CN103045721A

CN103045721A - 解脲脲原体和微小脲原体的荧光定量检测方法

Info

Publication number: CN103045721A
Application number: CN2012101243393A
Authority: CN
Inventors: 赵缜; 刘璐; 平亚芬
Original assignee: SHANGHAI GUOXING MEDICAL INSTRUMENT CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI GUOXING MEDICAL INSTRUMENT CO Ltd
Priority date: 2011-09-23
Filing date: 2012-04-25
Publication date: 2013-04-17
Anticipated expiration: 2032-04-25
Also published as: CN103045721B

Abstract

本发明涉及一种解脲脲原体和微小脲原体的荧光定量检测方法，该方法包括：样品处理和DNA提取；将与解脲脲原体和微小脲原体拓扑异构酶IV DNA互补的寡核苷酸序列作为PCR反应中的正向引物、反向引物和荧光标记探针分别加入两个不同的PCR扩增管中，利用相同的扩增条件同时分别扩增上述两个扩增管中的解脲脲原体和微小脲原体的DNA靶序列；根据检测反应体系中不同荧光信号的变化，通过标准曲线来判断待测样品中是否含有解脲脲原体、微小脲原体，并确定其相应含量。对于解脲脲原体和微小脲原体的鉴定和定量分析，本发明提供的方法具有快速、灵敏、特异性高和成本低的特点。

Description

解脲脲原体和微小脲原体的荧光定量检测方法

技术领域

本发明涉及一种荧光定量检测方法，具体涉及一种解脲脲原体和微小脲原体的荧光定量检测方法。

背景技术

脲原体(Ureaplasma)是从人体中分离的能自身繁殖的13种支原体之一，属硬壁菌门柔膜体纲支原体目支原体科脲原体属。脲原体介于病毒和细菌之间，是在人工培养基上能繁殖的最小的原核细胞型微生物，无细胞壁，能自我复制，呈球杆状，大小为125～250nm，分子量为4.5×10⁸，具高度多形性。脲原体根据分子生物学特征分为两个生物群和14个血清型，两个生物群包括微小脲原体(Ureaplasmaparvum，Up)和解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum，Uu)，14个血清型中，基因组较小的血清型1、3、6、14属于微小脲原体，占脲原体感染的90％～92％；基因组较大的血清型2、4、5、8～13属于解脲脲原体，占脲原体感染的8％～10％。

脲原体两个生物型在人群中的分布及致病性存在差异，常用的脲原体血清学分型方法操作比较繁琐，易出现交叉反应，结果难以准确判断。

因此，为了克服现有技术的缺点和不足，本发明提供一种操作简便、检测效率高的基因定量分析方法。

发明内容

本发明涉及一种解脲脲原体和微小脲原体的荧光定量检测方法，利用荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术，可同时对标本中的解脲脲原体和微小脲原体两种基因进行鉴别与定量分析，获得更为准备的实验结果，该方法对样品需求量少，操作简便，检测效率高。

本发明通过以下技术方案实现：

一种解脲脲原体和微小脲原体的荧光定量检测方法，该方法包括以下步骤：

步骤一，样本处理和DNA提取；

步骤二，将与解脲脲原体的拓扑异构酶IV DNA互补的寡核苷酸序列作为PCR反应中的正向引物、反向引物和荧光标记探针加入一个PCR扩增管中；

步骤三，将与微小脲原体的拓扑异构酶IV DNA互补的寡核苷酸序列作为PCR反应中的正向引物、反向引物和荧光标记探针加入另一个PCR扩增管中；

步骤四，在相同的扩增条件下，同时分别扩增上述两个扩增管中所述解脲脲原体和所述微小脲原体的DNA靶序列；

步骤五，检测所述反应体系中不同荧光信号的变化，通过标准曲线来判断待测样品中是否含有解脲脲原体、微小脲原体或混合感染，并确定其相应含量。

优选的，在所述步骤一中，所述样本处理和DNA提取的具体过程包括：将标本管置于振荡器上振荡，自管壁挤干棉试子，吸取全部液体转至洁净的离心管中，12000rpm/min离心10分钟，去上清，沉淀加入裂解液溶解，37℃保温60min，沸水浴保温5min，酚氯仿抽提法抽提DNA，提取的DNA沉淀溶于TE缓冲液。

优选的，在所述步骤二中，所述正向引物与所述解脲脲原体的拓扑异构酶IV基因对应的靶序列上游位点杂交；所述反向引物与所述解脲脲原体的拓扑异构酶IV基因对应的靶序列下游位点杂交；所述荧光标记探针与所述解脲脲原体的拓扑异构酶IV基因对应靶序列杂交。

优选的，在所述步骤二中，所述荧光标记探针的序列选自SEQ ID No.4所示的序列或其互补序列，或由该序列或其互补序列衍生出的差别不大于3个碱基的核苷酸序列。

优选的，在所述步骤三中，所述正向引物与所述微小脲原体的拓扑异构酶IV基因对应的靶序列上游位点杂交；所述反向引物与所述微小脲原体的拓扑异构酶IV基因对应的靶序列下游位点杂交；所述荧光标记探针与所述微小脲原体的拓扑异构酶IV基因对应靶序列杂交。

优选的，在所述步骤三中，所述荧光标记探针的序列选自SEQ ID No.8所示的序列或其互补序列，或由该序列或其互补序列衍生出的差别不大于3个碱基的核苷酸序列。

优选的，所述荧光标记探针为TaqMan探针，所述探针5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团。进一步优选的，所述荧光报告基团选自FAM、TAT、JOE、ROX、VIC、TAMRA、CY3或CY5，所述荧光淬灭基团选自TAMRA、DABCYL或NFQ。

本发明的有益效果如下：一般荧光定量PCR仅检测脲原体，而没有对它们进行分群鉴定。本发明通过对脲原体的拓扑异构酶IV A亚单位编码基因(ParC)进行比对，发现解脲脲原体中ParC的部分序列在其10个血清型之间同源性为100％，但是与微小脲原体的ParC基因序列同源性仅87％；同样微小脲原体的ParC基因中部分序列在其4个血清型之间同源性为100％，但与解脲脲原体序列同源性仅87％。本发明根据解脲脲原体ParC和微小脲原体ParC的该部分序列分别合成一对引物和荧光标记探针，分别置于两个不同的PCR扩增管中，在相同的扩增条件下(包括变性、退火、延伸和循环扩增)对解脲脲原体和微小脲原体分别进行荧光定量PCR扩增。经对比试验和测序分析，该荧光定量PCR检测方法的解脲脲原体扩增和微小脲原体扩增是分开进行的，解脲脲原体和微小脲原体之间无交叉扩增，而且与其它阴道常见病原菌也无交叉扩增，因此具有良好的特异性。经与脲原体培养进行比较，本发明的检测敏感性高于培养法。本发明操作简便，检测效率高，能够获得准备的实验结果。

附图说明

图1为用解脲脲原体特异性引物和探针扩增的曲线图。

图2为用微小脲原体特异性引物和探针扩增的曲线图。

图3为解脲脲原体阳性质控品和阴性质控品的PCR产物电泳图。

图4为微小脲原体阳性质控品和阴性质控品的PCR产物电泳图。

图5为阴性质控品和其它阴道常见病原菌的PCR产物电泳图。

图6为解脲脲原体标准品的扩增曲线图。

图7为微小脲原体标准品的扩增曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例荧光定量检测解脲脲原体和微小脲原体

步骤一，引物和探针的设计与合成

引物和探针的序列如序列表所示，引物和探针在对应核苷酸序列表中的位置与扩增产物的长度如表1所示。

引物与探针用设计软件设计后合成，引物和探针均为PAGE级纯化。其中微小脲原体探针的5′端标记报告基团FAM，3′端标记淬灭基团TAMRA；解脲脲原体探针的5′端标记报告基团ROX，3′端标记淬灭基团TAMRA。

表1

步骤二，标准品的制备

解脲脲原体和微小脲原体中的靶序列分别经引物扩增，扩增产物经纯化柱纯化后，用T-A克隆连接至质粒载体pGEM-T(Promega Corperation.pGEM-T Easy Vector System试剂盒)，然后用CaCl₂转化法，导入大肠杆菌DH5α，经筛选后，分别构建了解脲脲原体和微小脲原体重组质粒，用于定量PCR扩增中标准品的制备。

步骤三，标本采集与保存

男性：直接用棉签取尿道分泌物，或用细小棉签试子伸入尿道约2-4cm，略捻试子取出分泌物。将分泌物或棉签试子置入无菌玻璃管，加入1ml无菌生理盐水，用无菌棉球或橡皮塞将试管塞紧后，密闭送检。前列腺液或精液同常规标本采集。

女性：阴道用无菌生理盐水棉球洗去宫颈外分泌物，再用无菌棉签试子插入宫颈内，停5秒种后略捻试子采取宫颈分泌物。将棉签试子置入无菌玻璃管，加入1ml无菌生理盐水，用无菌棉球或橡皮塞将试管塞紧后，密闭送检。尿道用无菌生理盐水棉球洗净尿道口，再用无菌棉签试子插入尿道约2cm，略捻试子取出分泌物。将棉签试子置入无菌玻璃管，加入1ml无菌生理盐水，用无菌棉球或橡皮塞将试管塞紧后，密闭送检。

体液：包括脑脊液、胸腹水、尿液等可直接把标本留于无菌管中，密闭送检。

标本可立即用于测试，也可保存于4℃不超过24小时，或保存于-20℃不超过6个月。

步骤四，标本处理和DNA提取

标本管置于振荡器上振荡2-3分钟，自管壁挤干棉试子，吸取全部液体转至洁净的1.5ml离心管中，12000rpm/min离心10分钟，去上清。沉淀加入500μl裂解液(0.5％NP-40、0.5％Tween20、1％SDS、2mg/ml蛋白酶K、50mmol/L Tris-HCl、50mmol/L NaCl、100mmol/LEDTA、pH8.0)溶解，37℃作用60min，沸水浴5min，酚氯仿抽提法抽提DNA，提取的DNA沉淀溶于40μl TE缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0)。

阴性质控品：人上皮细胞标本，取100μl，与标本同样处理。

阳性质控品：解脲脲原体阳性质控品为脲原体血清型标准株血清型4(ATCC 27816)，微小脲原体阳性质控品为脲原体血清型标准株血清型1(ATCC 27813)，培养后灭菌分装，取50μl与标本同样处理。

标准品：解脲脲原体和微小脲原体重组质粒，分别为1×10³拷贝数/ml，1×10⁴拷贝数/ml，1×10⁵拷贝数/ml，1×10⁶拷贝数/ml。直接取5μl进行PCR扩增。

步骤五，配制PCR反应液

按表2所示的组成配制PCR反应液，每次试验必须包括阴性对照、阳性对照和四个标准品。配制完成后，充分混匀，并低速离心上机扩增。

表2

试剂名称	加入体积	终浓度
			10×PCR缓冲液	5μl	1×
MgCl₂	9μl	4.5mmol/L
			dNTP	1μl	200μmol/L
引物	2μl×2	0.2μmol/L
			探针	2μl	0.2μmol/L
Taq酶	0.5μl	2.5U
			H₂O	23.5μl
DNA模板	5μl	1μg

步骤六，扩增程序

设置测定FAM和ROX的荧光检测通道，把PCR扩增管放入ABI7500荧光定量PCR扩增仪。PCR扩增程序如表3所示。

表3

步骤七，结果判断

如图1所示，用解脲脲原体特异性引物和探针扩增的曲线包括解脲脲原体阳性质控品(血清型4)、微小脲原体阳性质控品(血清型1)和其它阴道常见病原菌。这些病原菌包括大肠杆菌(ATCC 25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)、铜绿假单孢菌(ATCC27853)、粪肠球菌(ATCC 29212)、白色念珠菌(ATCC 90028)、人型支原体临床分离株、淋病奈瑟球菌临床分离株。S型曲线为解脲脲原体阳性质控品的扩增结果(阳性)，下方平坦且无规则的曲线是阴性质控品、微小脲原体阳性质控品和其它常见阴道病原菌的扩增结果(阴性)。

如图2所示，用微小脲原体特异性引物和探针扩增的曲线包括微小脲原体阳性质控品、阴性质控品和其它阴道常见病原菌。这些病原菌包括大肠杆菌(ATCC 25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)、铜绿假单孢菌(ATCC 27853)、粪肠球菌(ATCC 29212)、白色念珠菌(ATCC 90028)、人型支原体临床分离株、淋病奈瑟球菌临床分离株、解脲脲原体标准株。S型曲线为微小脲原体阳性质控品的扩增结果(阳性)，下方平坦且无规则的曲线是阴性质控品和其它常见阴道病原菌的扩增结果(阴性)。

解脲脲原体阳性质控品的PCR产物电泳结果如图3所示，所有PCR扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳和EB染色后，紫外灯下观察，出现目的条带者判断为阳性。1和2分别为解脲脲原体阳性质控品和阴性质控品PCR扩增产物的电泳结果，可见解脲脲原体阳性质控品扩增出107bp目的条带，结果为阳性。解脲脲原体阴性质控品未扩增出目的条带，结果为阴性。

微小脲原体阳性质控品的PCR产物电泳结果如图4所示，所有PCR扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳和EB染色后，紫外灯下观察，出现目的条带者判断为阳性。1和2分别为微小脲原体阳性质控品和阴性质控品PCR扩增产物的电泳结果，可见微小脲原体阳性质控品扩增出148bp目的条带，结果为阳性。微小脲原体阴性质控品未扩增出目的条带，结果为阴性。

阴性质控品和其它阴道常见病原菌的PCR产物电泳如图5所示，所有PCR扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳和EB染色后，紫外灯下观察，出现目的条带者判断为阳性。泳道1为大肠杆菌；泳道2为金黄色葡萄球菌；泳道3为铜绿假单孢杆菌；泳道4为粪肠球菌；泳道5为白色念珠菌；泳道6为淋病奈瑟球菌；泳道7为人型支原体；泳道8为阴性质控品。

解脲脲原体标准品的扩增结果如图6所示，其中S型曲线从左到右分别为1×10⁶拷贝数/ml，1×10⁵拷贝数/ml，1×10⁴拷贝数/ml，1×10³拷贝数/ml解脲脲原体标准品的扩增结果。

微小脲原体标准品的扩增结果如图7所示，其中S型曲线从左到右分别为1×10⁶拷贝数/ml，1×10⁵拷贝数/ml，1×10⁴拷贝数/ml，1×10³拷贝数/ml微小脲原体标准品的扩增结果。

ABI7500荧光定量PCR扩增仪扩增结束后，保存检测数据。根据图像调节basel ine的start值介于3～8之间，stop值介于13～18之间，并调节Threshold值，使Std curve窗口下的标准曲线达到最佳(correlation数值介于-0.97～-1之间，correlation数值等同于|r|值)，最后到Reporter窗口下记录仪器自动分析计算出未知标本的数值(Qty-Copies/ml)。

阴性质控品：全部阴性。

阳性质控品和标准品：阳性质控品和标准品的Ct值均应小于40，|r|≥0.97(correlation数值介于-0.97～-1之间，correlation数值等同于|r|值)。以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效，全部试验应重新进行。阳性质控品的PCR扩增曲线如图1和图2所示，标准品的PCR扩增曲线如图6和图7所示。

测定结果的计算：如果Ct值＜40，则实验样品的解脲脲原体或微小脲原体DNA含量(基因拷贝数/ml)＝Qty-Copies/ml，结果为阳性；如果Ct值≥40，则解脲脲原体或微小脲原体DNA含量(基因拷贝数/ml)＜1×10²拷贝数/ml(低于检测下限)，结果为阴性。

步骤八，特异性分析

本发明应用解脲脲原体和微小脲原体荧光定量检测方法对脲原体标准株血清型1(ATCC 27813)、血清型4(ATCC27816)、9株解脲脲原体临床分离株、36株微小脲原体临床分离株和其它阴道常见病原菌，包括大肠杆菌(ATCC 25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC29213)、铜绿假单孢菌(ATCC 27853)、粪肠球菌(ATCC29212)、白色念珠菌(ATCC 90028)，以及人型支原体临床分离株、淋病奈瑟球菌临床分离株进行分析。结果发现解脲脲原体荧光定量PCR反应体系仅仅扩增脲原体标准株血清型4和解脲脲原体临床分离株，对其它病原菌没有扩增；微小脲原体荧光定量PCR反应体系仅仅扩增脲原体标准株血清型1和微小脲原体临床分离株，对其它病原菌没有扩增；9株解脲脲原体临床分离株和36株微小脲原体临床分离株相互之间没有交叉扩增，45株脲原体临床分离株的基因分型与测序结果如表4所示，证明该解脲脲原体和微小脲原体荧光定量检测方法具有高度的特异性。

表4

步骤九，敏感性分析

解脲脲原体和微小脲原体荧光定量检测方法的敏感性均为1×10²拷贝数/ml。本发明对141例标本分别应用解脲脲原体和微小脲原体荧光定量检测方法进行基因定量，同时用脲原体液体培养基(珠海丽珠试剂股份有限公司提供)进行培养。结果PCR扩增阳性125例，阴性16例；脲原体培养阳性112例，阴性29例，基因分型方法的敏感性显著高于脲原体培养，定量PCR检测与脲原体培养结果的对比如表5所示。

表5

Claims

1.一种解脲脲原体和微小脲原体的荧光定量检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤一，样本处理和DNA提取；

2.根据权利要求1所述的荧光定量检测方法，其特征在于，在所述步骤一中，所述样本处理和DNA提取的具体过程包括：将标本管置于振荡器上振荡，自管壁挤干棉试子，吸取全部液体转至洁净的离心管中，12000rpm/min离心10分钟，去上清，沉淀加入裂解液溶解，37℃保温60min，沸水浴保温5min，酚氯仿抽提法抽提DNA，提取的DNA沉淀溶于TE缓冲液。

3.根据权利要求1所述的荧光定量检测方法，其特征在于，在所述步骤二中，所述正向引物与所述解脲脲原体的拓扑异构酶IV基因对应的靶序列上游位点杂交；所述反向引物与所述解脲脲原体的拓扑异构酶IV基因对应的靶序列下游位点杂交；所述荧光标记探针与所述解脲脲原体的拓扑异构酶IV基因对应靶序列杂交。

4.根据权利要求1、2或3所述的荧光定量检测方法，其特征在于，在所述步骤二中，所述荧光标记探针的序列选自SEQ ID No.4所示的序列或其互补序列，或由该序列或其互补序列衍生出的差别不大于3个碱基的核苷酸序列。

5.根据权利要求1所述的荧光定量检测方法，其特征在于，在所述步骤三中，所述正向引物与所述微小脲原体的拓扑异构酶IV基因对应的靶序列上游位点杂交；所述反向引物与所述微小脲原体的拓扑异构酶IV基因对应的靶序列下游位点杂交；所述荧光标记探针与所述微小脲原体的拓扑异构酶IV基因对应靶序列杂交。

6.根据权利要求1、2或5所述的荧光定量检测方法，其特征在于，在所述步骤三中，所述荧光标记探针的序列选自SEQ ID No.8所示的序列或其互补序列，或由该序列或其互补序列衍生出的差别不大于3个碱基的核苷酸序列。

7.根据权利要求1、2、3或5所述的荧光定量检测方法，其特征在于，所述荧光标记探针为TaqMan探针，所述探针5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团。

8.根据权利要求7所述的荧光定量检测方法，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、TAT、JOE、ROX、VIC、TAMRA、CY3或CY5。

9.根据权利要求7所述的荧光定量检测方法，其特征在于，所述荧光淬灭基团选自TAMRA、DABCYL或NFQ。