CN106967839A

CN106967839A - B族链球菌荧光定量pcr检测的引物、探针、试剂盒和方法

Info

Publication number: CN106967839A
Application number: CN201710392750.1A
Authority: CN
Inventors: 龚小鹏; 韩典霖; 杨亮
Original assignee: Jifan Biotechnology (beijing) Co Ltd
Current assignee: Jifan Biotechnology (beijing) Co Ltd
Priority date: 2017-05-27
Filing date: 2017-05-27
Publication date: 2017-07-21

Abstract

本发明公开了一种B族链球菌荧光定量PCR检测的引物、探针、试剂盒和方法，属于细菌检测领域。所述引物和探针包括扩增B族链球菌的引物对GBS‑F和GBS‑R及检测B族链球菌的探针GBS‑P，以及扩增人β‑actin的引物对β‑actin‑F和β‑actin‑R及检测人β‑actin的探针β‑actin‑P；所述试剂盒含有上述引物对和探针。本发明采用的引物对和探针，能特异性同时复合扩增B族链球菌基因和人类β‑actin基因，由于增加了样本采集监控的常染色体内标系统，结果更可靠、准确。

Description

B族链球菌荧光定量PCR检测的引物、探针、试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及细菌检测的装置和方法领域，具体涉及一种B族链球菌荧光定量PCR检测的引物、探针、试剂盒和方法。

背景技术

B族链球菌(group B streptococcus,GBS)是一种寄生于人类泌尿生殖道及下消化道的条件致病菌，健康人群带菌率可达35％。早在20世纪70年代GBS就已经被证实为围产期母婴感染的重要致病菌之一。定植于产妇生殖道的B族链球菌，可在分娩时垂直传播给新生儿，而新生儿GBS感染所引起的新生儿败血症、脑膜炎和肺炎等症致死率极高，并可导致神经系统后遗症。2010年美国疾病预防中心制定了《围产期GBS预防指南》，建议孕妇于妊娠35-37周进行GBS筛查。

目前国内对GBS的筛查有三种方法：

(1)细菌培养法：采用标准细菌培养方法来检测B族链球菌的存在，取样后大约需要18-48小时得到检测结果，比较费时，不能够有效、快速地检测出B族链球菌的存在，且阳性率受到多种因素影响，弊端明显。

(2)免疫学诊断方法：血清学方法不能高通量处理样本。由于窗口期的存在，血清学的诊断存在滞后性，不能准确反映当前是否感染。该方法费时、费力，无法满足快速、早期诊断的要求。

(3)荧光PCR法检测法：荧光PCR法检测不仅耗时短，在灵敏度和特异性上也优于培养法，因此研制出一种使用简单、结果准确的B族链球菌PCR检测试剂具有重要的临床意义。但是该方法与培养法存在一个共同问题，即检测结果受取样误差影响较大，阴道及直肠样本取样操作难度大，取样结果影响到后续的检测结果。取样失败将会引起假阴性的诊断。

发明内容

本发明的目的在于提供一种B族链球菌荧光定量PCR检测的引物、探针、试剂盒和方法，用以解决现有取样误差或取样失败而引起检测假阴性结果的问题。

为实现上述目的，本发明在基于荧光定量PCR检测GBS的同时，增加了人保守基因作为内对照目的基因，设计了β-actin内标，该内标可以从样本采集、到核酸提取以及GBS基因扩增全过程监控实验操作各个环节，使得检测结果更加可靠、稳定。具体地，B族链球菌荧光定量PCR检测引物及对应探针，包括：

扩增B族链球菌的引物对GBS-F和GBS-R及检测B族链球菌的探针GBS-P，所述GBS-F、GBS-R和GBS-P的核苷酸序列分别依次如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:3所示；

以及扩增人β-actin的引物对β-actin-F和β-actin-R及检测人β-actin的探针β-actin-P，所述β-actin-F、β-actin-R和β-actin-P的核苷酸序列分别依次如SEQ ID NO:4～SEQ ID NO:6所示。上述SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6核苷酸序列具体参见表1。

表1 检测B族链球菌和人β-actin的引物和探针

名称	核苷酸序列	SEQ ID NO：
			GBS-F	5’-GAGGCTATTACTAGCGTTGAA-3’	1
GBS-R	5’-GGCTTCTACACGACTACCAAT-3’	2
			GBS-P	5’-CTTCATTGCGTGCCAACCCTGAGACA-3’	3
β-actin-F	5’-TGGCAAGAAAGTGCTCGGTG-3’	4
			β-actin-R	5’-CAGCTTGTCACAGTGCAGCTCA-3’	5
β-actin-P	5’-ATGGCCTGGCTCACCTGGACAAC-3’	6

所述GBS-P和β-actin-P的核苷酸序列5’端分别标记不同的荧光报告集团，所述荧光报告集团选自FAM、HEX、CY3、CY5、JOE、TET或LC RED640中；所述GBS-P和β-actin-P的核苷酸序列的3’端分别标记荧光淬灭集团，所述荧光淬灭集团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3或Dabcy1。

优选的，所述GBS-P核苷酸序列5’端标记FAM荧光报告集团，3’端标记BHQ1荧光淬灭集团；所述探针β-actin-P核苷酸序列5’端标记HEX荧光报告集团，3’标记BHQ1荧光淬灭集团。

本发明还提供了针对上述引物和探针的试剂盒，包括PCR扩增反应液、酶混合液、阳性对照和阴性对照，所述PCR扩增反应液中含有上述扩增B族链球菌的引物对GBS-F和GBS-R及检测B族链球菌的探针GBS-P，以及扩增人β-actin的引物对β-actin-F和β-actin-R及检测人β-actin的探针β-actin-P。所述PCR扩增反应液中还含有进行PCR扩增的其他常规试剂，如PCR反应缓冲液、MgCl₂、dNTPs等；上述试剂为常规组分，可自行配置或购买，也可以全部装配入试剂盒。

所述所述酶混合液包括热启动Taq酶和尿嘧啶-N-糖基化酶。

所述阳性对照含有B族链球菌保守序列，可为含有B族链球菌保守序列的质粒或者为灭活的B族链球菌培养液。所述阴性对照为不含B族链球菌的纯化水或生理盐水。

本发明还提供了一种采用上述试剂盒，进行荧光定量PCR的检测方法，包括以下步骤：

A、提取样本DNA，制备DNA模板；

B、加样：将样本DNA、阳性对照或阴性对照分别对应加入装有PCR扩增反应液和酶混合液的PCR管中，得对应的样本PCR反应体系、阳性PCR反应体系或阴性PCR反应体系；

C、PCR扩增：将步骤B所得样本PCR反应体系、阳性PCR反应体系或阴性PCR反应体系分别反应管置于荧光定量PCR仪上，设置循环参数，进行PCR扩增；

D、PCR反应结束后，根据荧光曲线判断是否感染B族链球菌。

上述技术方案中由于在PCR扩增反应液中增加了人保守基因β-actin(即肌动蛋白)作为内对照目的基因，与B族链球菌基因同时复合扩增。若检测结果中没有任何DNA的存在，则检测不到任何荧光，可能是取样失败或其他操作环节出现问题；若只有人β-actin基因扩增，则为B族链球菌阴性；若有两种荧光同时出现，才是B族链球菌阳性。因此，可以排除B族链球菌假阴性的情况。

本发明的试剂盒和方法具有如下优点：(1)本发明采用荧光定量PCR检测方法，与传统的细菌培养法相比，大幅度缩短了检测时间；与血清学方法比较，排除了既往感染IgG阳性患者带来的假阳性结果；(2)本发明采用的引物对和探针，能特异性同时复合扩增B族链球菌基因和人类β-actin基因，由于增加了样本采集监控的常染色体内标系统，结果更可靠、准确。

附图说明

图1是本发明实施例2的样本扩增曲线，其中横坐标表示循环数，纵坐标表示荧光强度。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 B族链球菌荧光定量PCR检测试剂盒。

本实施例的B族链球菌荧光PCR检测试剂盒，包括PCR扩增反应液、酶混合液、阳性对照和阴性对照。

其中所述PCR扩增反应液主要包括：

①PCR缓冲溶液(PCR Buffer)，由tris-HCl、KCl和纯化水组成提供反应所需的pH值和盐离子环境；

②MgCl₂，提供反应酶的催化剂；

③dNTPs，提供反应过程中DNA链形成所需原料；

④检测B族链球菌和人β-actin的引物对及对应的探针。

如表1所述的引物对GBS-F、GBS-R及探针GBS-P是源于B族链球菌的保守区域的引物和探针；引物对β-actin-F、β-actin-R及β-actin-P是源于人β-actin的保守区域的引物和探针。在GBS-P的5’端标记FAM荧光报告集团，3’端标记BHQ1荧光淬灭集团，在β-actin-P5’端标记HEX荧光报告集团，3’标记BHQ1荧光淬灭集团。上述引物对和探针能特异性同时复合扩增B族链球菌基因和人β-actin基因。

其中所述酶混合液为Taq酶和UNG酶，所述Taq酶为热启动Taq酶，所述UNG酶为尿嘧啶-N-糖基化酶。

所述阳性对照为含有B族链球菌保守序列的质粒或灭活的B族链球菌培养液，其浓度为1000～10000CFU/mL，所述阴性对照为为不含有B族链球菌的纯化水或生理盐水。

实施例2 B族链球菌的检测。

步骤A、提取样本DNA，制备DNA模板。

将来自医院的12例培养检测为阴性，10例培养检测为阳性的肛拭子及阴道拭子样本，按照试剂盒说明书提取核酸，制备DNA模板，本实施例采用的是由济凡生物科技(北京)有限公司提供的FinePure病毒DNA/RNA柱式提取试剂盒，按照试剂盒的说明书进行操作，还可以采用现有技术中其他的DNA提取方法。

步骤B、加样：将步骤A中制备的22个样本DNA以及试剂盒中的阳性对照和阴性对照分别对应加入装有PCR扩增反应液的PCR管中，得对应的样本PCR反应体系、阳性PCR反应体系和阴性PCR反应体系。

本实施例中PCR反应体系的组成参见表2。

表2 PCR反应体系的组成

步骤C、PCR扩增：将步骤B中所得的PCR反应体系的PCR反应管置于荧光定量PCR仪上，设置循环参数，进行PCR扩增，扩增反应程序如表3所述。

表3 扩增反应程序

步骤D、PCR反应结束后，根据荧光曲线判断是否感染B族链球菌，参见图1。

结果判定：若只有人β-actin基因扩增，则为B族链球菌阴性；若有两种荧光同时出现或者只有FAM荧光出现扩增，则是B族链球菌阳性；若两种荧光都没有扩增，则检测结果无效。最终的检测结果如表4所示。

表4 样本1～22的检测结果与培养检测结果的比对

结果分析：通过细菌培养法和荧光定量PCR方法的比较可见，荧光定量PCR方法阳性率更高。

采用本发明的试剂盒和方法，可以对生殖道分泌物和直肠分泌物等未知样本中的B族链球菌-DNA进行快速检测，为诊断B族链球菌感染提供可靠的实验依据。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 济凡生物科技（北京）有限公司

<120> B族链球菌荧光定量PCR检测的引物、探针、试剂盒和方法

<130> 2010

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 1

gaggctatta ctagcgttga a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 2

ggcttctaca cgactaccaa t 21

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 3

cttcattgcg tgccaaccct gagaca 26

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 4

tggcaagaaa gtgctcggtg 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 5

cagcttgtca cagtgcagct ca 22

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 6

atggcctggc tcacctggac aac 23

Claims

1.一种B族链球菌荧光定量PCR检测的引物及探针，其特征在于，所述引物及对应探针包括：

以及扩增人β-actin的引物对β-actin-F和β-actin-R及检测人β-actin的探针β-actin-P，所述β-actin-F、β-actin-R和β-actin-P的核苷酸序列分别依次如SEQ ID NO:4～SEQ ID NO:6所示。

2.根据权利要求1所述的B族链球菌荧光定量PCR检测的引物及探针，其特征在于，所述GBS-P和β-actin-P的核苷酸序列5’端分别标记不同的荧光报告集团，所述荧光报告集团选自FAM、HEX、CY3、CY5、JOE、TET或LC RED640中；所述GBS-P和β-actin-P的核苷酸序列的3’端分别标记荧光淬灭集团，所述荧光淬灭集团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3或Dabcy1。

3.根据权利要求2所述的B族链球菌荧光定量PCR检测的引物及探针，其特征在于，所述GBS-P核苷酸序列5’端标记FAM荧光报告集团，3’端标记BHQ1荧光淬灭集团；所述探针β-actin-P核苷酸序列5’端标记HEX荧光报告集团，3’标记BHQ1荧光淬灭集团。

4.一种B族链球菌荧光定量PCR检测的试剂盒，包括PCR扩增反应液、酶混合液、阳性对照和阴性对照，其特征在于，所述PCR扩增反应液中含有如权利要求1～3任一项所述的引物及对应探针。

5.根据权利要求4所述的B族链球菌荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于，检测B族链球菌的引物和探针的配比为GBS-F：GBS-R：GBS-P＝2:2:1；检测人β-actin的引物和探针的配比为β-actin-F：β-actin-R:β-actin-P＝2:2:1。

6.根据权利要求4所述的B族链球菌荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于，所述酶混合液包括热启动Taq酶和尿嘧啶-N-糖基化酶。

7.根据权利要求4所述的B族链球菌荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有B族链球菌保守序列的质粒或灭活的B族链球菌培养液，所述阴性对照为不含B族链球菌的纯化水或生理盐水。

8.一种B族链球菌荧光定量PCR检测的方法，采用权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，包括以下步骤：

A、提取样本DNA，制备DNA模板；

C、PCR扩增：将步骤B所得样本PCR反应体系、阳性PCR反应体系或阴性PCR反应体系分别置于荧光定量PCR仪上，设置循环参数，进行PCR扩增；

D、PCR扩增反应结束后，根据荧光曲线判断是否感染B族链球菌。

9.根据权利要求8所述的B族链球菌荧光定量PCR检测的方法，其特征在于，步骤C中PCR扩增的程序为：

步骤一、预变性95℃5分钟；

步骤二、变形95℃15秒，

步骤三、退火，延伸及荧光采集60℃15秒，

重复步骤二和步骤三，共设置45个循环。