CN102608186A

CN102608186A - 一种检测农药残留的免疫传感器的制备方法

Info

Publication number: CN102608186A
Application number: CN2012100888466A
Authority: CN
Inventors: 孙霞; 李青青; 王相友; 刘君峰; 杜淑媛
Original assignee: Shandong University of Technology
Current assignee: Shandong University of Technology
Priority date: 2012-03-30
Filing date: 2012-03-30
Publication date: 2012-07-25

Abstract

本发明涉及一种检测农药残留的免疫传感器的制备方法，其特征在于：玻碳电极的清洗活化和表征，电沉积纳米金，电极在饱和硫脲中的浸泡，沉积第二层纳米金，自组装克百威单克隆抗体，自组装BSA封闭，免疫传感器工作曲线的建立，免疫传感器性能如选择性、稳定性和再生能力的检测，免疫传感器对实际样品的检测。采用电沉积纳米金，与传统的自组装纳米金胶的方法相比增大了其稳定性、固定量并可使界面更均匀；硫脲具有大的比表面积，对周围环境影响较小，易处理，可以为固定第二层纳米金提供很好的生物兼容界面，再利用纳米金和-NH₂间的化学吸附作用去固定第二层纳米金。此外用这种方法形成的纳米金能提供一个稳定、粗糙和紧凑的表面，使之固定的抗体量增加，从而使制备的电流型免疫传感器检测时间较短，灵敏度高，选择性稳定性好，再生能力好和回收率符合要求。

Description

一种检测农药残留的免疫传感器的制备方法

技术领域

本发明提供一种检测农药残留的电流型免疫传感器的制备方法，属于生物传感器技术领域。

背景技术

我国是一个农业大国，农业对国民经济以及人民生活有着举足轻重的作用，在现代农业生产中农药是防治病虫害，保障农业丰收，确保粮食供应的重要生产资料。农药的大量使用，在提高农作物产量的同时，其农药残留超标的负面影响也逐渐显现出来所谓的农药残留是指农药使用后残存于生物体、农副产品和环境中的微量农药原体、有毒代谢物、降解物和杂质的总称。一般不易挥发和在植物体内、土壤中不易分解，且脂溶性强的农药施用后残留量更高。克百威农药是氨基甲酸酯类农药的一种，别名呋喃丹或虫螨威，也叫大扶农，化学名2,3-二氢-2,2-二甲基-7-苯并呋喃基甲氨基甲酸酯，是一种高效广谱的杀虫剂和杀螨剂，过量使用会对动物有致畸、致突变、致癌作用。随着我国人民生活水平不断提高，农产品的质量安全问题越来越受到关注，尤其蔬菜中农药残留问题已经成为公众关注的焦点，全国每年都有上百起因食用被农药污染的农产品而引起的急性中毒事件，严重影响广大消费者的身体健康，因此由农药残留超标导致的食品安全问题，已越来越受到各国政府和公众的重视。

关于农药残留检测的方法和技术有多种，无论是传统方法和近代快速检测方法都存在一定的缺陷。传统的农药残留的检测方法如气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、色谱/质谱联用技术(GC/LC-MS)、毛细管电泳法(CE)虽然具有高选择性和精确度，但仍存在着样品前处理复杂、仪器设备昂贵、操作麻烦、检测时间长、不适合现场检测等不足，因此不适用于农产品快速检测的要求。目前为了保障人们的食品安全，很多农产品批发市场、宾馆、饭店等场所都应用检测设备检测农产品的农药残留情况。目前，我国农药残留的速测方法是酶抑制试纸法和酶抑制分光光度法（农残快速检测仪），可以实现有机磷农药及氨基甲酸酯类农药的现场快速检测，具有较好的实用价值。速测卡是通过肉眼观察卡片的颜色变化，因此一般只能用于严重超标的蔬菜样品进行定性测量。酶抑制分光光度法的应用也比较广泛，国内已有多种农药残留速测仪均是基于此原理。分光光法的原理是基于吸光度的变化进行检测的，但蔬菜水果中大量的色素会对分光光度法造成很大的影响，导致检测结果的不准确。但是上述方法存在回收率低、错检、漏检比例较高、重复性差、难以满足低残留和定量检测的要求等缺点。

发明的目的在于提供一种能克服上述缺陷、操作简单、灵敏度高，选择性好的检测农药残留的电流型免疫传感器的制备方法。

其技术方案为：一种检测农药残留的免疫传感器的制备方法，其特征在于：电流型免疫传感器的组状过程为电沉积纳米金，在饱和硫脲溶液中浸泡，沉积第二层纳米金，自组装克百威单克隆抗体，自组装BSA封闭。

所述的一种检测农药残留的免疫传感器的制备方法，其特征在于：玻碳电极（d=3mm）的清洗，免疫传感器敏感界面的构建及过程表征，免疫传感器工作曲线的建立，免疫传感器性能的检测，免疫传感器对实际样品的检测。

所述的一种检测农药残留的免疫传感器的制备方法，其特征在于：所制备的电流型免疫传感器的工作曲线为：在1.0 ng/mL 到100.0ng/mL范围内为 y=0.0649x+0.0489，在100.0ng/mL 到 200μg/mL范围内为y=0.0532x+0.0767，免疫传感器的性能受免疫扩散控制。免疫传感器性能检测包括选择性、稳定性和再生能力，免疫传感器对蔬菜样品回收率的测定。

其制备原理为：免疫生物传感器以免疫生物分子作为识别元件，通过固定化技术将免疫蛋白结合到感受器表面，发生免疫识别反应后，生成的免疫复合物与产生的物理或化学信号相关联，由换能器将其转化为与待测物质浓度(或活度)有关的可定量或者可处理的物理化学信号，如电信号、光信号或者声波信号等，再通过二次仪表放大并且输出信号，从而可实现对待测物质的检测。本发明采用纳米金、饱和硫脲对玻碳电极进行修饰，与传统的方法相比，由于纳米金较高的比表面积、稳定性和导电性可以增大电极表面电子的转移和生物相容性，进而增大免疫传感器的响应电流；硫脲具有大的比表面积，可以为固定第二层纳米金提供很好的生物兼容界面，再利用纳米金和-NH₂间的化学吸附作用去固定第二层纳米金。此外用这种方法形成的纳米金能提供一个稳定、粗糙和紧凑的表面，使之固定的抗体量增加。将经过上述步骤修饰过的玻碳电极，制成免疫传感器后，检测农药的精度更高、实现小型、便捷、适用于现场检测的目的。采用本发明制成的电流型免疫传感器可以在蔬果采收、上市前，进行农药残留的快速测定，直接对克百威农药残留是否超标量进行检测，避免因食含有残留农药的蔬果而引起中毒，为农产品安全生产与消费提供残留检测的技术支撑。

为达到以上目的，采取以下技术方案实现：一种检测农药残留的电流型免疫传感器的制备方法，其特征在于：⑴电流型免疫传感器制备前玻碳电极的清洗，活化和性能测试，如果测试循环伏安曲线中的峰电位差在80mV以下，并尽可能接近64mV，所述玻碳电极可使用，否则要重新返回步骤清洗中，直到符合要求。⑵纳米金电沉积在前处理好的电极上，接下来将电沉积了纳米金的电极浸泡在饱和硫脲中，然后沉积第二层纳米金，最后用BSA封闭电流型免疫传感器制备结束，放入冰箱里4℃保存备用。

为达到以上目的，采取以下技术方案实现：一种检测农药残留的免疫传感器的制备方法，其特征在于：⑴将上述制备好的电流型免疫传感器在工作底液中做循环伏安方法扫描，可以检测组装过程的进展。⑵配置一系列的克百威标准液，用以得出上述制备的电流型免疫传感器的工作曲线、检测范围和检测限；

配置一系列经常混合使用的农药溶液，以检测所制备电流型免疫传感器的选择性；

通过循环伏安扫描多段验证上述免疫传感器的稳定性，通过解离和再次免疫检测其再生性能；

通过检测实际蔬菜样品得出免疫传感器的回收率。

本发明采用电沉积纳米金比传统的自组装纳米金胶的方法相比增大了其稳定性、固定量并可使界面更均匀；硫脲具有大的比表面积，对周围环境影响较小，易处理，可以为固定第二层纳米金提供很好的生物兼容界面，再利用纳米金和-NH₂间的化学吸附作用去固定第二层纳米金。此外用这种方法形成的纳米金能提供一个稳定、粗糙和紧凑的表面，使之固定的抗体量增加

所述免疫传感器的制备工艺如下：（1）将预处理好的玻碳电极浸入2mL1%的氯金酸溶液中，在-0.2V的电压下应用恒电位法电沉积30S。电沉积结束后用PH=7.5的PBS缓冲液冲洗，氮气吹干；（2）将沉积了纳米金的电极浸泡于饱和硫脲中12h，然后用PH=7.5的PBS缓冲液冲洗表面；（3）将上述处理过的电极浸入2mL1%的氯金酸溶液中，在-0.2V的电压下应用恒电位法电沉积60S。电沉积结束后用PH=7.5的PBS缓冲液冲洗，氮气吹干；（4）将上述制备好的电极浸于克百威单克隆抗体溶液中，4℃条件下浸泡8h，取出后冲去多余部分，晾干待用；（5）最后将上述制备好的电极最后浸入1%的BSA溶液中室温下静置2h，以封闭电极上非特异性结合位点，取出置于室温下晾干，免疫传感器制作完成，保存在4℃条件下备用。

具体实施方式

实施例：（1）玻碳电极的清洗：所述玻碳电极修饰前，首先浸入热的“piranha”溶液(H₂SO₄:30% H₂O₂ = 3:1)中浸泡15min，用水清洗干净，接下来用0.3μm、30nm的Al₂O₃浆在麂皮上抛光至镜面，抛光后用去离子水洗去表面污物，再移入超声水浴中清洗，每次5min，重复二次，然后依次用6mol/L 的HNO₃、无水乙醇和去离子水超声清洗，氮气环境下干燥；（2）玻碳电极的活化：彻底洗涤后，电极在0.5mol/L H₂SO₄溶液中用循环伏安法活化，扫描范围1.0～－1.0V，反复扫描直至达到稳定的循环伏安图为止。（3）预处理好的玻碳电极的测试：最后在0.20mol/L KNO₃中记录1×10^-3mol/L K₃Fe(CN)₆溶液的循环伏安曲线，以测试所述玻碳电极的性能，扫描速度50 mV/S，扫描范围为－0.1V～0.6；当所述循环伏安曲线中的峰电位差在80mV以下，并尽可能接近64mV，所述玻碳电极可使用，否则要重新返回步骤⑴中，处理所述玻碳电极，直到符合要求；（4）将上述前处理好的玻碳电极浸入2mL1%的氯金酸溶液中，在-0.2V的电压下应用恒电位法电沉积40S3）将上述处理过的电极浸入2mL1%的氯金酸溶液中，在-0.2V的电压下应用恒电位法电沉积60S。电沉积结束后用PH=7.5的PBS缓冲液冲洗，氮气吹干；（5）将上述制备好的电极浸于克百威单克隆抗体溶液中，4℃条件下浸泡8h，取出后冲去多余部分，晾干待用；（6）最后将上述制备好的电极最后浸入1%的BSA溶液中室温下静置2h，以封闭电极上非特异性结合位点，取出置于室温下晾干，免疫传感器制作完成，保存在4℃条件下备用。

将上述制备好的免疫传感器在含有5 mM [Fe(CN)₆] ^3-/4-和0.1 M KCl 的0.1 M 磷酸盐缓冲液(PBS) (pH 7.5)中以30 -500 mV/s的扫描速度进行循环伏安测试；配置0.1ng/mL-1μg/mL的克百威标准溶液，将上述制备好的电流型免疫传感器分别浸入不同浓度5mL的克百威标准溶液，在常温下孵育15min，检测免疫前后电流变化得到其工作曲线；将电流型免疫传感器分别在10 ng/mL常混合使用的农药溶液中常温下孵育15min，以检测其选择性，将免疫后的传感器用甘氨酸-HCl缓冲液 (pH 2.8)解离克百威农药5min后再次免疫，重复操作5次以检测其再生能力；

把蔬菜彻底清洗干净并用去离子水清洗3次，喷洒上一定浓度的农药，放置24h后，用PBS (pH 7.5)做溶剂超声处理30min(换溶剂三次)，以检测实际样品的回收率。

此种电流型免疫传感器农药残留的检测方法操作工艺简单，检测时间较短，灵敏度高，选择性稳定性好，再生能力好和回收率符合要求，符合我国农药残留快速检测技术发展和国际化要求。

Claims

1.一种检测农药残留的免疫传感器的制备方法，其特征在于：电流型免疫传感器的组状过程为电沉积纳米金，在饱和硫脲溶液中浸泡，沉积第二层纳米金，自组装克百威单克隆抗体，自组装BSA封闭。

2.如权利要求1所述的一种检测农药残留的免疫传感器的制备方法，其特征在于：玻碳电极（d=3mm）的清洗，免疫传感器敏感界面的构建及过程表征，免疫传感器工作曲线的建立，免疫传感器性能的检测，免疫传感器对实际样品的检测。

3.如权利要求1所述的一种检测农药残留的免疫传感器的制备方法，其特征在于：所制备的电流型免疫传感器的工作曲线为：在1.0 ng/mL 到100.0ng/mL范围内为 y=0.0649x+0.0489，在100.0ng/mL 到 200μg/mL范围内为y=0.0532x+0.0767，免疫传感器的性能为受免疫扩散控制，免疫传感器性能检测包括选择性、稳定性和再生能力，免疫传感器对蔬菜样品回收率的测定。