CN103940868B - 一种基于酶免疫传感器的农药残留快速检测仪 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于酶免疫传感器的农药残留快速检测仪，属于农产品安全检测技术领域。本发明所提供的基于酶免疫传感器的农药残留快速检测仪由三电极系统，信号检测与处理系统，显示与打印存储系统和供电系统构成。三电极系统先通过酶传感器，测定接触样品前后电流的变化，获知样品中是否含有农药是否超标。如果有农药超标，再使用免疫传感器，测定接触样品前后电流的变化，获知样品中含有何种农药及农药的浓度等信息。本发明所提供的检测仪具有操作简单、价格低廉、灵敏度高、重复性好且能够实现在线快速检测，适用于农产品的现场快速检测。

Description

一种基于酶免疫传感器的农药残留快速检测仪

技术领域

本发明涉及一种基于酶免疫传感器的农药残留快速检测仪，属于农产品安全检测技术领域。

技术背景

农药是重要的农业生产资料，在农产品生产中对病、虫、草、鼠危害的防治起到非常重要的作用。但是，农药污染及其产生的危害后果是严重的，农药对环境污染造成的损失是多方面的，包括对水环境的污染，对土壤的污染，对大气的污染，对环境生物的影响以及对人体健康的危害等。目前由于使用者普遍缺乏科学使用农药知识，片面追求产量，造成目前市场上流通的农业产品都不同程度地存在农药残留问题，其危害也日益引起公众的关注。我国是一个农业大国，随着我国人民生活水平不断提高，农产品的质量安全问题越来越受到关注，尤其蔬菜中农药残留问题已经成为公众关注的焦点。我国生产和使用的杀虫剂绝大多数品种为有机磷和氨基甲酸酯类农药(约占70%)，其中高毒性的有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂为70%左右，因此容易引起食物农药残留中毒。可见，加强对农产品中农药残留的检测对保护生态环境，尤其是保障人类健康有着十分深远的意义，而农药残留检测的重点应该放在有机磷和氨基甲酸酯类农药。

目前农药残留分析的主要方法是气相色谱仪、液相色谱仪、气质联用仪、液质联用仪等，这些方法虽然分析精度高，定量准确，但其样品的前处理复杂、检测耗时长、成本高、需要技术熟练的操作人员。我国农药残留的速测方法是酶抑制试纸法和酶抑制分光光度法（农残快速检测仪），可以实现有机磷农药及氨基甲酸酯类农药的现场快速检测，具有较好的实用价值。速测卡是通过肉眼观察卡片的颜色变化，因此一般只能用于严重超标的蔬菜样品进行定性测量。酶抑制分光光度法的应用也比较广泛，国内已有多种农药残留速测仪均是基于此原理。分光光法的原理是基于吸光度的变化进行检测的，但蔬菜水果中大量的色素会对分光光度法造成很大的影响，导致检测结果的不准确。并且上述方法存在回收率低、错检、漏检比例较高、重复性差、难以满足低残留和定量检测的要求等缺点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能克服上述缺陷以及操作简单、价格低廉、灵敏度高、实现在线快速检测的农药残留快速检测仪。可以准确获知样品中含有农药残留是否超标且能何种农药残留及浓度等信息。所采取的技术方案如下：

一种基于酶免疫传感器的农药残留快速检测仪，是由三电极系统，信号检测与处理系统，显示与打印存储系统和供电系统构成；

所述三电极系统由酶电极和免疫传感器，三电极检测电路，恒电位电路及模拟多路开关构成，酶电极和免疫传感器从检测样品中采集电流信号，三电极检测电路将电路信号传向信号检测与处理系统，恒电位电路为电极提供稳恒电压，模拟多路开关分别逐次将免疫传感器产生的电流信号采集并送入信号检测与处理系统；

所述酶电极由一个工作电极构成，在工作电极表面固定有乙酰胆碱酯酶；所述免疫传感器由一个圆形的电极盘构成，电极盘的中心位置有对电极和参比电极，外围是均匀分布的阵列工作电极，阵列工作电极固定有农药抗体；

所述信号检测与处理系统由TLC272CP芯片，A/D转换芯片和单片机构成，TLC272CP芯片的多路运放电路对从酶电极和免疫传感器传送来的电流信号进行I/V转化，放大，滤波处理，A/D转换芯片将转换后的数字信号送入单片机，单片机具有微控制器，对转换后的数字信号进行程序处理；

所述单片机的微控制器为STC89C52微控制器，单片机的程序包含数据打印与存储，时间显示，使用说明和对重要步骤提示的对话框，帮助用户快速掌握仪器的使用方法以及进行数据打印和存储；

所述显示与打印存储系统由显示器电路，打印电路和存储器电路构成，显示器用于显示数据并通过操作键进行控制，打印和存储电路分别为微型打印机及存储器相连进行数据打印和存储；

所述供电系统电路由开关电源和电压转换电路构成，开关电源将交流电转换成直流电经过电压转换电路分别向各系统电路和微型打印机供电，开关电源为+12V，1A、-12V，1A、+5V，5A三路输出，电源与供电系统中的开关电源相连。

所述恒电位电路，为工作电极与参比电极之间提供500mV的稳恒电压。

所述微控制器是内核为MCS-51的STC89C52RC+微控制器。

所述信号检测与处理系统的存储单元置入乙酰胆碱酯酶传感器和免疫传感器相应检测农药残留的农药浓度与电流关系的标准曲线数据库。

所述显示器采用3.5寸显示屏；所述微型打印机采用微型嵌入式打印机。

一种利用所述检测仪的检测方法步骤如下：

1)将固定有乙酰胆碱酯酶的酶电极放入不含农药的底物溶液中，检测不含农药时的电流I₁，或者采用系统设定的默认值；

2)取出酶电极后，用蒸馏水冲洗，再将酶电极放入样品液中孵育10min；

3)取出酶电极后，用蒸馏水冲洗，再次放入底物溶液中，检测电流I₂；

4)通过微控制器上的检测程序根据抑制率公式，计算抑制率；

5)利用免疫传感器替代酶电极，重复步骤1）至步骤4）过程重新检测步骤4）所测抑制率高于20%的样品，并获得超标抑制率；

6)将步骤5）所得超标抑制率与预先置入检测仪的抑制率与农药浓度标准曲线数据库进行对比，获得超标农药种类和浓度；

7)权利要求6所述方法，其特征在于，步骤4）所述抑制率公式，具体为：

抑制率=(I₁-I₂)/I₁％×100%。

本发明所提供的检测仪的基本原理是：三电极系统先通过酶传感器，测定接触样品前后电流的变化，获知样品中是否含有农药是否超标。如果确有农药超标，再使用免疫传感器，测定接触样品前后电流的变化，获知样品中含有何种农药及农药的浓度等信息。农药残留检测仪负责将三电极采集而来的微弱电流信号进行I/V转换，放大，滤波，A/D转换最终将数字量信号送入单片机进行程序处理。显示与打印存储系统将残留的农药浓度、抑制度等参数显示出来，并将数据存储下来以便用户及时查看和进行数据分析。显示与打印存储系统内含微型打印机，可以将数据进行相应的打印输出。

为了实现上述功能，所述的酶传感器有一个工作电极构成，在工作电极表面固定乙酰胆碱酯酶，制备乙酰胆碱酯酶传感器。所述的免疫传感器由一个圆形的电极盘组成，中心位置有对电极和参比电极，外围是均匀分布的工作电极，以确保对电极、参比电极与各工作电极的距离相等，其中阵列工作电极用来固定不同种类的农药抗体。检测仪存储单元置入乙酰胆碱酯酶传感器和免疫传感器相应检测农药残留的农药浓度与电流关系的标准曲线数据库。使用时先将固定乙酰胆碱酯酶传感器与检测仪相连，根据乙酰胆碱酯酶传感器获得的接触样品前后电流变化的信号，确定是否含有农药且是否超标。如果有超标显示，再将固定抗体的免疫传感器阵列连接到检测仪上，通过模拟多路开关分别逐次地将阵列免疫传感器产生的电流信号采集送入检测仪中，根据免疫传感器获得的接触样品前后电流的变化信号，确定具体何种农药超标及浓度为多少。因此该检测仪可在一次样品取样中同时获取农药是否超标，含有何种具体的农药及浓度等信息。

本发明的有益效果：本发明所提供给的基于酶免疫传感器的农药残留快速检测仪，可以弥补乙酰胆碱酯酶生物传感器和免疫传感器存在的缺陷。乙酰胆碱酯酶传感器只能检测有机磷和氨基甲酸酯类，是否含有这一类农药，而无法确定性的获知是哪一种农药残留超标。免疫传感器是抗原抗体的特异性识别，因此可以获知具体哪一种农药，但是抗体比较昂贵，如果没有农药残留超标的信息，就没有必要进行第二步的测量。因此本发明的一种基于酶免疫传感器的农药残留快速检测仪，既节约了检测成本，又能确定性的获知具体哪一种农药残留超标的信息，适合于农药残留的快速检测。用此方法可以达到的检测限为1ug/L。准确率因为使用两种传感器进行检测，所以准确度高于单纯用酶传感器和免疫传感器的准确度。

附图说明

图1为本发明一种基于酶免疫传感器的农药残留快速检测仪的结构框图。

图2为本发明三电极与恒电位电路及A/D转换前期处理电路。

具体实施方式

首先，对本发明的结构示意框图加以说明；其次，对信号检测及处理系统所包括的恒电位电路、A/D转换前期处理电路加以详细说明；最后，对整个系统的应用软件及检测流程加以说明。

图1为本发明一种基于酶免疫传感器的农药残留快速检测仪的结构框图。如图1所示,本发明由三电极系统，信号检测与处理系统，显示与打印存储系统，供电系统组成。三电极系统通过酶传感器和免疫传感器采集微弱电流信号；信号检测与处理系统将三电极采集而来的微弱电流信号进行I/V转换，放大，滤波，A/D转换最终将数字量信号送入单片机进行程序处理；显示与打印存储系统将残留的农药浓度、抑制度等参数显示出来，并将数据存储下来以便用户及时查看和进行数据分析。显示与打印存储系统内置微型打印机，可以将数据进行相应的打印输出。信号检测与处理系统内部的单片机对显示与打印存储系统统一进行编程控制，同时也对其它系统进行响应。供电系统将交流电转换成三路直流电为各系统电路以及微型打印机供电。所述的微控制器采用内核为MCS-51的STC89C52RC+微控制器，其上加载检测程序。

本发明中，检测电路中的恒电位电路为三电极系统电流/电压转化检测电路提供稳定的工作电压，图2为恒电位仪电路及A/D转换前期处理电路，由一个双路运算放大器U10TLC272CP和R44,R46,R4,C35,C16,R48构成。运放B的引脚6和7相连与A的3脚相连，A的2脚与三电极体系的工作电极相连并连上了C16，增强抗干扰能力，R48是作为反馈电阻在放大器A上，B的5管脚外接一个电位器R46，由正5V供电激励，R44,R46,R4通过电压分压供给500mv电压给与B的5管脚形成恒电位电路，初始电压为500mv.运放A和的引脚8接+5V电源，引脚4接-5V，U9TLC272CP的运放B引脚7与引脚6直接相连作为电压跟随器，ADE引脚3与B的引脚5相连接，共同接地，起到抗干扰的作用。A的引脚2直接与三电极体系的参比电极相连接，引脚1直接与三电极体系的辅助电极相连接，之间连接电容14，目的是起隔离电路的作用，同时能提高带负载的能力，因此U9和U10共同构成了生物传感器的三电极体系，所用检测端由U9和U10引出，采集与检测电化学反应产生的微弱电流信号。

一种基于酶免疫传感器的农药残留快速检测仪的检测流程是：首先，将固定乙酰胆碱酯酶的传感器放入不含农药的底物溶液中，测得不含农药时的电流I₁，即抑制前电流（抑制前电流也可以采用系统中设定的默认值）；之后将酶传感器的工作电极取出，用蒸馏水冲洗后，将固定乙酰胆碱酯酶的工作电极放入样品液中孵育，等待10分钟后取出用蒸馏水冲洗，再次放入底物溶液中，测得抑制后的电流I₂；最后通过微控制器上运行的检测程序自动计算出抑制率，计算公式如下：

抑制率=(I₁-I₂)/I₁％×100%。

如果抑制率超过20%，就使用阵列免疫传感器重复以上操作，获取检测抑制率，根据阵列传感器各通道测定电流变化的结果，再根据检测仪置入的抑制率与农药浓度的标准曲线数据库对应可知道样品中何种农药以及农药的浓度是多少。根据GB2763-2012中规定的食品中农药最大残留限量的国家标准，确定检测的此种农药是否超标。

微控制器根据得到的测定的抑制率做出定性结论，将结果送到显示屏显示，并将最后结果打印输出，数据同时一并进行存储供相关人员以后的查找和研究。

本发明微控制器上运行的检测程序还包含屏幕跳转演示和对重要步骤提示的对话框、打印提示，可以帮助用户快速掌握仪器的使用方法。

下面就检测过程的实施例做具体说明：首先，将鳄鱼夹分别加紧三电极系统对应的三个柱状电极，将固化酶的三电极浸入到含有碘化硫代乙酰胆碱的磷酸盐缓冲溶液中按下检测键，屏幕显示开始检测，约1min后，基线达到稳定水平，约30s后，得到第一个完整的电流数据，记为I₁。待测样品测试:将酶传感器放入提取好的样品溶液中，约10min，之后再将其浸入含有碘化硫代乙酰胆碱的磷酸盐缓冲溶液中，第二次点击检测之后，观察提示，显示结果I₂及抑制率；如果抑制率超过20%，屏幕提示进入第二轮测试。将各种农药抗体的阵列免疫传感器放入测试底液中，通过模拟多路开关分别逐次地将阵列免疫传感器产生的电流信号采集送入检测仪中，进行上述重复的二次测试（此时的测试底液改为铁氰化钾溶液），获得测试结果，如果测试结果中某一个免疫传感器的电流变化抑制率超过20%，则将结果与置入的电流与农药的标准曲线数据库进行比对，最终显示超标的农药的种类及浓度。

注意：1.若要测量下一个待测样品，点击复位即可。

2.关机后须重新进行仪器调零和标准样品测试。

本发明使用的一种基于酶免疫传感器的农药残留快速检测仪，可以实现农药残留的定性定量测量，同时本发明可以适用于同时检测多种农药残留的检测场合。上述实施例是对本发明做进一步说明，本发明不受实施例的限制。

Claims (7)

1.一种基于酶免疫传感器的农药残留快速检测仪，其特征在于，由三电极系统，信号检测与处理系统，显示与打印存储系统和供电系统构成；

所述三电极系统由酶电极和免疫传感器，三电极检测电路，恒电位电路及模拟多路开关构成，酶电极和免疫传感器从检测样品中采集电流信号，三电极检测电路将电路信号传向信号检测与处理系统，恒电位电路为电极提供稳恒电压，模拟多路开关分别逐次将免疫传感器产生的电流信号采集并送入信号检测与处理系统；

所述酶电极由一个工作电极构成，在工作电极表面固定有乙酰胆碱酯酶；所述免疫传感器由一个圆形的电极盘构成，电极盘的中心位置有对电极和参比电极，外围是均匀分布的阵列工作电极，阵列工作电极固定有农药抗体；

所述信号检测与处理系统由TLC272CP芯片，A/D转换芯片和单片机构成TLC272CP芯片的多路运放电路对从酶电极和免疫传感器传送来的电流信号进行I/V转化，放大，滤波处理，A/D转换芯片将转换后的数字信号送入单片机，单片机具有微控制器，对转换后的数字信号进行程序处理；

所述单片机的微控制器为STC89C52微控制器，单片机的程序包含数据打印与存储，时间显示，使用说明和对重要步骤提示的对话框，帮助用户快速掌握仪器的使用方法以及进行数据打印和存储；

所述显示与打印存储系统由显示器电路，打印电路和存储器电路构成，显示器用于显示数据并通过操作键进行控制，打印和存储电路分别与微型打印机和存储器相连进行数据打印和存储；

所述供电系统电路由开关电源和电压转换电路构成，开关电源将交流电转换成直流电经过电压转换电路分别向各系统电路和微型打印机供电，开关电源为+12V，1A、-12V，1A、+5V，5A三路输出，电源与供电系统中的开关电源相连。

2.权利要求1所述检测仪，其特征在于，所述恒电位电路，为工作电极与参比电极之间提供500mV的稳恒电压。

3.权利要求1所述检测仪，其特征在于，所述微控制器是内核为MCS-51的STC89C52RC+微控制器。

4.权利要求1所述检测仪，其特征在于，所述信号检测与处理系统的存储单元植入乙酰胆碱酯酶传感器和免疫传感器相应检测农药残留的农药浓度与电流关系的标准曲线数据库。

5.权利要求1所述检测仪，其特征在于，所述显示器采用3.5寸显示屏；所述微型打印机采用微型嵌入式打印机。

6.一种权利要求1所述检测仪的检测方法，其特征在于，步骤如下：

步骤1）将固定有乙酰胆碱酯酶的酶电极放入不含农药的底物溶液中，检测不含农药时的电流I1，或者采用系统设定的默认值；

步骤2）取出酶电极后，用蒸馏水冲洗，再将酶电极放入样品液中孵育10min；

步骤3）取出酶电极后，用蒸馏水冲洗，再次放入底物溶液中，检测电流I2；

步骤4）通过微控制器上的检测程序根据抑制率公式，计算抑制率；

步骤5）利用免疫传感器替代酶电极，重复步骤1）至步骤4）过程重新检测步骤4）所测抑制率高于20%的样品，并获得超标抑制率；

步骤6）将步骤5）所得超标抑制率与预先植入检测仪的抑制率与农药浓度标准曲线数据库进行对比，获得超标农药种类和浓度。

7.权利要求6所述方法，其特征在于，步骤4）所述抑制率公式，具体为：抑制率=(I1-I2)/I1×100%。