抑制剂、醋酸镁缓冲液、阳性对照模板、ddH₂O中的一种或多种。

上述试剂盒中的各种酶和缓冲液可分别独立包装或以预混液的形式提供。

上述试剂盒在用于实时荧光RNA恒温快速扩增时的反应体系包括：上、下游引物各0.3～0.5μM，探针0.01～0.015μM。

作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒在用于实时荧光RNA恒温快速扩增时的50μl反应体系包括：再水化缓冲液(Buffer A)29.0～29.5μl，上、下游引物(10μM)各1.5～2.5μl，探针(10μM)0.5～0.75μl，40U/μl的RNA酶抑制剂0.5μl，RNA模板5μl，干粉状的酶混合物(由逆转录酶、重组酶、聚合酶、单链结合蛋白、核酸外切酶组成)，醋酸镁溶液(BufferB)2.5～3μl，加ddH₂O至总体系为50μl。

上述试剂盒在用于实时荧光RNA恒温快速扩增时的反应程序为：35～45℃扩增2～15min。

第四方面，本发明提供发热伴血小板减少综合征病毒的实时荧光RNA恒温快速扩增检测方法，包括：以待测样品RNA为模板，利用所述引物探针组或所述检测试剂盒进行实时荧光RNA恒温快速扩增，根据扩增产物的荧光检测结果，判断待测样品中是否含有发热伴血小板减少综合征病毒核酸。

上述检测方法的结果判断方法具体如下：将反应管置于实时荧光等温扩增检测仪中，实时读取荧光信号，若待测样品出现相应的扩增曲线，则判断待测样品中含有发热伴血小板减少综合征病毒核酸，检测结果为阳性；若未出现扩增曲线或扩增曲线低于检测阈值。则判断待测样本中不含有发热伴血小板减少综合征病毒核酸，检测结果为阴性。

基于非疾病诊断目的，本发明提供发热伴血小板减少综合征病毒的实时荧光RNA恒温快速扩增检测方法，包括：以待测样品RNA为模板，利用所述引物探针组或所述检测试剂盒进行实时荧光RNA恒温快速扩增，根据扩增产物的荧光检测结果，判断待测样品中是否含有发热伴血小板减少综合征病毒。

本发明的有益效果在于：本发明以发热伴血小板减少综合征病毒的NP基因作为检测靶标，针对该基因提供的用于实时荧光RNA恒温快速扩增的引物探针组具有较高的特异性和灵敏度，能够实现高效的实时荧光RNA恒温快速扩增。在此基础上建立的实时荧光RNA恒温快速扩增检测方法可实现特异、灵敏、准确、快速的发热伴血小板减少综合征病毒的检测。此外，本发明提供的发热伴血小板减少综合征病毒检测方法还具有检测时间短、操作简单、不需依赖热循环设备等优势，保证了检测的及时性和精确性，可满足现场检测的需求，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明背景技术中用于实时荧光RNA恒温快速扩增的探针的设计原理图。

图2A、图2B、图2C、图2D、图2E、图2F为本发明实施例2中使用RT-RPA试剂盒的探针的筛选结果(模板为1×10⁸Copies/μl SFTSV NP体外转录RNA)。

图3A、图3B、图3C为本发明实施例2中使用RT-RPA试剂盒的探针的筛选结果(模板为1×10⁵Copies/μl SFTSV NP体外转录RNA)。

图4为本发明实施例2中使用RT-RPA试剂盒的上游引物的第一轮筛选结果。

图5为本发明实施例2中使用RT-RPA试剂盒的下游引物的第一轮筛选结果。

图6A、图6B、图6C、图6D、图6E、图6F为本发明实施例2中使用安普未来RNA恒温快速扩增试剂盒的第一轮引物筛选结果(模板为1×10³Copies/μl SFTSV NP体外转录RNA)，其中，图6A为F1-1与下游引物的筛选，图6B为F1-2与下游引物的筛选，图6C为F1-3与下游引物的筛选，图6D为F1-4与下游引物的筛选，图6E为F1-5与下游引物的筛选，图6F为F1-6与下游引物的筛选。

图7A、图7B、图7C、图7D、图7E、图7F、图7G、图7H为本发明实施例2中使用安普未来RNA恒温快速扩增试剂盒的第二轮引物筛选结果，其中，图7A为R1-4与上游引物的筛选，图7B为R2-4-1与上游引物的筛选，图7C为R2-4-2与上游引物的筛选，图7D为R1-2与上游引物的筛选，图7E为R 2-2-1与上游引物的筛选，图7F为R 2-2-2与上游引物的筛选，图7G为：R2-2-3与上游引物的筛选，图7H为R 2-2-4与上游引物的筛选。

图8为本发明实施例2中第二轮引物筛选中编号为1-1、1-2、1-4、2-1、4-1引物探针组合再次进行扩增比较结果。

图9为本发明实施例4中特异性评价结果，SFTSV代表发热伴血小板减少综合征病毒，其他病毒代表黄热病毒疫苗株，登革病毒Ⅰ、II、III、Ⅳ型，基孔肯雅病毒GD113株，汉滩病毒，汉城病毒，寨卡病毒。

图10为本发明实施例5中灵敏度评价结果，其中，1～8依次为1×10⁷copies/μl、1×10⁶copies/μl、1×10⁵copies/μl、1×10⁴copies/μl、1×10³copies/μl、1×10²copies/μl、1×10¹copies/μl体外转录RNA模板和空白对照的扩增曲线。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1发热伴血小板减少综合征病毒NP基因体外转录RNA的制备

本实施例利用体外转录方法制备了发热伴血小板减少综合征病毒NP基因的体外转录RNA，为后续检测实验提供阳性RNA模板。

1、PCR扩增含T7启动子的NP基因

利用PCR的方法将T7启动子引入发热伴血小板减少综合征病毒正链阅读框的上游和负链阅读框的下游，以实现经体外转录后，获得与病毒基因组序列一致的RNA。以病毒RNA逆转录合成的cDNA为模板，使用FastStart High Fidelity PCR system，配制如下PCR反应体系：

上游引物(SEQ ID NO.5)：5’-TTGTGAGCGGATAACAATTCCC-3’；

下游引物(SEQ ID NO.6)：5’-AATTAATACGACTCACTATAGGGAGTGGTGGT GGTGGTGGTG-3’。

扩增得到SFTSV NP基因全长，其序列如SEQ ID NO.7所示。

PCR反应条件为：94℃、3分钟；94℃、30秒，55℃、1分钟，72℃、2分钟，40个循环；72℃、10分钟。

2、PCR产物回收

步骤1得到的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，使用

IIGel Extraction Kit进行切胶回收，操作步骤如下：

(1)从琼脂糖凝胶中切下目的条带，称重；

(2)加入5倍于胶体积的QG Buffer；

(3)置于50℃水浴中10分钟融化凝胶，每隔2～3分钟轻柔振摇；

(4)将样品移入QIAquick柱，10,000rpm离心15秒，弃滤液；

(5)加入750μL PE Buffer，室温静置5分钟，10,000rpm，离心15秒，弃滤液；

(6)加入750μL PE Buffer，10,000rpm，离心15秒，弃滤液；

(7)10,000rpm，离心2分钟；

(8)将QIAquick柱置于新的1.5mL EP管中，向柱的中心加入40μL RNase freewater，室温静置2分钟，10,000rpm，离心1分钟，收集洗脱液。

3、体外转录

使用RiboMAX^TMLarge Scale RNA Production Systems—SP6 and T7进行体外转录，获得靶基因NP的RNA模板，配制如下体系：

30℃反应2～4小时后，加入1U/μg模板DNA的RQ1 RNase free DNase，37℃反应15分钟。

4、体外转录RNA产物的回收与定量

使用RNeasy Mini Kit立即对步骤3得到的体外转录RNA产物进行纯化，操作步骤如下：

(1)用DEPC处理水将上述体外转录反应产物的体积调整至100μL，加入350μL RLTBuffer，混匀，再加入250μL无水乙醇，混匀；

(2)将上述混合液加入到RNeasy Mini Spin柱中，10,000rpm，离心15秒，弃滤液；

(3)加入700μL RW1 Buffer，10,000rpm，离心15秒，弃滤液；

(4)加入500μL RPE Buffer，10,000rpm，离心15秒，弃滤液，重复该步骤一次；

(5)将RNeasy Mini Spin柱置于新的2mL收集管中，13,000rpm，离心1分钟；

(6)将RNeasy Mini Spin柱置于新的1.5mL EP管中，向柱的中心加入100μL RNasefree water，室温静置2分钟，13,000rpm，离心1分钟，收集洗脱液。

琼脂糖凝胶电泳分析体外转录获得的RNA模板(SFTSV-NP)的纯度后，使用DEPC处理水进行稀释后，采用Nanodrop分光光度计进行3次测量，保证测量的值在100-300ng/μL之间，取测量的平均值计算各纯化后RNA产物的质量浓度后，采用下列公式，计算各自的拷贝数浓度：

Y(copies/μL)＝[X(g/μL)/核苷酸的转录长度×340]×6.02×10²³。

实施例2适用于实时荧光RNA恒温快速扩增的引物和探针的设计

通过对发热伴血小板减少综合征病毒的NP基因进行序列比对，寻找保守区域，针对保守区域设计适用于实时荧光RNA恒温快速扩增技术的引物和探针。

用于RNA恒温快速扩增的引物和探针设计的一般原则如下：

(1)探针长度一般在46-52之间。

(2)探针一般包括荧光基团、淬灭基团、四氢呋喃(THF)以及3’末端的block。

(3)THF的5’端至少需要有30个碱基，3’端一般需要有15个碱基，THF位于荧光基团和淬灭基团之间，一般荧光基团和淬灭基团间相隔2-4个碱基。

(4)合成探针时，THF一般可以使用“dSpacer”代替，3’端block修饰一般可选用“C3-Spacer”和“a phosphate”。

(5)引物设计所在的目标区域序列应较保守，GC含量应介于40％-60％之间，且避免大量的长片段重复序列。

适用于RNA恒温快速扩增的引物和探针通常需要较长的序列，这使得在扩增过程中易产生二聚体和发夹结构，进而影响扩增效率。而且，目前没有适用于RNA恒温快速扩增的引物和探针设计的评价软件。因此，若想得到高效的RNA恒温快速扩增引物和探针需要进行大量的筛选和人工优化。本发明针对NP基因的保守序列设计了多组引物探针序列，在这些引物探针中进行不断的筛选、测试和优化，以下为本发明设计的大量候选引物探针组合的部分罗列及效果说明。

1、引物探针设计

选取SFTSV NP片段保守区设计多条引物和探针，以其中的6条上、下游引物和6条探针为例说明引物和探针的筛选过程，6条上、下游引物和6条探针的序列如表1所示。

表1 SFTSV NP exo-RT扩增引物序列

2、探针筛选

通过6条上游引物与1条下游引物进行一一组合，组合如表2所示，分别对6条探针进行筛选，模板选用1×10⁸Copies/μl SFTSV NP体外转录RNA。根据图2A、2B、2C、2D、2E、2F的结果显示，6种上下游引物组合均与探针SFTSV-S-exo-P1-1(1150-1195)具有较好的扩增反应，部分上下游引物组合与探针SFTSV-S-exo-P1-5(1187-1234)和SFTSV-S-exo-P1-6(1189-1238)有较好的扩增效应；为了让筛选结果更加准确，选用1×10⁵Copies/μl SFTSVNP体外转录RNA作为模板对SFTSV-S-exo-P1-1，SFTSV-S-exo-P1-5，SFTSV-S-exo-P1-6三条探针进行进一步筛选。结果如图3A、图3B和图3C所示，6种上下游引物组合与探针SFTSV-S-exo-P1-1(1150-1195)的扩增反应均优于SFTSV-S-exo-P1-5和SFTSV-S-exo-P1-6。

表2 6种引物组合对探针的筛选

3、引物的筛选

(1)第一轮引物筛选

①上游引物筛选

选取下游引物SFTSV-S-exo-R1-1和已筛选探针SFTSV-S-exo-P1-1对6条上游引物进行筛选，组合如表3所示。根据表3及图4结果显示，1f3r1p4组合效果较好，故上游引物SFTSV-S-exo-F1-3扩增相对较好。

表3上游引物筛选组合及反应时间结果

②下游引物筛选

利用已筛选的上游引物SFTSV-S-exo-F1-3和1条探针SFTSV-S-exo-P1-1对6条下游引物进行筛选，组合如表4所示，由表4及图5可得出下游引物SFTSV-S-exo-R1-4相对具有较好的扩增反应。

表4下游引物筛选组合及反应时间结果

由第一轮筛选结果可初步得出，与其他引物和探针相比，探针SFTSV-S-exo-P1-1、上游引物SFTSV-S-exo-F1-3、下游引物SFTSV-S-exo-R1-4的扩增效果更优，但仍需进一步调整。

上述筛选采用TwistAmp exo RT-RPA试剂盒进行，进一步采用安普未来公司的RNA恒温快速扩增试剂盒对第一轮引物重新进行引物筛选，保持探针SFTSV-S-exo-P1-1不变。

具体地，将6条上下游引物一一对应搭配，与探针SFTSV-S-exo-P1-1组合进行筛选，模板选用1×10³Copies/ul SFTSV NP体外转录RNA，由图6A、图6B、图6C、图6D、图6E、图6F可知，上游引物SFTSV-S-exo-F1-3与下游引物组合最佳，且从SFTSV-S-exo-F1-3与下游引物组合结果来看，SFTSV-S-exo-R1-2、SFTSV-S-exo-R1-4扩增效果更优。由第一轮筛选可初步得出，探针SFTSV-S-exo-P1-1、上游引物SFTSV-S-exo-F1-3、下游引物SFTSV-S-exo-R1-2、SFTSV-S-exo-R1-4相对具有更优的扩增效果，但仍需进一步调整。

(2)第二轮引物筛选

为进一步提高实时荧光RNA恒温快速扩增效率，依据引物筛选策略，探针SFTSV-S-exo-P1-1保持不变，在第一轮筛选结果的基础上将待选引物碱基位置及数量做进一步调整。重新设计3条上游引物和6条下游引物，序列如表5所示。

表5第二轮引物筛选序列

将第一轮筛选结果所得上游引物SFTSV-S-exo-F1-3、下游引物SFTSV-S-exo-R1-4与新合成的上下游引物分别一一组合，最后形成32组引物对，并将其编号，如表6所示。依据编号一一进行RNA恒温快速扩增扩增，筛选出待选引物对，结果如图7A、图7B、图7C、图7D、图7E、图7F、图7G、图7H所示。

表6第二轮引物筛选组合

结果显示，编号为1-1、1-2、1-4、2-1、4-1组合均具有相对较好的扩增曲线。将5对较好扩增引物探针组合再次进行扩增比较，结果如图8所示，组合1-2扩增较好，因此上游引物最佳为SFTSV-S-exo-F2-3-1(1138-1167)，下游引物最佳SFTSV-S-exo-R1-4(1261-1292)，探针最佳为SFTSV-S-exo-P1-1(1150-1195)，

经筛选和优化，最终确定的用于RNA恒温快速扩增的引物和探针序列如表7所示：

表7引物和探针序列

实施例3实时荧光RNA恒温快速扩增检测发热伴血小板减少综合征病毒的方法

利用表7中所示的引物和探针，使用RNA恒温快速扩增试剂盒(安普未来，荧光型)进行实时荧光RNA恒温快速扩增，具体方法如下：

将再水化缓冲液(Buffer A)29.4μl，上、下游引物(10μM)各2μl，探针(10μM)0.6μl，40U/μl的RNA酶抑制剂0.5μl以及ddH₂O 7.5μl混合得到42μl的工作缓冲液，然后加入5μl待测样品RNA作为模板与上述工作缓冲液混合，并将其加入装有干粉状的酶体系的酶扩增八联管中，将其溶解并混匀，最后将3μl醋酸镁溶液(Buffer B)加至八联管盖子上，小心盖上盖子，反应前利用涡旋震荡仪混匀并离心，使镁离子启动反应发生，并立即放置AGS8800恒温扩增荧光检测仪(杭州安誉公司)，启动仪器，扩增和信号收集同时开始，程序为42℃恒温，每30sec读取一次荧光值，循环60次，共30分钟。待扩增和检测同时进行至120sec时，暂停仪器运行，利用涡旋震荡仪进行涡旋并离心，立即置入仪器中，并启动仪器进行产物扩增，观察扩增曲线。根据扩增曲线判断待测样品中是否含有发热伴血小板减少综合征病毒核酸。

实施例4发热伴血小板减少综合征病毒检测的特异性评价

利用表1中所示的引物和探针以及实施例3中的检测方法对除发热伴血小板减少综合征病毒以外的9种病毒进行实时荧光RNA恒温快速扩增，以检测引物探针以及检测方法的特异性，具体如下：

(1)核酸提取：分别取黄热病毒疫苗株，登革病毒Ⅰ、II、III、Ⅳ型，基孔肯雅病毒GD113株，汉滩病毒，汉城病毒，寨卡病毒共计9种病毒的细胞培养物上清进行核酸提取。

(2)实时荧光RNA恒温快速扩增：9种病毒核酸各取5μl作为模板加入到RNA恒温快速扩增反应体系中进行扩增，以发热伴血小板减少综合征病毒核酸为模板设置阳性对照。

(3)通过AGS等温扩增仪收集荧光信号，判断其他病毒是否可进行扩增。

结果如图9所示，结果显示，黄热病毒疫苗株，登革病毒Ⅰ、II、III、Ⅳ型，基孔肯雅病毒GD113株，汉滩病毒，汉城病毒，寨卡病毒均未检测到荧光信号。本发明提供的引物、探针以及检测方法具有良好的特异性，只能特异性检测发热伴血小板减少综合征病毒，不与其他病毒发生交叉反应。

实施例5发热伴血小板减少综合征病毒检测的灵敏度评价

1、利用实施例1制备的体外转录RNA模板(SFTSV-NP)对表1中所示的引物和探针以及实施例3中的检测方法进行灵敏性评价，具体如下：

(1)取1μl体外转录RNA模板(6.30×10¹²copies/μL)加入62μl H₂O中，获得1×10¹¹copies/μL的体外转录RNA，并将其10倍梯度稀释，共设9个梯度，获得1×10¹⁰copies/μL至1×10¹copies/μL的SFTSV-NP体外转录模板。

(2)对1×10⁷copies/μL至1×10¹copies/μL的体外转录RNA模板分别进行实时荧光RNA恒温快速扩增和实时荧光定量PCR，并设置1个空白对照，进行梯度实验，独立重复8次。

(3)计算得到体外转录RNA模板的最低检出限，以评价RNA恒温快速扩增技术的灵敏性，并与实时荧光定量PCR进行比较。

各浓度模板的实时荧光RNA恒温快速扩增曲线如图10所示，结果显示，实时荧光RNA恒温快速扩增对体外转录RNA模板可检测到1×10²copies/μL。

实时荧光RNA恒温快速扩增与实时荧光定量PCR检测的比较结果如表8所示，实时荧光RNA恒温快速扩增技术可以检测到Ct值在31至32之间，可检出100copies/μl。

表8 RNA恒温快速扩增技术与实时荧光定量PCR技术比较

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

<120> 实时荧光RNA恒温快速扩增检测发热伴血小板减少综合征病毒的引物探针组和检测方法

<130> KHP201111198.4

<160> 31

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 155

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tggctccgcg catcttcaca ttgatagtct tggtgaaggc atcttgccat aaagagtaag 60

cctccatcag ggtcttggtt gtggcttcag atacccccgc agttggaatc agggatccaa 120

aggccatgca catcatctca gggggataat tctcg 155

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tggctccgcg catcttcaca ttgatagtct 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tggctccgcg catcttcaca ttgatagtct 30

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cttcacattg atagtcttgg tgaaggcatc ttgccataaa gagtaa 46

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttgtgagcgg ataacaattc cc 22

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aattaatacg actcactata gggagtggtg gtggtggtgg tg 42

<210> 7

<211> 738

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttacaggttt ctgtaagcag cagcagcaac ctcagcagct ctgctgggga ccccatctgg 60

gccaaggatc cccttggcct tcagccactt tacccgaaca tcattgggaa agaagacaga 120

gttcacagca gcatgaagag ggtccctgaa ggagttgtaa acttctgtct tgctggctcc 180

gcgcatcttc acattgatag tcttggtgaa ggcatcttgc cataaagagt aagcctccat 240

cagggtcttg gttgtggctt cagatacccc cgcagttgga atcagggatc caaaggccat 300

gcacatcatc tcagggggat aattctcgac cttcaggttc atgacggctg gccctactgg 360

gagatactcc tttagagctg ctgcagcagc acatgtccaa gtgggaaggc tctgcgcaac 420

cctcactgga gtgattgaga gcctggtctc tgccctctca accagtccat atttctcttg 480

gagtgccatc aacctcttgg accctgagtt tgacattttc cctgatgcct tgacgatctt 540

attgcctcga gtcagggcaa agacaatgat gaactttgta tccttcaccc aatcatctcc 600

acctgtctcc ttcagcttct tgatgatcaa agcagggtca aggccttcat aggccagctc 660

tctcgcgaag tcctcaagct cagtcaaatt gagctgctgc tcaccaaact ccactgcaat 720

cctggaccac tccgacat 738

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaagaaaaca gagttcacag cagcatgaag a 31

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tccctgaagg agttgtaaac ttctgtcttg c 31

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tggctccgcg catcttcaca ttgatagtct t 31

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tcattgggga agaaaacaga gttcacagca g 31

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttcacagcag catgaagagg gtccctgaag 30

<210> 13

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ttctgtcttg ctggctccgc gcatcttcac a 31

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tagggccagc cgtcatgaac ctgaaggtcg ag 32

<210> 15

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tgaaggtcga gaattatccc cctgagatga tg 32

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gtcatgaacc tgaaggtcga gaattatccc 30

<210> 17

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ggtcgagaat tatccccctg agatgatgtg c 31

<210> 18

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tgaacctgaa ggtcgagaat tatccccctg a 31

<210> 19

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tcacattgat agtcttggtg aaggcatctt gccataaaga gtaagcctcc 50

<210> 20

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tcacattgat agtcttggtg aaggcatctt gccataaaga gtaagcctcc 50

<210> 21

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ccataaagag taagcctcca ccagggtctt ggttgtggct tcagatac 48

<210> 22

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

taaagagtaa gcctccacca gggtcttggt tgtggcttca gatacccc 48

<210> 23

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

aagagtaagc ctccaccagg gtcttggttg tggcttcaga tacccccgca 50

<210> 24

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tggctccgcg catcttcaca ttgatagtct tg 32

<210> 25

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tggctccgcg catcttcaca ttgatagtct tgg 33

<210> 26

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

cgagaattat ccccctgaga tgatgtgcat g 31

<210> 27

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

cgagaattat ccccctgaga tgatgtgcat ggc 33

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

tgaaggtcga gaattatccc cctgagatga 30

<210> 29

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

tgaaggtcga gaattatccc cctgagatga tgt 33

<210> 30

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

tgaaggtcga gaattatccc cctgagatga tgtg 34

<210> 31

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

tgaaggtcga gaattatccc cctgagatga tgtgc 35

Claims

1.用于检测发热伴血小板减少综合征病毒的靶序列，其特征在于，其具有SEQ ID NO.1所示的序列或为其特异性片段。

2.权利要求1所述的靶序列在利用实时荧光RNA恒温快速扩增技术检测发热伴血小板减少综合征病毒中的应用。

3.用于实时荧光RNA恒温快速扩增技术检测发热伴血小板减少综合征病毒的引物探针组，其特征在于，包含核苷酸序列如SEQ ID NO.2-3所示的特异性引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的探针。

4.根据权利要求3所述的引物探针组，其特征在于，所述探针为荧光探针。

5.根据权利要求3或4所述的引物探针组，其特征在于，所述探针为：5’-CTTCACATTGATAGTCTTGGTGAAGGCA[荧光基团-dT][dSpacer][淬灭基团-dT]TGCCATAAAGAGTAA[C3spacer]-3’。

6.权利要求3～5任一项所述的引物探针组在制备发热伴血小板减少综合征病毒检测试剂盒中的应用。

7.发热伴血小板减少综合征病毒检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求3～5任一项所述的引物探针组。

8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在用于实时荧光RNA恒温快速扩增时的反应体系包括：上、下游引物各0.3～0.5μM，探针0.01～0.015μM。

9.根据权利要求7或8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在用于实时荧光RNA恒温快速扩增时的反应程序为：35～45℃扩增2～15min。

10.发热伴血小板减少综合征病毒的实时荧光RNA恒温快速扩增检测方法，其特征在于，包括：以待测样品RNA为模板，利用权利要求3～5任一项所述的引物探针组或权利要求7～9任一项所述的检测试剂盒进行实时荧光RNA恒温快速扩增，根据扩增产物的荧光检测结果，判断待测样品中是否含有发热伴血小板减少综合征病毒。