<Desc/Clms Page number 1>
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung, Isolierung und Produktion von Antigenen gegen ein spezifisches Pathogen, sowie neue Antigene, die zur Verwendung in einem Vakzin für einen bestimmten Tiertyp oder für Menschen geeignet sind.
Vakzine können mehr Leben (und Ressourcen) retten als jeder andere medizinische Eingriff.
Auf Grund weltweiter Im pfprogramme nahm das Auftreten vieler tödlicher Krankheiten drastisch ab.
Obwohl diese Behauptung für eine ganze Reihe von Erkrankungen zutrifft, z. B. für Diphtherie, Pertussis, Masern und Tetanus, gibt es für zahlreiche infektiöse Erkrankungen, einschliesslich der meisten Virusinfektionen, wie HIV, HCV, CMV und viele andere, keine wirksamen Vakzine. Es gibt auch andere Erkrankungen, seien sie nun infektiös oder nicht infektiös, für die es keine wirksamen Vakzine gibt, und die Millionen Patienten jedes Jahr das Leben kosten, einschliesslich Malaria oder Krebs. Ausserdem erfordert das rasche Auftreten Antibiotika-resistenter Bakterien und Mikroorga- nismen alternative Behandlungen, wobei Vakzine eine logische Wahl darstellen.
Schliesslich wird der grosse Bedarf an Vakzinen auch durch die Tatsache veranschaulicht, dass auf der ganzen Welt Infektionskrankheiten - und nicht Herzkreislauferkrankungen oder Krebs oder Verletzungen - die meisten Todesfälle und Behinderungen verursachen.
Mehrere etablierte Vakzine bestehen aus attenuierten Lebendorganismen, wobei das Risiko einer Reversion zum virulenten Wildtyp-Stamm besteht. Insbesondere für immunkompromittierte Wirte kann dies lebensbedrohlich sein. Alternativ werden Vakzine als Kombination von von Patho- gen abgeleiteten Antigenen zusammen mit Verbindungen, die Immunreaktionen gegen diese Anti- gene hervorrufen oder verstärken (diese Verbindungen werden allgemein als Adjuvans bezeich- net), verabreicht, da diese Untereinheits-Vakzine für sich alleine im Allgemeinen nicht wirksam sind.
Obgleich nicht bezweifelt wird, dass die obigen Vakzine eine wertvolle medizinische Behand- lung darstellen, besteht dabei der Nachteil, dass auf Grund ihrer Komplexität schwere Nebenwir- kungen hervorgerufen werden können, z. B. auf im Vakzin enthaltene Antigene, die eine Kreuzreak- tivität mit Molekülen, die von Zellen des geimpften Individuums exprimiert werden, aufweisen.
Zusätzlich sind bestehende Anforderungen seitens regelnder Behörden, z. B. der Weltgesundheits- organisation (WHO), der Food and Drug Administration (FDA) und ihrer Europäischen Gegen- stücke, hinsichtlich einer exakten Spezifizierung der Vakzin-Zusammensetzung und der eine Immunität induzierenden Mechanismen schwer zu erfüllen.
Einige Vakzine, die in weitverbreiteter Verwendung sind, sind Ganzzellen-Vakzine (attenuierte Bakterien oder Viren (z.B. Bacille Calmette-Guerin (BCG) (Tuberkulose), Masern, Mumps, Röteln, das orale Polio-Vakzin (Sabin), getötete Bakterien oder Viren (z. B. Pertussis, inaktiviertes Polio- Vakzin (Salk)), Untereinheits-Vakzine (z. B. Toxoid (Diphtherie, Tetanus)), kapseiförmiges Polysac- charid (H. influenza Typ B), rekombinante Hefe-Untereinheit (Hepatitis B surface-Protein).
Ein Vakzin kann eine ganze Vielfalt unterschiedlicher Antigene enthalten. Beispiele für Antige- ne sind ganze getötete Organismen, wie inaktivierte Viren oder Bakterien, Pilze, Protozoen, oder sogar Krebszellen. Antigene können auch aus Unterfraktionen dieser Organismen/Gewebe, aus Proteinen, oder - in ihrer einfachsten Form - aus Peptiden bestehen. Antigene können auch in Form glykosylierter Proteine oder Peptide vom Immunsystem erkannt werden, und sie können auch Polysaccharide oder Lipide sein oder enthalten. Kurze Peptide können verwendet werden, da beispielsweise zytotoxische T-Zellen (cytotoxic T-cells, CTL) Antigene in Form kurzer, üblicherwei- se 8-11 Aminosäuren langer Peptide in Verbindung mit dem Haupt-Histokompatibilitätskomplex (major histocompatibility complex, MHC) erkennen.
B-Zellen können lineare Epitope, die nur 4-5 Aminosäuren lang sind, sowie dreidimensionale Strukturen (Konformations-Epitope) erkennen. Um andauernde, Antigen-spezifische Immunreaktionen zu erhalten, müssen Adjuvantien Immunkaska- den auslösen, an welchen alle benötigten Zellen des Immunsystems beteiligt sind. Vor allem wirken Adjuvantien - ohne Einschrankung ihrer Wirkungsweise - auf sogenannte Antigen-präsen- tierende Zellen (APCs). Diese Zellen treffen üblicherweise zuerst das (die) Antigen (e), prozessiertes oder unmodifiziertes Antigen den Immun-Effektorzellen präsentiert wird. Intermediäre Zelltypen können ebenfalls beteiligt sein. Nur Effektorzellen mit der richtigen Speziität werden bei einer produktiven Immunantwort aktiviert. Das Adjuvans kann auch Antigene und co-injizierte andere Faktoren örtlich festhalten.
Ausserdem kann das Adjuvans als Chemoattraktionsmittel für andere Immunzellen wirken oder kann lokal und/oder systemisch als Stimulans für das Immun- system wirken.
<Desc/Clms Page number 2>
Antigen-präsentierende Zellen gehören zum angeborenen Immunsystem, das sich als erste Verteidigungslinie des Wirts entwickelte, welche die Infektion schon bald nach der Einwirkung von Mikroorganismen einschränkt. Zellen des angeborenen Immunsystems erkennen Muster oder relativ unspezifische Strukturen, die auf ihren Zielen exprimiert sind, eher als differenziertere, spezifische Strukturen, die vom adaptiven Immunsystem erkannt werden. Beispiele für Zellen des angeborenen Immunsystems sind Makrophagen und Dendriten-Zellen, aber auch Granulozyten (z. B. Neutrophile), natürliche Killer-Zellen und andere. Dagegen erkennen Zellen des adaptiven Immunsystems spezifische Antigen-Strukturen, einschliesslich Peptide, im Fall von T-Zellen, und Peptide sowie dreidimensionale Strukturen im Fall von B-Zellen.
Das adaptive Immunsystem ist viel spezifischer und differenzierter als das angeborene Immunsystem und verbessert sich nach wiederholter Einwirkung eines gegebenen Pathogens/Antigens. Phylogenetisch gesehen ist das angeborene Immunsystem viel älter und ist bereits in sehr primitiven Organismen zu finden. Trotz- dem ist das angeborene Immunsystem während der Anfangsphase einer Antigen-Einwirkung von kritischer Bedeutung, da Zellen des angeborenen Immunsystems, d. h. APCs, zusätzlich dazu, dass sie Pathogene enthalten, Zellen des adaptiven Immunsystems "primen" und somit spezifische Immunreaktionen auslösen, die zur Beseitigung der Eindringlinge führen.
Zusammenfassend kann man sagen, dass die Zellen des angeborenen Immunsystems und insbesondere die APCs eine kritische Rolle während der Induktionsphase von Immunreaktionen spielen, indem sie a) Infektio- nen durch ein Erkennungssystem mit einfachem Muster eingrenzen, und b) Zellen des adaptiven Immunsystems "primen", was zu spezifischen Immunreaktionen und einem Gedächtnis führt, das in der Beseitigung eindringender Pathogene oder anderer Ziele resultiert. Diese Mechanismen sind auch wichtig, um Tumorzellen zu beseitigen oder einzugrenzen.
Die für solche Vakzine verwendeten Antigene wurden häufig zufällig oder auf Grund ihrer leich- ten Verfügbarkeit ausgewählt. Es besteht ein Bedarf daran, effiziente Antigene für ein gegebenes Pathogen oder - vorzugsweise - einen fast kompletten Satz von Antigenen eines bestimmten Pathogens, die praktisch (klinisch) relevant sind, zu identifizieren. Solche Antigene können bevor- zugte Antigen-Anwärter bei einem Vakzin sein.
Die WO 00/45839 A2 betrifft ein Verfahren, worin nichtmenschliche Vertebraten mit einer Prä- paration eines pathogenen Organismus immunisiert werden.
In der WO 01/11081 A2 werden potentiell immunogene Polypeptide durch adsorbierte Antikör- per identifiziert. Nicht-adsorbierte Antikörper werden dann gegen Expressionsbibliotheken des Mikroorganismus getestet.
Der Artikel von Barbet in "Veterinary Molecular Biology - Chapter 10" betrifft einen allgemeinen Hintergrundartikel über Vakzinentwicklung.
Der Artikel von Burnie et al. (Infect. Immun. 68 (6) (2000), 3200-3209) betrifft das Immunoblot- ting von Sera von 26 Patienten mit Septikämie gegen einen epidemischen Stamm von resistenten S. aureus-Bakterien. Die überlebenden Patienten zeigten dabei IgG's, mit welchen eine 61-kDa- Bande identifiziert werden konnte.
Der Artikel von Gilden et al. (Arch. Neurol. 58(1) (2001),43-48) betrifft einen allgemeinen Re- view-Artikel über das für Multiple Sklerose verantwortliche Agens.
Schliesslich betrifft die WO 99/30151 A1 ein ganz spezifisches Bakterienoberflächen-Screening- verfahren.
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung diesen Erfordernissen zu entsprechen und ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit welchem solche Antigene vorgesehen werden können und mit welchem ein praktisch kompletter Satz Antigene von beispielsweise einem bestimmten Patho- gen identifiziert werden kann, wobei ein bestimmtes Serum als Antikörperquelle dient. Ein solches Verfahren sollte für rasch veränderliche Pathogene geeignet sein, die eine rasche Resistenz gegen übliche Arzneistoffe oder Vakzine entwickeln.
Daher sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung, Isolierung und Produk- tion hyperimmuner, Serum-reaktiver Antigene von einem Pathogen vor, wobei diese Antigene zur Verwendung in einem Vakzin für eine bestimmte Tierart oder für Menschen geeignet sind, wobei das Verfahren durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist:
das Vorsehen eines Antikörper-Präparats aus einem Plasma-Pool der bestimmten Tierart oder aus einem Humanplasma-Pool oder aus individuellen Seren mit Antikörpern gegen das spezifische Pathogen,
<Desc/Clms Page number 3>
. das Vorsehen von mindestens zwei Expressions-Bibliotheken dieses spezifischen Pathogens, wobei zumindest eine Ribosomen-Display-Bibliothek und eine Bakterien-Oberflächen-Bibliothek vorgesehen sind, . das Screenen dieser mindestens zwei Expressions-Bibliotheken mit diesem Antikörper-Präparat, . das Identifizieren von Antigenen, die bei mindestens zwei dieser Screenings an Antikörper in diesem Antikörper-Präparat binden, .
das Screenen der identifizierten Antigene mit individuellen Antikörper-Präparaten aus individuel- len Seren von Individuen mit Antikörpern gegen dieses spezifische Pathogen, . das Identifizieren des hyperimmunen, Serum-reaktiven Antigen-Teils dieser identifizierten Anti- gene, wobei die hyperimmunen, Serum-reaktiven Antigene an einen relevanten Teil dieser indi- viduellen Antikörper-Präparate aus diesen individuellen Seren binden, und . gegebenenfalls das Isolieren dieser hyperimmunen, Serum-reaktiven Antigene und die Produkti- on dieser hyperimmunen, Serum-reaktiven Antigene mittels chemischer oder rekombinanter
Methoden.
Dieses Verfahren ist im Allgemeinen auch zur Identifizierung eines praktisch kompletten Satzes hyperimmuner, Serum-reaktiver Antigene eines spezifischen Pathogens mit bestimmten Seren als Antikörperquellen geeignet, wenn mindestens drei verschiedene Expressions-Bibliotheken in einem Pathogen/Antigen-Identifikationsprogramm unter Verwendung des Verfahrens gemäss der vorliegenden Erfindung gescreent werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Identifizierung, Isolierung und Produktion eines praktisch kompletten Satzes hyperimmuner, Serum-reaktiver Antigene eines spezifischen Pathogens, wobei diese Antigene zur Verwendung bei einem Vakzin für eine bestimmte Tierart oder für Menschen geeignet sind, welches durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist:
. das Vorsehen eines Antikörper-Präparats aus einem Plasma-Pool dieser bestimmten Terart oder aus einem Human-Plasma-Pool oder individueller Seren mit Antikörpern gegen dieses spe- zifische Pathogen, * das Vorsehen von mindestens drei verschiedenen Expressions-Bibliotheken dieses spezifischen
Pathogens, wobei zumindest eine Ribosomen-Display-Bibliothek und eine Bakterien-Oberflä- chen-Bibliothek vorgesehen sind, . das Screenen dieser mindestens drei verschiedenen Expressions-Bibliotheken mit diesem
Antikörper-Präparat, . das Identifizieren von Antigenen, die bei mindestens einem der mindestens drei Screenings an
Antikörper in diesem Antikörper-Präparat binden, .
das Screenen der identifizierten Antigene mit individuellen Antikörper-Präparaten aus individuel- len Seren von Individuen mit Antikörpern gegen das spezifische Pathogen, . das Identifizieren des hyperimmunen, Serum-reaktiven Antigen-Teils der identifizierten Antigene, welche hyperimmunen, Serum-reaktiven Antigene an einen relevanten Teil der individuellen An- tikörper-Präparate aus diesen individuellen Seren binden, . das mindestens einmalige Wiederholen der Screening- und Identifizierungsschritte, .
das Vergleichen der identifizierten, hyperimmunen, Serum-reaktiven Antigene, die in den wieder- holten Screening- und Identifizierungsschritten identifiziert wurden, mit den identifizierten, hyper- immunen, Serum-reaktiven Antigenen, die in den anfänglichen Screening- und Identifizierungs- schritten identifiziert worden waren, . das weitere Wiederholen der Screening- und Identifizierungsschritte, wenn nur mindestens 5% der hyperimmunen, Serum-reaktiven Antigene in den wiederholten Screening- und Identifizie- rungsschritten identifiziert wurden, bis weniger als 5% der hyperimmunen, Serum-reaktiven Anti- gene in einem weiteren Wiederholungsschritt identifiziert werden, um einen kompletten Satz hyperimmuner, Serum-reaktiver Antigene eines spezifischen Pathogens zu erhalten, und .
gegebenenfalls das Isolieren der hyperimmunen, Serum-reaktiven Antigene und die Herstellung dieser hyperimmunen, Serum-reaktiven Antigene mittels chemischer oder rekombinanter Metho- den.
Das Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung besteht hauptsächlich aus drei wesentlichen Teilen, nämlich: 1. Identifizieren hyperimmuner Serum-Quellen, die spezifische Antikörper gegen ein bestimmtes Pathogen enthalten, 2. Screenen geeigneter Expressions-Bibliotheken mit einem geeigneten Antikörper-Präparat, wobei Anwärter-Antigene (oder Antigen-Fragmente solcher
<Desc/Clms Page number 4>
Antigene) selektiert werden, und 3. aus einer zweiten Screening-Runde, wobei die hyperimmunen, Serum-reaktiven Antigene durch ihre Fähigkeit, an einen relevanten Teil individueller Antikörper- Präparate aus individuellen Seren zu binden, um zu zeigen, dass diese Antigene praktisch relevant und nicht nur hyperimmun, Serum-reaktiv sind, sondern auch ein breites Immunogenitätsspektrum haben (d. h., dass viele individuelle Seren mit einem bestimmten Antigen reagieren).
Mit dem vorliegenden Verfahren ist es möglich, einen Satz von Antigenen eines bestimmten Pathogens vorzusehen, welcher hinsichtlich des gewählten Pathogens und des gewählten Serums praktisch komplett ist. Daher wird mit dem vorliegenden Verfahren eine Tendenz zu "falschen" Antigen- Anwärtern oder zu einem unkompletten Satz von Antigenen eines bestimmten Pathogens ausge- schlossen.
Die Komplettheit des Antigen-Satzes eines bestimmten Pathogens im Sinne der vorliegenden Erfindung hängt natürlich von der Komplettheit der Expressions-Bibliotheken, die beim vorliegen- den Verfahren verwendet werden, und der Qualität und Grösse der getesteten Serumsammlungen (Anzahl individueller Plasmen/Seren) ab, sowohl im Hinblick auf die Repräsentativität der Biblio- thek als auch auf die Nützlichkeit des Expressionssystems. Daher sind bevorzugte Ausführungs- formen des vorliegenden Verfahrens dadurch gekennzeichnet, dass die Expressions-Bibliotheken ausgewählt sind aus einer Ribosomen-Display-Bibliothek, einer Bakterien-Oberflächen-Bibliothek und einem Proteom.
Eine bei der vorliegenden Erfindung verwendete Serumkollektion sollte gegen eine Gruppe be- kannter antigener Verbindungen eines bestimmten Pathogens, wie Polysaccharid-, Lipid- und proteinhältige Bestandteile der Zellwand, Zellmembranen und des Zytoplasmas, sowie der sezer- nierten Produkte getestet werden. Vorzugsweise werden drei verschiedene Serum-Kollektionen verwendet : 1. mit sehr stabilem Altikörper-Repertoire: normale Erwachsene, klinisch gesunde Menschen, die einen früheren Challenge überwunden haben oder zur Zeit Träger beispielsweise eines bestimmten Pathogens sind, ohne akute Erkrankung und Symptome, 2. mit Antikörpern, die tatsächlich durch das Vorhandensein des pathogenen Organismus induziert sind : mit akuter Krankheit mit verschiedenen Manifestationen (z. B.
S. aureus-Sepsis oder Wundinfektion usw. ), 3. mit überhaupt keinen spezifischen Antikörpern (als negative Kontrollen): 5-8 Monate alte Babys, die die von der Mutter übertragenen Immunglobuline 5-6 Monate nach der Geburt verloren haben. Die Seren müssen mit mehreren Pathogen-spezifischen Antigenen reagieren, um sie als hyperimmun für ein bestimmtes Pathogen (Bakterien, Pilz, Wurm oder anderes) und für das beim Screening-Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung Relevante anzusehen.
Beim Antigen-Identifizierungsprogramm zur Identifizierung eines kompletten Satzes von Anti- genen gemäss der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass die mindestens drei verschiede- nen Expressions-Bibliotheken mindestens eine Ribosomen-Display-Bibliothek, eine Bakterien- Oberflächen-Bibliothek und ein Proteom sind. Es wurde beobachtet, dass, obwohl alle Expressi- ons-Bibliotheken komplett sein können, die Verwendung von nur einer oder zwei Expressions- Bibliotheken bei einem Antigen-Identifizierungsprogramm nicht zu einem kompletten Satz von Antigenen führen wird, weil jede der verschiedenen Expressions-Bibliotheken präferentielle Ex- pressionseigenschaften hat.
Obgleich es daher möglich ist, hyperimmune, Serum-reaktive Antige- ne zu erhalten, indem man nur eine oder zwei verschiedene Expressions-Bibliotheken verwendet, würde dies möglicherweise in vielen Fällen letztlich nicht zur Identifizierung eines kompletten Satzes hyperimmuner, Serum-reaktiver Antigene führen. Natürlich bedeutet der Ausdruck "kom- plett" gemäss der vorliegenden Erfindung nicht ein theoretisches Maximum, sondern ist tatsächlich eine praktische Vollständigkeit, d. h., dass mindestens 95% der praktisch relevanten Antigene oder Antigen-Determinanten für ein bestimmtes Pathogen identifiziert wurden. Die praktische Relevanz ist dabei durch das Auftreten von Antikörpern gegen bestimmte Antigene in der Patienten- Population definiert.
Gemäss der vorliegenden Erfindung sind auch Serum-Pools oder Plasma-Fraktionen oder an- dere gepoolte, Antikörper enthaltende Körperflüssigkeiten "Plasma-Pools".
Eine Expressions-Bibliothek, wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, sollte mindestens die Expression aller potentiellen Antigene, z.B. aller Oberflächen-Proteine eines bestimmten Patho- gens, ermöglichen. Mit den Expressions-Bibliotheken gemäss der vorliegenden Erfindung ist min- destens ein Satz potentieller Antigene eines bestimmten Pathogens vorgesehen, wobei dieser Satz vorzugsweise das komplette theoretische Komplement von (Poly)-Peptiden ist, die durch das
<Desc/Clms Page number 5>
Genom des Pathogens (d.h. Genom-Bibliotheken, wie in Beispiel 2 beschrieben) codiert und entweder in einem rekombinanten Wirt (vgl. Beispiel 3) oder in vitro (vgl. Beispiel 4) exprimiert sind.
Dieser Satz potentieller Antigene kann auch ein Protein-Präparat sein, im Falle extrazellulärer Pathogene vorzugsweise ein Protein-Präparat, das Oberflächen-Proteine dieses Pathogens ent- hält, die von diesem Pathogen, das unter definierten physiologischen Bedingungen gezüchtet wurde, erhalten wurden (vgl. Beispiel 5). Obgleich der Weg über das Genom potentiell den kom- pletten Satz Antigene enthalten kann, hat letzterer den Vorteil, die Proteine in ihrem natürlichen Zustand zu enthalten, d. h. beispielsweise einschliesslich post-translatorischer Modifikationen oder prozessierter Formen dieser Proteine, die aus der DNA-Sequenz nicht offensichtlich sind. Diese oder andere Sätze potentieller Antigene von einem Pathogen, werden nachstehend als "Expressi- ons-Bibliothek" bezeichnet.
Expressions-Bibliotheken sehr unterschiedlicher Arten können im Laufe der vorliegenden Erfindung angewendet werden. Geeignete Beispiele sind z. B. in Ausubel et al., 1994, angegeben. Insbesondere bevorzugt sind Expressions-Bibliotheken, die das gesamte gene- tische Set eines Pathogens in rekombinanter Form darstellen, wie durch in vitro-Translationstechni- ken erhaltene Expressionsbibliotheken, z. B. Ribosomen-Display, oder prokaryontische Expressi- onssysteme, z.B. Bakterien-Oberflächen-Expressions-Bibliotheken, oder Expressionsbibliotheken, die spezifischen physiologischen Expressionszuständen eines bestimmten Pathogens in einem bestimmten physiologischen Zustand ähnlich sind, wie ein Proteom.
Ribosomen-Display ist ein etabliertes Verfahren in der rekombinanten DNA-Technik, die für je- des spezifische Pathogen zum Zwecke der vorliegenden Erfindung anwendbar ist (Schaffitzel et al., 1999). Bakterien-Oberflächen-Display-Bibliotheken werden durch eine rekombinante Bibliothek eines bakteriellen Wirtes repräsentiert, der ein (gesamtes) Set exprimierter Peptid-Sequenzen eines bestimmten Pathogens, z. B. auf einem ausgewählten Aussenmembran-Protein an der Mem- bran des bakteriellen Wirtes, präsentiert (Georgiou et al., 1997).
Abgesehen davon, dass Peptid- oder Protein-Sequenzen in einem Aussenmembran-Protein präsentiert werden, sind auch andere Bakterien-Display-Techniken, wie Bakteriophagen-Display-Technologien und die Expression über exportierte Proteine, ebenfalls zum Erhalt von Bakterien-Oberflächen-Expressions-Bibliotheken bevorzugt (Forrer et al., 1999 ; Rodi und Makowski, 1993 ; et al., 1997).
Das Antigen-Präparat für die erste Screening-Runde beim Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung kann von jeder Quelle stammen, die Antikörper gegen ein bestimmtes Pathogen enthält.
Vorzugsweise wird, wenn ein Plasma-Pool als Quelle für das Antikörper-Präparat verwendet wird, ein Humanplasma-Pool ausgewählt, das Spender umfasst, die eine Infektion mit dem bestimmten Pathogen hatten oder haben. Obwohl eine solche Selektion von Plasma oder Plasma-Pools im Prinzip eine Standard-Technik, beispielsweise bei der Erzeugung von Hyperimmunglobulin- Präparaten ist, war es überraschend, dass solche Techniken diese Auswirkungen haben, wie insbesondere für die bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gezeigt.
Vorzugsweise sind die Expressions-Bibliotheken Genom-Expressions-Bibliotheken eines be- stimmten Pathogens, oder alternativ m-RNA-Bibliotheken. Es ist bevorzugt, dass diese Genom- oder m-RNA-Bibliotheken komplette Genom- oder m-RNA-Expressions-Bibliotheken sind, was heisst, dass sie mindestens einmal alle möglichen Proteine, Peptide oder Peptidfragmente des bestimmten Pathogens enthalten. Vorzugsweise weisen die Genom-Expressions-Bibliotheken eine Redundanz von mindestens 2x, mehr bevorzugt mindestens 5x, insbesondere mindestens 10x, auf.
Vorzugsweise umfasst das Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung das Screenen minde- stens einer Ribosomen-Display-Bibliothek, einer Bakterien-Oberflächen-Display-Bibliothek und eines Proteoms mit dem Antikörper-Präparat und das Identifizieren von Antigenen, die bei minde- stens zwei, vorzugsweise allen, Screenings an Antikörper in diesem Antikörper-Präparat binden.
Solche Antigene können dann - unabhängig vom Expressions-Weg - als besonders geeignet als hyperimmunogene Antigene angesehen werden. Vorzugsweise sollten die mindestens zwei Screenings mindestens das Proteom enthalten, da das Proteom immer die Antigene als natürlich exprimierte Proteine repräsentiert, einschliesslich post-translationaler Modifikationen, Prozessierung usw., die aus der DNA-Sequenz nicht offensichtlich sind.
Das Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung kann an jedem beliebigen Pathogen ange- wendet werden. Daher sind bevorzugte Pathogene ausgewählt aus der Gruppe der Bakterien-, Virus-, Pilz- und Protozoen-Pathogene. Natürlich sind besonders die rekombinanten Methoden
<Desc/Clms Page number 6>
ziemlich einfach für Pathogene, die ein kleines Genom oder eine vergleichsweise geringe Anzahl exprimierter Proteine haben (wie bakterielle oder virale Pathogene) und sind komplizierter für komplexe (eukaryontische) Organismen mit grossen Genomen. Es sind jedoch auch solche grossen Genom-Bibliotheken von Pathogenen höherer Organismen mit dem Verfahren gemäss der vorlie- genden Erfindung gut analysierbar, zumindest auf raschere und verlässlichere Weise als mit be- kannten Verfahren zur Identifizierung geeigneter Antigene.
Bevorzugte zu analysierende Pathogene, bzw. welche Antigene zu extrahieren sind, umfassen das Humane Immundefizienz-Virus (HIV), Hepatitis A-Virus (HAV), Hepatitis B-Virus (HBV), Hepa- titis C-Virus (HCV), Rous-Sarkom-Virus (RSV), Epstein-Barr-Virus (EBV), Influenza-Virus (IV), Rotavirus (RV), Staphylococcus aureus (S.aureus), Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis), Chlamydia pneumoniae (C.
Pneumoniae), Chlamydia trachomatis (C. trachomatis), Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), Mycobacterium leprae (M. leprae), Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae), Streptococcus pyogenes (S. pyogenes), Streptococcus agalactiae (S. agalactiae), Enterococcus faecalis (E. faecalis), Bacillus anthracis (B. anthracis), Vibrio cholerae (V. cholerae), Borrelia burgdorferi (B. burgdorferi), Plasmodium sp., Pilzerkrankungen, wie Pneumocystis carinii, Aspergillus sp., Cryptococcus sp., Candida albicans, oder parasitäre Infektionen, wie Ascariasis (Ascaris lumbricoides) und Taeniasis (Taenia saginata). Das erfindungsgemässe Verfahren ist am meisten anwendbar für Bakterien, Würmer oder Candida.
Als Modell-Organismus für die vorliegende Anmeldung wurde Staphylococcus aureus gewählt, um die Anwendbarkeit und Wirksamkeit des Verfahrens gemäss der vorliegenden Erfindung zu demonstrieren. Insbesondere in Bezug auf die Beispiele ist klar, dass die Erfindung auf alle poten- tiellen Pathogene, insbesondere die oben angeführten, leicht übertragen werden kann.
Es war überraschend, dass das Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung ein effizientes und rasches biologisches Screenen eines bestimmten Pathogens ermöglicht, insbesondere ange- sichts der Tatsache, dass nur ein kleiner Bruchteil des Antikörper-Repertoirs eines Patienten auf ein bestimmtes Pathogen gerichtet ist, selbst in einem Zustand, in dem dieses Pathogen wirksam besiegt ist. Im Laufe der vorliegenden Erfindung, insbesondere während der Durchführung des S. aureus-Beispiels, wurde die Entdeckung gemacht, dass nur 1-2% des Antikörper-Repertoirs eines Patienten mit hohem Titer gegen S. aureus tatsächlich gegen S. aureus gerichtete Antikörper sind.
Ausserdem sind über 70% dieses spezifischen 1%-Teiles gegen Antigene gerichtet, die kein Protein sind, wie Teichoinsäure, so dass nur insgesamt 0,1% oder weniger der Antikörper gegen protein- hältige Antigene gerichtet sind.
Einer der Vorteile der Verwendung rekombinanter Expressions-Bibliotheken, insbesondere von Ribosomen-Display-Bibliotheken und Bakterien-Oberflächen-Display-Bibliotheken, ist, dass die identifizierten hyperimmunen, Serum-reaktiven Antigene sofort durch Expression der Codier- Sequenzen der gescreenten und selektierten Klone, die die hyperimmunen, Serum-reaktiven Antigene exprimieren, erzeugt werden können, ohne dass eine weitere rekombinante DNA- Technologie oder Klonierungsschritte notwendig sind.
Gemass einer bevorzugten Ausführungsform stammt das individuelle Antikörper-Präparat für die zweite Screening-Runde von Patienten, die eine akute Infektion mit dem bestimmten Pathogen hatten, insbesondere von Patienten, die einen Antikörper-Titer gegen das bestimmte Pathogen aufweisen, der über einem bestimmten Minimum liegt, beispielsweise ein Antikörper-Titer von mehr als 80 Perzentil, vorzugsweise mehr als 90 Perzentil, insbesondere mehr als 95 Perzentil, der getesteten Human-(Patienten- oder Träger-) Seren. Die Verwendung individueller Antikörper- Präparate mit so hohem Titer in der zweiten Screening-Runde ermöglicht eine sehr selektive Identifikation der hyperimmunen, Serum-reaktiven Antigene gegen das bestimmte Pathogen.
Es ist wichtig, dass das zweite Screenen mit den individuellen Antikörper-Präparaten (die auch das selektierte Serum sein können) eine selektive Identifizierung der hyperimmunen, Serum- reaktiven Antigene aus all den vielversprechenden Anwärtern aus der ersten Runde ermöglicht.
Daher sollten mindestens 10 individuelle Antikörper-Präparate (d. h. Antikörper-Präparate (z.B.
Seren) von mindestens 10 verschiedenen Individuen, die eine Infektion mit dem gewählten Patho- gen erlitten haben) bei der Identifizierung dieser Antigene in der zweiten Screening-Runde ver- wendet werden. Es ist natürlich möglich, auch weniger als 10 individuelle Präparate zu verwenden, jedoch könnte die Selektivität des Schrittes mit einer geringeren Anzahl von individuellen Antikör- per-Präparaten nicht optimal sein. Anderseits ist, wenn ein bestimmtes hyperimmunes, Serum-
<Desc/Clms Page number 7>
reaktives Antigen (oder ein Antigen-Fragment davon) in mindestens 10 individuellen Antikörper- Präparaten, vorzugsweise mindestens 30, insbesondere mindestens 50 individuellen Antikörper- Präparaten, erkannt wird, die Identifizierung des hyperimmunen, Serum-reaktiven Antigens auch selektiv genug für eine korrekte Identifizierung.
Die hyperimmune Serum-Reaktivität kann natürlich auch mit so vielen individuellen Präparaten wie möglich getestet werden (z. B. mit mehr als 100 oder sogar mit mehr als 1000).
Deshalb sollte der relevante Teil des hyperimmunen, Serum-reaktiven Antikörper-Präparats gemäss dem Verfahren der vorliegenden Erfindung vorzugsweise mindestens 10, mehr bevorzugt mindestens 30, insbesondere mindestens 50 individuelle Antikörper-Präparate sein. Alternativ (oder in Kombination) kann hyperimmunes, Serum-reaktives Antigen vorzugsweise auch bei min- destens 20%, vorzugsweise mindestens 30%, insbesondere mindestens 40%, aller individuellen Antikörper-Präparate identifiziert werden, die bei der zweiten Screening-Runde verwendet werden.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Seren, aus welchen die individuellen Antikörper-Präparate für die zweite Screening-Runde hergestellt werden (oder welche als Antikörper-Präparate verwendet werden), durch ihren Titer gegen das spezifische Pathogen (z. B. gegen ein Präparat dieses Pathogens, wie ein Lysat, Zellwand-Komponenten und rekombinante Proteine) selektiert. Vorzugsweise sind einige mit einem Gesamt-lgA-Titer über 4000 E, insbesondere über 6000 E, und/oder einen IgG-Titer von über 10 000 E, insbesondere über 12 000 E (E = Einheiten, berechnet aus der OD405nm-Ablesung bei einer bestimmten Verdün- nung) selektiert, wenn ein ganzer Organismus (Gesamt-Lysat oder Ganz-Zellen) als Antigen in ELISA \erwendet wird.
Individuelle Proteine mit Ig-Titern von mehr als 800-1000 E sind für die Selektion der hyperimmunen, Serum-reaktiven Antigene gemäss der vorliegenden Erfindung ledig- lich auf Gesamt-Titer besonders bevorzugt. Die Feststellung bezüglich individueller Proteine kann Fig. 9 entnommen werden.
Gemäss dem Demonstrations-Beispiel, das auch eine bevorzugte Ausführungsform der vorlie- genden Erfindung darstellt, ist das bestimmte Pathogen ein Staphylococcus-Pathogen, insbeson- dere Staphylococcus aureus. Staphylokokken sind opportunistische Pathogene, die Krankheiten verursachen können, die von geringfügigen Infektionen bis zu lebensbedrohenden Erkrankungen reichen. Von der grossen Anzahl der Staphylokokken sind mindestens 3 allgemein mit Krankheiten des Menschen verbunden : aureus, S. epidermidis und selten S. saprophyticus (Crossley und Archer, 1997). S. aureus wurde im Laufe der vorliegenden Erfindung als illustratives Beispiel für die Art, wie die vorliegende Erfindung funktioniert, verwendet. Ausserdem ist er auch ein wichtiger Organismus hinsichtlich seiner schweren pathogenen Auswirkungen auf den Menschen.
Staphylo- kokken-Infektionen stellen weltweit eine zunehmende Gefahr in den Spitälern dar. Das Auftreten und die Krankheits-verursachende Kapazität der Staphylokokken stehen mit der weitverbreiteten Verwendung von Antibiotika in Verbindung, die eine Multi-Arzneistoff-Resistenz induzierten und weiterhin induzieren. Aus diesem Grund kann die medizinische Behandlung gegen Staphylokok- ken-Infektionen nicht mehr ausschliesslich auf Antibiotika beruhen. Es ist daher eine taktische Änderung bei der Behandlung dieser Erkrankungen dringendst notwendig, die darauf abzielt, Infektionen zu vermeiden. Die Induktion von Hoch-Affinitäts-Antikörpern vom Opsonisierungs- und Neutralisierungstyp durch Impfung hilft dem angeborenen Immunsystem, Bakterien und Toxine zu eliminieren.
Dies macht das Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung zu einem optimalen Werkzeug für die Identifizierung von Staphylokokken-Antigen-Proteinen.
Jeder Mensch ist von S. epidermidis besiedelt. Die normalen Habitate von S. epidermidis sind die Haut und die Schleimhaut. Die Haupthabitate der am meisten pathogenen Spezies, S. aureus, sind die vordere Nasenöffnung und das Perineum. Einige Individuen werden zu dauerhaften S. aureus-Trägern, oft mit demselben Stamm. Das Trägerstadium ist klinisch relevant, weil Träger, die operiert werden, mehr Infektionen haben als Nicht-Träger. Im Allgemeinen verhindert die etablierte Nasen-Flora das Ansiedeln neuer Stämme. Jedoch kann eine Besiedelung mit anderen Stämmen auftreten, wenn eine Antibiotikum-Behandlung erfolgt, die zur Eliminierung des empfindlichen Träger-Stammes führt. Weil diese Situation in den Spitälern vorkommt, können Patienten mit resistenten, Krankenhaus-Staphylokokken besiedelt werden.
Diese Bakterien haben eine angebo- rene Adaptionsfähigkeit, die durch die weit verbreitete und manchmal inkorrekte Verwendung von antimikrobischen Mitteln ergänzt wird. Daher bieten Spitäler ein fruchtbares Umfeld für die Entwick- lung von Arzneimittel-Resistenzen (naher Kontakt unter kranken Patienten, extensive Verwendung
<Desc/Clms Page number 8>
von antimikrobiellen Mitteln, Krankenhaus-Infektionen). Sowohl S. aureus als auch S. epidermidis sind gegen viele allgemein verwendete Antibiotika resistent geworden, insbesondere gegen Methi- cillin (MRSA) und Vancomycin (VISA). Die Arzneimittel-Resistenz ist eine Sorge der öffentlichen Gesundheit von wachsender Bedeutung, und es könnte sein, dass bald viele durch Staphylokok- ken verursachte Infektionen durch Antibiotika unbehandelbar sind.
Zusätzlich zu dieser negativen Auswirkung auf die Volksgesundheit, erhöht die Antimikroben-Resistenz die Kosten des Gesund- heitswesens, da die Behandlung resistenter Infektionen oft die Verwendung toxischerer und teure- rer Arzneimittel erforderlich macht und zu längeren Krankenhausaufenthalten infizierter Patienten führen kann.
Ausserdem haben die schwersten Staphylokokken-Infektionen auch unter Einsatz wirksamer Antibiotika eine Mortalitätsrate von 30-50%.
Staphylokokken werden potentiell pathogen, sobald das natürliche Gleichgewicht zwischen den Mikroorganismen und dem Immunsystem gestört wird, wenn natürliche Barrieren (Haut, Schleim- haut) durchbrochen werden. Der Koagulase-positive S. aureus ist die am höchsten pathogene Staphylokokken-Spezies, die von den Chirurgen seit langem gefürchtet ist. Am häufigsten verur- sacht sie Infektionen chirurgischer Wunden und induziert die Bildung von Abszessen. Diese lokale Infektion kann systemisch werden und eine Bakteriämie und Sepsis bewirken. Insbesondere nach Virusinfektionen und bei älteren Menschen kann sie eine schwere Pneumonie verursachen.
S. aureus ist auch eine häufige Ursache für Infektionen, die mit medizinischen Vorrichtungen, wie intravaskulären und perkutanen Kathetern (Endocarditis, Sepsis, Peritonitis) und prothetischen Vorrichtungen (septische Arthritis, Osteomyelitis) in Zusammenhang stehen. S. epidermidis verur- sacht Erkrankungen, die vor allem mit der Anwesenheit eines Fremdkörpers und der Benützung von Vorrichtungen verbunden sind, wie mit einem Katheter verbundene Infektionen, Liquor cere- brospinalis-Shunt-Infektionen, Peritonitis bei Dialyse-Patienten (vor allem CAPD), Endocarditis bei Individuen mit prothetischen Ventilen. Dies sind z. B. immunkompromittierte Individuen, wie Onko- logie-Patienten, und Frühgeburten, bei welchen Koagulase-negative Staphylokokken-Infektionen in Verbindung mit der Verwendung einer intravaskulären Vorrichtung häufig vorkommen.
Das ver- mehrte Auftreten steht in Beziehung mit der vermehrten Verwendung dieser Vorrichtungen und einer steigenden Anzahl immunkompromittierter Patienten.
Über S. saprophyticus, einen anderen Koagulase-negativen Staphylokokkus, der bei zuvor ge- sunden Menschen eine akute Harnwegsinfektion auslöst, weiss man viel weniger. Mt einigen Ausnahmen sind dies Frauen im Alter von 16-25 Jahren.
Die Pathogenese von Staphylokokken ist multifaktoriell. Um die Infektion auszulösen, muss das Pathogen Zugang zu den Zellen und Geweben des Wirts erhalten, d. h., an diesen haften. S. aureus e < primiert Oberflächen-Proteine, die das Anhaften an den Wirts-Proteinen fördern, wie Laminin, Fibronectin, Elastin, Vitronectin, Fibrinogen und viele andere Moleküle, die Teil der extra- zellulären Matrix bilden (extrazelluläre Matrix-bindende Proteine, ECMBP). S. epidermidis ist mit Zelloberflächenmolekülen ausgestattet, die das Haften an Fremdmaterial fördern und durch diesen Mechanismus die Infektion im Wirt etablieren. Die anderen starken Waffen, die die Staphylokokken benützen, sind die sezernierten Produkte, wie Enterotoxine, Exotoxme und Gewebe-schädigende Enzyme.
Die Toxine töten Immunzellen, die wichtig bei der Verteidigung des Wirts sind, oder leiten sie fehl. Die vielen verschiedenen Toxin-Typen sind für die meisten der bei Infektionen auftreten- den Symptome verantwortlich.
Die Wirtsverteidigung gegen S. aureus beruht hauptsächlich auf angeborenen immunologi- schen Mechanismen. Die Haut und die Schleimhäute sind starke Barrieren gegen eine Invasion durch Staphylokokken. Sobald jedoch die Haut oder die Schleimhäute durchbrochen sind (Wun- den, perkutane Katheter usw. ), beginnt die erste Linie der nicht-adaptiven Zellverteidigung ihre koordinierte Aktion durch Komplement und Phagozyten, insbesondere die polymorphonuklearen Leukozyten (PMNs). Diese Zellen können als grundlegend für die Eliminierung eindringender Bakterien angesehen werden. Da Staphylococci vor allem extrazelluläre Pathogene sind, kommt die adaptive Haupt-Anti-Staphylokokken-Reaktion vom humoralen Arm des Immunsystems und wird durch drei Haupt-Mechanismen vermittelt : Förderung der Opsonisierung, die Toxin- Neutralisierung und die Haftungshemmung.
Man nimmt an, dass die Opsonisierung besonders wichtig ist, weil dies für eine wirksame Phagozytose notwendig ist. Für eine effiziente Opsonisie- rung muss die mikrobielle Oberfläche mit Antikörpern und Komplement-Faktoren zur Erkennung
<Desc/Clms Page number 9>
mittels PMNs durch Rezeptoren für das Fc-Fragment des IgG-Moleküls oder für aktiviertes C3b beschichtet sein. Nach der Opsonisierung werden Staphylokokken phagozytiert und getötet.
Ausserdem kann S. aureus an Endothelzellen haften und durch einen Phagozytose-artigen Prozess internalisiert werden. Antikörper, die an spezifische Antigene an der Zelloberfläche von Bakterien gebunden sind, dienen als Liganden für die Bindung an PMNs und fördern die Phagozytose. Von diesen selben Antikörpern, die an die Adhesine und andere Zelloberflächen-Proteine gebunden sind, erwartet man, dass sie die Adhäsion neutralisieren und eine Besiedelung verhindern.
Es gibt wenig klinische Beweise dafür, dass die Zell-vermittelte Immunität einen wesentlichen Beitrag zur Verteidigung gegen Staphylokokken leistet, doch muss man zugeben, dass die Frage nicht entsprechend behandelt worden ist. Es ist jedoch bekannt, dass Staphylococcus aureus ein umfangreiches Arsenal an Gegenmassnahmen zur Manipulation der defensiven Mikroumgebung des infizierten Wirts benützt, indem er Polypeptide, die als Superantigene bezeichnet werden, sezerniert, welche auf die Multirezeptor-Kommunikation zwischen T-Zellen und Antigen-präsentie- renden Zellen, die für das Auslösen einer Pathogen-spezifischen Immun-Clearance von grund- legender Bedeutung ist, gerichtet sind. Superantigene spielen beim toxischen Schock-Syndrom und der Lebensmittelvergiftung eine kritische Rolle, doch versteht man ihre Funktion bei Routine- Infektionen nicht genau.
Ausserdem kann man ohne Beteiligung von T-Zellen keine lang anhaltende Antikörper (Gedächtnis)-Reaktion erwarten. Es ist auch bekannt, dass der Grossteil der Anti- Staphylokokken-Antikörper gegen T-Zellen-unabhängige Antigene (Kapsel-Polysaccharide, Lipotei- choinsäure, Peptidoglykan) ohne Gedächtnisfunktion ist. Die T-Zellen-abhängigen proteinhältigen Antigene können schützende Langzeit-Antikörper-Reaktionen hervorrufen. Diese Staphylokokken- Proteine und-Peptide wurden bisher noch nicht bestimmt.
Aus allen diesen oben erwähnten Gründen ist eine taktische Änderung im Kampf gegen Staphylokokken-Infektionen dringend notwendig. Ein Weg zur Bekämpfung von Infektionen ist, sie durch aktive Immunisierung zu verhindern. Die Entwicklung von Vakzinen gegen S. aureus wurde weltweit von mehreren Forschergruppen und staatlichen Institutionen begonnen, doch gibt es bisher noch kein wirksames, zugelassenes Vakzin. Es zeigte sich, dass ein Antikörper-Mangel- zustand zur Staphylokokken-Hartnäckigkeit beiträgt, was nahelegt, dass anti-Staphylokokken- Antikörper bei der Verteidigung des Wirts wichtig sind. Antikörper - als passive Immunisierung zugegeben oder durch aktive Vakzinierung induziert-, die gegen Oberflächen-Bestandteile gerich- tet sind, könnten sowohl das Anhaften von Bakterien verhindern als auch Toxine neutralisieren und die Phagozytose fördern.
Ein Vakzin auf Basis von Fibronectin-bindendem Protein induziert eine schützende Immunität gegen Mastitis bei Rindern und lässt den Schluss zu, dass dieser Weg bei Menschen funktionieren könnte (refs.). All dies zusammen weist darauf hin, dass ein wirksames Vakzin aus Proteinen oder Polypeptiden zusammengesetzt sein sollte, die von allen Stämmen exprimiert werden und hoch-affine, im Überschuss vorhandene, gegen die Zelloberflächen- Bestandteile von S. aureus gerichtete Antikörper induzieren können. Die Antikörper sollten lgG1 und/oder lgG3 für die Opsonisierung und jeder IgG-Subtyp und IgA zur Neutralisierung der Haftung und Toxin-Wirkung sein.
Ein chemisch definiertes Vakzin ist notwendigerweise im Vergleich zu einem Ganzzellen-Vakzin (attenuiert oder getötet) deutlich überlegen, da Bestandteile von S. aureus, die TR-Zellen (Superantigene) paralysieren oder die Opsonisierung (Protein A) inhibieren, eliminiert werden können, und die individuellen Proteine, die protektive Antikörper induzieren, ausgewählt werden können. Die Identifizierung der relevanten Antigene hilft mit, eine wirksame passive Immunisierung zu erzeugen (humanisierte monoklonale Antikörper-Therapie), die die Human-Immunglobulin-Verabreichung mit all ihren gefährlichen Nebenwirkungen ersetzen kann.
Staphylokokken-Infektionen bei Neugeborenen, schwere Septikämie und andere lebensbedrohen- de akute Erkrankungen sind das Hauptziel einer passiven Immunisierung. Ein wirksames Vakzin bietet für Patienten, die allgemein vor elektiven Operationen stehen, und insbesondere für jene, die endovaskuläre Vorrichtungen erhalten, eine grosse Möglichkeit. Ausserdem werden vermutlich Patienten, die an chronischen Erkrankungen leiden, die die Immunreaktionen verringern, oder die einer dauernden ambulanten Peritoneal-Dialyse unterzogen werden, von einem solchen Vakzin profitieren.
Für das illustrative Beispiel, das Staphylococcus aureus betrifft, wurden parallel drei verschie- dene Wege verwendet. Alle drei dieser Methoden beruhen auf der Wechselwirkung von Staphylo- kokkus-Proteinen oder-Peptiden mit den im Humanseren vorhandenen Antikörpern beim Verfah-
<Desc/Clms Page number 10>
ren gemäss der vorliegenden Erfindung. Diese Wechselwirkung beruht auf der Erkennung von Epitopen im Inneren der Proteine, die kurze Peptide (lineare Epitope) oder Polypeptid-Domänen (strukturelle Epitope) sein können. Die Antigen-Proteine werden mit den verschiedenen Methoden unter Verwendung von Pools zuvor ausgewählter Seren und - in der zweiten Screening-Runde - durch individuelle, selektierte Seren identifiziert.
Nach dem Hochdurchsatz-Screenen werden die selektierten Antigen-Proteine als rekombinan- te Proteine oder in vitro-translatierte Produkte (falls nicht in prokaryontischen Expressions-Syste- men exprimierbar) exprimiert und in einer Reihe von ELISA und Western-Blot-Tests zur Beurtei- lung der Immunogenität mit einer grossen Human-Serumkollektion ( > 100 nicht infiziert, > 50 Patien- ten-Seren) getestet. Die bevorzugten Antigene befinden sich an der Zelloberfläche oder sie sind sezerniert, d.h. extrazellulär zugänglich. Man erwartet, dass Antikörper gegen Zellwand-Proteine (wie die extrazellulären Matrix-bindenden Proteine) einem doppelten Zweck dienen : Adhäsion zu hemmen und die Phagozytose zu fördern. Die Antikörper gegen die sezernierten Proteine sind bei der Toxin-Neutralisierung günstig.
Es ist auch bekannt, dass Bakterien miteinander durch sezernierte Proteine kommunizieren. Neutralisierende Antikörper gegen diese Proteine werden eine wachstumsfördernde Kreuz-Kommunikation zwischen oder innerhalb von Staphylokokken- Spezies unterbrechen. Die Bioinformatik (Signal-Sequenzen, Zellwand-Lokalisierungssignale, Transmembran-Domänen) erwies sich als sehr nützlich bei der Beurteilung der Zeiloberflächen- Lokalisierung oder Sezernierung.
Zu diesem Herangehen über Versuche gehört die Isolierung von Antikörpern mit den entsprechenden Epitopen und Proteinen aus Human-Serum und die Verwen- dung derselben als Reagenzien bei den folgenden Tests: Zelloberflächenfärbung von Staphylokok- ken, die unter verschiedenen Bedingungen gezüchtet worden sind (FACS, Mikroskopie), die Be- stimmung einer neutralisierenden Kapazität (Toxin, Haftung), und die Förderung der Opsonisierung und Phagozytose (in vitro-Phagozytose-Test).
Die Erkennung der linearen Epitope durch Antikörper kann auf Sequenzen, die nur 4-5 AS lang sind, basieren. Natürlich bedeutet es nicht unbedingt, dass diese kurzen Peptide den bestimmten Antikörper in vivo induzieren können. Aus diesem Grund können die definierten Epitope, Polypep- tide und Proteine weiters in Tieren (vor allem in Mäusen) auf ihre Fähigkeit getestet werden, Anti- körper gegen die selektierten Proteine in vivo zu induzieren. Die Antigene mit der erwiesenen Fähigkeit, Antikörper zu induzieren, werden in Tiermodellen auf die Fähigkeit, Infektionen zu ver- hindern, getestet.
Die Antikörper, die vom menschlichen Immunsystem gegen Staphylokokken erzeugt wurden und in Human-Seren anwesend snd, sind ein Zeichen für die in vivo-Expression der Antigen- Proteine und ihrer Immunogenität.
Das Verfahren ist in den folgenden Beispielen und in den Figuren weiter beschrieben, sollte je- doch nicht auf diese eingeschränkt werden.
Fig. 1 zeigt die Vorselektion von Seren auf Basis von mittels ELISA gemessenen anti-Staphylo- kokken-Antikörper-Titern.
Fig. 2 zeigt die Grössenverteilung der DNA-Fragmente in der LSA50/6-Bibliothek bei pMAL4.1.
Fig. 3 zeigt die MACS-Selektion mit biotinyliertem Human-Serum. Die LSA50/6-Bibliothek in pMAL9. 1 wurde mit 10 g biotinyliertem Human-Serum in der ersten (A) und mit 1 g in der zweiten Selektions-Runde (B) gescreent. P.serum : B.serum: Kleinkinder-Serum. Die Anzahl der Zellen nach der 2. und 3. Elution ist für jede Selektionsrunde angegeben.
Fig. 4 zeigt die Serum-Reaktivität mit spezifischen Klonen, die durch Bakterien-Oberflächen- Display isoliert wurden, wie mittels Western-Blot-Analyse bei einem Patienten-Serum bei einer Verdünnung von 1:5000 analysiert.
Fig. 5 zeigt einen Peptid-ELISA mit Serum von Patienten und gesunden Individuen mit einem durch Ribosomen-Display identifizierten Epitop.
Fig. 6 zeigt einen repräsentativen, 2D-lmmunoblot von S. aureus-Oberflächen-Proteinen, die mit Human-Seren detektiert wurden. 800pg Protein aus S. aureus/COL, auf BHI gezüchtet, wurden durch IEF (pl 47) und SDS-PAGE (9-16%) aufgetrennt und danach auf eine PVDF-Membran transferiert. Nach dem Blockieren wurde die Membran mit Seren IC35 (1:20.000) inkubiert. Die Bindung von Serum-IgG wurde mittels eines anti-Human-IgG/HRPO-Konjugats und ECL-Entwick- lung sichtbar gemacht.
Fig. 7 zeigt ein repräsentatives 2D-Gel, das S. aureus-Oberflächen-Proteine zeigt, die mit
<Desc/Clms Page number 11>
Coomassie Blue gefärbt worden waren, 1 mg Protein von S. aureus/COL wurde durch IEF (pl 4-7) und SDS-PAGE (9-16%) aufgetrennt. Spots, die zur Sequenzierung nach serologischer Proteom- Analyse ausgewählt worden waren, sind markiert.
Fig. 8A und 8B zeigen die Struktur der LPXTG-Zellwand-Proteine.
Fig. 9 zeigt die IgG-Reaktion bei nicht-infizierten (N, C) und infizierten (P) Patienten auf LPXTGV, ein neues Antigen und wahrscheinliches Oberflächen-Adhesin von S. aureus, das so- wohl auf dem erfindungsgemässen Bakterienoberflächen-Display-Weg als auch auf dem Weg über Proteomics entdeckt wurde.
Fig. 10 zeigt die Oberflächenfärbung von S. aureus mit gereinigten anti-LPXTGV-IgGs.
BEISPIELE
Entdeckung neuer Staphylococcus aureus-Antigene
Beispiel 1: Herstellung von Antikörpern aus Human-Serum
Die vom menschlichen Immunsystem gegen Staphylokokken erzeugten und in Human-Seren anwesenden Antiköper sind ein Anzeichen für die in vivo-Expression der Antigen-Proteine und ihrer Immunogenität. Diese Moleküle sind für die Identifizierung individueller Antigene beim Weg der vorliegenden Erfindung, der auf der Wechselwirkung der spezifischen anti-Staphylokokken- Antikörper und den entsprechenden S. aureus-Peptiden oder-Proteinen basiert, wesentlich. Um einen Zugang zu relevanten Antikörper-Repertoires zu bekommen, wurden Human-Seren von I.
Patienten mit akuten S. aureus-Infektionen, wie Bakteriämie, Sepsis, Infektionen von intravaskulä- ren und perkutanen Kathetern und Vorrichtungen, Wundinfektionen und oberflächlichen und tiefen Weichteil-Infektionen, gesammelt. Durch medizinisch-mikrobiologische Tests wurde nachgewiesen, dass S. aureus der Erreger war. ll eine Sammlung von Serum-Proben nicht-infizierter Erwachsener wurde ebenso in der vorliegenden Analyse inkludiert, da Staphylokokken-Infektionen häufig sind und Antikörper als Folge einer natürlichen Immunisierung aus früheren Begegnungen mit Staphylo- kokken aus Haut- und Weichteil-Infektionen (Furunkel, Wundinfektionen, Periodontitis etc. ) vorhan- den sind.
Die Seren wurden durch eine Reihe von ELISA-Tests für S. aureus-Antikörper charakterisiert.
Es wurden mehrere Staphylokokken-Antigene verwendet, um zu beweisen, dass der gemessene Titer nicht das Ergebnis der Summe kreuz-reaktiver Antikörper war. Zu diesem Zweck wurde nicht nur Ganz-Zellen-S. aureus(Protein A-Mangel-)-Extrakte (unter verschiedenen Bedingungen ge- züchtet) oder ganze Bakterien in den ELISA-Tests verwendet, sondern auch individuelle Zellwand- Komponenten, wie Lipoteichoinsäure und Peptidoglykan, das aus S. aureus isoliert worden war.
Was noch wichtiger ist, es wurde zur besseren Charakterisierung der vorliegenden Human-Serum- Kollektionen eine rekombinante Protein-Kollektion erstellt, die bekannte Staphylokokken- Zelloberflächen-Proteine darstellt.
Kürzlich wurde berichtet, dass nicht nur IgG, sondern auch IgA-Serum-Antikörper durch die FcRIII-Rezeptoren von PMNs erkannt werden können und die Opsonisierung fördern (Phillips- Quagliata et al., 2000 ; Shibuya et al., 2000). Die Hauptrolle der IgA-Antikörper ist die Neutralisie- rung, vor allem an der Schleimhautoberfläche. Die Menge des Serum-IgA spiegelt die Qualität, Quantität und Spezifität des dimeren Sekretions-lgA wider. Aus diesem Grund wurde die Serum- Kollektion nicht nur auf anti-Staphylokokken-IgG, sondern auch auf IgA-Mengen analysiert. Bei den ELISA-Tests wurden hoch-spezifische Sekundär-Reagenzien verwendet, um Antikörper vom Hoch- Affinitäts-Typ, wie IgG und IgA, zu detektieren und IgM zu vermeiden.
Die Produktion von IgM- Antikörpern erfolgt während der primären adaptiven humoralen Antwort und führt zu Antikörpern mit geringer Affinität, wogegen IgG und IgA-Antikörper bereits eine Affinitätsreifung durchgemacht haben und zur Bekämpfung oder Verhinderung von Krankheiten wertvoller sind.
Versuchsmethoden
Enzym-verbundender Immuntest (enzyme-linked immune assay, ELISA). ELISA-Platten wur- den mit 2-10 g/l1 der verschiedenen Antigene in Beschichtungspuffer (Natriumcarbonat, pH 9,2) beschichtet. Serielle Verdünnungen der Seren (100-100. 000) wurden in TBS-BSA durchgeführt.
<Desc/Clms Page number 12>
Hoch-spezifische (kreuz-adsorbierte), mit HRP (horse radish peroxidase (Meerrettich-Peroxidase)) markierte sekundäre anti-Human-IgG- oder anti-Human-lgA-Antikörper (Southern Biotech) wurden gemäss den Empfehlungen der Hersteller verwendet (-2.000x). Antigen-Antikörper-Komplexe wurden durch Messung der Umwandlung des Substrats (ABTS) zu gefärbtem Produkt auf Basis von OD405nm-Ablesungen in einem automatisierten ELISA-Ablesegerät (Wallace Victor 1420) quan- tifiziert. Die Titer wurden bei einer bestimmten Verdünnung, bei welcher die Verdünnungs-Reaktion linear war, verglichen (Tabelle 1). Die -100 Seren wurden auf Grund der Reaktivität gegen mehre- re Staphylokokken-Bestandteile rangmässig geordnet, und die höchsten (über 90 Perzentil) wurden für eine weitere Analyse bei der Antigen-Identifizierung selektiert.
Es ist wichtig, dass die anti- Staphylokokken-Antikörper aus Seren klinisch gesunder Individuen sich als sehr stabil erwiesen und gleich hohe ELISA-Titer gegen alle Staphylokokken-Antigene ergaben, die nach 3,6 und 9 Monaten gemessen wurden (Daten nicht angegeben). Dagegen nehmen anti-S.aureus-Antikörper bei Patienten ab, verschwinden dann nach einigen Wochen nach der Infektion (Coloque-Navarro et al., 1998). Antikörper von Patienten sind jedoch sehr wichtig, da diese ein direkter Beweis für die in vivo-Expression der bakteriellen Antigene sind, die in ELISAs getestet wurden oder die während Screens gemäss der vorliegenden Erfindung als immunogen identifiziert wurden.
Die umfassende Vorgangsweise, der man während der Antikörper-Charakterisierung folgte, ist einzigartig und führte zu einer zweifelsfreien Identifizierung hyperimmuner anti-Staphylokokken- Seren.
Reinigung von Antikörpern für Genom-Screening. Fünf Seren aus sowohl der Patienten- als auch der nicht-infizierten Gruppe wurden auf Grund der anti-Staphylokokken-Gesamt-Titer ausge- wählt. Antikörper gegen E. coli-Proteine wurden entweder durch Inkubation der Hitze-inaktivierten Seren mit Ganzzellen-E.coli (DH5a, transformiert mit pHIE11, gezüchtet unter denselben Bedin- gungen, wie sie für Bakterien-Display verwendet werden) oder mit E.coli-Lysat-Affinitätschromato- graphie für Ribosomen-Display entfernt.
Stark angereicherte IgG-Präparate aus den gepoolten, abgereicherten Seren wurden durch Protein G-Affinitätschromatographie gemäss den Instruktionen des Herstellers (UltraLink Immobilized Protein G, Pierce) erzeugt. IgA -Antikörper wurden ebenfalls durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von mit Biotin markiertem anti-Human-lgA (Southern Biotech), das auf Streptavidin-Agarose (GIBCO BRL) immobilisiert war, gereinigt. Die Effizienz der Abreicherung und Reinigung wurde mittels SDS-PAGE, Western Blot, ELISA und Protein-Konzentrationsmessungen überprüft. Für den Proteomics-Approach war die Anreicherung der IgG- und IgA-Präparat nicht notwendig, da das sekundäre Reagens die Spezifität gewährleiste- te.
Beispiel 2 : von stark randomisierten, frame-selektierten Kleinfragment- Genom-DNA-Bibliotheken von Staphylococcus aureus
Versuchsmethoden
Herstellung von Staphylokokken-Genom-DNA. Diese Methode wurde als Modifizierung zweier früher veröffentlichter Protokolle (Sohail, 1998, Betley et al., 1984) entwickelt und ursprünglich für den Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus-Stamm COL spezifisch adaptiert, um Genom- DNA von hoher Qualität und in grossem Umfang zu erhalten. 500 ml BHI (Brain Heart Infusion)- Medium, ergänzt mit 5 g/ml Tetracyclin wurde mit Bakterien aus einem gefrorenen Einstich geimpft und unter Belüftung und Schütteln 18h lang bei 37 C gezüchtet. Die Kultur wurde dann in zwei Aliquots von je 250 ml geerntet, 15 min lang mit 1600 x g zentrifugiert, und der Überstand wurde entfernt.
Bakterien-Pellets wurden sorgfältig in 26 ml 0,1 mM Tris-HCI, pH 7,6, re-suspendiert und wiederum mit 1600 x g 15 min lang zentrifugiert. Die Pellets wurden in 20 ml 1 mM Tris-HCI, pH 7,6,0,1 mM EDTA, re-suspendiert und in sterile 50ml-Polypropylen-Röhrchen transferiert, 1 ml von 10 mg/mi Hitze-behandelter Rnase A und 200 E Rnase T1 wurden in jedes Röhrchen zugegeben, und die Lösung wurde sorgfältig gemischt. 250 l Lysostaphin (10 mg/ml Stammlösung, frisch zubereitet in ddH20) wurden dann in die Röhrchen zugegeben, gründlich gemischt und bei 40 C 10 min lang in einem geschüttelten Wasserbad unter dauerndem Bewegen inkubiert.
Nach der Zugabe von 1 ml 10% SDS, 40 l Proteinase K (25 mg/ml Stammlösung) und 100 l Pronase (10 mg/ml) wurden die Röhrchen wiederum mehrere Male umgedreht und 5 min lang bei 40 C in einem geschüttelten Wasserbad inkubiert. 3,75 ml von 5M NaCI und 2,5 ml Cetyltrimethylammoni-
<Desc/Clms Page number 13>
um-bromid-Lösung (CTAB) (10% Gew./Vol., 4% Gew./Vol. NaCI) wurden dann zugegeben, und die Röhrchen wurden in einem geschüttelten Wasserbad 10 min lang bei 65 C weiter inkubiert. Die Proben wurden auf Raumtemperatur abgekühlt und mit PhOH/CHCI3/IAS (25:24:1) und CHCI3/IAS (24:1) extrahiert. Die wässerigen Phasen wurden sorgfältig gesammelt und in neue, sterile 50 ml- Röhrchen transferiert.
In jedes Rohrchen wurden 1,5 ml StratacleanTM Resin zugegeben, sanft aber gründlich gemischt und eine Minute lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proben wurden zentrifugiert, und die oberen, die DNA enthaltenden Schichten wurden in sauberen 50 mi-Röhrchen gesammelt. Die DNA wurde bei Raumtemperatur durch Zugabe von 0,6 x Volumen Isopropanol ausgefällt, mit einer sterilen Pasteur-Pipette aus der Lösung aufgenommen und in Röhrchen trans- feriert, die 80% eiskaltes Ethanol enthielten. Die DNA wurde durch Zentrifugieren der Niederschlä- ge mit 10-12. 000 x g gewonnen, dann an Luft getrocknet und in ddH20 gelöst.
Herstellung kleiner Genom-DNA-Fragmente. Genom-DNA-Fragmente wurden mechanisch durch Scheren zu Fragmenten einer Grösse zwischen 150 und 300 bp zerkleinert, wobei ein Topf- Schalltrichter-Ultraschallgerät ("cup-horn sonicator") (Bandelin Sonoplus UV 2200-Ultraschallgerät, ausgestattet mit einem BB5-Topf-Schalltrichter, 10 s Impulse bei 100% Stromleistung) oder in Fragmente einer Grösse zwischen 50 und 70 bp durch Behandlung mit milder DNase I (Novagen) zerkleinert. Es wurde beobachtet, dass die Ultraschallbehandlung eine viel engere Fragment- grössenverteilung ergab, wenn die DNA in Fragmente in einem Grössenordnungsbereich von 150- 300 bp zerbrochen wurde.
Trotz umfangreicher Einwirkung der durch Ultraschallwellen induzierten hydromechanischen Scherkraft auf die DNA konnte eine nachfolgende Verringerung der Fragment- grösse nicht effizient und reproduzierbar erreicht werden. Daher wurden Fragmente mit einer Grösse von 50 bis 70 bp durch Behandlung mit milder DNase I unter Verwendung von Novagen's Gewehr- Spaltungs-Sets (Shotgun Cleavage Kit) erhalten. Eine 1:20-Verdünnung von DNase I, die mit dem Set zur Verfügung gestellt worden war, wurde hergestellt, und der Verdau wurde in Anwesenheit von MnCI2 in einem 60 l-Volumen bei 20 C 5 min lang durchgeführt, um eine doppelsträngige Spaltung durch das Enzym zu gewährleisten. Die Reaktionen wurden mit 2 l 0,5 M EDTA ge- stoppt, und die Fragmentierungseffizienz wurde auf einem 2% TAE-Agarose-Gel evaluiert.
Diese Behandlung führte zu einer vollständigen Fragmentierung der Genom-DNA in fast 50-70 bp- Fragmente. Die Fragmente wurden dann zweimal unter Verwendung von T4-DNA-Polymerase in Anwesenheit von je 100 M dNTPs stumpfendig gemacht, um ein effizientes Bündigmachen der Enden zu gewährleisten. Die Fragmente wurden sofort in Ligierungs-Reaktionen verwendet oder bei -20 C zur späteren Verwendung gefroren.
Beschreibung der Vektoren. Der Vektor pMAL4. 1 wurde auf einem pEH1-Gerüst (Hashemza- deh-Bonehi et al., 1998) mit dem Kanamycin-Resistenz-Gen konstruiert. Zusätzlich hat er ein #- Lactamase (bla)-Gen, das in die multiple Klonierungsstelle kloniert ist. Dem bla-Gen geht die Leader-Peptid-Sequenz von ompA voraus, um eine effiziente Sezernierung über die Zytoplasma- Membran zu gewährleisten. Eine Smal-Restriktionsstelle dient zur Bibliotheks-Insertion. Die Smal- Stelle ist von einer stromaufwärts gelegenen Fsel-Stelle und einer stromabwärts gelegenen Notl- Stelle flankiert, die für die Gewinnung der selektierten Fragmente benützt wurden. Die drei Restrik- tionsstellen sind nach der ompA-Leader-Sequenz so insertiert, dass das bla-Gen in den -1-Lese- rahmen transkribiert wird, was zu einem Stop-Codon 15 bp hinter der Notl-Stelle führt.
Eine +1 bp- Insertion stellt den bla-ORF wieder her, so dass #-Lactamase-Protein mit einer folglichen Zunahme an Ampicillin-Resistenz erzeugt wird.
Der Vektor PMAL4,31 wurde auf einem pASK-IBA-Gerüst (Skerra, 1994) erzeugt, wobei das #-Lactamase-Gen mit dem Kanamycin-Resistenz-Gen ausgetauscht war. Ausserdem hat es ein #-Lactamase(blaGen, das in die multiple Klonierungsstelle kloniert ist. Der für reife #-Lactamase codierenden Sequenz geht die Leader-Peptid-Sequenz von ompA voraus, um eine effiziente Sezernierung über die Zytoplasma-Membran zu ermöglichen. Weiters folgt eine Sequenz, die für die ersten 12 Aminosäuren (Spacer-Sequenz) von reifer #-Lactamase codiert, auf die ompA- Leader-Peptid-Sequenz, um eine Fusion von Sequenzen unmittelbar nach der Leader-Peptidase- Schnittstelle zu vermeiden, da z. B. düster positiv geladener Aminosäuren in dieser Region die Translokation über die Zytoplasma-Membran vermindern oder abschaffen würden (Kajava et al., 2000).
Eine Smal-Restriktionsstelle dient zur Bibliotheks-Insertion. Die Smal-Stelle ist durch eine stromaufwärts befindliche Fsel-Stelle und eine stromabwärts befindliche Notl-Stelle flankiert, die zur Gewinnung des selektierten Fragments verwendet wurden. Die drei Restriktionsstellen sind
<Desc/Clms Page number 14>
nach der Sequenz, die für die 12-Aminosäuren-Spacer-Sequenz codiert, so insertiert, dass das bla-Gen in den -1-Leserahmen transkribiert wird, was zu einem Stop-Codon 15 bp nach der Notl- Stelle führt. Eine +1 bp-Insertion stellt den bla-ORF wieder her, so dass #-Lactamase-protein mit einem folglichen Anstieg an Ampicillin-Resistenz erzeugt wird.
Der Vektor pMAL9. 1 wurde durch Klonieren des lamB-Gens in die multiple Klonierungsstelle von pEH1 erzeugt. Danach wurde eine Sequenz in lamB nach Aminosäure 154 insertiert, die die Restriktionsstellen Fsel, Smal und Notl enthält. Der Leserahmen für diese Insertion wurde so ausgewählt, dass ein Transfer von frame-selektierten DNA-Fragmenten, die durch Verdau mit Fsel und Notl aus den Plasmiden pMAL4. 1 oder pMAL4. 31 herausgeschnitten worden waren, in Plas- mid pMAL9. 1 einen kontinuierlichen Leserahmen von lamB und vom entsprechenden Insert erge- ben wird.
Der Vektor pHIE11 wurde konstruiert, indem das fhuA-Gen in die multiple Klonierungsstelle von pEH1 kloniert wurde. Danach wurde eine Sequenz in fhuA nach Aminosäure 405 insertiert, die die Restriktionsstelle Fsel, Xbal und Notl enthielt. Der Leserahmen für diese Insertion wurde so gewählt, dass ein Transfer von frame-selektierten DNA-Fragmenten, die durch Verdau mit Fsel und Notl aus den Plasmiden pMAL4. 1 oder pMAL4. 31 herausgeschnitten worden waren, zum Plasmid pHIE11einen kontinuierlichen Leserahmen von fhuA und ein entsprechendes Insert ergeben wird.
Klonierung und Evaluierung der Bibliothek für frame-Selektion. S. aureus-Genom-DNA- Fragmente wurden in die Smal-Stelle entweder von Vektor pMAL4. 1 oder von pMAL4.31 ligiert.
Rekombinante DNA wurde in DH10B-elektrokompetente E. coli-Zellen (GIBCO BRL) durch Elektro- poration eingebracht, und Transformanten wurden auf LB-Agar, ergänzt mit Kanamycin (50 g/ml) und Ampicillin (50 g/ml) ausplattiert. Die Platten wurden über Nacht bei 37 C inkubiert, und die Kolonien wurden für eine DNA-Extraktion in grossem Umfang gesammelt. Eine repräsentative Platte wurde gelagert und zum Sammeln von Kolonien für eine Kolonien-PCR-Analyse und eine Sequenzierung in grossem Umfang aufgehoben. Ein einfacher Kolonien-PCR-Test wurde verwen- det, um zuerst in groben Umrissen die Fragment-Grössenverteilung sowie die Insertionseffizienz zu bestimmen. Aus den Sequenzierungs-Daten wurde die genaue Fragment-Grösse, das Intaktsein der Verbindungsstellen an der Insertionssteile sowie die frame-Selektionsgenauigkeit (3n+1-Regel) evaluiert.
Klonierung und Evaluierung der Bibliothek für Bakterien-Oberflächen-Display. Genom-DNA- Fragmente wurden aus dem pMAL4. 1 oder pMAL4.31-Vektor, enthaltend die S.aureus-Bibliothek mit den Restriktions-Enzymen Fsel und Notl, herausgeschnitten. Die gesamte Fragment-Popula- tion wurde dann in die Plasmide pMAL9. 1 (LamB) oder pHIE11 (FhuA) transferiert, die mit Fsel und Notl verdaut worden waren. Unter Verwendung dieser beiden Restriktions-Enzyme, die eine 8 bp-GC-reiche Sequenz erkennen, wird der Leserahmen, der im pMAL4.1- oder pMAL4.31-Vektor selektiert worden war, in jedem der beiden Plattform-Vektoren aufrecht erhalten. Die Plasmid- Bibliothek wurde dann durch Elektroporation in E.coli-DH5 a-Zellen transformiert.
Die Zellen wur- den auf LB-Agar-Platten, ergänzt mit 50 g/ml Kanamycin, ausplattiert und über Nacht bei 37 C zu einer Dichte gezüchtet, die deutlich sichtbare Einzel-Kolonien ergab. Die Zellen wurden dann von der Oberfläche dieser Platten abgeschabt, mit frischem LB-Medium gewaschen und in Aliquots zum Bibliotheks-Screenen bei -80 C gelagert.
Ergebnisse
Bibliotheken für die frame-Selektion. Zwei Bibliotheken (LSA50/6 und LSA250/1) wurden im pMAL4.1-Vektor mit einer Grösse von etwa 50 bzw. 250 bp erzeugt. Für beide Bibliotheken wurde eine Gesamtanzahl von Klonen nach der frame-Selektion von 1-2x 106erhalten, wobei etwa 1 g pMAL4.1-Plasmid-DNA und 50 ng fragmentierte S. aureus-Genom-DNA verwendet wurde. Um die Zufälligkeit der LSA50/6-Bibliothek zu beurteilen, wurden 672 zufällig ausgewählte Klone sequen- ziert. Die Bioinformatik-Analyse zeigte, dass keiner dieser Klone mehr als einmal vorhanden war.
Weiters wurde gezeigt, dass 90% der Klone in den Grössenbereich von 19 bis 70 bp fielen, wobei die Durchschnittsgrösse 25 bp war (Fig. 2). Alle 672 Sequenzen folgten der 3n+1-Regel, was zeigt, dass alle Klone richtig frame-selektiert waren.
Bakterien-Oberflächen-Display-Bibliotheken. Die Präsentation (display) von Peptiden an der Oberfläche von E.coli erforderte den Transfer der Inserts aus der LSA50/6-Bibliothek aus dem
<Desc/Clms Page number 15>
frame-Selektions-Vektor pMAL4. 1 in die Display-Plasmide pMAL9. 1 (LamB) oder pHIE11 (FhuA).
Genom-DNA-Fragmente wurden durch Fsel- und Notl-Restriktion herausgeschnitten, und die Ligation von 5 ng Inserts mit 0,1 g Plasmid-DNA führte zu 2-5x 106 Klonen. Die Klone wurden von den LB-Platten abgeschabt und ohne weitere Amplifizierung gefroren.
Beispiel 3: Identifizierung von hoch immunogenen Peptid-Seguenzen von S. aureus unter Verwendung von an der Bakterien-Oberfläche präsentierten Genom-Bibliotheken und Hi- man-Serum.
Versuchsmethoden
MACS-Screening. Etwa 2,5x 108 Zellen einer bestimmten Bibliothek wurden in 5 ml LB- Medium, ergänzt mit 50 g/ml Kanamycin, 2 h lang bei 37 C gezüchtet. Die Expression wurde durch 30-minütige Zugabe von 1 mM IPTG induziert. Die Zellen wurden zweimal mit frischem LB- Medium gewaschen, und etwa 2x 107Zellen wurden in 100 l LB-Medium re-suspendiert und in ein Eppendorf-Röhrchen transferiert.
10 g biotinyliertes Human-Serum wurde zu den Zellen zugegeben, und die Suspension wurde über Nacht bei 4 C unter sanftem Schütteln inkubiert. 900 l LB-Medium wurden zugegeben, die Suspension wurde gemischt und danach 10 min lang bei 6000 U/min bei 4 C zentrifugiert. Die Zellen wurden einmal mit 1 ml LB gewaschen und danach in 100 l LB-Medium re-suspendiert.
10 l MACS-Mikrokügelchen, die an Streptavidin gekoppelt waren (Miltenyi Biotech, Deutschland) wurden zugesetzt, und de Inkubation 20 min lang bei 4 C fortgesetzt. Danach wurden 900 l LB- Medium zugegeben, und die MACS-Mikrokügelchen-Zell-Suspension wurde auf die äquilibrierte MS-Säule (Miltenyi Biotech, Deutschland) geladen, die am Magnet fixiert war. (Die MS-Säulen wurden durch einmaliges Waschen mit 1 ml 70% EtOH und zweimaliges Waschen mit 2 ml LB- Medium äquilibriert).
Die Säule wurde dann dreimal mit 3 ml LB-Medium gewaschen. Die Elution wurde durch Ent- fernen des Magnets und Waschen mit 2 ml LB-Medium durchgeführt. Nachdem die Säule mit 3 ml LB-Medium gewaschen worden war, wurde das 2 ml-Eluat ein zweites Mal auf dieselbe Säule geladen, und der Wasch- und Elutions-Prozess wurde wiederholt. Der Beladungs-, Wasch- und Elutions-Prozess wurde ein drittes Mal durchgeführt, was ein letztes Eluat von 2 ml ergab.
Eine zweite Screening-Runde wurde, wie folgt, durchgeführt. Die Zellen aus dem letzten Eluat wurden durch Zentrifugieren gesammelt und in 1 ml LB-Medium, ergänzt mit 50 g/ml Kanamycin, re-suspendiert. Die Kultur wurde 90 min lang bei 37 C inkubiert und dann mit 1 mM IPTG 30 min lang induziert. Die Zellen wurden danach gesammelt, einmal mit 1 ml LB-Medium gewaschen und in 10 l LB-Medium suspendiert. Da das Volumen reduziert war, wurde 1 g humanes, biotinylier- tes Serum zugegeben, und die Suspension wurde über Nacht bei 4 C unter sanftem Schütteln inkubiert. Alle weiteren Schritte waren genau dieselben wie bei der ersten Selektions-Runde. Die nach zwei Selektions-Runden selektierten Zellen wurden auf LB-Agar-Platten, ergänzt mit 50 g/ml Kanamycin, ausplattiert und über Nacht bei 37 C gezüchtet.
Evaluierung selektierter Klone durch Sequenzierung und Western Blot-Analyse. Selektierte Klone wurden über Nacht bei 37 C in 3 ml LB-Medium, ergänzt mit 50 g/ml Kanamycin, gezüch- tet, um Plasmid-DNA herzustellen, wobei Standard-Verfahren verwendet wurden. Die Sequenzie- rung wurde bei MWG (Deutschland) oder in Zusammenarbeit mit TIGR (USA) durchgeführt.
Für die Western Blot-Analyse wurden etwa 10 bis 20 g Gesamtzellen-Protein durch 10% SDS-PAGe getrennt und auf HybondC-Membran (Amersham Pharmacia Biotech, England) geblot- tet. Die LamB- und FhuA-Fusions-Proteine wurden unter Verwendung von Human-Serum als Primär-Antikörper bei einer Verdünnung von 1:5000 und anti-Human-IgG-Antikörper, gekoppelt an HRP, bei einer Verdünnung von 1:5000 als Sekundär-Antikörper detektiert. Die Detektion erfolgte unter Verwendung des ECL-Detektions-Sets (Amersham Pharmacia Biotech, England). Alternativ wurden Kaninchen-anti-FhuA- oder Maus-anti-LamB-Antikörper als Primär-Antikörper in Kombina- tion mit den jeweiligen Sekundär-Antikörpern, gekoppelt an HRP, zur Detektion der Fusions- Proteine verwendet.
Ergebnisse
<Desc/Clms Page number 16>
Screenen von Bakterien-Oberflächen-Display-Bibliotheken durch magnetisch aktivierte Zellsor- tierung (magnetic activated cell sorting, MACS) unter Verwendung von biotinyliertem Human- Serum. Die Bibliotheken LSA50/6 in pMAL9.1 und LSA250/1 in pHIE11 wurde mit einem Pool von biotinylierten, Human-Patienten-Seren (vgl. Beispiel 1) gescreent. Herstellung von Antikörpem aus Human-Serum. Das Selektionsverfahren wurde, wie unter Versuchsmethoden beschrieben, durch- geführt. Als Kontrolle wurden gepoolte Human-Seren von Kleinkindern, die höchstwahrscheinlich nicht mit S. aureus infiziert worden waren, verwendet. Unter den beschriebenen Bedingungen wurden zwischen 10- und 50-mal mehr Zellen mit den Patienten- im Vergleich zum Kleinkinder- Serum routinemässig selektiert (Fig. 3).
Zur Evaluierung der Leistung des Screens wurden etwa 100 selektierte Klone zufällig genommen und einer Western Blot-Analyse mit dem selben gepoolten Patienten-Serum unterzogen. Diese Analyse zeigte, dass 30 bis 50% der selektierten Klone eine Reaktität mit Antikörpern, die im Patienten-Serum vorhanden waren, aufwiesen, wogegen der Kontroll-Stamm, der LamB oder FhuA ohne S.aureus-spezifisches Insert exprimierte, mit demsel- ben Serum nicht reagierte. Eine Kolonien-PCR-Analyse zeigte, dass alle selektierten Klone ein Insert im erwarteten Grössenbereich enthielten.
Die nachfolgende Sequenzierung einer grösseren Anzahl zufällig genommener Klone (500 bis 800 pro Screen) führte zur Identifizierung des Gens und der entsprechenden Peptid- oder Protein- Sequenz, die von dem für das Screening verwendeten Human-Patienten-Serum spezifisch erkannt wurde. Die Häufigkeit, mit der ein spezifischer Klon selektiert wird, spiegelt mindestens teilweise das reichliche Vorhandensein und/oder die Affinität der spezifischen Antikörper, die für die Selekti- on und für die Erkennung des von diesem Klon präsentierten Epitops verwendet wurden, im Serum wider. In dieser Hinsicht ist es auffällig, dass einige Klone (ORF1, ORF1-Homolog I und ll, Lipase, IsaA) bis zu 90 Mal aufgenommen wurden, was ihre stark immunogene Eigenschaft anzeigt.
Alle Klone, die in Tabelle 2 repräsentiert sind, wurden mittels Western Blot-Analyse verifiziert, wobei Ganzzellen-Extrakte von einzelnen Klonen verwendet wurden, um die angezeigte Reaktivität mit dem Human-Serum-Pool, das im Screen verwendet wurde, zu zeigen. Die aufgefundenen Sequen- zen sind in Etz et al. (2002) angegeben. Die in Tabelle 2 angegebenen Sequenzen beziehen sich auch auf Baba et al. (2002) sowie auf die S. aureus COL-Sequenz, die von TIGR unter : http://www.tigr.org/tigr-scripts/CMR2/GenomePage3.spl?database=gsa im Internet abrufbar ist.
Es ist weiters feststellenswert, dass die meisten der durch den Bakterien-Oberflächen-Display- Screen identifizierten Gene für Proteine codieren, die entweder an der Oberfläche von S.aureus haften und/oder sezerniert werden. Dies stimmt mit der erwarteten Rolle der an der Oberfläche haftenden oder sezernierten Proteine bei der Virulenz von S. aureus überein.
Beurteilung der Reaktivität hoch-immunogener Peptid-Sequenzen mit verschiedenen Human- Seren. 10 bis 30 verschiedene Human-Patienten-Seren wurden danach verwendet, un das Vor- handensein von Antikörpern gegen die selektierten immunogenen Peptid-Sequenzen, die beim Screen gemäss der vorliegenden Erfindung entdeckt worden waren, zu beurteilen. Um eine mögli- che Kreuz-Reaktivität mit von E.coli exprimierten Proteinen auszuschalten, wurden alle Seren mit einem Gesamtzell-Lysat von E.coli DHa-Zellen, die FhuA-Protein exprimieren, vor-adsorbiert.
Diese Analyse ist in Tabelle 2 zusammengefasst und als Beispiel in Fig. 4 gezeigt und zeigt die Validität des vorliegenden Screens an. Sie zeigt weiters, dass schon kurze, selektierte Epitope bei einer grossen Anzahl von Patienten zur Erzeugung von Antikörpern führen können (ORF1178, ORF1163, IsaA, Empbp, Protein A). Jene Peptid-Sequenzen, die von einem grösseren Set von Patienten-Seren nicht erkannt werden, können noch immer Teil eines hoch immunogenen Proteins sein, doch kann zu diesem Zweck das rekombinante Protein selbst für jeden einzelnen Fall getes- tet werden.
Beispiel 4 : Identifizierung hoch-immunogener Peptid-Sequenzen aus Genom-Fragmen- ten von S. aureus unter Verwendung von Ribosomen-Display und Human-Serum
Versuchsm ethoden Ribosomen-Display-Screening: 2,4 ng der Genom-Bibliothek von S. aureus LSA250/1 in pMAL4. 1 (oben beschrieben) wurden mittels PCR amplifiziert mit den Oligos ICC277 und ICC 202 um für Ribosomen-Display verwendet zu werden. Die Oligos ICC277 (CGAATAATACGACTCAC- TATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCACTAGTAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATA-
<Desc/Clms Page number 17>
TCCATGCAGACCTTGGCCGGCCTCCC) und ICC202 (GGCCCACCCGTGAAGGTGAGCCGG- CGTAAGATGCTTTTGTGTGACTGG) hybridisieren 5' bzw. 3' von der Fsel-Notl-Insertionsstelle von Plasmid PMAL4. 1.
ICC277 führt einen T7-Phagen-RNA-Polymerase-Promotor, eine palindro- mische Sequenz, die zu einer Stamm-Schleifen("stem-loop")-Struktur auf RNA-Ebene führt, eine Ribosomen-Bindungsstelle (RBS) und den Translations-Start von Gen 10 des T7-Phagen ein- schliesslich des ATG-Start-Codons, ein. Oligo ICC202 hybridisiert an der Nukleotid-Position 668 des #-Lactamase-offenen Leserahmens und führt auch eine Stamm-Schlingen-Struktur am 3'-Ende der resultierenden RNA ein. PCR wurde mit dem High-fidelity PCR-Set (Roche Diagnostic) für 25 Zyklen bei 50 C Hybridisierungs-Temperatur und ansonsten Standard-Bedingungen durchgeführt.
Die resultierende PCR-Bibliothek wurde in 5 aufeinander folgenden Runden der Selektion und Amplifizierung durch Ribosomen-Display, ähnlich dem früher beschriebenen (Hanes et al. 1997), doch mit Modifikationen, wie nachstehend beschrieben, verwendet.
Eine Runde Ribosomen-Display enthielt die folgenden Schritte: In vitro-Transkription von 2 g PCR-Produkt mit dem RiboMax-Set (Promega) führte zu ca. 50 g A. Die In-vitro-Translation wurde 9 min bei 37 C in 22 l Volumen mit 4,4 ul-Premix Z (250 mM TRIS-Acetat, pH 7,5, 1,75 mM von jeder Aminosäure, 10 mM ATP, 2,5 mM GTP, 5 mM cAMP, 150 mM Acetylphosphat, 2,5 mg/ml E. coli tRNA, 0,1 Mg/ml Folinsäure, 7,5% PEG 8000,200 mM Kaliumglutamat, 13,8 mM Mg(Ac)2, 8 l S30-Extrakt (x mg/ml) und etwa 2 g in vitro-transkribierte RNA aus dem Pool durch- geführt. S30-Extrakt wurde, wie beschrieben, hergestellt (Chen et al., 1983).
Danach wurde die Probe in ein eiskaltes Röhrchen transferiert, das 35,2 l 10% Milch-WBT (TRIS-Acetat, pH 7,5, 150 mM NaCI, 50 mM Mg(Ac)2, 0,1% Tween-20,10% Milchpulver) und 52,8 l WBTH (wie zuvor, plus 2,5 mg/ml Heparin) enthielt. Danach wurde die Immunpräzipitation durchgeführt durch Zugabe von 10 g gereinigte IgGs, 90-minütige Inkubation auf Eis, gefolgt von der Zugabe von 30 l MAGmol Protein G-Kügelchen (Miltenyi Biotec, 90 Minuten auf Eis). Die Probe wurde auf eine vor- äquilibrierte -Säule (Miltenyi Biotec) aufgetragen und fünfmal mit eiskaltem WBT-Puffer gewa- schen. Danach wurden 20 l EB20-Elutions-Puffer (50 mM TRIS-Acetat, 150 mM NaCI, 20 mM EDTa, 50 g/ml S. cerevisiae-RNA) auf die Säule aufgetragen, 5 min lang bei 4 C inkubiert. Die Elution wurde durch Zugabe von 2 x 50 l EB20 beendet.
Die mRNA aus der Elutions-Probe wurde mit dem High pure RNA-Isolierungs-Set (Roche Diagnostics) gereinigt. Eine nachfolgende Rever- se-Transkription wurde mit dem Superscript ll reverse transkriptase-Set (Roche Diagnostics) gemäss den Instruktionen des Herstellers mit 60 pmol Oligo ICC202 1 h lang bei 50 C in 50 l Volumen durchgeführt. 5 l dieser Mischung wurden für die folgende PCR-Reaktion mit den Pri- mern ICC202 und ICC277, wie oben beschrieben, verwendet.
Drei Runden von Ribosomen-Display wurden durchgeführt, und der resultierende selektierte PCR-Pool danach in Plasmid pHIE11(voranstehend beschrieben) durch Spaltung mit den Restrik- tions-Endonukleasen Notl und Fsel kloniert.
Evaluierung der selektierten Klone durch Sequenzierung und Peptid-ELISA-Analyse: Selektier- te Klone wurden über Nacht bei 37 C in 3ml LB-Medium, ergänzt mit 50 pg/ml Kanamycin, gezüch- tet, um Plasmid-DNA unter Verwendung von Standardverfahren herzustellen. Die Sequenzierung wurde bei MWG (Deutschland) oder am Institute of Genomic Research (TIGR; Rockville, MD, USA) durchgeführt. Peptide, die den Insert entsprachen, wurden synthetisiert und in 10 mM NaH- CO3, pH 9,3, mit einer Konzentration von 10 pg/ml (50 l auf Mikrotiter-Platten mit 96 Vertiefungen (Nunc) beschichtet. Nach dem Blockieren mit 1% BSA in PBS bei 37 C wurden 1:200- und 1:1000- Verdünnungen der angegebenen Seren in 1% BSA/PBS verdünnt und in die Vertiefungen aufge- tragen.
Nach dem Waschen mit PBS/0,1% Tween-20, wurden mit Biotin markierte anti-Human- IgG-Sekundär-Antikörper (SBA) zugegeben, und diese wurden durch nachfolgende Zugabe von Meerrettich-Peroxidase-gekoppeltem Streptavidin gemäss den Standard-Verfahren detektiert.
Ergebnisse
Die oben beschriebene 250 bp-Genom-Bibliothek (LSA250/1) wurde für das Screening verwen- det. Gereinigte IgGs von nicht infizierten Erwachsenen, jedoch mit hohem Titer gegen S. aureus, wie oben beschrieben, wurden zur Selektion von Antigen-Peptiden verwendet.
Drei Ribosomen-Display-Selektions- und Amplifikations-Runden wurden gemäss den Versuchs- methoden durchgeführt ; durch Klonierung und Sequenzierung des resultierenden PCR-
<Desc/Clms Page number 18>
Pools.
Die Sequenzanalysen einer grossen Anzahl zufällig genommener Klone (700) führte zur Identi- fizierung des Gens und der entsprechenden Peptid- oder Protein-Sequenz, die durch das zum Screenen verwendete hochtitrige Serum spezifisch erkannt worden war. Die Häufigkeit, mit der ein spezifischer Klon selektiert wurde, spiegelt zumindest teilweise das reichliche Vorhandensein und/oder die Affinität der spezifischen Antikörper in dem zur Selektion und zum Erkennen des von diesem Klon präsentierten Epitops verwendeten Serums wider. Bemerkenswerterweise wurden einige Klone (ORFs) bis zu 50 mal genommen, was ihre hochimmunogene Eigenschaft aizeigt.
Tabelle 2 zeigt den ORF-Namen und die Anzahl, wie oft er vom erfindungsgemässen Screen identi- fiziert wurde.
Für eine Anzahl immunselektierter ORFs wurden Peptide, die der identifizierten immunogenen Region entsprechen, synthetisiert und im Peptid-ELISA auf ihre Reaktivität gegenüber dem Seren- Pool, mit dem sie identifiziert worden waren, und auch einer Anzahl zusätzlicher Seren von Patien- ten, die an einer Infektion durch S. aureus litten, getestet. Die beiden Beispiele in den Schaubildern der Fig. 5 zeigen die Werte von Peptiden aus Aureolysin und PLs. Sie sind nicht nur gegen den hochtitrigen Seren-Pool hyperimmun-reaktiv, sondern auch gegen eine Anzahl individueller Patien- ten-Seren. Alle synthetisierten Peptide, die den selektierten immunogenen Regionen entsprechen, zeigten eine Reaktivität gegenüber dem hochtitrigen Seren-Pool, und in Tabelle 2 ist zusammenge- fasst, wie oft die Peptide gegen individuelle Patienten-Seren reaktiv waren, ähnlich, wie oben beschrieben.
Ausserdem ist es auffallend, dass für jene ORFs, die auch durch Bakterien-Oberflächen-Display (oben beschrieben) identifiziert worden waren, sehr oft die tatsächliche immunogene Region inner- halb des ORF identisch mit der durch Ribosomen-Display identifizierten war oder diese überlappte.
Der Vergleich ist in Tabelle 2 ersichtlich.
Beispiel 5 : Identifizierung hoch-immunogener Antigene von S. aureus unter Verwendung serologischer Proteom-Analyse.
Versuchsmethoden
Oberflächen-Protein-Präparate von S. aureus, die hoch-immunogene Antigene enthielten. S. aureus-Stämme COL (Shafer und landolo, 1979) und agr- (Recsei et al., 1986) wurden als Glyce- rin-Stammlösungen bei -80 C oder auf BHI(DIFCO)-Platten bei 4 C gelagert. Einzelne Klone wurden zur Impfung von Über-Nacht-Kulturen entweder in BHI ("Standard-Bedingungen") oder RPMI 1640 (GibcoBRL) verwendet, wobei die Letztere durch Behandlung ü/n mit Iminodiessig- säure (Sigma) an Eisen abgereichert waren ("Stress-Bedingungen"). Frisches Medium wurde am nächsten Tag 1 :100 und die Bakterien wurden auf eine O.D.600 von zwischen 0,3 und 0,7 gezüchtet. Die Bakterien wurden durch Zentrifugieren geerntet und mit eiskalter PBS gewaschen.
Oberflächen-Proteine wurden durch Lysostaphin-Behandlung unter isotonischen Bedingungen (Lim et al., 1998) erzeugt. Kurz gesagt wurden -3x 109Bakterien (gemäss O.D.600 = 1 sind etwa 5#107 Bakterien) in 1 ml Verdauungs-Puffer, enthaltend 35% Raffinose (Aldrich Chemical Company), Pro- tease Inhibitoren (Roche) und 5 Einheiten Lysostaphin (Sigma), re-suspendiert. Nach 30 min Inkubation bei 37 C wurden die Protoplasten durch Zentrifugieren bei niedriger Geschwindigkeit vorsichtig sedimentiert. Diese Behandlung setzt Oberflächen-Proteine frei, die kovalent an die Pentaglycin-Brücke der Peptidoglykan-Zellwand gebunden sind, in den Überstand frei (in Crossley, 1997). Die Zell-Oberflächen-Proteine wurden entweder mit Methanol/Chloroform (Wessel, 1984) ausgefällt oder in Zentrifugenfilter-Röhrchen (Millipore) konzentriert.
Die Protein-Proben wurden gefroren und bei -80 C gelagert oder in Proben-Puffer gelöst und sofort für isoelektrisches Fokus- sieren (IEF) verwendet (Pasquali et al., 1997).
Serologische Proteom-Analyse von Oberflächen-Protein-Präparate von S. aureus. Proben wurden erhalten von a) S. aureus/agr, gezüchtet unter "Stress-Bedingungen", b) S. aureus/COL, gezüchtet unter "Standard-Bedingungen", und c) S. aureus/COL "Stress-Bedingungen". Die Bela- dung auf 17 cm-Streifen, enthaltend immobilisierte pH-Gradienten (pH 4-7, BioRad) erfolgte unter Verwendung des "In-Gel-Wiederquellungsverfahrens" (Pasquali et al., 1997). Die Gele zum Blotten wurden mit 100-800 gProtein beladen, die präparativen Gele mit 400-1.000 g Protein. Isoelek- trisches Fokussieren und SDS-PAGE (9-16% Gradienten-Gele) wurden, wie beschrieben, durchge-
<Desc/Clms Page number 19>
führt (Pasquali et al., 1997). Für Western Blots wurden die Proteine auf PVDF-Membranen (BioRad) durch halbtrockenes Blotten übertragen.
Die Transfer-Effizienz wurde durch Amido- Schwarz-Färbung überprüft. Nach dem Blockieren (PBS/0,1% Tween 20/10% Trockenmilch, 4 C, 16 h lang) wurden die Blots 2 h lang mit Serum (1:2.500-1:100.000 in Blockierungslösung, vgl.
Tabelle 3) inkubiert. Nach dem Waschen wurde die spezifische Bindung von Serum-IgG mit einem Ziegen-anti-human-IgG/Peroxidase-Konjugat (1:25.000, Southern Biotech) als Sekundär-Antikör- per und Entwicklung mit einem Chemilumineszenz-Substrat (ECLTM, Amersham) sichtbar gemacht.
Ein repräsentatives Ergebnis ist in Fig. 6 gezeigt. Die Membranen wurden durch 30-minütige Behandlung mit 2%/#-ME/Laemmli-Puffer bei 50-65 C gestrippt, sofort mit einem anderen Serum wieder sondiert und, wie oben beschrieben, entwickelt. Diese Vorgangsweise wurde bis zu fünfmal wiederholt. Signale, die sich bei Patienten- und/oder gesunden Spender-Kontroll-Seren zeigten, jedoch nicht im Kleinkinder-Serum, wurden mit den mit Coomassie (BioRad) gefärbten präparati- ven Gelen abgestimmt (Beispiel in Fig. 7 gezeigt) . Die Ergebnisse dieser serologischen Proteom- Analysen der Oberflächen-Protein-Präparate von S. aureus sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
Sequenzierung von Protein-Spots durch Peptid-Fingerabdruck MALDI-TOF-MS und Tandem- MS/MS. Mit Coomassie-Blue gefärbte Spots, die nach serologischen Proteom-Analysen selektiert worden waren, wurden herausgeschnitten und mit Trypsin verdaut. MALDI-TOF-MS und Tandem- MS/MS-Analyse (Immler 1998) tryptischer Peptide und Vergleich der Spektren mit den vom kom- pletten S. aureus-Genom abgeleiteten ORFs ermöglichten die eindeutige Identifizierung der selek- tierten Spots. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in Tabelle 4 zusammengefasst.
Beispiel 6 : Charakterisierung hoch-immunogener Proteine von S. aureus
Die durch verschiedene Screening-Methoden mit den IgG- und IgA-Präparate zuvor ausge- wählter Seren identifizierten Antigene werden folgendermassen weiter charakterisiert:
1. Die Proteine werden gereinigt, am meisten bevorzugt als rekombinante Proteine, die in E. coli oder in einem Gram+ Expressions-System oder in einem in vitro-Translations-System expri- miert worden sind, und auf Antigenität mittels einer Reihe von Human-Seren evaluiert. Die Proteine sind auf Basis von Bioinformatik-Analysen modifiziert : Nterminale Sequenzen, die das Signal- Peptid repräsentieren, werden entfernt, C-terminale Regionen stromabwärts des Zellwand-Ankers werden ebenfalls entfernt, und Extra-Aminosäuren als Markierungen ("tags") werden zwecks leichter Reinigung eingeführt (wie Strep-Markierungll, His-Markierung usw. ).
Eine grosse Anzahl von Seren wird dann in ELISA-Tests verwendet, um die Fraktion der Human-Seren, die spezifische Antikörper gegen das bestimmte Protein enthalten, zu beurteilen (vgl. Fig. 9 als Beispiel). Eines der selektierten Antigene ist ein 895 AS langes Protein, welches LPXTGV (vgl. Tabellen 2 und 4) genannt wurde, da es die Gram+ Zellwand-Anker-Sequenz LPXTG enthält. Es zeigte sich, dass diese Signatur als Schnittstelle für Sortase, eine Trans-Peptidase, die das LPXTG-Motiv enthalten- de Proteine kovalent an die Peptidoglykan-Zellwand bindet, dient. LPXTGV ist auch mit einem typischen Signal-Peptid ausgestattet (Fig. 8). ELISA-Daten unter Verwendung dieses Proteins als ein Strep-markiertes rekombinantes Protein zeigen, dass dieses Protein bei einem hohen Prozent- satz von Seren hoch-immunogen (hohe Titer im Vergleich zu anderen rekombinanten Proteinen) ist (Fig. 9).
Es ist wichtig, dass Patienten mit akuter S. aureus-Infektion deutlich mehr dieser anti- LPXTGV-Antikörper produzieren als gesunde normale Individuen, was darauf hindeutet, dass das Protein während einer in vivo-Infektion exprimiert wird. Die gesamten ELISA-Titer der individuellen Antigen-Proteine werden verglichen, und jene, die die höchsten Antikörper-Mengen (hoch immu- nogen) bei den meisten Individuen induzieren (das Protein wird von den meisten Stämmen in vivo exprimiert) werden favorisiert. Da die Antigen-Spezifität und Qualität (Klasse, Sub-Typ, funktionell, nicht-funktionell) der Antikörper gegen S. aureus, die in individuellen Patienten erzeugt werden, je nach der Stelle der Infektion, chronischen Begleit-Erkrankungen (z. B.
Diabetes) und chronischen Bedingungen (z.B. intravaskuläre Einrichtung) und der Immunantwort der Individuen variieren kann, wurde besonderes Augenmerk auf Unterschiede, die unter den verschiedenen Patienten- gruppen entdeckt wurden, gerichtet, da medizinische Aufzeichnungen, die zu jedem Serum gehör- ten, zur Verfügung standen. Ausserdem ist jedes Patienten-Serum vom pathogenen Stamm beglei- tet, der zur Zeit der Serum-Probennahme vom Patienten isoliert wurde.
2. Spezifische Antikörper werden zwecks funktioneller Charakterisierung gereinigt. Die
<Desc/Clms Page number 20>
Reinheit und die Integrität der rekombinanten Proteine werden überprüft (z. B. Detektion der N- terminalen Strep-Markierung in der Western Blot-Analyse im Vergleich zur Silberfärbung in SDS- PAGE). Die Antigene werden durch die Markierungen immobilisiert, um eine Affinitäts-Matrix zu schaffen, und für die Reinigung spezifischer Antikörper aus hoch-reaktiven Seren verwendet. Zum Beispiel wurden bei Verwendung von strep-markiertem LPXTGV als Capture-Antigen 20 g Anti- körper aus 125 mg IgG gereinigt. Auf Grund der ELISA-Daten wurde ein reines Präparat erhalten, das beispielsweise keine anti-LTA- und anti-Peptidoglykan-Aktivität (beide bei unfraktioniertem IgG vorherrschend) aufwies.
Die Antikörper werden dann verwendet, um die Zell-Oberflächen-Lokali- sierung durch FACS und Fluoreszenz-Mikroskopie zu testen (Fig. 10).
3. Gen-Vorkommen in klinischen Isolaten
Ein ideales Vakzin-Antigen wäre ein Antigen, das in allen - oder in einer grossen Mehrheit von - Stämmen des Ziel-Organismus, gegen den das Vakzin gerichtet ist, vorhanden ist. Um festzustel- len, ob die für die identifizierten Staphylococcus aureus-Antigene codierenden Gene in S. aureus- Stämmen allgegenwärtig vorkommen, wurde eine PCR an einer Reihe unabhängiger S aureus- Isolate mit Primern durchgeführt, die für das Gen, an dem Interesse bestand, spezifisch waren. S. aureus-Isolate wurden von Patienten mit verschiedenen S. aureus-Infektionen erhalten. Ausserdem wurden mehrere Nasen-Isolate von gesunden Trägern und mehrere lab-Stämme ebenfalls gesam- melt und analysiert.
Die Stämme wurden gemäss der Restriktions-Fragmentlängen-Polymorphie (RFLP) der spa- und coa-Gene typisiert (Goh et al., 1992, Frenay et al., 1994, vanden Bergh et al., 1999). Aus diesen Ergebnissen wurden 30 verschiedene Stämme identifiziert - 24 Patienten- Isolate, 3 Nasen-Isolate und 3 lab-Stämme. Um die Gen-Verteilung selektierter Antigene zu etab- lieren, wurde die Genom-DNA dieser 30 Stämme einer PCR mit Gen-spezifischen Primern, die das selektierte Epitop flankieren, unterzogen (ORF190, ORF503, ORF831, ORF1163, ORF1443, ORF1633, ORF1988, ORF2135). Die PCR-Produkte wurden mittels Gelelektrophorese analysiert, um ein Produkt der richtig vorhergesagten Grösse zu identifizieren. Die ORFs 190,503, 831,1163, 1443 und 1988 sind in 100% der getesteten Stämme vorhanden, und ORF1633 in 97%. ORF2135 kam jedoch nur in 71% der Stämme vor.
Somit weisen die ORFs 190,503, 831,1163, 1443,1633 und 1988 jeweils die notwendige allgegenwärtige Präsenz unter den S. aureus-Isolaten auf.
Diese Antigene (oder Antigen-Fragmente davon, insbesondere die identifizierten Fragmente) sind zur Verwendung bei einem Impfprojekt gegen S. aureus besonders bevorzugt.
4. Identifizierung von HLA-Klasse II-Helper-Epitopen mit hoher Promiskuität innerhalb der ORFs der selektierten Antigene
Die ORFs, die den auf Basis einer Erkennung durch Antikörper in Human-Seren identifizierten Antigenen entsprechen, enthalten sehr wahrscheinlich auch lineare T-Zellen-Epitope. Insbesonde- re die überraschende Feststellung im Laufe der Erfindung, dass selbst gesunde, nicht-infizierte, nicht besiedelte Individuen extrem hohe Antikörper-Titer ( > 100.000 bei einigen Antigenen, vgl.
Beispiel 5) aufweisen, die für > 1 Jahr stabil sind (vgl. Beispiel 1), legt die Existenz eines von T- Zellen abhängigen Gedächtnisses, das höchstwahrscheinlich von CD4+ Helper-T-Zellen vermittelt wird, nahe. Die molekulare Definition der entsprechenden HLA-Klasse II-Helper-Epitope ist für das Entwerfen synthetischer anti-Staphylokokken-Vakzine, die ein immunologisches Gedächtnis indu- zieren können, nützlich. In diesem Szenario stellen die Helper-Epitope, die von den Staphylokok- ken-Antigenen stammen, eine "verwandte Hilfe" für die B-Zellen-Antwort gegen diese Antigene oder deren Fragmente bereit. Ausserdem ist es möglich, diese Helper-Epitope zu verwenden, um bei T-unabhängigen Antigenen, wie z. B. Kohlehydraten ein Gedächtnis zu induzieren (Konjugat- Vakzine).
Anderseits können intrazellulär vorkommende Staphylokokken durch CD8+ zytotoxischer T-Zellen, die Epitope mit HLA-Klasse I-Restriktion erkennen, eliminiert werden.
T-Zellen-Epitope können durch verschiedene öffentliche Domänen-Algorithmen vorausgesagt werden : http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla bind/(Parker et al.,1994), http://134.2.96.221/scripts/MHCServer.dll/home.htm (Rammensee et al., 1999),
EMI20.1
mus bietet die Möglichkeit, Helper-Epitope mit Promiskuität, d. h. Peptide, die an mehrere HLA- Klasse 11-Moleküle binden, zu identifizieren. Um Helper-Epitope mit hoher Promiskuität innerhalb von Staphylokokken-Antigenen zu identifizieren, wurden die ORFs IsaA, POV2, ORF1 Hom2, LPXTGIV, LPXTGV, LPXTGVI, EMBP, ORF1hom1, Empbp, Autolysin und ORF0267 unter
<Desc/Clms Page number 21>
Verwendung des TEPITOPE-Package http://mvpaqe.ihost.com/usinet.hamme76/ (Sturniolo et al., 1999) analysiert.
Die Analyse erfolgte für 25 vorherrschende DR-Allele, und Peptide wurden selektiert, wenn sie voraussagemässig a) starke Bindungspartner (1 % Schwelle) für mindestens 10/25 Allelen, oder b) intermediäre (3% Schwelle) Bindungspartner für mindestens 17/25 Allele waren.
Die folgenden Peptide, die ein oder mehrere Helper-Epitope mit Promiskuität enthalten, wurden ausgewählt (und sind beansprucht):
LPXTGV: Pos.6-40, 583-598,620-646, 871-896
ORF0267 : kein Peptid erfüllt die Selektions-Kriterien
IsaA: kein Peptid erfüllt die Selektions-Kriterien
LPXTGIV: Pos. 24-53 ORF1hom1: Pos. 240-260
EMBP : Pos. 1660-1682,1746-1790
Autolysin: Pos. 1-29,680-709, 878-902
ORF1 Hom2: Pos. 96-136
Empbp : Pos. 1-29,226-269, 275-326
POV2: Pos. 237, 107-156
LPXTGVI: Pos. 24-53.
Die entsprechenden Peptide oder deren Fragmente (beispielsweise überlappende 15-Mere) können synthetisiert und auf ihre Fähigkeit, an verschiedene HLA-Moleküle in vitro zu binden, getestet werden. Ihre Immunogenität kann durch Beurteilung der Peptid(Antigen)-gesteuerten Proliferation (BrdU oder 3H-Thymidin-Einbau) oder der Sezernierung von Cytokinen (ELlspot, intrazelluläre Cytokin-Färbung) von T-Zellen in vitro (Mayer et al., 1996, Schmittel et al., 2000 ; Sester et al., 2000) getestet werden.
In dieser Hinsicht wird es interessant sein, quantitative und qualitative Unterschiede in der T-Zellen-Reaktion auf die Staphylokokken-Antigene oder die selek- tierten Peptide mit Promiskuität oder deren Fragmente in Patienten-Populationen mit unterschiedli- chen Staphylokokken-Infektionen oder mit Besiedelung versus gesunde Individuen, die in jüngster Zeit weder infiziert noch besiedelt wurden, zu bestimmen. Ausserdem erwartet man eine Korrelation zwischen den Antikörper-Titern und der Quantität und Qualität der in diesen Populationen beo- bachteten T-Zellen-Reaktion. Alternativ kann die Immunogenität der vorhergesagten Peptide in HLA-transgenen Mäusen getestet werden (Sonderstrup et al., 1999).
Ähnliche Vorgangsweisen kann man zur Identifizierung von Epitopen mit HLA-Klasse I-Restrik- tion innerhalb von Staphylokokken-Antigenen verwenden.
5. Antigene können in Mäuse injiziert werden - und die Antikörper gegen diese Proteine kön- nen gemessen werden.
6. Die Schutzkapazität der von den Antigenen durch Impfung induzierten Antikörper kann in Tiermodellen bewertet werden.
Sowohl 5. als auch 6. sind Methoden, die für den Fachmann gut verfügbar sind.
Beispiel 7 : Anwendungen
A) Ein wirksames Vakzin bietet grosse Möglichkeiten ganz allgemein für Patienten, die vor einer elektiven Operation stehen, und insbesondere für jene, die endovaskuläre Vorrichtungen bekom- men. Patienten, die an chronischen Erkrankungen mit verringerten Immunreaktionen leiden oder die eine kontinuierliche ambulante Peritoneal-Dialyse durchmachen, werden wahrscheinlich von einem Vakzin mit S. aureus durch immunogene, Serum-reaktive Antigene gemäss der vorliegenden Erfindung profitieren. Die Identifizierung der relevanten Antigene hilft, eine wirksame passive Immunisierung (humanisierte monoklonale Antikörper-Therapie) zu erzeugen, die eine Human- Immunglobulin-Verabreichung mit all ihren gefährlichen Nebenwirkungen ersetzen kann.
Daher bietet ein wirksames Vakzin ganz allgemein grosse Möglichkeiten für Patienten, die vor einer elekti- ven Operation stehen, und insbesondere für jene, die endovaskuläre Vorrichtungen bekommen.
S. aureus kann viele verschiedene Erkrankungen verursachen.
1. Sepsis, Bakteriämie 2. Hämodialyse-Patienten - Bakteriämie, Sepsis 3. Peritoneal-Dialyse-Patienten - Peritonitis
<Desc/Clms Page number 22>
4. Patienten mit endovaskulären Vorrichtungen (Herzoperation usw.) - Endocarditis, Bakteriämie,
Sepsis 5. Orthopädische Patienten mit Prothesen - septische Arthritis 6. Präventive Impfung der allgemeinen Bevölkerung
B) Passive und aktive Impfung, beides mit besonderem Augenmerk auf T-Zellen. Bei letzterer ist es ein Ziel, eine starke T-Helper-Zellen-Reaktion während der Impfung zu induzieren, um eine effiziente humorale Reaktion und auch ein immunologisches Gedächtnis zu erreichen. Bisher gibt es keinen direkten Beweis, dass T-Zellen eine wichtige Rolle bei der Beseitigung von S. aureus- Infektionen spielen, diese Frage wurde jedoch bisher nicht entsprechend untersucht.
Eine wirksa- me humorale Reaktion gegen proteinhältige Antigene muss eine T-Hilfe involvieren, und dies ist für die Entwicklung eines Gedächtnisses wesentlich. Naive CD4 + Zellen können sich zu Th1- oder Th2-Zellen differenzieren. Da angeborene immunologische Reaktionen (Cytokine) diese Entschei- dung beeinflussen werden, könnte die Beteiligung von T-Zellen während einer akuten, ernsten Infektion anders sein im Vergleich zur Immunisierung gesunder Individuen mit Untereinheits- Vakzinen, die keine Bestandteile enthalten, die die Immunantwort während des natürlichen Infekti- onsverlaufs beeinträchtigen. Die Konsequenzen einer Induktion von Th1- oder Th2-Reaktionen sind profund. Th1-Zellen führen zu einer durch Zellen vermittelten Immunität, wogegen Th2-Zellen eine humorale Immunität vorsehen.
C) Präventive und therapeutische Vakzine Präventiv : aktive Impfung/passive Immunisierung von Menschen in Hochrisikogruppen, vor einer Infektion.
Therapeutisch : passive Impfung bereits Erkrankter.
Aktive Impfung, um die Nase als Träger auszuschliessen.
Spezifisches Beispiel einer Anwendung
Eliminierung von MRSA-Transport und Prävention der Besiedelung des medizinischen Personals.
Die Träger-Raten von S. aureus in den Nasenöffnungen von Menschen ausserhalb von Spitä- lern variiert von 10 bis 40%. Spitals-Patienten und-Personal haben höhere Trägerraten. Die Raten sind besonders hoch bei Patienten, die eine Hämodialyse durchmachen und bei Diabetikern, Drogensüchtigen und Patienten mit einer Vielfalt dermatologischer Erkrankungen. Patienten mit dem höchsten Risiko für eine MRSA-Infektion sind jene in grossen Spitälern mit Pflege dritten Grades, insbesondere alte Menschen und Immun-kompromittierte, jene in Intensivstationen, Pati- enten mit Verbrennungen, jene mit chirurgischen Wunden und Patienten mit intravenösen Kathe- tern.
Die ELISA-Daten deuten stark darauf hin, dass es eine ausgeprägte IgA-Reaktion auf S. aureus gibt, was aus der Literatur nicht offensichtlich oder bekannt ist. Da die vorherrschende Schleimhaut-Immunreaktion die Erzeugung von IgA mit neutralisierender Aktivität ist, ist es sehr wahrscheinlich, dass die Staphylokokken-Epitope und Antigene, die mit den hochreinen IgA- Präparaten identifiziert wurden, zu einem effizienten Schleimhaut-Vakzin führen.
Eindeutige Indikation : Gefährdung in den Abteilungen, in welchen Operationen durchgeführt werden (insbesondere Orthopädie, Traumatologie, allgemeine Chirurgie); . genau definierte Population für Impfung (Ärzte und Krankenschwestern); . Menschen, die in der Krankenfürsorge arbeiten und als intranasale Träger eines epidemischen
Stammes von S. aureus identifiziert wurden, werden derzeit mit Mupirocin und Rifampicin be- handelt, bis die Bakterien eliminiert sind. Manchmal ist dies nicht wirksam, und es nimmt Zeit in
Anspruch.
. Verfügbare Tiermodelle: Es gibt Maus-Modelle für intranasalen Transport.
<Desc/Clms Page number 23>
en gegen mehrere staphylokokken-protei
EMI23.1
on Seren nicht
EMI23.2
Tablle 1 : EIISA-T
EMI23.3
EMI23.4
<tb> @
<tb>
EMI23.5
EMI23.6
<tb> @
<tb>
EMI23.7
EMI23.8
<tb> @
<tb>
EMI23.9
EMI23.10
<tb> @
<tb> e
<tb>
<tb>
<tb>
EMI23.11
<Desc/Clms Page number 24>
EMI24.1
<Desc/Clms Page number 25>
Tabelle 2 : Immunogene Proteine, die durch Bakterien-Oberflächen- und RibosomenDisplay identifiziert wurden.
Bakterien-Oberflächen-Display: A : LSA250/1-Bibliothek in fhuA bei Patienten-Seren (655), B: LAS50/6-Bibliothek in lamB bei Patienten-Seren (498), C: LSA250/1-Bibliothek in fhuA bei IC- Seren (680); Ribosomen-Display: D : LSA250/1 Bibliothek mit IC-Seren (350). * : 18mal bei 33 Gescreenten identifiziert ; daher aus Screen C eliminiert. ** : von Antigen- Sequenzen, die mehr als 5 Aminosäuren lang waren, wurde mit dem Programm ANTIGENIC (Kolaskar und Tongaonkar, 1990) durchgeführt.
EMI25.1
<tb>
S. <SEP> aureus- <SEP> putative <SEP> vorausgesagte <SEP> immunogene <SEP> Aminosäuren** <SEP> # <SEP> der <SEP> se- <SEP> Stelle <SEP> der <SEP> Serum-Reakti-
<tb>
<tb> Antigen- <SEP> Funktion <SEP> lektierten <SEP> identifizier- <SEP> vität <SEP> mit <SEP> rele-
<tb>
<tb> Protein <SEP> (durch <SEP> Klone <SEP> pro <SEP> ten <SEP> immu- <SEP> vanter <SEP> Region
<tb>
<tb> Homologie) <SEP> ORF <SEP> and <SEP> nogenen <SEP> (positiv/gesamt)
<tb>
EMI25.2
EMI25.3
<tb> ORF <SEP> unbe- <SEP> LPXTGVI-- <SEP> 9-33, <SEP> 56-62, <SEP> 75-84, <SEP> 99-105, <SEP> 122-127, <SEP> 163-180, <SEP> 186-192, <SEP> B <SEP> :3 <SEP> AS <SEP> 527-544 <SEP> B:
7/29
<tb>
<tb>
<tb> kannt <SEP> Protein <SEP> 206-228, <SEP> 233-240, <SEP> 254-262,275-283, <SEP> 289-296,322-
<tb>
<tb>
<tb> 330, <SEP> 348-355, <SEP> 416-424, <SEP> 426-438, <SEP> 441-452, <SEP> 484-491, <SEP>
<tb>
<tb> 522-528,541-549, <SEP> 563-569, <SEP> 578-584, <SEP> 624-641
<tb>
<tb>
<tb> ORF0053 <SEP> Cmp <SEP> Bindungs- <SEP> 12-29, <SEP> 34-40, <SEP> 63-71, <SEP> 101-110, <SEP> 114-122, <SEP> 130-138, <SEP> 140- <SEP> A:7, <SEP> C:2 <SEP> AS <SEP> 39-94 <SEP> A <SEP> :10/29
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Faktor <SEP> 1-Ho- <SEP> 195, <SEP> 197-209, <SEP> 215-229, <SEP> 239-253, <SEP> 255-274 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> molog
<tb>
<tb> ORF0175 <SEP> YtpT, <SEP> konser- <SEP> 37-42, <SEP> 57-62, <SEP> 121-135, <SEP> 139-145, <SEP> 183-190, <SEP> 204-212, <SEP> C <SEP> :3 <SEP> AS <SEP> 624-684 <SEP> C:
4/9
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> viert <SEP> hypothet. <SEP> 220-227, <SEP> 242-248, <SEP> 278-288, <SEP> 295-30, <SEP> 304-309, <SEP> 335-341, <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> Protein <SEP> 396-404, <SEP> 412-433, <SEP> 443-449, <SEP> 497-503, <SEP> 505-513, <SEP> 539- <SEP>
<tb>
<tb> 545,552-558,601-617,629-649,702-711,736-745,
<tb>
<tb>
<tb> 793-804, <SEP> 814-829, <SEP> 843-858, <SEP> 864-885, <SEP> 889-895, <SEP> 905- <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 913, <SEP> 919-929, <SEP> 937-943, <SEP> 957-965, <SEP> 970-986, <SEP> 990-1030, <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> 1038-1049, <SEP> 1063-1072, <SEP> 1080-1091, <SEP> 1093-1116, <SEP> 1126- <SEP>
<tb>
<tb> 1136, <SEP> 1145-1157, <SEP> 1163-1171, <SEP> 1177-1183, <SEP> 1189-1196, <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1211-1218, <SEP> 1225-1235, <SEP> 1242-1256, <SEP> 1261-1269 <SEP>
<tb>
EMI25.4
EMI25.5
<tb> tein <SEP> 214-232, <SEP> 236-241,
<SEP> 244-249, <SEP> 292-297, <SEP> 319-328, <SEP> 336- <SEP> AS <SEP> 63-77 <SEP> B:10/29
<tb>
<tb>
<tb> 341, <SEP> 365-380, <SEP> 385-391, <SEP> 407-416, <SEP> 420-429, <SEP> 435-441, <SEP> AS <SEP> 274-334 <SEP> A <SEP> :5/30;
<tb>
<tb>
<tb> B:n..b.452-461, <SEP> 477-488, <SEP> 491-498, <SEP> 518-532, <SEP> 545-556, <SEP> 569- <SEP>
<tb>
<tb> 576,581-587,595-602, <SEP> 604-609,617-640,643-651, <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> 702-715, <SEP> 723-731, <SEP> 786-793, <SEP> 805-811, <SEP> 826-839, <SEP> 874-889 <SEP>
<tb>
EMI25.6
EMI25.7
<tb>
Protease
<tb>
<tb>
<tb> ORF0212 <SEP> NifS-Protein- <SEP> 8-16, <SEP> 22-35, <SEP> 49-58, <SEP> 70-77, <SEP> 101-121, <SEP> 123-132, <SEP> 147-161, <SEP> A <SEP> :12 <SEP> AS <SEP> 34-94 <SEP> A:6/29
<tb>
<tb>
<tb> Homolog <SEP> 163-192, <SEP> 203-209, <SEP> 216-234, <SEP> 238-249, <SEP> 268-274, <SEP> 280- <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> 293, <SEP> 298-318, <SEP> 328-333, <SEP> 339-345, <SEP> 355-361, <SEP> 372-381 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> ORF0267 <SEP> konserviertes <SEP> 33-43, <SEP> 45-51, <SEP> 57-63, <SEP> 65-72, <SEP> 80-96, <SEP> 99-1 <SEP> 10, <SEP> 123-129, <SEP> D:12 <SEP> AS <SEP> 358-411 <SEP> D:17/21
<tb>
<tb>
<tb> hypothetisches <SEP> 161-171, <SEP> 173-179, <SEP> 185-191, <SEP> 193-200, <SEP> 208-224, <SEP> 227- <SEP> AS <SEP> 588-606 <SEP> D:n.b.
<tb>
<tb>
<tb>
Protein <SEP> 246, <SEP> 252-258, <SEP> 294-308, <SEP> 321-329, <SEP> 344-352, <SEP> 691-707 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> ORF0299 <SEP> konserviertes <SEP> 4-9, <SEP> 17-41, <SEP> 50-56, <SEP> 63-69, <SEP> 82-87, <SEP> 108-115, <SEP> 145-151, <SEP> C <SEP> :3 <SEP> AS <SEP> 414-455 <SEP> C:9/9
<tb>
<tb>
<tb> hypothetisches <SEP> 207-214, <SEP> 244-249, <SEP> 284-290, <SEP> 308-316, <SEP> 323-338, <SEP> 348- <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> Protein <SEP> 358, <SEP> 361-378, <SEP> 410-419, <SEP> 445-451, <SEP> 512-522, <SEP> 527-533,
<tb>
<tb>
<tb> 540-546, <SEP> 553-558, <SEP> 561-575, <SEP> 601-608, <SEP> 632-644, <SEP> 656- <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> 667, <SEP> 701-713, <SEP> 727-733, <SEP> 766-780 <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 26>
EMI26.1
<tb> S. <SEP> aureus- <SEP> putative <SEP> vorausgesagte <SEP> immunogene <SEP> Aminosäuren** <SEP> #
<SEP> der <SEP> se- <SEP> Stelle <SEP> der <SEP> Serum-Reakti-
<tb>
<tb> Antigen- <SEP> Funktion <SEP> lektierten <SEP> identifizier- <SEP> vität <SEP> mit <SEP> rele-
<tb>
<tb> Protein <SEP> (durch <SEP> Klone <SEP> pro <SEP> ten <SEP> immu- <SEP> vanter <SEP> Region
<tb>
<tb> Homologie) <SEP> ORF <SEP> and <SEP> nogenen <SEP> (positiv/gesamt)
<tb>
<tb> Screen <SEP> Region
<tb> ORF0302 <SEP> YycH-Protein <SEP> 16-38, <SEP> 71-77, <SEP> 87-94, <SEP> 105-112, <SEP> 124-144, <SEP> 158-164, <SEP> 169- <SEP> D:14 <SEP> AS <SEP> 401-494 <SEP> D:n.b.
<tb>
<tb>
<tb>
177, <SEP> 180-186, <SEP> 194-204, <SEP> 221-228, <SEP> 236-245, <SEP> 250-267, <SEP>
<tb> 336-343, <SEP> 363-378, <SEP> 385-394, <SEP> 406-412, <SEP> 423-440, <SEP> 443-449 <SEP> ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
<tb>
EMI26.2
EMI26.3
<tb> 220, <SEP> 229-235, <SEP> 242-248, <SEP> 251-258, <SEP> 281-292, <SEP> 309-316, <SEP> AS <SEP> 646-727 <SEP> C:
2/9
<tb>
<tb> 333-343,348-354, <SEP> 361-367, <SEP> 393-407, <SEP> 441-447,481- <SEP> AS <SEP> 2104-
<tb>
<tb> 488,493-505, <SEP> 510-515, <SEP> 517-527, <SEP> 530-535, <SEP> 540-549, <SEP> 2206
<tb>
<tb> 564-583, <SEP> 593-599, <SEP> 608-621, <SEP> 636-645, <SEP> 656-670, <SEP> 674- <SEP>
<tb>
<tb> 687, <SEP> 697-708, <SEP> 726-734, <SEP> 755-760, <SEP> 765-772, <SEP> 785-792,
<tb>
<tb> 798-815, <SEP> 819-824, <SEP> 826-838,846-852, <SEP> 889-904,907-
<tb>
EMI26.4
EMI26.5
<tb> 1024, <SEP> 1028-1034, <SEP> 1059-1065, <SEP> 1078-1084, <SEP> 1122-1129, <SEP>
<tb>
<tb> 1134-1143, <SEP> 1180-1186, <SEP> 1188-1194, <SEP> 1205-1215, <SEP> 1224-
<tb>
<tb>
<tb> 1230, <SEP> 1276-1283, <SEP> 1333-1339, <SEP> 1377-1382, <SEP> 1415-1421, <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> 1448-1459, <SEP> 1467-1472, <SEP> 1537-1545,1556-1566, <SEP> 1647-
<tb>
<tb>
<tb> 1654,1666-1675,
<SEP> 1683-1689, <SEP> 1722-1737, <SEP> 1740-1754,
<tb>
<tb>
<tb> 1756-1762, <SEP> 1764-1773, <SEP> 1775-1783, <SEP> 1800-1809, <SEP> 1811-
<tb>
<tb>
<tb> 1819, <SEP> 1839-1851, <SEP> 1859-1866, <SEP> 1876-1882, <SEP> 1930-1939, <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> 1947-1954, <SEP> 1978-1985, <SEP> 1999-2007, <SEP> 2015-2029, <SEP> 2080- <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> 2086,2094-2100,2112-2118,2196-2205,2232-2243
<tb>
EMI26.6
EMI26.7
<tb> ISPP <SEP> sezemierter <SEP> 317, <SEP> 321-331, <SEP> 341-353, <SEP> 357-363, <SEP> 366-372, <SEP> 377-384, <SEP> AS <SEP> 206-220 <SEP> B:1/1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Protein-Vor- <SEP> 390-396, <SEP> 409-415, <SEP> 440-448, <SEP> 458-470, <SEP> 504-520, <SEP> 544- <SEP> AS <SEP> 297-309 <SEP> B:
6/27
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> läufer, <SEP> putativ <SEP> 563, <SEP> 568-581, <SEP> 584-592, <SEP> 594-603, <SEP> 610-616
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ORF0418 <SEP> Aureolysin <SEP> 10-29, <SEP> 46-56, <SEP> 63-74, <SEP> 83-105, <SEP> 107-114, <SEP> 138-145, <SEP> 170- <SEP> A:1.C:6 <SEP> AS <SEP> 83-156 <SEP> A:14/29
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 184, <SEP> 186-193, <SEP> 216-221, <SEP> 242-248, <SEP> 277-289, <SEP> 303-311,
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 346-360, <SEP> 379-389, <SEP> 422-428, <SEP> 446-453, <SEP> 459-469,479-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ¯¯¯¯¯¯¯ <SEP> 489, <SEP> 496-501 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ORF0426 <SEP> Verklumpungs- <SEP> 5-10, <SEP> 17-45, <SEP> 120-127, <SEP> 135-141, <SEP> 168-180, <SEP> 187-208, <SEP> 216- <SEP> D:
9 <SEP> AS <SEP> 706-762
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Faktor <SEP> B <SEP> 224, <SEP> 244-254, <SEP> 256-264, <SEP> 290-312, <SEP> 322-330, <SEP> 356-366, <SEP> AS <SEP> 810-852
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 374-384, <SEP> 391-415, <SEP> 421-428, <SEP> 430-437, <SEP> 442-449, <SEP> 455-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 461, <SEP> 464-479, <SEP> 483-492, <SEP> 501-512, <SEP> 548-555, <SEP> 862-868, <SEP>
<tb>
EMI26.8
EMI26.9
<tb> IsaA <SEP> Adhasion/Ag- <SEP> 148,169-181,217-228 <SEP> C <SEP> :3 <SEP> AS <SEP> 98-184 <SEP> A:22/29; <SEP> B:n.b. <SEP>
<tb>
<tb> gregation <SEP> AS <SEP> 182-225 <SEP> A:16/29;
<tb>
<tb> ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ <SEP> ¯¯¯¯¯¯¯ <SEP> B,b71:16/29
<tb>
<tb> ORF0509 <SEP> ORF1;
<SEP> Homo- <SEP> 5-31, <SEP> 47-55, <SEP> 99-104, <SEP> 133-139, <SEP> 156-172, <SEP> 214-224, <SEP> 240- <SEP> A:130, <SEP> AS <SEP> 7-87 <SEP> A:1/1
<tb>
<tb> logie <SEP> mit <SEP> puta- <SEP> 247 <SEP> B:51. <SEP> C:13 <SEP> AS <SEP> 133-242 <SEP> A,bmd16:6/29;
<tb> tivem <SEP> B.bdb20:1/1
<tb>
<tb> sezemiertem
<tb>
<tb>
<tb> Antigen-Vorlaufer <SEP> aus <SEP> S.
<tb>
<tb>
<tb> epidermidis <SEP> ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
<tb>
<Desc/Clms Page number 27>
EMI27.1
<tb> S. <SEP> aureus- <SEP> putative <SEP> vorausgesagte <SEP> immunogene <SEP> Aminosäuren** <SEP> #
<SEP> der <SEP> se. <SEP> Stelle <SEP> der <SEP> Serum-Reakti-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Antigen- <SEP> Funktion <SEP> lektierten <SEP> identifizier- <SEP> vität <SEP> mit <SEP> rele-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Protein <SEP> (durch <SEP> Klone <SEP> pro <SEP> ten <SEP> immu- <SEP> vanter <SEP> Region
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Homologie) <SEP> ORF <SEP> and <SEP> nogenen <SEP> (positiv/gesamt)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Screen <SEP> Region
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ORF0519 <SEP> konserviertes <SEP> 14-22, <SEP> 32-40, <SEP> 52-58, <SEP> 61-77, <SEP> 81-93, <SEP> 111-117, <SEP> 124-138, <SEP> D:
3 <SEP> AS <SEP> 403-462
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> hypothetisches <SEP> 151-190, <SEP> 193-214, <SEP> 224-244, <SEP> 253-277,287-295, <SEP> 307-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Protein <SEP> 324, <SEP> 326-332, <SEP> 348-355, <SEP> 357-362, <SEP> 384-394,397-434,
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 437-460, <SEP> 489-496, <SEP> 503-510, <SEP> 516-522, <SEP> 528-539, <SEP> 541-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 547, <SEP> 552-558, <SEP> 563-573, <SEP> 589-595, <SEP> 602-624, <SEP> 626-632, <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 651-667, <SEP> 673-689, <SEP> 694-706, <SEP> 712-739, <SEP> 756-790 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ORF0551 <SEP> unbekannt <SEP> 49-56, <SEP> 62-68, <SEP> 83-89, <SEP> 92-98, <SEP> 109-115, <SEP> 124-131, <SEP> 142- <SEP> B:2 <SEP> AS <SEP> 34-46 <SEP> B:
1/1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 159, <SEP> 161-167, <SEP> 169-175, <SEP> 177-188, <SEP> 196-224, <SEP> 230-243,
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 246-252
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ORF0588 <SEP> Fnbp <SEP> 8-29, <SEP> 96-105, <SEP> 114-121, <SEP> 123-129, <SEP> 141-147, <SEP> 151-165, <SEP> A:4, <SEP> C:4, <SEP> AS <SEP> 710-787 <SEP> C:9/9
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 171-183,198-206,222-232,253-265,267-277,294- <SEP> D:5 <SEP> AS <SEP> 855-975 <SEP> D:
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 300, <SEP> 302-312, <SEP> 332-338, <SEP> 362-368, <SEP> 377-383, <SEP> 396-402, <SEP> AS <SEP> 916-983 <SEP> A:
17/30
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 410-416, <SEP> 451-459, <SEP> 473-489, <SEP> 497-503, <SEP> 537-543, <SEP> 549-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 559, <SEP> 58 <SEP> 1-600, <SEP> 623-629, <SEP> 643-649, <SEP> 655-666, <SEP> 680-687,
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 694-700, <SEP> 707-712, <SEP> 721-727, <SEP> 770-782, <SEP> 810-822, <SEP> 874- <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 881, <SEP> 883-889, <SEP> 897-903, <SEP> 911-917, <SEP> 925-931, <SEP> 933-939,
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 946-963, <SEP> 965-973, <SEP> 997-1010 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ORF0590 <SEP> FnbpB <SEP> 5-12, <SEP> 18-37, <SEP> 104-124, <SEP> 139-145, <SEP> 154-166, <SEP> 175-181, <SEP> 185- <SEP> A:2, <SEP> C:5 <SEP> AS <SEP> 701-777 <SEP> A:
28/28
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 190, <SEP> 193-199, <SEP> 203-209, <SEP> 235-244, <SEP> 268-274, <SEP> 278-292, <SEP> AS <SEP> 783-822 <SEP> A:1/1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 299-307, <SEP> 309-320, <SEP> 356-364, <SEP> 375-384, <SEP> 390-404, <SEP> 430- <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 440, <SEP> 450-461, <SEP> 488-495, <SEP> 505-511, <SEP> 527-535, <SEP> 551-556,
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 567-573, <SEP> 587-593, <SEP> 599-609, <SEP> 624-631, <SEP> 651-656, <SEP> 665- <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 671, <SEP> 714-726, <SEP> 754-766, <SEP> 799-804, <SEP> 818-825, <SEP> 827-833, <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 841-847,855-861,876-893,895-903,927-940
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ORF0594 <SEP> LPXTGIV- <SEP> 11-20, <SEP> 26-47, <SEP> 69-75, <SEP> 84-92, <SEP> 102-109, <SEP> 119-136, <SEP> 139- <SEP> A <SEP> :4, <SEP> C <SEP> :
3 <SEP> AS <SEP> 493-587 <SEP> A,s61,164:1/1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Protein <SEP> 147,160-170,178-185,190-196,208-215,225-233. <SEP> AS <SEP> 633-715 <SEP> A:1/1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 245-250, <SEP> 265-272, <SEP> 277-284, <SEP> 300-306, <SEP> 346-357, <SEP> 373- <SEP> AS <SEP> 704-760 <SEP> A:16/30
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 379, <SEP> 384-390, <SEP> 429-435, <SEP> 471-481, <SEP> 502-507,536-561,
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 663-688, <SEP> 791-816, <SEP> 905-910, <SEP> 919-933, <SEP> 977-985, <SEP> 1001- <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1010, <SEP> 1052-1057, <SEP> 1070-1077, <SEP> 1082-1087, <SEP> 1094-1112
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ORF0691 <SEP> IgG-Bindungs- <SEP> 6-20, <SEP> 53-63, <SEP> 83-90, <SEP> 135-146, <SEP> 195-208, <SEP> 244-259, <SEP> 263- <SEP> A:1, <SEP> B:1 <SEP> AS <SEP> 208-287 <SEP> A:
25/29
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sbi <SEP> Protein <SEP> 314, <SEP> 319-327, <SEP> 337-349, <SEP> 353-362, <SEP> 365-374, <SEP> 380-390, <SEP> AS <SEP> 286-314 <SEP> B,b34:8/29
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 397-405, <SEP> 407-415 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ORF0749 <SEP> unbekannt <SEP> 10-26, <SEP> 31-43, <SEP> 46-58, <SEP> 61-66, <SEP> 69-79, <SEP> 85-92, <SEP> 100-115, <SEP> B <SEP> :2 <SEP> AS <SEP> 59-74 <SEP> 8:
11/26
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 120-126, <SEP> 128-135, <SEP> 149-155, <SEP> 167-173, <SEP> 178-187, <SEP> 189- <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 196, <SEP> 202-222, <SEP> 225-231 <SEP> , <SEP> 233-240, <SEP> 245-251 <SEP> , <SEP> 257-263,
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 271-292, <SEP> 314-322, <SEP> 325-334, <SEP> 339-345
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ORF0826 <SEP> Homologie <SEP> mit <SEP> 4-9, <SEP> 15-26, <SEP> 65-76, <SEP> 108-115, <SEP> 119-128, <SEP> 144-153 <SEP> A <SEP> :5 <SEP> AS <SEP> 38-52 <SEP> B:n.b.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
ORF1 <SEP> ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ <SEP> AS <SEP> 66-114 <SEP> A:5/30
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ORF0831 <SEP> Homologie <SEP> mit <SEP> 5-22, <SEP> 42-50, <SEP> 74-81, <SEP> 139-145, <SEP> 167-178, <SEP> 220-230, <SEP> 246- <SEP> A:224, <SEP> AS <SEP> 137-237 <SEP> B,c7:1/1;
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ORF1 <SEP> 253, <SEP> 255-264 <SEP> B:58, <SEP> AS <SEP> 250-267 <SEP> A,k29:15/29
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> C:169 <SEP> B <SEP> :
8/29
<tb>
EMI27.2
EMI27.3
<tb> Lyase <SEP> 205. <SEP> 216-223, <SEP> 226-238, <SEP> 241-258, <SEP> 271-280, <SEP> 295-315,
<tb>
<tb> 346-351,371-385, <SEP> 396-407, <SEP> 440-446, <SEP> 452-457, <SEP> 460-
<tb>
<tb> 466, <SEP> 492-510, <SEP> 537-543, <SEP> 546-551, <SEP> 565-582, <SEP> 590-595,
<tb>
<tb> 635-650, <SEP> 672-678, <SEP> 686-701, <SEP> 705-712, <SEP> 714-721, <SEP> 725- <SEP>
<tb>
EMI27.4
<Desc/Clms Page number 28>
EMI28.1
<tb> S. <SEP> aureus- <SEP> putative <SEP> vorausgesagte <SEP> immunogene <SEP> Aminosäuren" <SEP> #
<SEP> der <SEP> se- <SEP> Stelle <SEP> der <SEP> Serum-Reakti-
<tb>
<tb>
<tb> Antigen- <SEP> Funktion <SEP> lektierten <SEP> identifizier- <SEP> vität <SEP> mit <SEP> rele-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Protein <SEP> (durch <SEP> Klone <SEP> pro <SEP> ten <SEP> immu- <SEP> vanter <SEP> Region
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Homologie) <SEP> ORF <SEP> and <SEP> nogenen <SEP> (positiv/gesamt)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ¯¯¯ <SEP> Screen <SEP> Region <SEP> ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ORF <SEP> 1024 <SEP> unbekannt <SEP> 5-32, <SEP> 35-48, <SEP> 55-76 <SEP> C <SEP> :1 <SEP> Komplement <SEP> C:1/1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> bp <SEP> 237- <SEP> 170
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ORF1163 <SEP> SdrH <SEP> -Homolog <SEP> 7-35, <SEP> 54-59, <SEP> 247-261, <SEP> 263-272, <SEP> 302-320, <SEP> 330-339, <SEP> 368- <SEP> B <SEP> :7 <SEP> AS <SEP> 126-143 <SEP> B:n.b.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
374,382-411 <SEP> AS <SEP> 168-186 <SEP> B <SEP> :20/29
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ORF1178 <SEP> LukM <SEP> -Homo- <SEP> 5-24,88-94, <SEP> 102-1 <SEP> 13, <SEP> 132-143, <SEP> 163-173, <SEP> 216-224, <SEP> 254- <SEP> A:12,B:3 <SEP> AS <SEP> 31-61 <SEP> A:20/29
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ¯¯¯ <SEP> log <SEP> 269, <SEP> 273-278,305-313, <SEP> 321-327,334-341 <SEP> C <SEP> :36 <SEP> AS <SEP> 58-74 <SEP> B:22/29
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ORF1180 <SEP> Leukocidin <SEP> F- <SEP> 16-24, <SEP> 32-39, <SEP> 43-49, <SEP> 64-71, <SEP> 93-99, <SEP> 126-141, <SEP> 144-156, <SEP> A <SEP> :9 <SEP> AS <SEP> 158-220 <SEP> A:8/29
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Homolog <SEP> 210-218, <SEP> 226-233, <SEP> 265-273, <SEP> 276-284 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ORF <SEP> 1307 <SEP> unbekannt <SEP> 49-72, <SEP> 76-83, <SEP> 95-105, <SEP> 135-146, <SEP> 148-164, <SEP> 183-205 <SEP> A <SEP> :
1 <SEP> AS <SEP> 57-128 <SEP> A:7/30
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ORF1331 <SEP> putatives <SEP> ex- <SEP> 6-15, <SEP> 22-32, <SEP> 58-73, <SEP> 82-88, <SEP> 97-109, <SEP> 120-131, <SEP> 134-140, <SEP> A:10,C:30 <SEP> AS <SEP> 5-134 <SEP> A:6/28
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> trazellulares <SEP> 151-163, <SEP> 179-185, <SEP> 219-230, <SEP> 242-255,271-277, <SEP> 288-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Matrix-Bin- <SEP> 293, <SEP> 305-319, <SEP> 345-356, <SEP> 368-381, <SEP> 397-406, <SEP> 408-420, <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> dungs-Protein <SEP> 427-437, <SEP> 448-454, <SEP> 473-482, <SEP> 498-505, <SEP> 529-535, <SEP> 550- <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 563, <SEP> 573-580, <SEP> 582-590, <SEP> 600-605, <SEP> 618-627, <SEP> 677-685, <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 718-725, <SEP> 729-735, <SEP> 744-759, <SEP> 773-784, <SEP> 789-794, <SEP> 820- <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 837, <SEP> 902-908,
<SEP> 916-921, <SEP> 929-935, <SEP> 949-955, <SEP> 1001-1008, <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1026-1032,1074-1083,1088-1094,1108-1117,1137-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1142, <SEP> 1159-1177, <SEP> 1183-1194, <SEP> 1214-1220, <SEP> 1236-1252, <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1261-1269, <SEP> 1289-1294, <SEP> 1311-1329, <SEP> 1336-1341, <SEP> 1406- <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1413,1419-1432,1437-1457,1464-1503,1519-1525,
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1531-1537, <SEP> 1539-1557, <SEP> 1560-1567, <SEP> 1611-1618, <SEP> 1620- <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1629, <SEP> 1697-1704, <SEP> 1712-1719, <SEP> 1726-1736, <SEP> 1781-1786, <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1797-1817, <SEP> 1848-1854, <SEP> 1879-1890, <SEP> 1919-1925, <SEP> 1946- <SEP>
<tb>
EMI28.2
EMI28.3
<tb> ORF1414 <SEP> Yfix <SEP> 6-33,40-46,51-59,61-77,84-104,112-118,124-187, <SEP> D <SEP> :
4 <SEP> AS <SEP> 483-511 <SEP> D <SEP> :n.b.
<tb>
<tb>
194-248, <SEP> 252-296, <SEP> 308-325, <SEP> 327-361, <SEP> 367-393, <SEP> 396- <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> 437, <SEP> 452-479, <SEP> 484-520, <SEP> 535-545, <SEP> 558-574, <SEP> 582-614, <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> 627-633, <SEP> 656-663, <SEP> 671-678, <SEP> 698-704, <SEP> 713-722, <SEP> 725- <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> 742, <SEP> 744-755, <SEP> 770-784, <SEP> 786-800, <SEP> 816-822, <SEP> 827-837 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> ORF <SEP> 1462 <SEP> Carbamoyl- <SEP> 8-23, <SEP> 31-38, <SEP> 42-49, <SEP> 61-77, <SEP> 83-90, <SEP> 99-108, <SEP> 110-119, <SEP> C <SEP> :2 <SEP> AS <SEP> 630-700 <SEP> C:
5/9
<tb>
<tb>
<tb> phosphat- <SEP> 140-147, <SEP> 149-155, <SEP> 159-171, <SEP> 180-185, <SEP> 189-209, <SEP> 228- <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> Synthase <SEP> 234, <SEP> 245-262, <SEP> 264-275,280-302, <SEP> 304-330,343-360,
<tb>
<tb>
<tb> 391-409, <SEP> 432-437, <SEP> 454-463, <SEP> 467-474, <SEP> 478-485, <SEP> 515- <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> 528, <SEP> 532-539, <SEP> 553-567, <SEP> 569-581, <SEP> 586-592, <SEP> 605-612, <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> 627-635, <SEP> 639-656, <SEP> 671-682, <SEP> 700-714, <SEP> 731-747, <SEP> 754- <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> 770, <SEP> 775-791, <SEP> 797-834, <SEP> 838-848, <SEP> 872-891, <SEP> 927-933, <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> 935-942,948-968, <SEP> 976-986, <SEP> 1000-1007,1029-1037
<tb>
<tb>
<tb> ORF <SEP> 1633 <SEP> Autolysin, <SEP> Ad- <SEP> 4-19, <SEP> 57-70, <SEP> 79-88, <SEP> 126-132, <SEP> 144-159, <SEP> 161-167, <SEP> 180- <SEP> A:22, <SEP> B:
47, <SEP> AS <SEP> 6-66 <SEP> A,n93:1/1,
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Autolysin <SEP> häsion <SEP> 198, <SEP> 200-212, <SEP> 233-240, <SEP> 248-255, <SEP> 276-286, <SEP> 298-304, <SEP> C <SEP> :61 <SEP> AS <SEP> 65-124 <SEP> C,h05:7/8
<tb>
<tb> 309-323, <SEP> 332-346, <SEP> 357-366, <SEP> 374-391, <SEP> 394-406, <SEP> 450- <SEP> AS <SEP> 590-604 <SEP> A,bmd18:16/30;
<tb>
<tb>
<tb> 456, <SEP> 466-473, <SEP> 479-487, <SEP> 498-505, <SEP> 507-519, <SEP> 521-530, <SEP> B,b89:
1/1
<tb>
EMI28.4
EMI28.5
<tb> 642, <SEP> 650-656, <SEP> 658-665, <SEP> 676-682, <SEP> 690-699, <SEP> 724-733, <SEP>
<tb>
<tb> 740-771, <SEP> 774-784, <SEP> 791-797, <SEP> 808-815, <SEP> 821-828, <SEP> 832- <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> 838, <SEP> 876-881, <SEP> 893-906, <SEP> 922-929, <SEP> 938-943, <SEP> 948-953, <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> 969-976, <SEP> 1002-1008, <SEP> 1015-1035, <SEP> 1056-1069, <SEP> 1105-1116, <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> 1124-1135, <SEP> 1144-1151, <SEP> 1173-1181, <SEP> 1186-1191, <SEP> 1206- <SEP>
<tb>
EMI28.6
<Desc/Clms Page number 29>
EMI29.1
<tb> S. <SEP> aureus- <SEP> putative <SEP> vorausgesagte <SEP> immunogene <SEP> Aminosäuren** <SEP> #
<SEP> der <SEP> se- <SEP> Stelle <SEP> der <SEP> Serum-Reakti-
<tb>
<tb> Antigen- <SEP> Funktion <SEP> lektierten <SEP> identifizier- <SEP> vität <SEP> mit <SEP> rele-
<tb>
<tb> Protein <SEP> (durch <SEP> Klone <SEP> pro <SEP> ten <SEP> immu- <SEP> vanter <SEP> Region
<tb>
<tb> Homologie) <SEP> ORF <SEP> and <SEP> nogenen <SEP> (positiv/gesamt)
<tb>
<tb> ¯¯¯¯¯¯¯ <SEP> ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ <SEP> ¯¯¯¯ <SEP> Screen <SEP> Region
<tb>
<tb> ORF <SEP> 1640 <SEP> V8-Protease <SEP> 5-32, <SEP> 66-72, <SEP> 87-98, <SEP> 104-112, <SEP> 116-124, <SEP> 128-137, <SEP> 162- <SEP> A <SEP> :1 <SEP> AS <SEP> 174-249 <SEP> A:11/30
<tb>
<tb> 168, <SEP> 174-183, <SEP> 248-254, <SEP> 261-266, <SEP> 289-303, <SEP> 312-331 <SEP>
<tb>
<tb> ORF <SEP> 1704 <SEP> Homologie <SEP> mit <SEP> 4-21, <SEP> 28-40, <SEP> 45-52, <SEP> 59-71, <SEP> 92-107, <SEP> 123-137, <SEP> 159-174, <SEP> A:2,C:
1 <SEP> AS <SEP> 21-118 <SEP> A <SEP> :28/30
<tb>
<tb> ORF1 <SEP> 190-202,220-229, <SEP> 232-241,282-296, <SEP> 302-308,312-331
<tb>
<tb> ORF1879 <SEP> SdrC <SEP> 23-51, <SEP> 75-80, <SEP> 90-99, <SEP> 101-107, <SEP> 151-157, <SEP> 173-180, <SEP> 186- <SEP> A:1,D:5, <SEP> AS <SEP> 98-182 <SEP> A <SEP> :9/30
<tb>
<tb> 205, <SEP> 215-226, <SEP> 239-263, <SEP> 269-274, <SEP> 284-304, <SEP> 317-323, <SEP> C <SEP> :1 <SEP> AS <SEP> 684-764 <SEP> D:n.b.
<tb>
<tb>
*329-336, <SEP> 340-347, <SEP> 360-366, <SEP> 372-379, <SEP> 391-397, <SEP> 399- <SEP> AS <SEP> 836-870 <SEP> C:3/8
<tb>
<tb> 406, <SEP> 413-425, <SEP> 430-436, <SEP> 444-455, <SEP> 499-505, <SEP> 520-529,
<tb>
<tb> 553-568,586-592, <SEP> 600-617,631-639, <SEP> 664-678,695-
<tb>
<tb> 701, <SEP> 891-903, <SEP> 906-912, <SEP> 926-940
<tb>
<tb> ORF1881 <SEP> SdrE <SEP> 25-45, <SEP> 72-77, <SEP> 147-155, <SEP> 198-211, <SEP> 217-223, <SEP> 232-238, <SEP> C:12 <SEP> AS <SEP> 147-192 <SEP> C <SEP> :
1/8
<tb>
<tb> 246-261,266-278, <SEP> 281-294, <SEP> 299-304,332-340, <SEP> 353-
<tb>
<tb> 360, <SEP> 367-380, <SEP> 384-396, <SEP> 404-409, <SEP> 418-429, <SEP> 434-440, <SEP>
<tb>
<tb> 448-460, <SEP> 465-476, <SEP> 493-509, <SEP> 517-523, <SEP> 531-540, <SEP> 543- <SEP>
<tb> 555, <SEP> 561-566, <SEP> 576-582, <SEP> 584-591, <SEP> 603-617, <SEP> 633-643, <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> 647-652, <SEP> 668-674, <SEP> 677-683, <SEP> 696-704, <SEP> 716-728, <SEP> 744- <SEP>
<tb>
EMI29.2
EMI29.3
<tb> 887-903, <SEP> 918-924, <SEP> 1110-1116, <SEP> 1125-1131, <SEP> 1145-1159 <SEP>
<tb>
<tb> ORF <SEP> 1909 <SEP> unbekannt <SEP> 9-28, <SEP> 43-48, <SEP> 56-75, <SEP> 109-126, <SEP> 128-141, <SEP> 143-162, <SEP> 164- <SEP> B:3 <SEP> AS <SEP> 168-181 <SEP> B <SEP> :
5/27
<tb>
<tb> 195, <SEP> 197-216, <SEP> 234-242, <SEP> 244-251 <SEP>
<tb>
<tb> ORF1941 <SEP> unbekannt <SEP> 4-10,20-42,50-86,88-98,102-171,176-182,189-221, <SEP> A <SEP> :1 <SEP> AS <SEP> 112-188 <SEP> A:5/30
<tb>
<tb> 223-244,246-268,276-284, <SEP> 296-329
<tb>
<tb> ORF1988 <SEP> Homologie <SEP> mit <SEP> 4-9, <SEP> 13-24, <SEP> 26-34, <SEP> 37-43, <SEP> 45-51, <SEP> 59-73, <SEP> 90-96, <SEP> 99-113, <SEP> A:58, <SEP> AS <SEP> 45-105 <SEP> A,m63:1/1
<tb>
<tb> ORF1 <SEP> 160-173, <SEP> 178-184, <SEP> 218-228, <SEP> 233-238, <SEP> 255-262 <SEP> C:18* <SEP> AS <SEP> 103-166 <SEP> A,m82:14/29
<tb>
<tb> AS <SEP> 66-153 <SEP> A,bmd3:25/30
<tb>
<tb> ORF2077 <SEP> putatives <SEP> inte- <SEP> 13-27, <SEP> 42-63, <SEP> 107-191, <SEP> 198-215, <SEP> 218-225, <SEP> 233-250 <SEP> A:6, <SEP> B <SEP> :2, <SEP> Komplement
<tb>
<tb> grales <SEP> Mem- <SEP> C <SEP> :
49 <SEP> bp <SEP> 474-367 <SEP> A:11/30:B:10/27
<tb>
EMI29.4
EMI29.5
<tb> ORF2088 <SEP> Präprotein- <SEP> 16-29, <SEP> 64-77, <SEP> 87-93, <SEP> 95-101, <SEP> 127-143, <SEP> 150-161, <SEP> 204- <SEP> A <SEP> :1 <SEP> AS <SEP> 1-19 <SEP> A <SEP> :6/29
<tb>
<tb> translocase <SEP> 221, <SEP> 225-230, <SEP> 236-249, <SEP> 263-269, <SEP> 281-309, <SEP> 311-325, <SEP>
<tb>
<tb> seca-Unterein- <SEP> 337-343, <SEP> 411-418, <SEP> 421-432, <SEP> 435-448, <SEP> 461-467, <SEP> 474- <SEP>
<tb>
<tb> heit <SEP> 480, <SEP> 483-489, <SEP> 508-516, <SEP> 542-550, <SEP> 580-589, <SEP> 602-611, <SEP>
<tb>
<tb> 630-636, <SEP> 658-672, <SEP> 688-705, <SEP> 717-723, <SEP> 738-746, <SEP> 775- <SEP>
<tb>
<tb> 786, <SEP> 800-805, <SEP> 812-821, <SEP> 828-834 <SEP>
<tb>
<tb> ORF2110 <SEP> hypothet. <SEP> Pro- <SEP> 26-53, <SEP> 95-123, <SEP> 164-176, <SEP> 189-199 <SEP> D:
12 <SEP> AS <SEP> 8-48 <SEP> D:n.b.
<tb> tein
<tb>
EMI29.6
EMI29.7
<tb>
Faktor <SEP> A <SEP> 215-229, <SEP> 236-244, <SEP> 246-273, <SEP> 276-283, <SEP> 285-326,328-
<tb>
<tb> 342, <SEP> 349-355, <SEP> 362-370, <SEP> 372-384, <SEP> 396-402, <SEP> 405-415, <SEP>
<tb>
<tb> 423-428, <SEP> 432-452, <SEP> 458-465, <SEP> 471-477, <SEP> 484-494, <SEP> 502- <SEP>
<tb>
<tb> 515, <SEP> 540-547, <SEP> 554-559, <SEP> 869-875, <SEP> 893-898, <SEP> 907-924, <SEP>
<tb>
<tb> ORF2135 <SEP> extrazellulares <SEP> 7-13, <SEP> 15-23, <SEP> 26-33, <SEP> 68-81, <SEP> 84-90, <SEP> 106-117, <SEP> 129-137, <SEP> A:50, <SEP> B:27, <SEP> AS <SEP> 22-56 <SEP> A,k24:1/1;
<tb>
<tb> Empbp <SEP> Matrix- <SEP> und <SEP> 140-159, <SEP> 165-172, <SEP> 177-230, <SEP> 234-240, <SEP> 258-278, <SEP> 295-319 <SEP> C <SEP> :15 <SEP> AS <SEP> 23-99 <SEP> B,b43:24/30
<tb>
<tb> Plasma-Bin- <SEP> AS <SEP> 97-115 <SEP> A,bmd1:
30/30
<tb>
<tb> dungs-Protein <SEP> AS <SEP> 233-250 <SEP> B,bdb19:1/1
<tb>
<tb> AS <SEP> 245-265 <SEP> B:n.b.
<tb>
<Desc/Clms Page number 30>
EMI30.1
<tb>
S. <SEP> aureus- <SEP> putative <SEP> vorausgesagte <SEP> immunogene <SEP> Aminosäuren** <SEP> # <SEP> der <SEP> se- <SEP> Stelle <SEP> der <SEP> Serum-Reakti-
<tb>
<tb> Antigen- <SEP> Funktion <SEP> lektierten <SEP> identifizier- <SEP> vität <SEP> mit <SEP> rele-
<tb>
<tb> Protein <SEP> (durch <SEP> Klone <SEP> pro <SEP> ten <SEP> immu- <SEP> vanter <SEP> Region
<tb>
<tb> Homologie) <SEP> ORF <SEP> and <SEP> nogenen <SEP> (positiv/gesamt)
<tb>
<tb> Screen <SEP> Region
<tb>
<tb> ORF2227 <SEP> Coma-Operon- <SEP> 17-25, <SEP> 27-55, <SEP> 84-90, <SEP> 95-101, <SEP> 115-121 <SEP> C <SEP> :3 <SEP> AS <SEP> 55-101 <SEP> C:1/1
<tb>
<tb> Protein <SEP> 2
<tb>
<tb> ORF2295 <SEP> putatives <SEP> Exo- <SEP> 13-28, <SEP> 40-46, <SEP> 69-75, <SEP> 86-92, <SEP> 114-120, <SEP> 126-137, <SEP> 155- <SEP> C <SEP> :3 <SEP> AS <SEP> 22- <SEP> 100 <SEP> C <SEP> :
3/7
<tb>
EMI30.2
EMI30.3
<tb> 270-276, <SEP> 284-290
<tb>
<tb> ORF2298 <SEP> putatives <SEP> Exo- <SEP> 13-36, <SEP> 40-49, <SEP> 111-118, <SEP> 134-140, <SEP> 159-164, <SEP> 173-183, <SEP> C <SEP> :101 <SEP> AS <SEP> 1-85 <SEP> C,g32:6/7
<tb>
<tb> toxin <SEP> 208-220, <SEP> 232-241, <SEP> 245-254, <SEP> 262-271, <SEP> 280-286, <SEP> 295- <SEP> AS <SEP> 54-121 <SEP> C,bhe2:26/30
<tb>
<tb> 301,303-310,319-324,332-339 <SEP> AS <SEP> 103-195 <SEP> C,n80:6/7
<tb>
<tb> ORF2351 <SEP> metC <SEP> 39-44, <SEP> 46-80, <SEP> 92-98, <SEP> 105-113, <SEP> 118-123, <SEP> 133-165, <SEP> 176- <SEP> A <SEP> :1 <SEP> AS <SEP> 386-402 <SEP> A:
<SEP> 17/29 <SEP>
<tb>
<tb> 208, <SEP> 226-238, <SEP> 240-255, <SEP> 279-285, <SEP> 298-330, <SEP> 338-345,
<tb>
<tb> 350-357, <SEP> 365-372, <SEP> 397-402, <SEP> 409-415, <SEP> 465-473, <SEP> 488-
<tb>
<tb> 515, <SEP> 517-535, <SEP> 542-550, <SEP> 554-590, <SEP> 593-601, <SEP> 603-620,
<tb>
<tb> 627-653, <SEP> 660-665, <SEP> 674-687, <SEP> 698-718, <SEP> 726-739
<tb>
<tb> ORF2451 <SEP> konserviertes <SEP> 5-32, <SEP> 34-49 <SEP> D:21 <SEP> AS <SEP> 1-43 <SEP> D:n.b.
<tb>
<tb> hypothetisches
<tb>
<tb> Protein
<tb>
<tb> ORF2469 <SEP> Lipase <SEP> (geh) <SEP> 12-35, <SEP> 93-99, <SEP> 166-179, <SEP> 217-227, <SEP> 239-248, <SEP> 269-276, <SEP> A:42, <SEP> B:45, <SEP> AS <SEP> 48-136 <SEP> C:2/6
<tb>
<tb> 288-294.296-320,322-327,334-339,344-356.362- <SEP> C <SEP> :3 <SEP> AS <SEP> 128-172 <SEP> A:,bmd12:11/30;
<tb>
EMI30.4
EMI30.5
<tb> 480-486, <SEP> 497-503, <SEP> 516-525, <SEP> 535-541, <SEP> 561-570, <SEP> 579- <SEP> A,n20:8/30
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 585, <SEP> 603-622, <SEP> 633-641 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ORF2470 <SEP> unbekannt <SEP> 10-27,37-56,64-99,106-119,121-136,139-145,148- <SEP> B:3 <SEP> AS <SEP> 183-200 <SEP> B:11/27
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 178, <SEP> 190-216, <SEP> 225-249, <SEP> 251-276, <SEP> 292-297, <SEP> 312-321,
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 332-399,403-458
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ORF2507 <SEP> Homologie <SEP> mit <SEP> 5-12, <SEP> 15-20, <SEP> 43-49,94-106, <SEP> 110-116, <SEP> 119-128, <SEP> 153- <SEP> A:1 <SEP> AS <SEP> 63-126 <SEP> A:
8/29 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ORF1 <SEP> 163, <SEP> 175-180, <SEP> 185-191, <SEP> 198-209, <SEP> 244-252, <SEP> 254-264, <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 266-273, <SEP> 280-288. <SEP> 290-297
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ORF2515 <SEP> hypothet. <SEP> Pro- <SEP> 5-44, <SEP> 47-55, <SEP> 62-68, <SEP> 70-78, <SEP> 93-100, <SEP> 128-151, <SEP> 166-171, <SEP> D:4 <SEP> AS <SEP> 1-59 <SEP> D:n.b.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
¯¯¯ <SEP> tein <SEP> 176-308
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ORF2577 <SEP> Coagulase <SEP> 4-18, <SEP> 25-31, <SEP> 35-40, <SEP> 53-69, <SEP> 89-102, <SEP> 147-154, <SEP> 159-165, <SEP> C:26 <SEP> AS <SEP> 438-516 <SEP> C,h16:3/5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 185-202, <SEP> 215-223, <SEP> 284-289, <SEP> 315-322,350-363, <SEP> 384- <SEP> AS <SEP> 505-570 <SEP> C,g24:1/7
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 392, <SEP> 447-453, <SEP> 473-479, <SEP> 517-523, <SEP> 544-550, <SEP> 572-577, <SEP> AS <SEP> 569-619 <SEP> C,182:2/7
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 598-604, <SEP> 617-623
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ORF2588 <SEP> Hexose- <SEP> 18-28, <SEP> 36-49, <SEP> 56-62, <SEP> 67-84, <SEP> 86-95, <SEP> 102-153, <SEP> 180-195, <SEP> D:16 <SEP> AS <SEP> 328-394 <SEP> D.n.b.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Transporter <SEP> 198-218, <SEP> 254-280, <SEP> 284-296, <SEP> 301-325, <SEP> 327-348, <SEP> 353-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 390, <SEP> 397-402, <SEP> 407-414, <SEP> 431-455 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ORF2593 <SEP> konserviertes <SEP> 7-37, <SEP> 56-71, <SEP> 74-150, <SEP> 155-162, <SEP> 183-203, <SEP> 21 <SEP> 1-222, <SEP> 224- <SEP> D:35 <SEP> AS <SEP> 77-128 <SEP> D:n.b.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> hypothetisches <SEP> 234, <SEP> 242-272 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Protein
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ORF2614 <SEP> unbekannt <SEP> 34-58, <SEP> 63-69, <SEP> 74-86, <SEP> 92-101, <SEP> 130-138, <SEP> 142-150, <SEP> 158- <SEP> C <SEP> :1 <SEP> AS <SEP> 5-48 <SEP> C <SEP> :
25/30
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 191, <SEP> 199-207, <SEP> 210-221 <SEP> , <SEP> 234-249, <SEP> 252-271
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ORF2683 <SEP> hypothet. <SEP> Pro- <SEP> 4-21, <SEP> 49-56, <SEP> 65-74, <SEP> 95-112, <SEP> 202-208, <SEP> 214-235 <SEP> C <SEP> :6 <SEP> AS <SEP> 99-171 <SEP> C:1/1
<tb>
EMI30.6
EMI30.7
<tb> ORF2711 <SEP> lgG-Bindungs- <SEP> 4-16, <SEP> 24-57, <SEP> 65-73, <SEP> 85-91, <SEP> 95-102, <SEP> 125-132, <SEP> 146-152, <SEP> A:53, <SEP> B:63, <SEP> AS <SEP> 1-48 <SEP> A,k68:21/30
<tb>
<tb> ProteinA <SEP> Protein <SEP> 156-163, <SEP> 184-190, <SEP> 204-210, <SEP> 214-221, <SEP> 242-252, <SEP> 262- <SEP> C <SEP> :36 <SEP> AS <SEP> 47-143 <SEP> A,k41:1/1
<tb>
<tb> 268, <SEP> 272-279, <SEP> 300-311, <SEP> 320-337, <SEP> 433-440, <SEP> 472-480, <SEP> AS <SEP> 219-285 <SEP> A,n38:19/30
<tb>
<tb> 505-523 <SEP> AS <SEP> 345-424 <SEP> A,111:
10/30;
<tb>
EMI30.8
<Desc/Clms Page number 31>
EMI31.1
<tb> S. <SEP> aureus- <SEP> putative <SEP> vorausgesagte <SEP> immunogene <SEP> Aminosäuren** <SEP> # <SEP> der <SEP> se- <SEP> Stelle <SEP> der <SEP> Serum-Reakti-
<tb>
<tb> Antigen- <SEP> Funktion <SEP> lektierten <SEP> identifizier- <SEP> vität <SEP> mit <SEP> rele-
<tb>
<tb> Protein <SEP> (durch <SEP> Klone <SEP> pro <SEP> ten <SEP> immu- <SEP> vanter <SEP> Region
<tb>
<tb> Homologie) <SEP> ORF <SEP> and <SEP> nogenen <SEP> (positiv/gesamt)
<tb>
<tb> Screen <SEP> Region
<tb>
<tb> ORF2963 <SEP> Rekombinati- <SEP> 5-20, <SEP> 37-44, <SEP> 52-59, <SEP> 87-94, <SEP> 116-132 <SEP> c <SEP> 3 <SEP> AS <SEP> 112-189 <SEP> C,m94 <SEP> 8/8 <SEP>
<tb>
EMI31.2
EMI31.3
<tb> ORF2967 <SEP> Rekombinati- <SEP> 7-19, <SEP> 46-57, <SEP> 85-91, <SEP> 110-117, <SEP> 125-133, <SEP> 140-149,
<SEP> 156- <SEP> C. <SEP> 18 <SEP> AS <SEP> 9-42 <SEP> C'1/1
<tb>
<tb>
<tb> ons-Protein <SEP> 163, <SEP> 198-204, <SEP> 236-251, <SEP> 269-275, <SEP> 283-290, <SEP> 318-323, <SEP> AS <SEP> 158-174 <SEP> C <SEP> 1/1 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 347-363
<tb>
<tb>
<tb> ORF3006 <SEP> hemN <SEP> -Homo- <SEP> 12-36, <SEP> 43-50, <SEP> 58-65, <SEP> 73-78, <SEP> 80-87, <SEP> 108-139, <SEP> 147-153, <SEP> B <SEP> AS <SEP> 167-181 <SEP> B <SEP> 20/30
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> log <SEP> 159-172, <SEP> 190-203, <SEP> 211-216, <SEP> 224-232, <SEP> 234-246, <SEP> 256-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 261, <SEP> 273-279, <SEP> 286-293, <SEP> 299-306, <SEP> 340-346, <SEP> 354-366
<tb>
Tabelle 3.
Serologische Proteom-Analyse von S. aureus-Oberflächen-Proteinen unter Verwendung von Human-Seren a) S. aureuslagr"Stre ss-Bedingungen"
EMI31.4
<tb> Spot <SEP> IC40 <SEP> IC35, <SEP> N26, <SEP> C4 <SEP> Kleinkinder- <SEP> N22 <SEP> 1:10.000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ID/Seren <SEP> 1:20.000 <SEP> je <SEP> 1:50.000 <SEP> Pool <SEP> IC40 <SEP> 1:50,000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> C2,5,6,10,12
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1 <SEP> :10.000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> PCK2 <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> PCK4 <SEP> + <SEP> +++ <SEP> +++
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> PCK5 <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> PCK6 <SEP> + <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Spot <SEP> IC35, <SEP> 40 <SEP> P-Pool <SEP> Kleinkinder-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ID/Seren <SEP> 1:
50.000 <SEP> (P6,18,25,28, <SEP> Pool
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> N221:10.000 <SEP> 29) <SEP> C2,5,6,10,12
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> je <SEP> 1 <SEP> :50.000 <SEP> 1 <SEP> :10.000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> PAC1 <SEP> ++ <SEP> ++
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> PAC2 <SEP> ++ <SEP> +++
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> PAC3 <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> PAC5 <SEP> ++
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Spot <SEP> P-Pool <SEP> Kleinkinder <SEP> 14 <SEP> IC <SEP> Pool/lgG <SEP> IC <SEP> Pool/lgA
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ID/Seren <SEP> (P6,18,25,28,29) <SEP> 1:10.000 <SEP> (N26,LC34,35) <SEP> je <SEP> (N26, <SEP> IC34,35) <SEP> je
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> je <SEP> 1:50.000 <SEP> 1:30.000 <SEP> 1:
30.000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> PAC11 <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> PAC12 <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> PAC13 <SEP> ++
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> PAC14 <SEP> + <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> PAC15 <SEP> +++
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> PAC16 <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> PAC17 <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> PAC18++
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> PAC19 <SEP> ++ <SEP> ++
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> PAC20 <SEP> ++
<tb>
<Desc/Clms Page number 32>
b) S. aureus/COL "Standard-Bedingungen"
EMI32.1
<tb> Spot <SEP> IC <SEP> Pool <SEP> IC35 <SEP> P18 <SEP> P25 <SEP> P1 <SEP> P29 <SEP> Klein-
<tb>
<tb> ID/Seren <SEP> (N26, <SEP> IC34,35) <SEP> 1:20.000 <SEP> 1:10.000 <SEP> 1:10.000 <SEP> 1:5.000 <SEP> 1:
2.500 <SEP> kinder <SEP> 18 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> je <SEP> 1 <SEP> :30.000
<tb>
<tb>
<tb> 1:10.000POV2 <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++
<tb>
<tb>
<tb> POV3.1 <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++
<tb>
<tb>
<tb> POV3.2 <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> POV4 <SEP> + <SEP> +++
<tb>
<tb>
<tb> POV7 <SEP> - <SEP> - <SEP> +++ <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb> POV10 <SEP> - <SEP> ++ <SEP> (+) <SEP> (+) <SEP> - <SEP> (+) <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb> POV12 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> +++
<tb>
<tb>
<tb> POV13 <SEP> ++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> ++
<tb>
<tb>
<tb> POV14 <SEP> ++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++
<tb>
<tb>
<tb> POV15 <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> (+) <SEP> - <SEP> -
<tb>
c) S.
aureus/COL "Stress-Bedingungen"
EMI32.2
<tb> Spot <SEP> P-Pool <SEP> IC34+IC35 <SEP> P18 <SEP> 1 <SEP> :10.000 <SEP> P29 <SEP> 1:10.000 <SEP> Klein-kinder
<tb>
<tb> ID/Seren <SEP> (P6,18,25,28,29) <SEP> je <SEP> 1:20.000 <SEP> 14 <SEP> 1:10.000 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> je <SEP> 1:50.000
<tb>
<tb>
<tb> POV16 <SEP> - <SEP> +++
<tb>
<tb>
<tb> POV17 <SEP> - <SEP> +++ <SEP> (+) <SEP> - <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb> POV18 <SEP> + <SEP> - <SEP> ++ <SEP> - <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb> POV19 <SEP> (+) <SEP> - <SEP> +++ <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> POV21 <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb> POV23 <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb> POV24 <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb> POV25 <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb>
Tabelle 4.
S. aureus-Antigene, die durch MALDI-TOP-MS-Sequenzierung identifiziert worden waren (ORFs in Fettdruck wurden auch durch Bakterien-Oberflächen-Display identi- fiziert)
Vorhersage von Antigen-Regionen in selektierten Antigenen durch serologische Prote- om-Analyse unter Verwendung von Human-Seren identifiziert
EMI32.3
<tb> Spot <SEP> ID <SEP> S. <SEP> aureus- <SEP> Putative <SEP> Funktion <SEP> (durch <SEP> Homologie) <SEP> Putative
<tb> Protein <SEP> Lokalisierung
<tb> (ORF <SEP> Nr.
<tb>
Abkürzung) <SEP> ¯¯¯¯¯¯¯¯
<tb> PCK2 <SEP> ORF01613 <SEP> Glycinamid-Ribosyl-Synthase <SEP> zytoplasmat.
<tb>
PCK5 <SEP> ORF02260 <SEP> uitU <SEP> konserviertes <SEP> hypoth. <SEP> Protein <SEP> (yitU) <SEP> zytoplasmat.
<tb>
<tb>
PCK6 <SEP> ORF00462 <SEP> mqo <SEP> Membran-assoziierte <SEP> Malat-chinon-Oxidase <SEP> penphere
<tb> Membran
<tb> POV2 <SEP> ORF01443 <SEP> Protein-Phosphatase <SEP> trägt <SEP> zu <SEP> Methicilin- <SEP> trans-membran
<tb> aux1 <SEP> Resistenz <SEP> bei
<tb>
<Desc/Clms Page number 33>
EMI33.1
<tb> Spot <SEP> ID <SEP> S. <SEP> aureus- <SEP> Putative <SEP> Funktion <SEP> (durch <SEP> Homologie) <SEP> Putative
<tb>
<tb> Protein <SEP> Lokalisierung
<tb>
<tb> (ORF <SEP> Nr. <SEP> /
<tb>
<tb> Abkürzung) <SEP> ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ <SEP> ¯¯¯¯¯¯¯¯¯
<tb>
<tb>
<tb> POV4, <SEP> 17 <SEP> ORF01863 <SEP> EF- <SEP> C-terminaler <SEP> Teil <SEP> von <SEP> 44 <SEP> kDa <SEP> Protein <SEP> zytoplasmat.
<SEP> /
<tb>
<tb> PAC14,19 <SEP> Tu <SEP> ähnlich <SEP> dem <SEP> Elongations-Faktor <SEP> Tu <SEP> sezerniert
<tb>
<tb>
<tb> POV5 <SEP> 1) <SEP> ORF01435+1 <SEP> 3-Ketoacyl-Acyl <SEP> Träger-Protein-Re-duktase <SEP> zytoplasmat.
<tb>
<tb>
434 <SEP> Fusion <SEP> (fabG)
<tb>
<tb>
<tb> POV7 <SEP> ORF02088 <SEP> Protein-Transport <SEP> über <SEP> die <SEP> Membran <SEP> SecA <SEP> zytoplasmat.
<tb>
<tb>
SecA <SEP> ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ <SEP> ¯¯¯¯¯¯¯¯¯
<tb>
<tb>
<tb> POV10 <SEP> ORF02932 <SEP> yrzC <SEP> hypothetische <SEP> BACSU <SEP> 11. <SEP> 9 <SEP> kd <SEP> Protein <SEP> (upf <SEP> zytoplasmat.
<tb>
<tb>
0074 <SEP> (rff <SEP> 2)-Familie)
<tb>
<tb>
<tb> POV12 <SEP> ORF01588 <SEP> Dihydrolipoamid-AcetylTransferase <SEP> (pdhB) <SEP> zytoplasmat.
<tb>
EMI33.2
EMI33.3
<tb> POV14 <SEP> ORF01857 <SEP> DNA-gelenkte <SEP> RNA-Polymerase-# <SEP> zytoplasmat.
<tb> rpoB
<tb>
<tb> POV15 <SEP> ORF01862 <SEP> EF- <SEP> 85 <SEP> kD <SEP> Vitronectin-Bindungs-Protein <SEP> zytoplasmat.
<tb>
EMI33.4
EMI33.5
<tb> POV18 <SEP> nicht <SEP> gefunden <SEP> allgemeines <SEP> Stress-Protein <SEP> YLY1 <SEP> zytoplasmat.
<tb>
YLY1 <SEP> ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ <SEP> ¯¯¯¯¯¯¯¯¯
<tb> POV30 <SEP> 1) <SEP> ORF01854RL <SEP> 7 <SEP> Ribosomen-Protein <SEP> L7 <SEP> zytoplasmat.
<tb>
<tb>
POV21 <SEP> ORF01890 <SEP> wahrscheinl. <SEP> Hexulose-6-Phosphate- <SEP> zytoplasmat.
<tb> yckG <SEP> Synthase <SEP> (yckG) <SEP> ¯¯¯¯¯¯¯¯¯
<tb> POV24 <SEP> ORF02192 <SEP> yurX <SEP> konserviertes <SEP> hypothetisches <SEP> Protein <SEP> (yurX) <SEP> zytoplasmat.
<tb>
<tb>
POV25 <SEP> ORF00326 <SEP> gidA <SEP> Glucose-inhibiertes <SEP> Teilungs-Protein <SEP> a <SEP> zytoplasmat.
<tb>
(gidA)
<tb> PAC1 <SEP> ORF0054 <SEP> Protein-Export-Protein <SEP> prsa <SEP> Vorläufer <SEP> (prsA) <SEP> periplasmat.
<tb> prsA
<tb> PAC2 <SEP> ORF00853 <SEP> periplasmat. <SEP> Molybdat-Bindungs-Pro-tein <SEP> Oberfläche
<tb> ¯¯¯¯¯¯ <SEP> ModA <SEP> (ModA)
<tb> PAC3 <SEP> ORF00725 <SEP> Schwermetall-abhängiger <SEP> Transkriptions- <SEP> zytoplasmat.
<tb>
Aktivator, <SEP> putativer <SEP> Regulator <SEP> von <SEP> MehrfachArzneimittel-Resistenz-Efflux-Pumpe <SEP> pmrA
<tb>
<tb> PAC5 <SEP> ORF0541 <SEP> ydaP <SEP> Pyruvat-Oxidase <SEP> (ydaP) <SEP> zytoplasmat.
<tb>
<tb>
PAC11 <SEP> ORF00190 <SEP> LPXTGV, <SEP> extrazelluläre <SEP> Matrix-Bdg. <SEP> Oberfläche
<tb> PAC12 <SEP> ORF02925 <SEP> alaS <SEP> Alanyl-tRNA <SEP> Synthetase <SEP> zytoplasmat.
<tb>
<tb>
PAC13 <SEP> ORF02759 <SEP> RNA-Prozessierungs-Enzym/ATP-Bdg. <SEP> zytoplasmat.
<tb> ymfA <SEP> ¯¯¯¯¯¯¯¯¯
<tb> PAC15 <SEP> ORF01232 <SEP> Lipoamid-Acyltransferase-Komponente <SEP> von <SEP> zytoplasmat.
<tb> bfmBB <SEP> verzweigt-kettigem <SEP> alpha-keto-SäureDehydrogenase-Komplex
<tb>
<Desc/Clms Page number 34>
EMI34.1
<tb> Spot <SEP> ID <SEP> S. <SEP> aureus- <SEP> Putative <SEP> Funktion <SEP> (durch <SEP> Homologie) <SEP> Putative
<tb>
<tb>
<tb> Protein <SEP> Lokalisierung
<tb>
<tb>
<tb> (ORF <SEP> Nr. <SEP> /
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Abkürzung) <SEP> ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> PAC16 <SEP> ORF02115 <SEP> Glyceraldehyde-3-phosphat- <SEP> Dehydro- <SEP> zytoplasmat.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
GAPDH <SEP> genase
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> PAC17 <SEP> nicht <SEP> gefunden <SEP> 5'-Methylthioadenosin-Nukleosidase <SEP> S- <SEP> zytoplasmat.
<tb>
<tb>
<tb>
Contig83 <SEP> Adenosylhomo-cystein-Nukleosidase
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> PAC20 <SEP> ORF02545 <SEP> 75% <SEP> Identität <SEP> mit <SEP> ORF02541 <SEP> unbekannt <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ähnlich <SEP> den <SEP> hypothetischen <SEP> Proteinen
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Spot <SEP> S. <SEP> aureus <SEP> Putative <SEP> Lo- <SEP> Putative <SEP> Antigen-Oberfächen-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ID <SEP> ORF <SEP> Nr.
<SEP> / <SEP> kalisierung <SEP> Regionen
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Abkürzung <SEP> (Antigen-Packung)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> PCK6 <SEP> ORF00462 <SEP> periphere <SEP> 61-75,82-87,97-104,113-123,128-133,
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> mqo <SEP> Membran <SEP> 203-216,224-229,236-246,251-258,271-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 286,288-294, <SEP> 301-310,316-329, <SEP> 337-346,
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 348-371, <SEP> 394-406,418-435, <SEP> 440-452
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> POV2 <SEP> ORF01443 <SEP> trans-Membran <SEP> 30-37,44-55,83-91,101-118,121-128,
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> aux1 <SEP> 136-149,175-183, <SEP> 185-193,206-212, <SEP> 222-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 229, <SEP> 235-242
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> POV4 <SEP> ORF01863 <SEP> zytoplasmat./ <SEP> 28-38,76-91,102-109,118-141,146-153,
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> EF-Tu <SEP> sezerniert <SEP> 155-161,165-179, <SEP> 186-202, <SEP> 215-221,
<SEP> 234- <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 249,262-269, <SEP> 276-282,289-302, <SEP> 306-314,
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 321-326, <SEP> 338-345,360-369, <SEP> 385-391
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> PAC2 <SEP> ORF00853 <SEP> periplasma- <SEP> 29-44, <SEP> 74-83, <SEP> 105-113, <SEP> 119-125, <SEP> 130-148, <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ModA <SEP> tisch <SEP> 155-175,182-190, <SEP> 198-211,238-245
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> PAC1 <SEP> ORF0054 <SEP> periplasma- <SEP> 5-24,38-44,100-106,118-130,144-154,
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> prsA <SEP> tisch <SEP> 204-210,218-223,228-243,257-264,266-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 286, <SEP> 292-299
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> PAC20 <SEP> ORF02545 <SEP> unbekannt <SEP> 7-14,21-30, <SEP> 34-50,52-63, <SEP> 65-72,77-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 84,109-124, <SEP> 129-152,158-163, <SEP> 175-190,
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 193-216,
219-234
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Spot <SEP> ID <SEP> Gl <SEP> Nr. <SEP> S. <SEP> aureus- <SEP> Putative <SEP> Funktion <SEP> (durch <SEP> Homologie)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> oder <SEP> TIGR <SEP> Protein
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Nr. <SEP> (ORF <SEP> Nr. <SEP> /
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Abkürzung)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> PCK2 <SEP> TIGR1280 <SEP> ORF01613 <SEP> Glycinamid-Ribosyl-Synthase
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> PCK4 <SEP> 7672993 <SEP> ORF00503 <SEP> ggf. <SEP> Adhäsion/Aggregation
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> IsaA
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> PCK5 <SEP> TIGR6209 <SEP> ORF02260 <SEP> konserviertes <SEP> hypoth.
<SEP> Protein <SEP> (yitU)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> yitU
<tb>
<tb>
<tb> PCK6 <SEP> TIGR6182 <SEP> ORF00462 <SEP> Membrane-assoziierte <SEP> Malate-chinone-Oxidase
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> POV2 <SEP> 6434044 <SEP> ORF01443 <SEP> Protein-Phosphatase <SEP> trägt <SEP> zu <SEP> Methicilin-Resistenz
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> aux1 <SEP> bei
<tb>
<Desc/Clms Page number 35>
EMI35.1
<tb> Spot <SEP> ID <SEP> Gl <SEP> Nr. <SEP> S. <SEP> aureus- <SEP> Putative <SEP> Funktion <SEP> (durch <SEP> Homologie)
<tb>
<tb>
<tb> oder <SEP> TIGR <SEP> Protein
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Nr. <SEP> (ORF <SEP> Nr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Abkürzung)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> POV3.1 <SEP> 7672993 <SEP> ORF00503 <SEP> ggf. <SEP> Adhäsion/Aggregation
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> IsaA
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> POV3.2 <SEP> 7672993 <SEP> ORF00503 <SEP> ggf. <SEP> Adhäsion/Aggregation
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> IsaA
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> POV4 <SEP> TIGR8079 <SEP> ORF01863 <SEP> C-terminaler <SEP> Teil <SEP> von <SEP> 44 <SEP> kDa <SEP> Protein <SEP> ähnlich <SEP> dem
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> EF-Tu <SEP> Elongations-Faktor <SEP> Tu
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> POV51) <SEP> 1) <SEP> TIGR8091 <SEP> ORF01434 & 014 <SEP> 3-Ketoacyl-Acyl-Trägerprotein-Reductase <SEP> (fabG)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 35
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> POV7 <SEP> 2500720 <SEP> ORF02088 <SEP> Protein-Transport <SEP> über <SEP> die <SEP> Membran <SEP> SecA
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> SecA
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> POV10 <SEP> TIGR8097 <SEP> ORF02932 <SEP> hypothetische <SEP> BACSU <SEP> 11. <SEP> 9 <SEP> kd <SEP> Protein
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> YIZC <SEP> (upf0074 <SEP> (rff2)-Familie) <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> POV12 <SEP> 2499415 <SEP> ORF01588 <SEP> Dihydrolipoamid-Acetyltransferase <SEP> (pdhB)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> pdhB
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> POV13 <SEP> 7470965 <SEP> ORF01880 <SEP> Fibrinogen-Bdg. <SEP> (LPXTG)-Protein-Homolog
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> SdrD <SEP> (SdrD)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> POV14 <SEP> 1350849 <SEP> ORF01857 <SEP> DNA-gelenkte <SEP> RNA-Polymerase <SEP> #
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> rpoB
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> POV15 <SEP> 6920067 <SEP> ORF01862 <SEP> 85 <SEP> kD <SEP> Vitronectin-Bindungs-Protein
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> EF-G
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> POV17 <SEP> TIGR8079 <SEP> ORF01863 <SEP> C-terminaler <SEP> Teil <SEP> vom <SEP> 44 <SEP> kDa <SEP> Protein <SEP> ähnlich <SEP> dem
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Elonqations-Faktor <SEP> Tu
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> POV18 <SEP> 3025223 <SEP> nicht <SEP> gefunden <SEP> allgemeines <SEP> Stress-Protein <SEP> YLY1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> POV301) <SEP> 350771 <SEP> ORF01854RL7 <SEP> Ribosomen-Protein <SEP> L7
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> POV21 <SEP> ORF01890 <SEP> wahrscheinl. <SEP> Hexulose-6-phosphat-Synthase
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (vckG)
<tb>
<tb>
<tb> POV23 <SEP> ORF01953 <SEP> Lipoprotein <SEP> (S.epidermis)
<tb>
1) identifiziert aus einem Gesamt-Lysat von S.
aureus 8325-4 spa-, unter Standardbedingungen gezüchtet. Serumreaktivität mit 1/1 Patienten- and 2/4 Normal-Seren, jedoch nicht mit Kleinkinder- Serum (C5) .
LITERATURSTELLEN
Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. und Struhl, K.
Hrsgb.(1994). Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons, Inc.
Baba T, Takeuchi F, Kuroda M, Yuzawa H, Aoki K, Oguchi A, Nagai Y, Iwama N, Asano K, Naimi T, Kuroda H, Cui L, Yamamoto K, Hiramatsu K.. Genome and virulence determinants of high virulence community-acquired MRSA. Lancet (2002), 359 (9320): 1819-1827.
Betley, M. J., Lofdahl, S., Kreiswirth, B.N., Bergdoll, M. S. und Novick, R.P. (1984). Staphylococ- cal enterotoxin A gene is associated with a variable genetic element. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S.A.
81 :5179-5183.
Bruggemann M, Neuberger MS (1996) Immunol. Today 17:391-397
Burnie, J. P., Matthews, R.C., Carter, T., Beaulieu, E., Donohoe, M., Chapman, C., Williamson,
<Desc/Clms Page number 36>
P. und Hodgetts, S. J. (2000). Identification of an immunodominant ABC transporter in methicil- lin-resistant Staphylococcus aureus infections. Infect. Immun. 68 :3200-3209.
Chen, H.Z. und Zubay, G. (1983). Methods Enzymol. 101:674-690.
Coloque-Navarro, P., Söderquist, B., Holmberg, H., Blomqvist, L., Olcen, P., und Möllby, R.
(1998) Antibody response in Staphylococcus aureus septicaemia - a prospective study. J. Med.
Microbiol. 47,217-25.
Crossley, K. B. und Archer G. L., Hrsgb. (1997). The Staphylococci in Human Disease. Churchill Livingston Inc.
Etz, H., Minh, D.B., Henics, T., Dryla, A., Winkler, B., Triska, C., Boyd, A.P., Söllner, J., Schmidt, W., von Ahsen, U., Buschle, M., Gill, S.R., Kolonay, J., Khalak, H., Fraser, C.M., von Gabain, A., Nagy E., und Meinke, A. (2002). Identification of in vivo expressed vaccine candidate antigens from Staphylococcus aureus. PNAS 99 : 6573-6578.Flock, J-l. (1999). Extracellular-matrix-binding proteins as targets for the prevention of Staphy- lococcus aureus infections. Molecular Medicine Today 5:532-537.
Forrer, P., Jung, S. und Plückthun, A. (1999). Beyond binding: using phage display tu select for structure, folding and enzymatic activity in proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 9 :514-520.
Foster, T. J. und Hook, M. (1998). Surface protein adhesins of Staphylococcus aureus. Trends Microbiol. 6:484-488.
Frenay, H. M. E., Theelen, J. P. G., Schouls, L. M., Vandenbroucke-Grauls, C. M. J. E., Ver- noef, J., van Leeuwen, W. J., und Mooi, F. R. (1994). Discrimination of epidemic and non-epidemic methicillin-resistant Staphylococcus aureus on the basis of protein A gene polymorphism. J. Clin.
M icrobiol. 32 :846-847.
Georgiou, G., Stathopoulos, C., Daugherty, P. S., Nayak, A.R., Iverson, B.L. und Curtiss lll, R.
(1997). Display of heterologous proteins on the surface of microorganisms: From the screening of combinatorial libraries to live recombinant vaccines. Nature Biotechnology 15 :29-34.
Goh, S. -H., Byrne, S. K., Zhang, J. L., und Chow, A. W. (1992). Molecular typing of Staphylo- coccus aureus on the basis of coagulase gene polymorphisms. J. Clin. Microbiol. 30 :1642-1645.
Graziano et al. (1995) J. Immunol. 155 :4996-5002
Hanes, J. und Plückthun, A. (1997). In vitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display. PNAS 94:4937-4942.
Hashemzadeh-Bonehi, L., Mehraein-Ghomi, F., Mitsopoulos, C., Jacob, J. P., Hennessey, E.S. und Broome-Smith, J. K. (1998). Importance of using lac rather than ara promoter vectors for modu- lating the levels of toxic gene products in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 30 :676-678.
Hryniewicz, W. (1999). Epidemiology of MRSA. Infection 27:S13-16.
Immler, D., Grenim, D., Kirsch, D., Spengler, B., Presek, P., Meyer, H. E. (1998). Electrophore- sis 19:1015-1023.
Kajava, A.V., Zolov, S. N., Kalinin, A. E. und Nesmeyanova, M.A. (2000). The net charge of the first 18 residues of the mature sequence affects protein translocation across the cytoplasmic mem- brane of Gram-negative bacteria. J. Bacteriol. 182 :2163-2169.
<Desc/Clms Page number 37>
Kluytmans, J., van Belkum, A. und Verbrugh, H. (1997). Nasal carriage of Staphylococcus aureus : epidemiology, underlying mechanisms, and associated risks. Clin. Microbiol. Rev. 10:505- 520.
Kolaskar, A.S. und Tongaonkar, P. C. (1990). A semi-empirical method for prediction of anti- genic determinants on protein antigens. FEBS Lett. 276 :172-174.
Lim, Y., Shin, S. H., Jang, I.Y., Rhee, J. H. und Kim, I.S. (1998). Human transferring-binding pro- tein of Staphylococcus aureus is immunogenic in vivo and has an epitope in common with human transferring receptor. FEMS Microbiol. Letters 166 :225-230.
Lorenz, U., Ohlsen, K., Karch, H., Hecker, M., Thiede, A. und Hacker, J. (2000). Human anti- body response during sepsis against targets expressed by methicillin resistant Staphylococcus aureus. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 29 :145-153.
Mamo, W., Jonsson, P. und Muller, H. P. (1995). Opsonization of Staphylococcus aureus with a fibronectin-binding protein antiserum induces protection in mice. Microb. Pathog. 19:49-55
McGuiness BT et al. (1996) Nature Biotech. 14 :1149
Modun, B., Evans, R. W., Joannou, C. L. und Williams, P. (1998). Receptor-mediated recogni- tion and uptake of iron from human transferring by Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Infect. Immun. 66 :3591-3596.
Nilsson, 1, Patti, J.M., Bremell, T., Höök, M. und Tarkowski, A. (1998). Vaccination with a Re- combinant Fragment of Collagen Adhesin provides Protection against Staphylococcus aureus- mediated Septic Death. J. Clin. Invest. 101:2640-2649.
Parker, K. C., M. A. Bednarek, und J. E. Coligan (1994) Scheme for ranking potential HLA-A2 binding peptides based on independent binding of hdividual peptide side-chains. J. Immunol.
152 :163.
Pasquali, C., Fialka, I. & Huber, L.A. (1997). Electrophoresis 18 :2573-2581.
Phillips-Quagliata, J. M., Patel, S., Han, J.K., Arakelov, S., Rao, T.D., Shulman, M. J., Fazel, S., Corley, R. B., Everett, M., Klein, M. H., Underdown, B. J. und Corthesy, B. (2000). The IgA/lgM receptor expressed on a murine B cell lymphoma is poly-Ig receptor. J. Immunol. 165 :2544-2555
Rammensee, Hans-Georg, Jutta Bachmann, Niels Nikolaus Emmerich, Oskar Alexander Bachor, Stefan Stevanovic (1999) SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs.
Immunogenetics 50 :213-219
Recsei P., Kreiswirth, B., O'Reilly, M., Schlievert, P., Gruss, A. und Novick, R. P. (1986). Regu- lation of exoprotein gene expression in Staphylococcus aureus by agr. Mol. Gen. Genet. 202:58- 61.
Rodi, D.J. und Makowski, L. (1999). Phage-display technology-- finding a needle in a vast molecular haystack. Curr. Opin. Biotechnol. 10:87-93.
Schaffitzel et al., Ribosome display: an in vitro method for selection and evolution of antibodies from libraries; Journal of Immunological Methods 231,119-135 (1999)
Sanchez-Campillo, M., Bini, L., Comanducci, M., Raggiaschi, R., Marzocchi, B., Pallini, V. und Ratti, G. (1999). Electrophoresis 20:2269-2279.
<Desc/Clms Page number 38>
Schmittel A, Keilholz U, Thiel E, Scheibenbogen C. (2000) Quantification of tumor-specific T lymphocytes with the ELISPOT assay. J Immunother 23 (3):289-95
Sester M, Sester U, Kohler H, Schneider T, Deml L, Wagner R, Mueller-Lantzsch N, Pees HW, Meyerhans A. (2000) Rapid whole blood analysis of virus-specific CD4 and CD8 T cell responses in persistent HIV infection. AIDS 14 (17):2653-60
Shafer, W. M. und landolo, J. J. (1979). Genetics of staphylococcal enterotoxin B in methicillin- resistant isolates of Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 25 :902-911.
Shibuya, A., Sakamoto, N., Shimizu, Y., Shibuya, K., Osawa, M., Hiroyama, T., Eyre, H.J., Sutherland, G. R., Endo, Y., Fujita, T., Miyabayashi, T., Sakano, S., Tsuji, T., Nakayama, E., Phil- lips, J. H., Lanier, L. L. und Nakauchi, H. (2000). Fca/g receptor mediates endocytosis of IgM-coated microbes. Nature Immunology 1:441-446.)
Skerra, A. (1994). Use of the tetracycline promoter for the tightly regulated production of a mur- ine antibody fragment in Escherichia coli. Gene 151:131-135.
Sohail, M. (1998). A simple and rapid method for preparing genomic DNA from Gram-positive bacteria. Mol. Biotech. 10:191-193.
Sonderstrup G, Cope AP, Patel S, Congia M, Hain N, Hall FC, Parry SL, Fugger LH, Michie S, McDevitt HO (1999) HLA class ll transgenic mice: models of the human CD4+ Tcell immune response. Immunol Rev 172:335-43
Sturniolo, T. et al., E Bono, J Ding, L Raddrizzani, O. Tuereci, U Sahin, M Braxenthaler, F Gal- lazzi, MP Protti, F Sinigaglia, und J Hammer (1999) Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA chips and virtual HLA class ll matrices. Nature Biotechnology 17:555-562.
VandenBergh M. F. Q., Yzerman E. P. F., van Belkum, A., Boelens, H. A. M., Sijmons, M., und Verbrugh, H. A. (1999). Follow-up of Staphylococcus aureus nasal carriage after 8 years : the persistent carrier state. J. Clin. Microbiol. 37 :3133-3140.
Wessel, D. und Fluegge, U.l. (1984). Anal. Biochem. 138 :141-143.
**WARNUNG** Ende DESC Feld kannt Anfang CLMS uberlappen**.