CN102621321A - 一种检测农药残留的免疫传感器敏感界面的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测农药残留的免疫传感器敏感界面的构建方法，其特征在于：敏感界面的组成为纳米金晶体(DpAu)1%、三维纳米复合膜（功能化多壁碳-壳聚糖溶液-普鲁士蓝MWCNTs-CTS-PB）、蛋白A2mg/mL、农药抗体5μg/mL、BSA１%。依次将上述材料固定在免疫传感器表面后，因为纳米金晶体、功能化多壁碳、普鲁士蓝溶液能增大电子的转移，进而增大免疫传感器的相应，提高传感器的灵敏度；功能化多壁碳和壳聚糖有良好的成膜性并具有丰富的基团，可以增大与传感器表面和生物的结合度进而提高传感器的灵敏度和稳定性；蛋白A的定向固定农药抗体分子和BSA的封闭作用可以增大传感器的特异性和稳定性，从而可以制备高稳定性、高灵敏度、选择性好、长寿命的免疫传感器。
Description
本发明提供一种检测农药残留的免疫传感器敏感界面的构建方法，属于构建免疫传感器技术领域。
背景技术
免疫传感器的关键是敏感界面的构建，因为其直接影响生物分子的固定化、传感器的稳定性、灵敏度和选择性等主要性能。生物分子的固定化可以分为生物分子的固定化材料和生物分子的固定化技术，固定化材料和固定化技术既要保持生物活性单元的固有特性和生物活性，又要避免生物自由活性单元应用上的缺陷，因此它们是生物传感器制备过程中的关键性因素。生物分子的固定化材料主要包括有机导电聚合物、溶胶—凝胶、生物材料及表面活性剂、纳米材料等，但是单独使用目中材料往往不能满足所构建的免疫传感器的高稳定性、灵敏度和选择性等主要性能。因此，制备稳定的、与生物分子高结合度的和可保持生物分子活性的三维纳米复合膜和其他材料组合构建的免疫传感器敏感界面，以制备高稳定性、高灵敏度和选择性好的免疫传感器成为免疫传感器技术发展的主要方向。
目前关于免疫传感器敏感界面的制备方法有多种，进而固定化方法多种多样，常用的免疫蛋白分子的固载方法主要有：吸附法、包埋法、共价键合法、定向固定法和层层自组装法。但是这些方法中都存在一定的缺陷，如基于高分子膜、无机多孔材料、聚电解质等作为固载的吸附法，存在容易脱落，对溶液pH值、温度、离子强度和换能器表面状况较为敏感等缺点；直接将免疫分子与高分子溶剂，如聚氯乙烯(PVC)、聚碳酸酷、醋酸纤维、Nafion等合成的高聚物及海藻酸、明胶、壳聚糖等天然的溶胶状高聚物，混合得到包覆了免疫分子复合膜的包埋法实验条件温和，操作较简单，但是对被测免疫蛋白与包埋蛋白的免疫结合增加了空间位阻，同时也不利于底物与产物的扩散；通过自发的化学吸附作用或键合作用的层层自组装方法在传感器界面形成二维有序单层膜操作简便，具有良好的稳定性、有序性，但对自组装分子结构有限制，且容易受到杂质吸附、分子聚合、溶剂选择、基片表面物理性质的影响。上述方法的缺陷都会对制备的免疫传感器的灵敏度、稳定性、选择性和使用寿命造成影响。
发明的目的在于提供一种能克服上述缺陷，可构建出高灵敏度、高选择性、低成本和长寿命的免疫传感器的敏感界面的制备方法。
其技术方案为：一种检测农药残留的免疫传感器敏感界面的构建方法，其特征在于：免疫传感器的敏感界面组成为纳米金晶体 (DpAu)、由功能化多壁碳、普鲁士蓝、壳聚糖制作的三维纳米复合膜、蛋白A和BSA。
所述的一种检测农药残留的免疫传感器敏感界面的构建方法，其特征在于：纳米金晶体 (DpAu)其浓度为1%，蛋白A浓度为2mg/mL，BSA的浓度为１％。
所述的一种检测农药残留的免疫传感器敏感界面的构建方法，其特征在于：三维纳米复合膜的组成功能化多壁碳（MWNTs）0.769g/mL、酰基化壳聚糖（CTS）１mg/mL、普鲁士蓝溶液。
其制备原理为：本发明制备的免疫传感器敏感界面可以兼顾保持免疫传感器表面固定的单克隆抗体蛋白的生物物质活性与固载后的稳定性和耐用性。本发明采用的纳米金（DpAu）晶体具有扩大电极比表面积和增大三维复合膜固定量的功能 同时能提供和自然相似的微环境并保持固定分子的生物活性使得修饰电极表面能吸附大量抗体并很好地保持其生物活性。功能化多壁碳纳米管（MWNTs）具有极高的化学稳定性、良好的传递电子性能以及催化活性的表面，被用于免疫传感器敏感界面的制作。壳聚糖（CTS）属多糖类, 它具有优异的成膜性、吸附性、透气性和渗透性，成膜后具有很好的吸附性、稳定性和良好的生物相容性，其丰富的氨基、多孔性结构使它被广泛用于生物分子的固定和修饰电极的制备。普鲁士蓝(PB)具有良好的氧化还原活性、高度的化学稳定性和易于制备等优点, 是制备免疫传感的理想电极材料，本发明中把PB引入溶胶-凝胶膜(壳聚糖)来提高PB的稳定性。作者将功能化多壁碳、壳聚糖与普鲁士蓝同时复合制成三维纳米复合膜，不但增大了传感器的电流响应以增大检测精度，更获得了具有大量氨基的共沉积膜，可为蛋白A生物分子提供一个合适的亲水性环境，蛋白A分子可以固定地结合抗体的Fc端，从而可以将抗体定向地固定在电极上使与农药特异性结合端暴露在表面上，最后BSA对非特异性位点的封闭进一步增大检测精度，以研发性能优异的电化学生物传感器。
为达到以上目的，采取以下技术方案实现：一种检测农药残留的免疫传感器敏感界面的构建方法，其特征在于：⑴多壁碳纳米管的功能化：称取10mg的多壁碳纳米管(MWNTs)，放入100mL的烧杯中，量取40mL浓HNO3和H2SO4混合液(V:V=1:3)加入所述烧杯中混合后，超声4 h、120℃离心回流3 h，水洗至中性，红外炉干燥，室温下保存待用；⑵普鲁士蓝溶液的制备：普鲁士蓝溶液指包含1.0 mmol/L FeCl3, 1.0 mmol/L K 3[Fe (CN) 6], 0.1 mol/L KCl和0.025 mol/L的HCl的混合水溶液；⑶壳聚糖溶液的制备：称取0.5g壳聚糖（CTS），溶于1.0%的醋酸溶液，混合液连续搅拌30min，使壳聚糖完全溶解。
为达到以上目的，采取以下技术方案实现：一种检测农药残留的免疫传感器敏感界面的构建方法，其特征在于：⑴快速称取0.1g氯金酸固体，溶于9.9g去离子水中，制得1%的氯金酸溶液备用；⑵称取２mg蛋白A溶于1mL去离子水中，配制成2mg/mL的蛋白A溶液；⑶称取1g BSA，加入99g去离子水，搅拌至完全溶解制成1%的BSA溶液。将全部溶液放入冰箱里4℃保存备用。
本发明采用纳米金晶体较高的比表面积、稳定性和导电性可以增大电极表面电子的转移和生物相容性，进而增大免疫传感器的响应电流；由功能化多壁碳、壳聚糖与普鲁士蓝复合制成三维纳米复合膜，与传统方法相比不但增大了传感器的电流响应以增大检测精度，更获得了具有大量氨基的共沉积膜，可为生物分子提供一个合适的亲水性环境。蛋白A分子可以固定地结合克百威单克隆抗体的Fc端，从而可以将抗体定向地固定在电极上使与农药特异性结合端暴露在表面上，进一步增大检测精度。
所述三维复合膜的制备工艺如下：⑴ MWNT-CTS修饰剂的制备：称取1mg预处理过的功能性MWNTs于0.3mL无水乙醇中超声分散,向其中加入1mL1.0%壳聚糖溶液，再超声分散8h，最后得到稳定的黑色分散液(MWNT-CTS修饰剂)，其中MWNTs浓度为0.769g/mL；⑵三维纳米复合膜的制备：将配制的MWCNTs-CTS与普鲁士蓝按体积比1：1混合，超声混合1h，所得溶液为功能化多壁碳-壳聚糖溶液-普鲁士蓝（MWCNTs-CTS-PB），将其放入冰箱里4℃保存备用。
具体实施方式
实施例：快速称取0.1g氯金酸固体，溶于9.9g去离子水中，制得1%的氯金酸溶液，固定在电极上，然后用PH=7.4的PBS缓冲液冲洗表面，氮气吹干；取10μL上述由功能化多壁碳、壳聚糖溶液、普鲁士蓝溶液制备好的三维纳米复合膜滴涂在固定过纳米金晶体的电极表面，常温下静置1.5h，然后用PH=7.4的PBS缓冲液冲洗表面，氮气吹干；上述制作好的电极晾干后，取10μL 2mg/mL的蛋白A溶液滴涂在电极上，常温下2h，然后用PH=7.4的PBS缓冲液冲洗表面。将制备好的电极浸入农药抗体中在4℃下浸泡8h，取出用PH=7.4的PBS缓冲液冲洗掉多余的液体，氮气吹干；将上述制备好的电极最后浸入1%的BSA溶液中37℃下静置2h，以封闭电极上非特异性结合位点，取出置于室温下晾干，免疫传感器的敏感界面制作完成，保存在4℃条件下备用。使用此敏感界面制作的免疫传感器灵敏度、选择性较高，其稳定性性和再生性良好。
[0014] 此构建方法操作工艺简单，成本较低，能提高免疫传感器的灵敏度、选择性等，符合我国免疫传感器制备方法发展和国际化的要求。
Claims (3)
1.一种检测农药残留的免疫传感器敏感界面的构建方法，其特征在于：免疫传感器的敏感界面组成为纳米金晶体 (DpAu)、由功能化多壁碳、普鲁士蓝、壳聚糖制作的三维纳米复合膜、蛋白A和BSA。
2.如权利要求1所述的一种检测农药残留的免疫传感器敏感界面的构建方法，其特征在于：纳米金晶体 (DpAu)其浓度为1%，蛋白A浓度为2mg/mL，BSA的浓度为１％。
3.如权利要求1所述的一种检测农药残留的免疫传感器敏感界面的构建方法，其特征在于：三维纳米复合膜的组成功能化多壁碳（MWNTs）0.769g/mL、酰基化壳聚糖（CTS）１mg/mL、普鲁士蓝溶液。
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