CN103169960A

CN103169960A - 免疫原性组合物

Info

Publication number: CN103169960A
Application number: CN2013100995763A
Authority: CN
Inventors: P.德内尔; J.普尔曼
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2006-03-30
Filing date: 2007-03-29
Publication date: 2013-06-26
Also published as: JP2009531387A; ZA200808246B; EA200801839A1; EP1998802A2; MX337528B; KR20080111115A; IL193565A; KR101541383B1; US20180104323A1; AU2011201158B2; MX2008012405A; EP2476434A1; EA015833B1; CR20150097A; AU2011201158A1; IL227934A; WO2007113222A3; SG170090A1; CA2647441A1; EP3141261A1

Abstract

本申请涉及包含来自金黄色葡萄球菌的、具有30-100%O-乙酰化的5型和/或8型荚膜多糖或寡糖的免疫原性组合物。也描述了疫苗、使用包含具有30-100%O-乙酰化的5型和/或8型荚膜多糖的免疫原性组合物的治疗方法以及制备所述免疫原性组合物的方法。

Description

免疫原性组合物

本申请为申请号为200780010414.0的分案申请，要求2006年3月30日的优先权。

技术领域

本发明涉及葡萄球菌免疫原性组合物和疫苗领域，它们的制备以及这些组合物在医学中的用途。更特别地，它涉及疫苗组合物，其包含来自金黄色葡萄球菌的5型和/或8型多糖，其中O-乙酰化的程度是30-100%。也提供了使用这些疫苗来治疗或预防葡萄球菌感染的方法。

背景

近年来，随着血管内设备的使用增加，在社区获得的和在医院获得的感染数量都已经增加。在医院获得的（医源性）感染是发病和死亡的主要原因，更特别是在美国，它们每年影响了超过200万患者。根据各种研究，美国患者的大约6%在他们住在医院期间将获得感染。估计1992年在美国的经济负担超过45亿美元（Emori和Gaynes，1993，Clin.Microbiol.Rev.6；428）。大多数频发感染是尿道感染（UTI-感染的33%），接下来是肺炎（15.5%），手术部位感染（14.8%）以及原发血流感染（13%）（Emori和Gaynes，1993，Clin.Microbiol.Rev.6；428）。

金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性的葡萄球菌（大多数是表皮葡萄球菌）、肠球菌种、大肠杆菌以及绿脓杆菌是主要的医源性病原体。尽管那些病原体差不多引起同样数量的感染，但是它们可引起的病症的严重性再加上抗生素抗性的分离菌的频率，使这个排位朝向金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌进行平衡，它们成为了最重要的医源性病原体。

金黄色葡萄球菌是有着显著发病率和死亡率的医源性感染的最通常原因（Romero-Vivas等人，1995，Infect.Dis.21；1417）。它是骨髓炎、心内膜炎、脓毒性关节炎、肺炎、脓肿以及中毒性休克综合征的一些病例的原因。

表皮葡萄球菌是正常的皮肤共生生物，也是引起植入的医疗设备的感染以及在手术部位的感染的重要机会致病菌。被金黄色葡萄球菌感染的医疗设备包括心脏起搏器、脑脊液分流器、连续流动的腹膜透析导管、整形外科设备以及人工心脏瓣膜。

用抗生素治疗金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌感染，青霉素是选择的药物，而万古霉素用于甲氧苯青霉素抗性的分离菌。自1980年代以来，对抗生素呈现广谱抗性的葡萄球菌菌株的百分比已经变得日益普遍（Panlilo等人，1992，Infect.Control.Hosp.Epidemiol.13；582），造成了对有效的抗菌治疗的威胁。此外，近来出现的万古霉素抗性的金黄色葡萄球菌已经引起了恐惧，害怕甲氧苯青霉素抗性的金黄色葡萄球菌菌株将会产生并扩散，对此还没有可用的有效治疗。

已经研究了在被动免疫疗法中使用抗葡萄球菌抗原的抗体这一备选方法。包括给予多克隆抗血清的疗法（WO00/15238，WO00/12132），以及用抗脂磷壁酸质的单克隆抗体进行治疗（WO98/57994）正在研发之中。

备选方法将是使用主动接种来产生对葡萄球菌的免疫应答。已经确定了用作疫苗组分而包含的几种候选物。这些候选物包括纤连蛋白结合蛋白（US5840846）、MHC II类似物（US5648240）、纤维蛋白原结合蛋白（US6008341）、GehD（US2002/0169288）、胶原蛋白结合蛋白（US6288214）、SdrF、SdrG和SdrH（WO00/12689）、突变SEA和SEB外毒素（WO00/02523）以及52kDa玻连蛋白结合蛋白（WO01/60852）。

金黄色葡萄球菌基因组已经被测序，并已经确定了许多编码序列（EP786519，WO02/094868）。对于表皮葡萄球菌同样如此（WO01/34809）。作为该方法的改进，其他人已经确定了被来自患有葡萄球菌感染的患者的超免疫血清所识别的蛋白（WO01/98499，WO02/059148）。

靶向金黄色葡萄球菌或靶向它所产生的外蛋白的疫苗的首次产生已经获得了有限成功（Lee1996Trends Microbiol.4；162）。仍然存在研发抗葡萄球菌感染的有效疫苗的需求。

附图说明

图1-用于包括在免疫原性组合物中的蛋白的多肽序列。表1提供了有关每个SEQ ID代表哪个蛋白的信息。

图2-编码用于包括在免疫原性组合物中的蛋白的核苷酸序列。表1提供了有关每个SEQ ID编码哪个蛋白的信息。

图3-天然条件下α毒素的纯化。图A显示了α毒素纯化期间所制备样品的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE。第1道-分子量标志，第2道-含有过量表达α毒素的可溶性级分，第3道-从Ni-NTA柱流过，第4道-用10%缓冲液B洗脱的级分，第5道-用20%缓冲液B洗脱的级分，第6道-用30%缓冲液B洗脱的级分，第7道-用50%缓冲液B洗脱的级分，第8道-用75%缓冲液B洗脱的级分，第9道和第10道-用100%缓冲液B洗脱的级分，第11道-诱导前在T=0时的细菌，第12道-诱导后在T=4小时的细菌，第13道-细胞溶胞产物，第14道-可溶性级分，第15道-不溶性级分。

图B显示了10、5、2和1μl纯化α毒素的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE。

图4-变性条件下的SdrC的纯化。图A显示了α毒素纯化期间所制备样品的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE。泳道M-分子量标志，泳道Start-由含有过量表达SdrC的不溶性级分所形成的上清液，泳道FT1-从Ni-NTA柱流过，泳道C-用洗涤缓冲液C洗脱的级分，泳道D-用缓冲液D洗脱的级分，道E-用缓冲液E洗脱的级分。

图B显示了1、2、5和10μl纯化SdrC的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE。

图5-在包被了纯化蛋白的平板中抗葡萄球菌蛋白抗血清的ELISA结果。

合并小鼠pre-使用提取自接种前小鼠的合并的血清的结果。合并小鼠Post III-使用免疫后提取的合并的小鼠血清的结果。合并兔pre-使用提取自接种前兔的合并的血清的结果。合并兔Post III-使用免疫后提取的合并的兔血清的结果。Blc-阴性对照。

图6-在包被了杀死的葡萄球菌的平板上产生的抗葡萄球菌蛋白的小鼠抗血清的ELISA结果。

图A使用由金黄色葡萄球菌血清型5的杀死的完整细胞所包被的平板。图B使用由金黄色葡萄球菌血清型8的杀死的完整细胞所包被的平板。图C使用由表皮葡萄球菌的杀死的完整细胞所包被的平板。

用方块符号标记的线显示使用来自小鼠的抗血清的ELISA结果，所述小鼠用所标明的葡萄球菌蛋白免疫三次。用菱形符号标记的线显示免疫前小鼠血清的ELISA结果。

图7-在包被了杀死的葡萄球菌的平板上产生的抗葡萄球菌蛋白的兔抗血清的ELISA结果。

用方块符号标记的线显示使用来自兔的抗血清的ELISA结果，所述小鼠用所标明的葡萄球菌蛋白免疫三次（HarA除外，其中仅仅给出了一次免疫）。用菱形符号标记的线显示免疫前兔血清的ELISA结果。

详细描述

本发明公开了免疫原性组合物，其包含金黄色葡萄球菌5型和/或8型多糖，其中5型和/或8型荚膜多糖或寡糖是30%-100%乙酰化的。在特定实施方案中，本发明的免疫原性组合物还包含PNAG或葡萄球菌蛋白。PNAG在革兰氏阳性菌中是高度保守的，提供了抗大范围的细菌的保护，而5型和8型多糖是引起抗大多数金黄色葡萄球菌菌株的免疫应答的有效免疫原，金黄色葡萄球菌是医源性感染最通常的原因。

多糖

本发明的免疫原性组合物包含PNAG和来自金黄色葡萄球菌的5型和8型多糖，其中之一或这两者是30%-100%乙酰化的。

聚N-乙酰化葡糖胺（PNAG）

PNAG是多糖胞间粘附素，由任选被N-乙酰和O-琥珀酰成分取代的β-（1→6）连接的葡糖胺的聚合物组成。该多糖存在于金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌两者中，能够从所述任一来源分离（Joyce等人，2003，Carbohydrate Research338；903；Maira-Litran等人，2002，Infect.Imun.70；4433）。例如，PNAG可从金黄色葡萄球菌菌株MN8m分离（WO04/43407）。dPNAG的制备描述于WO04/43405。

该多糖在以前被称为聚-N-琥珀酰-β-（1→6）-葡糖胺（PNSG），最近显示它不具有预期结构，因为确定了N-琥珀酰化是不正确的（Maira-Litran等人，2002，Infect. Imun. 70；4433）。因此，以前称为PNSG而现在发现是PNAG的多糖也被术语PNAG所包括。

PNAG可以是不同大小的由最多达30个重复单元（任选被N-乙酰和O-琥珀酰成分取代的β-（1→6）连接的葡糖胺的重复单元）所组成的寡糖，从超过400kDa、到75和400kDa之间、到10和75kDa之间变化。任何大小的PNAG多糖或寡糖都可用于本发明的免疫原性组合物中，例如可以使用超过40kDa的大小。大小分级可通过现有技术中已知的任何方法来获得，例如通过微流化、超声照射或者通过化学裂解（WO03/53462，EP497524，EP497525）。

PNAG的大小范围是例如40-400kDa、50-350kDa、40-300kDa、60-300kDa、50-250kDa和60-200kDa。

PNAG可由于氨基被乙酸酯取代而具有不同程度的乙酰化。体外产生的PIA几乎在氨基上被全部取代（95-100%）。作为选择，可以使用脱乙酰化的PNAG，其具有少于50%、40%、30%、20%、10%或5%的N-乙酰化。使用脱乙酰化PNAG使得能够调理性杀死革兰氏阳性菌，任选金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌（WO04/43405）。在一个实施方案中，PNAG具有40kDa和300kDa之间的大小并且是脱乙酰化的，使得少于50%、40%、30%、20%、10%或5%氨基被乙酰化。

术语脱乙酰化的PNAG（dPNAG）是指少于50%、40%、30%、20%、10%或5%的氨基被乙酰化的PNAG多糖或寡糖。

如本文使用的，术语PNAG包括乙酰化的和脱乙酰化形式的该糖。

在一种实施方案中，通过化学处理天然多糖来使PNAG脱乙酰化以形成dPNAG。例如，用碱性溶液处理天然PNAG，以使得pH上升到超过10。例如用0.1-5M、0.2-4M、0.3-3M、0.5-2M、0.75-1.5M或1M NaOH、KOH或NH₄OH处理PNAG。处理进行至少10或30分钟，或者1、2、3、4、5、10、15或20小时，温度在20-100、25-80、30-60或30-50或35-45℃。可按照WO04/43405的描述来制备dPNAG。

在一种实施方案中，包括在本发明免疫原性组合物中的多糖被如下文所述缀合到载体蛋白上，或者作为选择，不被缀合。

来自金黄色葡萄球菌的5型和8型多糖

在人体中引起感染的大多数金黄色葡萄球菌菌株含有5型或8型多糖。大约60%的人菌株是8型，大约30%是5型。5型和8型荚膜多糖抗原的结构描述于Moreau等人，Carbohydrate Res.201；285（1990）以及Fournier等人，Infect.Immun.45；87（1984）中。两者都在它们的重复单元中具有FucNAcp以及具有ManNAcA，可用于引入巯基。

最近（Jones Carbohydrate Research340，1097-1106（2005））NMR谱将荚膜多糖的结构修正为：

5型

→4）-β-D-ManNAcA-（1→4）-α-L-FucNAc（3OAc）-（1→3）-β-D-FucNAc-（1→

8型

→3）-β-D-ManNAcA（4OAc）-（1→3）-α-L-FucNAc（1→3）-α-D-FucNAc（1→

可以使用本领域技术人员公知的方法从合适的金黄色葡萄球菌菌株中提取多糖，例如按照US6294177或Infection and Immunity（1990）58（7）；2367中的描述。例如，ATCC12902是5型金黄色葡萄球菌菌株，ATCC12605是8型金黄色葡萄球菌菌株。

多糖是天然大小，或者作为选择可以通过例如微流化、超声照射或者通过化学处理进行大小分级。本发明也包括衍生自金黄色葡萄球菌5型和8型多糖的寡糖。

包括在本发明免疫原性组合物中的5型和/或8型荚膜多糖或寡糖是O-乙酰化的。在一个实施方案中，5型荚膜多糖或寡糖的O-乙酰化程度是10-100%、20-100%、30-100%、40-100%、50-100%、60-100%、70-100%、80-100%、90-100%、50-90%、60-90%、70-90%或80-90%。在一个实施方案中，8型荚膜多糖或寡糖的O-乙酰化程度是10-100%、20-100%、30-100%、40-100%、50-100%、60-100%、70-100%、80-100%、90-100%、50-90%、60-90%、70-90%或80-90%。在一个实施方案中，5型和8型荚膜多糖或寡糖的O-乙酰化程度是10-100%、20-100%、30-100%、40-100%、50-100%、60-100%、70-100%、80-100%、90-100%、50-90%、60-90%、70-90%或80-90%。

可以通过本领域已知的任何方法，例如，通过质子MMR（Lemercinier和Jones1996，Carbohydrate Resarch296；83-96，Jones和Lemercinier2002，J Pharmaceutical and Biomedical analysis30；1233-1247，WO05/033148或WO00/56357）确定多糖或寡糖的O-乙酰化程度。另一种常用的方法是Hestrin（1949）J.Biol.Chem.180；249-261描述的方法。

可以通过水解除去O-乙酰基，例如，通过用诸如无水酰肼的碱处理（Konadu等人，1994；Infect.Immun.62；5048-5054）或用0.1N NaOH处理1-8小时。为了保持5型和/或8型多糖或寡糖上的高水平O-乙酰化，使将导致O-乙酰基水解的处理最少化。例如，使在极端pH的处理最少化。

包括在本发明免疫原性组合物中的5型和8型多糖任选被如下文所述缀合到载体蛋白上，或者作为选择，不被缀合。

作为选择，本发明的免疫原性组合物含有5型或8型多糖。

金黄色葡萄球菌336抗原

在一种实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含US6294177中描述的金黄色葡萄球菌336抗原。

336抗原包含β-连接的己糖胺，不含O-乙酰基，并且特异性结合到针对保藏为ATCC55804的金黄色葡萄球菌336型的抗体上。

在一种实施方案中，336抗原是天然大小，或者作为选择可以通过例如微流化、超声照射或者通过化学处理进行大小分级。本发明也包括来源于336抗原的寡糖。

包括在本发明免疫原性组合物中的336抗原任选被如下文所述缀合到载体蛋白上，或者作为选择，不被缀合。

来自表皮葡萄球菌的I、II和III型多糖

表皮葡萄球菌菌株ATCC-31432、SE-360和SE-10的特征分别在于三种不同的荚膜I、II和III型（Ichiman和Yoshida1981，J.Appl.Bacteriol.51；229）。提取自每种表皮葡萄球菌血清型的荚膜多糖构成I、II和III型多糖。可以通过几种方法提取多糖，包括描述于US4197290中的方法或者按照Ichiman等人，1991，J.Appl.Bacteriol.71；176中所描述的方法。

在本发明的一个实施方案中，免疫原性组合物包含来自表皮葡萄球菌的I和/或II和/或III型多糖或寡糖。

多糖是天然大小，或者作为选择可以通过例如微流化、超声照射或者通过化学裂解进行大小分级。本发明也包括提取自表皮葡萄球菌菌株的寡糖。

这些多糖不被缀合，或者任选地被如下所述进行缀合。

多糖的缀合

在与疫苗接种中使用多糖相关的问题中，其中之一是多糖本身为弱免疫原的这一事实。已经设计来克服这一免疫原性缺乏的策略包括将多糖连接到大的蛋白载体上，其提供了旁观T细胞辅助。在一个实施方案中，将本发明所利用的多糖连接到提供旁观T细胞辅助的蛋白载体上。目前用于与多糖或寡糖免疫原偶联的这些载体的例子包括白喉和破伤风类毒素（DT、DT Crm197和TT）、匙孔血蓝蛋白（KLH）、绿脓杆菌外蛋白A（rEPA）和结核菌素的纯化蛋白衍生物（PPD）、来自流感嗜血杆菌的蛋白D、肺炎球菌溶血素或者上述任何之一的片段。适合使用的片段包括含有T辅助表位的片段。特别地，蛋白D片段将任选包含蛋白的N末端1/3。蛋白D是来自流感嗜血杆菌的IgD结合蛋白（EP0594610B1）。

在本发明的免疫原性组合物中使用的备选载体蛋白是单一的葡萄球菌蛋白或其片段或其融合蛋白，其包含至少或正好1、2、3或4种或者更多下面部分所列出的葡萄球菌蛋白或其片段。

特别有利于使用在葡萄球菌疫苗中的新载体蛋白是葡萄球菌α类毒素。可将天然形式缀合到多糖上，因为缀合步骤降低了毒性。任选地将遗传去毒的α毒素诸如His35Leu或His35Arg变体用作载体，因为残留毒性更低。作为选择，通过用交联试剂、甲醛或戊二醛处理将α毒素化学去毒。遗传去毒的α毒素被任选化学去毒，任选通过用交联试剂、甲醛或戊二醛处理以进一步降低毒性。

可通过任何已知方法将多糖连接到载体蛋白上（例如通过Likhite的美国专利4,372,945，Armor等人的美国专利4,474,757以及Jennings等人的美国专利4,356,170）。任选地，实施CDAP缀合化学（参见WO95/08348）。

在CDAP中，氰化试剂1-氰基-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐（CDAP）被任选用于多糖-蛋白缀合物的合成。氰化反应可以在相对温和的条件下进行，这避免了碱敏感性的多糖的水解。这种合成法使得能够直接偶联到载体蛋白上。

可将多糖溶于水中或盐溶液中。可将CDAP溶解在乙腈中，立即加入到多糖溶液中。CDAP与多糖的羟基反应形成氰酸酯。反应步骤之后，加入载体蛋白。赖氨酸的氨基与活化的多糖反应形成异脲共价连接。偶联反应之后，然后加入大大过量的甘氨酸以淬灭残留的活化官能团。然后将产物通过凝胶渗透柱以去除未反应的载体蛋白和残留试剂。

蛋白

本发明的免疫原性组合物任选进一步包含葡萄球菌蛋白，例如，来自金黄色葡萄球菌或者表皮葡萄球菌的蛋白。本发明的一些实施方案含有来自金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌两者的蛋白。

本发明的免疫原性组合物包含分离的蛋白，其包含与图1的任意序列具有至少85%同一性、任选至少90%同一性、至少95%同一性、至少97-99%或完全同一性的氨基酸序列。

本文在明确提及蛋白时，任选指天然或重组的、全长蛋白或者任选地已经去除了任何信号序列的成熟蛋白。蛋白可直接从葡萄球菌菌株中分离或者通过重组DNA技术生产。可将蛋白的免疫原性片段加入到本发明的免疫原性组合物中。这些片段是包含从蛋白的氨基酸序列连续选取的至少10个氨基酸、至少20个氨基酸、至少30个氨基酸、至少40个氨基酸、至少50个氨基酸、或至少100个氨基酸的片段。此外，这样的免疫原性片段典型地是与针对葡萄球菌蛋白而产生的抗体有免疫反应的，或者是与通过用葡萄球菌感染哺乳动物宿主而产生的抗体有免疫反应的，或者含有T细胞表位。在一个实施方案中，免疫原性片段也包括以有效剂量给予时，（单独或者作为结合到载体上的半抗原），引起抗葡萄球菌感染的保护性免疫应答的片段，任选是对金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌感染有保护性的。这样的免疫原性片段可包括例如缺少N末端前导序列、和/或跨膜结构域和/或C末端锚定结构域的蛋白。在一个实施方案中，根据本发明的免疫原性片段包含蛋白基本上所有的胞外结构域，所述蛋白在片段序列的整个长度上具有与选自图1的序列的至少85%、90%、95%、97或99%同一性。

在一种实施方案中，本发明的免疫原性组合物可含有葡萄球菌蛋白或者葡萄球菌蛋白的片段的融合蛋白。这样的融合蛋白可以重组制备，并且可包含至少2、3、4、5或6种葡萄球菌蛋白的一个部分，例如下文列出的葡萄球菌蛋白的组合。作为选择，融合蛋白可包含至少2、3、4或5种葡萄球菌蛋白的多个部分。这些融合蛋白可以将不同的葡萄球菌蛋白或其片段组合到同一蛋白中。作为选择，本发明也包括葡萄球菌蛋白或其片段的单个的融合蛋白，作为与异源序列诸如T细胞表位或纯化标志的提供者的融合蛋白，所述T细胞表位或纯化标志例如：β-半乳糖苷酶，谷胱苷肽-S-转移酶，绿色荧光蛋白（GFP），表位标志诸如FLAG、myc标志、聚组氨酸，或者病毒表面蛋白诸如流感病毒血凝素，或者细菌蛋白诸如破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197。融合蛋白可以存在于本发明的免疫原性组合物中，作为游离蛋白，或它可以是与糖连接的载体蛋白。

蛋白

在一种实施方案中，本发明的免疫原性组合物进一步包含一种或多种下面提及的蛋白或其免疫原性片段。许多所述蛋白落入胞外成分结合蛋白、转运蛋白或者毒素以及毒力调节剂的范畴。本发明的免疫原性组合物任选进一步包含葡萄球菌胞外成分结合蛋白或者葡萄球菌转运蛋白或者葡萄球菌毒素或毒力调节剂。本发明的免疫原性组合物任选包含至少或正好1、2、3、4、5或6种葡萄球菌蛋白。

表1

下表列出了分别在图1和图2中发现的优选蛋白序列和DNA序列的SEQ ID号。SA表示来自金黄色葡萄球菌的序列，SE表示来自表皮葡萄球菌的序列。

胞外成分结合蛋白

胞外成分结合蛋白是结合宿主胞外成分的蛋白。该术语包括但不限于粘附素。

胞外成分结合蛋白的例子包括层粘连蛋白受体（Naidu等人，J.Med.Microbiol.1992，36；177），SitC/MntC/唾液结合蛋白（US5801234，Wiltshire和Foster Infec.Immun.2001，69；5198），EbhA（Williams等人，Infect.Immun.2002，70；6805），EbhB，弹性蛋白结合蛋白（EbpS）（Park等人，1999，J.Biol.Chem.274；2845），EFB（FIB）（Wastfelt和Flock1995，J.Clin.Microbiol.33；2347），SBI（Zhang等人，FEMSImmun.Med.Microbiol.2000，28；211），自溶素（Rupp等人，2001，J.Infect.Dis.183；1038），ClfA（US6008341，McDevitt等人，Mol.Microbiol.1994，11；237），SdrC，SdrG（McCrea等人，Microbiology2000，146；1535），SdrH（McCrea等人，Microbiology2000，146；1535），脂肪酶GehD（US2002/0169288），SasA（Roche等人，Microbiology2003，149；643），SasC（Roche等人，Microbiology2003，149；643），SasK（Roche等人，Microbiology2003，149；643），FnbA（Flock等人，Mol Microbiol.1994，12；599，US6054572），FnbB（WO97/14799，Booth等人，2001Infec.Immun.69；345），胶原结合蛋白Cna（Visai等人，2000，J.Biol.Chem.275；39837），ClfB（WO99/27109），SdrD（WO99/27109），SdrE（WO99/27109），FbpA（Phonimdaeng等人，1988J.Gen Microbiol.134；75），Npase（Flock2001J.Bacteriol.183；3999），IsaA/PisA（Lonenz等人，FEMS Immuno.Med.Microbiol.2000，29；145），SsaA（Lang等人，FEMS Immunol.Med.Microbiol.2000，29；213），EPB（Hussain and Hermann symposium on Staph Denmark14-17th2000），SSP-1（Veenstra等人，1996，J.Bacteriol.178；537），SSP-2（Veenstra等人，1996，J.Bacteriol.178；537）,17kDa肝素结合蛋白HBP（Fallgren等人，2001，J.Med.Microbiol.50；547），玻连蛋白结合蛋白（Li等人，2001，Curr.Microbiol.42；361），纤维蛋白原结合蛋白，凝固酶，Fig（WO97/48727）以及MAP（US5648240）。

SitC/MntC/唾液结合蛋白

这是ABC转运蛋白，它是肺炎葡萄球菌粘附素PsaA的同源物。它是高度免疫原性的32kDa脂蛋白，分布在整个细菌细胞壁（Cockayne等人，Infect.Immun.199866；3767）。它在金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌中表达为32kDa脂蛋白，40kDa同源物存在于人葡萄球菌中。在表皮葡萄球菌中，它是铁调节的操纵子的成分。它显示了与包括副血链球菌的FimA在内的粘附素有相当高的同源性，以及与具有证实的或推定的金属铁转运功能的ABC转运蛋白家族的脂蛋白具有相当高的同源性。因此SitC被包括为胞外结合蛋白和金属离子转运蛋白。

披露于US5,801,234的唾液结合蛋白也是SitC的形式，可被包括在本发明的免疫原性组合物中。

ClfA和ClfB

这两种蛋白都具有纤维蛋白原结合活性，在存在血浆时引起金黄色葡萄球菌形成簇。它们含有细胞壁相关蛋白所共有的LPXTG基序。

ClfA描述于US6008341，ClfB描述于WO99/27109。

凝固酶（FbpA）

这是一种纤维蛋白原结合蛋白，在存在血浆时引起金黄色葡萄球菌形成簇。它描述于涉及到凝固酶的参考文献中：Phonimdaeng等人，（J.Gen.Microbio.1988，134:75-83），Phonimdaeng等人（Mol Microbiol1990；4:393-404），Cheung等人（Infect Immun1995；63:1914-1920）以及Shopsin等人（J.CLin.Microbiol.2000；38:3453-3456）。在一种实施方案中，包含在本发明的免疫原性组合物中的片段包括已经去除信号肽（C末端27个氨基酸）的成熟蛋白。

凝固酶具有三个不同的结构域。氨基酸59-297是卷曲螺旋区，氨基酸326-505是富含脯氨酸和甘氨酸的区域，从氨基酸506到645的C末端结构域具有β折叠构象。这些结构域的每一个都是可以加入到本发明的免疫原性组合物中的片段。

SdrG

该蛋白描述于WO00/12689。SdrG在凝固酶阴性的葡萄球菌中被发现，是含有LPXTG序列的细胞壁相关蛋白。

SdrG含有信号肽（氨基酸1-51）、含有纤维蛋白原结合位点和胶原蛋白结合位点的区域（氨基酸51-825）、两个CnaB结构域（氨基酸627-698和738-809）、SD重复区（氨基酸825-1000）以及锚定结构域（氨基酸1009-1056）。

在一种实施方案中，SdrG的片段包括已经去除了信号肽和/或SD重复序列以及锚定结构域的多肽。这些包括包含以下氨基酸或者由以下氨基酸组成的多肽：SEQ ID NO:70或20或21的氨基酸50-825、氨基酸50-633、氨基酸50-597（WO03/76470的SEQ ID NO2）、氨基酸273-597（WO03/76470的SEQ ID NO4）、氨基酸273-577（WO03／76470的SEQ ID NO6)、氨基酸1—549、氨基酸219—549、氨基酸225—549、氨基酸219—528、氨基酸225—528。

任选地，将与SEQ ID NO：70、20或21的序列具有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或100％同源性的SdrG多肽加入到本发明的免疫原性组合物中。

本发明的组合物任选包含上述SdrG多肽的片段。

在一种实施方案中，片段已经去除了信号肽和／或SD重复结构域和／或锚定结构域。例如对应于SEQ ID70的氨基酸1—713、1—549、225—549、225—529、24—717、1—707、1—690、1—680、1—670、1—660、1—650、1—640、1—630、1—620、1—610、1—600、34—707、44—697、36—689的序列或者与SEQ ID 70或20或21具有85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

在一种实施方案中，去除了信号肽的片段在片段的N末端具有甲硫氨酸残基以确保正确翻译。

在一种实施方案中，该片段具有下面的序列：

MEENSVQDVKDSNTDDELSDSNDQSSDEEKNDVINNNQSINTDDNNQIIKKEETNNYDGIEKRSEDRTESTTNVDENEATFLQKTPQDNTHLTEEEVKESSSVESSNSSIDTAQQPSHTTINREESVQTSDNVEDSHVSDFANSKIKESNTESGKEENTIEQPNKVKEDSTTSQPSGYTNIDEKISNQDE

LLNLPINEYENKARPLSTTSAQPSIKRVTVNQLAAEQGSNVNHLIKVTDQSITEGYDDSEGVIKAHDAENLIYDVTFEVDDKVKSGDTMTVDIDKNTVPSDLTDSFTIPKIKDNSGEIIATGTYDNKNKQITYTFTDYVDKYENIKAHLKLTSYIDKSKVPNNNTKLDVEYKTALSSVNKTITVEYQRPNENRTANLQSMFTNIDTKNHTVEQTIYINPLRYSAKETNVNISGNGDEGST

IIDDSTIIKVYKVGDNQNLPDSNRIYDYSEYEDVTNDDYAQLGNNNDVNINFGNIDSPYIIKVISKYDPNKDDYTTIQQTVTMQTTINEYTGEFRTASYDNTIAFSTSSGQGQGDLPPEKTYKIGDYVWEDVDKDGIQNTNDNEKPLSNVLVTLTYPDGTSKSVRTDEDGKYQFDGLKNGLTYKITFETPEGYTPTLKHSGTNPALDSEGNSVWVTINGQDDMTIDSGFYQTPKYSLGNY

VWYDTNKDGIQGDDEKGISGVKVTLKDENGNIISTTTTDENGKYQFDNLNSGNYIVHFDKPSGMTQTTTDSGDDDEQDADGEEVHVTITDHDDFSIDNGYYDDE

EbhA和EbhB

EbhA和EbhB是在金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌两者中都表达的蛋白(Clarke和Foster Infect．Immun．2002，70；6680，Williams等人，Infect．Immun．2002，20；6805)，它们结合到纤连蛋白。由于纤连蛋白是胞外基质的重要成分，EbhA和EbhB在将葡萄球菌粘附到胞外基质方面具有重要功能。

Ebh蛋白较大，具有1．1兆道尔顿的分子量。由于生产和配制的容易性，使用Ebh蛋白的片段而不是完整序列是有利的。蛋白的中部区域含有不完全重复序列，其含有纤连蛋白结合位点。下述含有一个或多个重复结构域的片段是适用于加入到本发明的免疫原性组合物中的片段。

Ebh蛋白含有127个氨基酸长度的不完全重复单元，其特征在于含有共有序列：

L.G.{10}A.{13}Q.{26}L...M..L.{33}A

或

.{19}L.G.{10}A.{13}Q.{26}L...M..L.{33}A.{12}

或

.....I/V..A...I/V..AK.ALN/DG..NL..AK..A.{6}L..LN.AQK..L..QI/V..A..V..V.{6}A..LN/D.AM..L...I/V.D/E...TK.S.NY/F.N/DAD..K..AY/F..AV..A..I/V.N/D.......

其中“.”代表任意氨基酸，“.{10}”代表任意10个氨基酸，I/V表示氨基酸的备选。

参考Kuroda等人（2001）Lancet357；1225-1240中披露的序列以及表2，很容易推知Ebh蛋白中的重复序列。

在一个实施方案中，包括在本发明的免疫原性组合物中的片段包括含有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或超过10个的127个氨基酸的重复单元的蛋白。这样的片段可以由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多的127个氨基酸的重复区的重复序列所组成，或者可以由在片段的任一末端或两个末端带有额外氨基酸残基的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多的重复序列所组成。任选地，该片段是跨越三个重复序列（氨基酸3202-3595）的大约44kDa的H2多肽，如Clarke等人，Infection and Immunity70，6680-6687，2002中所描述的。这样的片段将任选能够结合纤连蛋白和/或诱导对整个Ebh蛋白有反应性的抗体。

Ebh蛋白能够结合纤连蛋白。在一种实施方案中，这些多肽序列的片段保持了结合到纤连蛋白的能力。可通过由Clarke等人，（Infectionand Immunity70；6680-66872002）所描述的ELISA来评估对纤连蛋白的结合。

在一种实施方案中，片段是那些包含B细胞或T辅助细胞表位的片段，例如表3和4中描述的那些片段/肽。

表2.Ebh全长序列中的重复序列。

Ebh全长序列披露于Kuroda等人（2001）Lancet357；1225-1240。下表显示了127个氨基酸的重复序列在全长序列中开始和结束位置的氨基酸残基。

表3．对127个氨基酸的重复序列的B细胞表位预测：

全长序列披露于Kuroda等人(2001)Lancet357；1225—1240。选择这些重复序列中序列的一个由全长序列的氨基酸3204—3331所编码的重复序列来进行表位预测：

开始	结束	表位序列	起始	终止
					5	10	TVNQKA	3208	3213
14	19	KSTKDA	3217	3222
					21	33	DGQQNLQRAKTEA	3224	3236
42	51	DLNQAQKNAL	3245	3254
					66	74	DIKQTTQSL	3269	3277
100	112	ADTNKKNDYNNAY	3303	3315
					117	123	DIINGNA	3320	3326

-“开始”和“结束”栏代表所预测的B细胞表位在127个氨基酸的重复序列中的位置

-“起始”和“终止”栏代表所预测的B细胞表位在Ebh全长序列中的位置

表4Ebh中的T辅助细胞表位预测：

全长序列披露于TrEMBL数据库，序列索引Q8NWQ6。选择这些重复序列中的一个由全长序列的氨基酸3204-3331所编码的重复序列来进行表位预测：

-“重复序列中的位置”栏表示所预测的T细胞表位在重复序列中的位置

-“序列中的位置”栏表示所预测的T细胞表位在Ebh全长序列中的位置

可以使用本发明的蛋白的片段通过肽合成来生产相应的全长多肽；因此，这些片段可被用作生产本发明的全长蛋白的中间体。

在一种实施方案中，使用变体，其中几个、5-10、1-5、1-3、1-2或1个氨基酸以任意组合被取代、缺失或添加。

弹性蛋白结合蛋白（EbpS）

EbpS是含有486个氨基酸的分子量83kDa的蛋白。它与金黄色葡萄球菌的细胞质膜相关联，具有三个将蛋白保持在膜中的疏水区（Downer等人，2002，J.Biol.Chem.277；243；Park等人，1996，J.Biol.Chem.271；15803）。

氨基酸1-205和343-486之间的两个区域是在细胞质膜外表面上表面暴露的。EbpS的配体结合结构域位于N末端的残基14-34之间（Park等人，1999，J.Biol.Chem.274；2845）。

在一种实施方案中，加入到本发明的免疫原性组合物中的片段是含有弹性蛋白结合区域的表面暴露片段（氨基酸1-205）。任选地，片段不含完整的暴露环，但是应当含有弹性蛋白结合区域（氨基酸14-34）。能够使用的作为选择的片段由形成第二表面暴露环的氨基酸组成（氨基酸343-486）。在一端或两端含有最多1、2、5、10、20、50个氨基酸的作为选择的片段也是可能的。

层粘连蛋白受体

金黄色葡萄球菌的层粘连蛋白受体在致病性方面起着重要作用。感染的典型特征就是允许广泛的转移性脓肿形成的血流侵袭。血流侵袭需要通过血管基底膜外渗的能力。这是通过层粘连蛋白受体结合到层粘连蛋白而实现的（Lopes等人，Science1985，229；275）。

层粘连蛋白是表面暴露的，存在于葡萄球菌的许多菌株包括金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌中。

SBI

Sbi是除了蛋白A之外的第二IgG结合蛋白，它在大多数金黄色葡萄球菌菌株中表达（Zhang等人，1998，Microbiology144；985）。

Sbi序列的N末端具有典型的信号序列，在氨基酸29之后带有切割位点。因此可以用于本发明的免疫原性组合物中的Sbi的片段在氨基酸残基30、31、32或33处开始，延续到Sbi的C末端，例如SEQ IDNO:26。

已经将Sbi的IgG结合结构域确定为从氨基酸41-92朝向蛋白N末端的区域。这个结构域与蛋白A的IgG结合结构域同源。

Sbi的最小IgG结合结构域含有下面的序列：

QTTQNNYVTDQQKAFYQVLHLKGITEEQRNQYIKTLREHPERAQEVFSESLK

** *** * *** * * * * *

*-表示在IgG结合结构域之间相似的氨基酸

在一种实施方案中，包括在本发明的免疫原性组合物中的Sbi片段含有IgG结合结构域。该片段含有IgG结合结构域的共有序列，如上面序列中所示的由*标明的。任选地，片段含有上面所示的完整序列或者由上面所示的完整序列组成。任选地，片段含有Sbi，例如SEQ IDNO:26的氨基酸30-92、33-92、30-94、33-94、30-146、33-146、30-150、33-150、30-160、33-160、33-170、33-180、33-190、33-200、33-205或33-210，或由上述氨基酸组成。

片段可含有来自所指序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸的取代。

片段可含有IgG结合结构域的多个重复序列（2、3、4、5、6、7、8、9或10个）。

EFB-FIB

Fib是19kDa纤维蛋白原结合蛋白，它由金黄色葡萄球菌分泌到胞外基质中。所有测试的金黄色葡萄球菌分离物都产生它（Wastfelt和Flock1995，J.Clin.Microbiol.33；2347）。

金黄色葡萄球菌在存在纤维蛋白原时成簇并结合到纤维蛋白原包被的表面。该能力有助于导管和内皮细胞的葡萄球菌集群。

Fib在蛋白的N末端含有信号序列，在大约氨基酸30处带有推定的切割位点。在一种实施方案中，本发明的免疫原性组合物中含有成熟蛋白的序列（从大约氨基酸30到蛋白的C末端）或由其组成。

Fbe-EfB/FIG

Fbe是在表皮葡萄球菌的许多分离物中发现的纤维蛋白原结合蛋白，具有119kDa的推断分子量（Nilsson等人，1998.Infect.Immun.66；2666）。它的序列与金黄色葡萄球菌的聚集因子（ClfA）的序列相关。抗Fbe的抗体可阻断表皮葡萄球菌结合到纤维蛋白原包被的平板和导管上（Pei和Flock2001，J.Infect.Dis.184；52）。

Fbe具有推定的信号序列，在氨基酸51和52之间带有切割位点。因此Fbe的可能片段含有Fbe的成熟形式，从氨基酸52延续到C末端（氨基酸1092）。

Fbe从氨基酸52到氨基酸825的结构域负责纤维蛋白原结合。在一种实施方案中，Fbe的片段由氨酸52-825组成或包含氨酸52-825。

Fbe的氨基酸373和516之间的区域显示了Fbe和ClfA之间的最大保守性。在一种实施方案中，片段含有Fbe的氨基酸373-516。

Fbe的氨基酸825-1041含有高度重复区，由串联重复的天冬氨酸和丝氨酸残基组成。

IsaA/PisA

IsaA是29kDa蛋白，也称为PisA，已经显示出它是医院患者脓毒症期间的免疫优势的葡萄球菌蛋白（Lorenz等人，2000，FEMS Immunol.Med.Microb.29；145）。

IsaA序列的开头29个氨基酸被认为是信号序列。在一种实施方案中，包括在本发明的免疫原性组合物中的IsaA的片段含有从氨基酸残基30起到编码序列的末端。

纤连蛋白结合蛋白

纤连蛋白结合蛋白A含有参与结合纤连蛋白的几个结构域（WO94/18327）。这些结构域被称为D1、D2、D3和D4。在一种实施方案中，纤连蛋白结合蛋白A或B的片段包含D1、D2、D3、D4、D1-D2、D2-D3、D3-D4、D1-D3、D2-D4或D1-D4或由其组成。

纤连蛋白结合蛋白含有36个氨基酸的信号序列。例如：

VKNNLRYGIRKHKLGAASVFLGTMIVVGMGQDKEAA

任选地，缺失该信号序列的成熟蛋白包括在本发明的免疫原性组合物中。

转运蛋白

革兰氏阳性菌的细胞壁作为屏障来防止代谢物自由扩散到细菌中。一个家族的蛋白协同形成了必需养分进入细菌的通道，因此对于细菌生存是必需的。术语转运蛋白包括参与结合到代谢物诸如铁的初始步骤的蛋白以及参与将代谢物事实上转运到细菌中的那些蛋白。

分子铁对于细菌生长来说是必需的辅助因子。分泌结合游离铁的铁载体，然后被递送铁的细菌表面受体捕获来转运通过细胞质膜。铁的采集对于确定人感染来说是关键的，以便针对该类蛋白的免疫应答的产生能够导致葡萄球菌生存力的丧失。

转运蛋白的例子包括免疫优势的ABC转运蛋白（Burnie等人，2000Infect.Imun.68；3200），IsdA（Mazmanian等人，2002PNAS99；2293），IsdB（Mazmanian等人，2002PNAS99；2293），Mg²⁺转运蛋白，SitC（Wiltshire和Foster2001Infect.Immun.69；5198）以及Ni ABC转运蛋白。

免疫优势的ABC转运蛋白

免疫优势的ABC转运蛋白是有良好保守性的蛋白，它可能能够产生抗不同葡萄球菌菌株的交叉保护性的免疫应答（Mei等人，1997，Mol.Microbiol.26；399）。抗这种蛋白的抗体已经在患有败血症的患者中发现（Burnie等人，2000，Infect.Immun.68；3200）。

免疫优势的ABC转运蛋白的任选片段将包括肽DRHFLN、GNYD、RRYPF、KTTLLK、GVTTSLS、VDWLR、RGFL，、KIKVYVGNYDFWYQS、TVIVVSHDRHFLYNNV和/或TETFLRGFLGRMLFS，因为这些序列含有被人免疫系统识别的表位。

IsdA-IsdB

金黄色葡萄球菌的isd基因（铁调节的表面决定簇）编码负责血红蛋白结合以及传递血红素铁到细胞质的蛋白，它在这里作为必需养分。IsdA和IsdB位于葡萄球菌的细胞壁中。IsdA似乎被暴露在细菌表面上，因为它对蛋白酶K消化是敏感的。IsdB被部分消化，表明它部分暴露在细菌表面上（Mazmanian等人，2003Science299；906）。

IsdA和IsdB都是结合血红素的29kDa蛋白。它们的表达通过Fur阻抑物而被铁的可获得性所调节。它们的表达在铁浓度低的宿主感染期间将是高的。

它们也被称为FrpA和FrpB（Morrissey等人，2002，Infect.Immun.70；2399）。FrpA和FrpB是带有高电荷的主要表面蛋白。已经显示它们提供了粘附到塑料的主要贡献。

在一种实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含IsdA和/或IsaB片段，其描述在WO01/98499或WO03/11899中。

毒素和毒力调节剂

这个蛋白家族的成员包括毒素诸如α毒素、溶血素、肠毒素B和TSST-1以及调节毒素产生的蛋白诸如RAP。

α毒素（Hla）

α毒素是由大多数金黄色葡萄球菌菌株产生的重要毒力决定因素。它是具有溶血活性的孔形成毒素。已经显示抗α毒素的抗体中和动物模型中α毒素的有害和致命效应（Adlam等人，1977Infect.Immun.17；250）。人血小板、内皮细胞和单核细胞对α毒素的效应是敏感的。

α毒素的高毒性要求其在作为免疫原使用之前应当脱毒。这可以通过化学处理实现，例如通过用甲醛、戊二醛或其它交联试剂处理或者通过将它化学缀合到如下所述的细菌多糖上。

除去毒性的进一步的方式是引入除去毒性同时保持毒素的抗原性的点突变。在α毒素的氨基酸35处的点突变的引入导致毒性的去除同时保持免疫原性，所述突变是用亮氨酸残基取代组氨酸残基（Menzies和Kernodle1996；Infect.Immun.64；1839）。组氨酸35似乎对于孔形成所需的正确寡聚化来说是关键性的，这个残基的突变导致毒性丧失。

当加入到本发明的免疫原性组合物中时，α毒素任选通过His35突变而被脱毒，例如通过用Leu或Arg取代His35。在作为选择的实施方案中，α毒素通过缀合到免疫原性组合物的其它组分上而被脱毒，例如荚膜多糖或PNAG，任选缀合到金黄色葡萄球菌5型多糖和/或金黄色葡萄球菌8型多糖和/或PNAG上。

RNA III激活蛋白（RAP）

RAP本身不是毒素。但是它是毒力因子表达的调节剂。RAP由葡萄球菌产生并分泌。它激活其它葡萄球菌的agr调节系统并激活毒力因子诸如溶血素、肠毒素B和TSST-1的表达和随后的释放。

其它免疫优势的蛋白

累积-结合蛋白（Aap）

Aap是表皮葡萄球菌菌株累积在表面上所必需的140kDa蛋白（Hussain等人，Infect.Immun.1997，65；519）。表达该蛋白的菌株产生显著更大量的生物膜，Aap似乎参与了生物膜的形成。抗Aap的抗体能够抑制生物膜形成并抑制表皮葡萄球菌的累积。

葡萄球菌分泌抗原SsaA

SsaA是在金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌中都发现的30kDa强免疫原性蛋白（Lang等人，2000FEMS Immunol.Med.Microbiol.29；213）。它在心内膜炎期间的表达表明了特异性针对感染疾病发病的毒力作用。

SsaA含有N末端前导序列和信号肽酶切割位点。前导肽之后是从残基30到残基130的大约100个氨基酸的亲水区。

加入到本发明的免疫原性组合物中的任选SsaA片段由成熟蛋白（氨基酸27到C末端或者氨基酸30到C末端）组成。

另一种任选的片段含有SsaA从氨基酸30到氨基酸130的疏水区。

组合

葡萄球菌感染的发展经过几个不同阶段。例如，葡萄球菌的生存周期包括共栖集群、通过接触相邻组织或血流而开始感染、在血液中的厌氧增殖、金黄色葡萄球菌毒力决定因子与宿主防御机制之间的相互作用以及诱导并发症包括心内膜炎、转移性脓肿形成和脓毒症综合征。细菌表面上的不同分子将参与感染周期的不同步骤。通过靶定针对参与葡萄球菌感染不同过程的特定抗原的组合的免疫应答，影响了葡萄球菌功能的多方面，这能够产生好的疫苗功效。

特别地，来自不同类型的某些抗原的组合，其中一些参与对宿主细胞的粘附，其中一些参与铁捕获或其它转运蛋白功能，其中一些是毒素或毒力调节剂和免疫优势抗原，能够引起防止多阶段感染的免疫应答。

一些抗原组合在诱导免疫应答时是特别有效的。这可以通过如实施例中描述的动物模型分析法测定和/或使用如实施例中描述的调理吞噬作用分析法测定。不希望被理论限制，我们认为这样的有效抗原组合能够通过针对抗原组合的免疫应答的许多特征获得。抗原本身通常被暴露在葡萄球菌细胞的表面，它们倾向于是保守的，但是也倾向于不会在细胞表面上存在足够的量以便使用针对单个抗原引起的抗体来产生最佳杀菌应答。本发明的抗原组合能够产生引起抗体的有利组合的配方，其超过临界阈值与葡萄球菌细胞相互作用。在这个临界水平，足够质量的足够抗体结合到细菌表面以使得能够通过补体有效杀灭或者中和细菌。这可以通过如实施例中描述的动物攻击模型或调理吞噬作用分析法测定。

本发明优选的免疫原性组合物包含选自至少两种不同种类蛋白的多种蛋白，所述蛋白具有葡萄球菌的不同功能。这样的蛋白种类的例子是胞外结合蛋白，转运蛋白诸如Fe采集蛋白，毒素或毒力调节剂以及其它免疫优势蛋白。

在一种优选的实施方案中，本发明的免疫原性组合物进一步包含等于或多于2、3、4、5或6种选自2、3或4个不同组的多个蛋白，所述的组选自：

·组a）胞外成分结合蛋白；

·组b）转运蛋白；

·组c）毒素或毒力调节剂；

·组d）结构蛋白。

在一种优选的实施方案中，本发明的免疫原性组合物进一步包含等于或多于2、3、4、5或6种选自2、3或个下面组的多个蛋白：

·组a）-至少一种葡萄球菌胞外成分结合蛋白或其片段，其选自层粘连蛋白受体、SitC/MntC/唾液结合蛋白、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白（EbpS）、EFB（FIB）、SBI、ClfA、SdrC、SdrD、SdrE、SdrG、SdrH、SasF、脂肪酶GehD、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、FnbA、FnbB、Cna，ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig和MAP；

·组b）-至少一种葡萄球菌转运蛋白或其片段，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、Mg²⁺转运蛋白、HarA、SitC和Ni ABC转运蛋白；

·组c）-至少一种葡萄球菌毒力调节剂、毒素或其片段，其选自α毒素（Hla）、α毒素H35R突变体、RNA III激活蛋白（RAP）。

·组d）-至少一种葡萄球菌结构蛋白或其免疫原性片段，其选自MEPII和自溶素。

在一种优选的实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含等于或多于2、3、4、5或6种选自2或3个下面组的多个蛋白：

·组a）-至少一种葡萄球菌胞外成分结合蛋白或其免疫原性片段，其选自层粘连蛋白受体、SitC/MntC/唾液结合蛋白、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白（EbpS）、EFB（FIB）、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrD、SdrE、SdrG、SdrH、SasF、脂肪酶GehD、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、FnbA、FnbB、Cna，ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig和MAP；

·组b）-至少一种葡萄球菌转运蛋白或其免疫原性片段，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC和Ni ABC转运蛋白；

·组c）-至少一种葡萄球菌毒力调节剂、毒素或其免疫原性片段，其选自α毒素（Hla）、α毒素H35R突变体、RNA III激活蛋白（RAP）。

在一种优选的实施方案中，本发明的免疫原性组合物含有至少一种选自组a）的蛋白以及选自组b）和/或组c）的额外蛋白。

在进一步的实施方案中，本发明的免疫原性组合物含有至少一种选自组b）的抗原以及选自组c）和/或组a）的额外蛋白。

在进一步的实施方案中，本发明的免疫原性组合物含有至少一种选自组c）的抗原以及选自组a）和/或组b）的额外蛋白。

本发明的免疫原性组合物中的任选蛋白组合包含层粘连蛋白受体和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含SitC和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含EbhA和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含EbhB和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含EbpS和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含EFB（FIB）和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含SBI和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含自溶素和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含ClfA和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含SdrC和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含SdrD和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含SdrE和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含SdrG和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体和RAP。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含SdrH和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含SasF和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含脂肪酶GehD和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含SasF和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含FnbA和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含FnbB和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含Cna和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含ClfB和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含FbpA和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含Npase和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含IsaA/PisA和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含SsaA和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含EPB和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含SSP-1和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含SSP-2和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含HPB和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含玻连蛋白结合蛋白和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含纤维蛋白原结合蛋白和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含凝固酶和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含Fig和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含MAP和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含免疫优势的ABC转运蛋白和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自层粘连蛋白受体、SitC/MntC/唾液结合蛋白、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白（EbpS）、EFB（FIB）、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrD、SdrE、SdrG、SdrH、脂肪酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfA、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含IsdA和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自层粘连蛋白受体、SitC/MntC/唾液结合蛋白、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白（EbpS）、EFB（FIB）、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrD、SdrE、SdrG、SdrH、SasF、脂肪酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfA、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含IsdB和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自层粘连蛋白受体、SitC/MntC/唾液结合蛋白、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白（EbpS）、EFB（FIB）、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、SasF、脂肪酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfA、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含SitC和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自层粘连蛋白受体、SitC/MntC/唾液结合蛋白、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白（EbpS）、EFB（FIB）、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrD、SdrE、SdrG、SdrH、SasF、脂肪酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfA、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含α毒素和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自层粘连蛋白受体、SitC/MntC/唾液结合蛋白、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白（EbpS）、EFB（FIB）、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrD、SdrE、SdrG、SdrH、SasF、脂肪酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含α毒素H35L或H35R变体和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自层粘连蛋白受体、SitC/MntC/唾液结合蛋白、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白（EbpS）、EFB（FIB）、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrD、SdrE、SdrG、SdrH、SasF、脂肪酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含RAP和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自层粘连蛋白受体、SitC/MntC/唾液结合蛋白、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白（EbpS）、EFB（FIB）、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrD、SdrE、SdrG、SdrH、SasF、脂肪酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种蛋白组合包含IsdA和IsdB；IsdA和ClfA；IsdA和ClfB；IsdA和SdrC；IsdA和SdrD；IsdA和SdrE；IsdA和SdrG；IsdA和SasF；lsdB和ClfA；IsdB和ClfB；IsdB和SdrC；IsdB和SdrD；IsdB和SdrE；IsdB和SdrG；IsdB和SasF；ClfA和ClfB；ClfA和SdrC；ClfA和SdrD；ClfA和SdrE；ClfA和SasF；ClfB和SdrC；ClfB和SdrD；ClfB和SdrE；ClfB和SasF；SdrC和SdrD；SdrC和SdrE；SdrC和SasF；SdrD和SdrE；SdrD和SasF；SdrE和SasF。

在上面的以及下面的组合中，特定蛋白可以任选作为如上所述的片段或融合蛋白而存在于本发明的免疫原性组合物中。

三种蛋白的组合

在一种实施方案中，本发明的免疫原性组合物进一步包含α-毒素、胞外成分结合蛋白（例如粘附素）和转运蛋白（例如铁结合蛋白）相组合的三种蛋白成分。

在这样的组合中，α毒素可以被化学脱毒或通过引入点突变而遗传学脱毒，例如His35Leu点突变。Α毒素作为游离蛋白存在或者作为选择被缀合到免疫原性组合物的多糖或PNAG成分上。

组合的实例包括：

免疫原性组合物，包含α毒素、IsdA和胞外成分结合蛋白，其选自层粘连蛋白受体、SitC/MntC/唾液结合蛋白、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白（EbpS）、EFB（FIB）、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、脂肪酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig和MAP。

免疫原性组合物，包含α毒素、IsdB和胞外成分结合蛋白，其选自层粘连蛋白受体、SitC/MntC/唾液结合蛋白、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白（EbpS）、EFB（FIB）、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrD、SdrE、SdrG、SdrH、脂肪酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig和MAP。

免疫原性组合物，包含α毒素、IsdA和粘附素，其选自层粘连蛋白受体、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白（EbpS）、EFB（FIB）、ClfA、SdrC、SdrD、SdrE、SdrG、SdrH、自溶素、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、SSP-1、SSP-2、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig和MAP。

免疫原性组合物，包含α毒素、IsdB和粘附素，其选自层粘连蛋白受体、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白（EbpS）、EFB（FIB）、自溶素、ClfA、SdrC、SdrD、SdrE、SdrG、SdrH、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、SSP-1、SSP-2、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig和MAP。

包含α毒素、IsdA和层粘连蛋白受体的免疫原性组合物。

包含α毒素、IsdA和EbhA的免疫原性组合物。

包含α毒素、IsdA和EbhB的免疫原性组合物。

包含α毒素、IsdA和EbpS的免疫原性组合物。

包含α毒素、IsdA和EFB（FIB）的免疫原性组合物。

包含α毒素、IsdA和SdrG的免疫原性组合物。

包含α毒素、IsdA和ClfA的免疫原性组合物。

包含α毒素、IsdA和ClfB的免疫原性组合物。

包含α毒素、IsdA和FnbA的免疫原性组合物。

包含α毒素、IsdA和凝固酶的免疫原性组合物。

包含α毒素、IsdA和Fig的免疫原性组合物。

包含α毒素、IsdA和SdrH的免疫原性组合物。

包含α毒素、IsdA和SdrC的免疫原性组合物。

包含α毒素、IsdA和SdrD的免疫原性组合物。

包含α毒素、IsdA和SdrE的免疫原性组合物。

包含α毒素、IsdA和MAP的免疫原性组合物。

包含IsaA和Sbi的免疫原性组合物。

包含IsaA和IsdB的免疫原性组合物。

包含IsaA和IsdA的免疫原性组合物。

包含IsaA和SdrC的免疫原性组合物。

包含IsaA和Ebh或其如上所述的片段的免疫原性组合物。

包含Sbi和SdrC的免疫原性组合物。

包含Sbi和Ebh或其如上所述的片段的免疫原性组合物。

包含IsaA、Sbi或SdrC的免疫原性组合物。

在不同克隆系中表达的抗原的选择

对与金黄色葡萄球菌群体结构相关的毒力因子的出现进行的分析表明，金黄色葡萄球菌的天然群体中可变存在毒力基因。

在金黄色葡萄球菌的临床分离物中，至少五种克隆系显示出是非常普遍的（Booth等人，2001Infect Immun.69（1）:345-52）。α-溶血素（hla）、纤连蛋白结合蛋白A（fnbA）和聚集因子A（clfA）显示出存在于大多数分离物中，无论品系身份如何，表明了些蛋白在金黄色葡萄球菌的生存中的重要作用（Booth等人，2001Infect Immun.69（1）:345-52）。而且，根据Peacock等人2002的描述，fnbA、clfA、凝固酶、spa、map、pvl（Panton-Valentine杀白细胞素）、hlg（γ-毒素）、α-毒素和ica似乎与潜在的克隆结构无关，表明了这些基因相当多的水平转移。

相反，其它毒力基因诸如纤连蛋白结合蛋白B（fnbB）、β-溶血素（hlb）、胶原蛋白结合蛋白（can）、TSST-1（tst）和甲氧苯青霉素抗性基因（mecA）与特定品系强相关（Booth等人，2001Infect Immun.69（1）:345-52）。同样地，Peacock等人2002（Infect Immun.70（9）:4987-96）显示出肠毒素、tst、脱叶菌素（eta和etb），β-和δ-毒素、sdr基因（sdrD、sdrE和bbp）、cna、ebpS和efb在群体中的分布是与MLST-衍生的克隆复合物相当显著地相关的。

MLST数据没有提供证据证明引起医源性疾病的菌株代表了与引起社区获得疾病的菌株或者从无症状带菌者回收的菌株所截然不同的亚群（Feil等人，2003J Bacteriol.185（11）:3307-16）。

在一种实施方案中，本发明的免疫原性组合物对于抗来自不同克隆系的葡萄球菌是有效的。

在一种实施方案中，免疫原性组合物包含1、2、3、4种或至少1种在大多数葡萄球菌分离物中表达的蛋白。这样的蛋白的例子包括α-溶血素（hla）、纤连蛋白结合蛋白A（fnbA）和聚集因子A（clfA）、凝固酶、spa、map、pvl（Panton-Valentine杀白细胞素）、hlg（γ-毒素）、ica、免疫优势的ABC转运蛋白、RAP、自溶素（Rupp等人，2001，J.Infect.Dis.183；1038）、层粘连蛋白受体、SitC、IsaA/PisA、SPOIIIE（）、SsaA、EbpS、SasF（Roche等人，2003，Microbiology149；643）、EFB（FIB）、SBI、ClfB、IsdA、IsdB、FnbB、Npase、EBP、骨唾液酸结合蛋白II、IsaB/PisB（Lorenz等人，FEMS Immuno.Med.Microb.2000，29；145）、SasH（Roche等人，2003，Microbiology149；643）、MRPI、SasD（Roche等人，2003，Microbiology149；643）、SasH（Roche等人，2003，Microbiology149；643）、自溶素前体（AUR）/Sepp1以及新的自溶素。

在作为选择的实施方案中，在不同的克隆菌株组中表达的2或多种蛋白被包括在本发明的免疫原性组合物中。任选地，抗原组合将使得能够产生有效抗多种克隆菌株，或抗所有克隆菌株的免疫应答。例如，组合包括FnbB和β-溶血素、FnbB和Cna、FnbB和TSST-1、FnbB和mecA、FnbB和SdrD、FnbB和SdrF、FnbB和EbpS、FnbB和Efb、β-溶血素和Cna、β-溶血素和TSST-1、β-溶血素和mecA、β-溶血素和SdrD、β-溶血素和SdrF、β-溶血素和EbpS、β-溶血素和Efb、Cna和TSST-1、Cna和mecA、Cna和SdrD，Cna和SdrF、Cna和EbpS、Cna和Efb、TSST-1和mecA、TSST-1和SdrD、TSST-1和SdrF、TSST-1和EbpS、TssT-1和Efb、MecA和SdrD、MecA和SdrF、MecA和EbpS、MecA和Efb、SdrD和SdrF、SdrD和EbpS、SdeD和Efb、SdrF和EbpS、SdrF和Efb以及EbpS和Efb。

上述组合可以与上述额外成分相组合。

抗金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的保护作用

在本发明的一种实施方案中，免疫原性组合物提供抗多于一种葡萄球菌菌株的有效免疫应答，例如，抗来自金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌两者的菌株。例如，产生抗金黄色葡萄球菌5型和8型血清型的保护性免疫应答。

本发明免疫原性组合物的一种用途是通过在医院治疗之前接种疫苗来预防医源性感染，例如在择期手术的患者中。在这个阶段，很难精确预测患者将暴露于哪些葡萄球菌菌株。因此用能够产生抗各种葡萄球菌菌株的有效免疫应答的疫苗进行接种是有利的。

有效免疫应答被定义为在如实施例中描述的小鼠攻击模型或调理吞噬作用分析中产生明显保护。在例如实施例5的小鼠攻击模型中的明显保护被定义为与接种了载体的小鼠相比LD50至少10%、20%、50%、100%或200%的增加。在例如实施例8的棉鼠攻击模型中的明显保护被定义为所观察到的平均logCFU/鼻至少10%、20%、50%、70%或90%的降低。已知调理性抗体的存在是与保护作用相关联的，因此在例如实施例7的调理吞噬作用分析中细菌计数至少10%、20%、50%、70%或90%的减少表明了明显的保护。

包括免疫优势的ABC转运蛋白、RNA III激活蛋白、层粘连蛋白受体、SitC、IsaA/PisA、SsaA、EbhA/EbhB、EbpS和Aap在内的几种蛋白在金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌之间是相当保守的，实施例8显示IsaA、ClfA、IsdB、SdrG、HarA、FnbpA和Sbi能够产生交叉反应性免疫应答（例如在至少一种金黄色葡萄球菌和至少一种表皮葡萄球菌菌株之间的交叉反应性）。PIA在金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌之间也是相当保守的。

因此在一种实施方案中，本发明的免疫原性组合物将包含PNAG和5型和8型多糖以及一种、两种、三种或四种上述蛋白。

疫苗

在一种实施方案中，本发明的免疫原性组合物与药学可接受的赋形剂相混合，并任选与佐剂混合以形成疫苗。

本发明的疫苗可以被佐剂化，特别是当意欲用于老年群体但也用于婴儿群体时。合适的佐剂包括铝盐诸如氢氧化铝凝胶或磷酸铝，但是也可以是其它金属盐，如钙盐、镁盐、铁盐或锌盐，或者可以是酰化酪氨酸或酰化糖、阳离子或阴离子衍生多糖或聚磷腈的不溶悬浮液。

优选所选择的佐剂是TH1型应答的优先诱导物。高水平的Th1型细胞因子倾向于有利于对特定抗原的细胞介导免疫应答的诱导，而高水平的Th2型细胞因子倾向于有利于对抗原的体液免疫应答的诱导。

Th1和Th2型免疫应答的区别不是绝对的。实际上个体都将支持被描述为Th1优势或Th2优势的免疫应答。然而，根据Mosmann和Coffman在鼠CD4+ve T细胞克隆中所描述的（Mosmann，T.R.和Coffman，R.L.（1989）TH1and TH2cells：different patterns of lymphokinesecretion lead to different functional properties.Annual Review ofImmunology，7，p145-173）来考虑细胞因子家族经常是方便的。传统上，Th1型应答是与T-淋巴细胞所产生的INF-γ和IL-2细胞因子相关联的。经常与Th1型免疫应答的诱导直接关联的其它细胞因子不是T细胞产生的，诸如IL-12。相反，Th2型应答是与IL-4、IL-5、IL-6、IL-10的分泌相关联的。促进Th1优势应答的合适佐剂系统包括：单磷酰脂质A或其衍生物（或总体而言是脱毒的脂质A-参见例如WO2005107798），特别是3-脱-O-酰化单磷酰脂质A（3D-MPL）（它的制备参见GB2220211A）；和单磷酰脂质A的组合，优选3-脱-O-酰化单磷酰脂质A加上铝盐（例如磷酸铝或氢氧化铝）或水包油乳状液。在这样的组合中，抗原和3D-MPL被包含在同一颗粒结构中，以便能够用于抗原性和免疫刺激性信号的更有效递送。研究已经表明3D-MPL能够进一步增强明矾吸附的抗原的免疫原性[Thoelen等人Vaccine（1998）16:708-14；EP689454-B1]。

增强的系统涉及单磷酰脂质A与皂苷衍生物的组合，特别是如WO94/00153中披露的QS21和3D-MPL的组合，或者更低反应原性的组合物，其中用胆固醇淬灭了QS21，如WO96/33739中所披露的。WO95/17210中描述了涉及水包油乳状液中的QS21、3D-MPL和生育酚的特别有效的佐剂制剂。在一种实施方案中，免疫原性组合物额外包含皂苷，其可以是QS21。制剂也可包含水包油乳状液和生育酚（WO95/17210）。含有未甲基化CpG的寡核苷酸（WO96/02555）和其它免疫调节性寡核苷酸（WO0226757和WO03507822）也是TH1应答的优先诱导物，并且适合用于本发明中。

特定的佐剂是选自下组的那些：金属盐、水包油乳状液、Toll样受体激动剂（特别是Toll样受体2激动剂、Toll样受体3激动剂、Toll样受体4激动剂、Toll样受体7激动剂、Toll样受体8激动剂和Toll样受体9激动剂）、皂苷、或其组合。

可以用于本发明的疫苗组合物的佐剂是来自革兰氏阴性菌菌株，如WO02/09746教导的那些菌株的疱（bleb）和外膜小泡制剂，特别是脑膜炎奈瑟氏球菌疱。可以通过保留其表面上的LOS（脂寡糖）而改进疱的佐剂特性（如通过用低浓度的去污剂[例如0-0.1%脱氧胆酸盐]提取）。可以通过WO02/09746中讨论的msbB（-）或htrB（-）突变使LOS脱毒。也可以通过保留来自脑膜炎球菌疱的PorB（并任选除去PorA）而改进佐剂特性。也可以通过截短脑膜炎球菌疱上的LOS的外核心糖结构而改进佐剂特性-例如通过WO2004/014417中讨论的IgtB（-）突变。或者，可以将上述LOS（例如，分离自msbB（-）和/或IgtB（-）菌株）纯化并且用作本发明组合物中的佐剂。

可以用于本发明组合物的其它佐剂可以选自：皂苷、脂质A或其衍生物、免疫刺激性寡核苷酸、烷基氨基葡糖苷磷酸酯、水包油乳状液或其组合。进一步优选的佐剂是金属盐与另一种佐剂的组合。优选的是佐剂是Toll样受体激动剂，特别是Toll样受体2、3、4、7、8或9的激动剂或皂苷，特别是Qs21。进一步优选的是佐剂系统包含两种或更多来自上述列表的佐剂。特别地，所述组合优选包含皂苷（特别是Qs21）佐剂和/或Toll样受体9激动剂，如含有CpG的免疫刺激性寡核苷酸。其它优选的组合包含皂苷（特别是QS21）和Toll样受体4激动剂，如单磷酰脂质A或其3脱酰基衍生物，即3D-MPL，或皂苷（特别是QS21）和Toll样受体4配体，如烷基氨基葡糖苷磷酸酯。

特别优选的佐剂是3D-MPL和QS21的组合（EP0671948B1）、包含3D-MPL和QS21的水包油乳状液（WO95/17210，WO98/56414）、或用其它载体配制的3D-MPL（EP0689454B1）。其它优选的佐剂系统包含US6558670、US6544518中描述的3D MPL、QS21和CpG寡核苷酸的组合。

在一种实施方案中，佐剂是Toll样受体（TLR）4配体，优选是激动剂，如脂质A衍生物，特别是单磷酰脂质A或更特别是3脱酰基单磷酰脂质A（3D-MPL）。

3D-MPL可以获自GlaxoSmithKline Biologicals North America，并且主要促进具有IFN-g（Th1）表型的CD4+T细胞应答。它可以根据GB2220211A中公开的方法生产。化学上，它是具有3、4、5或6个酰化链的3-脱酰基单磷酰脂质A。优选地，在本发明的组合物中，使用小颗粒3D-MPL。小颗粒3D-MPL具有的颗粒大小使得它可以通过0.22μm的滤器灭菌过滤。所述制剂描述于国际专利申请No.WO94/21292。脂质A的合成衍生物是已知的，并且认为是TLR4激动剂，包括但不限于：

OM174（2-脱氧-6-o-[2-脱氧-2-[（R）-3-十二酰基氧基十四酰基氨基]-4-o-膦酰基-β-D-吡喃葡糖基]-2-[（R）-3-羟基十四酰基氨基]-α-D-吡喃葡糖基二氢磷酸酯），（WO95/14026）

OM294DP（3S，9R）-3--[（R）-十二酰基氧基十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9（R）-[（R）-3-羟基十四酰基氨基]十-1,10-二醇,1,10-二（二氢磷酸酯）（W099/64301和WO00/0462）

OM197MP-Ac DP（3S-，9R）-3-[（R）-十二酰基氧基十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[（R）-3-羟基十四酰基氨基]十-1,10-二醇,1-二氢磷酸10-（6-氨基己酸酯）（WO01/46127）

可以使用的其他TLR4配体是烷基氨基葡糖苷磷酸酯（AGP），例如在WO9850399或US6303347中公开的那些（还公开了制备AGP的过程），或US6764840中公开的AGPs的药学上可接受的盐。一些AGP是TLR4激动剂，一些是TLR4拮抗剂。这两种都被认为是作为佐剂有用的。

用于本发明中的另一种优选的免疫刺激剂是Quil A和它的衍生物。Quil A是分离自南美树木Quilaja Saponaria Molina的皂苷制品，最初于1974年由Dalsgaard等人描述具有佐剂活性（“Saponinadjuvants”，Archiv.für die gesamte Virusforschung，Vol.44，SpringerVerlag，Berlin，p243-254）。通过HPLC分离了纯化的Quil A片段，其保持了佐剂活性而没有与Quil A相关的毒性（EP0362278），例如QS7和QS21（也称为QA7和QA21）。QS-21是来自Quillaja saponariaMolina的树皮的天然皂苷，其诱导CD8+细胞毒性T细胞（CTL）、Th1细胞和优势的IgG2a抗体反应，是本发明的上下文中优选的皂苷。

已经描述了特别优选的特定QS21制剂，这些制剂进一步包含固醇（W096/33739）。本发明的皂苷形成部分可以是以胶束、混合的胶束（优先地，而不是专门地与胆汁盐混合）的形式独立存在，或当与胆固醇或脂质配制时可以是ISCOM基质（EP0109942B1）、脂质体或相关的胶体结构的形式，例如蠕虫样或环样多聚复合物或油脂/分层结构和薄层，或者是水包油乳状液的形式（例如，如WO95/17210）。皂苷可以优选与金属盐缔合，例如氢氧化铝或磷酸铝（WO98/15287）。优选地，皂苷以脂质体、ISCOM或水包油乳状液的形式存在。

增强的系统涉及单磷酰脂质A（或脱毒的脂质A）和皂苷衍生物的组合，特别是WO94/00153中公开的QS21和3D-MPL的组合，或反应原性较低的组合物，其中QS21如WO96/33739中公开的，用胆固醇猝灭。特别有效的佐剂制剂涉及水包油乳状液中含有或不含QS21和/或3D-MPL的生育酚，该佐剂制剂描述于WO95/17210。在一种实施方案中，免疫原性组合物还包含皂苷，其可以是QS21。

也可以使用免疫刺激性寡核苷酸或任何其他Toll样受体（TLR）9激动剂。用于本发明的佐剂或疫苗中的优选的寡核苷酸是含CpG的寡核苷酸，优选含有由至少三个、更优选至少六个或更多核苷酸分隔的两个或多个二核苷酸CpG基序。CpG基序是胞嘧啶核苷酸继之以鸟嘌呤核苷酸。本发明的CpG寡核苷酸一般是脱氧核苷酸。在一种优选的实施方式中，在寡核苷酸中的核苷酸间键是二硫代磷酸酯，或更优选的是硫代磷酸酯键，然而磷酸二酯和其他核苷酸间键也在本发明的范围内。还包括在本发明的范围内的是具有混合的核苷酸间键的寡核苷酸。产生硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法在US5,666,153、US5,278,302和WO95/26204中描述。

优选的寡核苷酸的实例具有以下序列。该序列优选含有硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键。

OLIGO1(SEQ ID NO:1):TCCATCACCTTCCTGACGTT(CpG1826)

OLIGO2(SEQ ID NO:2):TCTCCCAGCGTGCGCCAT(CpG1758)

OLIGO3(SEQ ID NO:3):ACCGATGACGTCGCCGGTGACGGCACCACG

OLIGO4(SEQ ID N0.4):TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCCTT(CpG2006)

OLIGO5(SEQ ID NO:5):TCCATGACGTTCCTGATGCT(CpG1668)

OLIGO6(SEQ ID NO:6):TCGACGTTTTCGGCGCGCGCCG(CpG5456)

备选的CpG寡核苷酸可以包含上述优选的序列，在其中具有不重要的缺失或添加。

在本发明中利用的CpG寡核苷酸可以通过本领域已知的任何方法（例如参见，EP468520）合成。方便地，这种寡核苷酸可以利用自动化合成仪合成。

佐剂可以是水包油乳状液或可以包含水包油乳状液和其它佐剂的组合。乳状液系统的油相优选包含可代谢油。术语可代谢油的意思在本领域是公知的。可代谢被定义为“能被代谢作用转化的”（Dorland’sIllustrated Medical Dictionary，W.B.Sanders Company，第25版（1974））。该油可以是任何植物油、鱼油、动物油或合成油，这些油对受体是无毒的并且能被代谢作用转化。坚果、种子和谷物是植物油的常用来源。合成油也是本发明的一部分，并且可包括商品油如

和其它。角鲨烯（2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯）是被发现在鲨鱼肝油中大量存在而在橄榄油、麦胚油、米糠油和酵母中较少量存在的不饱和油，并且是适用于本发明的一种特别优选的油。角鲨烯是可代谢油，这依据了角鲨烯是胆固醇生物合成过程中的中间体的事实（Merck index，第10版，条目号8619）。

母育酚（如维生素E）也通常用于油乳状液佐剂（EP0382271B1；US5667784；WO95/17210）。用于本发明的油乳状液（优选水包油乳状液）中的母育酚可以按照EP0382271B1中的描述进行配制，其中母育酚可以是直径优选小于1微米的母育酚液滴的分散体，其任选包含乳化剂。或者，母育酚可以与另一种油组合使用，形成油乳状液的油相。可以与母育酚组合使用的油乳状液的实例在本文中描述，如上文描述的可代谢油。

已经建议将水包油乳状液佐剂自身用作佐剂组合物（EP0399843B），也已经将水包油乳状液和其它活性剂的组合描述为疫苗的佐剂（WO95/17210；WO98/56414；WO99/12565；WO99/11241）。已经描述了其它油乳状液佐剂，如油包水乳状液（US5,422,109；EP0480982B2）和水包油包水乳状液（US5,424,067；EP0480981B）。所有这些都形成优选的油乳状液系统（特别是当掺入母育酚时）从而形成本发明的佐剂和组合物。

更优选地，油乳状液（例如水包油乳状液）进一步包含乳化剂，如TWEEN80和/或固醇，如胆固醇。优选的油乳状液（优选水包油乳状液）包含可代谢的、无毒的油，如角鲨烷、角鲨烯或生育酚，如α生育酚（优选角鲨烯和α生育酚两者），任选包含乳化剂（或表面活性剂）如Tween80。也可以包含固醇（优选胆固醇）。产生水包油型乳状液的方法是本领域技术人员众所周知的。通常，所述方法包括将含母育酚的油相与表面活性剂例如PBS/TWEEN80^TM溶液混合，然后用均化器均化，包括使所述混合物两次通过注射器针头的方法适合于将小体积液体均化，这对于本领域技术人员而言是显而易见的。同样地，本领域技术人员可修改在微流化床装置（microfluidiser）（M110S微流体机器，最多为50个通道，在6巴的最大压力输入下2分钟的时间段（输出压力为约850巴））中的乳化方法以产生更小体积或更大体积的乳状液。这种修改可通过常规实验完成，所述实验包括：测量所得乳状液，直到得到具有所需直径的油滴的制剂。在水包油乳状液中，油和乳化剂应该在水性载体中。水性载体可以是例如磷酸缓冲盐水。

在稳定的水包油乳状液中存在的油滴大小优选小于1微米，可以大致在30-600nm的范围，优选直径大致在30-500nm左右，最优选直径大致为150-500nm，特别是通过光子相关光谱学测定直径约为150nm。在这一方面，按数目计80%的油滴应该在所述优选范围内，更优选按数目计超过90%、最优选超过95%的油滴在所限定的大小范围内。在本发明油乳状液中存在的所述成分的量通常为（总剂量体积的）0.5-20%或2-10%的油，例如角鲨烯；并且当存在时，为2-10%α生育酚；和0.3-3%表面活性剂，例如聚氧乙烯失水山梨糖醇一油酸酯。油（优选角鲨烯）:母育酚（优选α-生育酚）之比优选等于或小于1，因为这一比率提供了更为稳定的乳状液。也可以存在大约1%水平的乳化剂，例如吐温80或斯盘85。在某些情况下，可能有利的是本发明的疫苗还含有稳定剂。

优选的乳状液系统的实例描述于WO95/17210、WO99/11241和WO99/12565中，文中公开了基于角鲨烯、α-生育酚和吐温80的乳状液佐剂，所述乳状液佐剂任选与免疫刺激剂QS21和/或3D-MPL一起配制。因此，本发明的一个特别优选的实施方案中，本发明的佐剂可以附加地包含另外的免疫刺激剂，例如LPS或其衍生物，和/或皂苷。另外的免疫刺激剂的实例描述于此以及描述于“Vaccine Design-TheSubunit and Adjuvant Approach”1995Pharmaceutical Biotechnology，Volume6，Powell，M F和Newman，M J.，Plenum Press，New York andLondon，ISBN0-306-44867-X。

在一个优选的方面，本发明的佐剂和免疫原性组合物包含：在如前文所述的油乳状液中的皂苷（优选QS21）和/或LPS衍生物（优选3D-MPL），任选地含有固醇（优选胆固醇）。另外，油乳状液（优选水包油乳状液）可以含有斯盘85和/或卵磷脂和/或三辛酸甘油酯。包含水包油乳状液、固醇和皂苷的佐剂描述于WO99/12565中。

通常对于人类施用而言，皂苷（优选QS21）和/或LPS衍生物（优选3D-MPL）将以1μg-200μg/剂的范围，例如10-100μg/剂，优选10μg-50μg/剂存在于人用剂量的免疫原性组合物中。通常油乳状液（优选水包油乳状液）会包含2%-10%的可代谢油。优选其包含2%-10%的角鲨烯、2%-10%的α生育酚和0.3%-3%的（优选0.4-2%）的乳化剂（优选吐温80[聚氧乙烯失水山梨糖醇一油酸酯]）。当既存在角鲨烯又存在α生育酚时，优选角鲨烯:α生育酚的比例等于或小于1，因为这提供更稳定的乳状液。斯盘85（失水山梨糖醇三油酸酯）也可以以0.5-1%的水平存在于本发明使用的乳状液中。在某些情况下，本发明的免疫原性组合物和疫苗进一步含有稳定剂例如其他乳化剂/表面活性剂（包括辛酸）（merck index第10版，条目号1739）可能是有利的，其中特别优选三辛酸甘油酯。

当包括角鲨烯和皂苷（优选QS21）时，在制剂中也包括固醇（优选胆固醇）会有益处，因为这允许降低乳状液中的总油水平。这将导致生产成本降低，接种的总体舒适度改进以及所产生的免疫应答在数量和质量上得到改进，例如IFN-γ的产量提高。因此，本发明的佐剂系统典型地包含范围从200:1到300:1的可代谢油:皂苷比例（w/w），本发明也可以以“低油”的形式使用，其优选的范围是1:1-200:1，优选20:1-100:1，最优选基本上是48:1，此疫苗保留了所有组分的有利佐剂特性，并且反应原性谱大大降低。因此，特别优选的实施方案中，角鲨烯:QS21（w/w）的比例范围从1:1到250:1，优选范围是20:1-200:1，优选20:1-到200:1，最优选基本上是48:1。优选也包括固醇（最优选胆固醇），并以于此描述的皂苷:固醇的比例存在。

本发明的乳状液系统优选具有亚微米范围的小油滴大小。最优选该小油滴的大小在120-750nm的范围内，最优选直径为120-600nm。

特别有效的佐剂制剂（对于在本发明的免疫原性组合物中最终与AlPO4组合）包括皂苷（优选QS21）、LPS衍生物（优选3D-MPL）和油乳状液（优选水包油乳状液中的角鲨烯和α生育酚），如WO95/17210或WO99/12565中所描述的（特别是在实施例2表1中的佐剂制剂11）。

TLR2激动剂的实例包括肽聚糖或脂蛋白。咪唑并喹啉，例如咪喹莫特（Imiquimod）和雷西莫特（Resiquimod）是已知的TLR7激动剂。单链RNA也是已知的TLR激动剂（人类中的TLR8和小鼠中的TLR7），而双链RNA和聚IC（聚肌胞苷酸-一种市售的合成的病毒RNA模拟物）是典型的TLR3激动剂。3D-MPL是TLR4激动剂的实例，同时CPG是TLR9激动剂的实例。

免疫原性组合物可以包含吸附在金属盐上的抗原和免疫刺激剂。基于铝的疫苗制剂描述于EP0576478B1、EP0689454B1和EP0633784B1中，其中抗原与免疫刺激剂3-脱-O-酰化单磷酰脂质A（3D-MPL）吸附在同一颗粒上。在这些情况下中，抗原首先吸附在铝盐上，随后使免疫刺激剂3D-MPL吸附在同一铝盐颗粒上。这些方法首先涉及通过在水浴中超声处理直到颗粒大小达到80-500nm而使3D-MPL悬浮。通常在室温中搅拌一小时使抗原吸附到铝盐上。然后将3D-MPL悬浮液加到已吸附的抗原中，该制剂于室温下温育1小时，然后在4℃下保存待用。

在另一种方法中，免疫刺激剂和抗原在分开的金属颗粒上，如EP1126876中所述。改进的方法包括使免疫刺激剂吸附在金属盐颗粒上，随后使抗原吸附在另一金属盐颗粒上，随后混合这些离散的金属颗粒以形成疫苗。用于本发明的佐剂可以是包含吸附在金属盐颗粒上的免疫刺激剂的佐剂组合物，其特征为金属盐颗粒基本上无其他抗原。此外，疫苗由本发明提供并且其特征为免疫刺激剂吸附在金属盐颗粒上，所述金属盐颗粒基本上无其他抗原，并且特征为吸附了抗原的金属盐颗粒中基本上无其他免疫刺激剂。

因此，本发明提供包含免疫刺激剂的佐剂制剂，所述免疫刺激剂已经吸附在金属盐颗粒上，其特征是所述组合物基本上无其他抗原。此外，此佐剂制剂可以是中间体，如果使用该佐剂，则此中间体是疫苗制造所需的。因此，提供了疫苗的制备方法，其包括将佐剂组合物与抗原混合，其中所述佐剂组合物是一种或更多种吸附在金属颗粒上的免疫刺激剂。优选所述抗原已经预先吸附在金属盐上。所述金属盐可以等同于或类似于吸附在免疫刺激剂上的金属盐。优选所述金属盐是铝盐，例如磷酸铝或氢氧化铝。

本发明还提供疫苗组合物，所述疫苗组合物包含吸附在第一金属盐颗粒上的免疫刺激剂、和吸附在金属盐上的抗原，其特征为第一和第二金属盐颗粒是分开的颗粒。

于此描述的LPS或LOS衍生物或突变体或脂质A衍生物被设计为比天然脂多糖（例如3D-MPL）毒性低，并且就本文描述的这些部分的任何使用而言，是可互换的等同物。

在一个实施方案中，用于本发明组合物的佐剂包括脂质体载体（通过已知的技术从磷脂（例如二油酰磷脂酰胆碱[DOPC]）和任选的固醇[例如胆固醇]制得）。这些脂质体载体可以携带脂质A衍生物[例如3D-MPL，参见上文]和/或皂苷（例如QS21，参见上文）。在一个实施方案中，佐剂包含（每0.5mL剂量）：0.1-10mg、0.2-7、0.3-5、0.4-2或0.5-1mg（例如0.4-0.6、0.9-1.1、0.5或1mg）的磷脂（例如DOPC）；0.025-2.5、0.05-1.5、0.075-0.75、0.1-0.3或0.125-0.25mg（例如0.2-0.3、0.1-0.15、0.25或0.125mg）的固醇（例如胆固醇）；5-60、10-50或20-30μg（例如5-15、40-50、10、20、30、40或50μg）的脂质A衍生物（例如3D-MPL）；和5-60、10-50或20-30μg（例如5-15、40-50、10、20、30、40或50μg）的皂苷（例如QS21）。

在一个实施方案中，用于本发明组合物的佐剂包含：由可代谢油（例如角鲨烯）、乳化剂（例如吐温80）和任选的母育酚（例如α-生育酚）制得的水包油乳状液。在一个实施方案中，佐剂包含（每0.5mL剂量）：0.5-15、1-13、2-11、4-8或5-6mg（例如2-3、5-6或10-11mg）的可代谢油（例如角鲨烯）；0.1-10、0.3-8、0.6-6、0.9-5、1-4或2-3mg（例如0.9-1.1、2-3或4-5mg）的乳化剂（例如吐温80）和任选的0.5-20、1-15、2-12、4-10、5-7mg（例如11-13、5-6或2-3mg）的母育酚（例如α-生育酚）。

此佐剂可以任选地进一步包含5-60、10-50或20-30μg（例如5-15、40-50、10、20、30、40或50μg）的脂质A衍生物（例如3D-MPL）。

此佐剂可以任选含有：0.025-2.5、0.05-1.5、0.075-0.75、0.1-0.3或0.125-0.25mg（例如0.2-0.3、0.1-0.15、0.25或0.125mg）的固醇（例如胆固醇）；5-60、10-50或20-30μg（例如5-15、40-50、10、20、30、40或50μg）的脂质A衍生物（例如3D-MPL）；和5-60、10-50或20-30μg（例如5-15、40-50、10、20、30、40或50μg）的皂苷（例如QS21）。

在一个实施方案中，用于本发明组合物的佐剂包括磷酸铝和脂质A衍生物（例如3D-MPL）。该佐剂可以包含（每0.5ml剂量）100-750、200-500或300-400μg作为磷酸铝的Al和5-60、10-50或20-30μg（例如5-15、40-50、10、20、30、40或50μg）的脂质A衍生物（例如3D-MPL）。

含有本发明免疫原性组合物的疫苗制剂可以通过系统途径或粘膜途径施用所述疫苗，用于保护或治疗易于感染的哺乳动物。这些施用可以包括通过肌内、腹膜内、皮内或皮下途径注射；或通过粘膜施用到口腔/消化道、呼吸道、泌尿生殖道。优选鼻内施用疫苗以治疗肺炎或中耳炎（因为可以更有效地预防鼻咽携带肺炎球菌，因此在感染的最早期削弱感染）。尽管本发明的疫苗可以作为单一剂量给药，但其组分也可以于同一时间或不同时间共同施用（例如可以同时地或在施用疫苗的任何细菌蛋白组分1-2周后，单独施用肺炎球菌糖缀合物，使两者相互之间的免疫应答达到最佳的配合）。对于共同施用，可以在任何或所有不同的施用中存在任选的Th1佐剂。除了单一的施用途径以外，还可以使用2种不同的施用途径。例如，多糖可以IM（或ID）施用，而细菌蛋白可以IN（或ID）施用。此外，本发明的疫苗对于激发剂量可以IM施用，而对于增强剂量可以IN施用。

每剂疫苗中的缀合抗原的量选择为在典型疫苗中诱导免疫保护性应答而没有明显的不利副作用的量。这样的量将根据采用的是哪种特定免疫原以及如何呈递它而变化。通常，期望的是每剂将包含0.1-100μg多糖，对于多糖缀合物，典型地是0.1-50μg，0.1-10μg，1-10μg，或1-5μg。

疫苗中的蛋白抗原含量将典型地在1-100μg、5-50μg或5-25μg的范围。在初次疫苗接种之后，受试者可接受一次或几次适当间隔的加强免疫。

疫苗制备一般地描述于Vaccine Design（“The subunit and adjuvantapproach”）（eds Powell M.F.& Newman M.J.）（1995）Plenum PressNew York）中。在脂质体中的胶囊化描述于Fullerton的美国专利4,235,877中。

本发明的疫苗可保存在溶液中或者冻干。任选地，在存在糖诸如蔗糖、海藻糖或乳糖的情况下冻干溶液。还进一步优选的是，将它们冻干，在使用之前临时重配。冻干可形成更稳定的组合物（疫苗）。

方法

本发明也包括制备本发明的免疫原性组合物和疫苗的方法。

在一个实施方案中，本发明的方法是制备疫苗的方法，包括混合抗原以制备本发明的免疫原性组合物的步骤以及加入药学可接受赋形剂的步骤。

治疗方法

本发明也包括治疗或预防葡萄球菌感染的方法，特别是在医院获得的医源性感染。

本发明的免疫原性组合物或疫苗用于择期手术病例中是特别有利的。这样的患者将预先知道手术日期并能够预先接种疫苗。由于不知道患者是否将暴露于金黄色葡萄球菌还是表皮葡萄球菌感染，因此优选用如上所述的防护两者的本发明的疫苗进行接种。优选地，用本发明的免疫原性组合物和疫苗处理等待择期手术的16岁以上成人。或者，用本发明的免疫原性组合物和疫苗处理等待择期手术的3-16岁的儿童。

用本发明的疫苗接种医护人员也是有利的。

本发明的疫苗制剂可用于保护或治疗对感染敏感的哺乳动物，其通过经全身或粘膜途径施用所述疫苗。这些施用可包括经肌内、腹膜内、皮内或皮下途径的注射；或者经粘膜给予口腔/消化道、呼吸道、泌尿生殖道。

每剂疫苗中的缀合抗原的量选择为在典型疫苗中诱导免疫保护性应答而没有明显的不利副作用的量。这样的量将根据采用的是哪种特定免疫原以及如何呈递它而变化。疫苗的蛋白含量将典型地在1-100μg、5-50μg的范围，典型地在10-25μg的范围。对于特定疫苗来说最佳的量可通过标准研究确定，包括在受试者中的合适免疫应答的观察。在初次疫苗接种之后，受试者可接受一次或几次适当间隔的加强免疫。

尽管本发明的疫苗可通过任何途径给药，但是将所述疫苗施用到皮肤中（ID）构成本发明的一种实施方案。人体皮肤包含外部“角状的”外皮，称为角质层，它覆盖表皮。在该表皮之下是称为真皮的层，它又覆盖皮下组织。研究人员已经证明，疫苗注射进皮肤中，特别是真皮中，刺激了免疫应答，这也可能与许多另外的优点相关联。用这里描述的疫苗进行的皮内接种构成本发明的优选特征。

皮内注射的常规技术“mantoux方法”包括如下步骤，清洁皮肤，然后用一只手伸展，用窄规针（26-31规格）朝向针上部的斜面以10-15°的角度插入。一旦针的斜面插入，就降低针管，进一步推进，同时提供低压以在皮肤下抬高它。然后极慢地注射液体从而形成皮肤表面上的疱或隆起，接着慢慢抽出针。

更为近来，已经描述了特别地设计来将液体试剂施用于到皮肤中或穿过皮肤的设备，例如描述于WO99/34850和EP1092444中的设备，以及描述于例如WO01/13977；US5,480,381、US5,599,302、US5,334,144、US5,993,412、US5,649,912、US5,569,189、US5,704,911、US5,383,851、US5,893,397、US5,466,220、US5,339,163、US5,312,335、US5,503,627、US5,064,413、US5,520，639、US4,596,556、US4,790,824、US4,941,880、US4,940,460、WO97/37705和WO97/13537中的快速注射设备。皮内施用疫苗制剂的作为选择的方法可包括常规注射器和针，或者设计来冲击递送固体疫苗的设备（WO99/27961），或者皮肤贴（WO97/48440；WO98/28037）；或者施加到皮肤表面上（经皮或经皮下的递送WO98/20734；WO98/28037）。

当将本发明的疫苗施用于皮肤时，或者更特别地施用于真皮中时，疫苗是较低的液体体积，特别是在大约0.05ml和0.2ml之间的体积。

本发明的皮肤或皮内疫苗中抗原的含量可以类似于肌内疫苗中存在的常规剂量（见上文）。然而，皮肤或经皮疫苗的一个特征是制剂可以是“低剂量”。因此“低剂量”疫苗中的蛋白抗原任选存在为每剂仅仅0.1到10μg，任选每剂0.1到5μg；多糖（任选缀合的）抗原可以在每剂0.01-1μg的范围内存在，任选每剂0.01-0.5μg多糖。

如这里使用的，术语“皮内递送”意指将疫苗递送到皮肤中的真皮区域。然而，疫苗将不必全部位于真皮中。真皮是位于距离人体皮肤表面大约1.0和大约2.0mm之间的皮肤层，但是在个体之间以及身体不同部分中存在一定量的变化。通常，可预期的是通过到达皮肤表面下1.5mm来到达真皮。真皮位于表面的角质层和表皮以及下面的皮下层之间。根据递送模式，疫苗可能最终完全或主要位于真皮中，或者它可能最终分布在表皮和真皮中。

本发明一个实施方案是预防或治疗葡萄球菌感染或疾病的方法，包括将本发明的免疫原性组合物或疫苗施用于有此需要的患者的步骤。

本发明的另一种实施方案是本发明的免疫原性组合物在制备用于治疗或预防葡萄球菌感染或疾病的疫苗中的用途，任选手术后葡萄球菌感染。

术语“葡萄球菌感染”包括由金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌以及能够引起哺乳动物，任选人宿主中感染的其它葡萄球菌菌株所引起的感染。

在每种情况下，发明人都认为这里的术语“包含”、“包括”和“含有”可以任选用“由…组成”替换。

在本专利说明书中引用的所有参考文献或专利申请通过引用被引入这里。

为使本发明可被更好地理解，提供下面的实施例。这些实施例仅仅用于说明目的，不意欲以任何方式理解为限制本发明的范围。

实施例

实施例1表达重组蛋白的质粒的构建

A：克隆。

工程化到特异于葡萄球菌基因的寡核苷酸中的合适限制性位点允许将PCR产物定向克隆到大肠杆菌表达质粒pET24d或pQE-30中，这样蛋白就能够表达为在N-或C-末端含有（His）6亲合层析标志的融合蛋白。

所使用的引物是：

α毒素-5’-CGCGGATCCGCAGATTCTGATATTAATATTAAAAC-3’和5’CCCAAGCTTTTAATTTGTCATTTCTTCTTTTTC-3’

EbpS-5’-CGCGGATCCGCTGGGTCTAATAATTTTAAAGATG-3’和5’CCCAAGCTTTTATGGAATAACGATTTGTTG-3’

ClfA-5’-CGCGGATCCAGTGAAAATAGTGTTACGCAATC-3’和5’CCCAAGCTTTTACTCTGGAATTGGTTCAATTTC-3’

FnbpA-5’-CGCGGATCCACACAAACAACTGCAACTAACG-3’和5’CCCAAGCTTTTATGCTTTGTGATTCTTTTTCAAAC3’

Sbi-5’-CGCGGATCCAACACGCAACAAACTTC-3’和5’GGAACTGCAGTTATTTCCAGAATGATAATAAATTAC-3’

SdrC-5’-CGCGGATCCGCAGAACATACGAATGGAG-3’和5’CCCAAGCTTTTATGTTTCTTCTTCGTAGTAGC-3’

SdrG-5’-CGCGGATCCGAGGAGAATTCAGTACAAG-3’和5’CCCAAGCTTTTATTCGTCATCATAGTATCCG-3’

Ebh-5’-AAAAGTACTCACCACCACCACCACC-3’和5’AAAAGTACTCACTTGATTCATCGCTTCAG-3’

Aaa-5’-GCGCGCCATGGCACAAGCTTCTACACAACATAC-3’和5’GCGCGCTCGAGATGGATGAATGCATAGCTAGA-3’

IsaA-5’-GCATCCATGGCACCATCACCATCACCACGAAGTAAACGTTGATCAAGC-3’和5’-AGCACTCGAGTTAGAATCCCCAAGCACCTAAACC-3’

HarA-5’-GCACCCATGGCAGAAAATACAAATACTTC-3’和5’TTTTCTCGAGCATTTTAGATTGACTAAGTTG-3’

自溶素氨基葡糖苷酶-5’-CAAGTCCCATGGCTGAGACGACACAAGATCAAC-3’和5’-CAGTCTCGAGTTTTACAGCTGTTTTTGGTTG-3’

自溶素酰胺酶-5’-AGCTCATATGGCTTATACTGTTACTAAACC-3’和5’GCGCCTCGAGTTTATATTGTGGGATGTCG-3’

IsdA-5’-CAAGTCCCATGGCAACAGAAGCTACGAACGCAAC-3’和5’ACCAGTCTCGAGTAATTCTTTAGCTTTAGAGCTTG-3’

IsdB-5’-TATTCTCGAGGCTTTGAGTGTGTCCATCATTTG-3’和5’GAAGCCATGGCAGCAGCTGAAGAAACAGGTGG-3’

MRPII-5’-GATTACACCATGGTTAAACCTCAAGCGAAA-3’和5’AGGTGTCTCGAGTGCGATTGTAGCTTCATT-3’

首先按照厂商说明使用Top10细菌细胞将PCR产物引入到pGEM-T克隆载体（Novagen）中。制备该中间构建体是为了帮助进一步克隆到表达载体中。通过限制酶分析选择含有DNA插入片段的转化体。消化之后，通过凝胶电泳（Tris-乙酸-EDTA（TAE）缓冲液中的0.8%琼脂糖）分析约20μl反应等分物。在凝胶电泳和溴化乙锭染色之后通过UV照射观察DNA片段。将DNA分子大小标准（1Kb梯，LifeTechnologies）与测试样品平行电泳，用于估计DNA片段的大小。然后用如厂商（Life Technologies）所建议的合适限制酶将从用于每次克隆的选定转化体纯化的质粒顺序消化完全。然后使用基于硅胶的自旋柱纯化已消化的DNA片段，接着用pET24d或pQE-30质粒连接。使用pET24d质粒进行Ebh（H2片段）、AaA、IsdA、IsdB、HarA、Atl-酰胺酶、Atl-葡糖胺、MRPII、IsaA的克隆，使用pQE-30质粒进行ClfA、SdrC、SdrE、FnbpA、SdrG/Fbe、α毒素和Sbi的克隆。

B：表达载体的生产。

为制备用于连接的表达质粒pET24d或pQE-30，用合适的限制酶同样消化完全。使用大约为所制备载体5倍摩尔过量的消化片段来进行连接反应。使用本领域公知的方法，用T4DNA连接酶（约2.0单位/反应，Life Technologies）进行标准的约20μl的连接反应（约16℃，约16小时）。根据本领域公知方法使用连接等分物（约5μl）转化M15（pREP4）或BT21::DE3电感受态细胞。在约1.0ml的LB培养液中于37℃经约2-3小时生长期后，将转化细胞铺板在含有氨苄青霉素（100μg/ml）和/或卡那霉素（30μg/ml）的LB琼脂平板上。在选择中包括抗生素。将平板在37℃下培养约16小时。用无菌牙签挑取各个ApR/KanR克隆，用于“斑片”接种新鲜的LB ApR/KanR平板以及约1.0ml LB Ap/Kan培养液培养物。斑片平板和培养液培养物两者都在标准孵育器（平板）或振荡水浴中于37℃下赋予过夜。采用基于全细胞的PCR分析来证明转化体含有DNA插入片段。这里，将约1.0ml过夜LB Ap/Kan培养液培养物转移到1.5ml聚丙烯管中，在Beckmann微型离心机（约3分钟，室温，约12,000X g）中经离心收集细胞。将细胞沉淀悬浮在约200μl无菌水中，使用约10μl等分物进行约50μl终体积的含有正向和反向扩增引物的PCR反应。将最初的95℃变性步骤增加到3分钟以确保细菌细胞的热破坏和质粒DNA的释放。使用ABI Model9700热循环仪和32个循环的三步热扩增程序，即95℃、45秒；55-58℃、45秒，72℃、1分钟来从裂解的转化体样品中扩增BASB203片段。在热扩增之后，通过凝胶电泳（Tris-乙酸-EDTA（TAE）缓冲液中的0.8%琼脂糖）分析约20μl反应等分物。在凝胶电泳和溴化乙锭染色之后通过UV照射观察DNA片段。将DNA分子大小标准（1Kb梯，Life Technologies）与测试样品平行电泳，用于估计PCR产物的大小。将产生预期大小的PCR产物的转化体确定为含有蛋白表达构建体的菌株。然后对含有表达质粒的菌株进行重组蛋白可诱导表达的分析。

C：PCR阳性转化体的表达分析。

将过夜的种子培养物等分物（约1.0ml）接种到含有约25ml LBAp/Kan培养液的125ml锥形瓶中，在37℃振荡（约250rpm）培养直到培养物浊度达到约0.5的O.D.600，即对数中期（通常大约1.5-2.0小时）。这时，将大约一半培养物（约12.5ml）转移到第二个125ml烧瓶中，通过加入IPTG（制备在无菌水中的1.0M原液，Sigma）到1.0mM的终浓度来诱导重组蛋白的表达。IPTG诱导的和没有诱导的培养物在37℃下继续振荡培养另外的约4小时。在诱导期之后移出诱导的和没有诱导的培养物的样品（约1.0ml），在微型离心机中于室温离心约3分钟来收集细胞。将单独的细胞沉淀悬浮在约50μl无菌水中，然后与等体积的含有2-巯基乙醇的2X Laemelli SDS-PAGE样品缓冲液混合，置于沸水浴中约3分钟变性蛋白。将等体积（约15μl）的未加工的IPTG诱导和没有诱导的细胞裂解物加样到双份12%Tris/甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶（1mm厚的Mini-凝胶，Novex）上。将诱导的和没有诱导的裂解物样品与预先染色过的分子量标志（SeeBlue，Novex）一起在常规条件下使用标准SDS/Tris/甘氨酸跑胶缓冲液（BioRad）进行电泳。电泳之后，将一份凝胶用考马斯亮蓝R250（BioRad）染色，然后脱色以观察新的IPTG可诱导的蛋白。使用BioRad Mini-Protean II印迹设备和Towbin氏甲醇（20%）转移缓冲液将第二份凝胶在PVDF膜（0.45微米孔径，Novex）上于4℃电印迹约2小时。根据本领域公知的方法封闭膜并进行抗体赋予。首先使用单克隆抗-RGS（His）3抗体，然后使用缀合到HRP（QiaGen）的兔抗小鼠第二抗体来确证重组蛋白的表达和识别。使用ABT不溶性底物或者使用带有Amersham ECL化学发光系统的Hyperfilm来实现抗-His抗体反应模式的观察。

实施例2：重组蛋白的生产

细菌菌株

使用含有质粒（pQE30）的大肠杆菌M15（pREP4）的重组表达菌株或者含有编码葡萄球菌蛋白的质粒pET24d的BL21::DE3来生产用于重组蛋白纯化的细胞团。

培养基

用于重组蛋白生产的发酵培养基由含有100μg/ml Ap和/或30μg/ml Km的2X YT培养液（Difco）组成。以0.25ml/L（消泡剂204，Sigma）加入消泡剂到发酵罐的培养基中。为诱导重组蛋白的表达，加入IPTG（异丙基β-D-硫代半乳糖苷）到发酵罐中（1mM终浓度）。

重组蛋白的生产

在天然条件下

以1mM的终浓度加入IPTG，将培养物生长另外的4小时。然后将培养物在6,000rpm离心10分钟，将沉淀重悬浮在包括蛋白酶抑制剂混合物的磷酸盐缓冲液（50mM K₂HPO₄，KH₂PO₄pH7）中。使用1500巴的压力将该样品进行氟氏压碎器裂解（2次）。在15,000rpm离心30分钟后，保留上清液用于进一步纯化，加入NaCl到0.5M。然后将样品加样到50mM K₂HPO₄，KH₂PO₄pH7中调节的Ni-NTA树脂（XK16柱Pharmacia，Ni-NTA树脂Qiagen）。加样之后，用缓冲液A（0.2M NaH₂PO₄pH7，0.3M NaCl，10%甘油）洗涤柱。为洗脱结合的蛋白，使用分步梯度，其中在缓冲液A中加入了不同比例的缓冲液B（0.2M NaH₂PO₄pH7，0.3M NaCl，10%甘油和200mM咪唑）。缓冲液B的比例由10%逐渐增加到100%。纯化后，汇集含有蛋白的洗脱组分，浓缩，对0.002M KH₂PO₄/K₂HPO₄pH7，0.15M NaCl进行透析。

使用该方法纯化ClfA、SdrG、IsdA、IsaB、HarA、Atl-葡糖胺和α毒素。

在变性条件下

以1mM的终浓度加入IPTG，将培养物生长另外的4小时。然后将培养物在6,000rpm离心10分钟，将沉淀重悬浮在包括蛋白酶抑制剂混合物的磷酸盐缓冲液（50mM K₂HPO₄，KH₂PO₄pH7）中。使用1500巴的压力将该样品进行氟氏压碎器裂解（2次）。在15,000rpm离心样品30分钟后，用包括1M尿素的磷酸盐缓冲液洗涤沉淀。在15,000rpm离心30分钟后，在8M尿素、0.1M NaH₂PO₄、0.5M NaCl、0.01M Tris-HCl pH8中重悬浮沉淀，在室温保持过夜。将样品在15000rpm离心20分钟，收集上清液用于进一步纯化。然后将样品加样到8M尿素、0.1M NaH₂PO₄、0.5M NaCl、0.01M Tris-HCl pH8中调节的Ni-NTA树脂（XK16柱Pharmacia，Ni-NTA树脂Qiagen）。在流通后，用缓冲液A（8M尿素、0.1MNaH₂PO₄、0,5M NaCl、0.01M Tris、pH8.0）、缓冲液C（8M尿素、0.1M NaH₂PO₄、0.5M NaCl、0.01M Tris、pH6.3）、缓冲液D（8M尿素、0.1M NaH₂PO₄、0.5M NaCl、0.01M Tris、pH5.9）和缓冲液E（8M尿素、0.1M NaH₂PO₄、0.5M NaCl、0.01M Tris、pH4.5）连续洗涤柱。在洗涤期间用缓冲液D和E从柱上洗脱重组蛋白。变性的重组蛋白可被溶于缺少尿素的溶液中。为此目的，将8M尿素中所含有的变性蛋白对4M尿素、0.1M Na₂PO₄、0.01M Tris-HCl、pH7.1，2M尿素、0.1M NaH₂PO₄、0.01M Tris-HCl、pH7.1，0.5M精氨酸和0.002MKH₂PO₄/K₂HPO₄pH7.1，0.15M NaCl，0.5M精氨酸连续透析。

该方法用于纯化Ebh（H2片段）、AaA、SdrC、FnbpA、Sbi、Atl-酰胺酶和IsaA。

通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白。在天然条件（α毒素）下纯化的一种蛋白和在变性条件（SdrC）下纯化的一种蛋白的结果示于图3和4中。

实施例3用CDAP制备金黄色葡萄球菌荚膜多糖缀合物

用CDAP进行天然PS8的活化和偶联化学

SA08-TT004

室温下在连续搅拌下进行活化和偶联。将10mg天然多糖溶解，获得0.2M NaCl中的2.5mg/ml的最终PS浓度。然后在活化步骤前将溶液调节到pH6.0+/-0.2。

在0时间，手工加入50μl CDAP溶液（100mg/ml，在乙腈/WFI，50/50中新制备），达到合适的CDAP/PS（0.5/1）比。

1.5分钟后，通过加入0.5M NaOH使pH升高到pH9.00+/-0.05。

NaOH添加需要1分钟，将pH稳定在pH9.00+/-0.05，直到添加载体。

在4.5分钟时，加入1.5ml TT（10mg/ml，溶于0.2M NaCl中），达到合适的蛋白/PS比（1.5/1）；立即将pH调节到偶联pH9.00+/-0.05。在手工pH调节下将溶液放置1小时。

偶联步骤后，加入0.5ml2M甘氨酸（比值gly/PS（w/w）：7.5/1）；立即将pH调节到9.00+/-0.05。在手工pH调节下将溶液放置30分钟。然后用5μm Minisart滤器使缀合物澄清，并且注射到Sephacryl S400HR（XK16/100）上。用150mM NaCl将流速固定在30ml/h。

通过间苯二酚并通过μBCA分析洗脱级分。合并感兴趣的级分并且在0.22μm Sterivex上过滤。

通过间苯二酚和Lowry测定评估，得到的缀合物的最终TT/PS比（w/w）是1.05。

实施例4用CDAP在大小分级的多糖上制备金黄色葡萄球菌荚膜多糖缀合物

用CDAP进行大小分级的PS8的活化和偶联

在10%的理论含水量的基础上对PS称重。将2g天然的、潮湿的PS在WFI中以10mg/ml的最初浓度溶解过夜。大小分级前，在5μm截留值的滤器上使天然PS溶液澄清。

在活化步骤前用EMULSIFLEX C-50匀浆仪设备减少多糖的分子量和粘度，所述设备中用Microfluidics F20Y-0.75μm相互作用室代替了匀浆室。在前10个循环中以10000psi实现大小减少，然后在后面的60个循环中以15000psi实现。过程中通过测量粘度继续进行大小减少的过程。70个周期后终止大小分级，此时到2.74±0.2cp的目标。

室温下在连续搅拌下进行活化和偶联。将50mg大小分级的多糖8稀释，获得0.2M NaCl中的5mg/ml的最终PS浓度。

在0时间，手工加入375μl CDAP溶液（100mg/ml，在乙腈/WFI，50/50中新制备），达到合适的CDAP/PS（0.75/1）比。

1分钟后，通过加入0.5M NaOH使pH升高到pH9.00+/-0.05。

在2.5分钟时，加入10ml TT（10mg/ml，溶于0.2M NaCl中），达到合适的蛋白/PS比（2/1）；立即将pH调节到偶联pH9.00+/-0.05。在手工pH调节下将溶液放置55分钟。

偶联步骤后，加入2.5ml2M甘氨酸（比值gly/PS（w/w）：7.5/1）；立即通过调节器将pH调节到9.00+/-0.05。在手工pH调节下将溶液放置30分钟。

然后用5μm Minisart滤器使缀合物澄清，并且注射到SephacrylS400HR（XK16/100）上。将流速固定在60ml/h。

通过间苯二酚并通过蛋白剂量分析洗脱级分。合并感兴趣的级分并且在0.22μm Millipack20上过滤。

得到的缀合物的最终TT/PS比是1.94。

实施例5用EDAC制备金黄色葡萄球菌荚膜多糖缀合物

用EDAC进行的活化和偶联化学

金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖-TT缀合物

PS衍生

连续搅拌下在室温下进行活化和偶联。将30mg天然多糖稀释，得到水中的5mg/ml的最终多糖浓度。用0.5N HCl将溶液调节到pH4.5-5.0，然后加入66μg ADH（2.2mg/mg PS）。完全溶解后，加入60mg EDAC（2mg/mg PS）。70分钟后，用1N NaOH将pH升高到pH7.5，以终止反应。通过在Sephacryl S100HR（XK16/40）上纯化，除去游离ADH。用0.2M NaCl作为洗脱缓冲液，将流速固定在60ml/h。通过超声处理15分钟，进行大小减少，从而使得能够在millex滤器（0.22μm）上进行灭菌过滤。

偶联

将破伤风类毒素加入0.2M NaCl中的5-10mg衍生的多糖，通过加入0.5N HCl将pH调节到pH5.0或pH6.0。将EDAC溶解于0.1M Tris缓冲液pH7.5中，然后在10分钟的时间段中加入（每2分钟1/5vol）。根据使用的条件（参见表6），在30-180分钟后通过加入1M Tris-HClpH7.5终止反应。在Sephacryl S400HR上纯化前，用5μm Minisart滤器使缀合物澄清。或者，通过5分钟超声处理步骤使缀合物澄清。然后将缀合物注射到Sephacryl S400HR（XK16/100）上。用150mM NaCl作为洗脱缓冲液，将流速固定在30ml/h。基于间苯二酚和μBCA谱（其分别测量多糖和蛋白剂量）选择洗脱合并物。将缀合物在0.22μm灭菌膜（Millipack20）上以10ml/min过滤。

表5

表5：*在pH6.0进行偶联

得到的缀合物具有表6所示的如下特征：

表6

在用ADH衍生前也通过微流化处理金黄色葡萄球菌8型多糖

PS衍生

连续搅拌下在室温下进行活化和偶联。将200mg大小分级的多糖稀释，得到水中的10mg/ml的最终PS浓度。然后加入440mg ADH（2.2mg/mg PS）。在加入400mg EDAC（2mg/mg PS）前，用1N HCl将溶液调节到pH4.7。60分钟后，用5M NaOH将pH升高到pH7.5，以终止反应。在Amicon Ultra（截留值10.000MWCO）上浓缩混合物。在Sephacryl S200HR（XK16/100）上纯化前，用5μm Minisart滤器使缀合物澄清。用0.150M NaCl作为洗脱缓冲液，将流速固定在30ml/h。

偶联

将100mg TT加入0.2M NaCl中的50mg衍生的多糖。通过加入0.3N HCl将pH调节到5.0±0.02。将EDAC溶解于0.1M Tris缓冲液pH7.5中，然后在10分钟的时间段中加入（每分钟1/10vol）。根据使用的条件（参见表8），在30-180分钟后通过加入1M Tris-HCl pH7.5终止反应。在Sephacryl S400HR上纯化前，用5μm Minisart滤器使缀合物澄清。然后将缀合物注射到Sephacryl S400HR（XK50/100）上。用150mM NaCl作为洗脱缓冲液，将流速固定在60ml/h。基于间苯二酚和μBCA谱（其分别测量多糖和蛋白剂量）选择洗脱合并物。将缀合物在0.22μm灭菌膜（Millipack20）上以10ml/min过滤。

表7

*“一次”加入EDAC

表8

实施例6用EDAC在脱-O-乙酰化金黄色葡萄球菌多糖8上制备金黄色葡萄球菌荚膜多糖缀合物

脱-O-乙酰化

将0.1N NaOH加入16ml大小分级的PS（10mg/ml），达到9mg/ml的最终PS浓度和0.1N的最终NaOH浓度。在37℃下处理1或2小时后，与未处理的PS相比，PS分别具有35和12%（Hestrin剂量）的O-乙酰化水平。

将0.1N NaOH加入19ml大小分级的PS（10mg/ml），达到9.5mg/ml的最终PS浓度和0.05N的最终NaOH浓度。在37℃下处理1或2小时后，与未处理的PS相比，PS分别具有78和58%（Hestrin剂量）的O-乙酰化水平。

衍生步骤按照前面对未处理的PS的描述进行。

表9

*TNBS测定

O-乙酰基的除去导致反应性羧基的可获得性增加。实际上，具有仅仅12%的O-乙酰基的PS的衍生水平比具有78%O-乙酰基的PS高±2.5倍。

偶联按照前面对未处理的PS的描述进行。

表10

表11

实施例7dPNAG的缀合

dPNAG的活化和偶联：

dPNAG-TT缀合物

用下文描述的方法生产以下缀合物：

dPNAG-TT010：dPNAG-S-GMBS+DTT处理的TT-LC-SPDP

dPNAG-TT011：dPNAG-S-GMBS+DTT处理的TT-LC-SPDP

dPNAG-TT012：dPNAG-S-GMBS+DTT处理的TT-SPDP

dPNAG-TT014：dPNAG-SPDP+DTT处理的TT-SPDP

dPNAG-TT017：DTT处理的dPNAG-SPDP+TT-LC-SPDP

dPNAG-TT019：dPNAG-S-GMBS+DTT处理的TT-SPDP

dPNAG-TT020：dPNAG-S-GMBS+DTT处理的TT-SPDP

dPNAG

将1g PNAG以20mg/ml的浓度溶解于5N HCl中，温育1小时。然后将其用5N NaOH中和。在5μm膜上使溶液澄清，在SephacrylS400HR上纯化。合并相应于“中等分子大小”（参见Infection andImmunity，70：4433-4440（2002））的感兴趣的级分，在脱-N-乙酰化处理前浓缩。

在1M NaOH下调节溶液，37℃下放置24小时。中和后，对产物进行透析和浓缩。

dPNAG活化

将S-GMBS（N-（γ-马来酰亚胺基丁酰氧基）磺基琥珀酰亚胺，Pierce）加入0.2M NaCl中的dPNAG（比例是S-GMBS/PS（w/w）:1/1），pH7.0下室温下温育2小时（用1M NaOH进行pH调节）。通过用PBS，10mM EDTA，50mM NaCI pH7.2作为洗脱缓冲液，采用固定在60ml/h的流速在Toyopearl HW-40F上纯化，除去过量的GMBS和副产物。以光密度（UV=206nm）的函数选择洗脱合并物，然后在Vivaspin管3,000MWCO或Amicon Ultra10,000MWCO上浓缩。

偶联

混合GMBS活化的dPNAG和DTT还原的TT-SPDP，在室温下搅拌。根据使用的条件，在20-120分钟后通过加入半胱氨酸（4mg/ml，溶于磷酸钠缓冲液pH8.0）30分钟，猝灭反应。在5μm滤器上使缀合物澄清，注射到Sephacryl S300HR树脂（XK16/100）上进行纯化。在200mM NaCl中，用固定在30ml/h的流速实现洗脱。通过氨基己糖并通过蛋白剂量分析洗脱级分。合并感兴趣的级分，在0.22μm Sterivex上过滤。测试最终缀合物的多糖（氨基己糖剂量）和蛋白组成（Lowry剂量）。

表12

*没有在缀合中使用的批次上进行，但采用相同的脱-N-乙酰化方法通过NMR在前面的批次中评估。

表13

dPNAG-SPDP：

将溶解于DMSO（二甲亚砜，Merck）中的5倍摩尔过量的SPDP（N-琥珀酰亚胺基-3-（2-吡啶基二硫代）丙酸酯，MW：312.4，Pierce）加入100mM磷酸钠，pH7.2中的5mg/ml的100mg dPNAG中，室温下温育1小时。在Sephacryl S100HR（XK16/40）上纯化前，在AmiconUltra10,000MWCO上将反应混合物浓缩到±6ml（在28分钟时间内以3000rpm离心）。以固定在60ml/h的流速实现在磷酸盐缓冲液pH7.4中的洗脱。合并感兴趣的级分（在206nm读数），并且在Amicon Ultra10,000MWCO（在30分钟的时间内以3000rpm离心）上浓缩到1.1ml。

TT-SPDP：

将溶解于DMSO（二甲亚砜，Merck）中的15倍摩尔过量的SPDP（Pierce）加入100mM磷酸钠,pH7.2中的1g TT（50mg/ml）中，室温下温育80分钟。然后将产物注射到Sephacryl S100HR（XK16/40）上，在100mM醋酸钠pH5.6，100mM NaCl，1mM EDTA中以固定在60ml/h的流速洗脱。作为光密度（UV=280nm）的函数选择洗脱合并物，然后在Amicon Ultra10,000MWCO上浓缩到19.6ml（在75分钟的时间内以3000rpm离心）。

按照对TT-SPDP的描述生产TT-LC-SPDP，但使用LC-SPDP（琥珀酰亚胺基6-[3-（2-吡啶基二硫代）-丙酰胺基]己酸酯，Pierce），并且温育时间是60分钟。

TT-SH或TT-LC-SH

以0.7/1的DTT/TT比（mg/mg）将DTT加入TT-SPDP或TT-LC-SPDP。室温下2小时后，根据343nm处的特征性吸光度检测到吡啶-2-硫酮的释放。通过凝胶过滤（PD-10，Amersham）从过量的DTT纯化硫醇化的蛋白。在Amicon Ultra10,000MWCO上浓缩后，通过Lowry剂量评估蛋白含量。

dPNAG-SPDP+TT-SH或TT-LC-SH（dPNAG-TT014和016）

室温下在连续搅拌下进行偶联，采用的初始TT/PS比（w/w）是2/1。

混合dPNAG和TT-SH以获得20mg/ml的最终PS浓度和40mg/ml的最终蛋白浓度。30分钟后，通过加入2-碘乙酰胺（Merck）猝灭未反应的巯基。

混合dPNAG和TT-LC-SH以获得10mg/ml的最终PS浓度和20mg/ml的最终蛋白浓度。75分钟后，通过加入2-碘乙酰胺（Merck）猝灭未反应的巯基。

然后用5μm Minisart滤器使缀合物澄清，注射到Sephacryl S300HR（XK16/100）上。以固定在30ml/h的流速在200mM NaCl中实现洗脱。

通过氨基己糖并通过蛋白剂量分析洗脱级分。合并感兴趣的级分，并且在0.22μm Sterivex上过滤。

得到的缀合物的最终TT/PS比（w/w）是2.18（TT-SH）和2.24（TT-LC-SH）。

dPNAG的硫醇化

将11.6mg DTT（1,4-二硫苏糖醇，Boerhinger Mannheim，MW：154.24）加入16.5mg dPNAG-SPDP。室温下2小时后，根据343nm处的特征性吸光度检测到吡啶-2-硫酮的释放。通过凝胶过滤（ToyopearlHW40F）从过量的DTT纯化硫醇化的PS，然后在Amicon Ultra10,000MWCO上浓缩到860μl。

dPNAG-SH+TT-SPDP（dPNAG-TT017）

室温下在连续搅拌下进行偶联，采用的初始TT/PS比（w/w）是1.7/1。

混合dPNAG-SH和TT-SPDP以获得7.73mg/ml的最终PS浓度和13.3mg/ml的最终蛋白浓度。90分钟后，通过加入2-碘乙酰胺（Merck）猝灭未反应的巯基。

得到的缀合物的最终TT/PS比（w/w）是2.74。

实施例8制剂

佐剂组成

在不含佐剂或以佐剂A为佐剂的条件下接种缀合物，所述佐剂A具有以下组成：

佐剂A的组成：

定性的定量的（每0.5mL剂量）

脂质体：

-DOPC1mg

-胆固醇0.25mg

3DMPL50μg

QS2150μg

KH₂PO₄₁3.124mg缓冲剂

Na2HPO₄₁0.290mg缓冲剂

NaCl2.922mg

（100mM）

WFI q.s.ad0.5ml溶剂pH6.1

₁.总PO₄浓度=50mM

实施例9

动物实验。

8到10周龄的雌性CD-1小鼠由Charles River Laboratories，Kingston，Mass获得。对于致死率研究来说，用CSA平板上培养的金黄色葡萄球菌的连续稀释物腹膜内（i.p.）攻击五组9到11只CD-1小鼠。接种大小在约10¹⁰到10⁸CFU/小鼠的范围。按天评估死亡率3天。通过使用剂量-应答关系的概率单位模型估计50%致死剂量（LD₅₀）。通过似然比检验测试共同LD₅₀的零假设。通过用约2x10⁶CFU/小鼠经静脉内（i.v.）途径或者用约2x10⁷CFU/小鼠经i.p.途径攻击8到20只小鼠的组来引起亚致死的菌血症。接种后，在特定时间从尾部对分开的动物组取血，通过在带有5%绵羊血（Becton DickinsonMicrobiology Systems）的胰蛋白酶水解的大豆琼脂平板上重复进行定量平板计数两次来评估菌血症水平。用不配对的斯氏t检验的Welch修正来确定统计显著性。

实施例10金黄色葡萄球菌PS8-TT和dPNAG-TT缀合物的免疫原性

在第0、14、28和42天，用不含佐剂或与佐剂A组合的糖剂量为3μg的金黄色葡萄球菌PS8-TT缀合物皮下接种30只小鼠的各组。在第0天，小鼠接受第一种糖剂量，包括0.001-0.013μg。另外的三次免疫用盐水中的0.3μg剂量进行。在第55天，从小鼠采集血清，通过ELISA测试每个血清样品，以评估抗PS8的免疫应答。将10只小鼠的各组用于对照组，它们用盐水或含有佐剂A的盐水接种。

4℃下在高结合微量滴定板（Nunc Maxisorp）上在磷酸盐缓冲的盐水（PBS）中以2μg/ml包被纯化的PS8。室温下搅拌下用PBS-BSA1%将平板封闭30分钟。预先以1/100稀释小鼠抗血清，然后在微量滴定板中进一步进行两倍稀释，所述板在37℃下温育1小时。洗涤后，用1:5000稀释于PBS-吐温0.05%中的Jackson ImmunoLaboratories公司的过氧化物酶缀合的affiniPure山羊抗小鼠IgG（H+L）（ref：115-035-003）检测结合的鼠抗体。室温下搅拌下将检测抗体温育30分钟。室温下在暗处用每10ml pH4.50.1M柠檬酸缓冲液4mg OPD（Sigma）+5μlH₂O₂显色。用50μl HCl终止反应，在490nm相对于650nm读出光密度。

结果表示为中点滴度，对30个样品（10个用于对照）计算GMT。结果示于下表14。

表14

用不含佐剂或与佐剂A组合的、200mM NaCl中的糖剂量为0.3μg的金黄色葡萄球菌dPNAG-TT缀合物（含有10%-30%N-乙酰化的dPNAG）皮下接种30只小鼠的各组。在第0、14和28天，小鼠接受三次接种。在第41或42天，从小鼠采集血清，通过ELISA测试每个血清样品，以评估抗PNAG的免疫应答。将10只小鼠的各组用于对照组，它们用盐水或用单独的佐剂接种。

抗PNAG ELISA：

4℃下将与在磷酸盐缓冲的盐水（PBS）中稀释的甲基化HSA（2.5μg/ml）混合的纯化的PNAG（2.5μg/ml）包被在高结合微量滴定板（NuncMaxisorp）上过夜。

室温下搅拌下用PBS-BSA1%将平板封闭30分钟。预先以1/100稀释小鼠抗血清，然后在微量滴定板中进一步进行两倍稀释，并且在室温下搅拌下温育1小时。洗涤后，用1:5000稀释于PBS-吐温0.05%中的Jackson ImmunoLaboratories公司的过氧化物酶缀合的affiniPure山羊抗小鼠IgG（H+L）（ref：115-035-003）检测结合的鼠抗体。室温下搅拌下将检测抗体温育30分钟。室温下在暗处用每10ml pH4.50.1M柠檬酸缓冲液4mg OPD（Sigma）+5μl H₂O₂显色。用50μl HCl终止反应，在490nm相对于650nm读出光密度。

对30个样品（10个用于对照）的中点滴度计算GMT。

表15

实施例11通过CDAP方法制备的PS*-TT缀合物的免疫原性

结果

表16

实施例12

调理吞噬作用分析。

按照Xu等人，1992Infect.Immun.60；1358所述进行人多形核白细胞（PMN）对金黄色葡萄球菌的体外调理吞噬作用杀伤。人PMN是通过在3%葡聚糖T-250中沉淀而从肝素化血液制备的。调理反应混合物（1ml）含有存在于补充了10%热灭活胎牛血清的RPMI1640培养基中的约10⁶个PMN，约10⁸CFU的金黄色葡萄球菌，以及0.1ml的测试血清或IgG制剂。将超免疫的兔血清用作阳性对照，将0.1ml的未免疫的兔血清用作IgG样品的完全来源。将反应混合物在37℃温育，将细菌样品在0、60和120分钟时转移到水中，随后稀释，散布在胰蛋白酶水解的大豆琼脂平板上，在37℃温育，过夜温育后用于细菌计数。

实施例13

葡萄球菌蛋白在小鼠和兔中的免疫原性

用纯化的葡萄球菌蛋白免疫动物以便产生超免疫血清。用Specol为佐剂的每种蛋白10μg免疫小鼠三次（第0、14和28天）。用Specol为佐剂的每种蛋白20μg免疫兔三次（第0、21和42天）。收集免疫血清，在抗-蛋白和抗-杀伤的完整细胞的ELISA中进行评估。

抗-蛋白ELISA：

将磷酸盐缓冲的盐水（PBS）中的1μg/ml的纯化蛋白包被在高结合微量滴定板（Nunc Maxisorp）上于4℃过夜。用PBS-BSA1%在室温搅拌下封闭平板30分钟。然后将测试样品1/1000稀释，在室温搅拌下温育1小时。洗涤之后，使用在PBS-吐温0.05%中1:5000稀释的Jackson ImmunoLaboratories公司的过氧化物酶缀合的affiniPure山羊抗小鼠IgG（H+L）（ref：115-035-003）或AffiniPure山羊抗兔IgG（H+L）（ref：11-035-003）检测结合的鼠或兔抗体。将检测抗体在室温搅拌下温育30分钟。使用每10ml pH4.5的0.1M柠檬酸盐缓冲液4mg OPD（Sigma）+5μl H₂O₂在室温于暗处显色15分钟。用50μl HCl终止反应，在490nm相对于650nm读取光密度。

将Post III的1/1000稀释液的O.D.与用预先免疫的血清的相同稀释液所获得的O.D.相比较。

用小鼠和兔血清产生的结果在图5中。观察到了抗每种抗原的良好血清转化。抗SBI的血清的评估受损，这是由于该蛋白的Ig结合活性。

抗-杀伤的完整细胞的ELISA：

将磷酸盐缓冲的盐水（PBS）中的20μg/ml的来自金黄色葡萄球菌5型和8型或者表皮葡萄球菌菌株Hay的杀伤的完整细胞（热灭活或甲醛灭活）包被在高结合微量滴定板（Nunc Maxisorp）上于4℃蒸发下过夜。用PBS-BSA1%在室温搅拌封闭平板30分钟。通过加入在PBS-吐温0.05%中稀释的10μg/ml的亲和纯化的鸡抗-蛋白A（ICL ref：CPA-65A-2）接着在室温温育1小时而中和蛋白A。然后将测试样品在微量滴定板上由1/10的起始稀释成为于PBS-0.05%中稀释两倍，在室温搅拌下温育1小时。漂洗之后，使用在PBS-吐温0.05%中1:5000稀释的Jackson ImmunoLaboratories公司的过氧化物酶缀合的affiniPure山羊抗小鼠IgG（H+L）（ref：115-035-003）或AffiniPure山羊抗兔IgG（H+L）（ref：11-035-003）检测结合的鼠或兔抗体。将检测抗体温育30分钟。使用在每10ml pH4.5的0.1M柠檬酸盐缓冲液4mg OPD（Sigma）+5μl H₂O₂在室温于暗处显色15分钟。用50μl HCl终止反应，在490nm相对于650nm读取光密度。

应当注意的是，蛋白在葡萄球菌中的表达水平将根据培养条件而变化。因此阴性结果可能反映了不正确的培养条件选择而不是缺少免疫原性。

使用小鼠血清的结果示于表17中，一些图示于图6中。用抗SdrC、FnbpA、Ebh、Sbi和IsaA的血清观察到了金黄色葡萄球菌菌株5的微弱识别。只有用抗Sbi的血清才观察到金黄色葡萄球菌菌株8的识别。用抗Atl酰胺酶、MRPII、IsdA、IsaA、Ebh、Aaa和Sbi的血清观察到了表皮葡萄球菌Hay的微弱识别。

使用兔血清产生的结果选择性示于图7中，并总结在表18中。用IsaA和IsdB观察到了三种菌株的非常良好的识别。用HarA观察到了三种菌株的微弱识别，即使动物只接受一次注射而不是用于其它蛋白的三次注射。

表17

蛋白名称	对SA5的反应	对SA8的反应	对SE Hay的反应
				IsaA	（+）	（+）	（+）
ClfA	-	（+）	（+）
				Atl酰胺酶	-	-	++
SdrG	-	-	-
				葡糖酰胺酶	-	-	-
IsdA	-	-	++
				α毒素	-	-	-
SrdC	++	（+）	-
				Ebh	+	-	+
AaA	-	-	++
				MRPII	-	-	++
Sbi	++	++	+++
				FnbpA	+	+	（+）

Claims

1.免疫原性组合物，包含来自金黄色葡萄球菌的5型和/或8型荚膜多糖或寡糖，其中所述5型荚膜多糖或寡糖是30%-100%O-乙酰化的，并且包含葡萄球菌蛋白或其片段，所述葡萄球菌蛋白或其片段是胞外成分结合蛋白，其选自层粘连蛋白受体、SitC/MntC/唾液结合蛋白、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白（EbpS）、EFB（FIB）、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrD、SdrE、SdrG、SdrH、脂肪酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig和MAP。

2.免疫原性组合物，包含来自金黄色葡萄球菌的5型和/或8型荚膜多糖或寡糖，其中所述8型荚膜多糖或寡糖是30%-100%O-乙酰化的，并且包含葡萄球菌蛋白或其片段，所述葡萄球菌蛋白或其片段是胞外成分结合蛋白，其选自层粘连蛋白受体、SitC/MntC/唾液结合蛋白、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白（EbpS）、EFB（FIB）、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrD、SdrE、SdrG、SdrH、脂肪酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig和MAP。

3.权利要求2的免疫原性组合物，其中所述5型荚膜多糖或寡糖是30%-100%O-乙酰化的。

4.权利要求1-3的任一项的免疫原性组合物，包含葡萄球菌PNAG。

5.权利要求4的免疫原性组合物，其中所述PNAG是少于40%N乙酰化的。

6.权利要求1-5的任一项的免疫原性组合物，进一步包含来自表皮葡萄球菌的I型和/或II型和/或III型荚膜多糖或寡糖。

7.权利要求1-6的任一项的免疫原性组合物，进一步包含金黄色葡萄球菌336抗原。

8.权利要求1-7的任一项的免疫原性组合物，进一步包含葡萄球菌蛋白或其片段。

9.权利要求8的免疫原性组合物，包含两种或更多种选自至少两个下列不同组的葡萄球菌蛋白：

a）至少一种葡萄球菌胞外成分结合蛋白或其片段，其选自层粘连蛋白受体、SitC/MntC/唾液结合蛋白、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白（EbpS）、EFB（FIB）、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrD、SdrE、SdrG、SdrH、脂肪酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig和MAP；

b）至少一种葡萄球菌转运蛋白或其片段，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、HarA、Mg²⁺转运蛋白、SitC和NiABC转运蛋白；

c）至少一种葡萄球菌毒力调节剂、毒素或其片段，其选自α毒素（Hla）、α毒素H35R突变体、RNAIII激活蛋白（RAP）。

10.权利要求1-9的任一项的免疫原性组合物，其中葡萄球菌多糖缀合到蛋白载体上。

11.权利要求4-10的任一项的免疫原性组合物，其中PNAG缀合到载体蛋白上。

12.权利要求10或11的免疫原性组合物，其中载体蛋白包含葡萄球菌蛋白或其片段，其选自层粘连蛋白受体、SitC/MntC/唾液结合蛋白、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白（EbpS）、EFB（FIB）、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrD、SdrE、SdrG、SdrH、脂肪酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、IsdC、Mg²⁺转运蛋白、SitC和NiABC转运蛋白、α毒素（Hla）、α毒素H35R突变体和RNAIII激活蛋白（RAP）。

13.权利要求10或11的免疫原性组合物，其中载体蛋白选自破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197、流感嗜血杆菌蛋白D、绿脓杆菌外蛋白A、肺炎球菌溶血素和α类毒素。

14.权利要求1-13的免疫原性组合物，其中针对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌两者，产生有效的免疫应答。

15.包含权利要求1-14的免疫原性组合物和药学可接受赋形剂的疫苗。

16.制备疫苗的方法，包括混合抗原以制备权利要求1-14的免疫原性组合物以及加入药学可接受赋形剂的步骤。

17.预防或治疗葡萄球菌感染的方法，包括给有此需要的患者施用权利要求15的疫苗的步骤。

18.权利要求1-14的免疫原性组合物在制备用于治疗或预防葡萄球菌感染的疫苗中的用途。

19.缀合来自金黄色葡萄球菌的5型或8型荚膜多糖或寡糖的方法，包括以下步骤：

a）将所述5型或8型多糖或寡糖溶解在水或盐溶液中；

b）加入氰化试剂（例如CDAP）以形成活化的多糖或寡糖；

c）加入载体蛋白，使得氨基与活化的多糖反应，以形成异脲共价连接。

20.权利要求19的方法，其中所述5型荚膜多糖或寡糖是30%-100%O-乙酰化的。