CN101128215B

CN101128215B - 用于进行抗葡萄球菌接种的免疫原性组合物

Info

Publication number: CN101128215B
Application number: CN2005800396900A
Authority: CN
Inventors: C·卡斯塔多; N·P·F·勒克雷尼耶; C·A·尼特; J·普尔曼
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2004-09-22
Filing date: 2005-09-20
Publication date: 2012-10-10
Anticipated expiration: 2025-09-20
Also published as: KR20070054732A; HK1155658A1; IL223141A0; ZA200702224B; US20080095777A1; EP2305296A1; EP2298340B1; EP2181714A3; KR20120128724A; ES2540771T3; US20080085289A1; BRPI0515516B1; EP2305295B1; WO2006032500A3; KR101359930B1; CA2580103A1; US20150328302A1; CN102657855A; EP1791559A2; ES2540770T3

Abstract

本发明涉及包含葡萄球菌抗原的混合物的免疫原性组合物，该混合物组合了具有不同功能的抗原，例如，包括葡萄球菌胞外成分结合蛋白和葡萄球菌转运蛋白或葡萄球菌胞外成分结合蛋白和葡萄球菌毒力调节剂或毒素或葡萄球菌转运蛋白和葡萄球菌毒力调节剂或毒素的组合。也描述了疫苗、治疗方法、用途和制备葡萄球菌疫苗的方法。

Description

用于进行抗葡萄球菌接种的免疫原性组合物

技术领域

本发明涉及葡萄球菌免疫原性组合物和疫苗，它们的制备以及这些组合物在医学中的用途。更特别地，它涉及疫苗组合物，包含用于治疗或预防葡萄球菌感染的抗原的组合。也提供了所述疫苗在医学中的使用和它们的制备方法。

背景

近年来，随着血管内设备的使用增加，在社区获得的和在医院获得的感染数量都已经增加了。在医院获得的(医源性)感染是发病和死亡的主要原因，更特别是在美国，它每年影响了超过200万患者。根据各种研究，美国患者的大约6％在他们呆在医院期间将获得感染。估计1992年在美国的经济负担超过45亿美元(Emori和Gaynes，1993，Clin.Microbiol.Rev.6；428)。大多数频发感染是尿道感染(UTI-感染的33％)，接下来是肺炎(15.5％)，外科手术部位感染(14.8％)以及原发血流感染(13％)(Emori和Gaynes，1993，Clin.Microbiol.Rev.6；428)。

金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性的葡萄球菌(大多数是表皮葡萄球菌)、肠球菌种、大肠杆菌以及绿脓杆菌是主要的医源性病原体。尽管那些病原体差不多引起同样数量的感染，但是它们可引起的失调的严重性再加上抗生素抗性的分离菌的频率，对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的这个排位进行平衡，它们成为了最重要的医源性病原体。

金黄色葡萄球菌是有着显著发病率和死亡率的医源性感染的最通常原因(Romero-Vivas et al1995，Infect.Dis.21；1417)。它是骨髓炎、心内膜炎、脓毒性关节炎、肺炎、脓肿以及中毒性休克综合征的一些病例的原因。

表皮葡萄球菌是正常的皮肤共生生物，也是引起植入的医疗设备的感染以及在外科手术部位的感染的重要机会致病菌。被金黄色葡萄球菌感染的医疗设备包括心脏起搏器、脑脊液分流器、连续流动的腹膜透析导管、整形外科设备以及人工心脏瓣膜。

用抗生素治疗金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌感染，青霉素是首选药物，而万古霉素用于甲氧苯青霉素抗性的分离菌。自1980年代以来，对抗生素呈现广谱抗性的葡萄球菌菌株的百分比已经变得日益普遍(Panlilo et al1992，Infect.Control.Hosp.Epidemiol.13；582)，造成了对有效的抗菌治疗的威胁。此外，近来出现的万古霉素抗性的金黄色葡萄球菌已经引起了恐惧，害怕甲氧苯青霉素抗性的金黄色葡萄球菌菌株将会产生并扩散，对此还没有可用的有效治疗。

已经研究了在被动免疫疗法中使用抗葡萄球菌抗原的抗体这一备选方法。包括给予多克隆抗血清的疗法正在研发之中(WO00/15238，WO00/12132)，以及用抗脂磷壁酸的单克隆抗体进行治疗(WO98/57994)。

备选方法将是使用主动疫苗接种来产生对葡萄球菌的免疫应答。已经确定了用作疫苗组分而包含的几种候选物。这些候选物包括纤连蛋白结合蛋白(US5840846)、MHC II类似物(US5648240)、纤维蛋白原结合蛋白(US6008341)、GehD(US2002/0169288)、胶原蛋白结合蛋白(US6288214)、SdrF、SdrG和SdrH(WO00/12689)、突变体SEA和SEB外毒素(WO00/02523)以及52kDa玻连蛋白结合蛋白(WO01/60852)。

金黄色葡萄球菌基因组已经被测序，并已经确定了许多编码序列(EP786519，WO02/094868)。对于表皮葡萄球菌同样如此(WO01/34809)。作为该方法的改进，其他人已经确定了被来自患有葡萄球菌感染的患者的超免疫血清所识别的蛋白质(WO01/98499，WO02/059148)。

靶向金黄色葡萄球菌或靶向它所产生的外蛋白的疫苗的首次产生已经获得了有限成功(Lee1996Trends Microbiol.4；162)。仍然存在研发针对葡萄球菌感染的有效疫苗的需求。

因此，本发明提供了包含至少两种不同的蛋白或其免疫原性片段的免疫原性组合物，所述蛋白或其免疫原性片段选自以下至少两组蛋白或免疫原性片段：

组a)至少一种葡萄球菌胞外成分结合蛋白或其免疫原性片段，其选自层粘连蛋白受体、SitC/MntC/唾液结合蛋白、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、 SdrG、SdrH、酯酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig和MAP；

组b)至少一种葡萄球菌转运蛋白或其免疫原性片段，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC和Ni ABC转运蛋白；

组c)至少一种葡萄球菌毒力调节剂、毒素或其免疫原性片段，其选自α毒素(Hla)、α毒素H35R突变体、RNA III活化蛋白(RAP)。

附图说明

图1-优选蛋白质的多肽序列。表1提供了有关每个SEQ ID代表哪个蛋白质的信息。

图2-编码优选蛋白质的核苷酸序列。表1提供了有关每个SEQ ID编码哪个蛋白质的信息。

图3-天然条件下α毒素的纯化。图A显示了α毒素纯化期间所制备样品的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE。第1道-分子量标志，第2道-含有过量表达α毒素的可溶性级分，第3道-从Ni-NTA柱流过，第4道-用10％缓冲液B洗脱的级分，第5道-用20％缓冲液B洗脱的级分，第6道-用30％缓冲液B洗脱的级分，第7道-用50％缓冲液B洗脱的级分，第8道-用75％缓冲液B洗脱的级分，第9道和第10道-用100％缓冲液B洗脱的级分，第11道-诱导前在T＝0时的细菌，第12道-诱导后在T＝4时的细菌，第13道-细胞溶胞产物，第14道-可溶性级分，第15道-不溶性级分。

图B显示了10、5、2和1μl纯化α毒素的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE。

图4-变性条件下的SdrC的纯化。图A显示了α毒素纯化期间所制备样品的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE。泳道M-分子量标志，泳道Start-由含有过量表达SdrC的不溶性级分所形成的上清液，泳道FT1-从Ni-NTA柱流过，泳道C-用漂洗缓冲液C洗脱的级分，泳道D-用缓冲液D洗脱的级分，道E-用缓冲液E洗脱的级分。

图B显示了1、2、5和10μl纯化SdrC的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE。

图5-在包被了纯化蛋白质的平板中抗葡萄球菌蛋白质抗血清的ELISA结果。

合并小鼠pre-使用提取自接种前小鼠的合并的血清的结果。合并小鼠Post III-使用免疫后提取的合并的小鼠血清的结果。合并兔pre-使用提取自接种前兔的合并的血清的结果。合并兔Post III-使用免疫后提取的合并的兔血清的结果。Blc-阴性对照。

图6-在包被了杀死的葡萄球菌的平板上产生的抗葡萄球菌蛋白质的小鼠抗血清的ELISA结果。

图A使用由金黄色葡萄球菌血清型5杀死的完整细胞所包被的平板。图B使用由金黄色葡萄球菌血清型8杀死的完整细胞所包被的平板。图C使用由表皮葡萄球菌杀死的完整细胞所包被的平板。

用方块符号标记的线显示使用来自小鼠的抗血清的ELISA结果，该小鼠用所标明的葡萄球菌蛋白质免疫三次。用菱形符号标记的线显示免疫前小鼠血清的ELISA结果。

图7-在包被了杀死的葡萄球菌的平板上产生的抗葡萄球菌蛋白质的兔抗血清的ELISA结果。

用方块符号标记的线显示使用来自兔的抗血清的ELISA结果，该小鼠用所标明的葡萄球菌蛋白质免疫三次。用菱形符号标记的线显示免疫前兔血清的ELISA结果。

详细描述

本发明公开了葡萄球菌抗原的特定组合，当其组合时，引起有效治疗或预防葡萄球菌感染的免疫原性组合物的产生。本发明的免疫原性组合物合适地掺入了参与不同葡萄球菌感染的抗原。所述免疫原性组合物以针对葡萄球菌功能的不同方面的免疫应答为目标，因此能够诱导特别优选的免疫应答。

葡萄球菌感染的发展经过几个不同阶段。例如，葡萄球菌的生存周期包括共栖增殖、通过接触相邻组织或血流而开始感染、在血液中的厌氧增殖、金黄色葡萄球菌毒力决定子与宿主防御机制之间的相互作用以及诱导并发症包括心内膜炎、转移性脓肿形成和败血病综合征。细菌表面上的不同分子将参与感染周期的不同步骤。通过以针对参与葡萄球菌感染不同步骤的有效量的特定抗原的组合的免疫应答为目标，能够产生功效增强的葡萄球菌免疫原性组合物或疫苗。

特别地，来自不同类型的某些抗原的组合，其中一些参与对宿主细胞的粘附，其中一些参与铁捕获或其它转运蛋白功能，其中一些是毒素或毒力调节剂和免疫优势抗原，能够引起防止多阶段感染的免疫应答。

可以通过如实施例中描述的动物模型分析法测定和/或使用如实施例中描述的调理吞噬作用分析法测定免疫应答的有效性。

本发明的一个额外优点是免疫原性组合物中来自不同蛋白家族的本发明的抗原组合将能够产生抗更广泛菌株的保护作用。

本发明涉及包含多种蛋白的免疫原性组合物，所述蛋白选自至少两类不同的蛋白，具有具有葡萄球菌的不同功能。这样的蛋白质种类的例子是胞外结合蛋白质，转运蛋白诸如Fe捕获蛋白，毒素或毒力调节剂以及其它免疫优势蛋白质。本发明的疫苗组合能够有效抗同源葡萄球菌菌株(得到抗原的菌株)，并且优选也抗异源葡萄球菌菌株。

本发明的免疫原性组合物包含等于或多于2、3、4、5或6种的选自2或3个以下组的多种蛋白质：

组a)至少一种葡萄球菌胞外成分结合蛋白或其免疫原性片段，其选自层粘连蛋白受体、SitC/MntC/唾液结合蛋白、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酯酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig和MAP；

例如，第一种蛋白质选自组a)、b)或c)，第二种蛋白质选自一个组，该组选自组a)、b)和c)，其不包括第二种蛋白质。

在一种优选实施方案中，本发明的免疫原性组合物含有至少一种选自组a)的蛋白质以及选自组b)和/或组c)的额外蛋白质。

在另一种优选实施方案中，本发明的免疫原性组合物含有至少一种选自组b)的抗原以及选自组c)和/或组a)的额外蛋白质。

在另一种优选实施方案中，本发明的免疫原性组合物含有至少一种选自组c)的抗原以及选自组a)和/或组b)的额外蛋白质。

本发明的免疫原性组合物合适地含有来自金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌的蛋白。

蛋白质

本发明的免疫原性组合物包含分离的蛋白质，其包含与图1的任意序列具有至少85％同一性、优选至少90％同一性、更优选至少95％同一性、最优选至少97-99％或完全同一性的氨基酸序列。

本文在明确提及蛋白质时，优选指天然或重组的、全长蛋白质或者任选地已经去除了任何信号序列的成熟蛋白质。蛋白质可直接从葡萄球菌菌株中分离或者通过重组DNA技术生产。可将蛋白质的免疫原性片段加入到本发明的免疫原性组合物中。这些片段是包含从蛋白质的氨基酸序列连续选取的至少10个氨基酸、优选20个氨基酸、更优选30个氨基酸、更优选40个氨基酸或50个氨基酸、最优选100个氨基酸的片段。此外，这样的免疫原性片段是与针对葡萄球菌蛋白质而产生的抗体有免疫反应的，或者是与通过用葡萄球菌感染而产生的抗体有免疫反应的。免疫原性片段也包括以有效剂量给予时，(单独或者作为结合到载体上的半抗原)，引起针对葡萄球菌感染的保护性免疫应答的片段，更优选地是对金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌感染有保护性的。这样的免疫原性片段可包括例如缺少N末端前导序列、和/或跨膜结构域和/或C末端锚定结构域的蛋白质。在优选的方面，根据本发明的免疫原性片段包含蛋白质基本上所有的胞外结构域，所述蛋白质在片段序列的整个长度上具有与选自图1的序列至少85％同一性、优选至少90％同一性、更优选至少95％同一性、最优选至少97-99％同一性。

本发明的免疫原性组合物还可以含有葡萄球菌蛋白质的融合蛋白质或者葡萄球菌蛋白质的免疫原性片段。这样的融合蛋白质可以重组制备，可包含至少2、3、4、5或6种葡萄球菌蛋白质的一个部分。作为选择，融合蛋白质可包含至少2、3、4或5种葡萄球菌蛋白质的多个部分。这些融合蛋白质可以将不同的葡萄球菌蛋白质或其片段组合到同一蛋白质中。作为选择，本发明也包括葡萄球菌蛋白质或其片段的单独的融合蛋白质，作为与异源序列诸如T细胞表位或纯化标志的提供者的融合蛋白质，例如：β-半乳糖苷酶，谷胱苷肽-S-转移酶，绿色荧光蛋白(GFP)，表位标志诸如FLAG、myc标志、聚组氨酸，或者病毒表面蛋白质诸如流感病毒血凝素，或者细菌蛋白质诸如破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197。

表1

下表列出了分别在图1和图2中发现的蛋白质序列和DNA序列的SEQ ID号。SA表示来自金黄色葡萄球菌的序列，SE表示来自表皮葡萄球菌的序列。

胞外成分结合蛋白

胞外成分结合蛋白是结合宿主胞外成分的蛋白质。该术语包括但不限于粘附素。

胞外成分结合蛋白的例子包括层粘连蛋白受体(Naidu et al J.Med.Microbiol.1992，36；177)，SitC/MntC/唾液结合蛋白(US5801234，Wiltshire和Foster Infec.Immun.2001，69；5198)，EbhA(Williamset al Infect.Immun.2002，70；6805)，EbhB，弹性蛋白结合蛋白(EbpS)(Park et al1999，J.Biol.Chem.274；2845)，EFB(FIB)(Wastfelt和Flock1995，J.Clin.Microbiol.33；2347)，SBI(Zhanget al FEMS Immun.Med.Microbiol.2000，28；211)，自溶素(Rupp etal2001，J.Infect.Dis.183；1038)，ClfA(US6008341，McDevitt etal Mol.Microbiol.1994，11；237)，SdrC，SdrG(McCrea et alMicrobiology2000，146；1535)，SdrH(McCrea et al Microbiology2000，146；1535)，脂肪酶GehD(US2002/0169288)，SasA，FnbA(Flock et al Mol Microbiol.1994，12；599，US6054572)，FnbB(WO97/14799，Booth et al2001Infec.Immun.69；345)，胶原蛋白结合蛋白Cna(Visai et al2000，J.Biol.Chem.275；39837)，ClfB(WO99/27109)，FbpA(Phonimdaeng et al1988J.Gen Microbiol.134；75)，Npase(Flock2001J.Bacteriol.183；3999)，IsaA/PisA(Lonenzet al FEMS Immuno.Med.Microbiol.2000，29；145)，SsaA(Lang etal FEMS Immunol.Med.Microbiol.2000，29；213)，EPB(Hussain和Hermann，丹麦14-17th关于葡萄球菌的研讨会，2000)，SSP-1(Veenstra et al1996，J.Bacteriol.178；537)，SSP-2(Veenstra et al1996，J.Bacteriol.178；537)，17kDa肝素结合蛋白HBP(Fallgrenet al2001，J.Med.Microbiol.50；547)，玻连蛋白结合蛋白(Li et al2001，Curr.Microbiol.42；361)，纤维蛋白原结合蛋白，凝固酶，Fig(WO97/48727)以及MAP(US5648240)。

SitC/MntC/唾液结合蛋白

这是ABC转运蛋白，它是肺炎葡萄球菌粘附素PsaA的同源物。它是高度免疫原性的32kDa脂蛋白，分布在整个细菌细胞壁(Cockayne et al Infect.Immun.199866；3767)。它在金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌中表达为32kDa脂蛋白，40kDa同源物存在于人葡萄球菌中。在表皮葡萄球菌中，它是铁调节操纵子的成分。它显示了与包括副血链球菌的FimA在内的粘附素有相当高的同源性，以及与具有证实的或推定的金属离子转运功能的ABC转运蛋白家族的脂蛋白具有相当高的同源性。因此SitC被包括为胞外结合蛋白和金属离子转运蛋白。

披露于US5,801,234的唾液结合蛋白也是SitC的形式，可被包括在本发明的免疫原性组合物中。

ClfA和ClfB

这两种蛋白质都具有纤维蛋白原结合活性，在存在血浆时引起金黄色葡萄球菌形成聚集。它们含有细胞壁相关蛋白质所共有的LPXTG基序。

ClfA描述于US6008341，ClfB描述于WO99/27109。

凝固酶(FbpA)

这是一种纤维蛋白原结合蛋白质，在存在血浆时引起金黄色葡萄球菌形成聚集。它描述于涉及到凝固酶的参考文献中：Phonimdaeng etal(J.Gen.Microbio.1988，134：75-83)，Phonimdaeng et al.(MolMicrobiol1990；4：393-404)，Cheung et al.(Infect Immun1995；63：1914-1920)以及Shopsin et al.(J.CLin.Microbiol.2000；38：3453-3456)。

包含在本发明的免疫原性组合物中的优选片段包括已经去除信号肽(C末端27个氨基酸)的成熟蛋白质。

凝固酶具有三个明显的结构域。氨基酸59-297是卷曲螺旋区，氨基酸326-505是富含脯氨酸和甘氨酸的区域，从氨基酸506到645的C末端结构域具有β折叠构象。这些结构域的每一个都是本发明的优选片段。

Sd rG-Fbe-EfB/FIG

Fbe是在表皮葡萄球菌的许多分离株中发现的纤维蛋白原结合蛋白，具有119kDa的推断分子量(Nilsson et al1998.Infect.Immun.66； 2666)。它的序列与金黄色葡萄球菌的聚集因子(ClfA)的序列相关。抗Fbe的抗体可阻断表皮葡萄球菌结合到纤维蛋白原包被的平板和导管上(Pei和Flock2001，J.Infect.Dis.184；52)。该蛋白在WO00/12689中也描述为SdrG。SdrG在凝固酶阴性的葡萄球菌中被发现，是含有LPXTG序列的细胞壁相关蛋白质。

SdrG含有信号肽(氨基酸1-51)，含有纤维蛋白原结合位点和胶原蛋白结合位点的区域(氨基酸51-825)，两个CnaB结构域(氨基酸627-698和738-809)，SD重复区(氨基酸825-1000)以及锚定结构域(氨基酸1009-1056)。

Fbe具有推定的信号序列，在氨基酸51和52之间带有裂解位点。因此Fbe的优选片段含有Fbe的成熟形式，从氨基酸52延续到C末端(氨基酸1092)。

Fbe从氨基酸52到氨基酸825的结构域负责纤维蛋白原结合。因此Fbe的优选片段包含或由氨酸52-825组成。

Fbe的氨基酸373和516之间的区域显示了Fbe和ClfA之间的最大保守性。因此优选片段将含有Fbe的氨基酸373-516。

Fbe的氨基酸825-1041含有高度重复区，由串联重复的天冬氨酸和丝氨酸残基组成。

SdrG的优选片段包括已经去除了信号肽和/或SD重复序列以及锚定结构域的多肽。这些多肽包括或者由SEQ ID NO：70的氨基酸50-825、氨基酸50-633、氨基酸50-597(WO03/76470的SEQ ID NO2)、氨基酸273-597(WO03/76470的SEQ ID NO4)、氨基酸273-577(WO03/76470的SEQ ID NO6)、氨基酸1-549、氨基酸219-549、氨基酸225-549、氨基酸219-528、氨基酸225-528所组成的多肽。

优选地，将与SEQ ID NO：70、20或21的序列具有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或100％同源性的SdrG多肽加入到本发明的免疫原性组合物中。

本发明的组合物任选包含上述SdrG多肽的片段。

优选片段已经去除了信号肽和/或SD重复序列和/或锚定结构域。例如对应于SEQ ID76的氨基酸1-713、1-549、225-549、225-529、24-717、1-707、1-690、1-680、1-670、1-660、1-650、1-640、1-630、1-620、1-610、1-600、34-707、44-697、36-689的序列或者与SEQ ID70 或20或21具有85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

去除了信号肽的优选片段在片段的N末端具有甲硫氨酸残基以确保正确翻译。

更优选的片段具有下面的序列：

MEENSVQDVKDSNTDDELSDSNDQSSDEEKNDVINNNQSINTDDN

NQIIKKEETNNYDGIEKRSEDRTESTTNVDENEATFLQKTPQDNT

HLTEEEVKESSSVESSNSSIDTAQQPSHTTINREESVQTSDNVEDS

HVSDFANSKIKESNTESGKEENTIEQPNKVKEDSTTSQPSGYTNID

EKISNQDE

LLNLPINEYENKARPLSTTSAQPSIKRVTVNQLAAEQGSNVNHLI

KVTDQSITEGYDDSEGVIKAHDAENLIYDVTFEVDDKVKSGDTM

TVDIDKNTVPSDLTDSFTIPKIKDNSGEIIATGTYDNKNKQITYTFT

DYVDKYENIKAHLKLTSYIDKSKVPNNNTKLDVEYKTALSSVNK

TITVEYQRPNENRTANLQSMFTNIDTKNHTVEQTIYINPLRYSAK

ETNVNISGNGDEGST

IIDDSTIIKVYKVGDNQNLPDSNRIYDYSEYEDVTNDDYAQLGNN

NDVNINFGNIDSPYIIKVISKYDPNKDDYTTIQQTVTMQTTINEYT

GEFRTASYDNTIAFSTSSGQGQGDLPPEKTYKIGDYVWEDVDKD

GIQNTNDNEKPLSNVLVTLTYPDGTSKSVRTDEDGKYQFDGLKN

GLTYKITFETPEGYTPTLKHSGTNPALDSEGNSVWVTINGQDDM

TIDSGFYQTPKYSLGNY

VWYDTNKDGIQGDDEKGISGVKVTLKDENGNIISTTTTDENGKY

QFDNLNSGNYIVHFDKPSGMTQTTTDSGDDDEQDADGEEVHVTI

TDHDDFSIDNGYYDDE

EbhA和EbhB

EbhA和EbhB是在金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌两者中都表达的蛋白质(Clarke and Foster Infect.Immun.2002，70；6680，Williams et alInfect.Immun.2002，20；6805)，它们结合到纤连蛋白。由于纤连蛋白是胞外基质的重要成分，EbhA和EbhB在将葡萄球菌粘附到胞外基质方面具有重要功能。

Ebh蛋白质较大，具有1.1兆道尔顿的分子量。由于生产和配制的容易性，使用Ebh蛋白质的片段而不是完整序列是有利的。蛋白质的中部区域含有不完全重复序列，其含有纤连蛋白结合位点。下述含有一个或多个重复结构域的片段是用来加入到本发明的免疫原性组合物中的优选片段。

Ebh蛋白质含有127个氨基酸长度的不完全重复单元，其特征在于含有共有序列：

L.G.{10}A.{13}Q.{26}L...M..L.{33}A

优选地

.{19}L.G.{10}A.{13}Q.{26}L...M..L.{33}A.{12}

更优选地

.....I/V..A...I/V..AK.ALN/DG..NL..AK..A.{6}L..LN.AQK..L..QI/V..A..V..V.{6}A..LN/D.AM..L...I/V.D/E...TK.S.NY/F.N/DAD..K..AY/F..AV..A..I/V.N/D.......

其中“.”代表任意氨基酸，“.{10}”代表任意10个氨基酸，I/V表示氨基酸的备选。

参考Kuroda et al(2001)Lancet357；1225-1240中披露的序列以及表2，很容易推知Ebh蛋白质中的重复序列。

包括在本发明的免疫原性组合物中的优选片段包括含有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或超过10个的127个氨基酸的重复单元的蛋白质。这样的片段可以由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多的127个氨基酸的重复区的重复序列所组成，或者可以由在片段的任一末端或两个末端带有额外氨基酸残基的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多的重复序列所组成。另一种优选的片段是跨越三个重复序列(氨基酸3202-3595)的大约 44kDa的H2多肽，如Clarke et al Infection and Immunity70，6680-6687，2002中所描述的。这样的片段将优选能够结合纤连蛋白和/或引起针对整个Ebh蛋白质有活性的抗体。

Ebh蛋白质能够结合纤连蛋白。这些多肽序列的优选片段保持了结合到纤连蛋白的能力。可通过由Clarke et al(Infection andImmunity70；6680-66872002)所描述的ELISA来评估对纤连蛋白的结合。

还有另一种优选的片段是那些包含B细胞或T辅助细胞表位的片段，例如表3和4中描述的那些片段/肽。

表2.Ebh全长序列中的重复序列。

Ebh全长序列披露于Kuroda et al(2001)Lancet357；1225-1240。下表显示了127个氨基酸的重复序列在全长序列中开始和结束位置的氨基酸残基。

表3.对127个氨基酸的重复序列所预测的B细胞表位：

全长序列披露于Kuroda et al(2001)Lancet357；1225-1240。选择这些重复序列中序列的一个由全长序列的氨基酸3204-3331所编码的重复序列来进行表位预测：

MDVNTVNQKAASVKSTKDALDGQQNLQRAKTEATNAITHASDL

NQAQKNALTQQVNSAQNVHAVNDIKQTTQSLNTAMTGLKRGV

ANHNQVVQSDNYVNADTNKKNDYNNAYNHANDIINGNAQHPVI

开始	结束	表位序列	起始	终止
					5	10	TVNQKA	3208	3213
14	19	KSTKDA	3217	3222
					21	33	DGQQNLQRAKTEA	3224	3236
42	51	DLNQAQKNAL	3245	3254
					66	74	DIKQTTQSL	3269	3277
100	112	ADTNKKNDYNNAY	3303	3315
					117	123	DIINGNA	3320	3326

-“开始”和“结束”栏代表所预测的B细胞表位在127个氨基酸的重复序列中的位置

-“起始”和“终止”栏代表所预测的B细胞表位在Ebh全长序列中的位置

表4预测的Ebh中的T辅助细胞表位：

全长序列披露于TrEMBL数据库，序列索引Q8NWQ6。选择这些重复序列中的一个由全长序列的氨基酸3204-3331所编码的重复序列来进行表位预测：

MDVNTVNQKAASVKSTKDALDGQQNLQRAKTEATNAITHASDL

NQAQKNALTQQVNSAQNVHAVNDIKQTTQSLNTAMTGLKRGV

ANHNQVVQSDNYVNADTNKKNDYNNAYNHANDIINGNAQHPVI

重复序列中的位置	表位序列	序列中的位置
			1	MDVNTVNQK	3204
3	VNTVNQKAA	3206
			6	VNQKAASVK	3209
26	LQRAKTEAT	3229
			37	ITHASDLNQ	3240
43	LNQAQKNAL	3246
			51	ITQQVNSAQ	3254
55	VNSAQNVHA	3258
			61	VHAVNDIKQ	3264
64	VNDIKQTTQ	3267
			67	IKQTTQSLN	3270
74	LNTAMTGLK	3277
			78	MTGLKRGVA	3281
81	LKRGVANHN	3284
			85	VANHNQVVQ	3288
91	VVQSDNYVN	3294
			92	VQSDNYVNA	3295
97	YVNADTNKK	3301
			98	VNADTNKKN	3302
108	YNNAYNHAN	3311
			112	YNHANDIIN	3315
118	IINGNAQHP	3321
			119	INGNAQHPV	3322

[0132] -“重复序列中的位置”栏表示所预测的T细胞表位在重复序列中的位置

-“序列中的位置”栏表示所预测的T细胞表位在Ebh全长序列中的位置

可以使用本发明的多肽的片段通过肽合成来生产相应的全长多肽；因此，这些片段可被用作生产本发明的全长多肽的中间体。

特别优选的是其中几个、5-10、1-5、1-3、1-2或1个氨基酸以任意组合被取代、缺失或添加的变体。

弹性蛋白结合蛋白质(EbpS)

EbpS是含有486个氨基酸的分子量83kDa的蛋白质。它与金黄色葡萄球菌的细胞质膜相关联，具有三个将蛋白质保持在膜中的疏水区(Downer et al2002，J.Biol.Chem.277；243；Park et al1996，J.Biol.Chem.271；15803)。

氨基酸1-205和343-486之间的两个区域是在细胞质膜外表面上表面暴露的。EbpS的配体结合结构域位于N末端的残基14-34之间(Park et al1999，J.Biol.Chem.274；2845)。

加入到本发明的免疫原性组合物中的优选片段是含有弹性蛋白结合区域的表面暴露片段(氨基酸1-205)。一些优选片段不含完整的暴露环，但是应当含有弹性蛋白结合区域(氨基酸14-34)。能够使用的作为选择的片段由形成第二表面暴露环的氨基酸组成(氨基酸343-486)。在一端或两端含有少至1、2、5、10、20、50个氨基酸的作为选择的片段也是可能的。

层粘连蛋白受体

金黄色葡萄球菌的层粘连蛋白受体在致病性方面起着重要作用。感染的典型特征就是允许广泛的转移性脓肿形成的血流侵袭。血流侵袭需要流过血管基底膜的能力。这是通过层粘连蛋白受体结合到层粘连蛋白而实现的(Lopes et al Science1985，229；275)。

层粘连蛋白是表面暴露的，存在于葡萄球菌的许多菌株包括金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌中。

SBI

Sbi是除了蛋白A之外的第二IgG结合蛋白，它在大多数金黄色葡萄球菌菌株中表达(Zhang et al1998，Microbiology144；985)。

Sbi序列的N末端具有典型的信号序列，在氨基酸29之后带有裂解位点。因此加入到本发明的免疫原性组合物中的Sbi的优选片段在氨基酸残基30、31、32或33处开始，延续到Sbi的C末端，例如SEQID NO：26。

已经将Sbi的IgG结合结构域确定为从氨基酸41-92向蛋白质N末端的区域。这个结构域与蛋白A的IgG结合结构域同源。

Sbi的最小IgG结合结构域含有下面的序列：

QTTQNNYVTDQQKAFYQVLHLKGITEEQRNQYIKTLREHPERAQEVFSESLK

＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊

^＊-表示在IgG结合结构域之间相似的氨基酸

包括在本发明的免疫原性组合物中的Sbi优选片段含有IgG结合结构域。该片段含有IgG结合结构域的共有序列，如上面序列中所示的由^*标明的。优选地，片段含有或者由上面所示的全部序列组成。更优选地，片段含有或者由Sbi的氨基酸30-92、33-92、30-94、33-94、30-146、33-146、30-150、33-150、30-160、33-160、33-170、33-180、33-190、33-200、33-205或33-210组成，例如SEQ ID NO：26。

优选的片段可含有来自所指序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸的取代。

优选的片段可含有IgG结合结构域的多个重复序列(2、3、4、5、6、7、8、9或10个)。

EFB-FIB

Fib是19kDa纤维蛋白原结合蛋白，它由金黄色葡萄球菌分泌到胞外基质中。所有测试的金黄色葡萄球菌分离株都产生它(Wastfeltand Flock1995，J.Clin.Microbiol.33；2347)。

金黄色葡萄球菌在存在纤维蛋白原时聚集并结合到纤维蛋白原包被的表面。该能力有助于导管和内皮细胞的葡萄球菌菌落增殖。

Fib在蛋白质的N末端含有信号序列，在大约氨基酸30处带有推定的裂解位点。因此引入到本发明的免疫原性组合物中的优选片段将含有成熟蛋白质的序列(从大约氨基酸30到蛋白质的C末端)。

IsaA/PisA

IsaA是29kDa蛋白质，也称为PisA，已经显示出它是医院患者败血症期间的免疫优势的葡萄球菌蛋白质(Lorenz et al2000，FEMSImmunol.Med.Microb.29；145)。

IsaA序列的开头29个氨基酸被认为是信号序列。因此包括在本发明的免疫原性组合物中的IsaA优选序列将含有从氨基酸残基30起到编码序列的末端。

纤连蛋白结合蛋白

纤连蛋白结合蛋白A(FnbA)描述于US5320951和Schennings etal(1993，Mircob.Pathog.15；207)。纤连蛋白结合蛋白A含有参与结合纤连蛋白的几个结构域(WO94/18327)。这些结构域被称为D1、D2、D3和D4。纤连蛋白结合蛋白A或B的优选片段包含或由D1、D2、D3、D4、D1-D2、D2-D3、D3-D4、D1-D3、D2-D4或D1-D4组成(如WO94/18327中的描述)。

纤连蛋白结合蛋白含有36个氨基酸的信号序列。例如：

VKNNLRYGIRKHKLGAASVFLGTMIVVGMGQDKEAA

任选地，缺失该信号序列的成熟蛋白质包括在本发明的免疫原性组合物中。

转运蛋白

革兰氏阳性菌的细胞壁作为屏障来防止代谢物自由扩散到细菌中。一系列蛋白质协同形成了必需养分进入细菌的通道，因此对于细菌生存是必需的。术语转运蛋白包括参与结合到代谢物诸如铁的初始步骤的蛋白质以及参与将代谢物事实上转运到细菌中的那些蛋白质。

分子铁对于细菌生长来说是必需的辅助因子。分泌结合游离铁的铁载体，然后被递送铁的细菌表面受体捕获来转运通过细胞质膜。铁的探测对于确定人感染来说是关键的，以便针对该类蛋白质的免疫应答的产生能够导致葡萄球菌生存力的丧失。

转运蛋白的例子包括免疫优势的ABC转运蛋白(Burnie et al2000Infect.Imun.68；3200)，IsdA(Mazmanian et al2002PNAS99；2293)，IsdB(Mazmanian et al2002PNAS99；2293)，Mg²⁺转运蛋白，SitC(Wiltshire和Foster2001Infect.Immun.69；5198)以及NiABC转运蛋白。

免疫优势的ABC转运蛋白

免疫优势的ABC转运蛋白是有良好保守性的蛋白质，它可能能够产生针对不同葡萄球菌菌株的交叉保护性的免疫应答(Mei et al1997，Mol.Microbiol.26；399)。抗这种蛋白质的抗体已经在患有败血症的患者中发现了(Burnie et al2000，Infect.Immun.68；3200)。

免疫优势的ABC转运蛋白的优选片段将包括肽DRHFLN、GNYD、RRYPF、KTTLLK、GVTTSLS、VDWLR、RGFL，更优选KIKVYVGNYDFWYQS、TVIVVSHDRHFLYNNV和/或TETFLRGFLGRMLFS，因为这些序列含有被人免疫系统识别的表位。

IsdA-IsdB

金黄色葡萄球菌的isd基因(铁调节的表面决定子)编码负责血红蛋白结合以及传递血红素铁到细胞质的蛋白质，它在这里作为必需养分。IsdA和IsdB位于葡萄球菌的细胞壁中。IsdA似乎被暴露在细菌表面上，因为它对蛋白酶K消化是敏感的。IsdB被部分消化，表明它部分暴露在细菌表面上(Mazmanian et al2003Science299；906)。

IsdA和IsdB都是结合血红素的29kDa蛋白质。它们的表达通过 Fur阻抑物而被铁的可获得性所调节。它们的表达在铁浓度将变低的宿主感染期间将变高。

它们也被称为FrpA和FrpB(Morrissey et al2002，Infect.Immun.70；2399)。FrpA和FrpB是带有高电荷的主要表面蛋白。已经显示它们提供了粘附到塑料的主要作用。

在一种实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含IsdA和/或IsaB片段，其描述在WO01/98499或WO03/11899中。

毒素和毒力调节剂

这个蛋白质家族的成员包括毒素诸如α毒素、溶血素、肠毒素B和TSST-1以及调节毒素产生的蛋白质诸如RAP。

α毒素(Hla)

α毒素是由大多数金黄色葡萄球菌菌株产生的重要毒力决定子。它是具有溶血活性的孔形成毒素。已经显示抗α毒素的抗体中和动物模型中α毒素的有害和致命效应(Adlam et al1977Infect.Immun.17；250)。人血小板、内皮细胞和单核细胞对α毒素的效应是敏感的。

α毒素的高毒性要求其在作为免疫原使用之前应当脱毒。这可以通过化学处理实现，例如通过用甲醛、戊二醛或其它交联试剂处理或者通过将它化学缀合到如下所述的细菌多糖上。

除去毒性的进一步的方式是引入除去毒性同时保持毒素的抗原性的点突变。在α毒素的氨基酸35处的点突变的引入导致毒性的去除同时保持免疫原性，所述突变是用亮氨酸残基取代组氨酸残基(Menzies和Kernodle1996；Infect.Immun.64；1839)。组氨酸35似乎对于孔形成所需的正确寡聚化来说是关键性的，这个残基的突变导致毒性丧失。

当加入到本发明的免疫原性组合物中时，α毒素优选通过His35突变而被脱毒，最优选通过用Leu或Arg取代His35。在作为选择的实施方案中，α毒素通过缀合到免疫原性组合物的其它组分上而被脱毒，优选荚膜多糖，最优选缀合到金黄色葡萄球菌V型多糖和/或金黄色葡萄球菌VIII型多糖和/或PNAG上。

RNA III活化蛋白(RAP)

RAP本身不是毒素。但是它是毒力因子表达的调节剂。RAP由葡萄球菌产生并分泌。它激活其它葡萄球菌的agr调节系统并激活毒力因子诸如溶血素、肠毒素B和TSST-1的表达和随后的释放。

针对RAP产生的免疫应答将不会杀死细菌，但是将干扰它们的致病性。这具有这样的优点，即对于新的抗性菌株的形成提供更小的选择压力。

它将具有第二个优点，即产生的免疫应答在减少感染的发病方面将是有帮助的。

将RAP与疫苗中的其它抗原结合是特别有利的，特别是在额外的抗原将提供能够杀死细菌的免疫应答的情况。

其它蛋白质

累积-结合蛋白质(Aap)

Aap是表皮葡萄球菌菌株累积在表面上所必需的140kDa蛋白质(Hussain et al Infect.Immun.1997，65；519)。表达该蛋白质的菌株产生显著更大量的生物膜，Aap似乎参与了生物膜的形成。抗Aap的抗体能够抑制生物膜形成并抑制表皮葡萄球菌的累积。

Aap的优选片段是包含氨基酸550-1069或由氨基酸550-1069组成的保守结构域。

葡萄球菌分泌的抗原SsaA

SsaA是在金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌中都发现的30kDa强免疫原性蛋白质(Lang et al2000FEMS Immunol.Med.Microbiol.29；213)。它在心内膜炎期间的表达表明了特异性针对感染疾病发病的毒力作用。

SsaA含有N末端前导序列和信号肽酶裂解位点。前导肽之后是从残基30到残基130的大约100个氨基酸的亲水区。

加入到本发明的免疫原性组合物中的优选SsaA片段由成熟蛋白(氨基酸27到C末端或者氨基酸30到C末端)组成。

另一种优选的片段含有SsaA从氨基酸30到氨基酸130的疏水区。

优选组合

本发明的免疫原性组合物中的优选蛋白质组合包含层粘连蛋白受体和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含SitC和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含EbhA和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含EbhB和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含EbpS和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含EFB(FIB)和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含SBI和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含自溶素和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含ClfA和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含SdrC和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含SdrG和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体和RAP。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含SdrH和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含酯酶GehD和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含SasA和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含FnbA和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含 FnbB和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含Cna和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含ClfB和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含FbpA和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含Npase和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含IsaA/PisA和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含SsaA和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含EPB和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含SSP- 1和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含SSP-2和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含HPB和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含玻连蛋白结合蛋白和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含纤维蛋白原结合蛋白和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含凝固酶和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含Fig和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含MAP和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含免疫优势的ABC转运蛋白和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自层粘连蛋白受体、SitC/MntC/唾液结合蛋白、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酯酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含IsdA和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自层粘连蛋白受体、SitC/MntC/唾液结合蛋白、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酯酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含IsdB和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自层粘连蛋白受体、SitC/MntC/唾液结合蛋白、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酯酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含SitC和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自层粘连蛋白受体、SitC/MntC/唾液结合蛋白、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酯酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、α毒素、α毒素H35L或H35R突变体、RAP、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含α毒素和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自层粘连蛋白受体、SitC/MntC/唾液结合蛋白、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酯酶GehD、SasA、FnbA、 FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含α毒素H35L或H35R突变体和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自层粘连蛋白受体、SitC/MntC/唾液结合蛋白、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酯酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含RAP和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自层粘连蛋白受体、SitC/MntC/唾液结合蛋白、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酯酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、Aap和SsaA。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含Aap和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自层粘连蛋白受体、SitC/MntC/唾液结合蛋白、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酯酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、RAP、α毒素和H35L OR H35Rα毒素。

本发明的免疫原性组合物中的另一种优选的蛋白质组合包含SsaA和1、2、3、4或5种另外的抗原，其选自层粘连蛋白受体、SitC/MntC/唾液结合蛋白、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、 SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酯酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、RAP、α毒素和H35L OR H35Rα毒素。

发明人证明了某些抗原产生了抗原混合物范畴内的特别有效的免疫应答。因此，本发明的一个实施方案是包含IsaA和葡萄球菌转运蛋白或IsaA和葡萄球菌毒力调节剂或毒素，或包含Sbi和葡萄球菌转运蛋白或Sbi和葡萄球菌毒力调节剂或毒素，或包含SdrC和葡萄球菌转运蛋白或SdrC和葡萄球菌毒力调节剂或毒素，或IsaA和Sbi，或IsaA和SdrC，或IsaA和自溶素，或IsaA和Ebh，或Sbi和SdrC，或Sbi和自溶素，或Sbi和Ebh，或SdrC和自溶素，或SdrC和Ebh，或自溶素-葡糖酰胺酶和Ebh的免疫原性组合物。对于这些组合中的每一种，蛋白可以是全长或片段，其具有与图1的序列具有至少85％、90％、95％、98％或100％同一性的序列。

在上面的以及下面的组合中，特定蛋白质可以任选作为如上所述的片段或融合蛋白而存在于本发明的免疫原性组合物中。

本发明的优选免疫原性组合物不包括WO02/094868中公开的蛋白序列。

三种蛋白质的组合

本发明的优选免疫原性组合物包含α-毒素、胞外成分结合蛋白(优选粘附素)和转运蛋白(优选铁结合蛋白)相组合的三种蛋白质成分。

在这样的组合中，α毒素可以被化学脱毒或通过引入点突变而遗传学脱毒，优选His35Leu点突变。A毒素作为游离蛋白质存在或者作为选择而被缀合到免疫原性组合物的多糖或LTA成分上。

优选的组合包括：

免疫原性组合物，包含α毒素、IsdA和胞外成分结合蛋白，其选自层粘连蛋白受体、SitC/MntC/唾液结合蛋白、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酯酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig和MAP。

免疫原性组合物，包含α毒素、IsdB和胞外成分结合蛋白，其选自层粘连蛋白受体、SitC/MntC/唾液结合蛋白、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酯酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig和MAP。

免疫原性组合物，包含α毒素、IsdA和粘附素，其选自层粘连蛋白受体、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、自溶素、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、SSP-1、SSP-2、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig和MAP。

免疫原性组合物，包含α毒素、IsdB和粘附素，其选自层粘连蛋白受体、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、SSP-1、SSP-2、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig和MAP。

包含α毒素、IsdA和层粘连蛋白受体的免疫原性组合物。

包含α毒素、IsdA和EbhA的免疫原性组合物。

包含α毒素、IsdA和EbhB的免疫原性组合物。

包含α毒素、IsdA和EbpS的免疫原性组合物。

包含α毒素、IsdA和EFB(FIB)的免疫原性组合物。

包含α毒素、IsdA和SdrG的免疫原性组合物。

包含α毒素、IsdA和ClfA的免疫原性组合物。

包含α毒素、IsdA和ClfB的免疫原性组合物。

包含α毒素、IsdA和FnbA的免疫原性组合物。

包含α毒素、IsdA和凝固酶的免疫原性组合物。

包含α毒素、IsdA和Fig的免疫原性组合物。

包含α毒素、IsdA和SdrH的免疫原性组合物。

包含α毒素、IsdA和SdrC的免疫原性组合物。

包含α毒素、IsdA和MAP的免疫原性组合物。

包含IsaA和Sbi的免疫原性组合物。

包含IsaA和IsdB的免疫原性组合物。

包含IsaA和IsdA的免疫原性组合物。

包含IsaA和SdrC的免疫原性组合物。

包含IsaA和Ebh或其如上所述的片段的免疫原性组合物。

包含Sbi和SdrC的免疫原性组合物。

包含Sbi和Ebh或其如上所述的片段的免疫原性组合物。

包含IsaA、Sbi或SdrC的免疫原性组合物。

在不同克隆系中表达的抗原的选择

对与金黄色葡萄球菌种群结构相关的毒力因子的出现进行的分析表明，金黄色葡萄球菌的天然种群中存在可变的毒力基因。

在金黄色葡萄球菌的临床分离株中，至少五种克隆系显示出是非常普遍的(Booth et al.，2001Infect Immun.69(1)：345-52)。A-溶血素(hla)、纤连蛋白结合蛋白A(fnbA)和聚集因子A(clfA)显示出存在于大多数分离株中，无论品系身份如何，表明了些蛋白质在金黄色葡萄球菌的生存中的重要作用(Booth et al.，2001Infect Immun.69(1)：345-52)。而且，根据Peacock et al.2002，fnbA、clfA、凝固酶、spa、map、pvl(Panton-Valentine杀白细胞素)、hlg(gamma-毒素)、α-毒素和ica似乎与潜在的克隆结构无关，表明了这些基因相当多的水平转移。

相反，其它毒力基因诸如纤连蛋白结合蛋白B(fnbB)、β-溶血素(hlb)、胶原蛋白结合蛋白(can)、TSST-1(tst)和甲氧苯青霉素抗性基因(mecA)与特定品系有力地相关联(Booth et al.，2001InfectImmun.69(1)：345-52)。同样地，Peacock et al.2002(Infect Immun.70(9)：4987-96)显示出肠毒素、tst、exfolatin(eta和etb)，β-和δ-毒素、sdr基因(sdrD、sdrE和bbp)、cna、ebpS和efb在种群中的分布是与MLST-衍生的克隆复合物相当明显地相关的。

MLST数据没有提供证据证明引起医源性疾病的菌株代表了与引起社区获得疾病的菌株或者从健康带菌者回收的菌株所截然不同的亚群(Feil et al.，2003J Bacteriol.185(11)：3307-16)。

本发明的优选免疫原性组合物对于来自不同克隆系的葡萄球菌是有效的。

在一种实施方案中，这是通过包含1、2、3、4种的优选至少1种在大多数葡萄球菌分离株中表达的蛋白质而实现的。这样的蛋白质的例子包括α-溶血素(hla)、纤连蛋白结合蛋白A(fnbA)和聚集因子A(clfA)、凝固酶、spa、map、pvl(Panton-Valentine杀白细胞素)、hlg(gamma-毒素)和ica。我们也鉴定了免疫优势的ABC转运蛋白、RAP、自溶素(Rupp et al2001，J.Infect.Dis.183；1038)、层粘连蛋白受体、SitC、IsaA/PisA、SPOIIIE()、SsaA、EbpS、SasF(Rocheet al2003，Microbiology149；643)、EFB(FIB)、SBI、ClfB、IsdA、IsdB、FnbB、Npase、EBP、骨唾液酸结合蛋白II、IsaB/PisB(Lorenzet al FEMS Immuno.Med.Microb.2000，29；145)、SasH(Roche et al2003，Microbiology149；643)、MRPI、SasD(Roche et al2003，Microbiology149；643)、SasH(Roche et al2003，Microbiology149；643)、自溶素前体(AUR)/Sepp1以及新的自溶素。

在作为选择的实施方案中，在不同的克隆菌株组中表达的2或多种蛋白质被包括在本发明的免疫原性组合物中。优选地，抗原组合将使得能够产生针对多种克隆菌株有效的免疫应答，最优选针对所有克隆菌株。优选组合包括FnbB和β-溶血素、FnbB和Cna、FnbB和TSST-1、FnbB和mecA、FnbB和SdrD、FnbB和SdrF、FnbB和EbpS、FnbB和Efb、β-溶血素和Cna、β-溶血素和TSST-1、β-溶血素和mecA、β-溶血素和SdrD、β-溶血素和SdrF、β-溶血素和EbpS、β-溶血素和Efb、Cna和TSST-1、Cna和mecA、Cna和SdrD，Cna和SdrF、Cna和EbpS、Cna和Efb、TSST-1和mecA、TSST-1和SdrD、TSST-1和SdrF、TSST-1和EbpS、TssT-1和Efb、MecA和SdrD、MecA和SdrF、MecA和EbpS、MecA和Efb、SdrD和SdrF、SdrD和EbpS、SdeD和Efb、SdrF和EbpS、SdrF和Efb以及EbpS和Efb。

上述优选组合可以与上述额外成分相结合。

选择在不同生长阶段表达的抗原

葡萄球菌经历指数生长阶段，在该阶段表达特定组的蛋白。这包括很多胞外成分结合蛋白和转运蛋白。在指数生长阶段后，葡萄球菌回到指数后阶段，在该阶段中其生长较慢，并且调节蛋白表达。在指数生长阶段表达的很多蛋白都受到下调，而其它蛋白，如酶和大多数毒素，包括α毒素，都以更高水平表达。

本发明的优选免疫原性组合物包含在指数生长阶段以更高水平表达的蛋白和在指数后阶段以更高水平表达的蛋白。

“更高水平”是指一个阶段的表达水平相对于其它阶段更高。

在一个优选实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含α毒素和胞外成分结合蛋白(优选FnbA、FnbB、ClfA和ClfB)或转运蛋白。

更优选地，其包含α毒素或Cna或酯酶GehD和选自下组的蛋白：层粘连蛋白受体、SitC/MntC/唾液结合蛋白、弹性蛋白结合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、SasA、FnbA、FnbB、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC、Ni ABC转运蛋白、Aap和SsaA。

在上文描述的组合中，α毒素可以按照上文的描述遗传学或化学脱毒，并且可能缀合或不缀合到下文描述的多糖上。

多糖

本发明的免疫原性组合物优选进一步包含荚膜多糖，包括一种或多种PIA(也被称为PNAG)和/或金黄色葡萄球菌的V型和/或VIII型荚膜多糖和/或表皮葡萄球菌I型和/或II型和/或III型荚膜多糖。

PIA(PNAG)

现在清楚的是，被确定为PS/A、PIA和SAA的各种形式的葡萄球菌表面多糖是同样的化学实体-PNAG(Maira-Litran et al Vaccine22；872-879(2004))。因此术语PIA或PNAG包括所有这些多糖或者衍生自它们的寡糖。

PIA是多糖胞间粘附素，由被N-乙酰和O-琥珀酰成分取代的

(1

)连接的葡糖胺的聚合物所组成。该多糖存在于金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌两者中，能够从任一来源分离(Joyce et al2003，Carbohydrate Research338；903；Maira-Litran et al2002，Infect.Imun.70；4433)。例如，PNAG可从金黄色葡萄球菌菌株MN8m分离(WO04/43407)。

分离自表皮葡萄球菌的PIA是生物膜的组成成分。它负责介导细胞-细胞粘连，或许也起作用来防止生长的菌落免受宿主的免疫应答。该多糖在以前被称为聚-N-琥珀酰-β-(1葡糖胺(PNSG)，最近显示它不具有预期结构，因为确定了N-琥珀酰化是不正确的(Maira-Litran et al2002，Infect.Imun.70；4433)。因此，形式上称为PNSG而现在发现是PNAG的多糖也被术语PIA所包括。

PIA(或PNAG)可以是不同大小的由多达30个重复单元(被N-乙酰和O-琥珀酰成分取代的

连接的葡糖胺聚合物)所组成的寡糖，从超过400kDa、到75和400kDa之间、到10和75kDa之间变化。任何大小的PIA多糖或寡糖都可用于本发明的免疫原性组合物中，然而超过40kDa的大小是优选的。大小分级可通过现有技术中已知的任何方法来获得，例如通过微流化、超声照射或者通过化学裂解(WO03/53462，EP497524，EP497525)。

PIA(PNAG)的优选大小是40-400kDa、50-350kDa、40-300kDa、60-300kDa、50-250kDa和60-200kDa。

PIA(PNAG)PIA可由于氨基被乙酸酯取代而具有不同程度的乙酰化。体外产生的PIA几乎在氨基上被全部取代(95-100％)。作为选择，可以使用脱乙酰化的PIA(PNAG)，具有少于60％、优选少于50％、40％、30％、20％、10％的乙酰化。使用脱乙酰化PIA(PNAG)是优选的，因为PNAG的非乙酰化表位在介导调理素杀死革兰氏阳性菌时是有效的，优选金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌。更优选地，PIA(PNAG)具有40kDa和300kDa之间的大小并且是脱乙酰化的，以使得少于60％、50％、40％、30％或20％的氨基被乙酰化。

术语使PNAG脱乙酰化(dPNAG)是指少于60％、50％、40％、30％、20％或10％的氨基被乙酰化的PNAG多糖或寡糖。

在一种实施方案中，通过化学处理天然多糖来使PNAG脱乙酰化以形成dPNAG。例如，用碱性溶液处理天然PNAG，以使得pH上升到超过10。例如用0.1-5M、0.2-4M、0.3-3M、0.5-2M、0.75-1.5M或1MNaOH、KOH或NH₄OH处理PNAG。处理进行至少10或30分钟，或者1、2、3、4、5、10、15或20小时，温度在20-100、25-80、30-60或30-50或35-45℃。可按照WO04/43405的描述来制备dPNAG。

包括在本发明免疫原性组合物中的多糖优选被如下所述缀合到载体蛋白质上，或者作为选择不被缀合。

来自金黄色葡萄球菌的5型和8型多糖

在人体中引起感染的大多数金黄色葡萄球菌菌株含有5型或8型多糖。大约60％的人体菌株是8型的，大约30％是5型的。5型和8型荚膜多糖抗原的结构描述于Moreau et al Carbohydrate Res.201；285(1990)以及Fournier et al Infect.Immun.45；87(1984)中。两者都在它们的重复单元中具有FucNAcp以及具有ManNAcA，可用于引入巯基。所报道的结构为：

5型

→4)-

-D-ManNAcA(3OAc)-(1→4)--L-FucNAc(1→3)-

-D-FucNAc-(1→

8型

→3)-

-D-ManNAcA(4OAc)-(1→3)--L-FucNAc(1→3)-

-D-FucNAc-(1→

最近(Jones Carbohydrate Research340，1097-1106(2005))NMR谱将结构修正为：

5型

→4)-

-D-ManNAcA-(1→4)-

-L-FucNAc(3OAc)-(1→3)-

-D-FucNAc-(1→

8型

→3)-

-D-ManNAcA(4OAc)-(1→3)-

-L-FucNAc(1→3)--D- FucNAc(1→

可以使用本领域技术人员公知的方法从合适的金黄色葡萄球菌菌株中提取多糖，例如按照US6294177中的描述。例如，ATCC12902是5型金黄色葡萄球菌菌株，ATCC12605是8型金黄色葡萄球菌菌株。

多糖是天然大小，或者作为选择可以通过例如微流化、超声照射或者通过化学处理进行大小分级。本发明也包括衍生自金黄色葡萄球菌5型和8型多糖的寡糖。

包括在本发明免疫原性组合物中的5型和8型多糖优选被如下所述缀合到载体蛋白质上，或者作为选择不被缀合。

作为选择，本发明的免疫原性组合物含有5型或8型多糖。

金黄色葡萄球菌336抗原

在一种实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含US6294177中描述的金黄色葡萄球菌336抗原。

336抗原包含β-连接的己糖胺，不含O-乙酰基，特异性结合到针对保藏为ATCC55804的金黄色葡萄球菌336型的抗体上。

在一种实施方案中，336抗原是天然大小，或者作为选择可以通过例如微流化、超声照射或者通过化学处理进行大小分级。本发明也包括衍生自336抗原的寡糖。

包括在本发明免疫原性组合物中的336抗原优选被如下所述缀合到载体蛋白质上，或者作为选择不被缀合。

来自表皮葡萄球菌的I、II和III型多糖

表皮葡萄球菌菌株ATCC-31432、SE-360和SE-10的特征分别在于三种不同的荚膜I、II和III型(Ichiman and Yoshida1981，J.Appl.Bacteriol.51；229)。提取自每种表皮葡萄球菌血清型的荚膜多糖构成I、II和III型多糖。可以通过几种方法提取多糖，包括描述于US4197290中的方法或者按照Ichiman et al1991，J.Appl.Bacteriol.71；176中所描述的方法。

在本发明的一个实施方案中，免疫原性组合物包含来自表皮葡萄球菌的I和/或II和/或III型多糖或寡糖。

多糖是天然大小，或者作为选择可以通过例如微流化、超声照射或者通过化学裂解进行大小分级。本发明也包括提取自表皮葡萄球菌菌株的寡糖。

这些多糖不被缀合，或者优选地被如下所述进行缀合。

多糖的缀合

在与疫苗接种中使用多糖相关的问题中，其中之一是多糖本身为弱免疫原的这一事实。已经设计来克服这一免疫原性缺乏的策略包括将多糖连接到较大的蛋白质载体上，其提供了旁观者T细胞辅助。优选的是，将本发明所利用的多糖连接到提供旁观者T细胞辅助的蛋白质载体上。可以与多糖免疫原缀合的这些载体的例子包括白喉和破伤风类毒素(分别是DT、DT Crm197和TT)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、和结核菌素的纯化蛋白质衍生物(PPD)、绿脓杆菌外蛋白A(rEPA)、来自流感嗜血杆菌的蛋白D、肺炎球菌溶血素或者上述任何之一的片段。适合使用的片段包括含有T辅助表位的片段。特别地，蛋白D片段将优选包含蛋白质的N末端1/3。蛋白D是来自流感嗜血杆菌的IgD结合蛋白质(EP 0 594 610 B1)，并且是潜在的免疫原。

此外，葡萄球菌蛋白可以用作本发明的多糖缀合物中的载体蛋白。下文描述的葡萄球菌蛋白可以用作载体蛋白；例如层粘连蛋白受体、SitC/MntC/唾液结合蛋白、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酯酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg²⁺转运蛋白、SitC和Ni ABC转运蛋白、α毒素(Hla)、α毒素H35R突变体、RNA III活化蛋白(RAP)或其片段。

特别有利于使用在葡萄球菌疫苗中的新载体蛋白质是葡萄球菌α类毒素。可将天然形式缀合到多糖上，因为缀合步骤降低了毒性。优选地将遗传去毒的α毒素诸如His35Leu或His35Arg变体用作载体，因为残留毒性更低。作为选择，通过用交联试剂、甲醛或戊二醛处理将α毒素化学去毒。遗传去毒的α毒素被任选化学去毒，优选通过用交联试剂、甲醛或戊二醛处理以进一步降低毒性。

可通过任何已知方法将多糖连接到载体蛋白质上(例如通过Likhite的美国专利4,372,945，Armor的美国专利4,474,757以及Jennings et al.的美国专利4,356,170)。优选地，实施CDAP缀合化学(参见WO95/08348)。

在CDAP中，氰化试剂1-氰基-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)被优选用于多糖-蛋白质缀合物的合成。氰化反应可以在相对温和的条件下进行，这避免了碱性敏感的多糖的水解。这种合成法使得能够直接偶联到载体蛋白质上。

可将多糖溶于水中或盐溶液中。可将CDAP溶解在乙腈中，立即加入到多糖溶液中。CDAP与多糖的羟基反应形成氰酸酯。反应步骤之后，加入载体蛋白质。赖氨酸的氨基与活化的多糖反应形成异脲共价连接。偶联反应之后，然后加入大大过量的甘氨酸以淬灭残留的活化官能团。然后将产物通过凝胶渗透柱以去除未反应的载体蛋白质和残留试剂。

缀合优选包括在载体蛋白和多糖之间产生直接的键。任选地，可以将间隔基(如己二酸酐(ADH))导入载体和多糖之间。

抗金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的保护作用

在本发明的优选实施方案中，免疫原性组合物提供针对多于一种葡萄球菌菌株的有效免疫应答，优选针对来自金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌两者的菌株。更优选地，产生针对金黄色葡萄球菌5型和8型血清型的保护性免疫应答。更优选地，产生针对表皮葡萄球菌的多种菌株，例如血清型I、II和III中至少两种血清型的菌株的保护性免疫应答。

本发明免疫原性组合物的一种用途是通过在医院治疗之前接种疫苗来预防医源性感染。在这个阶段，很难精确预测患者将暴露于哪些葡萄球菌菌株。因此用能够产生针对各种葡萄球菌菌株的有效免疫应答的疫苗进行接种是有利的。

有效免疫应答被定义为在如实施例中描述的小鼠攻击模型或调理吞噬作用分析中产生明显保护。在例如实施例5的小鼠攻击模型中的明显保护被定义为与接种了载体的小鼠相比LD50至少10％、20％、 50％、100％或200％的增加。在例如实施例8的棉鼠攻击模型中的明显保护被定义为所观察到的平均对数CFU/鼻至少10％、20％、50％、70％或90％的降低。已知调理性抗体的存在是与保护性相关联的，因此在例如实施例7的调理吞噬作用分析中细菌计数至少10％、20％、50％、70％或90％的减少表明了明显的保护。

包括免疫优势的ABC转运蛋白、RNA III活化蛋白、层粘连蛋白受体、SitC、IsaA/PisA、SsaA、EbhA/EbhB、EbpS和Aap在内的几种蛋白质在金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌之间是相当保守的，实施例8显示IsaA、ClfA、IsdB、SdrG、HarA、FnbpA和Sbi能够产生交叉反应性免疫应答(例如在至少一种金黄色葡萄球菌和至少一种表皮葡萄球菌菌株之间的交叉反应性)。PIA在金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌之间也是相当保守的，并且能够诱导交叉免疫应答。

因此在优选实施方案中，本发明的免疫原性组合物将包含两种、三种或四种上述蛋白质，优选进一步包含PIA(PNAG)。

多核苷酸疫苗

另一方面，本发明涉及图2的多核苷酸在治疗、预防或诊断葡萄球菌感染中的用途。所述多核苷酸包括分离的多核苷酸，其包含编码在序列的全长上与图1的氨基酸序列具有至少70％同一性，优选至少80％同一性，更优选至少90％同一性，更优选至少95％同一性的多肽。在此方面，高度优选的是具有至少97％同一性的多肽，而具有至少98-99％同一性的多肽是更高度优选的，具有至少99％同一性的多肽是最高度优选的。

在本发明中有用的其它多核苷酸包括分离的多核苷酸，其包含在整个编码区与编码本发明的蛋白的核苷酸序列具有至少70％同一性，优选至少80％同一性，更优选至少90％同一性，更优选至少95％同一性的核苷酸序列。在此方面，高度优选的是具有至少97％同一性的多核苷酸，而具有至少98-99％同一性的多核苷酸是更高度优选的，具有至少99％同一性的多核苷酸是最高度优选的。

其它多核苷酸包括分离的多核苷酸，其包含与图1的序列具有至少70％同一性，优选至少80％同一性，更优选至少90％同一性，更优选至少95％同一性的核苷酸序列。在此方面，高度优选的是具有至少97％同一性的多核苷酸，而具有至少98-99％同一性的多核苷酸是更高度优选的，具有至少99％同一性的多核苷酸是最高度优选的。所述多核苷酸可以插入合适的质粒或重组微生物载体，并且用于免疫(参见例如Wolff et.al.，Science247：1465-1468(1990)；Corr et.al.，J.Exp.Med.184：1555-1560(1996)；Doe et.al.，Proc.Natl.Acad.Sci.93：8578-8583(1996))。

本发明也提供了编码本发明的前述蛋白的核酸和它们在医学中的用途。在一种优选实施方案中，本发明的分离的多核苷酸可以是单链(编码或反义)或双链的，并且可以是DNA(基因组、cDNA或合成)或RNA分子。其它的编码或非编码序列可能但不是必须存在于本发明的多核苷酸中。在其它相关实施方案中，本发明提供了与图2中公开的序列具有显著同一性的多核苷酸变体；采用此处描述的方法(如采用标准参数的BLAST分析)与本发明的多核苷酸序列相比具有至少75％序列同一性，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性的多核苷酸。在相关实施方案中，本发明的分离的多核苷酸将包含编码在图1的序列的全长上与图1的氨基酸序列具有至少90％，优选95％和更高同一性的多肽的核苷酸序列；或与所述分离的多核苷酸互补的核苷酸序列。

本发明也涉及与上述所有多核苷酸互补的多核苷酸的用途。

本发明也提供了本发明的多核苷酸的片段的用途，当给予受试者时，所述片段与图1的多核苷酸具有相同的免疫原性特征。

本发明也提供了编码此处定义的图1的蛋白的免疫原性片段的多核苷酸的用途。也考虑具有图2所示多核苷酸编码的多肽序列的免疫原性活性水平的至少约50％，优选至少约70％，更优选至少约90％的免疫原性活性水平的片段的用途。

用于本发明的多肽片段优选包含至少约5、10、15、20、25、50或100或更多个连续氨基酸，包括此处所述多肽组分的所有中间长度，如上文列出的那些。

可以用标准克隆和筛选技术，从来源于人肿瘤前或肿瘤组织(如肺)的细胞中的mRNA的cDNA文库获得用于本发明的多核苷酸(例如Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2^ndEd.，Cold Spring harbor Laboratory Press，Cold Spring harbor，N.Y. (1989))。本发明的多核苷酸也可以从天然来源如基因组DNA文库获得，或可以用公知和可商购的技术合成。

存在一些本领域技术人员可获得并且公知的方法来获得全长cDNAs或延伸短cDNAs，例如基于cDNA末端快速扩增法(RACE)的那些方法(参见例如Frohman et al.，PNAS USA85，8998-9002，1988)。最近对该技术的改进，例如Marathon^TM技术(ClontechLaboratories Inc.)，显著简化了对更长cDNAs的检索。在Marathon^TM技术中，从提取自选择的组织的mRNA制备cDNAs，并且在每个末端连接上“衔接子”序列。然后，进行核酸扩增(PCR)，以便用基因特异性和衔接子特异性寡核苷酸引物的组合扩增cDNA的“丢失的”5’末端。然后，用“嵌套的”引物，即设计用于在扩增的产物内退火的引物(典型是在衔接子序列中的更3’处退火的衔接子特异性引物和在已知基因序列的更5’处退火的基因特异性引物)重复PCR反应。然后可以通过DNA测序分析该反应的产物，通过将产物直接连接于存在的cDNA而构建全长cDNA，以得到完整序列，或用关于设计5’引物的新序列信息进行独立的全长PCR。

包含所述DNA的载体、用所述载体转化的宿主和按照下文表达的它们的截短或杂合蛋白都形成本发明的部分。

表达载体也可以是重组活微生物，如病毒或细菌。可以将感兴趣的基因插入活重组病毒或细菌的基因组。用该活载体进行接种和体内感染，将导致抗原的体内表达和免疫应答的诱导。

因此，在某些实施方案中，使用多种已知的基于病毒的系统的任何一种将编码用于本发明的免疫原性多肽的多核苷酸导入到适合的哺乳动物宿主细胞中用于表达。在一个说明性的实施方式中，逆转录病毒提供了基因递送系统的方便和有效的平台。编码用于本发明的多肽的选定核苷酸序列可以使用本领域已知的技术插入到载体中，并包装到逆转录病毒颗粒中。然后能分离重组病毒并递送给受试者。已经描述了许多说明性的逆转录病毒系统(例如，美国专利No.5,219,740；Miller and Rosman(1989)Bio Techniques7：980-990；Miller，A.D.(1990)Human Gene Therapy1：5-14；Scarpa et al.(1991)Virology180：849-852；Burns et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：8033-8037和Boris-Lawrie and Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop. 3：102-109。

此外，还已经描述了许多说明性的基于腺病毒的系统。与整合到宿主基因组中的逆转录病毒不同，腺病毒存留在染色体外，因而使与插入诱变有关的风险最小化(Haj-Ahmad and Graham(1986)J.Virol.57：267-274；Bett et al.(1993)J.Virol.67：5911-5921；Mittereder etal.(1994)Human Gene Therapy5：717-729；Seth et al.(1994)J.Virol.68：933-940；Barr et al.(1994)Gene Therapy1：51-58；Berkner，K.L.(1988)BioTechniques6：616-629；and Rich et al.(1993)HumanGene Therapy4：461-476)。

也已经开发出各种腺病毒相关病毒(AAV)载体系统用于多核苷酸递送。使用本领域公知的技术可以容易地构建AAV载体。参见，例如，美国专利No.5,173,414和5,139,941；国际公开No.WO92/01070和WO93/03769；Lebkowski et al.(1988)Molec.Cell.Biol.8：3988-3996；Vincent et al.(1990)Vaccines90(Cold Spring HarborLaboratory Press)；Carter，B.J.(1992)Current Opinion inBiotechnology3：533-539；Muzyczka，N.(1992)Current Topics inMicrobiol.and Immunol.158：97-129；Kotin，R.M.(1994)HumanGene Therapy5：793-801；Shelling and Smith(1994)Gene Therapy1：165-169；and Zhou et al.(1994)J.Exp.Med.179：1867-1875。

对于通过基因转移递送编码本发明的多肽的核酸分子有用的其他病毒载体包括那些来源于痘病毒家族的那些，例如牛痘病毒和禽痘病毒。举例来说，表达感兴趣的分子的牛痘病毒重组体可以如下构建。首先将编码多肽的DNA插入到合适的载体中，使得它接近牛痘启动子和侧翼的牛痘DNA序列，例如编码胸苷激酶(TK)的序列。然后这个载体被用于转染同时感染了牛痘的细胞。同源重组用于将牛痘启动子加编码所述目标多肽的基因插入到病毒基因组中。可以通过在存在5-溴脱氧尿核苷的情况下培养所述细胞，并选取对其有抗性的病毒斑块，来选择产生的TK.sup.(-)重组体。

基于牛痘的感染/转染系统可以被方便地用于提供在生物体的宿主细胞中在此描述的一种或多种多肽的可诱导的、瞬时的表达或共表达。在这个特定的系统中，细胞首先在体外用编码噬菌体T7RNA聚合酶的牛痘病毒重组体感染。该聚合酶显示了精确的特异性，仅转录带有T7启动子的模板。在感染之后，将细胞用由T7启动子驱动的多核苷酸或目标多核苷酸转染。在细胞质中表达的、来自牛痘病毒重组体的聚合酶将转染的DNA转录成RNA，然后RNA通过宿主的翻译机制被翻译成多肽。该方法提供了高水平的、瞬时的、细胞质的大量RNA和它的翻译产物的产生。参见，例如ElroyStein and Moss，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87：6743-6747；Fuerst et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83：8122-8126。

做为选择，也可以使用鸟类痘病毒例如禽痘(fowlpox)和雀痘(canarypox)病毒来递送目标编码序列。已知表达来自哺乳动物病原体的免疫原的重组禽痘病毒，当给非禽类物种施用时，给予了保护性免疫。在人类和和其他哺乳动物物种中施用Avipox载体是特别希望的，因为Avipox属的成员仅在易感的禽类物种中生产性复制，因而在哺乳动物细胞中没有传染性。生产重组禽痘病毒的方法是本领域已知的，并应用了遗传重组，在以上关于牛痘病毒的生产中描述了。参见，例如WO91/12882；WO89/03429；和WO92/03545。

许多甲病毒属载体的任何一种也可以被用于递送本发明的多核苷酸组合物，例如那些在美国专利No.5,843,723；6,015,686；6,008,035和6,015,694中描述的。也可以使用某些基于委内端拉马脑炎(VEE)的载体，这些的说明性实例可以在美国专利No.5,505,947和5,643,576中找到。

此外，也可以将分子缀合载体，如Michael et al.J.Biol.Chem.(1993)268：6866-6869and Wagner et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89：6099-6103中描述的腺病毒嵌合载体用于本发明的基因递送。

关于这些和其它公知的基于病毒的送递系统的其它说明性的信息可以参见例如Fisher-Hoch et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：317-321，1989；Flexner et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.569：86-103，1989；Flexner et al.，Vaccine8：17-21，1990；U.S.Patent Nos.4,603,112，4,769,330，and5,017,487；WO89/01973；U.S.Patent No.4,777,127；GB2,200,651；EP0,345,242；WO91/02805；Berkner，Biotechniques6：616-627，1988；Rosenfeld et al.，Science252：431-434，1991；Kolls et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：215-219，1994；Kass-Eisler et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：11498-11502，1993；Guzman etal.，Circulation88：2838-2848，1993；和Guzman et al.，Cir.Res.73：1202-1207，1993。

上文描述的重组活微生物可以是有毒的或以各种方式减毒的，以获得活疫苗。所述活疫苗也形成本发明的部分。

在某些实施方案中，可以将多核苷酸整合到靶细胞的基因组中。该整合可以是通过同源重组发生在特异性的位置和方向(基因替代)和可以在随机、非特异性的位置整合(基因增强)。在进一步的实施方案中，多核苷酸可以稳定维持在细胞中，作为DNA的独立的附加片段。所述多核苷酸片段或“附加体”编码足够独立于宿主细胞周期而维持和复制，或与宿主细胞周期同步维持和复制的序列。将表达构建体递送到细胞和多核苷酸在细胞中维持的方式不依赖于采用的构建体的表达。

在本发明的另一种实施方案中，作为“裸”DNA施用/递送本发明的多核苷酸，例如在Ulmer et al.，Science259：1745-1749，1993中描述的和Cohen，Science259：1691-1692，1993综述的。通过将DNA包被在生物可降解的珠中可以增加裸DNA的摄取，所述生物可降解的珠被有效地转运到细胞中。

在另一种实施方案中，可以用粒子轰击方法递送本发明的组合物，很多这样的方法已经描述过。在一个说明性的实例中，用例如Powderject Pharmaceuticals PLC(Oxford，UK)和PowderjectVaccines Inc.(Madison，WI)制造的那些装置可以实现气体驱动的粒子加速，这一点的一些实例在美国专利No.5,846,796；6,010,478；5,865,796；5,584,807；和EP Patent No.0500799中描述了。这种方法提供了一种无针的递送方法，其中微观粒子，例如多核苷酸或多肽粒子的干粉制剂在手持装置产生的氦气喷射内被加速到高速，推动所述粒子进入目标靶组织。

在相关的实施方案中，对于气体驱动的无针注射本发明的组合物有用的其他装置和方法包括Bioject，Inc.(Portland，OR)提供的那些，其某些实例在美国专利No.4,790,824；5,064,413；5,312,335；5,383,851；5,399,163；5,520,639和5,993,412中描述。

疫苗

在优选实施方案中，本发明的免疫原性组合物与药学可接受的赋形剂相混合，更优选与佐剂混合以形成疫苗。

本发明的疫苗优选被佐剂化。合适的佐剂包括铝盐诸如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝，但是也可以是钙盐、镁盐、铁盐或锌盐，或者可以是酰化酪氨酸或酰化糖、阳离子或阴离子衍生多糖或聚磷腈的不溶悬浮液。

优选所选择的佐剂是TH1或TH2型应答的优先诱导物。高水平的Th1型细胞因子倾向于帮助对特定抗原的细胞介导免疫应答的诱导，而高水平的Th2型细胞因子倾向于帮助对抗原的体液免疫应答的诱导。

重要的是要记住，Th1和Th2型免疫应答的区别不是绝对的。实际上每个人都将维持被描述为Th1优势或Th2优势的免疫应答。然而，根据Mosmann和Coffman在鼠CD4+ve T细胞克隆中所描述的(Mosmann，T.R.和Coffman，R.L.(1989)TH1和TH2细胞：淋巴因子分泌的不同模式导致不同的功能性质(TH1and TH2cells：different patterns of lymphokine secretion lead to different functionalproperties).Annual Review of Immunology，7，p145-173)来考虑细胞因子家族经常是方便的。传统上，Th1型应答是与T-淋巴细胞所产生的INF-γ和IL-2细胞因子相关联的。经常与Th1型免疫应答的诱导直接关联的其它细胞因子不是T细胞产生的，诸如IL-12。相反，Th2型应答是与IL-4、IL-5、IL-6、IL-10的分泌相关联的。促进Th1优势应答的合适佐剂体系包括：单磷酰脂A或其衍生物，特别是3-脱氧-酰化单磷酰脂A(3D-MPL)(它的制备参见GB2220211A)；单磷酰脂A的组合，优选3-脱氧-酰化单磷酰脂A加上铝盐(例如磷酸铝或氢氧化铝)或水包油乳剂。在这样的组合中，抗原和3D-MPL被包含在同一微粒结构中，以便能够用于抗原性和免疫刺激性信号的更有效递送。研究已经表明3D-MPL能够进一步增强明矾吸附抗原的免疫原性[Thoelen et al.Vaccine(1998)16：708-14；EP689454-B1]。

增强体系涉及单磷酰脂A与皂苷衍生物的组合，特别是如WO94/00153中披露的QS21和3D-MPL的组合，或者更低反应原性的组合物，其中用胆固醇淬灭了QS21，如WO96/33739中所披露的。WO 95/17210中描述了涉及水包油乳剂中的QS21、3D-MPL和生育酚的特别有效的佐剂制剂，这是优选的制剂。优选地，疫苗额外包含皂苷，更优选QS21。制剂也可包含水包油乳剂和生育酚(WO95/17210)。本发明也提供了生产疫苗制剂的方法，包括将本发明的蛋白质与药学可接受的赋形剂诸如3D-MPL混合在一起。含有未甲基化CpG的寡核苷酸(WO96/02555)也是TH1应答的优先诱导物，适合用于本发明中。

本发明的优选组合物是形成脂质体结构的那些。其中的固醇/免疫学活性的皂苷组分形成ISCOM结构的组合物也构成本发明的方面。

QS21：固醇的比将典型地大约在1:100到1:1的重量比。优选存在过量的固醇，QS21：固醇的比至少1:2w/w。对于人体给药来说，典型地，QS21和固醇将以大约1μg到大约100μg的范围存在于疫苗中，优选每剂量大约10μg到大约50μg。

脂质体优选含有天然脂，例如卵磷脂，优选在室温不结晶的，例如卵黄卵磷脂、二油酰卵磷脂或二月桂基团卵磷脂。脂质体也可含有增加脂质体-QS21结构稳定性的带电荷的脂，因为脂质体是由饱和脂组成的。在这些情况下，带电荷的脂的量优选1-20％w/w，最优选5-10％。固醇与磷脂的比为1-50％(mol/mol)，最优选20-25％。

优选地，本发明的组合物含有MPL(3-脱酰基单磷酰脂A，也称为3D-MPL)。由GB2220211(Ribi)可知，3D-MPL是3型脱氧酰化单磷酰脂A与4、5或6个酰化链的混合物，由Ribi Immunochem，Montana生产。优选形式披露在国际专利申请92/116556中。

本发明合适的组合物是最初制备脂质体时没有MPL、然后加入MPL的那些组合物，优选100nm微粒。因此MPL不包含在囊泡膜内部(称为MPL在外部)。MPL包含在囊泡膜内部的组合物(称为MPL在内部)也构成本发明的方面。抗原可包含在囊泡膜内部或者包含在囊泡膜外部。优选地，可溶性抗原在外部，疏水性或脂化抗原包含在膜的内部或外部。

本发明的疫苗制剂可用于防护或治疗哺乳动物对感染的敏感性，其通过经全身性或粘膜途径给予所述疫苗。这些给药可包括经肌肉内、腹膜内、皮内或皮下途径的注射；或者经粘膜给予口腔/食道、呼吸道、泌尿生殖道。用于肺炎或中耳炎治疗的疫苗鼻内给药是优选的 (因为能够更有效地预防肺炎双球菌的鼻咽递送，从而减弱了在它的最早阶段的感染)。尽管本发明的疫苗可作为单剂量给药，但是其组分也可同时或不同时间一起共同给药(例如肺炎球菌多糖可分开给药，在疫苗的任何细菌蛋白质组分给药的同时或1-2周后给药，以便免疫应答的最佳彼此协调)。对于共同给药来说，可任选Th1佐剂存在于任意或所有的不同给药中，然而优选的是它与疫苗的细菌蛋白质组分结合存在。除了单一途径给药之外，也可使用2种不同的给药途径。例如，多糖可IM(或ID)给药，细菌蛋白质可IN(或ID)给药。此外，本发明的疫苗可以IM给药用于致敏剂，IN给药用于加强剂。

每剂疫苗中的缀合抗原的量选择为在典型疫苗中诱导免疫保护性应答而没有明显的不利副作用的量。这样的量将根据采用的是哪种特定免疫原以及如何呈递它而变化。通常，期望的是每剂将包含0.1-100μg多糖，优选0.1-50μg的多糖缀合物，优选0.1-10μg，更优选1-10μg，其中1到5μg是更优选的范围。

疫苗中的蛋白质抗原含量将典型地在1-100μg的范围，优选5-50μg的范围，最典型地在5-25μg的范围。在初次疫苗接种之后，受试者可接受一次或几次适当间隔的加强免疫。

疫苗制备一般地描述于Vaccine Design(“亚基和佐剂方法”(“Thesubunit and adjuvant approach”)(eds Powell M.F.&NewmanM.J.)(1995)Plenum Press New York)中。在脂质体中的胶囊化描述于Fullerton的美国专利4,235,877中。

本发明的疫苗可保存在溶液中或者冻干。优选地，在存在糖诸如蔗糖、海藻糖或乳糖的情况下冻干溶液。还进一步优选的是，将它们冻干，在使用之前当场再生。冻干可形成更稳定的组合物(疫苗)，可能在存在3D-MPL且缺少铝基佐剂的情况下产生更高的抗体滴度。

抗体和被动免疫

本发明的另一方面是制备用于预防或治疗葡萄球菌感染的免疫球蛋白的方法，包括用本发明的疫苗免疫受体并从受体分离免疫球蛋白的步骤。由该方法制备的免疫球蛋白是本发明进一步的方面。包含本发明的免疫球蛋白和药学可接受载体的药物组合物是本发明进一步的方面，其可用在治疗或预防葡萄球菌疾病的药物的生产中。本发明进一步的方面是用于治疗或预防葡萄球菌感染的方法，包括给予患者有效量的本发明的药物制剂的步骤。

用于多克隆抗体生产的接种物典型地是通过将抗原性组合物分散在生理相容性稀释剂诸如盐水或其它合适用于人体用途的佐剂中以形成水溶性组合物而制备的。将免疫刺激量的接种物给予哺乳动物，然后将接种过的哺乳动物维持足够时间以便抗原性组合物诱导保护性抗体。

可通过公知技术诸如亲合层析在期望的程度上分离抗体(Harlow和Lane Antibodies；a laboratory manual1988)。

抗体可包括来自各种常用动物的抗血清，例如山羊、灵长类、驴、猪、马、豚鼠、大鼠或人。从动物取血，回收血清。

根据本发明生产的免疫球蛋白可包括完整抗体、抗体片段或亚片段。抗体可以是任何类型的完整免疫球蛋白，例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE、具有针对本发明的两种或多种抗原的双特异性的嵌合抗体或杂交抗体。它们也可以是片段，例如F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv等等，包括杂交片段。免疫球蛋白也包括天然的、合成的或遗传工程化的蛋白质，它们象抗体一样通过结合到特定抗原上形成复合物而起作用。

本发明的疫苗可被给予受体，然后该受体作为免疫球蛋白源，是对来自特定疫苗的攻击的应答而产生的。这样，治疗过的受试者将提供血浆，从该血浆中经常规的血浆分级方法将获得超免疫球蛋白。超免疫球蛋白将被给予另一受试者以便给予抗葡萄球菌感染的抗性或者治疗葡萄球菌感染。本发明的超免疫球蛋白特别适用于治疗或预防婴儿、免疫受损个体中的葡萄球菌疾病，或者在需要治疗时而没有时间给该个体针对疫苗接种的应答产生抗体。

本发明的另外方面是药物组合物，其包含两种或多种针对本发明免疫原性组合物的至少两种成分有反应的单克隆抗体(或其片段；优选人抗体或人源化抗体)，可用于治疗或预防革兰氏阳性菌引起的感染，优选葡萄球菌，更优选金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌。

这样的药物组合物包含可以是任何类型的完整免疫球蛋白的单克隆抗体，例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE、具有针对本发明的两种或多种抗原的特异性的嵌合抗体或杂交抗体。它们也可以是片段，例如F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv等等，包括杂交片段。

制备单克隆抗体的方法是现有技术中公知的，可包括脾细胞与骨髓瘤细胞的融合(Kohler和Milstein1975Nature256；495；Antibodies-a laboratory manual Harlow和Lane1988)。作为选择，单克隆Fv片段可通过筛选合适的噬菌体展示文库而获得(Vaughan TJ et al1998Nature Biotechnology16；535)。单克隆抗体可以通过已知方法人源化或部分人源化。

方法

本发明也包括制备本发明的免疫原性组合物和疫苗的方法。

本发明的优选方法是制备疫苗的方法，包括混合抗原以制备本发明的免疫原性组合物的步骤以及加入药学可接受赋形剂的步骤。

治疗方法

本发明也包括治疗或预防葡萄球菌感染的方法，特别是在医院获得的医源性感染。

本发明的免疫原性组合物或疫苗用于择期手术病例中是特别有利的。这样的患者将预先知道手术日期并能够预先接种疫苗。由于不知道患者是否将暴露于金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌感染，因此优选用如上所述的防护两者的本发明的疫苗进行接种。优选地，等待择期手术的16岁以上成人用本发明的免疫原性组合物和疫苗进行治疗。

用本发明的疫苗接种医护人员也是有利的。

本发明的疫苗制剂可用于防护或治疗哺乳动物对感染的敏感性，其通过经全身性或粘膜途径给予所述疫苗。这些给药可包括经肌肉内、腹膜内、皮内或皮下途径的注射；或者经粘膜给予口腔/食道、呼吸道、泌尿生殖道。

每剂疫苗中的缀合抗原的量选择为在典型疫苗中诱导免疫保护性应答而没有明显的不利副作用的量。这样的量将根据采用的是哪种特定免疫原以及如何呈递它而变化。疫苗的蛋白质含量将典型地在1-100μg的范围，优选5-50μg，最典型地在10-25μg的范围。通常，期望的是每剂将包含0.1-100μg所呈递的多糖，优选0.1-50μg，优选 0.1-10μg，更优选1-10μg，其中1到5μg是最优选的范围。对于特定疫苗来说最佳的量可通过标准研究确定，包括在受试者中的合适免疫应答的观察。在初次疫苗接种之后，受试者可接受一次或几次适当间隔的加强免疫。

尽管本发明的疫苗可通过任何途径给药，但是将所述疫苗给药到皮肤中(ID)构成本发明的一种实施方案。人体皮肤包含外部“角质状的”角质层，称为角质层，它覆盖表皮。在该表皮之下是称为真皮的层，它又覆盖皮下组织。研究人员已经证明，疫苗注射进皮肤中，特别是真皮中，刺激了免疫应答，这也可能与许多另外的优点相关联。用这里描述的疫苗进行的皮内接种构成本发明的优选特征。

皮内注射的常规技术“mantoux方法”包括如下步骤，清洁皮肤，然后用一只手伸展，用窄规针(26-31规格)朝向针上部的斜面以10-15°的角度插入。一旦针的斜面插入，就降低针管，进一步推进，同时提供低压以在皮肤下抬高它。然后极慢地注射液体从而形成皮肤表面上的泡或隆起，接着慢慢抽出针。

更为近来，已经描述了特别地设计来将液体试剂给药到皮肤中或穿过皮肤的设备，例如描述于WO99/34850和EP1092444中的设备，以及描述于例如WO01/13977中的快速注射设备；US5,480,381、US5,599,302、US5,334,144、US5,993,412、US5,649,912、US5,569,189、US5,704,911、US5,383,851、US5,893,397、US5,466,220、US5,339,163、US5,312,335、US5,503,627、US5,064,413、US5,520,639、US4,596,556、US4,790,824、US4,941,880、US4,940,460、WO97/37705和WO97/13537。皮内给予疫苗制剂的作为选择的方法可包括常规注射器和针，或者设计来冲击递送固体疫苗的设备(WO99/27961)，或者皮肤贴(WO97/48440；WO98/28037)；或者施加到皮肤表面上(通过皮肤或经皮的递送WO98/20734；WO98/28037)。

当将本发明的疫苗给药到皮肤时，或者更特别地给药到真皮中时，疫苗是较低的液体体积，特别是在大约0.05ml和0.2ml之间的体积。

本发明的皮肤或经皮疫苗中抗原的含量可以类似于肌肉内疫苗中存在的常规剂量(见上文)。然而，皮肤或经皮疫苗的特征是制剂可以是“低剂量”。因此“低剂量”疫苗中的蛋白质抗原优选存在为仅仅0.1到10μg每剂，优选0.1到5μg每剂；多糖(优选缀合的)抗原可以在0.01-1μg每剂的范围内存在，优选0.01到0.5μg之间的多糖每剂。

如这里使用的，术语“经皮递送”意指将疫苗递送到皮肤中的真皮区域。然而，疫苗将不必全部位于真皮中。真皮是位于距离人体皮肤表面大约1.0和大约2.0mm之间的皮肤层，但是在个体之间以及身体不同部分中存在一定量的变化。通常，可预期的是通过到皮肤表面下1.5mm来到达真皮。真皮的表面是角质层和表皮，下面是皮下层。根据递送模式，疫苗可能最终完全或主要位于真皮中，或者它可能最终分布在表皮和真皮中。

本发明的优选实施方案是预防或治疗葡萄球菌感染或疾病的方法，包括将本发明的免疫原性组合物或疫苗给予有此需要的患者的步骤。

在优选实施方案中，患者是等待择期手术的。

本发明的另一种优选的实施方案是本发明的免疫原性组合物在制备用于治疗或预防葡萄球菌感染或疾病的疫苗中的用途，优选手术后葡萄球菌感染。

术语“葡萄球菌感染”包括由金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌以及能够引起哺乳动物中优选人宿主中感染的其它葡萄球菌菌株所引起的感染。

在每种情况下，发明人都认为这里的术语“包含”、“包括可以任选用“由...组成”替换。

在本专利说明书中引用的所有参考文献或专利申请通过引用被引入这里。

为使本发明可被更好地理解，提供下面的实施例。这些实施例仅仅用于说明目的，不要以任何方式理解为限制本发明的范围。

实施例

实施例1表达重组蛋白质的质粒的构建

A：克隆。

设计在特异于葡萄球菌基因的寡核苷酸中的合适限制性位点允许将PCR产物定向克隆到E.coli表达质粒pET24d或pQE-30中，这样蛋白质就能够表达为在N-或C-末端含有(His)6亲合层析标志的融合蛋白质。

所使用的引物是：α毒素-5’-CGCGGATCCGCAGATTCTGATATTAATATTAAAAC-3’和5’CCCAAGCTTTTAATTTGTCATTTCTTCTTTTTC-3’EbpS-5’-CGCGGATCCGCTGGGTCTAATAATTTTAAAGATG-3’和5’CCCAAGCTTTTATGGAATAACGATTTGTTG-3’ClfA-5’-CGCGGATCCAGTGAAAATAGTGTTACGCAATC-3’和5’CCCAAGCTTTTACTCTGGAATTGGTTCAATTTC-3’FnbpA-5’-CGCGGATCCACACAAACAACTGCAACTAACG-3’和5’CCCAAGCTTTTATGCTTTGTGATTCTTTTTCAAAC3’Sbi-5’-CGCGGATCCAACACGCAACAAACTTC-3’和5’GGAACTGCAGTTATTTCCAGAATGATAATAAATTAC-3’SdrC-5’-CGCGGATCCGCAGAACATACGAATGGAG-3’和5’CCCAAGCTTTTATGTTTCTTCTTCGTAGTAGC-3’SdrG-5’-CGCGGATCCGAGGAGAATTCAGTACAAG-3’和5’CCCAAGCTTTTATTCGTCATCATAGTATCCG-3’Ebh-5’-AAAAGTACTCACCACCACCACCACC-3’和5’AAAAGTACTCACTTGATTCATCGCTTCAG-3’Aaa-5’-GCGCGCCATGGCACAAGCTTCTACACAACATAC-3’和5’GCGCGCTCGAGATGGATGAATGCATAGCTAGA-3’IsaA-5’-GCATCCATGGCACCATCACCATCACCACGAAGTAAACGTTGATCAAGC-3’和5’-AGCACTCGAGTTAGAATCCCCAAGCACCTAAACC-3’HarA-5’-GCACCCATGGCAGAAAATACAAATACTTC-3’和5’TTTTCTCGAGCATTTTAGATTGACTAAGTTG-3’ 自溶素葡糖酰胺酶-5’-CAAGTCCCATGGCTGAGACGACACAAGATCAAC-3’和5’-CAGTCTCGAGTTTTACAGCTGTTTTTGGTTG-3’自溶素酰胺酶-5’-AGCTCATATGGCTTATACTGTTACTAAACC-3’和5’GCGCCTCGAGTTTATATTGTGGGATGTCG-3’IsdA-5’-CAAGTCCCATGGCAACAGAAGCTACGAACGCAAC-3’和5’ACCAGTCTCGAGTAATTCTTTAGCTTTAGAGCTTG-3’IsdB-5’-TATTCTCGAGGCTTTGAGTGTGTCCATCATTTG-3’和5’GAAGCCATGGCAGCAGCTGAAGAAACAGGTGG-3’MRPII-5’-GATTACACCATGGTTAAACCTCAAGCGAAA-3’和5’AGGTGTCTCGAGTGCGATTGTAGCTTCATT-3’

首先按照厂商说明使用Top10细菌细胞将PCR产物引入到pGEM-T克隆载体(Novagen)中。制备该中间构建体是为了帮助进一步克隆到表达载体中。通过限制酶分析选择含有DNA插入片段的转化体。消化之后，通过凝胶电泳(Tris-乙酸-EDTA(TAE)缓冲液中的0.8％琼脂糖)分析约20μl反应试样。在凝胶电泳和溴化乙啶染色之后通过UV照射观察DNA片段。将DNA分子大小标准(1Kb梯度，Life Technologies)与测试样品平行电泳，用于估计DNA片段的大小。然后用如厂商(Life Technologies)所建议的合适限制酶将从每种克隆的选定转化体纯化的质粒顺序消化完全。然后使用硅胶基自旋柱纯化已消化的DNA片段，接着用pET24d或pQE-30质粒连接。使用pET24d质粒进行Ebh(H2片段)、AaA、IsdA、IsdB、HarA、Atl-酰胺酶、Atl-葡糖胺、MRP、IsaA的克隆，使用pQE-30质粒进行ClfA、SdrC、SdrE、FnbpA、SdrG/Fbe、α毒素和Sbi的克隆。

B：表达载体的生产。

为制备用于连接的表达质粒pET24d或pQE-30，用合适的限制酶同样消化完全。使用大约为所制备载体5倍摩尔过量的消化片段来进行连接反应。使用本领域公知的方法，用T4DNA连接酶(约2.0单位/反应，Life Technologies)进行标准的约20μl的连接反应(约16℃，约16小时)。根据本领域公知方法使用连接试样(约5μl)转化M15(pREP4)或BT21::DE3电感受态细胞。在约1.0ml的LB肉汤培养基中于37℃经约2-3小时生长期后，将转化细胞置于含有氨苄青霉素(100μg/ml)和/或卡那霉素(30μg/ml)的LB琼脂平板上。在选择中包括抗生素。将平板在37℃下培养约16小时。用无菌牙签挑取单独的ApR/KanR克隆，用于“补充”接种新鲜的LB ApR/KanR平板以及约1.0ml LB Ap/Kan肉汤培养基。补充平板和肉汤培养基两者都在标准培养器(平板)或振荡水浴中于37℃下培养过夜。采用基于全细胞的PCR分析来证明转化体含有DNA插入片段。这里，将约1.0ml过夜LB Ap/Kan肉汤培养基转移到1.5ml聚丙烯管中，在Beckmann微型离心机(约3分钟，室温，约12,000Xg)中经离心收集细胞。将细胞沉淀悬浮在约200μl无菌水中，使用约10μl试样进行约50μl终体积的含有正向和反向扩增引物的PCR反应。将最初的95℃变性步骤增加到3分钟以确保细菌细胞的热破坏和质粒DNA的释放。使用ABI Model9700热循环仪和32循环的三步热扩增程序即95℃、45秒；55-58℃、45秒，72℃、1分钟来从裂解的转化体样品中扩增BASB203片段。在热扩增之后，通过凝胶电泳(Tris-乙酸-EDTA(TAE)缓冲液中的0.8％琼脂糖)分析约20μl反应试样。在凝胶电泳和溴化乙啶染色之后通过UV照射观察DNA片段。将DNA分子大小标准(1Kb梯度，Life Technologies)与测试样品平行电泳，用于估计PCR产物的大小。将产生预期大小的PCR产物的转化体确定为含有蛋白质表达构建体的菌株。然后对含有表达质粒的菌株进行重组蛋白质可诱导表达的分析。

C：PCR阳性转化体的表达分析。

将过夜的种子培养物试样(约1.0ml)接种到含有约25ml LBAp/Kan肉汤的125ml锥形瓶中，在37℃振荡(约250rpm)培养直到培养物浊度达到约0.5的O.D.600，即对数中期(通常大约1.5-2.0小时)。这时，将大约一半培养物(约12.5ml)转移到第二个125ml瓶中，通过加入IPTG(制备在无菌水中的1.0M原液，Sigma)到1.0mM的终浓度来诱导重组蛋白质的表达。IPTG诱导的和没有诱导的培养物在37℃下继续振荡培养另外的约4小时。在诱导期之后移出诱导的和没有诱导的培养物的样品(约1.0ml)，在微型离心机中于室温离心约3分钟来收集细胞。将单独的细胞沉淀悬浮在约50μl无菌水中，然后与等体积的含有2-巯基乙醇的2X Laemelli SDS-PAGE样品缓冲液混合，置于沸水浴中约3分钟变性蛋白质。将等体积(约15μl)的未加工的IPTG诱导和没有诱导的细胞裂解物加样到双份12％Tris/甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶(1mm厚的Mini胶，Novex)上。将诱导的和没有诱导的裂解物样品与预先染色过的分子量标志(SeeBlue，Novex)一起在常规条件下使用标准SDS/Tris/甘氨酸跑胶缓冲液(BioRad)进行电泳。电泳之后，将一份胶用考马斯亮蓝R250(BioRad)染色，然后脱色以观察新的IPTG可诱导的蛋白质。使用BioRad Mini-Protean II印迹设备和Towbin氏甲醇(20％)转移缓冲液将第二份胶在PVDF膜(0.45微米孔径，Novex)上于4℃电印迹约2小时。根据本领域公知的方法封闭膜并进行抗体温育。首选使用单克隆抗-RGS(His)3抗体，然后使用缀合到HRP(QiaGen)的兔抗小鼠第二抗体来确证重组蛋白质的表达和识别。使用ABT不溶性底物或者使用带有Amersham ECL化学发光系统的Hyperfilm来实现抗-His抗体反应模式的观察。

实施例2：重组蛋白质的生产

使用含有质粒(pQE30)的大肠杆菌M15(pREP4)或者含有质粒pET24d的BL21：：DE3的编码葡萄球菌蛋白质的重组表达菌株来生产用于重组蛋白质纯化的细胞团。

培养基

用于重组蛋白质生产的发酵培养基由含有100μg/ml Ap和/或30μg/ml Km的2X YT肉汤(Difco)组成。以0.25ml/L(消泡剂204，Sigma)加入消泡剂到发酵罐的培养基中。为诱导重组蛋白质的表达，加入IPTG(异丙基β-D-硫代半乳糖苷)到发酵罐中(1mM终浓度)。

重组蛋白质的生产

在天然条件下

以1mM的终浓度加入IPTG，将培养物生长另外的4小时。然后将培养物在6,000rpm离心10分钟，将沉淀重悬浮在包括蛋白酶抑制剂混合物的磷酸盐缓冲液(50mM K2HPO₄，KH₂PO₄pH7)中。使用1500巴的压力将该样品进行French压力裂解(2次)。在15,000rpm离心30分钟后，保留上清液用于进一步纯化，加入NaCl到0.5M。然后将样品加样到50mM K₂HPO₄，KH₂PO₄pH7环境的Ni-NTA树脂(XK16柱Pharmacia，Ni-NTA树脂Qiagen)。加样之后，用缓冲液A(0.2M NaH₂PO₄pH7，0.3M NaCl，10％甘油)漂洗柱。为洗脱结合的蛋白质，使用分步梯度，其中在缓冲液A中加入了不同比例的缓冲液B(0.2M NaH₂PO₄pH7，0.3M NaCl，10％甘油和200mM咪唑)。缓冲液B的比例由10％逐渐增加到100％。纯化后，汇集含有蛋白质的洗脱组分，浓缩，对0.002M KH₂PO₄/K₂HPO₄pH7，0.15MNaCl透析。

使用该方法纯化ClfA、SdrG、IsdA、IsaB、HarA、Atl-葡糖胺和α毒素。

在变性条件下

以1mM的终浓度加入IPTG，将培养物生长另外的4小时。然后将培养物在6,000rpm离心10分钟，将沉淀重悬浮在包括蛋白酶抑制剂混合物的磷酸盐缓冲液(50mM K₂HPO₄，KH₂PO₄pH7)中。使用1500巴的压力将该样品进行French压力裂解(2次)。在15,000rpm离心样品30分钟后，用包括1M尿素的磷酸盐缓冲液漂洗沉淀。在15,000rpm离心30分钟后，在8M尿素、0.1M NaH₂PO₄、0.5M NaCl、0.01M Tris-HCl pH8中重悬浮沉淀，在室温保持过夜。将样品在15000rpm离心20分钟，收集上清液用于进一步纯化。然后将样品加样到8M尿素、0.1M NaH₂PO₄、0.5M NaCl、0.01M Tris-HCl pH8环境的Ni-NTA树脂(XK16柱Pharmacia，Ni-NTA树脂Qiagen)。在流过通道后，用缓冲液A(8M尿素、0.1MNaH₂PO₄、0，5M NaCl、0.01MTris、pH8.0)、缓冲液C(8M尿素、0.1M NaH₂PO₄、0.5M NaCl、0.01MTris、pH6.3)、缓冲液D(8M尿素、0.1M NaH₂PO₄、0.5M NaCl、0.01MTris、pH5.9)和缓冲液E(8M尿素、0.1M NaH₂PO₄、0.5M NaCl、0.01M Tris、pH4.5)连续漂洗柱。在漂洗期间用缓冲液D和E从柱上洗脱重组蛋白质。变性的重组蛋白质可被溶于缺少尿素的溶液中。为此目的，将8M尿素中所含有的变性蛋白质对4M尿素、0.1MNa₂PO₄、0.01M Tris-HCl、pH7.1，2M尿素、0.1M NaH₂PO₄、0.01M Tris-HCl、pH7.1，0.5M精氨酸和0.002M KH₂PO₄/K₂HPO₄pH7.1，0.15M NaCl，0.5M精氨酸连续透析。

该方法用于纯化Ebh(H2片段)、AaA、SdrC、FnbpA、Sbi、Atl-酰胺酶和IsaA。

通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白质。在天然条件(α毒素)下纯化的一种蛋白质和在变性条件(SdrC)下纯化的一种蛋白质的结果示于图3和4中。

实施例3多糖的制备

如Joyce et al2003，Carbohydrate Research338；903-922中所描述的制备PIA(PNAG)。

如Infection and Immunity(1990)58(7)；2367中所描述的从金黄色葡萄球菌提取5型和8型多糖。

活化和偶联化学：

将天然多糖溶于NaCI2M中或水中。估计所有血清型的最佳多糖浓度，在2mg/ml和5mg/ml之间。

从存在于乙腈中的100mg/ml原液中，将CDAP(CDAP/PS比：0.75mg/mg PS)加入到多糖溶液中。1.5分钟后，加入0.2M三乙胺以获得特定的活化pH(pH8.5-10.0)。在该pH下的2分钟期间于25℃进行多糖活化。将载体蛋白质加入到活化的多糖中，其量足以产生1/1的摩尔比，在特定pH下进行偶联反应1小时。

然后，用甘氨酸在25℃淬灭反应30分钟，在4℃过夜。

使用以0.2M NaCI平衡过的Sephacryl500HR凝胶过滤柱经凝胶过滤纯化缀合物。

确定洗脱组分的糖和蛋白质含量。汇集缀合物，在0.22μm灭菌膜上无菌过滤。确定缀合物制剂中的PS/蛋白质比。

表征：

表征每种缀合物的蛋白质和多糖含量。

经间苯二酚测试测定多糖含量，经Lowry测试测定蛋白质含量。通过浓度比确定最终PS/PD比(w/w)。

残留的DNAP含量(ng/μg PS)：

用CDAP活化多糖就在多糖中引入了氰酸酯基团并释放DMAP(4-二甲氨基-嘧啶)。通过在GSK发展和验证的特定分析法确定残留的DMAP含量。

游离多糖含量(％)：

置于4℃下或储存于37℃7天的缀合物的游离多糖含量是根据上清液确定的，所述上清液是与α-载体抗体和饱和硫酸氨温育之后接着离心而获得的。

使用α-PS/α-PS ELISA来定量上清液中的游离多糖。缀合物的缺少也可通过α-载体/α-PS ELISA来控制。

实施例4制剂

佐剂组合物

来自上面实施例的蛋白质可以与葡萄球菌多糖组合单独或一起配制，作为佐剂，制剂可包含3-脱氧-酰化-单磷酰基酯A(3D-MPL)和氢氧化铝的混合物，或者3-脱氧-酰化-单磷酰基酯A(3D-MPL)和磷酸铝的混合物，或者3D-MPL和/或QS21的混合物，任选在油/水乳剂中，任选与胆固醇或铝盐单独配制，优选磷酸铝。

3D-MPL：是革兰氏阴性菌明尼苏达沙门氏菌的脂多糖(LPS)的化学脱毒形式。

在GSK Biologicals进行的实验已经显示3D-MPL与各种载体的组合有力地增强了体液型和TH1型细胞免疫。

QS21：是纯化自Quillaja Saponaria Molina树的树皮粗提取物的一种皂苷，它具有强的佐剂活性：它活化抗原特异性的淋巴细胞增殖以及对几种抗原的CTL。

含有3D-MPL和明矾的有本发明抗原的疫苗可按照WO93/19780或92/16231中所描述的类似方式制备。

在GSK Biologicals进行的实验已经证明了3D-MPL和QS21的组合在诱导体液型和TH1型细胞免疫应答方面的明显协同效应。含有这样抗原的疫苗描述于US5750110中。

油/水乳剂由2种油(生育酚和角鲨烯)和含有吐温80作为乳化剂的PBS所组成。乳剂包含5％角鲨烯、5％生育酚、0.4％吐温80，具有180nm的平均粒径，被称为SB62(见WO95/17210)。

在GSK Biologicals进行的实验已经证明了该O/W乳剂添加MPL/QS21就进一步增加了它们的免疫刺激性。

乳剂SB62(2倍浓度)的制备

将吐温80溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中产生2％PBS溶液。为提供100ml两倍浓度乳剂，将5g的DLα生育酚和5ml的角鲨烯进行涡旋以彻底混合。加入90ml的PBS/吐温溶液，彻底混合。然后将所得溶液通过注射器，最后通过使用微流控机微流化。所得油滴具有大约180nm的大小。

实施例5

动物实验。

8到10周龄的雌性CD-1小鼠由Charles River Laboratories，Kingston，Mass获得。对于致死率研究来说，用CSA平板上培养的金黄色葡萄球菌的连续稀释物腹膜内(i.p.)攻击五组9到11个CD-1小鼠。接种物数量在约10¹⁰到10⁸CFU/小鼠的范围。按天评估死亡率3天。通过使用剂量-应答关系的概率单位模型估计50％致死剂量(LD₅₀)。通过似然比检验测试普通LD₅₀的虚假设。通过用约2x10⁶CFU/小鼠经静脉(i.v.)途径或者用约2x10⁷CFU/小鼠经i.p.途径攻击8到20个小鼠的组来引起亚致死的菌血症。接种后，在特定时间从尾部将分开的动物组放血，通过在带有5％绵羊血(Becton DickinsonMicrobiology Systems)的胰蛋白酶水解的大豆琼脂平板上重复进行定量平板计数两次来评估菌血症水平。用不配对的Stutent氏t检验的Welch修正来确定统计显著性。

实施例6

确定不同哺乳动物中的抗体应答的一般方法

通过ELISA测试血清的针对葡萄球菌多糖的IgG抗体。简要地说，将来自ATCC(Rockville，Md，20852)的纯化荚膜多糖以磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的25μg/ml浓度包被在高结合性的微量滴定板(Nunc Maxisorp)上于4℃过夜。用10％胎牛血清(FCS)于37℃封闭平板1小时。用20μg/ml细胞壁多糖(Statens Serum Institute，Copenhagen)和10％FCS在室温预孵育血清样品30分钟以中和针对该抗原的抗体。然后将样品在微量平板上稀释两倍于PBS中的10％FCS中，在室温搅拌平衡1小时。漂洗之后，用1:4000稀释于PBS中的10％FCS中的过氧化物酶标记的抗人IgG Fc单克隆抗体(HP6043-HRP，Stratech Scientific Ltd)在室温搅拌平衡微量平板1小时。使用1:5000的Jackson ImmunoLaboratories Inc.过氧化物酶-缀合的AffiniPure山羊抗-大鼠IgG(H+L)(代码112-035-003)进行ELISA来测定大鼠IgG。使用SoftMax Pro的逻辑对数比较对每种血清型的标准血清进行滴定曲线鉴定。用于包被ELISA平板的多糖浓度是10-20μg/ml。在每10ml的pH4.5的0.1M柠檬酸盐缓冲液中使用4mg OPD(Sigma)加上14μl H₂O₂在室温于暗处显影颜色15分钟。用50μlHCl终止反应，在490nm相对于650nm读取光密度。使用由SoftMax Pro软件计算的4-参数的逻辑对数方程通过参照校准曲线模型的滴定点来确定IgG浓度。

测定针对葡萄球菌多糖的鼠和大鼠IgG的ELISA是类似的，除了下面的例外。采用Jackson ImmunoLaboratories Inc.过氧化物酶缀合的affiniPure山羊抗小鼠IgG(H+L)和AffiniPure山羊抗大鼠IgG(H+L)来检测结合的IgG。

HP6043-HRP与人和恒河猴纯化IgG同样地反应，所以将该试剂用于恒河猴抗血清。

蛋白质ELISA是类似于多糖ELISA进行的，有下面的修改。将蛋白质以2.0μg/ml在PBS中包被过夜。将血清样品稀释在含有10％胎牛血清和0.1％聚乙烯醇的PBS中。使用针对人IgG Fc的Sigma过氧化物酶缀合的山羊亲合纯化抗体(索引A-2290)检测结合的人抗体。

实施例7

调理吞噬作用分析。

按照Xu et al1992Infect.Immun.60；1358所述进行人多形核白细胞(PMN)对金黄色葡萄球菌的体外调理吞噬作用杀死。人PMN是通过在3％葡聚糖T-250中沉淀而从肝素化血液制备的。调理素反应混合物(1ml)含有存在于补充了10％热灭活胎牛血清的RPMI1640培养基中的约10⁶PMN，约10⁸CFU的金黄色葡萄球菌，以及0.1ml的测试血清或IgG制剂。将超免疫的兔血清用作阳性对照，将0.1ml的未免疫的兔血清用作IgG样品的完全来源。将反应混合物在37℃温育，将细菌样品在0、60和120分钟时转移到水中，随后稀释，涂布在胰蛋白酶水解的大豆琼脂平板上，在37℃温育，过夜温育后用于细菌计数。

实施例8

葡萄球菌蛋白质在小鼠和兔中的免疫原性

用纯化的葡萄球菌蛋白质免疫动物以便产生超免疫血清。用Specol为佐剂的每种蛋白质10μg免疫小鼠三次(第0、14和28天)。用Specol为佐剂的每种蛋白质20μg免疫兔三次(第0、21和42天)。收集免疫血清，在抗-蛋白质和抗-已杀死的完整细胞的ELISA中进行评估。

抗-蛋白质ELISA：

将磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的1μg/ml的纯化蛋白质包被在高结合性微量滴定板(Nunc Maxisorp)上于4℃过夜。用PBS-BSA1％在室温搅拌封闭平板30分钟。然后将测试样品1/1000稀释，在室温搅拌温育1小时。漂洗之后，使用在PBS-吐温0.05％中1:5000稀释的Jackson ImmunoLaboratories Inc.过氧化物酶缀合的affiniPure山羊抗小鼠IgG(H+L)(索引：115-035-003)或AffiniPure山羊抗兔IgG(H+L)(索引：11-035-003)检测结合的鼠或兔抗体。将检测抗体在室温搅拌温育30分钟。使用在每10ml的pH4.5的0.1M柠檬酸盐缓冲液中的4mg OPD(Sigma)+5μl H₂O₂在室温于暗处显影颜色15分钟。用50μl HCI终止反应，在490nm相对于650nm读取光密度。

将Post III的1/1000稀释液的O.D.与用预先免疫的血清所获得的O.D.相比较。

用小鼠和兔血清产生的结果在图5A中。观察到了针对每种抗原的良好血清转化。直接针对SBI的血清的评估减少了，这是由于该蛋白质的Ig结合活性。

抗-已杀死的完整细胞的ELISA：

将磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的20μg/ml的来自金黄色葡萄球菌5型和8型或者表皮葡萄球菌菌株Hay的已杀死的完整细胞(热灭活或甲醛灭活)包被在高结合性微量滴定板(Nunc Maxisorp)上于4℃蒸发过夜。用PBS-BSA1％在室温搅拌封闭平板30分钟。通过加入在PBS-吐温0.05％中稀释的10μg/ml的亲合纯化鸡抗-蛋白质A(ICL索引：CPA-65A-2)接着在室温温育1小时而中和蛋白质A。然后将测试样品在微量平板上由1/10的起始稀释成为稀释两倍于PBS-0.05％中，在室温搅拌温育1小时。漂洗之后，使用在PBS-吐温0.05％中1:5000稀释的Jackson ImmunoLaboratories Inc.过氧化物酶缀合的affiniPure山羊抗小鼠IgG(H+L)(索引：115-035-003)或AffiniPure山羊抗兔IgG(H+L)(索引：11-035-003)检测结合的鼠或兔抗体。将检测抗体温育30分钟。使用在每10ml的pH4.5的0.1M柠檬酸盐缓冲液中的4mg OPD(Sigma)+5μl H₂O₂在室温于暗处显影颜色15分钟。用50μl HCl终止反应，在490nm相对于650nm读取光密度。

应当注意的是，蛋白质在葡萄球菌中的表达水平将根据培养条件而变化。因此阴性结果可能反映了不正确的培养条件选择而不是缺少免疫原性。

使用小鼠血清的结果示于表5中，一些图示于图6中。用针对SdrC、FnbpA、Ebh、Sbi和IsaA的血清观察到了金黄色葡萄球菌菌株5的微弱识别。只有用针对Sbi的血清才观察到金黄色葡萄球菌菌株8的识别。用针对Atl酰胺酶、MRP、IsdA、IsaA、Ebh、Aaa和Sbi的血清观察到了表皮葡萄球菌Hay的微弱识别。

使用兔血清产生的结果选择性示于图7中，并总结在表6中。用 IsaA和IsdB观察到了三种菌株的非常良好的识别。用HarA观察到了三种菌株的微弱识别，即使动物只接受一次注射而不是用于其它蛋白质的三次注射。

表5

蛋白质名称	对SA5的反应	对SA8的反应	对SE Hay的反应
				IsaA	(+)	(+)	(+)
ClfA	-	(+)	(+)
				Atl酰胺酶	-	-	++
SdrG	-	-	-
				葡糖酰胺酶	-	-	-
IsdA	-	-	++
				α毒素	-	-	-
SrdC	++	(+)	-
				Ebh	+	-	+
AaA		-	++
				MRP		-	++
Sbi	++	++	+++
				FnbpA	+	+	(+)

[0492] 表6

蛋白质名称	对SA5的反应	对SA8的反应	对SE Hay的反应
				IsaA	+++	+++	+++
ClfA	+	++	++
				Atl酰胺酶	-	++	+
IsdB	+++	+++	+++
				SdrG	+	+	+
葡糖酰胺酶	-	-	-
				HarA(1次注射)	+	+	+
IsdA	-	-	-
				α毒素	-	-	+
SrdC	-	-	-
				Ebh	-	+	-
AaA	-	-	-
				MRP	-	-	++
Sbi	-	+++	--
				FnbpA	-	++	++

实施例9

葡萄球菌蛋白组合在鼻菌落增殖模型中的功效。

用八种葡萄球菌抗原的组合接种十五组的三只棉鼠，作为对照的五只棉鼠不用抗原处理。这十六组如下：

组1-Atl-葡糖胺、AAA、α毒素、SdrC、SdrG、Ebh、Sbi

组2-Atl-葡糖胺、Atl-酰胺酶、IsdA、IsdB、ClfA、SdrC、Ebh、FnbpA

组3-Atl-葡糖胺、Atl-酰胺酶、HarA、IsdA、MRP、IsdB、AAA、α毒素

组4-Atl-葡糖胺、HarA、IsdA、AAA、ClfA、IsaA、Ebh、Sbi

组5-HarA、MRP、AAA、α毒素、ClfA、SdrC、Ebh、FnbpA

组6-IsdA、IsdB、AAA、α毒素、ClfA、SdrG、Sbi、FnbpA

组7-Atl-酰胺酶、IsdA、MRP、AAA、IsaA、SdrG、Ebh、FnbpA

组8-对照

组9-Atl-葡糖胺、IsdA、MRP、α毒素、IsaA、SdrC、Sbi、FnbpA

组10-Atl-葡糖胺、MRP、IsdB、AAA、ClfA、IsaA、SdrC、SdrG

组11-Atl-酰胺酶、MRP、IsdB、α毒素、ClfA、IsaA、Ebh、Sbi

组12-Atl-葡糖胺、HarA、IsdB、α毒素、IsaA、SdrG、Ebh、FnbpA

组13-Atl-酰胺酶、HarA、IsdB、AAA、IsaA、SdrC、Sbi、FnbpA

组14-Atl-葡糖胺、Atl-酰胺酶、HarA、MRP、ClfA、SdrG、Sbi、FnbpA

组15-Atl-酰胺酶、HarA、IsdA、α毒素、ClfA、IsaA、SdfC、SdrG

组16-HarA、IsdA、MRP、IsdB、SdrC、SdrG、Ebh、Sbi

每种抗原混合物含有与佐剂相混合的3μg的每种抗原，所述佐剂由含有MPL和QS21的脂质体所制备。在实验的第1、14和28天接种棉鼠三次。接种后两周，使用如Kokai-Kun et al(2003)Antimicrob.Agents.Chemother.47；1589-1597中所描述的鼻菌落增殖分析法评估免疫功效。

使用“Design Expert6”软件对数据进行经典的多重线性回归分析。将抗原存在编码为1，抗原不存在为-1。使用模型的公式，确定哪些抗原是产生每个鼻菌落数量大量减少的关键抗原是可能的。

结果

鼻菌落增殖分析的结果示于表7中。对照组具有3.51335的平均对数CFU/鼻，在用葡萄球菌蛋白接种的所有棉鼠组中都能看到鼻菌落增殖的减少。组4、9和13显示出鼻菌落增殖的最大减少，有超过2个对数CFU/鼻的减少。组12和16也得到了良好结果，显示出大约2个对数CFU/鼻的减少。

表7

组	观察到的平均对数CFU/鼻	预计的对数CFU/鼻
			1	1.77527	2.03560
2	2.90435	2.52684
			3	1.96556	2.23033
4	1.27748	1.21872
			5	1.67304	1.93128
6	2.79745	2.98193
			7	2.21481	2.30705
8	3.51355	3.47317
			9	1.22480	1.44080
10	2.03085	1.93204
			11	2.02522	1.81581
12	1.53402	1.70996
			13	1.36063	1.49100
14	2.31201	1.73909
			15	2.22979	1.98223
16	1.58109	1.44004

使用鼻菌落增殖数据的多重线性回归分析来计算抗原混合物中特定抗原的贡献。最终的模型含有七种最好的抗原。这些抗原的结果示于表8中。在蛋白质混合物中，HarA的包含就产生了鼻菌落增殖的最大减少，接着是IsaA、Sbi、SdrC、自溶素-葡糖胺、MRP和Ebh。

表8模型中七种最好抗原的对数CFU/鼻和CFU/鼻比值的差异的影响以及相应的p-值。

抗原	prob>F	估计影响	减少比例	累积影响	累积比例
						HarA	0.033	-0.596	3.9	-0.596	3.9
IsaA	0.046	-0.558	3.6	-1.154	14.3
						Sbi	0.077	-0.491	3.1	-1.645	44.2
SdrC	0.22	-0.337	2.2	-1.982	96.0
						Atl-葡糖胺	0.238	-0.324	2.1	-2.306	202.2
MRP	0.239	-0.323	2.1	-2.629	425.3
						Ebh	0.297	-0.286	1.9	-2.914	821.0

Claims

1.免疫原性组合物，其包含：

a)至少一种葡萄球菌胞外成分结合蛋白或其免疫原性片段，其选自

SdrG或包含从SEQ ID NO：20、21或70连续选取的至少20个氨基酸的其免疫原性片段、

SBI或包含从SEQ ID NO：26连续选取的至少20个氨基酸的其免疫原性片段、

自溶素、

ClfA或包含从SEQ ID NO：30连续选取的至少20个氨基酸的其免疫原性片段、

SdrC或包含从SEQ ID NO：29或69连续选取的至少20个氨基酸的其免疫原性片段、

FnbA或包含从SEQ ID NO：31连续选取的至少20个氨基酸的其免疫原性片段、和

IsaA/PisA或包含从SEQ ID NO：10或11连续选取的至少20个氨基酸的其免疫原性片段；和

b)葡萄球菌转运蛋白IsdB或包含从SEQ ID NO：28连续选取的至少20个氨基酸的其免疫原性片段。

2.权利要求1的免疫原性组合物，包含至少一种来自金黄色葡萄球菌的蛋白或免疫原性片段。

3.权利要求1或2的免疫原性组合物，包含至少一种来自表皮葡萄球菌的蛋白或免疫原性片段。

4.权利要求1-3的任一项的免疫原性组合物，进一步包含PIA多糖或寡糖。

5.权利要求1-4的任一项的免疫原性组合物，进一步包含来自金黄色葡萄球菌的V型和/或VIII型荚膜多糖或寡糖。

6.权利要求1-5的任一项的免疫原性组合物，进一步包含来自表皮葡萄球菌的I型和/或II型和/或III型荚膜多糖或寡糖。

7.权利要求4-6的任一项的免疫原性组合物，其中葡萄球菌荚膜多糖缀合到蛋白质载体上。

8.权利要求7的免疫原性组合物，其中蛋白载体选自破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197、流感嗜血杆菌蛋白D、肺炎球菌溶血素和α类毒素。

9.权利要求1-8的任一项的免疫原性组合物，其能够产生针对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌两者的有效免疫应答。

10.包含权利要求1-9的任一项的免疫原性组合物和药学可接受赋形剂的疫苗。

11.制备疫苗的方法，包括混合抗原以制备权利要求1-9的任一项的免疫原性组合物的步骤以及加入药学可接受赋形剂的步骤。

12.权利要求1-9的任一项的免疫原性组合物在制备用于治疗或预防葡萄球菌感染的疫苗中的用途。

13.包含与权利要求1-9的任一项的免疫原性组合物的至少两种组分具有反应性的两种或更多种单克隆抗体或F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv或其杂交片段的药物组合物，其中所述至少两种组分选自组a)和b)。