CN1066198C

CN1066198C - 控制植物病原体的方法

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Publication number: CN1066198C
Application number: CN94194281A
Authority: CN
Inventors: E·B·劳伦斯; E·B·莱文; D·M·沙
Original assignee: Monsanto Co
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1993-11-24
Filing date: 1994-10-25
Publication date: 2001-05-23
Anticipated expiration: 2014-10-25
Also published as: AU8120994A; HU9601403D0; BG61548B1; CN1136329A; HUT74393A; BR9408140A; CZ131796A3; CA2172628A1; EP0733116A1; SK280613B6; AU678640B2; JPH09506249A; PL178652B1; WO1995014784A1; SK65596A3; PL314590A1; BG100619A; US5516671A

Abstract

植物能被转化以表达来自曲霉(Aspergillus sp.)的葡萄糖氧化酶，并使其获得细菌和真菌病原体抗性。此外，该植物也能表达转化酶以增加可能得到的作为酶催化底物的葡萄糖的量。

Description

控制植物病原体的方法

发明领域

本发明涉及用通过遗传工程方法修饰植物而产生的蛋白质来控制植物病原体的方法，并且还涉及在该方法中有用的基因和植物。

发明背景

众所周知，葡萄糖氧化酶的酶促反应具有抗菌作用，在氧存在的情况下，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成α-葡萄糖酸内酯和过氧化氢。其抗菌作用方式是归因于过氧化氢的氧化作用，以及α-葡萄糖酸内酯的存在，后者是一种已知的葡糖基转移酶抑制剂。

葡萄糖氧化酶产物的抗菌作用致使其广泛应用于食品工业，在食品工业上它被普遍认为是一种公认安全化合物，即GRAS化合物，因此葡萄糖氧化酶现被人们用来防止食物制品中细菌所致的腐败。在医药上，它作为酶促杀菌剂用于作为制备伤口敷料、牙签、牙线和小型牙刷的组成部分。此外，葡萄糖氧酶也被提及作为控制龋齿的一种方法。

最近的报道表明，葡萄糖氧化酶参与青霉菌(Panicillinmdangearii)的生物控制机制的部分而控制植物病原真菌大丽花轮枝孢菌(Verticillium dahliae)[Kim et al.，1988，1990]。

然而，认为由于葡萄糖氧化酶的酶促作用的性质，使得植物利用葡萄糖氧化酶作为一种保护自身不受病原体损害的手段无太大潜力。首先，在植物体中几乎没有游离的葡萄糖，该酶似乎没有足够的底物产生足够的过氧化氢和/或α-葡萄糖酸内酯，以克服病原体的攻击。其次，在植物细胞中，这种酶的存在消耗了葡萄糖，而产生甚至是少量的过氧化氢可以预见这对植物细胞的生命力是有害的。预见表达葡萄糖氧化酶的转基因植物，无论是在再生植物，还是在其子代中都不能正常发育。

本发明的一个目的是提供能在植物细胞中安全表达的葡萄糖氧化酶，及其对植物细胞提供疾病抗性。本发明的另一目的是提供一种表达能转化植物表达葡萄糖氧化酶的方法，以在植物体内表达葡萄糖氧化酶及对这些植物提供疾病抗性。

发明概述

出人意料地发现，来自黑曲霉(Aspergillus niger)的葡萄糖氧化酶的基因能用于转化植物，并使之正常发育和抗病原体的攻击。故本发明的一个目的是提供遗传构建体，它含有可插入植物细胞的有用的曲霉葡萄糖氧化酶(AGO)的基因。另一个目的是提供含有这样的遗传物质的转化了的，抗病原体的植物。

另外，植物体也可被转化而共表达其它的抗真菌蛋白和杀虫蛋白，例如用苏云金杆菌(B.t)基因。表达B.t基因的转化植物的实例公布在欧洲专利公开No.0385962对应于1990年2月12日申请的美国连续号07/476661[Fischhoff et al]。在此引用作为参考。B.t基因可以通过同时转化，顺次转化或杂交的方法而被整合到本发明的植物中。

根据本发明的一个方面提供了一种重组体双链DNA分子，在该重组体的操作序列中含有：

a)一个在植物细胞起作用的以引起一个RNA序列产生的启动子；

b)一个编码(AGO)产物的结构编码序列;

c)一个在植物细胞中起作用以引起RNA序列的3′末端添加多聚腺苷酸(poly A)的3′-非转译区。

根据本发明的另一个方面：提供了一种能表达抗病原体量的AGO的遗传工程转化植物的方法包括步骤：

a)把一双链DNA分子重组体，插入植物细胞基因组，所述重组体含有：

(ⅰ)一个在植物细胞中起作用以引起一个RNA序列产生的启动子；

(ⅱ)一种编码AGO产物的结构编码序列；

(ⅲ)一个在所述植物细胞中起作用以引起RNA序列的3′末端添加多聚腺苷酸(poly A)的3′-非转译区。

b)得到转化的植物细胞：

c)由转化的植物细胞再生能表达抑制量的AGO的遗传工程转化的植物。

本发明的另一方面还提供了含有上述元件(ⅰ)、(ⅱ)和(ⅲ )的DNA的转化植物。

如本文所用，术语“曲霉葡萄糖氧化酶”或“AGO”是指曲霉属天然产生的葡萄糖氧化酶，或者是与这样一种酶，例如，SEQ ID NO：1编码的酶有≥80％的同源性，优选≥90％的同源性的葡萄糖氧化酶。

如本文所用的，术语“控制微生物损伤”或“病原体抗性”是指由于细菌或真菌病原体感染而对作物所造成的损伤的减少。

如本文所用的，术语“结构编码序列”是指编码多肽的DNA序列，所述多肽在DNA转录为mRNA，进而转译成期望的多肽后，由细胞产生。

如本文所用的，术语“植物位点”意指直接围绕植物的范围，包括植物本身及其根区。

发明详述

本发明的实施方案包含从黑曲霉中分离出的一种蛋白质，该蛋白质称为AGO，已被纯化成均一产品，在以检测条件下，只需用少到50ng的AGO，便可抑制农学上非常重要的病原真菌的生长，包括：大丽花轮枝孢菌(Verticillium dahliae)它是宿主范围最广的损害植物的病原体之一，并可引起许多植物致病；致病疫霉(Phytophthorainfertans(Pi))，是引起土豆和西红柿中晚期枯萎病的病原体；灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea(Bc))，是引起各种水果和蔬菜出现灰霉的病原体；小麦颖枯病菌(Septoria nodorum(Sn))，是引起小麦颖枯的病原体；假尾孢病菌(Pieudocercosporellaherpotrichoides(Ph))，是引起小麦眼点病的病原体；小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis var tritici(Ggt))，是引起谷物类全蚀病的病原体。人们还发现AGO可抑制土豆软腐病的病原体土豆软腐菌(Erwinia carotovara)的生长，后者是一种土豆收获后而出现的疾病。人们基于该蛋白的酶促活性产物α-葡萄糖酸内酯和过氧化氢的特点，可以期望它有控制其它许多植物病原生物的能力。因为AGO的每一副产物，对这些生物都是有毒的。

用本发明的方法可保护许多种植物，例如，用这些方法可使诸如草莓、土豆和西红柿之类的许多水果和蔬菜免受植物病原体的侵害。疫霉属(Phytophthora)多种种类对诸如果树和草皮之类的许多植物是致病的，因此，这些植物也可用本发明的方法予以保护。此外，小麦和大麦也可用本方法来保护不受Ggt、Su和Ph的侵害。

如上所述，本发明的抗微生物蛋白也可与其它抗真菌蛋白结合使用，以达到提供一种广谱抗病活性，也就是说，达到控制更多的病原体，以及/或为抑制同一病源真菌生物提供多种作用方式。这样的抗真菌蛋白的来源，可以是微生物，如本发明的蛋白质，也可以是植物。许多这样的抗真菌基因在文献上已有报道。

尽管AGO将在天然含量水平的葡萄糖存在时，保护植物免受病原体的侵害，但是人们也可期望提供转化酶以引起蔗糖水解从而释放额外的葡萄糖使AGO起作用。转化酶优选的是例如来自酵母的细胞壁转化酶(EP 0 442 592，Willmitzer et al.，1991，also AU 70898/91)，或者来自西红柿或其它植物的液泡酶，在这两种情况下，也可利用天然的信号序列，然而优选的可将转化酶隔离在细胞外空间直到需要的时候，或者是使其不到需要的时间不产生。两条途径中的第一条可通过利用信号序列来引导酶进入细胞外空间来完成。一种所述信号是土豆蛋白酶抑制剂信号(keil et al.，1986；Nelson etal.，1980)。一种只在病原体感染时才被活化的启动子，可以用于将转化酶表达限制在确实需要产生葡萄糖，以作为AGO的底物的情况。

在贮藏期间，当软腐细菌(Erwinia)感染引起大量的损失时，将土豆块茎自然会产生从淀粉降解而得到的葡萄糖。因此，用涉及一个转化酶基因的方法来保护不发生软腐病是不理想的，或者是不必要的。

体外生物功效检测抗真菌检测

来自黑曲霉的的葡萄糖氧化酶可以从Sigma Chemical Co.(St.Louis，Cat.#G-7141)获得。它被用来检测抗几种生物的体外活性。

抗Pi和Bc的试验是用培养基#303完成的，所述培养基按如下制备：一升含1g MgSO₄·7 H₂O：2g KH₂PO₄；0.5g NaCl；1g CaCO₃；1ml ZnSO₄·7H₂O储备液-1mg/ml；1mlFeSO₄ ·7H₂O储备液-1mg/ml；0.5ml FeEDTA储备液-100mM；20gMoltrin M-100；20g酪蛋白；5g酵母提取物；5g葡萄糖；3.02g Pipes 10mM；pH调到6.5，过滤灭菌。抗Ggt的试验在半浓度PDA(Difco)上完成。抗Ph试验在CDAA上完成1％培养基按如下制备：35g/L Difco Czapek Dox肉汤，1g/L脯氨酸，500mg/L天冬酰胺，500mg/L半胱氨酸和1g/L琼脂高压灭菌23分钟，加入过滤消毒的维生素(1ppm硫氨素和1ppm生物素)。

在96孔板中用一液体检测测定Bc和Pi。Bc每孔用的Bc量为5×10²孢子并在20℃培养24-48小时。以每孔5×10³个孢子囊接种Pi并在18℃培养24-48小时。生长的估价通过测定在595nm的OD来做。Pi的生长在浓度低至3×10-5 IU/μl时被抑制了90％。Bc的生长在0.001 IU/μl时被抑制了95％。

抗全蚀病菌的活性在固体琼脂平板上评价。一块支持重真菌生长的大约0.5cm²的琼脂块被放在一个半强度PDA平板中心并让它在22℃生长几天。用一个灭菌的木栓打孔器在生长前缘之外1cm处无菌地移出一个直径0.5cm的琼脂栓。无菌AGO储备液直接加到这些孔中。当浓度低至0.02 IU/孔时，一个可见的抑制区就显而易见了。

抗Ph的试验在96孔板上进行。在水琼脂上的假尾孢病菌的14天培养物被用于制孢子悬液。将5-10ml CDAA 1％培养基充满一个平板轻轻旋动使孢子与液体培养基混合。用移液器吸出浓缩的孢子悬液，并加到试验要求的CDAA总体积中，调孢子浓度到100，000孢子/孔。黑暗24℃测试培养。

孢子悬液按50μl/孔分到一个96孔微量滴定板上。然后将这些板放在一个培养箱里(10小时/无光照12℃)24小时(在用样品之前)。50μl样品被加到50μl接种物(24小时前准备的)中，产生每重复处理每处理孔100μl的总孔体积。培养滴定板48小时，结果通过用Biorad微量滴定板阅读仪3550型在595nm的单波长读光密度(OD)来决定。在0时刻(t₀)做一次OD读取(在放上样品后立即读)，在样品放置48小时(t₄₈)后做一次OD读取。真菌的生长估计是通过在t₀和t₄₈之间OD读取值的差乘以一个真菌生物量的计算值来决定的(真菌生物量的计算值是真菌生长和光密度间的关系并由不同的实验决定的。真菌生长和光密度间的关系是由在96孔微量滴定板上生长真菌，一段时间后收集菌丝体，在大约0.10D的吸光度间隔而决定的。对特殊的真菌，计算值来自真菌生物量和OD间的线性关系。Ph的计算值是4.91)。那么抑制百分率是由处理组的生物量和对照组的生物量之差决定的。在1.7×10^-4IU/μl时AGO表现出对Ph60％的抑制率。

除了孢子悬液的制备而外，抗Sn试验基本上象做抗Ph试验的方法做的。在YMA琼脂上的颖枯病菌的7天培养物被用来制孢子悬液。少量(＜1ml)的CDAA培养基滴加在一块有从分生孢子渗出粉红色孢子团的培养物上。通过反复将它们吸入和吹出移液器使孢子和CDAA培养基混合。浓缩的悬液加到试验要求的CDAA总体积中，调整孢子浓度到50，000个孢子/ml。Sn的计算值是0.508，在1.7×10^-4 IU/μl，AGO表现出对Sn 60％抑制率。细菌检测

细菌-胡萝卜欧文氏杆菌的培养物通过划线在PDA平板上保存并在24℃黑暗培养。为了制备接种物肉汤，一环活跃生长的细菌(5-9天老)被加到50ml的四分之一浓度的PD肉汤的125ml锥形瓶中。此瓶放在在24℃黑暗中的摇床(130rpm)上。24小时后，细菌沉淀，重悬在无菌的去离子水中，每3或4个100μl的等份加到一个96孔微量滴定板的孔内来读。微板阅读器于595nm，测定孔的平均光密度。这个吸光度(ABS=光密度)数被用于下面的等式来计算肉汤中含的菌落形成单位(CFUs)。

CFU=(3×10⁶)+[(3×10⁸)×ABS]+[(5×10⁸)ABS²]肉汤调至10⁵CFU来使用。

在浓度低至3×10^-5IU/μl时，AGO完全控制了胡萝卜欧文氏菌的生长。

酶鉴定

在一个异源系统，例如植物细胞中，可以设计许多方法检测一种蛋白质的产生。Western印迹技术可用于检测一种蛋白质的免疫性，或酶学的或生物学分析可用于检测蛋白质的活性。葡萄糖氧化酶的酶活测定

一种连续分光光度分析的改进方法(Frederick等人，1990)被用于估计GO活性。黑曲霉GO(Sigma)被用做阳性对照。反应混合物由20μg/ml辣根过氧化物酶(Sigma)0.32mM Triton X-100稳定的邻苯[二]茴香胺溶液(Sigma)和0.1M溶于75mM磷酸钠缓冲液(pH5.0)中的葡萄糖组成。向此混合物中加入100μl不同浓度的黑曲霉GO做对照反应或100μl来自异源的样品。在室温下做分析，在460nm监测吸光率的增加。

根据Gallo，1981，用试剂4-氨基-安替比林(4-AAP)的葡萄糖氧化酶的另一个分析法是适于使用的。5×4-AAP试剂是在10ml总体积中有0.68g KH₂PO₄，8.3mg 4-AAP(0.82mM)，25μl Triton-X-100，0.0658g结晶酚，1，0000辣根过氧化物酶制的，用KOH调pH至5.0。分析是通过混合200μl所述4-AAP试剂，5μl 1mM FAD，50μl 1M葡萄糖和试验样品(达到750μl)做的。结果在OD 508读。葡萄糖氧化酶生物活性分析

一栓4-6天的Ggt真菌被转到新鲜的1/4浓度的马铃薯右旋糖琼脂(Difco)平板上。真菌在22℃生长4天或直到生长圈约为2.5cm。用一无菌的木栓打孔器在位于生长圈外1cm处在琼脂上打孔，100μl缓冲液或来自异源的样品加到孔中。真菌在室温生长24小时并检查生长的抑制。葡萄糖氧化酶的免疫检测

黑曲霉产生的葡萄塘氧化酶多克隆抗体可以从许多商业途径获得，例如，Pockland，Inc.，Gilbertsville，Pennsylvania。

遗传转化AGO基因的克隆

从黑曲霉(ATCC 9029)总DNA分离并作为葡萄糖氧化酶基因PCR分离的模板。PCR引物是以公开的该基因序列(Frederick等人；Kriechbaum等人)为基础并设计用来分离包含信号序列的完整的该基因序列。另外，为了便于该基因插入到适宜在异源细菌中，棒状病毒或植物系统表达的载体中，5′PCR引物(SEQ ID NO：3)在该基因ATG转译起始密码子上游导入了XbaⅠ和BglⅡ限制性内切酶酶切位点。3′PCR引物(SEQ ID NO：4)在紧随终止密码子之后导入了BamⅪ和KpnⅠ限制性内切酶酶切位点。产生的PCR片段以XbaⅠ/KpnⅠ片段克隆到pUC118中以产生pMON22514并完全测序。序列(SEQ ID NO：1)与公开的序列完全匹配。SEQ ID NO：2是相应的氨基酸序列。植物基因构建

以双链DNA形式存在的植物基因的表达包括：在RNA聚合酶作用下从DNA一条链转录成信使RNA(mRNA )，随后在核内加工mRNA初级转录本。所述的加工包括一个3′非转译区，它将聚腺苷酸核苷酸加到RNA的3′末端。DNA的转录成mRNA是由通常称做“启动子”的DNA区调节。所述启动子区含一段碱基序列，这段序列通知RNA多聚酶与DNA结合，开始以DNA一条链为模板进行mRNA转录以产生对应的RNA链。

在文献中，已经描述了许多在植物细胞中有活性的启动子。它们包括：胭脂碱(noPaline)合成酶(NOS)和章鱼碱合成酶(OCS)启动子(由根癌病土壤杆菌的肿瘤诱导质粒所携带)花椰菜花叶病毒(CaMV)19S和35S启动子，玄参花叶病毒(FMV)35S启动子，和来自核酮糖1，5-二磷酸羧化酶小亚单位(ssRUBISCO，一种非常高丰度的植物多肽)的光诱导启动子。所有这些启动子已被用于产生各种已经在植物中表达的DNA构建体。美国专利号5，034，322(Fraley等人，1991)(引入本文作为参考)公开了所述用途。

已知有些启动子的表达限定于特定的植物部位或响应特殊的刺激，可以用例如马铃薯块茎特异性启动子，例如patatin启动子或ADP葡萄糖焦磷酸化酶的大或小亚单位的启动子，在块茎中获得的主要表达，因此与AGO结合，在块茎中提供针对感染的抗性，对如由欧文氏杆菌的抗性。一个水果特异性启动子在给予草莓或葡萄孢属的抗性是理想的。一个根特异性启动子对在小麦或大麦中获得AGO的表达以产生对Ggt的抗性是理想的。本领域专业技术人员熟知许多所述的植物部位特异性启动子在本发明中是有用的。

另外，可选择用于双链DNA分子的启动子以赋予响应真菌感染的AGO特异性表达。植物被真菌病原体的感染导致诱导了一大批蛋白质这些蛋白质被称为防御相关的或致病相关的(PR)蛋白质(Bowles：Bol等人，Linthorst)。所述防御相关的或PR基因可编码phenylpropanoid代谢酶(例如苯丙氨酸氨裂解酶，苯基苯乙烯酮合成酶，4-香豆CoA连接酶香豆酸4-水解酶)，修饰植物细胞壁的蛋白质(例如富含羟脯氨酸的糖蛋白，富含甘氨酸的蛋白质，过氧化物酶)，降解真菌细胞壁的酶(如几丁质酶和葡聚糖酶)类thaumatin蛋白质，或者目前尚不知道其功能的蛋白质。已经从一些数量的植物种中分离并鉴定了防御相关的或PR基因。当被病原体特别是如Pi的真菌病原体攻击时，这些基因的启动子可用于转基因植物获得AGO的表达。所述启动子可以从由马铃薯本身分离的防御相关的或PR基因得到(Fritzemeier等人；Cuypers等人；Logeman等人；Matton和Brisson；Taylor等人；Matton等人；Schroder等人)。为了将AGO置于由致病疫霉感染诱导的启动子控制之下。优选的是Taylor等人(1990)报道的启动子。

选择的特定启动子应该能引起酶编码序列的充分表达以导致产生有效量的AGO。

用于本发明DNA构建体(即嵌合植物基因)的启动子如果需要可以被修饰以便改变它们的控制特性。例如，可以将CaMV35S启动子与在无光时阻遏ssRUBISCO表达的部分ssRUBISCO基因相连，以产生一个在叶中有活性而在根部无活性的启动子。按本文所述可以使用所得的嵌合启动子。出于该描述的目的，词“CaMV35S”启动子因此包括CaMV35S启动子的变异体，即利用与操纵子区连接的方法，随机或控制的突变而得到的启动子等。而且，启动子可以被改变以含有多个“增强子序列”以便有助于提高基因表达。所述增强子序列的例子已由Kay等人报道。

一个增强的CaMV35S启动子已经按下列方法构建一个介于位置-343和+9之间的CaMV35S启动子的片段已预先构建在pUC13(Odell等人)中。所述片段含有一个被确定为对于CaMV35S启动子最大量表达所必需的区域，它被作为一个ClaⅠ-HindⅢ片段切下，用DNA聚合酶Ⅰ产生平末端(ClaⅠ片段)，并插入pUC18的HincⅡ位点。此35S启动子的上游区被作为一个HindⅢ-EcoRV片段(从-343伸展到-90)从这个质粒中切出，并插入相同质粒的HindⅢ和PstⅠ位点之间。增强的CaMV35S启动子(下文“CaMVE35S”)因此含一对有位于-343和-90之间的序列(Kay等人)。

由本发明的DNA构建体产生的RNA还含有一个5′非转译前导序列。这个序列可以从被选择表达此基因的启动子中得到，并能被特异性地修饰以提高mRNA的转译。5′非转译区也可以从病毒RNA′s，从合适的真核基因，或从-合成的基因序列获得。本发明不局限于其中非转译区是得自与启动子序列相伴的5′非转译序列的构建体。而是，非转译前导序列可以从一个不相关的启动子或编码序列中得到。例如，矮牵牛属植物热休克蛋白质70(Hsp70)含有这样一个前导序列(Winter)。

如上所述，本发明的嵌合植物基因的3′非转译区含一个多聚腺苷信号，其作用是在植物中使腺苷酸加到RNA的3′端。优选的3′区的例子是：(1)含土壤杆菌肿瘤诱导(Ti)质粒基因如胭脂碱合成酶基因(NOS)的多聚腺苷化信号的3′转录、非转译区和(2)植物基因，如大豆7S储存蛋白质基因和豌豆ssRUBISCO E9基因(Fischhoff，等人)。植物转化和表达

一个含本发明结构编码序列的嵌合植物基因可以通过任何适当的方法插入植物的基因组中。合适的植物转化载体包括那些从根病土壤杆菌的Ti质粒获得的，也包括那些由Herrera-Estrella(1983)，Bevan(1983)，Klee(1985)和EPO公开号0 120 516(Schilperoort等人)公开的。除了从土壤杆菌的Ti或根诱导的(Ri)质粒得到的植物转化载体外，其他方法也可用来将本发明的DNA构建体插入植物细胞。所述的方法可以包括，如使用脂质体，电穿孔，提高游离DNA吸收的化学物质，通过微粒发射轰击(microproject bombandment)运送游离DNA，和使用病毒或花粉的转化。

受本发明保护植物包括但不限于：马铃薯、番茄、小麦、谷类、草莓、葡萄及各种观赏植物。组织培养和植物繁殖的方法对所有这些类型植物都可获得的。葡萄糖氧化酶在烟草植物中的瞬间表达

用于双子叶植物转化的特别有用的质粒盒载体是pMON999，表达盒pMON999由CaMV35S启动子和包括来自NOS基因的多聚腺苷化信号的3′末端组成。 pMON999包括用于插入编码序列的BglⅡ、KpnⅠ和EcoRⅠ位点和位于植物基因表达盒侧翼的NotⅠ-NotⅠ位点。

将合AGO编码区的pMON22514的BglⅡ/KpnⅠ片段插入pMON999而产生pMON22515。将pMON22515电穿孔到烟草原生质体中。用Westernblot分析及酶活测定来证实转化的烟草细胞的葡萄糖氧化酶表达。双子叶植物的稳定转化

AGO的穿梭载体是通过从pMON22515切下作为BamHⅠ/BglⅢ片段的AGO编码区而产生的。然后将其置于一个基于pUC的载体上，得到质粒pMON22579含AGO编码区，FMV启动子和包括来自NOS基因的多聚腺苷化信号的3′端。含FMV启动子，AGO编码区和包括多聚腺苷化信号的NOS基因3′端的来自此载体的NotⅠ/NotⅠ片段被移入pMON17227(WO 92/0449，Barry等人)的)NotⅠ限制性位点以产生最终Ti载体pMON22587。

象上面讨论的，通过使用组织特异性启动子，AGO基因可以在植物的特定部位表达。patatin启动子主要在马铃薯的块茎中表达。含AGO编码区的KpnⅠ/XbaⅠ片段从pMON22514切出并插入到一个含patatin1.0启动子(Bevan等人，1986)和包括来自多聚腺甘化信号的NOS基因3′端的基于pUC的载体中，以产生pMON22516。然后，含有patatin启动子，AGO编码区和包括多聚腺苷化信号NOS基因3′端的pMON22516的NotⅠ片段移入pMON17227的NotⅠ限制性位点，pMON17227已在上面描述过，以产生Ti质粒载体pMON22517。

这些载体可以导入受损伤的土壤杆菌ABI中并用来转化中的马铃薯、番茄或其他外植体组织培养。卡那霉素或镇草宁(glyphosate)抗性筛选及植物再生后可以使含AGO基因的整植物复元。葡萄糖氧化酶的表达可以用Western blot分析和酶分析或生物分析法加以证实。转化的马铃薯植物的AGO表达

从已用Ti质粒载体pMON22517转化的马铃薯植物的块茎中提蛋白质并用Western blot检测是否存在葡萄糖氧化酶。在一些植物中检测到了葡萄糖氧化酶的高水平表达。用4-氨基酸安替比林系统进行酶学检测来确证这些表达水平。通过在25mM pH7.0磷酸缓冲液+5mMEDTA+100mM KCl研磨，从几个块茎中提取总蛋白质。用12.5mM磷酸盐缓冲液pH7.0浓缩和洗蛋白质。

表达AGO的块茎中提取的蛋白质溶于12.5mM pH7.0的磷酸盐缓冲液中，用96孔板检测从对P.infestans的抗性。结果见表1。与空载体pMON17227或缓冲液对照植物提取物对照时，在试验蛋白质的最高水平，21.2μg/μl。Pi孢子或者不萌发或者发生严重生长障碍。

表1

处理真菌抑制^*缓冲液对照 0空载体对照 2pMON22517品系9 3pMON22519品系30 3^*等级：0=无抑制， 1=轻度抑制，

2=中等抑制， 3=9严重抑制。

用一种酶活测定法测定用Ti质粒载体pMON22587转化的马铃薯叶中是否存在AGO。结果见表2。象上面一样，pMON17227转化的马铃薯植物被用做空载体对照植物。

表2

表达水平^a 葡萄糖氧化酶活性^b 等量品系号 (％) (U/10ng×10^-4) (U/gFW)Rus.Bur 0 0 022587-2 0.075 72.2 7.2222587-3 0.150 126.4 12.6422587-4 0.007 6.0 0.622587-12 0.125 88.2 8.8222587-31 0.350 140.4 14.0422587-32 0.350 121.0 12.1022587-33 0.450 181.8 18.1822587-34 0.003 1.2 0.12

a．表达水平是指葡萄糖氧化酶在全部提取的叶蛋白质中所占的百分率。

b．叶提取物中葡萄糖氧化酶活性是通过酶活测定而确定的，并计算为在总蛋白质中的酶活单位。

c．每克鲜重叶组织的葡萄糖氧化酶活性单位(U/g FW)是按转换系数为每克鲜重叶组织含10μg总蛋白从总蛋白活力计算而得。

还用氯化钛沉淀法测定了用Ti质粒载体pMON22587转化的马铃薯植物的叶中H₂O₂的水平。发现在二个品系中叶的H₂O₂水平比未转化的对照植物的高2至4倍。抗病马铃薯

在一个块茎盘测试中测表达AGO的块茎对胡萝卜软腐欧文氏菌的抗性。测试了用pMON22517转化的三十四个品系块茎对软腐病损伤中的抗性。还用Western blot分析法测试了它们的表达水平。根据Yang等人的方法(1989)对块茎表面灭菌。每个品系的2或3个块茎分别被无菌地切成7-10cm厚的园片，每个品系得到6至12个园片。将园片放在湿润无菌Whatman 1号滤纸的平皿中。每个园片的中央接10μl 50，000CFU的细菌。平皿在高湿度环境23℃保持3天。疾病评价包括测量所得损伤的长度，半径和深度。从病灶内的软化组织的稀释液用于测定每个病灶中最终的细菌数。测定的结果列在表3。就那些看似最受保护的品系来说，所有的参数都比空载体和缓冲液对照块茎的好。发现一般说来在损伤时AGO表达水平最高块茎其细菌水平最低。

表3表达^b品系# 表达水平 CFUX109缓冲液对照 0 16.76空载体 0 14.3222517-10 0 20.722517-24 0 20.0922517-13 0 16.322517-12 0 19.26-22517-9 低 9.3422517-28 低 13.5622517-33 低 9.5722517-14 低 8.2222517-17 低 8.3622517-19 低 9.3722517-32 低 7.1722517-20 低 7.422517-21 低 6.2522517-34 低 4.4422517-11 低 3.0622517-8 低 1.522517-7 中 12.8822517-31 中 12.0622517-1 中 7.5422517-15 中 6.722517-25 中 12.2522517-35 中 6.8122517-2 中 3.5222517-3 中 1.2622517-5 中 1.422517-6 高 15.7422517-18 高 2.67522517-26 高 4.5522517-29 中 4.3522517-4 中 4.222517-30 中 3.9222517-16 中 1.1222517-23 中 2.6722517-36 中 0.855

^aCFU=菌落形成单位

^b=用Western印迹分析法确定的表达水平。

用pMON22587转化并表达AGO的转化植物的嫩叶片进行Pi抗性检测，滴加100μl致病疫霉孢子囊悬浮液而接种至完全展开的小叶(约20cm²)叶轴外表面中心，用LB-V8培养的2-3周龄的平皿中收集到的接种物中孢子囊的密度为每毫升10⁵～10⁶个。接种的小叶保持在用底铺湿滤纸来维持湿度的Nunc Bio-Assay平皿中(243×243×18cm)，放在约19℃的培养室中，以16小时的光周期培养。观察症状的发展，用5mm×5mm的透明格网迭盖每一叶片来测量其感染面积。计算出每一品系的叶片感染面积的平均值及标准差。

表达AGO的转基因品系表现出小叶对致病疫霉感染引起的症状的显著抑制。用两个品系所得的结果如表4所示。与对照组(未转化的和空载体转化体)相比，症状分别降低47％和57％。

表4

感染面积^a(cm²)品系号 3dpib 4dpi 5dpi 6dpiRusset Burbank 1.2 2.1 4.2 7.117227-1c 1.6 2.7 4.7 8.722587-3d 0.4 0.8 1.1 3.022587-12d 0.5 1.3 2.3 3.7

a．感染面积是指5片叶子的平均值

b．接种后的天数

c．仅用载体转化的对照品系

d．表达葡萄糖氧化酶的转基因品系。

单子叶植物的稳定转化

为进行单子叶植物的转化，载体是由AGO和一个内含子构建而成，该内含子对于提高获得表达高水平目的蛋白的转化植物的频率是特别有用的。这里用的内含子是在EP 602193(相当于美国连续号08/181，364，Brown et al，在此引入以供参考)公开的hsp70的内含子，酶切本文公开的pMON19477其中将含有hsp70内含子的800bp BglⅡ-BamHI段克隆到pMON22515单一的BglⅡ位点，获得pMON22623。

用已知的微粒发射轰击的方法将pMON22623导入小麦细胞(Vasilet al.)。

得到转化植物之后，其抗真菌能力，尤其是抗Ggt的能力，便可用已知的方法来评价。

本说明书中提到的所有文献和专利引入本文以供参考，如同每个文献或专利均特别及逐个陈述过以供参考一样。

由前文可以看出，本发明是一个适用于容易达到具有上述各种优点的所有目标的发明，并且这些优点是显而易见的和本发明所固有的。

可以理解，本发明的某些特征和引用部分是很有用的，而且是没有参考其他发明的特征和引用部分而被采纳，这属于本发明所期望的，也是权利要求范围之内的。

由于本发明可以组成很多可能的实施方案而不会偏离本发明的范围，所以应理解本文所列的所有材料或附图中出现的所有材料均是为了说明而不是为了限制。

参考文献Barry，G.F.，G. Kishore，and S.R. Padgette.“Glyphosate Tolerant 5-Enol-

pyruvylshikimate-3-phosphate. Synthases.” PCT Appl. WO

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preparation.” European Patent Application，Publication Number 0

385 962，1990.Frederick，K et al. J. Biol. Chem.，265:3793-3802.Fritzemeier，K et al. Plant Phvsiol，85:34-41，1987.Gallo. Methods in Enzvmologv，71:665-668，1981.Herrera-Estrella，L. et al.Nature，303:20-9，1983.Kay，R. et al.，Science，236:1299-1302，1987.Keil，M. et al. Nucleic Acids Res.，14:5641-5650，1986.Klee，H. J. et al. Bio/Technologv，3:637-642，1985.Kim，K et al. Phvtopathology，78:488-492，1988.Kim，K. et al. Can. J. Microbiol.，36:199-205，1990.Kriechbaum M. et al. FEBS Lett.，255:63-66，1989.Linthorst，H. J. M. Crit Rev Plant Sci，10:123-150.Logemann，J. et al. Plant Cell，1:151-158，1989.Matton，D. and Brisson，N. Mol Plant-Microbe Interactions，2:325-331，

1989.Matton，D. et al. Plant Mol Biol，14:S63-865，1990.Nelson，C. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA，77:1975-1979，1980.Odell，J. et al.，Nature，313:810，1985.Schroder，M.et al. Plant J，2:161-172，1992.Taylor，J.，et al. Molecular Plant-Microbe Interactions，3:72-77，1990.Vasil et al. Bio/Technologv 11:1153-1158，1993.Winter et al. Mol. Gen. Genet.，221(2):315-19，1988.

序列表(1)一般资料：

(ⅰ)申请人：

(A)名称：Monsamto公司

(B)街道：800 North Lindbergh Boulevard

(C)城市：St.Louis(圣.路易丝)

(D)州：密苏里(Missouri)

(E)国家：美国

(F)邮政编码(邮编)：63198

(G)电话：(314)537-7286

(H)电传：(314)537-6047

(ⅱ)发明标题：控制植物病原体的方法

(ⅲ)序列数目：4

(ⅳ)计算机可读格式：

(A)媒介类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容型

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0，＃1.25版(EPO)

(ⅵ)在先的申请数据记录：

(A)申请号：US 08/161041

(B)申请日期：1993年11月24日(2)SEQ ID NO：1的资料：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：1848个碱基对

(B)类型：核酸

(C)线型：双链

(D)拓扑结构：直线

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组的)

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键：CDS

(B)位置：16..1833

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：1：TCTAGAAGAT CTATC ATG CAG ACT CTC CTT GTG AGC TCG CTT GTG GTC TCC 51

Met Gln Thr Leu Leu Val Ser Ser Leu Val Val Ser

1 5 10CTC GCT GCG GCC CTG CCA CAC TAC ATC AGG AGC AAT GGC ATT GAA GCC 99Leu Ala Ala Ala Leu Pro His Tyr Ile Arg Ser Asn Gly Ile Glu Ala

15 20 25AGC CTC CTG ACT GAT CCC AAG GAT GTC TCC GGC CGC ACG GTC GAC TAC 147Ser Leu Leu Thr Asp Pro Lys Asp Val Ser Gly Arg Thr Val Asp Tyr

30 35 40ATC ATC GCT GGT GGA GGT CTG ACT GGA CTC ACC ACC GCT GCT CGT CTG 195Ile Ile Ala Gly Gly Gly Leu Thr Gly Leu Thr Thr Ala Ala Arg Leu45 50 55 60ACG GAG AAC CCC AAC ATC AGT GTG CTC GTC ATC GAA AGT GGC TCC TAC 243Thr Glu Asn Pro Asn Ile Ser Val Leu Val Ile Glu Ser Gly Ser Tyr

65 70 75GAG TCG GAC AGA GGT CCT ATC ATT GAG GAC CTG AAC GCC TAC GGC GAC 291Glu Ser Asp Arg Gly Pro Ile Ile Glu Asp Leu Asn Ala Tyr Gly Asp

80 85 90ATC TTT GGC AGC AGT GTA GAC CAC GCC TAC GAG ACC GTG GAG CTC GCT 339Ile Phe Gly Ser Ser Val Asp His Ala Tyr Glu Thr Val Glu Leu Ala

95 100 105ACC AAC AAT CAA ACC GCG CTG ATC CGC TCC GGA AAT GGT CTC GGT GGC 387Thr Asn Asn Gln Thr Ala Leu Ile Arg Ser Gly Asn Gly Leu Gly Gly

110 115 120TCT ACT CTA GTG AAT GGT GGC ACC TGG ACT CGC CCC CAC AAG GCA CAG 435Ser Thr Leu Val Asn Gly Gly Thr Trp Thr Arg Pro His Lys Ala Gln125 130 135 140GTT GAC TCT TGG GAG ACT GTC TTT GGA AAT GAG GGC TGG AAC TGG GAC 483Val Asp Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn Glu Gly Trp Asn Trp Asp

145 150 155AAT GTG GCC GCC TAC TCC CTC CAG GCT GAG CGT GCT CGC GCA CCA AAT 531Asn Val Ala Ala Tyr Ser Leu Gln Ala Glu Arg Ala Arg Ala Pro Asn

160 165 170GCC AAA CAG ATC GCT GCT GGC CAC TAC TTC AAC GCA TCC TGC CAT GGT 579Ala Lys Gln Ile Ala Ala Gly His Tyr Phe Asn Ala Ser Cys His Gly

175 180 185GTT AAT GGT ACT GTC CAT GCC GGA CCC CGC GAC ACC GGC GAT GAC TAT 627Val Asn Gly Thr Val His Ala Gly Pro Arg Asp Thr Gly Asp Asp Tyr

190 195 200TCT CCC ATC GTC AAG GCT CTC ATG AGC GCT GTC GAA GAC CGG GGC GTT 675Ser Pro Ile Val Lys Ala Leu Met Ser Ala Val Glu Asp Arg Gly Val205 210 215 220CCC ACC AAG AAA GAC TTC GGA TGC GGT GAC CCC CAT GGT GTG TCC ATG 723Pro Thr Lys Lys Asp Phe Gly Cys Gly Asp Pro His Gly Val Ser Met

225 230 235TTC CCC AAC ACC TTG CAC GAA GAC CAA GTG CGC TCC GAT GCC GCT CGC 771Phe Pro Asn Thr Leu His Glu Asp Gln Val Arg Ser Asp Ala Ala Arg

240 245 250GAA TGG CTA CTT CCC AAC TAC CAA CGT CCC AAC CTG CAA GTC CTG ACC 819Glu Trp Leu Leu Pro Asn Tyr Gln Arg Pro Asn Leu Gln Val Leu Thr

255 260 265GGA CAG TAT GTT GGT AAG GTG CTC CTT AGC CAG AAC GGC ACC ACC CCT 867Gly Gln Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser Gln Asn Gly Thr Thr Pro

270 275 280CGT GCC GTT GGC GTG GAA TTC GGC ACC CAC AAG GGC AAC ACC CAC AAC 915Arg Ala Val Gly Val Glu Phe Gly Thr His Lys Gly Asn Thr His Asn285 290 295 300GTT TAC GCT AAG CAC GAG GTC CTC CTG GCC GCG GGC TCC GCT GTC TCT 963Val Tyr Ala Lys His Glu Val Leu Leu Ala Ala Gly Ser Ala Val Ser

305 310 315CCC ACA ATC CTC GAA TAT TCC GGT ATC GGA ATG AAG TCC ATC CTG GAG 1011Pro Thr Ile Leu Glu Tyr Ser Gly Ile Gly Met Lys_ser Ile Leu Glu

320 325 330CCC CTT GGT ATC GAC ACC GTC GTT GAC CTG CCC GTC GGC TTG AAC CTG 1059Pro Leu Gly Ile Asp Thr Val Val Asp Leu Pro Val Gly Leu Asn Leu

335 340 345CAG GAC CAG ACC ACC GCT ACC GTC CGC TCC CGC ATC ACC TCT GCT GGT 1107Gln Asp Gln Thr Thr Ala Thr Val Arg Ser Arg Ile Thr Ser Ala Gly

350 355 360GCA GGA CAG GGA CAG GCC GCT TGG TTC GCC ACC TTC AAC GAG ACC TTT 1155Ala Gly Gln Gly Gln Ala Ala Trp Phe Ala Thr Phe Asn Glu Thr Phe365 370 375 380GGT GAC TAT TCC GAA AAG GCA CAC GAG CTG CTC AAC ACC AAG CTG GAG 1203Gly Asp Tyr Ser Glu Lys Ala His Glu Leu Leu Asn Thr Lys Leu Glu

385 390 395CAG TGG GCC GAA GAG GCC GTC GCC CGT GGC GGA TTC CAC AAC ACC ACC 1251Gln Trp Ala Glu Glu Ala Val Ala Arg Gly Gly Phe His Asn Thr Thr

400 405 410GCC TTG CTC ATC CAG TAC GAG AAC TAC CGC GAC TGG ATT GTC AAC CAC 1299Ala Leu Leu Ile Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg Asp Trp Ile Val Asn His

415 420 425AAC GTC GCG TAC TCG GAA CTC TTC CTC GAC ACT GCC GGA GTA GCC AGC 1347Asn Val Ala Tyr Ser Glu Leu Phe Leu Asp Thr Ala Gly Val Ala Ser

430 435 440TTC GAT GTG TGG GAC CTT CTG CCC TTC ACC CGA GGA TAC GTT CAC ATC 1395Phe Asp Val Trp Asp Leu Leu Pro Phe Thr Arg Gly Tyr Val His Ile445 450 455 460CTC GAC AAG GAC CCC TAC CTT CAC CAC TTC GCC TAC GAC CCT CAG TAC 1443Leu Asp Lys Asp Pro Tyr Leu His His Phe Ala Tyr Asp Pro Gln Tyr

465 470 475TTC CTC AAC GAG CTG GAC CTG CTC GGT CAG GCT GCC GCT ACT CAA CTG 1491Phe Leu Asn Glu Leu Asp Leu Leu Gly Gln Ala Ala Ala Thr Gln Leu

480 485 490GCC CGC AAC ATC TCC AAC TCC GGT GCC ATG CAG ACC TAC TTC GCT GGG 1539Ala Arg Asn Ile Ser Asn Ser Gly Ala Met Gln Thr Tyr Phe Ala Gly

495 500 505GAG ACT ATC CCC GGT GAT AAC CTC GCG TAT GAT GCC GAT TTG AGC GCC 1587Glu Thr Ile Pro Gly Asp Asn Leu Ala Tyr Asp Ala Asp Leu Ser Ala

510 515 520TGG ACT GAG TAC ATC CCG TAC CAC TTC CGT CCT AAC TAC CAT GGC GTG 1635Trp Thr Glu Tyr Ile Pro Tyr His Phe Arg Pro Asn Tyr His Gly Val

525 530 535 540GGT ACT TGC TCC ATG ATG CCG AAG GAG ATG GGC GGT GTT GTT GAT AAT 1683Gly Thr Cys Ser Met Met Pro Lys Glu Met Gly Gly Val Val Asp Asn545 550 555GCT GCC CGT GTG TAT GGT GTG CAG GGA CTG CGT GTC ATT GAT GGT TCT 1731Ala Ala Arg Val Tyr Gly Val Gln Gly Leu Arg Val Ile Asp Gly Ser

560 565 570ATT CCT CCT ACG CAA ATG TCG TCC CAT GTC ATG ACG GTG TTC TAT GCC 1779Ile Pro Pro Thr Gln Met Ser Ser His Val Met Thr Val Phe Tyr Ala

575 580 585ATG GCG CTA AAA ATT TCG GAT GCT ATC TTG GAA GAT TAT GCT TCC ATG 1827Met Ala Leu Lys Ile Ser Asp Ala Ile Leu Glu Asp Tyr Ala Ser Met

590 595 600CAG TGATAAGGAT CCGGTACC 1848Gln605(2)SEQ ID NO：2的资料：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：605个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：直线

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Gln Thr Leu Leu Val Ser Ser Leu Val Val Ser Leu Ala Ala Ala1 5 10 15Leu Pro His Tyr Ile Arg Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Thr

20 25 30Asp Pro Lys Asp Val Ser Gly Arg Thr Val Asp Tyr Ile Ile Ala Gly

35 40 45Gly Gly Leu Thr Gly Leu Thr Thr Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro

50 55 60Asn Ile Ser Val Leu Val Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg65 70 75 80Gly Pro Ile Ile Glu Asp Leu Asn Ala Tyr Gly Asp Ile Phe Gly Ser

85 90 95Ser Val Asp His Ala Tyr Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln

100 105 110Thr Ala Leu Ile Arg Ser Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Val

115 120 125Asn Gly Gly Thr Trp Thr Arg Pro His Lys Ala Gln Val Asp Ser Trp

130 135 140Glu Thr Val Phe Gly Asn Glu Gly Trp Asn Trp Asp Asn Val Ala Ala145 150 155 160Tyr Ser Leu Gln Ala Glu Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gln Ile

165 170 175Ala Ala Gly His Tyr Phe Asn Ala Ser Cys His Gly Val Asn Gly Thr

180 185 190Val His Ala Gly Pro Arg Asp Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro Ile Val

195 200 205Lys Ala Leu Met Ser Ala Val Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr Lys Lys

210 215 220Asp Phe Gly Cys Gly Asp Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro Asn Thr225 230 235 240Leu His Glu Asp Gln Val Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu

245 250 255Pro Asn Tyr Gln Arg Pro Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln Tyr Val

260 265 270Gly Lys Val Leu Leu Ser Gln Asn Gly Thr Thr Pro Arg Ala Val Gly

275 280 285Val Glu Phe Gly Thr His Lys Gly Asn Thr His Asn Val Tyr Ala Lys

290 295 300His Glu Val Leu Leu Ala Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr Ile Leu305 310 315 320Glu Tyr Ser Gly Ile Gly Met Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu Gly Ile

325 330 335Asp Thr Val Val Asp Leu Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp Gln Thr

340 345 350Thr Ala Thr Val Arg Ser Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly

355 360 365Gln Ala Ala Trp Phe Ala Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp Tyr Ser

370 375 380Glu Lys Ala His Glu Leu Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp Ala Glu385 390 395 400Glu Ala Val Ala Arg Gly Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu Leu Ile

405 410 415Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg Asp Trp Ile Val Asn His Asn Val Ala Tyr

420 425 430Ser Glu Leu Phe Leu Asp Thr Ala Gly Val Ala Ser Phe Asp Val Trp

435 440 445Asp Leu Leu Pro Phe Thr Arg Gly Tyr Val His Ile Leu Asp Lys Asp

450 455 460Pro Tyr Leu His His Phe Ala Tyr Asp Pro Gln Tyr Phe Leu Asn Glu465 470 475 480Leu Asp Leu Leu Gly Gln Ala Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg Asn Ile

485 490 495Ser Asn Ser Gly Ala Met Gln Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr Ile Pro

500 505 510Gly Asp Asn Leu Ala Tyr Asp Ala Asp Leu Ser Ala Trp Thr Glu Tyr

515 520 525Ile Pro Tyr His Phe Arg Pro Asn Tyr His Gly Val Gly Thr Cys Ser

530 535 540Met Met Pro Lys Glu Met Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala Arg Val545 550 555 560Tyr Gly Val Gln Gly Leu Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr

565 570 575Gln Met Ser Ser His Val Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala Leu Lys

580 585 590Ile Ser Asp Ala Ile Leu Glu Asp Tyr Ala Ser Met Gln

595 600 605(2)SEQ ID NO：3的资料：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：33个碱基对

(B)类型：核酸

(C)线型：单链

(D)拓扑结构：直线

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组的)

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：3：CCATCTAGAA GATCTATCAT GCAGACTCTC CTT 33(2)SEQ ID NO：4的资料：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：36个碱基对

(B)类型：核酸

(C)线型：单链

(D)拓扑结构：直线

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组的)

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：4：TGGGGTACCG GATCCTTATC ACTGCATGGA AGCATA 36

Claims

1．一种重组体双链DNA分子，在所述重组体的操作序列中含有：

a)一个在植物细胞中起作用以引起一个RNA序列产生的启动子；

b)一个编码AGO产物的结构编码序列；以及

c)一个在植物细胞中起作用以引起RNA序列3′-末端添加多

聚腺苷酸的3′非转译区。

2．权利要求1的DNA分子，其中所述结构DNA是SEQ ID NO：1。

3．权利要求1的DNA分子，其中所述启动子选自FMV35S和CaMV35S的启动子。

4．权利要求1的DNA分子，其中所述启动子是由病原体的感染诱导的。

5．产生遗传工程转化的，抗病植物的方法，包括步骤：

a)将一重组体双链DNA分子插入植物细胞的基因组，所述重组体包括：

(ⅰ)一个在植物细胞中起作用以引起RNA序列产生的启动子；

(ⅱ)一个导致AGO产生的结构编码序列；

(ⅲ)一个在植物细胞中起作用以引起RNA序列的3′-末端添加多聚腺苷酸的3′-非转译区；

b)获得转化的植物细胞；以及

c)从转化的植物细胞再生遗传工程转化的植物。所述植物能表达出有效量的AGO以减少由细菌或真菌病原体感染造成的损害。

6．权利要求5的方法，其中所述结构编码序列是SEQ ID NO：1。

7．权利要求5的方法，其中所述启动子选自FMV35S和CaMV35S的启动子。

8．权利要求5的方法，其中所述启动子是由病原体感染诱导的。

9．权利要求5的方法，其中所述植物是马铃薯或小麦。