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CN112481417B - 新冠肺炎病毒分型及突变位点快速检测方法及试剂盒 - Google Patents

新冠肺炎病毒分型及突变位点快速检测方法及试剂盒 Download PDF

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CN112481417B CN202011554332.6A CN202011554332A CN112481417B CN 112481417 B CN112481417 B CN 112481417B CN 202011554332 A CN202011554332 A CN 202011554332A CN 112481417 B CN112481417 B CN 112481417B
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Abstract

本发明属于生物医学技术检测领域，具体涉及一种新冠肺炎病毒分型及突变位点快速检测方法及试剂盒。针对目前二代测序存在的问题，本发明提供了一种新冠肺炎病毒分型及突变位点快速检测方法及试剂盒。本发明将化学合成的DNA片段的PCR扩增产物作为待测样品的标准，然后用DGGE技术对作为标准的DNA片段及阳性待测样品进行检测，从而实现对新冠肺炎病毒分型及突变位点的快速检测。本发明在保证检出率的基础上，操作简便快捷，时间短，成本低，在实验室易普及；同时检测具有特异性强、肉眼可直接判读和不依赖大型实验设备等优势，为快速准确检测新冠肺炎病毒的突变提供了简便、易操作、耗时短的平台。

Description

新冠肺炎病毒分型及突变位点快速检测方法及试剂盒
技术领域
本发明属于生物医学技术检测领域，涉及一种新冠肺炎病毒分型及突变位点快速检测方法及试剂盒。
背景技术
2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是引发新型冠状病毒肺炎(新冠肺炎，COVID-19)的病原体。该病毒是一种具有29903个核苷酸的单链RNA-β冠状病毒。国际病毒分类委员会(ICTV)将新型冠状病毒(2019-nCoV)的正式分类为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severeacute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)。世界卫生组织(WHO)宣布，由这一病毒导致的疾病的正式名称为COVID-19。
该病毒在不到4个月的时间内就散布在210多个国家中，截至2020年6月28日，全世界报告的确诊病例超过1000万，死亡人数近50万。随着病毒的传播，其基因序列已经突变，世界各地出现越来越多的变异菌株，在相关统计中，收集到的48635个SARS-CoV-2完整基因组样品与原始病毒株相比，在每个样品中平均存在7.23个突变。其中单核苷酸突变是主要的突变类型，最突出的是SARS-CoV2 Spike蛋白中的D614G突变，实验表明：携带D614G突变的S-病毒在转导细胞上的效率比野生型S-病毒高8倍，D614G与另外三个突变组C14408T、C241T和C3037T这四个突变几乎总是在同一基因组中同时发生，从而定义了在病毒种群中观察到的主要进化枝G。同时还存在着其余的进化枝GH、GR。
所以，对于突变菌株的鉴定分类与追踪溯源显得尤为重要，目前在分子生物学检测手段上，基因测序最常用的方法。二代测序虽然操作简便，但测序成本贵，测序错误率高，同时依赖大型科研仪器与专业的生物信息分析人员，检测周期也比较长。因此需要一种快速准确检测突变的方法，用于检测临床标本中SARS-CoV-2病毒核酸突变序列。
当前，已有利用携带荧光报告基团探针检测新型冠状病毒两个碱基突变(8782C→T和28144T→C)的技术，但该技术所需试剂价格昂贵，单次实验耗量高，有效使用次数少，不适宜进行多次批量实验，并且灵敏度较低。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是为建立一种实现高效、快速、准确且经济的新冠肺炎病毒突变位点快速检测方法，本发明公开了一种PCR-DGGE检测突变的试剂盒和检测方法。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
本发明提供一种新冠肺炎病毒分型及突变位点快速检测的引物组及DNA片段，所述引物组(带GC夹子)包括：GC+C241T-F、C241T-R、GC+C3037T-F、C3037T-R、G11083T-F、G11083T-R、GC+C14408T-F、C14408T-R、GC+A23403G-F、A23403G-R、GC+G25563T-F、G25563T-R、GC+GGG28881AAC-F、GGG28881AAC-R，其序列依次如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14所示；GC夹子的加入，确保了发生在DNA片段中每个碱基处的序列差异都被区分开来。
所述DNA片段包括突变后的DNA片段及对应的原始DNA片段，其中：突变后的DNA片段包括C241T片段、C3037T片段、G11083T片段、C14408T片段、A23403G片段、G25563T片段、GGG28881AAC片段，序列分别如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21所示；对应的原始DNA片段包括C241片段、C3037片段、G11083片段、C14408片段、A23403片段、G25563片段、GGG28881片段，其序列分别如SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28所示。
进一步，所述引物组及DNA片段是通过化学合成的核苷酸片段。
本发明提供一种新冠肺炎病毒分型及突变位点快速检测的试剂盒，包括上述引物组和DNA片段，PCR缓冲液。
进一步，所述PCR缓冲液包括：5μl
Figure BDA0002858508220000031
4μl 10mmol/L dNTPs，1μl上游引物，1μl下游引物，1μl Taq酶，原始DNA片段与其突变后片段各1μl，37μl ddH2O，4μl Forward GSP，4μlReverse GSP，10μl 2×TS One-Step Reaction Mix，0.4μl
Figure BDA0002858508220000032
EnzymeSuperMix，7μl RNase-free Water。
本发明还提供一种新冠肺炎病毒分型及突变位点快速检测方法，包括以下步骤：
步骤1，对阴性样本、DNA片段及新冠肺炎病毒阳性样品分别进行PCR扩增，阴性样本PCR扩增产物作为待测样品的阴性对照，扩增后的DNA片段作为待测样品的标准；新冠肺炎病毒阳性样品PCR扩增产物作为DGGE检测的待测样品；
步骤2，对标准和待测样品进行DGGE检测；
步骤3，DGGE检测完毕后，将含有DNA片段及样品的凝胶放入2.5×4S Red Plus染液中染色15分钟，拍照进行分析对比，当阳性待测样品条带与原始DNA序列在DGGE凝胶上处于同一水平位置时，说明阳性待测样品为未突变的新冠肺炎病毒阳性样品，当阳性待测样品条带与原始DNA序列在DGGE凝胶上不处于同一水平位置时，将其与突变DNA序列比对来确定新冠肺炎病毒分型及突变类型。
进一步，所述的DGGE检测的条件为：选择8％-10％的聚丙烯酰胺凝胶，胶变性范围为40％-60％，梯度混合制胶；电泳液温度上升至55℃时，先220V恒压预电泳5分钟，用50μL微量进样器快速上样，上样量为25μL；在55℃，200V条件下恒温恒压电泳8h。
变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术是检测DNA片段中点突变的一种电泳技术。DGGE的原理是根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
本发明利用DGGE技术，在保证检出率的基础上，操作简便快捷，时间短，成本低；同时检测具有特异性强、肉眼可直接判读和不依赖大型实验设备等优势，为快速准确检测新冠肺炎病毒的突变提供了简便、易操作、耗时短的平台。对于病毒地理种类的分布鉴定具有重大意义，可对病人的临床特征和病情发展进行预判，因此制定更具针对性的治疗方案。
附图说明
图1为本发明DNA片段的DGGE检测结果。
图2为本发明DNA片段二次PCR扩增的凝胶电泳图。
图3为本发明DNA片段阳性克隆验证结果图。
图4为本发明的检测结果图。
具体实施方式
下面结合本发明实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行具体、详细的说明。引物组和DNA片段名称的命名规则为：原始核苷酸+突变位点+突变后的核苷酸。
实施例1
通过化学合成新冠肺炎病毒分型及突变位点快速检测的引物组及DNA序列。
引物组的组成及其序列如下：
GC+C241T-F(SEQ ID NO：1)、C241T-R(SEQ ID NO：2)，
GC+C3037T-F(SEQ ID NO：3)、C3037T-R(SEQ ID NO：4)，
GC+G11083T-F(SEQ ID NO：5)、G11083T-R(SEQ ID NO：6)，
GC+C14408T-F(SEQ ID NO：7)、C14408T-R(SEQ ID NO：8)，
GC+A23403G-F(SEQ ID NO：9)、A23403G-R(SEQ ID NO：10)，
GC+G25563T-F(SEQ ID NO：11)、G25563T-R(SEQ ID NO：12)，
GC+GGG28881AAC-F(SEQ ID NO：13)、GGG28881AAC-R(SEQ ID NO：14)；
DNA片段包括突变后的DNA片段及对应的原始DNA片段，其中：
突变后DNA片段包括C241T片段、C3037T片段、G11083T片段、C14408T片段、A23403G片段、G25563T片段、GGG28881AAC片段，其对应的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21所示；
对应的原始DNA片段包括C241片段、C3037片段、G11083片段、C14408片段、A23403片段、G25563片段、GGG28881片段，其对应的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28所示。
实施例2
1.将新冠肺炎病毒阳性样品RNA反转录成DNA。
PCR反应体系为：RNA Template：1μl，Forward GSP：0.4μl，ReverseGSP：0.4μl，2×TS One-Step Reaction Mix：10μl，
Figure BDA0002858508220000061
One-Step EnzymeSuperMix：0.4μl，RNase-free Water：7μl；
PCR反应程序为：45℃25min，94℃5min，94℃30s，50-60℃30s，72℃1min，35个循环，72℃10min；
2.对阴性样本、化学合成的DNA片段及反转录后的阳性样品DNA利用上述对应的带GC夹子的引物组进行PCR扩增，阴性样本PCR扩增产物作为待测样品的阴性对照，DNA片段扩增产物作为待测样品的标准；新冠肺炎病毒阳性样品PCR扩增产物作为DGGE检测的待测样品。
PCR反应体系为：10*EasyTaq Buffer:5μL，dNTPs(2,5mM):4μL，GC+F(10umol/L):1μL，R(10umol/L):1μL，EasyTaq DNA Polymerase:1μL，模板DNA：1μL，ddH2O:37μL；
PCR反应程序为：94℃5min，94℃30S，45～50℃30S，72℃30S，30个循环，72℃10min，12℃保存。
3.对作为标准的DNA片段进行DGGE检测及验证：
选择浓度为10％聚丙烯酰胺凝胶，胶变性范围为40％～60％，取40％、60％胶各16ml，分别加入50μL的TEMED及40μL的10％过硫酸铵，梯度混合制胶，凝胶时间至少3h；加样前，将电泳液温度上升至55℃时，后220V预电泳5min，PCR扩增产物上样量各25μL，后于55℃、200V条件下电泳8h；电泳完毕后，将胶放入2.5×4S Red Plus染液中染色15分钟，拍照观察，进行分析，见图1；
将特异性目的条带切下，放入无菌的EP管中，编号；用20μLddH2O浸泡胶条，并将胶条弄碎成小段，放于冰箱-20℃浸泡过夜，使用不含GC夹子的引物组再次进行PCR扩增，即第二次PCR扩增，扩增结果见图2，得到的PCR产物用生工生物工程(上海)股份有限公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收，-20℃保存备用；
PCR反应体系为：10*EasyTaq Buffer:5μL，dNTPs(2,5mM):4μL，F(10umol/L):1μL，R(10umol/L):1μL，EasyTaq DNA Polymerase:1μL，胶条浸泡液：2μL，ddH2O:36μL；
PCR反应程序为：94℃5min，94℃30S，45～50℃30S，72℃30S，30个循环，72℃10min，12℃保存运行；
不含GC夹子的引物组包括：
C241T-F(SEQ ID NO：29)、C241T-R(SEQ ID NO：2)，
C3037T-F(SEQ ID NO：30)、C3037T-R(SEQ ID NO：4)，
G11083T-F(SEQ ID NO：31)、G11083T-R(SEQ ID NO：6)，
C14408T-F(SEQ ID NO：32)、C14408T-R(SEQ ID NO：8)，
A23403G-F(SEQ ID NO：33)、A23403G-R(SEQ ID NO：10)，
G25563T-F(SEQ ID NO：34)、G25563T-R(SEQ ID NO：12)，
GGG28881AAC-F(SEQ ID NO：35)、GGG28881AAC-R(SEQ ID NO：14)；将上述纯化回收的DNA片段按北京全式金生物技术有限公司的pEASY-T3Cloning Kit方法进行克隆转化测序；克隆反应体系：PCR产物：4μL、Cloning Vector：1μL。将上述体系轻轻混合，25℃反应10min，反应结束后，将PCR管置于冰上，将上述体系加入50μL的刚解冻的DH5α感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min，42℃热激30s，立即置于冰上2min，加入250μL的LB培养基，200rpm、37℃培养1h。在此期间，取8μL的500mM IPTG和40μL的20mg/mlX-gal混合，均匀地涂布在含Amp+抗性的LB固体平板上，使IPTG和X-gal充分吸收。4000rpm离心菌液1min，弃掉部分上清，悬浮菌体，涂布在准备好的平板上，放于37℃恒温培养箱中培养12h左右；
挑取白色单克隆菌落于Amp+抗性的LB固体平板上备份菌种后，放入盛有10μL去离子水的EP管中，沸水浴煮样5min；取2μL沸水浴煮过的样液作模板进行PCR扩增，设阴性对照(以蓝色单克隆菌落为模板)；PCR产物于1.0％琼脂糖凝胶验证大小，片段大小在200-300bp之间的克隆子视为阳性克隆，PCR产物的1.0％琼脂糖凝胶验证图谱如图3；提取阳性克隆子质粒，后送出测序，测序结果与化学合成序列进行比对查看是否一致；
PCR反应体系为：10*EasyTaq Buffer:1μL，dNTPs(2,5mM):0.8μL，M13F(10umol/L):0.25μL，M13R(10umol/L):0.25μL，EasyTaq DNA Polymerase:0.25μL，沸水浴煮过后的水样：2μL，ddH20:5.45μL；
PCR反应程序为：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃45s，30个循环，72℃10min，12℃保存。
挑取确定的阳性克隆接种于5mL的LB液体培养基(接种前加入5μL50mg/mL的Amp)中，37℃，200rmp培养12～14h，用生工的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒，溶于40μL的去离子水中，-20℃保存备用；
实施例3
对新冠肺炎病毒分型及突变位点快速检测：
按实施例2中DGGE的检测方法对验证正确的作为标准的DNA片段和待测样品进行DGGE检测。通过对阴性样本、原始、突变、待检测样本加以相同的上下游引物GC+A23403GF和A23403GR，在同一条件下进行PCR得到大量扩增片段，通过DGGE电泳，染色拍照，得到实验结果。
DGGE电泳：选择浓度为10％聚丙烯酰胺凝胶，胶变性范围为40％～60％，取40％、60％胶各16ml，分别加入50μL的TEMED及40μL的10％过硫酸铵，梯度混合制胶，夏天室温凝固，冬天可放在37℃培养箱里凝固，若室温凝固，凝胶时间至少3h；待电泳液温度上升至55℃时，200V预电泳5min，用50μL微量进样器快速上样，上样量为25μL，后于55℃、200V条件下电泳8h；电泳完毕后，将胶放入2.5×4S Red Plus染液中染色15分钟，拍照观察，进行分析。
检测结果如图4。图中1号为未患病者(新冠肺炎病毒阴性)阴性对照，2号为原始序列，3号为待检测样品序列，4、5号为作标准的突变后DNA片段，从图中可以看出待检测样本条带与突变条带在同一水平上，实验结果表明检测样品为突变样品，为G614分型。
实施例4
新冠肺炎病毒分型及突变位点快速检测的试剂盒，包括引物组，DNA片段，PCR缓冲液。
引物组包括：GC+C241T-F(SEQ ID NO：1)、C241T-R(SEQ ID NO：2)，GC+C3037T-F(SEQ ID NO：3)、C3037T-R(SEQ ID NO：4)，G11083T-F(SEQ ID NO：5)、G11083T-R(SEQ IDNO：6)，GC+C14408T-F(SEQ ID NO：7)、C14408T-R(SEQ ID NO：8)，GC+A23403G-F(SEQ IDNO：9)、A23403G-R(SEQ ID NO：10)，GC+G25563T-F(SEQ ID NO：11)、G25563T-R(SEQ ID NO：12)，GC+GGG28881AAC-F(SEQ ID NO：13)、GGG28881AAC-R(SEQ ID NO：14)；
DNA片段包括突变后的DNA片段及对应的原始DNA片段，其中：突变后的DNA片段包括C241T片段(SEQ ID NO：15)、C3037T片段(SEQ ID NO：16)、G11083T片段(SEQ ID NO：17)、C14408T片段(SEQ ID NO：18)、A23403G片段(SEQ ID NO：19)、G25563T片段(SEQ ID NO：20)、GGG28881AAC片段(SEQ ID NO：21)；对应的原始DNA片段包括C241(SEQ ID NO：22)、C3037(SEQ ID NO：23)、G11083(SEQ ID NO：24)、C14408(SEQ ID NO：25)、A23403(SEQ IDNO：26)、G25563(SEQ ID NO：27)、GGG28881(SEQ ID NO：28)。
PCR缓冲液包括：5μl
Figure BDA0002858508220000101
4μl 10mmol/L dNTPs，1μl上游引物，1μl下游引物，1μl Taq酶，原始DNA序列与其突变序列片段各1μl，37μlddH2O，4μl ForwardGSP，4μlReverse GSP，10μl 2×TS One-Step Reaction Mix，0.4μl
Figure BDA0002858508220000102
EnzymeSuperMix，7μl RNase-free Water。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，都包含在本发明的保护范围之内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
序列表
SEQ ID NO：1
cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacggggggcttctgcaggctgcttacg
SEQ ID NO：2
gttttctcgttgaaaccagg
SEQ ID NO：3
cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacggggggctacttatttgatgagtc
SEQ ID NO：4
gatggctcaaactcttcttc
SEQ ID NO：5
cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacgggggggtccagagtactcaatgg
SEQ ID NO：6
catcattgcaaaagcagac
SEQ ID NO：7
cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacgggggggttttattctctacagtg
SEQ ID NO：8
ccagttgaaactacaaatggaacacc
SEQ ID NO：9
cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacggggggttggtggtgtcagtgttat
SEQ ID NO：10
aggagtaagttgatctgcat
SEQ ID NO：11
cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacggggggacaagcctcactccctttc
SEQ ID NO：12
aacacccttggagagtgctag
SEQ ID NO：13
cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacggggggcttctcgttcctcatcacg
SEQ ID NO：14
agcagcaaagcaagagcagc
SEQ ID NO：15
cttctgcaggctgcttacggtttcgtccgtgttgcagccgatcatcagcacatctaggttttgtccgggtgtgaccgaaaggtaagatggagagccttgtccctggtttcaacgagaaaac
SEQ ID NO：16
ctacttatttgatgagtctggtgagtttaaattggcttcacatatgtattgttctttttaccctccagatgaggatgaagaagaaggtgattgtgaagaagaagagtttgagccatc
SEQ ID NO：17
gtccagagtactcaatggtctttgttcttttttttttatgaaaatgcctttttaccttttgctatgggtattattgc
SEQ ID NO：18
gttttattctctacagtgttcccacttacaagttttggaccactagtgagaaaaatatttgttgatggtgttccatttgtagtttcaactgg
SEQ ID NO：19
ttggtggtgtcagtgttataacaccaggaacaaatacttctaaccaggttgctgttctttatcagggtgttaactgcacagaagtccctgttgctattcatgcagatcaacttactcct
SEQ ID NO：20
acaagcctcactccctttcggatggcttattgttggcgttgcacttcttgctgtttttcatagcgcttccaaaatcataaccctcaaaaagagatggcaactagcactctccaagggtgtt
SEQ ID NO：21
cttctcgttcctcatcacgtagtcgcaacagttcaagaaattcaactccaggcagcagtaaacgaacttctcctgctagaatggctggcaatggcggtgatgctgctcttgctttgctgct
SEQ ID NO：22
cttctgcaggctgcttacggtttcgtccgtgttgcagccgatcatcagcacatctaggtttcgtccgggtgtgaccgaaaggtaagatggagagccttgtccctggtttcaacgagaaaac
SEQ ID NO：23
ctacttatttgatgagtctggtgagtttaaattggcttcacatatgtattgttctttctaccctccagatgaggatgaagaagaaggtgattgtg
SEQ ID NO：24
gtccagagtactcaatggtctttgttcttttttttgtatgaaaatgcctttttaccttttgctatgggtattattgc
SEQ ID NO：25
gttttattctctacagtgttcccacctacaagttttggaccactagtgagaaaaatatttgttgatggtgttccatttgtagtttcaactgg
SEQ ID NO：26
ttggtggtgtcagtgttataacaccaggaacaaatacttctaaccaggttgctgttctttatcaggatgttaactgcacagaagtccctgttgctattcatgcagatcaacttactcct
SEQ ID NO：27
acaagcctcactccctttcggatggcttattgttggcgttgcacttcttgctgtttttcagagcgcttccaaaatcataaccctcaaaaagagatggcaactagcactctccaagggtgtt
SEQ ID NO：28
cttctcgttcctcatcacgtagtcgcaacagttcaagaaattcaactccaggcagcagtaggggaacttctcctgctagaatggctggcaatggcggtgatgctgctcttgctttgctgct
SEQ ID NO：29
cttctgcaggctgcttacg
SEQ ID NO：30
ctacttatttgatgagtctgg
SEQ ID NO：31
gtccagagtactcaatggtc
SEQ ID NO：32
gttttattctctacagtgttccc
SEQ ID NO：33
ttggtggtgtcagtgttat
SEQ ID NO：34
acaagcctcactccctttc
SEQ ID NO：35
cttctcgttcctcatcacgtagtc
序列表
<110> 山西大学
<120> 新冠肺炎病毒分型及突变位点快速检测方法及试剂盒
<160> 35
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggg cttctgcagg ctgcttacg 59
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gttttctcgt tgaaaccagg 20
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggg ctacttattt gatgagtc 58
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gatggctcaa actcttcttc 20
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggg gtccagagta ctcaatgg 58
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
catcattgca aaagcagac 19
<210> 7
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggg gttttattct ctacagtg 58
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccagttgaaa ctacaaatgg aacacc 26
<210> 9
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggg ttggtggtgt cagtgttat 59
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aggagtaagt tgatctgcat 20
<210> 11
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggg acaagcctca ctccctttc 59
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aacacccttg gagagtgcta g 21
<210> 13
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggg cttctcgttc ctcatcacg 59
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
agcagcaaag caagagcagc 20
<210> 15
<211> 121
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cttctgcagg ctgcttacgg tttcgtccgt gttgcagccg atcatcagca catctaggtt 60
ttgtccgggt gtgaccgaaa ggtaagatgg agagccttgt ccctggtttc aacgagaaaa 120
c 121
<210> 16
<211> 117
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ctacttattt gatgagtctg gtgagtttaa attggcttca catatgtatt gttcttttta 60
ccctccagat gaggatgaag aagaaggtga ttgtgaagaa gaagagtttg agccatc 117
<210> 17
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gtccagagta ctcaatggtc tttgttcttt tttttttatg aaaatgcctt tttacctttt 60
gctatgggta ttattgc 77
<210> 18
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gttttattct ctacagtgtt cccacttaca agttttggac cactagtgag aaaaatattt 60
gttgatggtg ttccatttgt agtttcaact gg 92
<210> 19
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ttggtggtgt cagtgttata acaccaggaa caaatacttc taaccaggtt gctgttcttt 60
atcagggtgt taactgcaca gaagtccctg ttgctattca tgcagatcaa cttactcct 119
<210> 20
<211> 121
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
acaagcctca ctccctttcg gatggcttat tgttggcgtt gcacttcttg ctgtttttca 60
tagcgcttcc aaaatcataa ccctcaaaaa gagatggcaa ctagcactct ccaagggtgt 120
t 121
<210> 21
<211> 121
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cttctcgttc ctcatcacgt agtcgcaaca gttcaagaaa ttcaactcca ggcagcagta 60
aacgaacttc tcctgctaga atggctggca atggcggtga tgctgctctt gctttgctgc 120
t 121
<210> 22
<211> 121
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cttctgcagg ctgcttacgg tttcgtccgt gttgcagccg atcatcagca catctaggtt 60
tcgtccgggt gtgaccgaaa ggtaagatgg agagccttgt ccctggtttc aacgagaaaa 120
c 121
<210> 23
<211> 95
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ctacttattt gatgagtctg gtgagtttaa attggcttca catatgtatt gttctttcta 60
ccctccagat gaggatgaag aagaaggtga ttgtg 95
<210> 24
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gtccagagta ctcaatggtc tttgttcttt tttttgtatg aaaatgcctt tttacctttt 60
gctatgggta ttattgc 77
<210> 25
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gttttattct ctacagtgtt cccacctaca agttttggac cactagtgag aaaaatattt 60
gttgatggtg ttccatttgt agtttcaact gg 92
<210> 26
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ttggtggtgt cagtgttata acaccaggaa caaatacttc taaccaggtt gctgttcttt 60
atcaggatgt taactgcaca gaagtccctg ttgctattca tgcagatcaa cttactcct 119
<210> 27
<211> 121
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
acaagcctca ctccctttcg gatggcttat tgttggcgtt gcacttcttg ctgtttttca 60
gagcgcttcc aaaatcataa ccctcaaaaa gagatggcaa ctagcactct ccaagggtgt 120
t 121
<210> 28
<211> 121
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cttctcgttc ctcatcacgt agtcgcaaca gttcaagaaa ttcaactcca ggcagcagta 60
ggggaacttc tcctgctaga atggctggca atggcggtga tgctgctctt gctttgctgc 120
t 121
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cttctgcagg ctgcttacg 19
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ctacttattt gatgagtctg g 21
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gtccagagta ctcaatggtc 20
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gttttattct ctacagtgtt ccc 23
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ttggtggtgt cagtgttat 19
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
acaagcctca ctccctttc 19
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
cttctcgttc ctcatcacgt agtc 24

Claims (3)

1.一种新冠肺炎病毒分型及突变位点快速检测的试剂盒，其特征在于：包括引物组和DNA片段，PCR缓冲液；
所述引物组包括：GC+C241T-F、C241T-R 、GC+C3037T-F、C3037T-R、GC+G11083T-F、G11083T-R、GC+C14408T-F、C14408T-R、GC+A23403G-F、A23403G-R、GC+G25563T-F、G25563T-R、GC+GGG28881AAC-F、GGG28881AAC-R，其序列依次如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14所示；
所述DNA片段包括突变后的DNA片段及对应的原始DNA片段，其中：突变后的DNA片段包括C241T片段、C3037T片段、G11083T片段、C14408T片段、A23403G片段、G25563T片段、GGG28881AAC片段，序列分别如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21所示；对应的原始DNA片段包括C241片段、C3037片段、G11083片段、C14408片段、A23403片段、G25563片段、GGG28881片段，其序列分别如SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28所示；
所述PCR缓冲液包括：5µl 10×EasyTaq®Buffer，4µl 10mmol/L dNTPs，1µl 上游引物，1µl下游引物，1µl Taq酶，原始DNA片段与其突变后的DNA片段各1µl，37µl ddH2O，4µlForward GSP，4µl Reverse GSP，10µl 2×TS One-Step Reaction Mix，0.4µlTransScript®One-Step EnzymeSuperMix， 7µl RNase-free Water。
2.一种非疾病诊断或治疗目的的新冠肺炎病毒分型及突变位点快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，对阴性样本、DNA片段及新冠肺炎病毒阳性样品分别进行PCR扩增，阴性样本PCR扩增产物作为待测样品的阴性对照，扩增后的DNA片段作为待测样品的标准；新冠肺炎病毒阳性样品PCR扩增产物作为DGGE检测的待测样品；
所述DNA片段包括突变后的DNA片段及对应的原始DNA片段，其中：突变后的DNA片段包括C241T片段、C3037T片段、G11083T片段、C14408T片段、A23403G片段、G25563T片段、GGG28881AAC片段，序列分别如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21所示；对应的原始DNA片段包括C241片段、C3037片段、G11083片段、C14408片段、A23403片段、G25563片段、GGG28881片段，其序列分别如SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28所示；
用于扩增所述阴性样本、DNA片段及新冠肺炎病毒阳性样品的引物组包括：GC+C241T-F、C241T-R 、GC+C3037T-F、C3037T-R、GC+G11083T-F、G11083T-R、GC+C14408T-F、C14408T-R、GC+A23403G-F、A23403G-R、GC+G25563T-F、G25563T-R、GC+GGG28881AAC-F、GGG28881AAC-R，其序列依次如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14所示；
步骤2，对标准和待测样品进行DGGE检测；
步骤3，DGGE检测完毕后，将含有DNA片段及待测样品的凝胶放入2.5×4S Red Plus染液中染色15分钟，拍照进行分析对比，当阳性待测样品条带与原始DNA片段在DGGE凝胶上处于同一水平位置时，说明阳性待测样品为未突变的新冠肺炎病毒阳性样品，当阳性待测样品条带与原始DNA片段在DGGE凝胶上不处于同一水平位置时，将其与突变DNA片段比对来确定新冠肺炎病毒分型及突变类型。
3.根据权利要求2所述的一种非疾病诊断或治疗目的的新冠肺炎病毒分型及突变位点快速检测方法，其特征在于，所述的DGGE检测的条件为：选择8%-10%的聚丙烯酰胺凝胶，胶变性范围为40%-60%，梯度混合制胶；电泳液温度上升至55℃时，先220V恒压预电泳5分钟，用50μL微量进样器快速上样，上样量为25μL；在55℃，200V条件下恒温恒压电泳8h。
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