CN101492741A - 一种定量检测猪肺炎支原体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于检测猪肺炎支原体的实时荧光定量PCR引物以及使用其进行定量检测的方法。猪肺炎支原体是猪地方流行性肺炎的主要病原，其极难培养，形态太小不易借助显微镜定量检测，而传统的支原体CCU检测方法和CFU检测方法耗时长，且污染几率高，且培养基、操作方法或判断标准的不同都可能导致检测结果不一致，难以实际应用。本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法利用已知浓度的含目的基因的标准质粒做参照，具有快速、灵敏度高、定量精确的优点，可用于猪肺炎支原体培养物和疫苗半成品的定量或微量检测。

Description

一种定量检测猪肺炎支原体的方法

技术领域

本发明属于分子生物学和病原体定量检测技术领域。具体而言，本发明涉及用于检测猪肺炎支原体的实时荧光定量PCR引物及探针，以及使用其进行定量检测的方法。更具体地说，是对肺炎支原体p110基因设计的实时荧光定量的PCR引物及探针，以及使用其进行定量检测的方法。

背景技术

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是引起猪地方流行性肺炎(SwineEnzootic Pneumoniae，EP)的主要病原。猪地方流行性肺炎在又称猪气喘病，具有高发病率，低死亡率的特点，发病后可出现慢性干咳，生长缓慢，发育迟缓等特点，感染后可引起猪免疫力降低，从而导致其他病原如胸膜肺炎放线杆菌、猪繁殖与呼吸综合征病毒、肺炎巴氏杆菌等混合感染，引发猪呼吸道综合征或者其他疾病，严重危害养猪业的发展。

Mhp分离困难，需要较长时间，且分离效率较低。即使分离成功，Mhp菌体特征不明显，显微镜观察菌体无法得到明确的结果。Mhp的固体菌落直径仅500μm，菌落特征与其他支原体菌落特征区别不明显(毕丁仁，“软皮体纲内霉形体的重新分类及最新命名”，1997年兽医微生物学学术年会论文集，第68-71页)，因此分离培养难以成为Mhp的主要诊断方法。在分子生物学方法得到充分发展前，血清学诊断是Mhp的主要诊断方法，现在仍然被广泛使用，主要有：免疫荧光技术，免疫酶技术，凝集试验，放射免疫酶试验，补体结合试验，间接血凝试验以及ELISA。其中以间接血凝试验、补体结合试验、ELISA和放射免疫酶试验较为常用。

随着分子生物学检测技术的发展，针对Mhp的诊断方法主要集中于DNA水平上的检测，包括核酸探针检测和PCR检测。Stemke等(Molecular and Cellular Probes.1989，3(3)：225-232)将Mhp DNA的EcoR I酶切片断随机克隆后，用重组产物制成探针，该探针虽然在严格杂交条件下对Mhp特异，但易与絮状支原体产生交叉反应，可检测到10pg的DNA，但无法直接检测到病肺中的Mhp DNA。随后，有一系列同位素、地高辛标记的探针被开发出来(AhrensP等，Letters in Applied Microbiology，1991，12(6)：249-253)；Satoshi Futo等，Journal of ClinicalMicrobiology，1992，30(6)：1509-1513；Kwon D等，Veterinary Pathology，1999，36(4)：308-313)。目前核酸探针主要用于基因克隆和克隆产物的鉴定，用于临床病例的检测，其敏感度和特异性尚需要更进一步的发展，而且探针检测步骤复杂。于是，后来发展出了灵敏度更高、操作更为简便的PCR检测方法(Blanchard等，Molecular and cellular probes.1996，10(1)：15-22；Baumeister等，Journal of Clinical Microbiology，1998，36(7)：1984-1988；Sorensen等，VeterinaryMicrobiology，1997，54：23-24)。随着nested PCR方法的出现，PCR检测Mhp的灵敏度和特异性进一步提高，同时临床样品的可检测时期也被延长(Stemke等，Molecular and CellularProbes.1989，3(3)：225-232；Stark等，Applied and Environmental Microbiology，1998，64(2)：543-548；Calasmiglia等，Veterinary Microbiology，2000，76(3)：299-303)。

Real Time PCR即实时监测PCR扩增产物并进行解析的方法，是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术(Montgomery R A等，Cytokine，1997，9(10)：717-726)，又称荧光定量PCR。

Real Time PCR不仅广泛应用于于基因表达解析，还广泛应用于SNP分型解析、物种鉴定、病毒和病原菌的检测、转基因食品的定量分析、导入基因拷贝数的解析等诸多领域。RealTime PCR秉承及发展了普通PCR的快速、高灵敏度检出等优点，同时克服了普通PCR不能准确定量、容易污染等不足。它不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、实时性和准确性等特点(张立国等，生物技术，113(12)：39-40；张蓓，国外医学临床生物化学与检验学分册，2003，24(6)：327-329；蔡刚，国外医学临床生物化学与检验学分册，2003，24(6)：330-332)。

Real Time PCR的原理是利用在PCR反应体系中加入荧光物质，并通过Real Time PCR检测系统对PCR反应进程中的荧光信号强度进行实时监测，最终对实验数据进行分析处理的方法。根据引入荧光信号的方法不同，可将Real Time PCR分为下列几种：荧光嵌合法(SYBRGREEN I法)；Taq Man探针法；杂交探针法；分子信标法(Molecular beacons)；scorpions方法；cycling探针法(张立国等，2003；张蓓，2003；蔡刚，2003；阳成波等，2003年；Takara，2006；王小红，2001；Joseph A.Whelan et al，2003)。目前应用最广泛的是荧光嵌合法和TaqMan探针法。

近年来，国内外开始利用荧光定量PCR技术检测支原体，但目前仅限于Mhp的定性检测，仍难以真正实现Mhp精确定量检测。

本发明人经过大量研究和反复实验，筛选出一对以Mhp p110基因为靶序列的引物p110realF/R及探针，在此基础上建立了一种能够对Mhp精确定量的TaqMan探针荧光PCR检测方法。

发明内容

本发明目的在于提供用于猪肺炎支原体p110基因定量检测用的荧光PCR引物及探针序列，及使用该引物进行定量检测的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：根据已发表在GenBank上的猪肺炎支原体基因组p110(p76)基因序列(ACCESSION No.NC_006360)，应用MegAlign软件分析其基因序列，根据引物和探针的设计原则，利用Primer Expressv2.0软件设计荧光定量PCR引物及探针。

在PCR反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物，目前在荧光定量PCR方法中最广泛使用的TaqMan探针就是运用了这个原理。PCR扩增时在反应体系加入一对引物和一条模板特异性的荧光探针，该探针为一两端标记的寡核苷酸链，5′端标记一个荧光报告基团和3′标记一个荧光淬灭基团，探针完整时5′端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3′端荧光淬灭基团，因此检测不到该探针5′端荧光基团发出的荧光。但在PCR扩增中，模板变性低温退火后，Taq酶在引物的介导下，沿模板向前延伸，Taq酶的5′-3′外切酶活性将早已结合在模板上的探针切割，5′端荧光报告基游离于反应体系中，脱离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光信号。即每有一条DNA链生成，就接收到一个荧光分子，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成对应，常用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX。

本发明提供了用于对猪肺炎支原体培养物半成品进行实时荧光定量PCR检测的引物对及探针，其中所述的引物及探针是特异性针对猪肺炎支原体p110基因的保守区域。

在本发明的方案中，其中所述的特异性地针对猪肺炎支原体p110基因的引物对及探针，其核苷酸序列为：

P110realF：AGGATACAAACTGAGAAACCGAGCTA

P110realR：CAAGACCGAGTGGGTATGACCT

探针：TGGACAGATCGGTGATACAACCCCACA

附图简述

图1图示的是猪肺炎支原体基因组的扩增曲线结果。1，以基因组稀释10倍为模板的扩增曲线；2，以基因组的10^-2为模板的扩增曲线；3，以基因组的10^-3为模板的扩增曲线；4，以基因组的10^-4为模板的扩增曲线；5，以基因组的10^-5为模板的扩增曲线；6，以DDW为模板的扩增曲线；

图2图示的是标准质粒的扩增曲线结果。1，以标准质粒稀释10倍(浓度为10⁶拷贝/μl)为模板的扩增曲线；2，以标准质粒的10^-2(浓度为10⁵拷贝/μl)为模板的扩增曲线；3，以标准质粒的10^-3(浓度为10⁴拷贝/μl)为模板的扩增曲线；4，以标准质粒的10^-4(浓度为10³拷贝/μl)为模板的扩增曲线；5，以标准质粒的10^-5(浓度为10²拷贝/μl)为模板的扩增曲线；6，以标准质粒的10^-6(浓度为10¹拷贝/μl)为模板的扩增曲线；7，以DDW为模板的扩增曲线；

图3图示的是标准质粒的标准曲线结果。横轴表示起始模板浓度(log10)，纵轴表示Ct值。将标准质粒进行10倍梯度稀释，取六个浓度的稀释样品做模板，每个浓度做三组平行样，相关系数＝0.999，扩增效率＝98.5％。

图4图示的是特异性试验结果。M，DL2000plus；1，以口腔支原体基因组为模板的PCR结果；2，以细菌BL21基因组为模板的PCR结果；3，以细菌DH5α基因组为模板的PCR结果；4，以猪鼻支原体基因组为模板的PCR结果；5，以猪肺炎支原体基因组为模板的PCR结果；6，以猪圆环病毒DNA为模板的PCR结果；7，以PRRSV cDNA为模板的PCR结果；8，以标准质粒为模板的PCR结果；9，以DDW为模板的PCR结果；

图5图示的是待检9个样品扩增曲线结果。1，以4号样品基因组为模板的扩增曲线；2，以3号样品基因组为模板的扩增曲线；3，以7号样品基因组为模板的扩增曲线；4，以6号样品基因组为模板的扩增曲线；5，以9号样品基因组为模板的扩增曲线；6，以5号样品基因组为模板的扩增曲线；7，以1号样品基因组为模板的扩增曲线；8，以2号样品基因组为模板的扩增曲线；9，以8号样品基因组为模板的扩增曲线；

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，而决不对本发明的内容和保护范围构成任何限制。

实施例

试剂和设备

蛋白酶K购自MERCK公司；CTAB购自AMRESCO公司；Premix Ex Taq^TM(perfect RealTime PCR)kit购自大连宝生物工程有限公司；其它试剂均为国产分析纯。Real Time PCR仪(iCycler)购自美国BIO-RAD公司；Real Time PCR 8联管购自美国BIO-RAD公司；Real TimePCR 8联管盖子购自美国BIO-RAD公司。

实施例1Mhp TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

本实施例旨在使用引物对p110realF/R及探针进行荧光定量PCR，建立了Mhp TaqMan荧光定量PCR检测方法。

1.1引物和探针的设计和合成

根据已发表在GenBank上的猪肺炎支原体基因组p110(p76)基因序列(ACCESSION No.NC_006360)，利用Primer Express v2.0软件设计下列荧光定量PCR引物及探针。

P110realF：AGGATACAAACTGAGAAACCGAGCTA

P110realR：CAAGACCGAGTGGGTATGACCT

探针：TGGACAGATCGGTGATACAACCCCACA

1.2猪肺炎支原体基因组的提取

1)将1ml Mhp支原体培养物12000rpm室温离心10min，弃上清；

2)向沉淀中加300μl蛋白酶K裂解缓冲体系(10mM Tris-EDTA[pH＝7.5]，0.5％[wt/vol]SDS，100μg/ml蛋白酶K)中，充分悬浮后60℃消化1h；

3)加入5M NaCl 50μl，CTAB(10％[wt/vol]，0.7M NaCl)40μl，混匀后65℃作用10min；

4)加等体积苯酚：氯仿，轻轻混匀，12000rpm 4℃离心5min；

5)小心吸取350μl上层水样到另一空离心管中，加1/10体积的3M NaAC混匀后再加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，4℃放置2h或过夜；

6)12000rpm，4℃离心10min；

7)弃上清，用700μl 75％酒精洗涤沉淀，将离心管倒置于吸水纸上，使酒精彻底干燥；

8)加30μl-50μl灭菌DDW溶解，分装后-20℃保存。

1.3荧光PCR反应体系及反应条件的建立

按下列配制Real Time PCR反应体系(20μl)：

Premix Ex Taq^TM(2×)         10μl

PCR Forward Primer(10μM)    0.4μl

PCR Reverse Primer(10μM)    0.4μl

荧光探针溶液                 0.8μl

DNA                          2μl

DDW                          6.4μl

反应液配好后，瞬时离心，将样品管放入Real-time PCR仪后，按照Premix Ex Taq^TM试剂盒说明书，采用如下条件进行反应：95℃30秒预变性，95℃10秒变性，60℃31秒复性及延伸，变性及复性过程重复共40个循环。根据扩增曲线判定结果。延伸过程中荧光定量PCR仪采集记录490nm波长的荧光信号。

1.4TaqMan Real Time PCR方法的建立

1.4.1Mhp基因组10倍梯度稀释

1)取7个灭菌的1.5ml离心管，编号为1-7，每管加入90μl灭菌DDW；

2)取提纯的Mhp基因组10μl，将其加入1号管，更换移液器枪头；

3)将1号管混匀，取10μl加入2号管，更换移液器枪头；

4)依次类推，至7号管，更换移液器枪头，将7号管混匀；

5)将稀释好的不同浓度的基因组分别分装，-20℃备用。

1.4.2扩增曲线的建立

将CCU为10⁸的猪肺炎支原体培养物按照1.2项方法提基因组，用灭菌DDW将基因组进行10倍梯度稀释，稀释至10^-7。取稀释倍数为10^-2-10^-7的基因组作模板DNA，按照1.3项进行Real Time PCR。根据扩增过程中荧光值的变化，由软件计算出荧光阈值(Thresholdvalue)，并计算出各条曲线的Ct(Cycle threshold)值。以Ct值为横坐标，荧光值为纵坐标，建立荧光定量PCR的扩增曲线。根据扩增曲线形状及Ct值的变化，分析PCR体系的可信性，结果见图1。

1.4.3标准曲线的建立

扩增曲线建立后，根据扩增曲线由软件自动分析计算Ct值；将稀释倍数为10^-7、10^-6、……10^-2的基因组浓度依次规定为10¹拷贝/μl、10²拷贝/μl、……10⁶拷贝/μl；以模板起始浓度的对数值为横轴，以Ct值为纵轴，由软件拟合出标准曲线；根据曲线的相关系数(r²)确定标准曲线的可信度；结合标准曲线的斜率(slope)，由软件或者根据公式计算PCR扩增效率(E)。

计算公式：E＝10^[-1/slope]-1。

由三组扩增曲线得到三组Ct值，由软件拟合出三组标准曲线。相关系数r²反映标准曲线的直线性，理想值应大于0.98，越接近1说明直线性越好，定量越准确。理想的PCR扩增效率应在0.8＜E＜1.2范围，用p110realF/R引物及探针进行TaqMan荧光定量PCR建立标准曲线，相关系数分别为0.999，说明标准曲线的直线性良好。扩增效率分别是87.5％，结果表明引物p110realF/R及探针符合荧光定量PCR技术的要求。

1.5标准质粒的构建

1.5.1引物设计及PCR产物制备

根据已发表在GenBank上的猪肺炎支原体基因组p110基因序列(ACCESSION NO.NC_006360，NC_007332，NC_007295)，结合筛选出的p110realF/R引物，使用DNAStar软件的Primerselect设计引物对：

P110cloneF：GCGGATCCACCAGGTGCATCTTCATC

P110cloneR：GCTCTAGACCGCTGTGGCTAATAGTA

该引物对由上海生物工程公司合成，上述p110realF/R处于该引物对扩增的序列内。以1.2中提取猪肺炎支原体DNA为模板，加引物对P110cloneF/R建立50μl反应体系

灭菌去离子水            33.7μl

10×PCR buffer          5μl

2.5mmol/l dNTP          4μl

rTaq(5U/μl)            0.3μl

P110cloneF(10pmol/μl)  3μl

P110cloneR(10pmol/μl)  3μl

DNA模板                 1μl

PCR反应热循环参数为：95℃预变性5min；95℃变性45秒、55℃退火30秒、72℃延伸1分钟，共30个循环；然后72℃延伸5min。取4μl PCR扩增产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳以5V/cm的电压电泳30min，EB染色20min后，紫外凝胶成像系统下观察结果。

1.5.2重组质粒的制备及鉴定

使用购自全式金公司的EASY PCR purification试剂盒，按照产品说明书进行PCR产物纯化。将回收的PCR产物克隆到pEASY-T1中，连接产物转化DH5α感受态细胞，向管中加入800μl LB培养基，37℃摇床中150rpm摇动培养1h，取200μl菌液涂布于含AMP(100μg/ml)的LB平板上，37℃培养过夜。从平板上随机挑取单菌落，分别接种到5ml LB(AMP⁺，100μg/ml)液体培养基中进行37℃振荡培养10h，采用碱裂解法小量制备质粒DNA，将质粒DNA溶于30μl灭菌TE中，取4μl电泳鉴定，其余-20℃保存。电泳后通过凝胶成像系统观察结果，根据质粒大小初步判断挑选阳性重组质粒。以初步判断为阳性的重组质粒进行PCR扩增，除以重组质粒代替猪肺炎支原体基因组DNA外，PCR反应体系及反应条件同1.5.1。反应结束后，取4μl PCR扩增产物以5V/cm的电压进行琼脂糖凝胶电泳30min，紫外凝胶成像系统下观察结果。将PCR鉴定阳性的重组质粒送交公司测序，将测序结果与GENBANK公布的Mhp p110基因序列进行对比，与公布序列一致的重组质粒为阳性质粒，将构建的含有Mhpp110基因的重组质粒记做标准质粒pEASY-T1-p110。

1.6标准质粒的扩增曲线的建立

将标准质粒进行适度稀释，用紫外分光光度计在260nm波长测定其OD值，结合标准质粒的分子量，计算每μl溶液中质粒拷贝数。

将已计算出拷贝数的标准质粒进行10倍梯度稀释，稀释至10拷贝/μl。取浓度为10⁶-10¹拷贝/μl的标准质粒为模板，p110realF/R为引物，用BIO-RAD icycler荧光定量PCR仪做RealTime PCR，每个浓度做3个平行样，根据结果建立扩增曲线，曲线遵循从高浓度到低浓度的次序排列，每个浓度的三个平行样Ct值差异不显著，如图2所示。

1.7标准质粒的标准曲线的建立

以拷贝数为10⁶-10¹/μl的标准质粒为模板做Real Time PCR，每个浓度同时做三个平行样。反应结束后由软件自动分析荧光阈值，结合扩增曲线计算出Ct值，然后以模板起始浓度的对数值为横轴，以荧光值为纵轴，由软件拟合得到标准曲线，并计算出曲线的相关系数和PCR扩增效率。

将标准质粒进行10倍梯度稀释后作为模板进行PCR，每个浓度做3个平行样，扩增结束后由计算机根据起始模板浓度的对数值和相应的Ct值拟合出标准曲线，标准曲线相关系数r²＝0.999，表明不同梯度定量模板的对数值与Ct值之间呈现良好的线性关系，标准曲线直线性好。经计算，标准曲线扩增效率E＝98.5％，如图3所示。

1.8TaqMan荧光定量PCR方法反应条件的优化

以标准质粒为模板，p110realF/R为引物，选用不同的引物浓度、退火温度、延伸时间进行Real Time PCR反应，根据PCR反应结果，选择最佳Real Time PCR反应条件。

通过多次实验，确定的荧光定量PCR最佳反应条件是：最佳引物终浓度为0.2μmol/l；

PCR反应体系如下(20μl)：

Premix Ex Taq^TM(2×)         10μl

PCR Forward Primer(10μM)    0.4μl

PCR Reverse Primer(10μM)    0.4μl

荧光探针溶液                 0.8μl

DNA                          2μl

DDW                          6.4μl

循环参数95℃3分钟预变性，95℃5秒变性，60℃30秒复性及延伸，变性及复性过程重复共40个循环。

实施例2猪肺炎支原体荧光PCR检测方法的特异性试验

分别实验室常见的实验室常见的基因工程菌(大肠杆菌DH5α株和BL21株)、口腔支原体、以及常与猪肺炎支原体混合感染病原体(猪圆环病毒、PRRSV和猪鼻支原体)为对照样品，同时以标准质粒作为阳性对照，以灭菌DDW作为阴性对照，检验基于猪肺炎支原体基础上的荧光PCR检测方法的特异性。

2.1实验材料

对照用的口腔支原体(Mycoplasma orale)CVCC 379株、猪鼻支原体(Mycoplasmahyorhinis)CVCC 361株均购自中国兽医药品监察所，其他均为实验室保存菌种。

2.2样品前处理

2.2.1病毒DNA的获得

按照Invitrogen公司说明书提取PRRSV RNA。利用Oligo(dt)15Primer(Promega)，按照PROMEGA公司M-MLV Reverse Transcriptase说明书进行反转录，合成的cDNA保存于-20℃，用作PCR模板。PCV利用天泽基因公司的病毒DNAout试剂盒提取DNA，保存于-20℃，用作PCR模板。

2.2.2细菌基因组的获得

按照常规方法复苏基因工程菌株E.coli DH5α、BL21。上述菌株菌液分别各取50μl，用天泽基因公司的细菌基因组out试剂盒提取基因组，保存于-20℃，用作PCR模板。

2.2.3口腔支原体和猪鼻支原体基因组的获得

口腔支原体CVCC 379株和猪鼻支原体CVCC 361株基因组提取方法同1.2。

2.3引物对p110realF/R的特异性试验

取2.2.2中制备的各种细菌基因组、2.2.3中制备的各种支原体基因组、2.2.1中制备的PRRSV cDNA和PCV的DNA、标准质粒及DDW分别模板做PCR。PCR体系(50μl)如下：

灭菌去离子水             31.7μl

10xPCR buffer            5μl

2.5mmol/l dNTP           4μl

rTaq(5U/μl)             0.3μl

p110realF(10pmol/μl)    3μl

p110realR(10pmol/μl)    3μl

DNA模板                  3μl

PCR反应热循环参数为：

95℃预变性      5min

95℃变性        30s

60℃退火        30s

72℃延伸        30s

重复35个循环

72℃延伸        5min

PCR产物各取4μl，在1％的琼脂糖凝胶中以5V/cm的电压电泳30min，通过紫外凝胶成像系统观察结果，结果如图1所示。

从图4可知，阳性对照及以Mhp为模板的泳道5和8在约100bp处出现一特异性条带，与预期大小117bp符合，其余泳道的扩增产物均为引物二聚体。这表明本发明所设计的引物对能够满足特异性检测的需要，并且与检测样品中可能存在的其它微生物不存在交叉干扰现象。

实施例3猪肺炎支原体荧光PCR检测方法的灵敏度试验

将已计算出拷贝数的含目的基因的标准质粒做10倍梯度稀释，稀释至10拷贝/μl。取浓度为10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹拷贝/μl的质粒为模板做Real Time PCR。有产物的最低起始模板浓度即为该Real Time PCR的灵敏度。根据扩增曲线分析，该Real Time PCR方法检测灵敏度为10拷贝/μl或者是20拷贝/20μl反应体系。详见图2。

实施例4荧光PCR方法对培养物中猪支原体的定量检测

4.1待检样品准备

培养三代猪肺炎支原体培养物，每代设有三个平行样，培养48小时后收获，分别记为1-9号样品，收获时立即作测定CCU实验，每天观察变色情况。

得到9个待检样品，按照实施1中所述提取基因组的方法，提取基因组。以9个样品的1000倍稀释液和标准质粒的10倍梯度稀释物为模板，作荧光定量PCR，根据建立的标准曲线，计算待检的样品的拷贝数。

4.2实验结果

9个样品中8号的CCU值为10^-7，其他均为10^-8。8号样品的荧光定量PCR计算的拷贝数为6.52×10⁶，其他为4.8±2.5×10⁷，见图5，实验结果表明建立的荧光定量方法与传统的CCU计数方法有显著的相关性，因此建立的荧光检测方法可以用于猪肺炎支原体培养物的定量检测。

Claims (6)

1.用于对猪肺炎支原体培养物进行实时荧光定量PCR检测的引物对及探针，其中所述的引物对及探针特异性针对猪肺炎支原体的P110基因的保守区域。

2.权利要求1所述的引物对和探针，其中所述引物对及探针的序列为：

P110realF：AGGATACAAACTGAGAAACCGAGCTA

P110realR：CAAGACCGAGTGGGTATGACCT

探针：TGGACAGATCGGTGATACAACCCCACA

3.一种对猪肺炎支原体进行定量检测的实时荧光PCR检测方法，该方法包括下列步骤：

1)菌株的培养；

2)对Mhp的基因组的提取；

3)向提取得基因组样品加入权利要求1所述引物对及探针，以及PCR扩增用的Premix ExTaq^TM(2×)、DDW，得到PCR扩增反应液；

4)将装有PCR扩增反应液的PCR管置于荧光PCR仪上；

5)根据所用的荧光染料类型，选择对应的荧光通道，进行荧光PCR扩增，记录各检测样本的PCR扩增循环数(C_t)；

6)根据各样本的反应C_t值，按照标准曲线判定待检样本中Mhp的拷贝数。

4.权利要求3所述的实时荧光PCR检测方法，该方法使用权利要求2所述的引物对及探针。权利要求3所述的实时荧光PCR检测方法，其中所述的基因组提取包括：

1)将1ml Mhp支原体培养物12000rpm室温离心10min，弃上清；

2)向沉淀中加入300μL蛋白酶K裂解缓冲体系(10mM Tris-EDTA[pH＝7.5]，0.5％[wt/vol]SDS，100μg/ml蛋白酶K)中，充分悬浮后60℃消化1h；

3)加入5M NaCl 50μL，CTAB(10％[wt/vol]，0.7M NaCl)40μL，混匀后65℃作用10min；

4)加等体积苯酚：氯仿，轻轻混匀，12000rpm 4℃离心5min；

5)小心吸取350μL上层水样到另一空离心管中，加1/10体积的3M NaAC混匀后再加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，4℃放置2h或过夜；

6)12000rpm，4℃离心10min；

7)弃上清，用700μL 75％酒精洗涤沉淀，将离心管倒置于吸水纸上，使酒精彻底干燥；

8)加30μL-50μL灭菌DDW溶解，分装后-20℃保存。

5.权利要求3所述的实时荧光PCR检测方法，其中荧光PCR扩增条件为：95℃3分钟预变性，95℃5秒变性，60℃30秒复性及延伸，变性及复性过程重复共40个循环。

6.权利要求1或2所述引物对及探针在用于猪肺炎支原体的检测中的用途。

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