CN113073150B - 一种用于新型冠状病毒及其变异株的数字pcr检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子检测领域，尤其涉及一种用于新型冠状病毒及其变异株的数字PCR检测试剂盒。首先公开了一种用于同时检测新型冠状病毒及其变异株的的引物探针组合物，所述新型冠状病毒包括野生型及B.1.1.7变异株、B.1.351变异株和P.1变异株变异株；针对N基因、ORF1ab基因和S基因HV69‑70del、K417N、K417T、N501Y突变型进行所述引物探针组合物设计。本发明开发了一种新的多重数字PCR体系以及利用该PCR体系进行新型冠状病毒及其变异株检测的试剂盒。该多重数字PCR体系解决了现有的不同新型冠状病毒变异株需要分次单独检测，过程繁琐的问题。
Description
技术领域
本发明属于分子检测领域，尤其涉及一种用于新型冠状病毒及其变异株的数字PCR检测试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是一种单股正链RNA病毒，容易发生变异。在临床上，新冠病毒感染者的症状差异较大，从无症状到危重症都有可能发生。除了个体因素的差异外，病毒变异也可能是导致感染患者症状差异大的重要因素。研究表明，新型冠状病毒突变速率约为每月2～4个突变，目前在已知的株系发现了超过25个突变的变异株。相继在多个国家发现B.1.1.7新冠变异株、B.1.351新冠变异株和P.1新冠变异株，它们在病毒表面刺突蛋白的受体结合域(RBD)发生了突变，使其与人体细胞表面的血管紧张素转化酶2(ACE2)受体更容易结合。发生在这些新冠病毒突变株刺突蛋白RBD的突变包括HV69-70del、K417N、K417T和N501Y突变等。病毒的变异会显著影响其传播能力和致病能力，甚至出现耐药问题而加大治疗难度。所以对病毒变异的监测极为重要，可以为防控疫情和治疗患者提供科学依据，以及为疫苗开发和药物靶点筛选等科学研究提供支持。
扩增阻滞突变系统PCR(Amplification Refractory Mutation System PCR，ARMS-PCR)，又称为等位基因特异性PCR(Allele-Specific PCR，AS-PCR)。ARMS-PCR技术建立在等位基因特异性延伸反应基础上，只有当某个等位基因特异性引物的3’末端碱基与突变位点处碱基互补时，才能进行延伸反应。常规PCR扩增DNA所用的上、下游引物与靶序列完全匹配，而等位基因PCR采用等位基因特异的两条上游引物，两者在3’端核苷酸不同，一个对野生型等位基因特异，另一个对突变型等位基因特异，在Taq DNA聚合酶作用下，与模板不完全匹配的上游引物将不能退火，不能生成PCR产物，而与模板匹配的引物体系则可扩增出产物，通过凝胶电泳或者qPCR就能很容易地分辨出扩增产物的有无，从而确定SNP基因型。
现有新型冠状病毒变异株的检测采用扩增阻滞突变系统PCR法(ARMS-PCR)，qPCR-ARMS技术分别检测新冠病毒的S基因的HV69-70del、K417N、K417T、N501Y等，其中B.1.1.7变异株检测位点为HV69-70del和N501Y，B.1.351变异株检测位点为K417N和N501Y，P.1变异株检测位点为K417T和N501Y)。然而ARMS-PCR需要多次检测才能确定相应的亚型，且对样品需求量大。
发明内容
本发明公开了一种全新的检测新型冠状病毒变异株的方法，通过单次检测即可同时确定样品中是否具有新型冠状病毒以及区分野生型、B.1.1.7变异株、B.1.351变异株和P.1变异株。
具体的，本发明的技术方案如下：
本发明第一个方面公开了一种用于同时检测多种新型冠状病毒野生型及三种变异株的引物探针组合物，所述多种新型冠状病毒变异株包括B.1.1.7变异株、B.1.351变异株和P.1变异株；针对N基因、ORF1ab基因和S基因HV69-70del、K417N、K417T、N501Y突变型进行所述引物探针组合物设计。
优选的，所述引物探针组合物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1-15所示的序列。
本发明第二个方面公开了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物探针组合物。
应当理解，本发明中公开的试剂盒成分并不限于以上成分，本领域技术人员可以根据需要添加或替换其他的成分，且均在本发明的保护范围之内。
优选的，所述试剂盒还包括核苷酸序列如SEQ ID NO：16-18所示的内控基因检测序列。
优选的，所述内控基因，通过采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒抽提口腔脱落细胞的基因组DNA得到内控基因。
本发明第三个方面公开了一种同时检测多种新型冠状病毒及其变异株的方法，包括：使用上述的试剂盒进行检测。
优选的，基于多重数字PCR平台进行检测。
术语“多重数字PCR”是指在同一数字PCR反应体系里加上两对或两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的数字PCR反应。
更优选的，包括以下步骤：
(1)获得样本核酸；
(2)配制数字PCR反应液；
(3)制备液滴芯片；
(4)运行液滴芯片扩增程序后，采用生物芯片阅读仪进行分析后报告输出。
优选的，所述扩增程序依次包括：98℃预变性5min；98℃变性15秒，55℃退火120秒，循环40次。
应当理解，扩增程序并不限于上述程序，本领域技术人员可以根据需要，选择任意合适的扩增程序完成本发明，且均在本发明的保护范围之内。
本发明第四个方面公开了根据上述的引物探针组合物、上述的试剂盒和上述的方法在分子检测领域的应用；优选的，所述分子检测领域为新型冠状病毒分子检测领域。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。
本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：
本发明开发了一种新的多重数字PCR体系以及利用该PCR体系进行新型冠状病毒及其变异株检测的试剂盒。该多重数字PCR体系解决了现有的不同新型冠状病毒变异株需要分次单独检测，过程繁琐的问题。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。
实施例1
本实施例公开了一种同时检测多种新型冠状病毒及其变异株的方法，包括：
依据新型冠状病毒的基因组序列，采用primer express软件设计N基因，ORF1ab基因，S基因HV69-70del、K417N、K417T、N501Y突变型以及人内源性内控基因的引物探针。
具体信息如下表1所示。
表1
二、样品
(1)ORF1ab基因和N基因假病毒：外购自生物公司，采用RNA提取试剂盒提取RNA，备用。
(2)B.1.1.7变异株S基因：带有HV69-70del和N501Y两个变异位点，其他位点均为野生型的DNA片段；外购自生物公司，采用TE稀释溶解后，备用。
(3)B.1.351变异株S基因：带有K417N和N501Y两个变异位点，其他位点均为野生型的DNA片段；外购自生物公司，采用TE稀释溶解后，备用。
(4)P.1变异株S基因：带有K417T和N501Y两个变异位点，其他位点均为野生型的DNA片段；外购自生物公司，采用TE稀释溶解后，备用。
(5)内控基因：采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒抽提口腔脱落细胞的基因组DNA，稀释到5ng/μL备用。
三、数字PCR扩增体系
3.1数字PCR扩增体系如下表2所示。
表2
3.2一步法RT-dPCR程序
50℃ 30min，98℃5min【98℃15s 55℃2min】*40
3.3检测结果如下表3所示：
表3
3.4结论
结论如下表4所示：
表4
表4的解析具体如下：
(1)检测空白对照，VIC通道有信号，其他通道均无信号。
(2)检测假病毒RNA，VIC通道、FAM通道、ROX通道有信号，其他通道均无信号。
(3)检测B.1.1.7变异株S基因假病毒RNA，VIC通道、FAM通道、ROX通道、CY5通道、A425通道有信号，其他两个通道无信号。
(4)检测B.1.351变异株S基因假病毒RNA，VIC通道、FAM通道、ROX通道、CY5.5通道、CY5通道有信号，其他两个通道无信号。
(5)检测P.1变异株S基因假病毒RNA，VIC通道、FAM通道、ROX通道、CY5通道、CY7通道有信号，其他两个通道无信号。
本发明开发了一种新的多重数字PCR体系以及利用该PCR体系进行新型冠状病毒及其变异株检测的试剂盒。该多重数字PCR体系解决了现有的不同新型冠状病毒变异株需要分次单独检测，过程繁琐的问题。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 领航基因科技（杭州）有限公司
<120> 一种用于新型冠状病毒及其变异株的数字PCR检测试剂盒
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acacacactc tctctc 16
Claims (2)
1.一种用于同时检测新型冠状病毒及其变异株的的引物探针组合物，其特征在于，所述新型冠状病毒变异株包括B.1.1.7变异株、B.1.351变异株和P.1变异株；针对N基因、ORF1ab基因和S基因HV69-70del、K417N、K417T、N501Y突变型以及内控基因进行所述引物探针组合物设计；
所述引物探针组合物如下：
2.根据权利要求1所述的一种用于同时检测新型冠状病毒及其变异株的的引物探针组合物，其特征在于，所述内控基因通过采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒抽提口腔脱落细胞的基因组DNA得到内控基因。
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| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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