CN102146466B - 检测布鲁氏菌的试剂及复合探针荧光定量pcr检测布鲁氏菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测布鲁氏菌的试剂它包括以下上游引物、下游引物、荧光探针和淬灭探针；上游引物的基因序列为：5′-caagggcaaggtggaagatt-3′；下游引物的基因序列为：5′-ctgcgaccgatttgatgttt-3′；荧光探针的基因序列为：5′-fam-atcgtttccgggtaaagcgtcgcca-P-3′；淬灭探针的基因序列为：5′-cgctttacccggaaacga-Dabcyl-3′。本发明还提供一种利用上述试剂的复合探针荧光定量PCR检测布鲁氏菌的方法。本发明具有操作简便，高效、快速、特异的优点，大大缩短了布鲁氏菌的检测时间，对样本的定量检测只需2小时左右即可完成，对布病的早期诊断具有重要意义。

Description

检测布鲁氏菌的试剂及复合探针荧光定量PCR检测布鲁氏菌的方法

技术领域

本发明涉及检测布鲁氏菌的试剂及布鲁氏菌的检测方法，尤其涉及复合探针布鲁氏菌标识基因进行扩增，进而利用荧光PCR技术检测布鲁氏菌的方法。

背景技术

布鲁氏菌病(布病)由布鲁氏菌引起的人畜共患自然疫源性传染病。布鲁氏菌可感染人类、多种家畜和野生动物，引起发热、流产与不育、慢性关节炎及神经损害。人类感染布病后，由于其病程较长，迁延不愈而导致巨大的经济损失和严重的公共卫生问题。近年来，由于家畜饲养量逐渐增加，产品流通日益频繁，人间和畜间的布病疫情在相当大范围又出现大幅回升。

传染病预防控制的最关键技术环节就是建立病原体检测的实验室诊断方法，能准确、高效地检出与监测病原体。布鲁氏菌的检测目前仍然主要是依靠细菌培养和血清学方法来鉴定。这些方法普遍存在检测时间长，操作繁琐，方法的敏感性差，影响因素较多等不足，不能满足快速准确的需求。传统PCR技术和核酸杂交技术的发现大大的推动了细菌检测技术的发展，但存在容易交叉污染、无法定量分析等缺陷。实时荧光定量PCR技术解决了传统PCR技术的不足，已经成为细菌等微生物快速定量检测的首选技术。定量PCR技术可在同一管内实现DNA的扩增和同步检测，而无需在PCR后进行凝胶电泳分析，具有高效、快速、特异的优点，非常适用于单一病原体的检测。Taqman探针、分子信标、杂交探针(Lightcycler)等用广泛应用于传染病病原体监测、食品安全、卫生检疫等领域中。发展快速、敏感、特异、系统的病原微生物的筛查技术、方法和试剂，发展先进、系统的病原微生物分离和检测方法，可以有效地对传染病的暴发和流行进行早期预警、快速确认，控制新发传染病的口岸传入，并可有助于提高对突发公共卫生事件、暴发疫情和不明原因疾病的快速应急反应和处理能力。

发明内容

本发明的第一个目的在于针对当前常规布鲁氏菌检测方法的不足，提供一种检测布鲁氏菌的试剂，可以用于快速准确地检测布鲁氏菌。为此，本发明采用以下技术方案：它包括以下上游引物、下游引物、荧光探针和淬灭探针；

上游引物的基因序列BRF1为：5′-caagggcaaggtggaagatt-3′，其基因序列如序列表SEQ NO：1所示；

下游引物的基因序列BRR1为：5′-ctgcgaccgatttgatgttt-3′，其基因序列如序列表SEQ NO：2所示；

荧光探针的基因序列FPBR1为：5′-fam-atcgtttccgggtaaagcgtcgcca-P-3′，其基因序列如序列表SEQ NO：3所示；

淬灭探针的基因序列QPBR1为：5′-cgctttacccggaaacga-Dabcyl-3′，其基因序列如序列表SEQ NO：4所示。

本发明另一个目的是提供一种复合探针荧光定量PCR检测布鲁氏菌的方法，可以快速准确地检测布鲁氏菌。为此，本发明采用以下技术方案：

它采用直接水煮法提取布鲁氏菌基因组DNA：取50μl的细菌样品，置于沸水浴中煮沸10分钟，10000×g离心2分钟，取2μl上清作为扩增模板；

所述方法的PCR反应体系为25μl：10mmol/L的Tris-HCl，pH为8.0；50mmol/L的KCl；体积百分比3％甲酰胺；7mmol/L MgCL₂；100μmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP；0.5μmol/L的上述上游引物，0.5μmol/L的上述下游引物，1.5U Taq酶，100nmol/L的上述荧光探针，200nmol/L的上述淬灭探针；PCR反应程序为：预变性95℃3min、95℃5s、扩增的退火温度为54℃30s共40个循环；

所述方法还包括以下检测步骤：提取样本DNA为扩增模板，按上述荧光定量PCR的反应体系及反应程序在实施荧光定量PCR仪上进行扩增，并同时进行阴性对照和阳性对照的扩增，其中阴性对照采用非布鲁氏菌，阳性对照采用布鲁氏菌标准株；反应结束后，将样本循环阈值C(t)与荧光定量PCR标准曲线对照，就得到样本DNA中的靶基因片段拷贝浓度；按照靶基因片段拷贝浓度判断样本中布鲁氏菌的浓度。

本发明相对于传统的布鲁氏菌检测技术，具有操作简便，高效、快速、特异的优点。BCSP31基因编码31KDa的布鲁氏杆菌表面蛋白，具有种属特异性，可作为布鲁氏菌的核酸诊断标志，与整个genebank数据库进行BLAST检索，发现其只对布鲁氏菌上的BCSP31基因序列特异，和其它物种的核酸序列无同源，保证了检测方法的特异性。该方法大大缩短了布鲁氏菌的检测时间，对样本的定量检测只需2小时左右即可完成，对布病的早期诊断具有重要意义。

附图说明

图1a为实施例1中组合1的检测同一模板的实时扩增曲线图，其中，1为ATCC25840的实时扩增曲线，2为B.abortus 2308的实时扩增曲线。

图1b为实施例1中组合2的检测同一模板的实时扩增曲线图，其中，1为ATCC25840的实时扩增曲线，2为B.abortus 2308的实时扩增曲线。

图2实施例2中质粒参考品的灵敏度分析实时扩增图，其中，1为1×10⁶个拷贝/μl的实时扩增曲线，2为1×10⁵个拷贝/μl的实时扩增曲线，3为1×10⁴个拷贝/μl的实时扩增曲线，4为1×10³个拷贝/μl的实时扩增曲线，5为1×10²个拷贝/μl的实时扩增曲线，6为1×10¹个拷贝/μl的实时扩增曲线，7为1×10⁰个拷贝/μl的实时扩增曲线。

图3为本发明实施例2绘制的荧光定量PCR标准曲线。

具体实施方式

实施例1引物与探针的制备

1.靶基因选择

布鲁氏菌细胞表面蛋白31kD(Brucella Cell Surfacial Protein，BCSP31)存在于该菌细胞表面，此蛋白由BCSP31基因编码，具有种属特异性，且高度保守，可作为布鲁氏菌的核酸诊断标志，根据genbank数据库检索，获得该基因序列。

2.PCR引物的设计和筛选

遵循复合探针设计原则，根据BCSP31基因序列，设计了两组引物和探针。

荧光探针5′端标记荧光分子FAM作为报告基团，3′端标记磷酸，以阻断其延伸。淬灭探针的3′端连接一淬灭基团Dabcyl。

为了从两组复合探针及引物组合中筛选出扩增效率高的一个组合，将这些组合进行实时PCR分析，采用羊种布鲁氏菌标准株ATCC25840和牛种布鲁氏菌标准株B.abortus 2308为检测样本，观察它们扩增样品的能力来确定最佳组合。

结果如表1和图1a、图1b所示，采用组合1进行检测时，其检测样本时的CT值较小，而且荧光响应强度值ΔRFU较高，说明该组合扩增效率较高，因此，在后述的所有实验中，均采用这个组合。

表1引物及探针组合对扩增效率的影响

组合1引物和探针的序列如下：

上游引物的基因序列BRF1为：5′-caagggcaaggtggaagatt-3′，其基因序列如序列表SEQ NO：1所示；

下游引物的基因序列BRR1为：5′-ctgcgaccgatttgatgttt-3′，其基因序列如序列表SEQ NO：2所示；

荧光探针的基因序列FPBR1为：5′-fam-atcgtttccgggtaaagcgtcgcca-P-3′，其基因序列如序列表SEQ NO：3所示；

淬灭探针的基因序列QPBR1为：5′-cgctttacccggaaacga-Dabcyl-3，其基因序列如序列表SEQ NO：4所示。

3.检测探针与PCR引物的制备

用于检测布鲁氏菌的寡核苷酸(包括荧光探针、淬灭探针以及PCR引物)的化学合成、标记与纯化使用美国ABI公司的Expedite 8909 DNA合成仪，荧光探针用美国transgenomic公司的荧光素FAM标记，淬灭探针用美国transgenomic公司的Dabcyl淬灭试剂标记。

实施例2，布鲁氏菌的检测

为了考察本发明检测实际应用能力，特制备了布鲁氏菌污染的血液模拟标本，同时设置纯菌作为阳性对照，非布鲁氏菌致病菌作为阴性对照。

1.样品制备

(1).污染血液的制备和处理：定值布鲁氏菌用抗凝血系列稀释，制成浓度为1×10⁶CFU/ml-1×10¹CFU/ml的污染血液样本。取含不同浓度细菌的血液各1ml，12000rpm离心10分钟，弃去上清，加入1ml红细胞裂解液(50mmol/L TrisHCL，25mmol/L KCl，5mmol/LMgCl₂，pH7.5，TKM液)，剧烈振荡混匀2min，12000rpm离心10分钟弃上清，再加TKM液1ml，混匀，12000rpm离心10分钟弃

(2).阴、阳性对照：为了考察该方法检测的特异性，用本方法分析了2株布鲁氏菌阳性特异性参考品(羊种布鲁氏菌和牛种布鲁氏菌)和20株阴性特异性参考品，见表2和表3。检测时设立阳性质控品和阴性质控品。

表2阳性菌株相关信息

表3阴性特异性菌株相关信息

^*ATCC：指美国标准菌库，CMCC：指中国医学菌种保藏中心

2.荧光定量PCR的反应体系及反应程序

荧光PCR反应体系为25μl，经优化后成分如下：10mmol/L的Tris-HCl，pH为8.0；50mmol/L的KCl；3％甲酰胺；7mmol/L MgCl2浓度；100μmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP；0.5μmol/L的上述上游引物，0.5μmol/L的上述下游引物，1.5U Taq酶，100nmol/L的上述荧光探针，200nmol/L的上述淬灭探针。PCR仪的运行参数为：预变性95℃3min。95℃5s、扩增的退火温度为54℃30s，40个循环。

3.标准曲线制备

3.1质粒DNA参考品的制备：通过体外重组的方式将扩增片段插入到PMD18-T载体，并转化大肠杆菌，提取阳性克隆进行测序，将测序正确的克隆，于空气浴摇床37℃振荡培养增菌，培养物用Promega质粒提取试剂盒提取质粒，取样稀释后用紫外分光光度计测定质粒浓度，并按公式〔浓度(拷贝/μl)＝OD₂₆₀×稀释倍数×50×阿伏加德罗常数/双链长度bp×660〕计算出DNA的初始拷贝数。然后用TE稀释成1×10¹、1×10²、1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶拷贝/μl六个浓度进行分类，50μl/管分装，-70℃保存。

3.2质粒DNA参考品标准曲线的制备：取不同DNA载量的质粒参考品(1×10⁰个拷贝/μl、1×10¹个拷贝/μl、1×10²个拷贝/μl、1×10³个拷贝/μl、1×10⁴个拷贝/μl、1×10⁵个拷贝/μl、1×10⁶个拷贝/μl)各2μl，进行荧光PCR检测，从图3，表4可见，本方法可检出10个拷贝的质粒DNA分子。

表4质粒DNA的灵敏度分析

如图2、图3，表4所示，将上述数据进行回归分析，得到PCR回归方程为：Y＝-0.3572X+13.817，相关系数为0.9928。实验结果表明，在1×10¹-1×10⁶拷贝范围之间，样本拷贝数与其相应的CT值具有良好的相关性，因此，本方法可对1×10¹-1×10⁶拷贝范围内的模板进行定量。

4.检测的重复性分析

将质粒标准品的强阳性对照、临界阳性对照和阴性对照各取2μl进行实时荧光PCR检测，批间重复测定3次，批内重复测定五次，计算批内及批间差异，从而对检测方法的精密度进行考核。检测方法按使用说明书方法进行，实验结果见表5。

表5检测质粒标准品的重复性分析

对上述结果的统计分析表明，本方法的精密度很好，阳性质控品和阴性质控品不同时间测定三次及同一时间五次重复实验结果CV值均小于5％。

对上述结果的统计分析表明，本方法的重复性很好，不同细菌参考品重复提取后测定，其CV值均小于5％。

5.样品检测

以上述布鲁氏菌污染的血液模拟标本及阴、阳性对照样本提取DNA作为模板，按上述荧光定量PCR的反应体系及反应程序在荧光定量PCR仪上进行扩增。反应体系及扩增条件与做标准曲线时一致。结果见表6在模拟血液中，可检出1×10³CFU/ml的细菌，表7可见两株布鲁氏菌结果为阳性，所有非布鲁氏菌结果为阴性。

表6模拟污染样品的检测结果

^*ND：Not Detectected

表7特异性检测结果

^*ND：Not Detectected

<110>  浙江国际旅行卫生保健中心

 

<120>  检测布鲁氏菌的试剂及复合探针荧光定量PCR检测布鲁氏菌的方法

 

<130> 

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

caagggcaag gtggaagatt                                                   20

 

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

ctgcgaccga tttgatgttt                                                   20

 

 

<210>  3

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

atcgtttccg ggtaaagcgt cgcca                                             25

 

 

<210>  4

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

cgctttaccc ggaaacga                                                     18

Claims (1)

1.检测布鲁氏菌的试剂，其特征在于它包括以下上游引物、下游引物、荧光探针和淬灭探针；

上游引物的基因序列BRF1为：5′- caagggcaaggtggaagatt -3′；

下游引物的基因序列BRR1为：5′- ctgcgaccgatttgatgttt -3′；

荧光探针的基因序列FPBR1为：5′- fam-atcgtttccgggtaaagcgtcgcca-P-3′；

淬灭探针的基因序列QPBR1为：5′- cgctttacccggaaacga -Dabcyl-3′。

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