CN103558272B

CN103558272B - 一种适配体传感器抗生素残留快速检测仪

Info

Publication number: CN103558272B
Application number: CN201310576568.3A
Authority: CN
Inventors: 郭业民; 王相友; 孙霞; 刘君峰; 赵国
Original assignee: Shandong University of Technology
Current assignee: Shandong University of Technology
Priority date: 2013-11-19
Filing date: 2013-11-19
Publication date: 2015-07-29
Anticipated expiration: 2033-11-19
Also published as: CN103558272A

Abstract

本发明涉及一种适配体传感器抗生素残留快速检测仪，由适配体传感器，信号检测与处理系统，显示与打印存储系统，供电系统组成。用壳聚糖、戊二醛与铁氰化钾复合物修饰的工作电极，再用纳米金胶将适配体固定到电极表面，制备适配体传感器。检测适配体传感器接触抗生素前后电流的变化来测定抗生素的浓度。信号处理电路将采集的微弱电流信号进行I/V转换，放大，滤波，A/D转换最终将数字量信号送入微控制器进行程序处理；该检测仪可对检测样品中的抗生素残留量是否超标及浓度值进行显示、存储和打印。本发明的适配体传感器抗生素残留快速检测仪可准确快速的检测样品中是否含有某种抗生素等信息，非常适合对抗生素残留进行现场快速检测的场合。

Description

一种适配体传感器抗生素残留快速检测仪

技术领域

本发明涉及一种抗生素残留快速检测仪，尤其涉及一种适配体传感器抗生素残留快速检测仪，属于农产品安全检测技术领域。

背景技术

近年来，随着我国畜牧养殖业的迅速发展，奶产量大幅度提高，新鲜牛奶和奶制品已经成为人民(尤其是老人和儿童)生活食品中的重要组成部分。然而，抗生素在现代畜牧业中的广泛应用，不可避免地造成牛奶中抗生素残留。若长期饮用含有抗生素的牛奶，无疑是等于长期服用小剂量的抗生素，对抗生素过敏体质的人服用残留抗生素的牛奶后可引发过敏反应。正常饮用者，会导致体内的某些条件性致病菌易产生耐药性，一旦患病再用同种抗生素治疗很难奏效。抗生素残留不仅危害人类健康，同时也影响牛奶的品质，造成经济损失。由于奶牛乳腺炎发病率较高，用抗生素来治疗乳腺炎等产科疾病仍较普遍, 这容易导致在牛奶中四环素的残留。过量使用抗生素不可避免会使母体代谢产物等相关抗生素残留于动物的肌肉、蛋、奶、脏器组织中, 进而通过食物链影响人体健康。可见，加强对牛奶等农产品中抗生素残留的检测，尤其是保障人类健康有着十分深远的意义。

传统的抗生素残留检测方法主要有：气相色谱(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、色谱/质谱联用技术(GC/LC-MS)、毛细管电泳法(CE)、荧光分析、酶联免疫法(ELISA)。这些方法虽然选择性好、灵敏度高、准确度高、检出限低，可同时检测多种元素或化合物，但其需要昂贵的仪器设备，样品前处理过程繁琐、费时，并且对分析人员的技术水平要求很高，不适于现场快速检测。与传统的分析方法相比，生物传感器具有如下特点：（1）较高的选择性，因此不需要对被测组分进行分离，即不用对样品进行预处理。（2）结构简单，体积小，使用方便，特别是便携式的免疫传感器，非常有利于农产品安全质量的快速测定。（3）可实现连续在线检测，使食品加工过程的质量控制变得简便。（4）响应速度快，样品用量少，与其他大型分析仪器相比，免疫传感器制作成本低，且可反复使用。

发明的目的在于针对现有技术的不足，设计提供一种适配体传感器抗生素残留检测仪，具有携带方便、检测快速准确、操作简单、可实现抗生素残留的在线定性定量测量等特点。

本发明一种适配体传感器抗生素残留快速检测仪的基本原理是：三电极系统将适配体传感器接触抗生素前后由于免疫反应而导致微弱电流信号的变化通过检测电路对信号进行采集。检测电路将采集而来的微弱电流信号进行I/V转换，放大，滤波，A/D转换最终将数字量信号送入单片机进行程序处理。最后，显示与打印存储系统将抗生素残留的浓度、抑制度等参数显示出来，并将数据存储下来以便用户及时查看和进行数据分析。本发明的检测仪内含微型打印机，可以将数据进行相应的打印输出。信号检测与处理系统内部的单片机对显示与打印存储系统统一进行编程控制。

为实现以上功能，本发明的一种适配体传感器抗生素残留快速检测仪的适配体传感器的制备方法为：(1) 壳聚糖、戊二醛与铁氰化钾复合物的制备：首先配置1% (1 ml/100 ml water) 的醋酸溶液并用配好的醋酸溶液作为溶剂制备50 ml 1% (1 g/100 ml) 的壳聚糖溶液。把500 μl 的5 mM的K3[Fe(CN)6] 与1 mL的壳聚糖溶液 (400 μl 1% 壳聚糖 + 600 μl 水) 混匀超声震荡5分钟得到清澈的黄色溶液。向上诉溶液中加入100 μl 5% 的戊二醛在超声10分钟后静置24h，壳聚糖、戊二醛与铁氰化钾复合物制备完成。(2) 纳米金胶的制备采用柠檬酸三钠热还原氯金酸(HAuCl4)的方法。所有的玻璃器皿均用王水浸泡，洗涤干净备用。配置100 mL 0.01% 的氯金酸溶液，在剧烈搅拌下加热至沸腾，然后迅速加入2.5 mL 1% 柠檬酸三钠溶液，继续搅拌20min(此间溶液由淡黄色转为无色，然后变灰黑色，最后成酒红色)，除去热源后继续搅拌至室温下慢慢冷却。将冷却后的金胶溶液置于干净的棕色玻璃瓶中于4°C冰箱中避光保存备用，数月有效。 (3) 取5μL制备好的壳聚糖、戊二醛与铁氰化钾的复合物滴涂在预处理好的玻碳电极表面，常温干燥，用pH7.5的磷酸银缓冲液冲洗电极表面。(4) 电极表面晾干后，取5μL纳米金胶滴涂在电极表面，常温下静置至干燥，然后用超纯水冲洗表面物理吸附的纳米金，氮气吹干。(8) 然后将5 μL 5mM的适配体滴在上述经纳米材料修饰好的电极上，用橡胶帽盖住防止水分的蒸发，4h后用超纯水冲洗表面，晾干待用。(9) 最后上述制备好的电极浸于用1M的巯基乙醇封闭1h，以封闭非特异性结合位点，适配体传感器制作完成，保存在4°C条件下备用。

所述的一种适配体传感器抗生素残留快速检测仪，其特征在于：三电极系统电路由三电极适配体传感器，三电极检测电路，恒电位电路组成；三电极免疫传感器采集电流信号由三电极检测电路传向信号检测与处理系统电路。恒电位电路向反应溶液环境提供500mV的稳定电压。

信号检测与处理系统电路具有I/V转换，放大，滤波功能，内含A/D转换芯片将经过I/V转换之后酶传感器采集的模拟量信号转换成数字量信号送入单片机进行程序处理。信号检测与处理系统的单片机微控制器为STC89C52。单片机的检测程序包含数据打印与存储，时间显示，使用说明和对重要步骤提示的对话框，帮助用户快速掌握仪器的使用方法以及进行数据打印和存储方便以后进行数据的检查和处理。信号检测与处理系统电路采用TLC272CP芯片多路运放电路具有I/V转换，放大，滤波并向三电极反应环境提供500mv恒定电压的功能。

显示与打印存储系统电路由显示器电路，打印电路和存储器电路组成。显示器用于显示数据通过操作按键进行控制作为用户进行控制的界面。打印存储系统电路分别与微型打印机以及存储器相连进行数据打印和存储。显示屏采用了一般的 3.5 寸的显示屏，微型打印机采用微型嵌入式打印机，其尺寸和功耗满足方便携带和便携式的功耗要求。

为达到以上目的，采取以下技术方案实现：供电系统电路由开关电源和电压转换电路组成，开关电源将交流电转换成直流电经过电压转换电路分别向各系统电路和微型打印机供电。开关电源为+12V，1A、-12V，1A、+5V，5A三路输出。电源与供电系统中的开关电源相连。

附图说明

图 1 为本发明一种适配体传感器抗生素残留快速检测仪的结构框图，

图 2 为本发明三电极与恒电位电路及A/D转换前期处理电路。

具体实施方式

首先，对本发明的结构示意框图加以说明；其次，对信号检测及处理系统所包括的恒电位电路、A/D转换前期处理电路加以详细说明；最后，对整个系统的应用软件及检测流程加以说明。

图1为本发明一种适配体传感器抗生素残留快速检测仪的结构框图。如图1所示，本发明由三电极系统，信号检测与处理系统，显示与打印存储系统，供电系统组成。三电极系统通过免疫传感器采集反应溶液中的微弱电流信号；信号检测与处理系统将三电极采集而来的微弱电流信号进行I/V转换，放大，滤波，A/D转换最终将数字量信号送入单片机进行程序处理；显示与打印存储系统将残留的抗生素浓度、抑制度等参数显示出来，并将数据存储下来以便用户及时查看和进行数据分析。本发明的检测仪内含微型打印机，可以将数据进行相应的打印输出。信号检测与处理系统内部的单片机对显示与打印存储系统统一进行编程控制。供电系统将交流电转换成三路直流电为各系统电路以及微型打印机供电。所述的微控制器采用内核为 MCS-51 的 STC89C52RC+ 微控制器，其上加载检测程序。

本发明中，检测电路中的恒电位电路为三电极系统电流/电压转化检测电路提供稳定的工作电压，图 2为恒电位仪电路的一个实施例，由一个双路运算放大器 U10 TLC272CP和R44,R46,R4,C35,C16,R48构成。运放 B的引脚6和7相连与A的3脚相连，A的2脚与三电极体系的工作电极相连并连上了C16，增强抗干扰能力，R48是做为反馈电阻在放大器A上，B的5管脚外接一个电位器R46，由正5V供电激励，R44,R46,R4通过电压分压供给500mv电压给与B的5管脚形成恒电位电路，初始电压为500mv. 运放A和的引脚 8 接 +5V 电源，引脚 4 接 -5V，U9 TLC272CP的运放 B引脚 7 与引脚6 直接相连作为电压跟随器，ADE 引脚 3 与 B的引脚5相连接，共同接地，起到抗干扰的作用。A的引脚2 直接与三电极体系的参比电极相连接，引脚1直接与三电极体系的辅助电极相连接，之间连接电容14，目的是起隔离电路的作用，同时能提高带负载的能力，因此U9和U10共同构成了生物传感器的三电极体系，所用检测端由这里引出，采集与检测电化学反应产生的微弱电流信号。

本发明的一种适配体传感器抗生素残留快速检测仪的适配体传感器制备方法为：(1) 壳聚糖、戊二醛与铁氰化钾复合物的制备：首先配置1% (1 ml/100 ml water) 的醋酸溶液并用配好的醋酸溶液作为溶剂制备50 ml 1% (1 g/100 ml) 的壳聚糖溶液。把500 μl 的5 mM的K3[Fe(CN)6] 与1 mL的壳聚糖溶液 (400 μl 1% 壳聚糖 + 600 μl 水) 混匀超声震荡5分钟得到清澈的黄色溶液。向上诉溶液中加入100 μl 5% 的戊二醛在超声10分钟后静置24h，壳聚糖、戊二醛与铁氰化钾复合物制备完成。(2) 纳米金胶的制备采用柠檬酸三钠热还原氯金酸(HAuCl4)的方法。所有的玻璃器皿均用王水浸泡，洗涤干净备用。配置100 mL 0.01% 的氯金酸溶液，在剧烈搅拌下加热至沸腾，然后迅速加入2.5 mL 1% 柠檬酸三钠溶液，继续搅拌20min(此间溶液由淡黄色转为无色，然后变灰黑色，最后成酒红色)，除去热源后继续搅拌至室温下慢慢冷却。将冷却后的金胶溶液置于干净的棕色玻璃瓶中于4°C冰箱中避光保存备用，数月有效。 (3) 取5μL制备好的壳聚糖、戊二醛与铁氰化钾的复合物滴涂在预处理好的玻碳电极表面，常温干燥，用pH7.5的磷酸银缓冲液冲洗电极表面。(4) 电极表面晾干后，取5μL纳米金胶滴涂在电极表面，常温下静置至干燥，然后用超纯水冲洗表面物理吸附的纳米金，氮气吹干。(8) 然后将5 μL 5mM的适配体滴在上述经纳米材料修饰好的电极上，用橡胶帽盖住防止水分的蒸发，4h后用超纯水冲洗表面，晾干待用。(9) 最后上述制备好的电极浸于用1M的巯基乙醇封闭1h，以封闭非特异性结合位点，适配体传感器制作完成，保存在4°C条件下备用。

本发明的检测流程是：首先，将制备好的适配体传感器放入不含抗生素的测试底液中，测得不含抗生素时的电流 I₁，即抑制前电流（抑制前电流也可以采用系统中设定的默认值）；之后将适配体传感器去除，用蒸馏水冲洗后，将适配体传感器工作电极放入待检测样品液孵育10分钟，再次将适配体传感器放入测试底液中，测得抑制后的电流I₂；最后通过微控制器上运行的检测程序自动计算出抑制率(I%)，计算公式如下：

I%=( I₁- I₂)/ I₁×100%

通常如果检测样品液中含有抗生素，由于适配体与抗生素发生免疫反应产生免疫复合物阻碍了测试液与电极之间的电子转移，电流 I₂小于 I₁。I₁ 与 I₂ 的差值愈大则抑制率愈大，表明检测样品液中抗生素残留的浓度愈高；I₁ 与I₂ 的差值愈小则抑制率愈小，表明检测样品液中抗生素残留的浓度愈低。

目前认为当抑制率大于、等于 50％时，抗生素残留超标；当抑制率小于 50％时，抗生素残留未超标。

微控制器根据得到的抑制率做出定性结论，将结果送到显示屏显示，并将最后结果打印输出，数据同时一并进行存储供相关人员以后的查找和研究。

本发明微控制器上运行的检测程序还包含屏幕跳转演示和对重要步骤提示的对话框、打印提示，可以帮助用户快速掌握仪器的使用方法。

检测程序的实施例：首先，将免疫传感器放入底物溶液中进行检测准备。然后，按下仪器开关键，系统初始化后进入首页，显示屏旁边有检测按钮、复位和打印三个播磨按键。第一次点击检测按钮，开始检测并显示读数I₁；第二次点击检测之后，观察提示，显示结果I₂ ；点击打印，打印结果并保存。打开电源键，屏幕显示“START 检测 ”，清零。将鳄鱼夹分别加紧三电极系统对应的三个柱状电极，将固定抗体的免疫传感器浸入到之前准备的磷酸盐缓冲溶液中按下检测键，屏幕显示开始检测，约1min后，基线达到稳定水平，约30s后，得到第一个完整的电流数据，记为I₁。待测样品测试：将免疫传感器放入提取好的样品溶液中，约10min，之后再将其浸入定量磷酸盐缓冲溶液中，按测量键，点击检测键第二次测量，同时显示第二个电流数据I₂。通过两个电流数据自动计算该样品液对固定化酶的活性抑制率。选择适当的关系曲线计算提取液的目标抗生素浓度，并折算成样品中目标抗生素的含量，最后自动生成测定结果报告。按下打印键，将印有前后两次检测电压、抗生素抑制率以及抗生素检测浓度的数据进行打印输出。

本发明的一种是适配体传感器抗生素残留快速检测仪，操作工艺简单，检测时间较短，可实现抗生素残留的定性定量测量，具有灵敏度高，稳定性好、重现性好等优点，符合我国抗生素残留快速检测技术发展和国际化要求。

Claims

1.一种适配体传感器抗生素残留快速检测仪，其特征在于：该检测仪由三电极适配体传感器，信号检测与处理电路，显示与打印存储电路，恒电位供电电路，操作按键，数据存储器，微型打印机，电源构成；免疫传感器产生的电流信号由检测电路传向信号检测与处理系统电路；恒电位电路向工作电极与参比电极之间提供 500mV 的稳定工作电压；所述的信号检测与处理电路具有 I/V 转换，放大，滤波功能，内含 A/D 转换芯片将适配体传感器采集的模拟量信号转换成数字量信号送入单片机进行程序处理；所述的免疫传感器使用纳米材料修饰工作电极后，将特定的抗生素适配体固定到电极表面，可特定性的测量样品液中是否含有某种抗生素；

所述适配体传感器，是通过如下方法制备的：

1）壳聚糖、戊二醛与铁氰化钾复合物的制备：首先配制体积比1%的醋酸溶液并用配好的醋酸溶液为溶剂配制50mL 质量体积比1%的壳聚糖溶液，把500μL5mM K3[Fe(CN)6]与1ml的壳聚糖溶液混匀超声震荡5分钟得到清澈的黄色溶液，向上述溶液中加入100μL 5%的戊二醛再超声10分钟后静置24h，壳聚糖、戊二醛与铁氰化钾复合物制备完成；

所述1ml的壳聚糖溶液，含有400μL 1%的壳聚糖和600μL的水；

2）纳米金胶的制备采用柠檬酸三钠热还原氯金酸的方法，所有玻璃器皿均用王水浸泡，洗涤干净后备用；配制100mL 0.01%的氯金酸溶液，在剧烈搅拌下加热至沸腾，然后迅速加入2.5mL 1% 的柠檬酸三钠溶液，继续搅拌20min，除去热源后继续搅拌至室温下慢慢冷却，将冷却后的金胶溶液置于干净的棕色玻璃瓶中于4℃冰箱中避光保存备用，数月有效；

3）取5μL制备好的壳聚糖、戊二醛与铁氰化钾的复合物滴涂在预处理好的玻碳电极表面，常温干燥，用pH7.5的磷酸盐缓冲冲洗电极表面；

4）电极表面晾干后，取5μL纳米金胶滴涂在电极表面，常温下静置至干燥，然后用超纯水冲洗表面物理吸附的纳米金，氮气吹干；

5）将5μL 5mM 的适配体滴在上述经纳米材料修饰好的电极上，用橡胶帽盖住防止水分蒸发，4h后用超纯水冲洗表面，晾干待用；

6）最后将上述制备好的电极浸于1M的巯基乙醇封闭1h，以封闭非特异性结合位点，适配体传感器制作完成，保存4℃条件下备用。

2. 如权利要求1所述的一种适配体传感器抗生素残留快速检测仪，其特征在于所述的信号检测与处理系统的单片机微控制器为 STC89C52。

3. 如权利要求1所述的一种适配体传感器抗生素残留快速检测仪，其特征在于该检测仪使用的是免疫传感器，在适配体传感器工作电极表面固定了特定的抗生素适配体，因此该检测仪可实现特定性的测定样品中是否含有某种抗生素，实现样品的抗生素残留定性定量测量。

4. 如权利要求1所述的一种适配体传感器抗生素残留快速检测仪，其特征在于所述的信号检测与处理系统电路采用 TLC272CP 芯片多路运放电路，具有 I/V 转换，放大，滤波并向三电极反应环境提供 500mv 恒定电压的功能。