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KR20240110818A - 유기체를 변형하기 위한 폴리뉴클레오티드 - Google Patents

유기체를 변형하기 위한 폴리뉴클레오티드 Download PDF

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KR20240110818A
KR20240110818A KR1020247018358A KR20247018358A KR20240110818A KR 20240110818 A KR20240110818 A KR 20240110818A KR 1020247018358 A KR1020247018358 A KR 1020247018358A KR 20247018358 A KR20247018358 A KR 20247018358A KR 20240110818 A KR20240110818 A KR 20240110818A
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KR
South Korea
Prior art keywords
rna
sequence
plant
endornavirus
recognition sequence
Prior art date
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KR1020247018358A
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English (en)
Inventor
아르준 드방 카카르
베리 앤드류 마틴
야지에 니우
다니엘 알렉산더 스프라게
푸 쳔 추
엘리자베스 제인 안토넬리 데니스
메흐메트 알리 할라크
위멍 하오
케빈 클리키
제임스 마이클 크레머
자야쉬리 쿠마르
치엔-위안 린
산카르 라즈 판트
데렉 토마스 로텐허버
미치카 가브리엘 샤프
아디티아 수실 쿠마르 싱
Original Assignee
플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 Vii, 엘엘씨
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Publication date
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Abstract

합성 엔도르나바이러스 위성 RNA 분자 및 이를 함유하는 위성 입자가 개시된다. 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA 분자는 코딩 및/또는 비코딩 카고 서열을 포함할 수 있고 식물의 세대에 걸쳐 유전될 수 있다. 식물 표현형을 변화시키고, 식물 스트레스 저항성을 개선하고, 식물 해충 및 병원체 저항성을 개선하기 위해 엔도르나바이러스 위성 RNA 분자 및 이를 함유하는 위성 입자를 사용하는 방법도 개시된다.

Description

유기체를 변형하기 위한 폴리뉴클레오티드
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2021년 11월 1일에 출원된 미국 가특허 출원 제63/274,156호 및 2022년 10월 11일에 출원된 미국 가특허 출원 제63/379,063호에 대한 우선권을 주장하며, 이는 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록 XML
본 출원에는 XML 파일 포맷으로 전자 제출되었고 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 서열 목록이 포함된다. 2022년 10월 22일에 생성된 XML 파일은 명칭이 P13754WO00.xml이고 크기가 1,015,030 바이트이다. 전체 내용이 본원에 참조로 포함된 추가 서열 목록은 하기를 포함한다: 2021년 10월 29일에 생성되고 미국 가특허 출원 제63/274,156호와 함께 2021년 11월 1일에 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출된, 크기가 535,414 바이트인 51484-006001_Sequence_Listing__10_29_21_ST25.txt; 및 2022년 10월 10일에 생성되고 미국 가특허 출원 제63/379,063호와 함께 2022년 10월 11일에 XML 포맷으로 전자적으로 제출된, 크기가 757,362 바이트인 P13754US01.xml.
기술분야
농업적 시용을 포함하는 다양한 적용에 사용하기 위한 변형 폴리뉴클레오티드가 본원에 제공된다.
유기체의 표현형 및 유전자형을 개선하기 위해; 특히 농작물과 같은 식물을 개선하기 위한 농업적 시용을 위해 폴리뉴클레오티드를 변형하는 것이 당업계에 필요하다.
일 양태에서, 세포에서 기능적이고 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 분자가 본원에 개시되고, 여기서 RNA 분자는 5'에서 3' 순서로, (a) 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제(RDRP)에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; (b) 카고 RNA 서열; 및 (c) 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하고; RNA 분자는 선택적으로, (e) 바이러스 이동 단백질(MP)을 인코딩하는 적어도 하나의 RNA; (f) 적어도 하나의 tRNA 유사 서열; 및 (g) 캡시드화 인식 서열(ERS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 요소를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함하고/하거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 표 11, 12 또는 13에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함한다.
일부 구현예에서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 1 내지 19, 372 내지 405, 465, 또는 483 내지 485에 의해 인코딩된 RNA 서열 중 적어도 하나, 또는 서열번호 580의 RNA 서열을 포함하고/하거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 20 내지 38, 406 내지 454, 467, 또는 486 내지 488에 의해 인코딩된 RNA 서열 중 적어도 하나, 또는 서열번호 581의 RNA 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래되고/되거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열은 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열, 3' 레플리카제 인식 서열 및 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제는 모두 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 세포는 박테리아 세포, 식물 세포, 진균 세포 또는 동물 세포이다.
일부 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스의 5' UTR 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 5' UTR 서열에 인접하여 그의 3'에 본래 위치하는 엔도르나바이러스의 게놈 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 3' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스의 3' UTR 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' 레플리카제 인식 서열은 3' UTR 서열에 인접하여 그의 5'에 본래 위치하는 엔도르나바이러스의 게놈 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, RNA 분자는 바이러스 MP를 인코딩하는 적어도 하나의 RNA 서열을 추가로 포함하고, MP를 인코딩하는 적어도 하나의 RNA 서열은 (a) 카고 RNA 서열 앞, (b) 카고 RNA 서열 뒤, 또는 (c) 카고 RNA 서열 앞과 뒤 둘 모두에 위치한다. 일부 구현예에서, MP를 인코딩하는 적어도 하나의 RNA 서열은 상이한 MP를 인코딩하는 적어도 2개의 RNA 서열 또는 MP의 다수의 카피를 인코딩하는 단일 RNA 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 구현예 중 임의의 하나의 재조합 DNA 분자는 세포에서 기능적이고 적어도 하나의 바이러스 이동 단백질을 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터, 및 선택적으로 종결자 요소를 포함하는 별개의 발현 카세트를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, RNA 분자는 ERS를 추가로 포함하고, ERS는 3' 레플리카제 인식 서열에 가깝게 또는 인접하여 위치하며, 선택적으로 3' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스의 3' UTR 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, ERS는 바이러스 조립 기점 서열(OAS: origin-of-assembly sequence)을 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 OAS 서열은 담배 모자이크 바이러스 OAS(TMV-OAS)이다.
일부 구현예에서, RNA 분자는 적어도 하나의 tRNA 유사 서열을 추가로 포함하고, 적어도 하나의 tRNA 유사 서열은 아라비돕시스(Arabidopsis) FT mRNA로부터의 tRNA 유사 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 분자는 적어도 하나의 tRNA 유사 서열, 예를 들어 서열번호 114 내지 161로 이루어진 군으로부터 선택되는 DNA 서열에 의해 인코딩된 RNA 서열을 포함하는 적어도 하나의 tRNA 유사 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 분자는 바이러스 MP를 인코딩하는 적어도 하나의 RNA, 아라비돕시스 FT mRNA로부터의 tRNA 유사 서열, 및 TMV-OAS를 포함하는 캡시드화 인식 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 카고 RNA 서열은 길이가 최대 약 14 kb이다.
일부 구현예에서, 카고 RNA 서열은 하기를 포함한다: (a) 적어도 하나의 코딩 서열, (b) 적어도 하나의 비코딩 서열, 또는 (c) 적어도 하나의 코딩 서열과 적어도 하나의 비코딩 서열 둘 모두.
일부 구현예에서, 카고 RNA 서열은 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하고, RNA 분자는 적어도 하나의 코딩 서열에 바로 인접하여 그의 5'에 위치하는 내부 리보솜 유입 부위(IRES)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 카고 RNA 서열은 다수의 코딩 서열을 포함하고, RNA 분자는 코딩 서열 각각에 바로 인접하여 그의 5'에 위치하는 IRES를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 카고 RNA 서열은 적어도 하나의 비코딩 서열을 포함하고, 적어도 하나의 비코딩 서열은 헤어핀 RNA(hpRNA); 다수의 줄기-루프를 형성하는 RNA; RNA 슈도노트; 적어도 부분적으로 이중 가닥 RNA를 형성하는 RNA 서열; 작은 간섭 RNA(siRNA) 또는 siRNA 전구체; 마이크로RNA(miRNA) 또는 miRNA 전구체; 자가 절단 리보자임; 리간드 반응성 자가 절단 리보자임(압타자임); RNA 앱타머; 및 긴 비코딩 RNA(lncRNA)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 구현예 중 임의의 하나의 재조합 DNA 분자는 적어도 하나의 자가 절단 리보자임을 인코딩하는 DNA 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 자가 절단 리보자임은 5' 레플리카제 인식 서열의 5' 또는 3' 레플리카제 인식 서열의 3'에 위치한다.
일부 구현예에서, 상기 구현예 중 임의의 하나의 재조합 DNA 분자는 적어도 하나의 리간드 반응성 자가 절단 리보자임(압타자임)을 인코딩하는 DNA 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 리간드 반응성 자가 절단 리보자임은 5' 레플리카제 인식 서열의 5' 또는 3' 레플리카제 인식 서열의 3'에 위치한다.
일부 구현예에서, 상기 구현예 중 임의의 하나의 재조합 DNA 분자는 인트론 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 구현예 중 임의의 하나의 재조합 DNA 분자는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 요소를 추가로 포함한다: (a) 전사될 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터, 및 선택적으로 종결자 요소를 포함하는 별개의 발현 카세트; (b) 발현 강화 요소; (c) 마커를 인코딩하는 DNA 서열; (d) DNA 앱타머; (e) RNA 앱타머를 인코딩하는 DNA 서열; (f) T-DNA 좌측 및 우측 경계 DNA 서열; (g) 스페이서 DNA 서열; (h) 전사 인자 결합 부위를 인코딩하는 DNA 서열; (i) 국소화 서열을 인코딩하는 DNA 서열; (j) 적어도 하나의 서열-특이적 재조합효소 인식 부위를 인코딩하는 DNA 서열; 및 (k) 전사물 안정화 또는 전사물 불안정화 서열을 인코딩하는 DNA 서열.
다른 양태에서, 상기 구현예 중 임의의 하나의 재조합 DNA 분자를 발현시킴으로써 생산되는 RNA 분자가 본원에 개시된다.
다른 양태에서, 상기 구현예 중 임의의 하나의 재조합 DNA 분자를 포함하는 세포가 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포이다.
다른 양태에서, 상기 구현예 중 임의의 하나의 재조합 DNA 분자를 포함하는 박테리아 매개 식물 형질전환을 위한 벡터가 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 식물 형질전환을 매개하는 박테리아는 아그로박테리움(Agrobacterium)이고, 벡터는 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 분자에 측접하는(flanking) T-DNA를 추가로 포함한다.
다른 양태에서, 식물 세포 내에 함유된, 상기 양태의 벡터가 본원에 개시된다.
다른 양태에서, (a) 세포에서 기능적이고, 5'에서 3' 순서로, (i) 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; (ii) 카고 RNA 서열; 및 (iii) 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하고; 선택적으로, (iv) 바이러스 이동 단백질(MP)을 인코딩하는 적어도 하나의 RNA; (v) 적어도 하나의 tRNA 유사 서열; 및 (vi) 캡시드화 인식 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 요소를 추가로 포함하는 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 분자; 및 (b) 엔도르나바이러스로부터 유래된 5' 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 RDRP 단백질을 함유하는 세포를 포함하는 발현 시스템이 본원에 개시된다.
일부 구현예에서, (i) 5' 레플리카제 인식 서열은 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함하고/하거나; (ii) 3' 레플리카제 인식 서열은 표 11, 12 또는 13에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함한다.
일부 구현예에서, (i) 5' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 1 내지 19, 372 내지 405, 465, 또는 483 내지 485에 의해 인코딩된 RNA 서열 중 적어도 하나, 또는 서열번호 580의 RNA 서열을 포함하고/하거나; (ii) 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 20 내지 38, 406 내지 454, 467, 또는 486 내지 488에 의해 인코딩된 RNA 서열 중 적어도 하나, 또는 서열번호 581의 RNA 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, (i) 5' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래되고/되거나; (ii) 3' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열은 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열, 3' 레플리카제 인식 서열 및 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제는 모두 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 세포는 박테리아 세포, 식물 세포, 진균 세포 또는 동물 세포이다.
일부 구현예에서, 발현 시스템은 캡시드화 인식 서열에 의해 인식되고 RNA 분자를 캡시드화하는 바이러스 외피 단백질을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 외피 단백질은 (a) 세포에서 재조합 DNA 분자에 의해 발현되거나, (b) 세포에서 제2 재조합 DNA 분자에 의해 공동 발현되거나; (c) 세포에 외인성으로 제공되거나; (d) 세포에서 바이러스에 의해 발현된다.
일부 구현예에서, RDRP 단백질은 세포에 대해 이종성이다. 일부 구현예에서, RDRP 단백질은 세포에 외인성으로 제공된다.
일부 구현예에서, 세포는 식물 세포이다.
일부 구현예에서, 5' 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 RDRP 단백질은 엔도르나바이러스에 의해 식물 세포에서 내인성으로 발현된다.
일부 구현예에서, 엔도르나바이러스는 식물 세포에서 자연적으로 발생한다.
일부 구현예에서, 재조합 DNA 분자는 바이러스 MP를 인코딩하는 적어도 하나의 RNA, 아라비돕시스 FT mRNA로부터의 tRNA 유사 서열, 및 TMV-OAS를 포함하는 캡시드화 인식 서열을 추가로 포함한다.
다른 양태에서, 상기 양태의 발현 시스템을 포함하는 농업용 제형이 본원에 개시된다.
다른 양태에서, 5'에서 3' 순서로, (a) 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; (b) 카고 RNA 서열; 및 (c) 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하고; 선택적으로, (d) 바이러스 이동 단백질("MP")을 인코딩하는 적어도 하나의 RNA; (e) 적어도 하나의 tRNA 유사 서열; 및 (f) 조립 기점 서열("OAS")로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 요소를 추가로 포함하는 재조합 RNA 분자가 본원에 개시된다.
일부 구현예에서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함하고/하거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 표 11, 12 또는 13에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함한다.
일부 구현예에서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 1 내지 19, 372 내지 405, 465, 또는 483 내지 485에 의해 인코딩된 적어도 하나의 RNA 서열, 또는 서열번호 580의 RNA 서열을 포함하고/하거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 20 내지 38, 406 내지 454, 467, 또는 486 내지 488에 의해 인코딩된 RNA 서열 중 적어도 하나, 또는 서열번호 581의 RNA 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래되고/되거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열은 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열, 3' 레플리카제 인식 서열 및 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제는 모두 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 바이러스 외피 단백질에 의해 캡시드화된다.
다른 양태에서, 상기 양태의 재조합 RNA 분자를 포함하는 농업용 제형이 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 바이러스 외피 단백질에 의해 캡시드화된다.
다른 양태에서, 상기 양태의 재조합 RNA 분자를 포함하는 세포가 본원에 개시된다.
다른 양태에서, 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 식물 세포에 제공하는 방법이 본원에 개시되고, 방법은 5'에서 3' 순서로, 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; 카고 RNA 서열; 및 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는 재조합 RNA 분자(예를 들어, 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA)를 식물 세포에 제공하는 단계를 포함하고, 식물 세포는 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 RDRP 단백질을 포함하고, 이에 의해 RDRP 단백질은 재조합 RNA 분자로부터 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA의 추가 카피의 합성을 촉매한다.
일부 구현예에서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함하고/하거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 표 11, 12 또는 13에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함한다.
일부 구현예에서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 1 내지 19, 372 내지 405, 465, 또는 483 내지 485에 의해 인코딩된 RNA 서열 중 적어도 하나, 또는 서열번호 580의 RNA 서열을 포함하고/하거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 20 내지 38, 406 내지 454, 467, 또는 486 내지 488에 의해 인코딩된 RNA 서열 중 적어도 하나, 또는 서열번호 581의 RNA 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래되고/되거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열은 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열, 3' 레플리카제 인식 서열 및 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제는 모두 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 식물 세포는 엔도르나바이러스를 포함하고, RDRP 단백질은 엔도르나바이러스에 의해 식물 세포에 제공된다.
일부 구현예에서, 엔도르나바이러스는 식물 세포에 풍토성이다.
일부 구현예에서, 엔도르나바이러스는 식물 세포에 외인성으로 제공되며; 구현예에서, 외인성으로 제공된 엔도르나바이러스는 상이한 식물 종, 변종 또는 생식질에 풍토성이거나 고유하며, 식물 세포에서 자가 복제 가능하다.
일부 구현예에서, RDRP 단백질은, 예를 들어 식물 세포에서 RDRP 단백질의 트랜스제닉 발현에 의해 식물 세포에 외인성으로 제공된다. 구현예에서, RDRP 단백질은 외인성 엔도르나바이러스, 예를 들어, 상이한 유기체, 종, 변종 또는 생식질에서 본래 발견되고 식물 세포 내로 도입될 때 자가 복제 가능한 엔도르나바이러스를 식물 세포 내로 도입함으로써 식물 세포에 외인성으로 제공된다.
일부 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 발효 시스템에서 생산되었다.
일부 구현예에서, 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA는 식물 세포에서 기능적이고 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 작제물을 식물 세포에서 전사함으로써 식물 세포에 제공된다.
일부 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 캡시드화 인식 서열을 추가로 포함하고, 식물 세포는 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 캡시드화할 수 있는 바이러스 외피 단백질을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 외피 단백질은 식물 세포에 외인성으로 제공된다.
일부 구현예에서, 재조합 DNA 작제물은 바이러스 외피 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 DNA 작제물은 식물 세포에서 기능적이고 바이러스 식물 단백질을 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 바이러스 외피 단백질은 식물 세포에서 발현되고 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 캡시드화한다.
일부 구현예에서, 식물 세포는 엔도르나바이러스를 포함하고, 엔도르나바이러스는 식물 세포에 RDRP 단백질을 제공한다.
다른 양태에서, 식물 또는 식물 세포에서 표현형 변화를 얻는 방법이 본원에 개시되고, 방법은 5'에서 3' 순서로, 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; 카고 RNA 서열; 및 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는 재조합 RNA 분자(예를 들어, 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA)를 식물 또는 식물 세포에 제공하는 단계를 포함하고, 카고 RNA 서열은 식물 또는 식물 세포에서 표현형 변화를 일으키는 RNA를 포함하고; 식물 또는 식물 세포는 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 RDRP 단백질을 포함하고, 이에 의해 RDRP 단백질은 재조합 RNA 분자로부터 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA의 추가 카피의 합성을 촉매하고 카고 RNA 서열은 표현형 변화를 일으킨다.
일부 구현예에서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함하고/하거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 표 11, 12 또는 13에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함한다.
일부 구현예에서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 1 내지 19, 372 내지 405, 465, 또는 483 내지 485에 의해 인코딩된 RNA 서열 중 적어도 하나, 또는 서열번호 580의 RNA 서열을 포함하고/하거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 20 내지 38, 406 내지 454, 467, 또는 486 내지 488에 의해 인코딩된 RNA 서열 중 적어도 하나, 또는 서열번호 581의 RNA 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래되고/되거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열은 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열, 3' 레플리카제 인식 서열 및 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제는 모두 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 식물 또는 식물 세포에서 표현형 변화를 일으키는 RNA는 재조합 RNA 분자가 제공되지 않은 대조군 식물 또는 식물 세포에서의 표적 유전자의 발현에 비해 표적 유전자의 발현을 조절하기 위한 RNA를 포함하며, 표현형 변화는 조절의 결과이다. 일부 구현예에서, 조절은 (a) 표적 유전자의 발현의 증가; 또는 (b) 표적 유전자의 발현의 감소이다. 일부 구현예에서, 식물 또는 식물 세포에서 표현형 변화를 일으키는 RNA는 표적 유전자의 발현을 억제한다.
일부 구현예에서, 식물 또는 식물 세포에서 표현형 변화를 일으키는 RNA는 siRNA 또는 siRNA 전구체, miRNA 또는 miRNA 전구체, 및 단계적 siRNA 또는 단계적 siRNA 전구체로부터 선택되는 적어도 하나의 RNA를 포함한다.
일부 구현예에서, 식물 또는 식물 세포에서 표현형 변화를 일으키는 RNA는 메신저 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 메신저 RNA는 식물 또는 식물 세포의 게놈에 부재하는 RNA 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 식물 또는 식물 세포에서 표현형 변화를 일으키는 RNA는 식물 또는 식물 세포의 게놈을 변형하기 위한 RNA를 포함한다.
일부 구현예에서, 식물 세포는 엔도르나바이러스를 포함하고, RDRP 단백질은 엔도르나바이러스에 의해 식물 세포에 제공된다.
일부 구현예에서, 엔도르나바이러스는 식물 세포에 풍토성이다.
일부 구현예에서, 엔도르나바이러스는 식물 세포에 외인성으로 제공되며; 구현예에서, 외인성으로 제공된 엔도르나바이러스는 상이한 식물 종, 변종 또는 생식질에 풍토성이거나 고유하며, 식물 세포에서 자가 복제 가능하다.
일부 구현예에서, RDRP 단백질은, 예를 들어 식물 세포에서 RDRP 단백질의 트랜스제닉 발현에 의해 식물 세포에 외인성으로 제공된다. 구현예에서, RDRP 단백질은 외인성 엔도르나바이러스, 예를 들어, 상이한 유기체, 종, 변종 또는 생식질에서 본래 발견되고 식물 세포 내로 도입될 때 자가 복제 가능한 엔도르나바이러스를 식물 세포 내로 도입함으로써 식물 세포에 외인성으로 제공된다.
일부 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 발효 시스템에서 생산되었다.
일부 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 식물 세포에서 기능적이고 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 작제물을 식물 세포에서 전사함으로써 식물 세포에 제공된다.
일부 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 캡시드화 인식 서열을 추가로 포함하고, 식물 세포는 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 캡시드화할 수 있는 바이러스 외피 단백질을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 바이러스 외피 단백질은 식물 세포에 외인성으로 제공된다.
일부 구현예에서, 재조합 DNA 작제물은 바이러스 외피 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 DNA 작제물은 식물 세포에서 기능적이고 바이러스 식물 단백질을 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 바이러스 외피 단백질은 식물 세포에서 발현되고 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 캡시드화한다.
일부 구현예에서, 식물 세포는 엔도르나바이러스를 포함하고, 엔도르나바이러스는 식물 세포에 RDRP 단백질을 제공한다.
일부 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 식물 세포를 재조합 RNA 분자를 포함하는 제형과 접촉시킴으로써 식물 세포에 제공되고, 재조합 RNA 분자는 발효 시스템에서 생산되었으며, 재조합 RNA 분자는 바이러스 외피 단백질에 의해 선택적으로 캡시드화된다.
다른 양태에서, 해충 또는 병원체에 대한 식물의 저항성 및/또는 내성을 증가시키는 방법이 본원에 개시되고, 방법은 5'에서 3' 순서로, 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; 카고 RNA 서열; 및 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는 재조합 RNA 분자(예를 들어, 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA)를 식물에 제공하는 단계를 포함하고, 카고 RNA 서열로 인해 해충 또는 병원체에 대한 식물의 저항성 및/또는 내성은 재조합 RNA 분자가 제공되지 않은 식물에 비해 증가하고, 식물 또는 식물 세포는 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 RDRP 단백질을 포함하고, 이에 의해 RDRP 단백질은 재조합 RNA 분자로부터 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA의 추가 카피의 합성을 촉매한다.
일부 구현예에서, 해충 또는 병원체는 하기를 포함하는 군으로부터 선택된다: 박테리아, 진균, 난균류(oomycete) 및 무척추동물.
다른 양태에서, 스트레스에 대한 식물의 저항성을 증가시키는 방법이 본원에 개시되고, 방법은 5'에서 3' 순서로, 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; 카고 RNA 서열; 및 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는 재조합 RNA 분자를 식물에 제공하는 단계를 포함하고, 식물 또는 식물 세포는 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 RDRP 단백질을 포함하고, 이에 의해 RDRP 단백질은 재조합 RNA 분자로부터 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA의 추가 카피의 합성을 촉매하고, 카고 RNA 서열로 인해 스트레스에 대한 식물의 저항성은 재조합 RNA 분자가 제공되지 않은 식물에 비해 증가한다.
일부 구현예에서, 스트레스는 하기를 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 비생물적 스트레스를 포함한다: 양분 스트레스, 광 스트레스, 수분 스트레스, 열 스트레스 및 저온 스트레스. 일부 구현예에서, 스트레스는 하기를 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 생물적 스트레스를 포함한다: 군집(crowding), 쉐이딩(shading) 및 알렐로파시(allelopathy).
다른 양태에서, 식물 또는 식물 세포에서 외인성 폴리펩티드를 발현시키는 방법이 본원에 개시되고, 방법은 식물 또는 식물 세포에서 기능적이고, 5'에서 3' 순서로, (a) 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; (b) 외인성 폴리펩티드를 인코딩하는 번역 가능한 메신저 RNA를 포함하는 카고 RNA 서열; 및 (c) 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는 RNA 분자(예를 들어, 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA)를 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 분자를 식물 또는 식물 세포에서 발현시키는 단계를 포함하고; RNA 분자는 선택적으로, (d) 바이러스 이동 단백질("MP")을 인코딩하는 적어도 하나의 RNA; (e) 적어도 하나의 tRNA 유사 서열; 및 (f) 캡시드화 인식 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 요소를 추가로 포함하고, 식물 또는 식물 세포는 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 RDRP 단백질을 포함하고, 이에 의해 RDRP 단백질은 재조합 RNA 분자로부터 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA의 추가 카피의 합성을 촉매하고, 외인성 폴리펩티드는 외인성 폴리펩티드를 인코딩하는 번역 가능한 메신저 RNA로부터 번역된다.
일부 구현예에서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함하고/하거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 표 11, 12 또는 13에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함한다.
일부 구현예에서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 1 내지 19, 372 내지 405, 465, 483 내지 485에 의해 인코딩된 RNA 서열 중 적어도 하나를 포함하고/하거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 20 내지 38, 406 내지 454, 467, 486 내지 488에 의해 인코딩된 RNA 서열 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 구현예에서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래되고/되거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열은 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열, 3' 레플리카제 인식 서열 및 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제는 모두 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래된다.
다른 양태에서, 합성 엔도르나바이러스 위성 입자를 제조하는 방법이 본원에 개시되고, 방법은 (a) 5'에서 3' 순서로, 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; 카고 RNA 서열; 및 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는 재조합 RNA 분자를 식물 세포에 제공하는 단계로서, 식물 세포는 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 RDRP 단백질을 포함하고, 이에 의해 RDRP 단백질은 재조합 RNA 분자로부터 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA의 합성을 촉매하는, 단계; 및 (b) 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 바이러스 외피 단백질로 캡시드화함으로써 합성 엔도르나바이러스 위성 입자를 제공하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 바이러스 외피 단백질은 식물 세포에 외인성으로 제공된다.
일부 구현예에서, 식물 세포는 바이러스 외피 단백질을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 바이러스 외피 단백질은 식물 세포에서 재조합적으로 발현된다.
일부 구현예에서, 카고 RNA 서열은 길이가 최대 약 14 kb이다.
일부 구현예에서, 카고 RNA 서열은 하기를 포함한다: (a) 적어도 하나의 코딩 서열, (b) 적어도 하나의 비코딩 서열, 또는 (c) 적어도 하나의 코딩 서열과 적어도 하나의 비코딩 서열 둘 모두.
일부 구현예에서, 카고 RNA 서열은 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하고, RNA 분자는 적어도 하나의 코딩 서열에 바로 인접하여 그의 5'에 위치하는 IRES를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 카고 RNA 서열은 다수의 코딩 서열을 포함하고, RNA 분자는 코딩 서열 각각에 바로 인접하여 그의 5'에 위치하는 IRES를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 카고 RNA 서열은 적어도 하나의 비코딩 서열을 포함하고, 적어도 하나의 비코딩 서열은 헤어핀 RNA(hpRNA); 다수의 줄기-루프를 형성하는 RNA; RNA 슈도노트; 적어도 부분적으로 이중 가닥 RNA를 형성하는 RNA 서열; 작은 간섭 RNA(siRNA) 또는 siRNA 전구체; 마이크로RNA(miRNA) 또는 miRNA 전구체; 자가 절단 리보자임; 리간드 반응성 자가 절단 리보자임(압타자임); RNA 앱타머; 및 긴 비코딩 RNA(lncRNA)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 식물 세포에서 기능적이고 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 작제물을 식물 세포에서 전사함으로써 식물 세포에 제공된다.
일부 구현예에서, 재조합 DNA 작제물은 바이러스 외피 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 DNA 작제물은 식물 세포에서 기능적이고 바이러스 식물 단백질을 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 식물 세포는 엔도르나바이러스를 포함하고, 엔도르나바이러스는 식물 세포에 RDRP 단백질을 제공한다.
일부 구현예에서, 엔도르나바이러스는 식물 세포에 풍토성이다.
일부 구현예에서, 엔도르나바이러스는 식물 세포에 외인성으로 제공되며; 구현예에서, 외인성으로 제공된 엔도르나바이러스는 상이한 식물 종, 변종 또는 생식질에 풍토성이거나 고유하며, 식물 세포에서 자가 복제 가능하다.
일부 구현예에서, RDRP 단백질은, 예를 들어 식물 세포에서 RDRP 단백질의 트랜스제닉 발현에 의해 식물 세포에 외인성으로 제공된다. 구현예에서, RDRP 단백질은 외인성 엔도르나바이러스, 예를 들어, 상이한 유기체, 종, 변종 또는 생식질에서 본래 발견되고 식물 세포 내로 도입될 때 자가 복제 가능한 엔도르나바이러스를 식물 세포 내로 도입함으로써 식물 세포에 외인성으로 제공된다.
일부 구현예에서, 방법은 합성 엔도르나바이러스 위성 입자를 단리하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 합성 엔도르나바이러스 위성 입자를 정제하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 합성 엔도르나바이러스 위성 입자를 제형화하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 양태에서, 상기 제공된 방법에 의해 제공되는 합성 엔도르나바이러스 위성 입자가 본원에 개시된다.
다른 양태에서, 상기 제공된 방법에 의해 제공되는 합성 엔도르나바이러스 위성 입자를 포함하는 농업용 제형이 본원에 개시된다.
다른 양태에서, 합성 엔도르나바이러스 위성 입자를 식물에 제공하는 방법이 본원에 개시되고, 방법은 식물을 상기 양태의 합성 엔도르나바이러스 위성 입자와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 접촉시키는 단계는 분무, 살포, 주입 또는 침지를 포함한다.
일부 구현예에서, 카고 RNA 서열은 폴리펩티드를 인코딩하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하고, 번역되어 식물에서 폴리펩티드를 생산한다.
다른 양태에서, (a) 5'에서 3' 순서로, (i) 엔도르나바이러스로부터 유래된 5' 레플리카제 인식 서열; (ii) 카고 RNA 서열; 및 (iii) 엔도르나바이러스로부터 유래된 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하고; 선택적으로, (iv) 바이러스 이동 단백질("MP")을 인코딩하는 적어도 하나의 RNA; (v) 적어도 하나의 tRNA 유사 서열; 및 (vi) 조립 기점 서열("OAS")로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 요소를 추가로 포함하는 RNA 분자: 및 (b) 엔도르나바이러스로부터 5' 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 RDRP 단백질을 포함하는 무세포 발현 시스템이 본원에 개시된다.
일부 구현예에서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함하고/하거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 표 11, 12 또는 13에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함한다.
일부 구현예에서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 1 내지 19, 372 내지 405, 465, 483 내지 485에 의해 인코딩된 RNA 서열 중 적어도 하나, 또는 서열번호 580의 RNA 서열을 포함하고/하거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 20 내지 38, 406 내지 454, 467, 486 내지 488에 의해 인코딩된 RNA 서열 중 적어도 하나, 또는 서열번호 581의 RNA 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래되고/되거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열은 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열, 3' 레플리카제 인식 서열 및 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제는 모두 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래된다.
일부 구현예에서, RDRP 단백질은 엔도르나바이러스에 의해 제공된다.
다른 양태에서, 상기 양태의 발현 시스템을 포함하는 농업용 제형이 본원에 개시된다.
다른 양태에서, 상기 양태의 재조합 RNA 분자 및 엔도르나바이러스 RDRP를 포함하는 식물 또는 식물 세포가 본원에 개시된다.
다른 양태에서, 상기 양태의 재조합 RNA 분자 및 엔도르나바이러스 RDRP를 포함하는 식물 번식체가 본원에 개시된다.
다른 양태에서, 재조합 RNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 식물 세포를 포함하는 변형된 식물 번식체를 생산하는 방법이 본원에 개시되고, 방법은 재조합 RNA 분자를 포함하는 식물 세포와 재조합 RNA 분자를 결여한 식물 세포 둘 모두를 포함하는 식물 세포의 혼합 집단으로부터 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제(RDRP) 및 재조합 RNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 식물 세포를 포함하는 식물 번식체를 단리하는 단계를 포함하고, 재조합 RNA 분자는 5'에서 3' 순서로, 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; 카고 RNA 서열; 및 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함한다.
다른 양태에서, 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 식물에 제공하는 방법이 본원에 개시되고, 방법은 5'에서 3' 순서로, 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제(RDRP)에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; 카고 RNA 서열; 및 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는 재조합 RNA 분자를 포함하는 대목 상에 접가지를 접목시키는 단계를 포함하고, 대목 및/또는 접가지의 적어도 하나의 세포는 엔도르나바이러스 RDRP를 포함한다.
다른 양태에서, 5'에서 3' 순서로, 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제(RDRP)에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; 카고 RNA 서열; 및 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는 재조합 RNA 분자를 포함하는 접목 식물을 생산하는 방법이 본원에 개시되고, 재조합 RNA 분자는 접목 식물을 생산하기 위해 접가지를 대목 상에 접목시키기 전에 접가지, 대목, 또는 접가지와 대목 둘 모두를 재조합 RNA 분자를 포함하는 조성물과 접촉시킴으로써 제공된다.
다른 양태에서, 재조합 RNA 분자를 자손 식물 또는 종자에 전파하는 식물을 생산하는 방법이 본원에 개시되고, 방법은 재조합 RNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 모 식물로부터 얻어진 F1 식물 또는 종자의 집단으로부터 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제(RDRP) 및 5'에서 3' 순서로, 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; 카고 RNA 서열; 및 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는 재조합 RNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 세포를 포함하는 F1 자손 식물 또는 종자를 단리하는 단계를 포함한다. 따라서 관련 양태는 적어도 재조합 RNA 분자를 포함하거나 재조합 RNA 분자와 엔도르나바이러스 RDRP(또는 엔도르나바이러스 RDRP를 생산하는 엔도르나바이러스) 둘 모두를 포함하는 F1, F2 또는 이후 세대의 자손 식물 또는 종자를 포함하고; 적어도 규제상의 이유로 특히 유리한 특정 구현예에서, 이러한 자손 식물 또는 종자는 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA를 결여하고 있다.
다른 양태에서, 식물, 식물 세포, 이의 자손 또는 이의 일부를 바코드화하는 방법이 본원에 개시되고, 방법은 상기 양태의 재조합 RNA 분자를 식물 또는 식물 세포에 제공하는 단계를 포함하고, 재조합 RNA 분자의 카고 RNA는 바코드 RNA 분자를 포함하고, 식물 또는 식물 세포는 재조합 RNA 분자의 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제(RDRP) 단백질을 포함한다. 적어도 규제상의 이유로 특히 유리한 특정 구현예에서, 식물, 식물 세포, 이의 자손 또는 이의 일부는 재조합 DNA 분자를 인코딩하는 DNA를 결여하고 있고 바코드 RNA를 인코딩하는 DNA를 결여하고 있다.
다른 양태에서, 바코드화된 식물, 식물 부분 또는 식물 세포를 식별하는 방법이 본원에 개시되고, 방법은 식물, 식물 부분 또는 식물 세포에서 바코드 RNA 분자의 존재에 대해 스크리닝하는 단계를 포함하고, 식물, 식물 부분 또는 식물 세포는 상기 양태의 재조합 RNA 분자를 포함하고, 재조합 RNA 분자의 카고 RNA는 바코드 RNA 분자를 포함한다.
본 개시내용의 다른 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
정의
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "F1", (제1 자손 세대) "F2", (제2 자손 세대) 등은 자가수분(자화수분)되거나 다른 식물과 교배(타가수분)된 바 있는 모 식물로부터 얻어진 식물 또는 종자를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이종"은, 제2 요소를 참조하여 제1 요소를 기재하는 데 사용되는 경우, 기재된 바와 같이 배치된 제1 요소 및 제2 요소가 자연에 존재하지 않는다는 것을 의미한다. 예를 들어, 이종 핵산 분자 또는 서열은 (a) 그것이 발현되는 세포에 고유하지 않거나 (b) 그것이 자연에서 연결 또는 융합되지 않거나, 자연에서 동일한 방식으로 연결 또는 융합되지 않는 핵산 분자 또는 서열에 연결 또는 융합되거나, (c) 그 천연 상태와 비교하여 사람의 손에 의해 변경 또는 돌연변이되었거나, (d) 유사한 조건 하에서 그 본래 발현 수준과 비교하여 발현이 변경된 핵산 분자 또는 서열이다. 예를 들어, "이종 프로모터"는 해당 프로모터에 의해 본래 전사되는 것이 아닌 서열의 전사를 유도하는 데 사용되고(예를 들어, 엔도르나바이러스 RNA 서열을 인코딩하는 DNA 분자의 전사를 유도하는 데 사용되는 진핵생물 프로모터); 따라서 "이종 프로모터" 서열은 대개 재조합 핵산 기법에 의해 발현 작제물에 포함된다. 다른 예에서, 본 개시내용에 의해 제공된 것들과 같은 재조합 폴리뉴클레오티드는 2개 이상의 상이한 엔도르나바이러스의 유전자 서열을 포함할 수 있고, 이러한 유전자 서열은 자연적으로 함께 발생하지 않을 것이라는 점에서 "이종"이다. 일부 구현예에서 "이종"은 분자 또는 분자의 별개의 부분을 지칭하고; 예를 들어, 더 큰 분자의 일부일 수 있는 카고 RNA 또는 페이로드(예를 들어, 단백질 인코딩 RNA, ssRNA, 조절 RNA, 간섭 RNA 또는 가이드 RNA와 같은 핵산)를 지칭하거나, 식물 엔도르나바이러스에서 자연적으로 발견되지 않는 구조(예를 들어, 플라스미드 또는 유전자 편집 시스템)를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "내부 리보솜 유입 부위" 또는 "IRES"는 리보솜 및 번역 기구를 모집하여 RNA 서열로부터 번역을 개시할 수 있는 서열(예를 들어, RNA 서열)을 지칭한다. IRES 요소는 일반적으로 100 내지 800개 뉴클레오티드이다. 적절한 IRES는 식물 및 식물 바이러스 IRES 서열, 예컨대 뇌심근염 바이러스 IRES(ECMV), 메이즈(maize) hsp101 IRES 5'UTR, 십자화과 식물 감염 토바모바이러스 crTMV CR-CP 148 IRES, 담배 식각 바이러스(TEV) IRES 5'UTR 및 히비스커스 황화 원형반점 바이러스(HCRSV) IRES로부터 얻어질 수 있다. 또한, 구현예에서, IRES 서열은 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 비식물 진핵 바이러스 서열로부터 유래된다: 급성 벌 마비 바이러스(ABPV), 돼지열병 바이러스(CSFV), 콕사키바이러스 B3 바이러스(CVB3), 뇌심근염 바이러스(ECMV), 엔테로바이러스 71(E71), A형 간염 바이러스(HAV), 인간 라이노바이러스(HRV2), 인간 라이노바이러스(HRV2), 인간 림프친화 바이러스(HTLV), 폴리오마 바이러스(PV) 및 제아 메이스(ZmHSP101). 본원에 기재된 조성물 및 방법에 유용한 IRES 서열의 예는 표 5에 나타나 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "동일성 퍼센트"는 표준 기법에 의한 정렬 후 참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열에 대한 서열 동일성 퍼센트(%)를 지칭한다. 핵산 퍼센트 또는 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 당업자의 능력 내에 있는 다양한 방식, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, PSI-BLAST, 또는 Megalign 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 소프트웨어는 MUSCLE(Edgar, Nucleic Acids Res., 32(5): 1792-1797, 2004)이다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 서열을 정렬하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 예를 들어, 구현예에서, 서열 동일성 퍼센트 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 BLAST(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol., 215:403-410)를 사용하여 생성된다. 예시로서, 주어진 핵산 또는 아미노산 서열 B에 대한, 그와의, 또는 그에 비한 주어진 핵산 또는 아미노산 서열 A의 서열 동일성 퍼센트(대안적으로 주어진 핵산 또는 아미노산 서열 B에 대한, 그와의, 또는 그에 비한 특정 서열 동일성 퍼센트를 갖는 주어진 핵산 또는 아미노산 서열 A로 표현될 수 있음)는 다음과 같이 계산된다:
100 곱하기 (분율 X/Y)
여기서, X는 해당 프로그램의 A와 B의 정렬에서 서열 정렬 프로그램(예를 들어, BLAST)에 의해 동일한 매치로 스코어가 매겨진 뉴클레오티드 또는 아미노산의 수이고, Y는 B에서 뉴클레오티드 또는 아미노산의 총 수이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "식물"은 전체 식물, 식물 기관, 식물 조직, 종자, 식물 세포, 종자 및 이의 자손을 지칭한다. 식물 세포는 종자, 현탁 배양물, 배아, 분열조직 영역, 캘러스 조직, 잎, 뿌리, 묘조, 배우체, 포자체, 꽃가루 및 미소포자로부터의 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 구현예에서, 식물 또는 식물 세포는 반수체, 이배체, 삼배체, 사배체, 오배체, 육배체 또는 팔배체이다. 구현예에서, 본 개시내용에 기재된 것들과 같은 조성물로 처리된 반수체 식물 또는 식물 세포는 추가로 반수체 배가 처리를 거치고, 이에 의해 배가 반수체 식물 또는 식물 세포가 생성된다. 식물 부분은 비제한적으로 하기를 포함하는 분화 및 미분화 조직을 포함한다: 뿌리, 줄기, 묘조, 잎, 꽃가루, 종자, 과일, 수확된 농산물, 종양 조직, 수액(예를 들어, 물관부 수액 및 체관부 수액) 및 다양한 형태의 세포 및 배양물(예를 들어, 단일 세포, 원형질체, 배아 및 캘러스 조직). 식물 세포 또는 조직 배양물은 세포 또는 조직이 얻어지는 식물의 생리학적 및 형태학적 특징을 갖는 식물을 재생시키고, 식물과 실질적으로 동일한 유전자형을 갖는 식물을 재생시킬 수 있다. 식물 세포 또는 조직 배양물에서 재생 가능한 세포는 배아, 원형질체, 분열조직 세포, 캘러스, 꽃가루, 잎, 꽃밥, 뿌리, 근단, 꽃 또는 자루일 수 있다. 대조적으로, 일부 식물 세포는 식물을 생산하기 위해 재생될 수 없으며 본원에서는 "재생 불가능한" 식물 세포로 지칭된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "미처리"는 재조합 폴리뉴클레오티드가 전달되지 않은 별도의 유기체, 재조합 폴리뉴클레오티드를 전달하기 전의 시점에 평가된 처리를 거치고 있는 동일한 유기체, 또는 유기체의 미처리 부분에서(즉, 재조합 폴리뉴클레오티드와 접촉하지 않은 유기체의 영역에서) 평가된 처리를 거치고 있는 동일한 유기체를 포함하는, 본원에 기재된 재조합 폴리뉴클레오티드와 접촉하거나 이를 전달하지 않은 유기체(예를 들어, 진핵생물, 예를 들어 식물, 진균, 곤충 또는 동물)를 지칭한다.
도 1은 엔도르나바이러스 위성 작제물의 구조의 비제한적 구현예를 나타낸다.
도 2는 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 생성하기 위한 아그로박테리움 침윤을 사용하는 것, 캡시드화된 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA의 단리, 및 캡시드화된 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 식물에 현장 시용하는 것의 개략도를 나타낸다.
도 3은 엔도르나바이러스 500 염기 5'UTR의 구조적 모티프 1을 나타낸다.
도 4는 엔도르나바이러스 500 염기 5'UTR의 구조적 모티프 2를 나타낸다.
도 5는 엔도르나바이러스 500 염기 5'UTR의 구조적 모티프 3을 나타낸다.
도 6은 엔도르나바이러스 500 염기 5'UTR에 위치하는 구조적 모티프 1에 대한 히스토그램을 나타낸다.
도 7은 엔도르나바이러스 500 염기 5'UTR에 위치하는 구조적 모티프 2에 대한 히스토그램을 나타낸다.
도 8은 엔도르나바이러스 500 염기 5'UTR에 위치하는 구조적 모티프 3에 대한 히스토그램을 나타낸다.
도 9는 엔도르나바이러스 500 염기 3'UTR의 구조적 모티프 1을 나타낸다.
도 10은 엔도르나바이러스 500 염기 3'UTR의 구조적 모티프 2를 나타낸다.
도 11은 엔도르나바이러스 500 염기 3'UTR의 구조적 모티프 3을 나타낸다.
도 12는 엔도르나바이러스 500 염기 3'UTR에 위치하는 구조적 모티프 1에 대한 히스토그램을 나타낸다.
도 13은 엔도르나바이러스 500 염기 3'UTR에 위치하는 구조적 모티프 2에 대한 히스토그램을 나타낸다.
도 14는 엔도르나바이러스 500 염기 3'UTR에 위치하는 구조적 모티프 3에 대한 히스토그램을 나타낸다.
도 15는 항-보트리티스(botrytis) 카고 RNA를 운반하는 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 페퍼 식물에 전달하는 개략도를 나타낸다.
도 16은 (i) 미처리 음성 대조군 페퍼 식물("WT"); (ii) 엔도르나바이러스 위성 RNA "작제물 1"(서열번호 578; "COM1")의 전신 분포를 갖는 2세대 페퍼 식물의 절단엽; (iii) 엔도르나바이러스 위성 RNA "작제물 2"(서열번호 579; "COM2")의 전신 분포를 갖는 2세대 페퍼 식물의 절단엽; 및 (iv) 캡탄(Captan) 살진균제로 처리된 양성 대조군 페퍼 식물의 절단엽에 대한 보트리티스 감염의 효과를 나타낸다. 또한 보트리티스 대신 물로 처리된 페퍼 식물 잎도 나타나 있다. "C1-y"로 표지된 우측 하단 패널은 캡탄으로 처리된 엔도르나바이러스 위성 RNA "작제물 1"(서열번호 578; "COM1")의 전신 분포를 갖는 2세대 페퍼 식물의 절단엽이다.
달리 정의되지 않는 한, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 기술 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 당업계에 제공되고 실시예 및 다양한 일반 참고문헌에서 입증된 것들과 같은 본원에 기재된 절차에는 통상적인 방법이 사용된다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 기재된 핵산 서열은 좌측에서 우측으로 읽을 때 5'에서 3' 방향으로 제공된다. 핵산 서열은 명시된 바와 같이 DNA 또는 RNA로서 제공될 수 있으며; 당업자에게 공지된 바와 같이, 하나의 개시내용은 필연적으로 다른 하나를 정의한다. 따라서 본원에 제공된 DNA 분자의 RNA 등가물은 본원에 제공된 특정 재조합 RNA에서 제공되고 사용된다. 더욱이, 공지된 코돈 축퇴로 인해, 상이한 핵산 서열이 동일한 폴리펩티드 서열을 인코딩할 수 있으며, (예를 들어, 주어진 종에 대한 코돈 최적화를 위한) 이러한 변형된 핵산 서열은 본 개시내용의 범주 내에 있다.
용어 "포함하다(comprise)"는 "포함하다(include)"를 의미하는 것으로 하고자 한다. 용어가 단수형으로 제공되는 경우, 이는 해당 용어의 복수형으로 기재되는 본 개시내용의 양태도 고려한다. 본원에 사용되는 용어 "및/또는"은 다른 것의 유무와 상관없이 다수의 명시된 특징 또는 성분 각각의 특정 개시내용으로서 간주되어야 한다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 문구에 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A"(단독) 및 "B"(단독)를 포함하는 것으로 하고자 한다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 문구에 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 하기 구현예 각각을 포함하는 것으로 하고자 한다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
재조합 폴리뉴클레오티드
본 개시내용은 특히 엔도르나바이러스의 또는 이로부터 유래된 하나 이상의 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 재조합 DNA, 재조합 RNA, 재조합 ssRNA, 재조합 벡터 등); 특히 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제(RDRP)에 의해 인식되는 5' 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열을 제공한다. 본 개시내용은 추가로, 예를 들어 식물에서 이종 카고 서열을 발현시키기 위해 이러한 재조합 폴리뉴클레오티드를 이용하고 선택적으로 이에 의해 식물의 내인성 표적 서열 및/또는 유전자형 또는 표현형의 발현을 변형함으로써 이러한 재조합 폴리뉴클레오티드를 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다. 구현예에서, 엔도르나바이러스는 편리공생 엔도르나바이러스, 즉 숙주에 명백한 부정적 효과를 야기하지 않으면서(즉, 비병원성으로 간주됨) 주어진 진핵생물 숙주(예컨대 숙주 식물)에 풍토성이거나 고유한 엔도르나바이러스이고, 대개 지속적이지만 낮은 집단(즉, 낮은 바이러스 역가)으로 존재하며 대개 숙주의 다음 세대에 수직으로 전파된다. 구현예에서, 엔도르나바이러스는 배우자(난세포 및/또는 꽃가루 또는 정세포)를 통해 자손 식물에 전파되며, 따라서 자손 식물 전체에 걸쳐 그의 다양한 세포 및 조직에 존재하고; 구현예에서, 엔도르나바이러스는 일반적으로 식물 내의 세포 간에 이동하지 않고/않거나 일반적으로 수평적으로(예를 들어, 기계적 손상을 통해 또는 곤충 벡터를 통해 개별 식물 사이에서) 전파되지 않는다. 구현예에서, 엔도르나바이러스는 외인성으로 도입된 엔도르나바이러스(즉, 숙주에 풍토성이거나 고유하지 않지만 인공적으로 도입된 것)이다. 예를 들어, 하나의 캡시쿰(Capsicum) 종, 변종 또는 생식질에서 본래 발견되는 엔도르나바이러스는 상응하는 재조합 엔도르나바이러스 위성 RNA가 있든 없든, 상이한 캡시쿰 종, 변종 또는 생식질 내로, 또는 심지어 상이한 가지과 식물 내로 도입될 수 있다. 구현예에서, 완전한 자가 복제 엔도르나바이러스 위성 시스템은 식물 또는 식물 세포 내로 도입되며, 자가 복제 엔도르나바이러스 위성 시스템은 (1) 5'에서 3' 순서로, (a) 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제(RDRP)에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; (b) 카고 RNA 서열; 및 (c) 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는 재조합 엔도르나바이러스 위성 RNA로서, 선택적으로, (d) 바이러스 이동 단백질(MP)을 인코딩하는 적어도 하나의 RNA; (e) 적어도 하나의 tRNA 유사 서열(TLS); 및 (f) 캡시드화 인식 서열(ERS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 요소를 추가로 포함하는 재조합 엔도르나바이러스 위성 RNA; 및 (2) 식물 또는 식물 세포에서 복제 가능하고, 재조합 엔도르나바이러스 위성 RNA에서 5' 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 엔도르나바이러스 RDRP를 인코딩하는 외인성 엔도르나바이러스(예를 들어, 식물 또는 식물 세포에 풍토성이거나 고유하지 않은 엔도르나바이러스)를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 분자는 서열번호 114 내지 161로 이루어진 군으로부터 선택되는 DNA 서열에 의해 인코딩된 RNA 서열을 포함하는 tRNA 유사 서열(TLS)을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 분자는 서열번호 114 내지 161로 이루어진 군으로부터 선택되는 DNA 서열에 의해 인코딩된 RNA 서열을 포함하는 스캐폴드 tRNA 유사 서열과 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖고 스캐폴드 tRNA 유사 서열의 이차 구조를 유지하는 변형된 tRNA 유사 서열을 포함한다.
DNA 분자
일 양태에서, 본 개시내용은 세포에서 기능적이고 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 분자에 관한 것이다. RNA 분자는 5'에서 3' 순서로 하기를 포함한다: (a) 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제(RDRP)에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; (b) 카고 RNA 서열; 및 (c) 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열. 도 1은 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 인코딩하는 DNA 폴리뉴클레오티드의 일반화된 구조의 구현예를 나타낸다. 예시적인 DNA 폴리뉴클레오티드(작제물 1 내지 11)는 표 7 및 실시예 1 내지 14에 기재되어 있다.
발현된 RNA 분자 또는 "엔도르나바이러스 위성" RNA는 5'에서 3' 순서로 하기를 포함한다: 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제(RDRP)에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; 카고 RNA 서열; 및 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열.
발현된 RNA 분자는 선택적으로 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 요소를 추가로 포함한다: (d) 바이러스 이동 단백질(MP)을 인코딩하는 적어도 하나의 RNA; (e) 적어도 하나의 tRNA 유사 서열; 및 (f) 캡시드화 인식 서열(ERS).
DNA, RNA 및 폴리뉴클레오티드와 같은 변형 분자를 구축하는 데 유용한 추가 요소뿐만 아니라 상기 언급된 요소가 이제 기재될 것이다.
프로모터
상기 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 양태는 세포(예를 들어, 박테리아 세포, 식물 세포, 진균 세포 또는 동물 세포)에서 기능적이고 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 분자에 관한 것이다. "작동 가능하게 연결된"은 적절한 분자(예를 들어, 폴리머라제)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 허용하는 방식으로 폴리뉴클레오티드 및 조절 서열(들)이 연결되는 것을 의미한다. "조절 요소"는 폴리뉴클레오티드 발현의 일부 양태를 제어하는 유전 요소를 의미한다. 예를 들어, 프로모터는 코딩 또는 비코딩 영역과 같은 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 카고 RNA 서열)의 전사의 개시를 용이하게 하는 조절 요소이다. 다른 조절 요소는 본원에 기재된 것들을 포함한다.
예를 들어, 진핵생물에서의 전사 조절 요소는 프로모터 및 선택적으로 다른 조절 요소를 포함한다. 프로모터 및 다른 조절 요소는 전사에 관여하는 세포 단백질과 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 서열의 어레이를 포함한다. 프로모터 및 연관된 요소는 포유동물, 동물, 곤충, 진균 및 박테리아 세포 및 본원에 기재된 해당 바이러스에서의 유전자를 포함하는 다양한 진핵, 원핵 및 바이러스 공급원으로부터 단리되었지만 이에 제한되지 않는다.
구현예에서, 식물 세포에서 기능적인 프로모터는 세포-, 조직- 또는 기관-특이적 유전자 발현, 또는 외부 신호 또는 제제(예를 들어, 광-, 병원체-, 상처-, 스트레스-, 또는 호르몬-유도 가능 요소 또는 화학적 유도물질)에 의해 유도 가능한 요소 또는 유전자 전사를 순환시킬 수 있는 요소에 대해 프로모터 의존성 유전자 발현을 제어 가능하게 하며; 이러한 요소는 천연 유전자의 5' 또는 3' 영역에 위치하거나 폴리뉴클레오티드로 조작될 수 있다.
일부 구현예에서, 프로모터는 그것이 기능적인 세포에 대해, 및/또는 프로모터가 작동 가능하게 연결된 다른 요소에 대해 이종성이다.
예시적인 프로모터는 바이러스, 박테리아, 진균, 동물 및 식물로부터의 프로모터를 포함한다. 프로모터의 구현예는 콜리플라워 모자이크 바이러스(예를 들어, p35S), 박테리오파지(예를 들어, pT7) 및 식물(예를 들어, pATUBQ10)로부터의 프로모터를 포함한다. 예를 들어, 표 7에 기재된 프로모터를 참조한다.
특정 구현예에서, 프로모터는 다수의 RNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결되고, RNA를 인코딩하는 서열은 마이크로RNA 인식/절단 부위 또는 자가 절단 리보자임을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과 같은 절단 부위에 의해 분리된다(예를 들어, 문헌[Ferr
Figure pct00001
-D'Amar
Figure pct00002
and Scott (2014) Cold Spring Harbor Perspectives Biol., 2:a003574] 참조). 특정 구현예에서, 프로모터는 RNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 pol II 프로모터이다. 특정 구현예에서, 게놈 편집 시스템의 요소를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 식물 세포에서 DNA 발현을 유도하는 구성적 프로모터이다. 특정 구현예에서, 프로모터는 핵 또는 소기관, 예컨대 색소체(예를 들어, 엽록체) 또는 미토콘드리아에서 DNA 발현(예를 들어, RNA 및/또는 단백질 발현)을 유도한다. 엔도르나바이러스 RDRP를 포함하는 관심 유전자를 발현시키는 데 사용될 수 있는 색소체에서 이종 유전자를 발현시키기 위한 방법 및 조성물은 미국 특허 출원 공개 제US20220220493호, 제US20120151627호, 제US20080086788호, 및 제US20040040058호에 개시된 것들을 포함하고, 이는 각각 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함되며, 식물 세포에서 활성인 구성적 프로모터의 예는 미국 특허 제5,858,742호 및 제5,322,938호에 개시된 CaMV 35S 프로모터, 미국 특허 제5,641,876호에 개시된 벼 액틴 프로모터, 미국 특허 제7,151,204호에 개시된 메이즈 엽록체 알돌라제 프로모터, 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로부터의 노팔린 신타제(NOS) 및 옥토핀 신타제(OCS) 프로모터를 포함한다. 특정 구현예에서, 게놈 편집 시스템의 요소를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 엽육 세포의 엽록체에서 활성인 피그워트 모자이크 바이러스(figwort mosaic virus, FMV)로부터의 프로모터, RUBISCO 프로모터 또는 피루브산인산 이인산화효소(PDK) 프로모터이다.
엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제(RDRP)에 의해 인식되는 5' 및 3' 레플리카제 인식 서열
본 개시내용의 다양한 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제(RDRP)에 의해 인식되는 5' 및 3' 레플리카제 인식 서열을 포함한다. 이러한 서열의 유용성을 평가할 시, RDRP 활성은 문헌[Horiuchi et al. Plant Cell Physiol. 42(2):197-203, 2001]에 기재된 것과 같은 표준 방법에 따라 검출된다.
예시적인 벨 페퍼 엔도르나바이러스(bell pepper endornaviral, BPEV) 및 오리자 사티바 엔도르나바이러스(Oryza sativa endornaviral, OsEV) 5' 및 3' 레플리카제 인식 서열은 표 7에 도시되어 있다.
추가로, 엔도르나바이러스 5' 및 3' 레플리카제 인식 서열에서 식별된 보존된 구조적 모티프는 표 8 내지 13에 나타나 있다. 이러한 모티프의 크기는 30 내지 50개 뉴클레오티드(nt) 범위이며 전형적으로 약 40 nt이다. 이들 모티프는 엔도르나바이러스 레플리카제 인식 서열로서 기능하는 조작된 폴리뉴클레오티드 서열을 설계하는 데 유용하다. 엔도르나바이러스 위성 RNA의 구현예는 5' 레플리카제 인식 서열이 이러한 5' 보존 모티프 중 하나 이상을 포함하고/하거나 3' 레플리카제 인식 서열이 이러한 3' 보존 모티프 중 하나 이상을 포함하는 것들을 포함한다.
특히 표 8 내지 10에는, 각각 5' 보존 모티프 1(완벽한 염기쌍 줄기의 말단에 약 3 내지 6개의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드의 작은 회전 루프를 포함하는 약 33개 뉴클레오티드의 줄기-루프 구조를 포함함), 5' 보존 모티프 2(완벽하지 않은 염기쌍 줄기의 말단에 약 10 내지 15개의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드의 큰 회전 루프를 포함하는 약 35개 뉴클레오티드의 줄기-루프 구조를 포함함), 및 5' 보존 모티프 3(일반적으로 완벽하거나 거의 완벽한 염기쌍인 줄기의 말단에 약 4개의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드의 작은 회전 루프를 포함하는 약 28개 뉴클레오티드의 줄기-루프 구조를 포함함)이 기재되어 있다. 이들 모티프는 각각 도 3, 도 4, 및 도 5에 도시되어 있다. 구현예에서, 합성 엔도르나바이러스 위성은 이들 5' 보존 모티프 중 적어도 2개(즉, 5' 보존 모티프 1, 5' 보존 모티프 2 및 5' 보존 모티프 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개)를 포함하는 합성 5' 레플리카제 인식 서열을 포함한다. 구현예에서, 합성 엔도르나바이러스 위성은 5' 보존 모티프 1, 5' 보존 모티프 2 및 5' 보존 모티프 3을 포함하는 합성 5' 레플리카제 인식 서열을 포함하며; 특정 구현예에서 이들 모티프는 기재된 바와 같이 5'에서 3' 순서로 5' 복제 인식 서열에 위치한다.
특히 표 11 내지 13에는, 각각 3' 보존 모티프 1(1개 또는 2개의 비염기쌍 염기를 함유할 수 있는 짧은 줄기의 말단에 약 11 내지 15개의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드의 큰 회전 루프를 포함하는 약 26개 뉴클레오티드의 줄기-루프 구조를 포함함), 3' 보존 모티프 2(완벽하지 않은 염기쌍 줄기의 말단에 가변 크기의 회전 루프(관찰: 5 내지 15개의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드)를 포함하는 약 41개 뉴클레오티드의 줄기-루프 구조를 포함함), 및 3' 보존 모티프 3(완벽하지 않은 염기쌍 줄기의 말단에 3 내지 6개(전형적으로 3개)의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드의 작은 회전 루프를 포함하는 약 31개 뉴클레오티드의 줄기-루프 구조를 포함함; 일부 경우에 줄기는 줄기의 반대쪽에 있는, 동일하지 않은 수의 비염기쌍 뉴클레오티드에 의해 형성된 "꼬임(kink)"을 가짐)이 기재되어 있다. 이들 모티프는 각각 도 9, 도 10, 및 도 11에 도시되어 있다. 구현예에서, 합성 엔도르나바이러스 위성은 이들 3' 보존 모티프 중 적어도 2개(즉, 3' 보존 모티프 1, 3' 보존 모티프 2 및 3' 보존 모티프 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개)를 포함하는 합성 3' 레플리카제 인식 서열을 포함한다. 구현예에서, 합성 엔도르나바이러스 위성은 3' 보존 모티프 1, 3' 보존 모티프 2 및 3' 보존 모티프 3을 포함하는 합성 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하며; 특정 구현예에서 이들 모티프는 기재된 바와 같이 5'에서 3' 순서로 3' 복제 인식 서열에 위치한다.
표 8 내지 13에 제공된 점 괄호 표기법은 염기쌍 확률의 최소 자유 에너지 예측을 기반으로 RNA 이차 구조를 예측하기 위한 RNA Fold 소프트웨어를 사용하여 생성되었다. 점 '.'은 쌍을 이루지 않은 염기를 나타내고, 괄호 '('또는')'는 쌍을 이루는 염기를 나타낸다. 점 괄호 표기법은 문헌[Mattei et al., Nucleic Acids Research, 42(10): 6146-6157, 2014]; 문헌[Ramlan and Zauner In: International Workshop on Computing With Biomolecules, E. Csuhaj-Varju, R. Freund, M. Oswald and K. Salomaa (Eds.), 27 August 2008, Wien, Austria, pp. 75-86, From: Austrian Computer Society, 2008]; 및 문헌[Hofacker et al., Monatshefte Fur Chemie Chem. Monthly, 125: 167-188, 1994]에 추가로 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스(예를 들어, 편리공생 엔도르나바이러스)의 5' UTR(비번역 영역) 서열을 포함한다. 5' 레플리카제 인식 서열의 구현예는 표 1에 기재된 보존된 5'UTR 서열 및 다른 5' 레플리카제 인식 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 5' UTR 서열에 인접하여 그의 3'에 본래 위치하는 엔도르나바이러스의 게놈 서열을 추가로 포함한다(예를 들어, 표 1에 기재된 게놈 서열의 대략 500개 염기를 포함하는 엔도르나바이러스 5' UTR 서열을 참조). 또 다른 추가의 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 19, 372 내지 405, 465, 및 483 내지 485(표 1에서 발견됨)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 의해 인코딩된 RNA 서열, 또는 서열번호 580의 RNA 서열과 적어도 80%(예를 들어, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 서열 동일성을 갖는 5' 레플리카제 인식 서열을 포함한다. 엔도르나바이러스 5'UTR의 500개 염기의 환경에서의 구조적 모티프 1, 2 및 3은 각각 도 3, 도 4 및 도 5에 도시되어 있다. 5'UTR 내의 이들 모티프의 위치는 도 6, 도 7, 및 도 8의 모티프 위치에 대한 히스토그램에 추가로 도시되어 있다. 특정 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 1 내지 19, 372 내지 405, 465, 또는 483 내지 485 중 적어도 하나에 의해 인코딩된 RNA 서열, 또는 서열번호 580의 RNA 서열의 적어도 50개, 적어도 75개, 적어도 100개, 또는 적어도 200개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 367, 355 내지 366, 368 내지 371, 456, 또는 534 내지 577 중 임의의 하나와 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식된다.
다른 구현예에서, 3' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스(예를 들어, 편리공생 엔도르나바이러스)의 3' UTR 서열을 포함한다. 3' 레플리카제 인식 서열의 구현예는 표 1에 기재된 보존된 3'UTR 서열 및 다른 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 구현예에서, 3' 레플리카제 인식 서열은 3' UTR 서열에 인접하여 그의 5'에 본래 위치하는 엔도르나바이러스의 게놈 서열을 추가로 포함한다(예를 들어, 표 1에 기재된 게놈 서열의 대략 500개 염기를 포함하는 엔도르나바이러스 3' UTR 서열을 참조). 또 다른 추가의 구현예에서, 작제물은 서열번호 20 내지 38, 406 내지 454, 467, 및 486 내지 488(표 1에서 발견됨)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 의해 인코딩된 RNA 서열 및 서열번호 580의 RNA 서열, 서열번호 20 내지 38, 406 내지 454, 467, 또는 486 내지 488에 의해 인코딩된 RNA 서열, 또는 서열번호 581의 RNA 서열과 적어도 80%(예를 들어, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 서열 동일성을 갖는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함한다. 엔도르나바이러스 3'UTR의 500개 염기의 환경에서의 구조적 모티프 1, 2 및 3은 각각 도 9, 도 10 및 도 11에 도시되어 있다. 5'UTR 내의 이들 모티프의 위치는 도 12, 도 13, 및 도 14의 모티프 위치에 대한 히스토그램에 추가로 도시되어 있다. 특정 구현예에서, 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 20 내지 38, 406 내지 454, 467, 또는 486 내지 488에 의해 인코딩된 RNA 서열 중 적어도 하나, 또는 서열번호 581의 RNA 서열의 적어도 50개, 적어도 75개, 적어도 100개, 또는 적어도 200개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 367, 355 내지 366, 368 내지 371, 456, 또는 534 내지 577 중 임의의 하나와 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식된다.
구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열은 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 동일한 엔도르나바이러스로부터의 5' 및 3' 레플리카제 인식 서열은 표 15에 제시된 쌍을 포함한다. 특정 구현예에서, 동일한 엔도르나바이러스로부터의 5' 및 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 2 및 서열번호 21, 서열번호 3 및 서열번호 22, 서열번호 4 및 서열번호 23, 서열번호 5 및 서열번호 24, 서열번호 6 및 서열번호 25, 서열번호 7 및 서열번호 26, 서열번호 8 및 서열번호 27, 서열번호 9 및 서열번호 28, 서열번호 10 및 서열번호 29, 서열번호 11 또는 378 및 서열번호 30 또는 415, 서열번호 12 및 서열번호 31 또는 452, 서열번호 13 및 서열번호 32, 서열번호 14 및 서열번호 33, 서열번호 15 및 서열번호 34, 서열번호 16; 및 서열번호 35 또는 412, 서열번호 17 또는 404 및 서열번호 36 또는 450, 서열번호 18 또는 379 및 서열번호 37 또는 416, 서열번호 19 및 서열번호 38, 서열번호 372 및 서열번호 406, 서열번호 373 및 서열번호 408, 서열번호 374 및 서열번호 409, 서열번호 375 및 서열번호 410, 서열번호 376 및 서열번호 411, 서열번호 377 및 서열번호 414, 서열번호 380 및 서열번호 419, 서열번호 381 및 서열번호 420, 서열번호 382 및 서열번호 421, 서열번호 383 및 서열번호 422, 서열번호 384 및 서열번호 423, 서열번호 385 및 서열번호 424, 서열번호 386 및 서열번호 425, 서열번호 387 및 서열번호 427, 서열번호 388 및 서열번호 429, 서열번호 389 및 서열번호 432, 서열번호 390 및 서열번호 433, 서열번호 391 및 서열번호 434, 서열번호 392 및 서열번호 436, 서열번호 393 및 서열번호 437, 서열번호 394 및 서열번호 438, 서열번호 395 및 서열번호 439, 서열번호 396 및 서열번호 440, 서열번호 397 및 서열번호 441, 서열번호 398 및 서열번호 442, 서열번호 399 및 서열번호 443, 서열번호 400 및 서열번호 445, 서열번호 401 및 서열번호 446, 서열번호 402 및 서열번호 447, 서열번호 403 및 서열번호 448, 서열번호 405 및 서열번호 451, 서열번호 483 및 서열번호 486, 서열번호 484 및 서열번호 487, 서열번호 485 및 서열번호 488, 서열번호 465 및 서열번호 467에 의해 인코딩된 RNA; 서열번호 580 및 서열번호 581의 RNA, 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열, 3' 레플리카제 인식 서열 및 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제는 모두 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 5' RNA 레플리카제 인식 서열 및 3' RNA 레플리카제 인식 서열은 서로 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 엔도르나바이러스 게놈으로부터 얻어진다. 특정 구현예에서, 5' RNA 레플리카제 인식 서열, 3' RNA 레플리카제 인식 서열 및 RDRP는 서로 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 엔도르나바이러스 게놈으로부터 얻어진다. 특정 구현예에서, 5' RNA 레플리카제 인식 서열, 3' RNA 레플리카제 인식 서열 및 RDRP 코딩 영역은 2개의 엔도르나바이러스 게놈으로부터 얻어지고, 5' RNA 레플리카제 인식 서열, 3' RNA 레플리카제 인식 서열 및/또는 RDRP 코딩 서열의 각 쌍의 구성원은 서로 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열은 상이한 엔도르나바이러스로부터 유래된다. 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열은 벨 페퍼 엔도르나바이러스(BPEV), 파세올루스 불가리스 알파엔도르나바이러스(Phaseolus vulgaris alphaendornavirus) 1(PvEV-1), 파세올루스 불가리스 엔도르나바이러스(Phaseolus vulgaris endornavirus) 2(PvEV-2) 및 헬리안투스 아누스 알파엔도르나바이러스(Helianthus annuus alphaendornavirus) 분리주 BJ로 이루어진 군으로부터 선택되는 엔도르나바이러스로부터 유래된다. 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열은 바셀라 알바 알파엔도르나바이러스(Basella alba alphaendornavirus) 1, 벨 페퍼 알파엔도르나바이러스(Bell pepper alphaendornavirus), 클러스터 콩 알파엔도르나바이러스(Cluster bean alphaendornavirus) 1, 쿠쿠미스 멜로 알파엔도르나바이러스(Cucumis melo alphaendornavirus), 헬리안투스 아누스 알파엔도르나바이러스, 호르데움 불가레 알파엔도르나바이러스(Hordeum vulgare alphaendornavirus), 핫 페퍼 알파엔도르나바이러스(Hot pepper alphaendornavirus), 라게나리아 시세라리아 알파엔도르나바이러스(Lagenaria siceraria alphaendornavirus), 오리자 루피포곤 알파엔도르나바이러스(Oryza rufipogon alphaendornavirus), 오리자 사티바 알파엔도르나바이러스(Oryza sativa alphaendornavirus), 페르세아 아메리카나 알파엔도르나바이러스(Persea americana alphaendornavirus) 1, 파세올루스 불가리스 알파엔도르나바이러스 1, 파세올루스 불가리스 알파엔도르나바이러스 2, 파세올루스 불가리스 알파엔도르나바이러스 3, 비시아 파바 알파엔도르나바이러스(Vicia faba alphaendornavirus), 날개콩 알파엔도르나바이러스(Winged bean alphaendornavirus) 1, 및 예르바 마테 알파엔도르나바이러스(Yerba mate alphaendornavirus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 엔도르나바이러스로부터 유래된다. 추가의 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열은 바셀라 알바 알파엔도르나바이러스 균주 Oahu4, 벨 페퍼 알파엔도르나바이러스 분리주 Antioquia May 5, 벨 페퍼 알파엔도르나바이러스 분리주 BPEV_Panama, 벨 페퍼 알파엔도르나바이러스 분리주 LA-E, 벨 페퍼 알파엔도르나바이러스 분리주 Marinilla, 벨 페퍼 알파엔도르나바이러스 분리주 May8A, 벨 페퍼 알파엔도르나바이러스 분리주 MS1, 벨 페퍼 알파엔도르나바이러스 분리주 San Vicente, 벨 페퍼 알파엔도르나바이러스 분리주 XJ, 벨 페퍼 엔도르나바이러스 분리주 BPEV-YW, 벨 페퍼 엔도르나바이러스 분리주 lj, 벨 페퍼 엔도르나바이러스 분리주 Maor, 벨 페퍼 엔도르나바이러스 분리주 Penol, 벨 페퍼 엔도르나바이러스 균주 IS, 갈조류 엔도르나바이러스 1 Chiba1, 갈조류 엔도르나바이러스 2 Chiba2, 캡시쿰 프루테센스 엔도르나바이러스(Capsicum frutescens endornavirus) 1 분리주 LA-A, 캡시쿰 프루테센스 엔도르나바이러스 1 분리주 LA-B, 캡시쿰 프루테센스 엔도르나바이러스 1 분리주 LA-C, 캡시쿰 프루테센스 엔도르나바이러스 1 분리주 MC7, 클러스터 콩 엔도르나바이러스 1 분리주 593049, 오이 엔도르나바이러스 1 분리주 CuEV1, 쿠쿠미스 멜로 알파엔도르나바이러스 분리주 IL, 쿠쿠미스 멜로 알파엔도르나바이러스 균주 CmEV/BRA/TO-23/2014, 쿠쿠미스 멜로 엔도르나바이러스 분리주 CL-01, 쿠쿠미스 멜로 엔도르나바이러스 분리주 CL-01, 파고피룸 에스쿨렌툼 엔도르나바이러스(Fagopyrum esculentum endornavirus) 2 분리주 SK, 제라늄 카롤리니아눔 엔도르나바이러스(Geranium carolinianum endornavirus), 헬리안투스 아누스 알파엔도르나바이러스 분리주 BJ, 호르데움 불가레 알파엔도르나바이러스 분리주 HYT-37, 호르데움 불가레 알파엔도르나바이러스 분리주 HYT-38, 라게나리아 시세라리아 엔도르나바이러스-California, 라게나리아 시세라리아 엔도르나바이러스-Hubei, 백합 알파엔도르나바이러스 분리주 BJ, 오리자 사티바 알파엔도르나바이러스 분리주 BXCFS134, 오리자 사티바 알파엔도르나바이러스 분리주 DHCFY127945, 페르세아 아메리카나 엔도르나바이러스 분리주 Fuerte, 파세올루스 엔도르나바이러스 3 분리주 LA, 파세올루스 불가리스 알파엔도르나바이러스 1 분리주 PVAV1/CG6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 엔도르나바이러스로부터 유래된다.
5' 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열의 다른 구현예는 엔도르나바이러스 게놈의 5' 말단 영역 및 3' 말단 영역을 각각 포함하거나 그로부터 유래된 RNA 서열이고, 5' 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스 RdRP에 의한(예를 들어, 동일한 엔도르나바이러스 게놈으로부터 식별된 동족 RdRP에 의한) 인식 및 복제를 허용한다. 이러한 구현예는, 예를 들어 엔도르나바이러스 게놈의 5' 또는 3' 말단 영역에 위치하는 적어도 50개, 적어도 100개, 적어도 150개, 적어도 200개, 적어도 250개, 적어도 300개, 적어도 350개, 적어도 400개, 적어도 450개, 또는 적어도 500개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 레플리카제 인식 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 약 300개 미만의 뉴클레오티드 또는 약 400개 미만의 뉴클레오티드(예를 들어, 약 200개 또는 약 225개 또는 약 250개 뉴클레오티드)를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 더 길거나(예를 들어, 적어도 400개, 적어도 500개, 적어도 600개, 적어도 700개, 적어도 800개, 적어도 900개, 또는 적어도 1000개 뉴클레오티드) 연장된 5' 레플리카제 인식 서열이다. 일부 구현예에서 5' 레플리카제 인식 서열은 야생형 엔도르나바이러스 게놈의 내인성 "닉"의 위치까지 또는 그를 지나 연장되는 뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서 5' 레플리카제 인식 서열은 폴리단백질을 인코딩하는 엔도르나바이러스 게놈의 영역 내로 연장되는 뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 더 길거나(예를 들어, 적어도 400개, 적어도 500개, 적어도 600개, 적어도 700개, 적어도 800개, 적어도 900개, 또는 적어도 1000개 뉴클레오티드) 연장된 5' 레플리카제 인식 서열을 포함하는 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA는 더 짧은(예를 들어, 약 225개 뉴클레오티드 또는 약 300개 미만의 뉴클레오티드 또는 약 400개 미만의 뉴클레오티드) 5' 레플리카제 인식 서열을 갖지만 그 외에는 유사한 위성 RNA보다 그들의 동족 엔도르나바이러스 RdRP에 의해 더 효율적으로 복제된다. 다른 구현예는 길이가 적어도 30개 뉴클레오티드(예를 들어, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 또는 적어도 100개 뉴클레오티드)이고, 엔도르나바이러스 게놈의 가장 5'측 또는 가장 3'측 500개 뉴클레오티드 내에 위치하는 등가 길이의 세그먼트와 적어도 80%(예를 들어, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%) 서열 동일성을 갖는 레플리카제 인식 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, RNA 서열은 본원에 기재된 바와 같은 코딩 RNA, 비코딩 RNA, 또는 코딩 및 비코딩 RNA 둘 모두를 포함한다.
구현예에서, 폴리뉴클레오티드를 구축하는 데 유용한 5' 및 3' 레플리카제 인식 서열은 하기 특징 중 하나 이상을 포함한다: (1) 5' 및 3' 레플리카제 인식 서열(예를 들어, 엔도르나바이러스 레플리카제에 의해 발현을 유도하도록 인식되는 임의의 서열)로서 기능함, (2) 이차 구조를 포함함(상기 기재된 바와 같음), (3) 서열 동일성(표 1 및 7에 기재된 것들 중 임의의 것과 동일한 서열뿐만 아니라 표 1 및 7에 기재된 하나 이상의 5' 및 3' 레플리카제 인식 서열과 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열), 및 (4) 기점(예를 들어, 임의의 엔도르나바이러스로부터의 임의의 적절한 서열). 구현예에서, 이러한 서열은 자연 발생, 변형된, 및/또는 합성 서열이다. 본원에 기재된 바와 같은 (동일한 엔도르나바이러스로부터의) 캡쳐 쌍 서열(capture paired sequence) 및 (상이한 엔도르나바이러스로부터의) 혼합/매칭된 서열도 유용하다.
RNA 요소
RNA 분자는 하기 추가 요소 중 하나 이상을 선택적으로 포함한다.
엔도르나바이러스 RDRP를 인코딩하는 RNA
상기 언급된 추가 RNA 요소는 엔도르나바이러스 RDRP를 인코딩하는 RNA를 포함할 수 있다. 엔도르나바이러스 RDRP를 인코딩하는 DNA 서열의 예는 월드 와이드 웹 인터넷 데이터베이스 "ncbi.nlm.nih.gov/nuccore" 내의 항목에 대한 미국 국가생물공학센터 데이터베이스 수탁 번호를 지칭하는 디스크립터 "NC_XXXXXX" 하에 표 1에 제시된 엔도르나바이러스 게놈의 상응하는 서열을 포함한다. 엔도르나바이러스 RDRP 및 엔도르나바이러스 RDRP 단백질 서열을 인코딩하는 DNA 서열의 예는 표 14에 제시된 서열뿐만 아니라 이와 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 DNA, 인코딩된 RNA 및 단백질 서열도 포함한다. 구현예에서, 엔도르나바이러스 RDRP 서열은 서열번호 355 내지 371, 456, 및 534 내지 577로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 80%(예를 들어, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 서열 동일성을 갖는다. 구현예에서, 엔도르나바이러스 RDRP를 인코딩하는 서열은 서열번호 338 내지 354, 455, 457, 459, 468 내지 469, 및 489 내지 533으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 80%(예를 들어, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 서열 동일성을 갖는다. 구현예에서, 엔도르나바이러스 RDRP는 벨 페퍼 엔도르나바이러스(BPEV), 파세올루스 불가리스 알파엔도르나바이러스 1(PvEV-1), 파세올루스 불가리스 엔도르나바이러스 2(PvEV-2) 및 헬리안투스 아누스 알파엔도르나바이러스 분리주 BJ로 이루어진 군으로부터 선택되는 엔도르나바이러스로부터 유래된다. 구현예에서, 엔도르나바이러스 RDRP는 바셀라 알바 알파엔도르나바이러스 1, 벨 페퍼 알파엔도르나바이러스, 클러스터 콩 알파엔도르나바이러스 1, 쿠쿠미스 멜로 알파엔도르나바이러스, 헬리안투스 아누스 알파엔도르나바이러스, 호르데움 불가레 알파엔도르나바이러스, 핫 페퍼 알파엔도르나바이러스, 라게나리아 시세라리아 알파엔도르나바이러스, 오리자 루피포곤 알파엔도르나바이러스, 오리자 사티바 알파엔도르나바이러스, 페르세아 아메리카나 알파엔도르나바이러스 1, 파세올루스 불가리스 알파엔도르나바이러스 1, 파세올루스 불가리스 알파엔도르나바이러스 2, 파세올루스 불가리스 알파엔도르나바이러스 3, 비시아 파바 알파엔도르나바이러스, 날개콩 알파엔도르나바이러스 1, 및 예르바 마테 알파엔도르나바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 엔도르나바이러스로부터 유래된다. 추가의 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열은 바셀라 알바 알파엔도르나바이러스 균주 Oahu4, 벨 페퍼 알파엔도르나바이러스 분리주 Antioquia May 5, 벨 페퍼 알파엔도르나바이러스 분리주 BPEV_Panama, 벨 페퍼 알파엔도르나바이러스 분리주 LA-E, 벨 페퍼 알파엔도르나바이러스 분리주 Marinilla, 벨 페퍼 알파엔도르나바이러스 분리주 May8A, 벨 페퍼 알파엔도르나바이러스 분리주 MS1, 벨 페퍼 알파엔도르나바이러스 분리주 San Vicente, 벨 페퍼 알파엔도르나바이러스 분리주 XJ, 벨 페퍼 엔도르나바이러스 분리주 BPEV-YW, 벨 페퍼 엔도르나바이러스 분리주 lj, 벨 페퍼 엔도르나바이러스 분리주 Maor, 벨 페퍼 엔도르나바이러스 분리주 Penol, 벨 페퍼 엔도르나바이러스 균주 IS, 갈조류 엔도르나바이러스 1 Chiba1, 갈조류 엔도르나바이러스 2 Chiba2, 캡시쿰 프루테센스 엔도르나바이러스 1 분리주 LA-A, 캡시쿰 프루테센스 엔도르나바이러스 1 분리주 LA-B, 캡시쿰 프루테센스 엔도르나바이러스 1 분리주 LA-C, 캡시쿰 프루테센스 엔도르나바이러스 1 분리주 MC7, 클러스터 콩 엔도르나바이러스 1 분리주 593049, 오이 엔도르나바이러스 1 분리주 CuEV1, 쿠쿠미스 멜로 알파엔도르나바이러스 분리주 IL, 쿠쿠미스 멜로 알파엔도르나바이러스 균주 CmEV/BRA/TO-23/2014, 쿠쿠미스 멜로 엔도르나바이러스 분리주 CL-01, 쿠쿠미스 멜로 엔도르나바이러스 분리주 CL-01, 파고피룸 에스쿨렌툼 엔도르나바이러스 2 분리주 SK, 제라늄 카롤리니아눔 엔도르나바이러스, 헬리안투스 아누스 알파엔도르나바이러스 분리주 BJ, 호르데움 불가레 알파엔도르나바이러스 분리주 HYT-37, 호르데움 불가레 알파엔도르나바이러스 분리주 HYT-38, 라게나리아 시세라리아 엔도르나바이러스-California, 라게나리아 시세라리아 엔도르나바이러스-Hubei, 백합 알파엔도르나바이러스 분리주 BJ, 오리자 사티바 알파엔도르나바이러스 분리주 BXCFS134, 오리자 사티바 알파엔도르나바이러스 분리주 DHCFY127945, 페르세아 아메리카나 엔도르나바이러스 분리주 Fuerte, 파세올루스 엔도르나바이러스 3 분리주 LA, 파세올루스 불가리스 알파엔도르나바이러스 1 분리주 PVAV1/CG6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 엔도르나바이러스로부터 유래된다.
바이러스 이동 단백질(MP)을 인코딩하는 RNA
기계적 가설에 얽매이지 않고, 바이러스 이동 단백질은, RNA에 결합하고, 예를 들어 원형질연락사를 통해 식물 전체에 걸쳐 그의 이동(그리고 그에 따라 카고 RNA의 이동)을 돕는 것으로 여겨진다. 예시적인 MP는 비제한적으로 담배 모자이크 바이러스, 검은눈콩 모자이크 바이러스, 감자 잎말림 바이러스, 토마토 반점 시듦 바이러스 및 토마토 모자이크 바이러스 내의 MP를 포함한다. 다양한 바이러스로부터의 MP는 표 3에 기재되어 있다. 예시적인 페퍼 마일드 모틀 바이러스 MP(pepper mild mottle virus MP, PMMoV MP)는 표 7에 기재되어 있다.
tRNA 유사 서열(TLS)
TLS는 평소라면 이동성이 없었을 RNA의 이동성을 촉발시켜 RNA 분자의 전신 전달을 증가시키는 것을 도울 수 있다. TLS는 tRNA 및 다른 유전 요소, 예를 들어 mRNA로부터 식별된 tRNA 유사 서열을 포함한다. 예시적인 TLS, 이소류신 tRNA는 표 7에 기재되어 있다. 폴리뉴클레오티드를 구축하는 데 유용한 아라비돕시스에서 식별된 TLS를 포함하는 다른 이동성 RNA는 표 4에 기재되어 있다. 표 4를 조립할 시, 이동성 mRNA 서열은 아라비돕시스에 대한 PLAMOM 데이터베이스로부터 다운로드하였다. RFAM 데이터베이스로부터의 tRNA "시드 정렬"은 스톡홀름 포맷(다중 서열 정렬 + 이차 구조)으로 다운로드하였다. tRNA 스톡홀름 정렬을 위해 INFERNAL을 사용하여 공분산 모델을 생성하였다. PLAMOM mRNA 서열을 일차 및 이차 구조 특징을 기반으로 tRNA와의 유의미한 유사성에 대해 스캔하였다. 이어서 유의미한 히트(E-val < 1)를 갖는 mRNA 서열을 fasta 파일에 저장하였다. 일 구현예에서, 이러한 tRNA 유사 서열은 아라비돕시스 개화 시기 T(FT) mRNA로부터의 tRNA 유사 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 분자는 바이러스 MP를 인코딩하는 적어도 하나의 RNA, 아라비돕시스 FT mRNA로부터의 tRNA 유사 서열, 및 TMV-OAS를 포함하는 캡시드화 인식 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, tRNA 유사 서열(TLS)은 서열번호 114 내지 161로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, TLS는 서열번호 114 내지 161로 이루어진 군으로부터 선택되는 DNA 분자에 의해 인코딩된 RNA 서열을 포함하는 스캐폴드 tRNA 유사 서열과 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖고 스캐폴드 tRNA 유사 서열의 이차 구조를 유지하는 변형된 tRNA 유사 서열을 포함한다.
바이러스 외피 단백질 및 캡시드화 인식 서열(ERS)
바이러스 외피 단백질(CP)은, 예를 들어 CP를 인코딩하는 재조합 작제물의 공동 발현에 의해 또는 식물 세포 내로 도입되거나 그에 내인성인 바이러스에 의한 천연 발현에 의해 제공될 수 있다. CP에 의한 RNA 분자의 캡시드화는 캡시드화 인식 서열(ERS), 예를 들어 조립 기점 서열(OAS)을 함유하는 경우에 달성된다. 표 2에는 작제물을 조작할 시에 유용한 다양한 바이러스로부터의 몇몇 OAS 및 CP 서열이 기재되어 있다. 표 7에는 담배 모자이크 바이러스(TMV) 외피 단백질 및 OAS를 포함하는 작제물이 기재되어 있다. 구현예에서, OAS는 작제물의 3' 말단 근처, 예를 들어 카고 서열의 3' 영역 내에 위치한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, OAS는 3' 레플리카제 인식 서열(예를 들어, BPEV 또는 OsEv 3' 레플리카제 인식 서열)의 5'에서 발견된다. 구현예에서, RNA 분자의 3' 말단에 위치하는 TMV-OAS는 TMV 외피 단백질에 의해 인식되어, RNA 주위에서 TMV 유사 비리온의 조립을 야기한다. 대안적으로, RNA 분자는 폴리펩티드와 회합되거나 복합체화될 수 있다. 구현예에서, RNA 분자는 항체와 같은 폴리펩티드에 의해 인식되고 결합될 수 있는 RNA 앱타머를 포함한다. 다른 구현예에서, RNA 분자는 MS2 박테리오파지 외피 단백질(GFP와 같은 다른 폴리펩티드에 선택적으로 융합될 수 있음)에 의해 인식되고 결합되는 (MS2 박테리오파지 게놈으로부터의) 적어도 하나의 MS2 줄기-루프를 포함한다.
리보자임
조작된 작제물의 구현예는 비제한적으로 적어도 하나의 자가 절단 리보자임, 리간드 반응성 자가 절단 리보자임(압타자임), 표적 서열을 절단하도록 설계된 트랜스-절단 리보자임(예를 들어, 페퍼 PDS 서열을 절단하도록 설계된 트랜스-절단 망치머리형 리보자임, 표 7 참조), 델타 간염 바이러스(HDV) 리보자임(표 7 참조), 또는 망치머리형 리보자임(표 7 참조)을 포함한다. 다양한 구현예에서, 다수의 리보자임이 폴리뉴클레오티드에 포함된다. 전형적으로, 이러한 리보자임은 5' 레플리카제 인식 서열의 5' 또는 3' 레플리카제 인식 서열의 3'에 위치한다. 작제물에 다수의 리보자임을 위치시키는 것을 포함하여, 이러한 리보자임을 위치시키는 것에 대한 비제한적 예는 표 7에 나타나 있다.
인트론 서열
구현예에서, 인트론 서열은 조작된 작제물에 포함된다. 예시적인 인트론 서열은 표 6에 기재되어 있다. 다양한 구현예에서, 인트론 서열, 및 폴리뉴클레오티드 내에 이들을 위치시키는 것은 표 7에 도시되어 있다(예를 들어, 작제물 10 및 11을 참조).
RNA 프로모터
이러한 상기 언급된 추가 RNA 요소는 RNA 프로모터 의존성 RNA 폴리머라제(RPDRP)에 의해 인식되는 RNA 프로모터 및/또는 RNA 프로모터 의존성 RNA 폴리머라제(RPDRP)를 인코딩하는 RNA 분자를 포함할 수 있다. 이러한 RNA 프로모터 및 RPDRP의 예는 브롬 모자이크 바이러스 RNA 프로모터 및 RPDRP를 포함한다(Siegal et al. 1998, doi: 10.1073/pnas.95.20.11613). 특정 구현예에서, 이러한 RNA 프로모터는 RPDRP가 제공될 때 RNA 분자의 + 및 - 가닥 중 하나 또는 둘 모두의 생산을 허용하기 위해 5' 레플리카제 인식 서열, 카고 RNA 및 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는 RNA 분자의 5' 및/또는 3'에 배치될 수 있다. 특정 구현예에서, 이러한 RNA 프로모터는 RPDRP가 제공될 때 상응하는 카고 및/또는 추가 RNA의 생산을 허용하기 위해 카고 RNA 분자 및/또는 임의의 추가 RNA 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
다른 요소
조작된 작제물의 구현예는 당업계에 공지된 다른 추가 요소를 추가로 포함한다. 이러한 요소는 (a) 전사될 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터, 및 선택적으로 종결자 요소를 포함하는 별개의 발현 카세트(예를 들어, 표 7에서 작제물 9 및 10을 참조); (b) 발현 강화 요소(예를 들어, 발현 강화 인트론 서열을 인코딩하는 DNA); (c) 마커를 인코딩하는 DNA 서열(예를 들어, 선택 가능한 마커, 예컨대 항생제 저항성 또는 제초제 저항성 서열을 인코딩하는 DNA; 스코어링 가능한 마커 또는 검출 가능한 표지를 인코딩하는 DNA(예를 들어, 베타-글루쿠로니다제, 형광 단백질, 루시퍼라제 등); (d) DNA 앱타머;€) RNA 앱타머를 인코딩하는 DNA 서열; (f) T-DNA 좌측 및 우측 경계 DNA 서열; (g) 스페이서 DNA 서열; (h) 전사 인자 결합 부위를 인코딩하는 DNA 서열; (i) 국소화 서열을 인코딩하는 DNA 서열(예를 들어, 핵 국소화 신호(NLS), 미토콘드리아 국소화 신호 또는 색소체 국소화 신호와 같은 표적 펩티드를 인코딩하는 DNA); 또는 (j) 적어도 하나의 서열-특이적 재조합효소 인식 부위를 인코딩하는 DNA 서열(예를 들어, 주어진 재조합효소에 의해 인식되는 한 쌍의 서열-특이적 재조합효소 인식 부위); 및 (k) 전사물 안정화 또는 전사물 불안정화 서열을 인코딩하는 DNA 서열(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2007/0011761호; 및 문헌[Geisberg et al. Cell (2014) 156: 812-824] 참조)을 포함한다.
카고 RNA 서열
카고 RNA 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 단일 카고 RNA 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 적어도 2개의 카고 RNA 서열, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 10개 초과의 카고 RNA 서열을 포함한다.
길이
구현예에서, RNA 분자를 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자는 카고 RNA 서열을 포함한다. 전형적으로, 카고 RNA 서열은 길이가 최대 약 14 킬로베이스(kb)이다. 카고 RNA 서열의 예시적인 길이는 100개 염기, 200개 염기, 300개 염기, 400개 염기, 500개 염기, 600개 염기, 700개 염기, 800개 염기, 900개 염기, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 및 14 kb 길이의 범위이다. 카고 RNA 서열의 다른 예시적인 길이는 100개 이하의 뉴클레오티드(nt), 예컨대 20 nt, 30 nt, 40 nt, 50 nt, 60 nt, 70 nt, 80 nt, 90 nt 및 100 nt이다. 일부 구현예에서, 카고 RNA 서열은 14 kb 초과이고, 예를 들어 15 kb, 16 kb, 17 kb, 18 kb, 19 kb, 또는 심지어 20 kb이다. 구현예에서, 카고 RNA 서열은 하기를 포함한다: (a) 적어도 하나의 코딩 서열, (b) 적어도 하나의 비코딩 서열, 또는 (c) 적어도 하나의 코딩 서열과 적어도 하나의 비코딩 서열 둘 모두. 이러한 카고 RNA 서열은 코딩/비코딩 서열의 조합; 다수의 비코딩/코딩 서열뿐만 아니라; 앱타머, 리보자임, 및 본원에 기재된 다른 요소를 포함한다.
코딩
구현예에서, 카고 RNA 서열은 적어도 하나의 코딩 서열(예를 들어, 번역 가능한 서열)을 포함한다. 일부 구현예에서, 코딩 서열은 따라서 단백질 또는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, RNA 분자는 적어도 하나의 코딩 서열에 바로 인접하여 그의 5'에 위치하는 내부 리보솜 유입 부위(IRES)를 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 카고 RNA 서열은 다수의 코딩 서열을 포함하고, RNA 분자는 코딩 서열 각각에 바로 인접하여 그의 5'에 위치하는 IRES를 추가로 포함한다. 예시적인 IRES 서열은 표 5에 도시되어 있다. 다양한 작제물에 위치하는 IRES를 포함하는 추가의 예시적인 폴리뉴클레오티드는 표 7에 나타나 있다.
구현예에서, 카고 RNA 서열은 단백질 또는 폴리펩티드가 발현되는 식물에서 바람직한 형질을 제공하는 적어도 하나의 단백질 또는 폴리펩티드를 인코딩한다. 농업적 시용에 유용한 폴리펩티드의 비제한적 예는, 예를 들어 박테리오신, 리신, 항미생물 펩티드, 결절 C-풍부 펩티드 및 균세포 조절 펩티드를 포함한다. 이러한 폴리펩티드는 익충(예컨대 꿀벌 및 누에)의 적합성을 증가시키거나 해충 무척추동물(예컨대 진딧물, 모충, 딱정벌레 유충, 및 응애 등)의 적합성을 감소시키기 위해 표적 미생물의 수준, 활성 또는 대사를 변경하는 데 사용될 수 있다. 농업적으로 유용한 폴리펩티드의 구현예는 당업계에 공지된 바와 같이 곤충병원성 박테리아(예를 들어, 바실러스 투링기엔시스(Bacillus thuringiensis), 포토랍두스 루미네센스(Photorhabdus luminescens), 세라티아 엔토모필라(Serratia entomophila), 또는 제노랍두스 네마토필라(Xenorhabdus nematophila))에 의해 자연적으로 생산되는 것들과 같은 펩티드 독소를 포함한다. 농업적으로 유용한 폴리펩티드의 구현예는 농업적으로 중요한 해충 또는 병원체를 방제하기 위한 폴리펩티드(사이클로디펩티드 또는 디케토피페라진과 같은 작은 펩티드를 포함함), 예를 들어 식물에서 질병을 방제하기 위한 항미생물 폴리펩티드 또는 항진균 폴리펩티드, 또는 곤충 또는 선충과 같은 무척추동물 해충을 방제하기 위한 농약 폴리펩티드(예를 들어, 살충 폴리펩티드 및/또는 살선충 폴리펩티드)를 포함한다. 항미생물 폴리펩티드의 구현예는 카텔리시딘, 세크로핀, 베타-데펜신, 양서류 항미생물 펩티드(예를 들어, 아우레인 유사 펩티드, 에스쿨렌틴, 개구린, 브레비닌, 루고신, 라나투에린, 라나사이클린, 우페린, 오셀라틴, 그라하민, 니그로신, 더모셉틴, 템포린, 봄비닌, 막시민), 엔테로신, 포니세린, 메고우린, 아피다에신, 아바에신, 아타신, 박테리오신 및 란티바이오틱스, 덤시딘, 포르마에신, 할로시딘, 락토신, 타키스타틴 및 거미 및 전갈에 의해 생산되는 일부 살충 독소를 포함한다. 농업적으로 유용한 폴리펩티드의 구현예는 항체, 나노바디 및 이의 단편, 예를 들어 온전한 항체 또는 나노바디의 특이적 결합 활성의 적어도 일부(예를 들어, 적어도 10%)를 보유하는 항체 또는 나노바디 단편을 포함한다. 농업적으로 유용한 폴리펩티드의 구현예는 전사 인자, 예를 들어 식물 전사 인자를 포함하며; 예를 들어 agris-knowledgebase[dot]org/AtTFDB/에서 공개적으로 이용 가능한 모델 식물 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)에서 식별된 전사 인자 패밀리를 나열한 "AtTFDB" 데이터베이스를 참조한다. 농업적으로 유용한 폴리펩티드의 구현예는 뉴클레아제, 예를 들어 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제(예를 들어 Cas9 또는 Cas12a와 같은 Cas 뉴클레아제)를 포함한다. 농업적으로 유용한 폴리펩티드의 구현예는 세포 침투성 펩티드, 효소(예를 들어, 아밀라제, 셀룰라제, 펩티다제, 리파제, 키티나제), 펩티드 페로몬(예를 들어, 효모 또는 진균 교미 페로몬, 무척추동물 생식 및 유충 신호전달 페로몬, 예를 들어 문헌[Altstein (2004) Peptides, 25:1373-1376] 참조)을 추가로 포함한다. 농업적으로 유용한 폴리펩티드의 구현예는 유익한 농경학적 특질, 예를 들어 제초제 내성, 곤충 방제, 변형된 수확량, 진균 또는 난균류 질병 저항성 증가, 바이러스 저항성 증가, 선충 저항성 증가, 세균성 질병 저항성 증가, 식물 성장 및 발달, 변형된 전분 생산, 변형된 오일 생산, 높은 오일 생산, 변형된 지방산 함량, 높은 단백질 생산, 과일 숙성, 강화된 동물 및 인간 영양, 바이오폴리머의 생산, 환경 스트레스 저항성, 약제학적 펩티드 및 분비성 펩티드, 개선된 가공 특질, 개선된 소화율(예를 들어, 독소 수준 감소 또는 리그닌, 렉틴 및 피트산염과 같은 "항영양" 품질을 갖는 화합물 수준 감소), 효소 생산, 향미, 질소 고정, 잡종 종자 생산, 섬유 생산 및 바이오연료 생산을 부여한다. 농업적으로 유용한 폴리펩티드의 비제한적 예는 제초제 저항성(미국 특허 제6,803,501호; 제6,448,476호; 제6,248,876호; 제6,225,114호; 제6,107,549호; 제5,866,775호; 제5,804,425호; 제5,633,435호; 및 제5,463,175호), 수확량 증가(미국 특허 제RE38,446호; 제6,716,474호; 제6,663,906호; 제6,476,295호; 제6,441,277호; 제6,423,828호; 제6,399,330호; 제6,372,211호; 제6,235,971호; 제6,222,098호; 및 제5,716,837호), 곤충 방제(미국 특허 제6,809,078호; 제6,713,063호; 제6,686,452호; 제6,657,046호; 제6,645,497호; 제6,642,030호; 제6,639,054호; 제6,620,988호; 제6,593,293호; 제6,555,655호; 제6,538,109호; 제6,537,756호; 제6,521,442호; 제6,501,009호; 제6,468,523호; 제6,326,351호; 제6,313,378호; 제6,284,949호; 제6,281,016호; 제6,248,536호; 제6,242,241호; 제6,221,649호; 제6,177,615호; 제6,156,573호; 제6,153,814호; 제6,110,464호; 제6,093,695호; 제6,063,756호; 제6,063,597호; 제6,023,013호; 제5,959,091호; 제5,942,664호; 제5,942,658호, 제5,880,275호; 제5,763,245호; 제5,763,241호; 제10,017,549호; 제10,233,217호; 제10,487,123호; 제10,494,408호; 제10,494,409호; 제10,611,806호; 제10,612,037호; 제10,669,317호; 제10,827,755호; 제11,254,950호; 제11,267,849호; 제11,130,965호; 제11,136,593호; 및 제11,180,774호), 진균병 저항성(미국 특허 제6,653,280호; 제6,573,361호; 제6,506,962호; 제6,316,407호; 제6,215,048호; 제5,516,671호; 제5,773,696호; 제6,121,436호; 제6,316,407호; 및 제6,506,962호), 바이러스 저항성(미국 특허 제6,617,496호; 제6,608,241호; 제6,015,940호; 제6,013,864호; 제5,850,023호; 및 제5,304,730호), 선충 저항성(미국 특허 제6,228,992호), 세균성 질병 저항성(미국 특허 제5,516,671호), 식물 성장 및 발달(미국 특허 제6,723,897호 및 제6,518,488호), 전분 생산(미국 특허 제6,538,181호; 제6,538,179호; 제6,538,178호; 제5,750,876호; 제6,476,295호), 변형된 오일 생산(미국 특허 제6,444,876호; 제6,426,447호; 및 제6,380,462호), 높은 오일 생산(미국 특허 제6,495,739호; 제5,608,149호; 제6,483,008호; 및 제6,476,295호), 변형된 지방산 함량(미국 특허 제6,828,475호; 제6,822,141호; 제6,770,465호; 제6,706,950호; 제6,660,849호; 제6,596,538호; 제6,589,767호; 제6,537,750호; 제6,489,461호; 및 제6,459,018호), 높은 단백질 생산(미국 특허 제6,380,466호), 과일 숙성(미국 특허 제5,512,466호), 강화된 동물 및 인간 영양(미국 특허 제6,723,837호; 제6,653,530호; 제6,5412,59호; 제5,985,605호; 및 제6,171,640호), 바이오폴리머(미국 특허 제RE37,543호; 제6,228,623호; 제5,958,745호; 및 제6,946,588호), 환경 스트레스 저항성(미국 특허 제6,072,103호), 약제학적 펩티드 및 분비성 펩티드(미국 특허 제6,812,379호; 제6,774,283호; 제6,140,075호; 및 제6,080,560호), 개선된 가공 특질(미국 특허 제6,476,295호), 개선된 소화율(미국 특허 제6,531,648호), 낮은 라피노스(미국 특허 제6,166,292호), 산업용 효소 생산(미국 특허 제5,543,576호), 개선된 향미(미국 특허 제6,011,199호), 질소 고정(미국 특허 제5,229,114호), 잡종 종자 생산(미국 특허 제5,689,041호), 섬유 생산(미국 특허 제6,576,818호; 제6,271,443호; 제5,981,834호; 및 제5,869,720호) 및 바이오연료 생산(미국 특허 제5,998,700호)을 부여하는 폴리펩티드를 포함한다.
비코딩
다른 예에서, 카고 RNA 분자는 비코딩 서열을 포함한다. 이러한 비코딩 서열은 헤어핀 RNA(hpRNA); 다수의 줄기-루프를 형성하는 RNA; RNA 슈도노트; 적어도 부분적으로 이중 가닥 RNA를 형성하는 RNA 서열; 작은 간섭 RNA(siRNA) 또는 siRNA 전구체; 마이크로RNA(miRNA) 또는 miRNA 전구체; 자가 절단 리보자임; 리간드 반응성 자가 절단 리보자임(압타자임); RNA 앱타머; 또는 긴 비코딩 RNA(lncRNA)를 포함한다.
CRISPR 가이드 RNA:
일부 구현예에서, 카고 RNA 서열은 CRISPR 가이드 RNA이다. CRISPR 연관 엔도뉴클레아제, 예컨대 Cas9, Cas12 및 Cas13 엔도뉴클레아제는 상이한 식물에서 게놈 편집 도구로 사용되며; 예를 들어, 문헌[Wolter et al. (2019) BMC Plant Biol., 19:176-183); 문헌[Aman et al. (2018) Genome Biol., 19:1-10]을 참조한다. CRISPR/Cas9는 2-성분 crRNA를 필요로 한다:표적화 서열("CRISPR RNA" 또는 "crRNA" 서열) 및 Cas9 뉴클레아제 모집 서열(tracrRNA)을 함유하는 tracrRNA "가이드 RNA"("gRNA"). 효율적인 Cas9 유전자 편집은 또한 키메라 "단일 가이드 RNA"("sgRNA"), 자연 발생 crRNA-tracrRNA 복합체를 모방하고 tracrRNA(뉴클레아제 결합을 위한 것임)와 적어도 하나의 crRNA(뉴클레아제를 편집을 위해 표적화된 서열로 가이드하기 위한 것임) 둘 모두를 함유하는 조작된 (합성) 단일 RNA 분자를 사용하여 달성되며; 예를 들어, 문헌[Cong et al. (2013) Science, 339:819-823]; 문헌[Xing et al. (2014) BMC Plant Biol., 14:327-340]을 참조한다. 화학적으로 변형된 sgRNA는 게놈 편집에 효과적인 것으로 입증되었고; 예를 들어, 문헌[Hendel et al. (2015) Nature Biotechnol., 985-991]을 참조한다. CRISPR 뉴클레아제 및 가이드 RNA의 상업적 제조업체는 가이드 RNA 서열을 설계하기 위한 알고리즘을 제공하며; 예를 들어, www[dot]idtdna[dot]com/pages/products/crispr-genome-editing/alt-r-crispr-cas9-system에서 Integrated DNA Technologies가 제공하는 가이드 설계 도구를 참조한다. Cas12a 및 Cas13을 포함하는 일부 Cas 뉴클레아제는 tracrRNA를 필요로 하지 않는다.
많은 Cas 뉴클레아제의 경우, 가이드 서열 설계는 (crRNA가 상보적으로 설계되는) DNA 표적 서열이, 이용될 특정 Cas 뉴클레아제에 의해 인식되는 프로토-스페이서 인접 모티프("PAM") 서열에 인접해야 한다는 요건에 의해 제약된다. Cas 뉴클레아제는 특정 PAM 서열을 인식하고 다양한 뉴클레아제 및 상응하는 PAM 서열이 있으며; 예를 들어, 문헌[Smakov et al. (2017) Nature Reviews Microbiol., doi:10.1038/nrmicro.2016.184]을 참조한다. 예를 들어, Cas9 뉴클레아제는 dsDNA를 절단하고, 가이드 RNA의 crRNA 성분에 의해 표적화되도록 DNA 표적 서열의 3'에 위치하는 GC-풍부 PAM 서열을 필요로 하며 절단하여 평활 말단을 남긴다. Cas12a 뉴클레아제는 dsDNA를 절단하고, 가이드 RNA의 crRNA 성분에 의해 표적화되도록 DNA 표적 서열의 5'에 위치하는 T-풍부 PAM 서열을 필요로 하며 절단하여 5' 오버행이 있는 점착 말단을 남긴다. Cas13 뉴클레아제는 단일 가닥 RNA를 절단하고 PAM 서열을 필요로 하지 않으며; 대신 Cas13 뉴클레아제는 직접 반복부("DR")가 있는 단일 crRNA에 의해 이들의 표적으로 가이드 된다. 실제로, 가이드 RNA의 crRNA 성분은 일반적으로 17 내지 24개 뉴클레오티드(흔히 19, 20 또는 21개 뉴클레오티드)의 길이, 및 PAM 모티프(Cas 뉴클레아제에 의해 요구되는 경우)에 그 자체가 인접한 표적화된 유전자 또는 핵산 서열에 대한 정확한 상보성(즉, 완벽한 염기쌍)을 갖도록 설계된다. 표적 서열에 대해 100% 미만의 상보성을 갖는 crRNA 성분을 사용할 수 있지만(예를 들어, 길이가 20개 뉴클레오티드이고 표적 서열과 1 내지 4개의 미스매치가 있는 crRNA) 이는 표적-외 효과의 잠재력을 증가시킨다.
효과적인 가이드 설계의 비제한적 예는, 예를 들어 미국 특허 출원 공개 US 2019/0032131호, 2015/0082478호, 및 2019/0352655호에서 발견될 수 있으며, 이는 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다. 유전자 편집을 위해, CRISPR "어레이"는 하나 이상의 원하는 표적 DNA 서열(들)에 상응하는 하나 또는 다수의 가이드 RNA 서열을 포함하도록 설계될 수 있으며, 예를 들어, 문헌[Cong et al. (2013) Science, 339:819-823]; 문헌[Ran et al. (2013) Nature Protocols, 8:2281-2308]을 참조한다.
구현예에서, 폴리뉴클레오티드에 통합된 카고 RNA 서열은 적어도 하나의 CRISPR 가이드 RNA를 포함하고; 가이드 RNA의 방출은, 예를 들어 DR 서열, 리보자임 서열 또는 다른 자가 절단 RNA에 측접함으로써, 또는 내인성 리보뉴클레아제에 의한 절단에 의해 매개된다. 상응하는 Cas 뉴클레아제는 별도 또는 동시 전달, 예를 들어 벡터 또는 폴리뉴클레오티드와의 공동 전달에 의해, 또는 폴리뉴클레오티드가 전달되는 세포에서 상응하는 Cas 뉴클레아제의 일시적 또는 안정한 발현에 의해 제공될 수 있다.
선택 가능한 또는 스코어링 가능한 마커
일부 구현예에서, 카고 RNA 서열은 선택 가능한 또는 스코어링 가능한 마커를 포함한다. 특정 구현예에서, 선택 가능한 마커 또는 스코어링 가능한 마커는 폴리펩티드를 인코딩하는 RNA 서열이다. 선택 가능한 마커의 예는 제초제 또는 항생제와 같은 선택 제제에 대한 저항성을 부여하는 것들을 포함한다. 선택 가능한 마커/선택 제제 조합의 예는 글리포세이트 저항성 EPSPS 효소 및/또는 글리포세이트 옥시다제/글리포세이트, 비알라포스 저항성(bar) 또는 포스피노트리신 아실 트랜스퍼라제(pat) 효소/글루포시네이트, 또는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(npt)/네오마이신 또는 카나마이신을 포함한다. 스코어링 가능한 마커의 예는 β-글루쿠로니다제(GUS), 루시퍼라제 및 형광 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질(GFP), 황색 형광 단백질(YFP), 및 시안 형광 단백질(CFP)을 포함한다. 특정 구현예에서, 선택 가능한 또는 스코어링 가능한 마커는 RNA 앱타머 또는 조절 RNA, 예컨대 siRNA 또는 siRNA 전구체(예를 들어, 미국 특허 제8,404,927호, 제8,455,716호, 제9,777,288호, 제10,378,012호 참조), miRNA 또는 miRNA 전구체(예를 들어, 미국 특허 제8,410,334호, 제8,395,023호, 제9,708,620호 참조), 트랜스-작용 siRNA 또는 트랜스-작용 siRNA 전구체(예를 들어, 미국 특허 제8,030,473호, 제8,476,422호, 제8,816,061호, 제9,018,002호 참조), 단계적 sRNA 또는 단계적 sRNA 전구체(예를 들어, 미국 특허 제8,404,928호 참조), siRNA 또는 miRNA 디코이(decoy)(예를 들어, 미국 특허 제8,946,511호, 제9,873,888호 참조), siRNA 또는 miRNA 절단 차단제(예를 들어, 미국 특허 제9,040,774호 참조), siRNA 또는 miRNA 인식 및 절단 서열(예를 들어, 미국 특허 제8,334,430호, 제9,139,838호, 제9,976,152호, 제10,793,869호, 제10,876,126호 참조), 리보스위치, 또는 리보자임이다. 적합한 RNA 앱타머는 분자에 결합할 시 형광을 나타내는 것들을 포함한다. 예를 들어, 형광 RNA 앱타머는 브로콜리 RNA 앱타머일 수 있다. 사용될 수 있는 다른 형광 RNA 앱타머는 시금치, 시금치2, 당근, 래디쉬, 옥수수, 레드 브로콜리, 오렌지 브로콜리 및 브로콜리 꽃부분을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 적합한 조절 RNA를 사용하여 마커 유전자의 발현을 하향조절(즉, 침묵화)할 수 있다. 예를 들어, 피토엔 디새튜라제(PDS)는 유전자의 침묵화가 광표백 표현형을 산출하기 때문에 마커 유전자로 널리 사용된다. 디코이 또는 절단 차단제와 같은 조절 RNA는 또한 내인성의 작은 RNA 조절 경로에 간섭하여, 가시적인 표현형을 생성하는 데 사용될 수 있으며; 예를 들어, 미국 특허 제8,946,511호, 제9,873,888호, 제9,040,774호를 참조한다.
상기를 고려하여 몇몇 구현예를 설명한다. 재조합 DNA 분자의 다양한 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스의 5' UTR 서열을 포함한다. 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 5' UTR 서열에 인접하여 그의 3'에 본래 위치하는 엔도르나바이러스의 게놈 서열을 추가로 포함한다. 구현예에서, 3' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스의 3' UTR 서열을 포함한다. 구현예에서, 3' 레플리카제 인식 서열은 3' UTR 서열에 인접하여 그의 5'에 본래 위치하는 엔도르나바이러스의 게놈 서열을 추가로 포함한다.
다른 구현예에서, RNA 분자는 바이러스 MP를 인코딩하는 적어도 하나의 RNA 서열을 추가로 포함하고, MP를 인코딩하는 적어도 하나의 RNA 서열은 (a) 카고 RNA 서열 앞, (b) 카고 RNA 서열 뒤, 또는 (c) 카고 RNA 서열 앞과 뒤 둘 모두에 위치한다. 구현예에서, MP를 인코딩하는 적어도 하나의 RNA 서열은 상이한 MP를 인코딩하는 적어도 2개의 RNA 서열 또는 MP의 다수의 카피를 인코딩하는 단일 RNA 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 DNA 분자는 세포에서 기능적이고 적어도 하나의 바이러스 이동 단백질을 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터, 및 선택적으로 종결자 요소를 포함하는 별개의 발현 카세트를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, RNA 분자는 ERS를 추가로 포함하고, ERS는 3' 레플리카제 인식 서열에 가깝게 또는 인접하여 위치하며, 선택적으로 3' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스의 3' UTR 서열을 포함한다. 구현예에서, ERS는 담배 모자이크 바이러스 OAS(TMV-OAS)와 같은 바이러스 OAS를 포함한다.
구현예에서, RNA 분자는 적어도 하나의 tRNA 유사 서열을 추가로 포함하고, 적어도 하나의 tRNA 유사 서열은 아라비돕시스 FT mRNA로부터의 tRNA 유사 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, RNA 분자는 바이러스 MP를 인코딩하는 적어도 하나의 RNA, 아라비돕시스 FT mRNA로부터의 tRNA 유사 서열, 및 TMV-OAS를 포함하는 캡시드화 인식 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 카고 RNA 서열은 길이가 최대 약 14 kb이다. 구현예에서, 카고 RNA 서열은 하기를 포함한다: (a) 적어도 하나의 코딩 서열, (b) 적어도 하나의 비코딩 서열, 또는 (c) 적어도 하나의 코딩 서열과 적어도 하나의 비코딩 서열 둘 모두. 다른 구현예에서, 카고 RNA 서열은 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하고, RNA 분자는 적어도 하나의 코딩 서열에 바로 인접하여 그의 5'에 위치하는 내부 리보솜 유입 부위(IRES)를 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 카고 RNA 서열은 다수의 코딩 서열을 포함하고, RNA 분자는 코딩 서열 각각에 바로 인접하여 그의 5'에 위치하는 IRES를 추가로 포함한다.
다른 구현예에서, 카고 RNA 서열은 적어도 하나의 비코딩 서열을 포함하고, 적어도 하나의 비코딩 서열은 헤어핀 RNA(hpRNA); 다수의 줄기-루프를 형성하는 RNA; RNA 슈도노트; 적어도 부분적으로 이중 가닥 RNA를 형성하는 RNA 서열; 작은 간섭 RNA(siRNA) 또는 siRNA 전구체; 마이크로RNA(miRNA) 또는 miRNA 전구체; 자가 절단 리보자임; 리간드 반응성 자가 절단 리보자임(압타자임); RNA 앱타머; 및 긴 비코딩 RNA(lncRNA)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 적어도 하나의 자가 절단 리보자임을 인코딩하는 DNA 서열이 제공된다. 구현예에서, 적어도 하나의 자가 절단 리보자임은 5' 레플리카제 인식 서열의 5' 또는 3' 레플리카제 인식 서열의 3'에 위치한다. 구현예에서, 적어도 하나의 리간드 반응성 자가 절단 리보자임(압타자임)을 인코딩하는 DNA 서열이 제공된다. 구현예에서, 적어도 하나의 리간드 반응성 자가 절단 리보자임은 5' 레플리카제 인식 서열의 5' 또는 3' 레플리카제 인식 서열의 3'에 위치한다.
RNA 분자
다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 재조합 DNA 분자를 발현시킴으로써 생산되고, 원하는 경우 실시예에 기재된 것들과 같은 통상적인 방법을 사용하여 정제 및 단리되는 RNA 분자에 관한 것이다. 구현예에서, RNA 분자는 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA이다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 5'에서 3' 순서로, (a) 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; (b) 카고 RNA 서열; 및 (c) 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하고; 선택적으로, (d) 바이러스 이동 단백질 €을 인코딩하는 적어도 하나의 RNA, (e) 적어도 하나의 tRNA 유사 서열; 및 (f) OAS로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 요소를 추가로 포함하는 재조합 RNA 분자에 관한 것이다.. 구현예에서, 카고 RNA는 5' 레플리카제 인식 서열에 대해 이종성이고/이거나 3' 레플리카제 인식 서열에 대해 이종성이다.
구현예에서, 재조합 RNA 분자는 (a) 5' 레플리카제 인식 서열이 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함하고/하거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열이 표 11, 12 또는 13에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 1 내지 19, 372 내지 405, 465, 또는 483 내지 485 중 적어도 하나에 의해 인코딩된 RNA 서열, 또는 서열번호 580의 RNA 서열, 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 RNA 서열을 포함하고/하거나(선택적으로 RNA는 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 추가로 포함함); (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 20 내지 38, 406 내지 454, 467, 또는 486 내지 488 중 적어도 하나에 의해 인코딩된 RNA 서열, 또는 서열번호 581의 RNA 서열, 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 RNA 분자를 포함하고, 선택적으로 RNA는 표 11, 12 또는 13에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래되고/되거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래된다. 또 다른 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열은 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열, 3' 레플리카제 인식 서열 및 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제는 모두 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래된다. 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열은 표 1에 제시된 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스의 5' UTR 서열을 포함한다. 이러한 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 5' UTR 서열에 인접하여 그의 3'에 본래 위치하는 엔도르나바이러스의 게놈 서열을 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 3' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스의 3' UTR 서열을 포함한다. 그리고 또 다른 구현예에서, 3' 레플리카제 인식 서열은 3' UTR 서열에 인접하여 그의 5'에 본래 위치하는 엔도르나바이러스의 게놈 서열을 추가로 포함한다.
구현예에서, 재조합 RNA 분자 또는 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA는 바이러스 외피 단백질에 의해 캡시드화된다. 제공되는 경우, 바이러스 외피 단백질은 엔도르나바이러스에 대해 이종성이다.
발현 시스템
본 개시내용은 무세포 및 세포 기반 발현 시스템을 포함하는 다양한 발현 시스템에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 개시내용은 (a) 5'에서 3' 순서로, (i) 엔도르나바이러스로부터 유래된 5' 레플리카제 인식 서열; (ii) 카고 RNA 서열; 및 (iii) 엔도르나바이러스로부터 유래된 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하고; 선택적으로, (iv) 바이러스 MP를 인코딩하는 적어도 하나의 RNA; (v) 적어도 하나의 tRNA 유사 서열; 및 (vi) OAS로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 요소를 추가로 포함하는 RNA 분자: 및 (b) 엔도르나바이러스로부터 5' 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 RDRP 단백질을 포함하는 무세포 발현 시스템에 관한 것이다. 일부 구현예에서, RDRP 단백질은 엔도르나바이러스에 의해 제공된다.
다른 양태에서, (a) 세포에서 기능적이고, 5'에서 3' 순서로, (i) 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; (ii) 카고 RNA 서열; 및 (iii) 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하고; 선택적으로, (iv) 바이러스 이동 단백질(MP)을 인코딩하는 적어도 하나의 RNA; (v) 적어도 하나의 tRNA 유사 서열; 및 (vi) 캡시드화 인식 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 요소를 추가로 포함하는 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 분자; 및 (b) 엔도르나바이러스로부터 유래된 5' 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 RDRP 단백질을 함유하는 세포를 특징으로 하는 세포 기반 발현 시스템인 발현 시스템이 제공된다. 구현예에서, 세포 기반 발현 시스템은 세포(예를 들어, 식물 세포 또는 진균 세포) 내로 도입되는 완전한 자가 복제 엔도르나바이러스 위성 시스템이며, 자가 복제 엔도르나바이러스 위성 시스템은 (1) 5'에서 3' 순서로, (a) 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제(RDRP)에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; (b) 카고 RNA 서열; 및 (c) 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는 재조합 엔도르나바이러스 위성 RNA로서, 선택적으로, (d) 바이러스 이동 단백질(MP)을 인코딩하는 적어도 하나의 RNA; (e) 적어도 하나의 tRNA 유사 서열(TLS); 및 (f) 캡시드화 인식 서열(ERS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 요소를 추가로 포함하는 재조합 엔도르나바이러스 위성 RNA; 및 (2) 세포에서 복제 가능하고, 재조합 엔도르나바이러스 위성 RNA에서 5' 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 엔도르나바이러스 RDRP를 인코딩하는 외인성 엔도르나바이러스(예를 들어, 세포에 풍토성이거나 고유하지 않은 엔도르나바이러스)를 포함한다.
구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함하고/하거나; 3' 레플리카제 인식 서열은 표 11, 12 또는 13에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함한다. 다른 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조와 적어도 80%(예를 들어, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%) 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 3' 레플리카제 인식 서열은 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조와 적어도 80%(예를 들어, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%) 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열은 표 1에 제시된 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함한다. 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 1 내지 19, 372 내지 405, 465, 또는 483 내지 485에 의해 인코딩된 RNA 서열 중 적어도 하나, 또는 서열번호 580의 RNA 서열을 포함하고/하거나; 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 20 내지 38, 406 내지 454, 467, 486 내지 488에 의해 인코딩된 RNA 서열 중 적어도 하나, 또는 서열번호 581의 RNA 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 1 내지 19, 372 내지 405, 465, 또는 483 내지 485에 의해 인코딩된 RNA 서열 중 적어도 하나, 또는 서열번호 580의 RNA 서열과 적어도 80%(예를 들어, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%) 서열 동일성을 갖는 RNA 서열을 포함하고/하거나; 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 20 내지 38, 406 내지 454, 467, 또는 486 내지 488에 의해 인코딩된 RNA 서열 중 적어도 하나, 또는 서열번호 580의 RNA 서열과 적어도 80%(예를 들어, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%) 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열은 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열, 3' 레플리카제 인식 서열 및 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제는 모두 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래된다.
전형적으로, 발현 시스템에 사용되는 세포는 박테리아 세포, 식물 세포, 진균 세포 또는 동물 세포이다.
일부 구현예에서, 발현 시스템은 캡시드화 인식 서열에 의해 인식되고 RNA 분자를 캡시드화하는 바이러스 외피 단백질을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 바이러스 외피 단백질은 (a) 세포에서 재조합 DNA 분자에 의해 발현되거나(예를 들어, 여기서 재조합 DNA 분자는 바이러스 외피 단백질을 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터, 및 선택적으로 종결자 요소를 포함하는 별개의 발현 카세트를 추가로 포함함), (b) 세포에서 제2 재조합 DNA 분자에 의해 공동 발현되거나; (c) 세포에 외인성으로 제공되거나; (d) 세포에서 바이러스에 의해 발현된다. 구현예에서, RDRP 단백질은 세포에 대해 이종성이다. 구현예에서, RDRP 단백질은 세포에 외인성으로 제공된다.
일부 구현예에서, 5' 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 RDRP 단백질은 엔도르나바이러스에 의해 식물 세포에서 내인성으로 발현된다(예를 들어, 여기서 엔도르나바이러스는 식물 세포에서 자연적으로 발생한다). 구현예에서, 엔도르나바이러스는 식물 세포에 고유하거나 풍토성이다. 구현예에서, 식물 세포에 풍토성인 엔도르나바이러스는 비병원성이다. 구현예에서, 식물 세포에 풍토성인 엔도르나바이러스는 비병원성이고 편리공생한다. 구현예에서, 엔도르나바이러스는 식물 세포에 외인성으로 제공된다. 구현예에서, 5' 및 3' 레플리카제 인식 서열은 상이한 식물 종에서 본래 발견되고 외인성 엔도르나바이러스로서 식물 세포에 도입되는 엔도르나바이러스로부터의 RDRP 단백질에 의해 인식된다.
또 다른 구현예에서, 재조합 DNA 분자는 바이러스 MP를 인코딩하는 적어도 하나의 RNA, 아라비돕시스 FT mRNA로부터의 tRNA 유사 서열, 및 TMV-OAS를 포함하는 캡시드화 인식 서열을 추가로 포함한다.
예시적인 발현 시스템은 실시예에 기재되어 있다. 다양한 발현 시스템에 유용한 벡터는 표 7에 기재되어 있다.
세포
다른 양태에서, 본 개시내용은 상기 언급된 폴리뉴클레오티드, 재조합 DNA 분자, RNA 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라, 실시예에 기재된 해당 분자 중 임의의 것을 포함하는 세포에 관한 것이다. 예시적인 세포는 원핵 세포(예를 들어, 박테리아, 예컨대 진핵 세포를 형질전환할 수 있는 박테리아(예를 들어, 아그로박테리움 spp., 리조박테리움(Rhizobacterium) spp.) 또는 진핵 세포(예를 들어, 식물 세포, 진균 세포, 또는 동물 세포, 예컨대 곤충 세포)이다. 특정 구현예에서, 세포는 식물 세포를 형질전환할 수 있는 박테리아 세포(예를 들어, 아그로박테리움 sp., 시노리조비움(Sinorhizobium) sp., 메소리조비움(Mesorhizobium) sp., 브라디리조비움(Bradyrhizobium) sp., 리조비움(Rhizobium) sp., 또는 엔시퍼(Ensifer) sp. 세포)이다. 본원에 제공된 재조합 폴리뉴클레오티드와 함께 사용하기에 적합한 식물 세포를 형질전환할 수 있는 박테리아 세포는 미국 특허 출원 공개 US20170369898호 및 US20180312854호에 개시된 아그로박테리움 sp., 시노리조비움 sp., 메소리조비움 sp., 브라디리조비움 sp., 리조비움 sp., 또는 엔시퍼 sp. 세포를 포함하고, 이는 각각 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
벡터
다른 양태에서, 본 개시내용은 박테리아 매개 식물 형질전환을 위한 벡터에 관한 것이다. 이러한 벡터는 상기 언급된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것, 재조합 DNA 분자, RNA 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라, 실시예에 기재된 해당 분자 중 임의의 것을 포함한다. 일부 구현예에서 식물 형질전환을 매개하는 박테리아는 아그로박테리움 sp., 시노리조비움 sp., 메소리조비움 sp., 브라디리조비움 sp., 리조비움 sp., 또는 엔시퍼 sp.이다. 아그로박테리움 sp.가 사용되는 구현예에서, 벡터는 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 재조합 DNA 분자에 측접하는 T-DNA를 포함한다(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 US20170369898호 및 US20180312854호에 기재된 바와 같고, 이는 각각 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨). 일부 구현예에서, 벡터는 식물 세포 내에 또는 박테리아 세포(아그로박테리움 sp., 시노리조비움 sp., 메소리조비움 sp., 브라디리조비움 sp., 리조비움 sp., 또는 엔시퍼 sp. 세포) 내에 함유된다.
바이러스 입자
다른 양태에서, 본 개시내용은 상기 언급된 폴리뉴클레오티드, 재조합 DNA 분자, RNA 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라, 실시예에 기재된 해당 분자 중 임의의 것을 포함하는 바이러스 입자에 관한 것이다. 구현예에서, 바이러스 입자는 작제물 1 내지 11(표 7)에서 발견된 발현 카세트에 의해 인코딩된 RNA와 적어도 80%(예를 들어, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%) 서열 동일성을 갖는 것들을 포함하는, 본원에 기재된 발현 카세트 중 임의의 것을 포함한다.
일 구현예에서, 도 2는 바이러스 외피 단백질, 적절한 UTR 내에 위치하는 엔도르나바이러스 5' 및 3' 인식 서열, 카고 RNA 서열, 이동 단백질 및 tRNA 유사 서열을 발현시키는(5'에서 3'으로) 폴리뉴클레오티드를 이용한 아그로박테리움-매개 형질전환을 사용한 숙주 또는 생산 식물의 침윤을 나타낸다. 이종 프로모터는 도시된 바와 같이 외피 단백질 및 카고의 발현을 독립적으로 유도한다. 폴리뉴클레오티드로부터 발현된 RNA는 TMV-OAS를 포함한다. 숙주 식물은 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA의 생산을 위해 형질전환된다. 후속적으로, 발현된 엔도르나바이러스 위성 RNA는, 예를 들어 원하는 대로 식물을 변형하기 위해, 숙주 식물의 잎 물질 또는 다른 조직으로부터 단리되고, 엔도르나바이러스 위성의 후속 발현 및 복제를 위해 상응하는 또는 동족 엔도르나바이러스를 내인성으로 함유하는 식물 상에 고압 분무하기 위해 정제된다(및 원하는 경우 제형화된다). 이동 단백질 및 t-RNA 유사 서열의 존재는 고압 분무 바이러스 입자를 제공받는 식물 전체에 걸친 전신 이동을 용이하게 한다.
식물, 식물 세포 및 식물 번식체
본원에 제공된 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA(예를 들어, 재조합 RNA)에 대한 숙주로 사용되는 표적 식물 및 식물 세포는 외떡잎 식물과 쌍자엽 식물 둘 모두, 및 엔도르나바이러스 복제를 지원할 수 있는 식물 세포를 포함하며, 줄뿌림 작물 식물, 과일 생산 식물 및 나무, 채소, 나무, 및 관상용 꽃, 관목, 나무, 지피 및 잔디 풀을 포함하는 관상용 식물을 포함한다. 특정 구현예에서, 식물 또는 식물 세포는 국화과(Asteraceae), 박과(Cucurbitaceae), 콩과(Fabaceae), 녹나무과(Lauraceae), 벼과(Poaceae) 또는 가지과(Solanaceae)에 속한다. 특정 구현예에서, 식물 또는 식물 세포는 캡시쿰, 쿠쿠미스(Cucumis), 쿠쿠르비타(Cucurbita), 헬리안투스(Helianthus), 호르데움(Hordeum), 니코티아나(Nicotiana), 오리자(Oryza), 세칼레(Secale), 솔라눔(Solanum), 또는 트리티쿰(Triticum) 속의 구성원이다. 특정 구현예에서, 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA에 대한 표적 식물 및 식물 세포 숙주는 아보카도(페르세아 아메리카나), 보리(호르데움 불가레), 누에콩(비시아 파바), 메밀(파고피룸 에스쿨렌툼), 호리병박(라게나리아 시세라리아), 일반콩(파세올루스 불가리스), 오이(쿠쿠미스 사티부스(Cucumis sativus)), 구아(시아모프시스 테트라고놀로바(Cyamopsis tetragonoloba)), 말라바 시금치(Malabar spinach)(바셀라 알바), 멜론(쿠쿠미스 멜로), 페퍼(캡시쿰 프루테센스, 캡시쿰 안눔(Capsicum annuum)), 감자(솔라눔 투베로숨(Solanum tuberosum)), 호박(쿠쿠르비타 페포(Cucurbita pepo)), 벼(오리자 사티바, 오리자 루피포곤), 호밀(세칼레 세레알레(Secale cereale)), 해바라기(헬리안투스 아누스), 토마토(솔라눔 리코페르시쿰(Solanum lycopersicum)), 동아(베닌카사 히스피다(Benincasa hispida)), 밀(트리티쿰 아에스티붐(Triticum aestivum)), 날개콩(프소포카르푸스 테트라고놀로부스(Psophocarpus tetragonolobus)), 및 예르바 마테(일렉스 파라구아리엔시스(Ilex paraguariensis)) 식물 및 식물 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA(예를 들어, 재조합 RNA)에 대한 숙주로 사용되는 표적 식물 및 식물 세포는 아보카도(페르세아 아메리카나), 보리(호르데움 불가레), 누에콩(비시아 파바), 메밀(파고피룸 에스쿨렌툼), 호리병박(라게나리아 시세라리아), 일반콩(파세올루스 불가리스), 오이(쿠쿠미스 사티부스), 구아(시아모프시스 테트라고놀로바), 말라바 시금치(바셀라 알바), 멜론(쿠쿠미스 멜로), 페퍼(캡시쿰 프루테센스, 캡시쿰 안눔), 감자(솔라눔 투베로숨), 호박(쿠쿠르비타 페포), 벼(오리자 사티바, 오리자 루피포곤), 호밀(세칼레 세레알레), 해바라기(헬리안투스 아누스), 토마토(솔라눔 리코페르시쿰), 동아(베닌카사 히스피다), 밀(트리티쿰 아에스티붐), 날개콩(프소포카르푸스 테트라고놀로부스), 및 예르바 마테(일렉스 파라구아리엔시스) 식물 및 식물 세포를 포함한다.
다른 양태에서, 상기 언급된 또는 달리 개시된 폴리뉴클레오티드, 재조합 DNA 분자, 및/또는 실시예에 기재된 해당 분자를 포함하는 재조합 RNA 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함하는 식물 번식체가 제공된다. 이러한 식물 번식체는 폴리뉴클레오티드, 재조합 DNA 분자 및/또는 재조합 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 세포 또는 폴리뉴클레오티드, 재조합 DNA 분자 및/또는 재조합 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 세포를 포함하는 종자, 묘목, 배주, 배아, 꽃가루, 뿌리, 줄기, 잎, 묘조, 덩이줄기, 뿌리줄기, 기는 줄기, 구근, 외식편 또는 캘러스를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 식물 번식체는 폴리뉴클레오티드, 재조합 DNA 분자 또는 재조합 RNA 분자를 포함하는 식물 세포와 폴리뉴클레오티드, 재조합 DNA 분자 및/또는 재조합 RNA 분자를 결여한 식물 세포 둘 모두를 포함하는 모자이크이다. 특정 구현예에서, 모자이크 내 식물 세포의 적어도 99%, 98%, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 또는 1%가 폴리뉴클레오티드, 재조합 DNA 분자, 또는 재조합 RNA 분자를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 식물 번식체는 엔도르나바이러스 RDRP를 포함하는 식물 세포와 엔도르나바이러스 RDRP를 결여한 식물 세포 둘 모두를 포함하는 모자이크이다. 적어도 규제상의 이유로 특히 유리한 특정 구현예에서, 식물 번식체는 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA를 결여하고 있다.
방법
다양한 양태에서, 본 개시내용은 (i) 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 식물 세포에 제공하는 단계, (ii) 식물 또는 식물 세포에서 표현형 변화를 얻는 단계; (iii) 해충 또는 병원체의 식물의 저항성 및/또는 내성을 증가시키는 단계, (iv) 스트레스에 대한 식물의 저항성을 증가시키는 단계, (v) 식물 또는 식물 세포에서 폴리펩티드를 발현시키는 단계, (vi) 합성 엔도르나바이러스 바이러스 입자를 제조하는 단계, (vii) 변형된 식물 번식체를 생산하는 단계, (viii) 접목을 통해 식물에 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 제공하는 단계, (ix) 접목 식물을 생산하는 단계, (x) 재조합 RNA 분자를 자손 식물 또는 종자에 전파하는 식물을 생산하는 단계, (xi) 식물, 식물 세포, 이의 자손 또는 이의 일부를 바코드화하는 단계, 및 (xii) 바코드화된 식물, 식물 부분 또는 식물 세포를 식별하는 단계를 포함하는 몇몇 유용한 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 추가 양태는 표현형 변화, 해충, 병원체 또는 스트레스에 대한 증가된 저항성 또는 내성을 갖는 식물; 변형된 식물 번식체, 접목 식물; 자손 식물 또는 종자; 바코드화된 식물, 식물 부분 또는 식물 세포; 및 그러한 바코드화된 식물, 식물 부분 또는 식물 세포를 식별하기 위한 키트에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 방법은 (a) (i) RDRP를 제공하는 엔도르나바이러스; 또는 (ii) RDRP를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 식물 세포를 포함하는 식물의 집단을 제공하는 단계; 및 (b) 식물 세포를 포함하는 식물에 재조합 RNA 분자(합성 엔도르나바이러스 위성 RNA)를 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 방법은 식물 세포가 RDRP를 제공할 수 있는 엔도르나바이러스를 포함하는지 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 식물 세포가, RDRP를 제공할 수 있는 엔도르나바이러스를 포함하는 것으로 결정된 구현예에서, 엔도르나바이러스, RDRP 단백질 및/또는 RDRP를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 선택적으로 식물 세포에 외인성으로 제공되지 않는다. 식물 세포가, RDRP를 제공할 수 있는 엔도르나바이러스를 포함하지 않는 것으로 결정되고 엔도르나바이러스가 세포에 외인성으로 제공되는 다른 구현예에서, RDRP 단백질 또는 RDRP를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 식물 세포에 외인성으로 제공되거나, 엔도르나바이러스, RDRP 단백질 또는 RDRP를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 조합은 식물 세포에 외인성으로 제공된다. 표적 식물에서 엔도르나바이러스의 존재 또는 부재는 엔도르나바이러스 RNA 또는 엔도르나바이러스 단백질을 검출할 수 있는 검정에 의해 결정될 수 있으며; 유사한 검정을 사용하여 표적 식물 또는 세포에서 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA(또는 이의 성분, 예를 들어 카고 RNA)의 존재 또는 부재를 결정할 수 있다. 엔도르나바이러스 RNA의 검출을 위한 검정은 핵산 프로브 및/또는 5' RNA 레플리카제 인식 서열, RDRP 코딩 영역 및/또는 3' RNA 레플리카제 인식 서열을 포함하는 엔도르나바이러스 게놈의 임의의 부분을 검출할 수 있는 프라이머를 사용하는 RNA 검출 검정(예를 들어, RT-PCR 검정)을 포함한다. 이러한 프로브 및 프라이머는 표 1에 제시된 5' 또는 3' RNA 레플리카제 인식 서열 중 임의의 것을 검출하거나 이와 유의미한 서열 동일성(예를 들어, 적어도 약 18, 20, 30, 40 또는 50 nt 길이에 걸쳐 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 것들을 포함한다. 표적 식물에서 엔도르나바이러스의 존재 또는 부재는 엔도르나바이러스 RDRP(예를 들어, 표 1에 개시된 엔도르나바이러스 게놈에 의해 인코딩된 RDRP에 의해 인코딩되거나 이와 상동성인 RDRP)에 대한 단백질 검출 검정(예를 들어, 면역검정)에 의해 결정될 수 있다. 엔도르나바이러스 단백질(예를 들어, 표 1에 개시된 엔도르나바이러스 게놈에 의해 인코딩된 RDRP에 의해 인코딩되거나 이와 상동성인 RDRP)을 검출할 수 있는 검정은 면역검출 및/또는 질량 분광분석 기반 검정을 포함한다. 방법에 사용되는 표적 식물 및 식물 세포는 상기 언급된 모든 표적 식물 및 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA(예를 들어, 재조합 RNA)에 대한 식물 세포 숙주를 포함한다. 특정 구현예에서, 방법에 사용되는 표적 식물 및 식물 세포 숙주는 아보카도(페르세아 아메리카나), 보리(호르데움 불가레), 누에콩(비시아 파바), 호리병박(라게나리아 시세라리아), 일반콩(파세올루스 불가리스), 구아(시아모프시스 테트라고놀로바), 말라바 시금치(바셀라 알바), 멜론(쿠쿠미스 멜로), 페퍼(캡시쿰 프루테센스, 캡시쿰 안눔), 벼(오리자 사티바, 오리자 루피포곤), 해바라기(헬리안투스 아누스), 동아(베닌카사 히스피다), 날개콩(프소포카르푸스 테트라고놀로부스), 및 예르바 마테(일렉스 파라구아리엔시스) 식물을 포함한다.
i. 식물 세포로의 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA의 제공
일 양태에서, 본 개시내용은 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 식물 세포에 제공하는 방법에 관한 것이다. 방법은 일반적으로 5'에서 3' 순서로, 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; 카고 RNA 서열; 및 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는 재조합 RNA 분자("합성 엔도르나바이러스 위성 RNA"의 카피 또는 이에 대한 주형)를 식물 세포에 제공하는 것을 포함하는 단계를 특징으로 하고, 식물 세포는 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 RDRP 단백질을 포함하고, 이에 의해 RDRP 단백질은 재조합 RNA 분자로부터 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA(즉, 재조합 RNA 분자의 추가 카피)의 합성을 촉매한다.
구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함하고/하거나; 3' 레플리카제 인식 서열은 표 11, 12 또는 13에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함한다. 다른 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 3' 레플리카제 인식 서열은 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열은 표 1에 제시된 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함한다. 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 1 내지 19, 372 내지 405, 465, 또는 483 내지 485의 DNA 서열에 의해 인코딩된 RNA 서열 중 적어도 하나, 또는 서열번호 580의 RNA 서열을 포함하고/하거나; 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 20 내지 38, 406 내지 454, 467, 또는 486 내지 488의 DNA 서열에 의해 인코딩된 RNA 서열 중 적어도 하나, 또는 서열번호 581의 RNA 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 1 내지 19, 372 내지 405, 465, 또는 483 내지 485의 DNA 서열에 의해 인코딩된 RNA 서열 중 적어도 하나, 또는 서열번호 580의 RNA 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고/하거나; 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 20 내지 38, 406 내지 454, 467, 또는 486 내지 488의 DNA 서열에 의해 인코딩된 RNA 서열 중 적어도 하나, 또는 서열번호 581의 RNA 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래되고/되거나; 3' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래된다. 전형적으로, 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열은 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열은 상이한 엔도르나바이러스로부터 유래된다.
다른 구현예에서, 식물 세포는 엔도르나바이러스를 포함하고, RDRP 단백질은 엔도르나바이러스에 의해 식물 세포에 제공된다. 구현예에서, 엔도르나바이러스는 식물 세포에 풍토성이다. 구현예에서, 식물 세포에 풍토성인 엔도르나바이러스는 식물 세포에 비병원성이고/이거나 편리공생한다. 다른 구현예에서, 엔도르나바이러스는 식물 세포에 외인성으로 제공된다.
일부 구현예에서, RDRP 단백질은, 예를 들어 식물 세포에서 RDRP 단백질의 트랜스제닉 발현에 의해 식물 세포에 외인성으로 제공된다. 구현예에서, RDRP 단백질은 외인성 엔도르나바이러스, 예를 들어, 상이한 유기체, 종, 변종 또는 생식질에서 본래 발견되고 식물 세포 내로 도입될 때 자가 복제 가능한 엔도르나바이러스를 식물 세포 내로 도입함으로써 식물 세포에 외인성으로 제공된다.
일부 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 발효 시스템에서 생산된다.
또 다른 구현예에서, 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA는 식물 세포에서 기능적이고 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 작제물을 식물 세포에서 전사함으로써 식물 세포에 제공된다.
구현예에서, 재조합 RNA 분자는 캡시드화 인식 서열을 추가로 포함하고, 식물 세포는 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 캡시드화할 수 있는 바이러스 외피 단백질을 추가로 포함한다. 구현예에서, 바이러스 외피 단백질은 식물 세포에 외인성으로 제공된다.
다른 구현예에서, RNA 분자의 3' 말단 근처의 캡시드화 인식 서열은 TMV-OAS이고, 이는 TMV 외피 단백질에 의해 인식되어, 캡시드화된 RNA의 조립을 야기한다.
구현예에서, 바이러스 외피 단백질은, 예를 들어 바이러스 외피 단백질을 인코딩하는 재조합 작제물의 공동 발현에 의해; 또는 식물 세포 내로 도입되거나 그에 내인성인 바이러스에 의한 천연 발현에 의해 제공될 수 있다.
다른 구현예에서, 재조합 DNA 작제물은 바이러스 외피 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 추가로 포함한다. 구현예에서, 재조합 DNA 작제물은 식물 세포에서 기능적이고 바이러스 식물 단백질을 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터를 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 바이러스 외피 단백질은 식물 세포에서 발현되고 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 캡시드화한다.
구현예에서, 식물 세포는 엔도르나바이러스를 포함하고, 엔도르나바이러스는 식물 세포에 RDRP 단백질을 제공한다.
ii. 식물 또는 식물 세포에서 표현형 변화를 얻는 것
다른 양태에서, 본 개시내용은 식물 또는 식물 세포에서 표현형 변화를 얻는 방법에 관한 것이다. 방법은 일반적으로 5'에서 3' 순서로, 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; 카고 RNA 서열; 및 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는 재조합 RNA 분자를 식물 또는 식물 세포에 제공하는 단계를 포함하고, 카고 RNA 서열은 식물 또는 식물 세포에서 표현형 변화를 (직접적으로 또는 간접적으로) 일으키는 RNA를 포함하고; 식물 또는 식물 세포는 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 RDRP 단백질을 포함하고, 이에 의해 RDRP 단백질은 재조합 RNA 분자로부터 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA의 합성을 촉매하고 카고 RNA 서열은 표현형 변화를 일으킨다.
구현예에서, 재조합 RNA 분자는 식물 또는 식물 세포에 직접 제공된다. 다른 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 분자를 식물 또는 식물 세포에서 발현시킴으로써 제공된다.
구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함하고/하거나; 3' 레플리카제 인식 서열은 표 11, 12 또는 13에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함한다. 다른 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 3' 레플리카제 인식 서열은 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열은 표 1에 제시된 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함한다. 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 1 내지 19, 372 내지 405, 465, 또는 483 내지 485 중 적어도 하나에 의해 인코딩된 RNA 서열, 또는 서열번호 580의 RNA 서열을 포함하고/하거나; 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 20 내지 38, 406 내지 454, 467, 또는 486 내지 488 중 적어도 하나에 의해 인코딩된 RNA 서열, 또는 서열번호 581의 RNA 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 1 내지 19, 372 내지 405, 465, 또는 483 내지 485에 의해 인코딩된 RNA 서열 중 적어도 하나, 또는 서열번호 580의 RNA 서열과 적어도 80%(예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고/하거나; 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 20 내지 38, 406 내지 454, 467, 486 내지 488에 의해 인코딩된 RNA 서열 중 적어도 하나, 또는 서열번호 581의 RNA 서열과 적어도 80%(예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열은 본원에 개시된 재조합 RNA 분자에 존재하는 상기 언급된 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열 중 임의의 것을 포함한다.
구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래되고/되거나; 3' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래된다.
구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열은 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래된다.
다른 구현예에서, 식물 또는 식물 세포에서 표현형 변화를 일으키는 RNA는 재조합 RNA 분자가 제공되지 않은 대조군 식물 또는 식물 세포에서의 표적 유전자의 발현에 비해 표적 유전자의 발현을 조절하기 위한 RNA를 포함하며, 표현형 변화는 조절의 결과이다.
구현예에서, 조절은 (a) 표적 유전자의 발현의 증가; 또는 (b) 표적 유전자의 발현의 감소이다.
다른 구현예에서, 식물 또는 식물 세포에서 표현형 변화를 일으키는 RNA는 표적 유전자의 발현을 억제한다.
또 다른 구현예에서, 식물 또는 식물 세포에서 표현형 변화를 일으키는 RNA는 siRNA 또는 siRNA 전구체, miRNA 또는 miRNA 전구체, 및 단계적 siRNA 또는 단계적 siRNA 전구체로부터 선택되는 적어도 하나의 RNA를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 식물 또는 식물 세포에서 표현형 변화를 일으키는 RNA는 메신저 RNA를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 메신저 RNA는 식물 또는 식물 세포의 게놈에 부재하는 RNA 서열을 포함한다.
구현예에서, 식물 또는 식물 세포에서 표현형 변화를 일으키는 RNA는 식물 또는 식물 세포의 게놈을 변형하기 위한 RNA(예를 들어, 게놈의 CRISPR Cas 뉴클레아제 편집을 위한 하나 이상의 가이드 RNA)를 포함한다.
전형적으로, 식물 세포는 엔도르나바이러스를 포함하고, RDRP 단백질은 엔도르나바이러스에 의해 식물 세포에 제공된다. 구현예에서, 엔도르나바이러스는 식물 세포에 풍토성이다. 다른 구현예에서, 엔도르나바이러스는 외인성 엔도르나바이러스, 예를 들어, 상이한 유기체, 종, 변종 또는 생식질에서 본래 발견되고 식물 세포 내로 도입될 때 자가 복제 가능한 엔도르나바이러스를 식물 세포 내로 도입함으로써 식물 세포에 외인성으로 제공된다. 일부 구현예에서, RDRP 단백질은, 예를 들어 식물 세포에서 RDRP 단백질의 트랜스제닉 발현에 의해 식물 세포에 외인성으로 제공된다.
또 다른 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 발효 시스템에서 생산된다. 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 식물 세포에서 기능적이고 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 작제물을 식물 세포에서 전사함으로써 식물 세포에 제공된다. 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 캡시드화 인식 서열을 추가로 포함하고, 식물 세포는 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 캡시드화할 수 있는 바이러스 외피 단백질을 추가로 포함한다.
구현예에서, 바이러스 외피 단백질은 식물 세포에 외인성으로 제공된다.
다른 구현예에서, 재조합 DNA 작제물은 바이러스 외피 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 재조합 DNA 작제물은 식물 세포에서 기능적이고 바이러스 외피 단백질을 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터를 추가로 포함한다. 구현예에서, 바이러스 외피 단백질은 식물 세포에서 발현되고 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 캡시드화한다.
또 다른 구현예에서, 식물 세포는 엔도르나바이러스를 포함하고, 엔도르나바이러스는 식물 세포에 RDRP 단백질을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 식물 세포를 재조합 RNA 분자를 포함하는 제형과 접촉시킴으로써 식물 세포에 제공되고, 재조합 RNA 분자는 발효 시스템에서 생산되었으며, 재조합 RNA 분자는 바이러스 외피 단백질에 의해 선택적으로 캡시드화된다.
구현예에서, 변화하는 예시적인 표현형은 비제한적으로 발달 속도, 성장률, 크기, 산출량(예를 들어, 고유 산출량), 활력, 광합성 능력, 향미, 전분 생산, 단백질 함량, 탄수화물 함량, 오일 함량, 지방산 함량, 지질 함량, 소화율, 바이오매스, 묘조 길이, 뿌리 길이, 뿌리 아키텍처, 종자 세트, 실중, 종자 품질(예를 들어, 영양 함량), 발아, 과일 세트, 과일 숙성 속도, 바이오폴리머의 생산, 섬유의 생산, 바이오연료의 생산, 약제학적 펩티드의 생산, 분비성 펩티드의 생산, 효소 생산, 개선된 가공 특질 또는 수확 가능한 농산물의 양을 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형은 식물로부터 수확된 생성물의 맛, 외관 또는 유통기한을 포함한다. 다른 구현예에서, 변화하는 표현형은 꽃 크기, 꽃 색깔, 꽃 패터닝, 수술의 존재 또는 부재를 포함하는 꽃 형태, 꽃 수, 꽃 수명, 꽃 향기, 잎 크기, 잎 색깔, 잎 패터닝, 잎 형태, 식물 높이 또는 식물 아키텍처를 포함한다.
구현예에서, 식물 또는 식물 세포에서 표현형 변화를 일으키는 RNA는 재조합 RNA 분자가 제공되지 않은 대조군 식물 또는 식물 세포에서의 표적 유전자의 발현에 비해 표적 유전자의 발현을 조절하기 위한 RNA를 포함하며, 표현형 변화는 조절의 결과이다.
일부 구현예에서, 조절은 표적 유전자의 발현의 증가이다. 예를 들어, 표적 유전자의 발현은 참조 수준(예를 들어, 재조합 분자가 제공되지 않은 대조군 식물 또는 식물 세포에서 발견되는 수준)에 비해 약 1%, 2%, 3%, %, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 또는 100% 초과만큼 증가한다.
특정 구현예에서, 표적 유전자의 발현은 참조 수준(예를 들어, 재조합 RNA 분자를 결여한 대조군 식물 또는 식물 세포에서 발견되는 수준)에 비해 최대 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 8배, 9배, 10배 또는 그 이상만큼 증가한다.
일부 구현예에서, 조절은 표적 유전자의 발현의 감소이다. 예를 들어, 표적 유전자의 발현은 참조 수준(예를 들어, 재조합 분자가 제공되지 않은 대조군 식물 또는 식물 세포에서 발견되는 수준)에 비해 약 1%, 2%, 3%, %, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 또는 100% 초과만큼 감소한다.
특정 구현예에서, 표적 유전자의 발현은 참조 수준(예를 들어, 재조합 RNA 분자를 결여한 대조군 식물 또는 식물 세포에서 발견되는 수준)에 비해 최대 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 8배, 9배, 10배 또는 그 이상만큼 감소한다.
표적 유전자 발현의 조절은 식물 또는 식물 세포의 게놈, 후성유전체 및/또는 전사체를 변형하기 위한 RNA 중 하나 이상에 의해 영향을 받을 수 있다. 게놈을 변형하기 위한 RNA는 CAS 뉴클레아제에 의해 인식되는 gRNA, TALEN을 인코딩하는 RNA 또는 인공 징크 핑거 단백질(aZFN)을 포함할 수 있다. 후성유전체를 변형하기 위한 RNA는 표적 유전자의 프로모터 영역에서와 같이 RNA 매개 DNA 메틸화를 제공하는 RNA를 포함할 수 있다(Matzke and Mosher (2014). Doi: 10.1038/nrg3683). 전사체를 변형하기 위한 RNA는 헤어핀 RNA(hpRNA); 다수의 줄기-루프를 형성하는 RNA; RNA 슈도노트; 적어도 부분적으로 이중 가닥 RNA를 형성하는 RNA 분자; 작은 간섭 RNA(siRNA) 또는 siRNA 전구체; 마이크로RNA(miRNA) 또는 miRNA 전구체; 리보자임; 리간드 반응성 리보자임(압타자임); RNA 앱타머; 또는 긴 비코딩 RNA(lncRNA)를 포함할 수 있다.
iii. 해충 또는 병원체에 대한 식물의 저항성 및/또는 내성의 증가
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 해충 또는 병원체에 대한 식물의 저항성 및/또는 내성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 방법은 일반적으로 5'에서 3' 순서로, 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; 카고 RNA 서열; 및 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는 재조합 RNA 분자를 식물에 제공하는 단계를 포함하고, (직접적으로 또는 간접적으로) 카고 RNA 서열로 인해 해충 또는 병원체에 대한 식물의 저항성 및/또는 내성은 재조합 RNA 분자가 제공되지 않은 식물에 비해 증가하고, 식물 또는 식물 세포는 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 RDRP 단백질을 포함하고, 이에 의해 RDRP 단백질은 재조합 RNA 분자로부터 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA의 합성을 촉매한다. 본원에 사용된 바와 같이, 해충 또는 병원체에 대한 저항성은 해충 또는 병원체의 활동(예를 들어 해충 섭식, 병원체 증식)을 제한하는 식물의 능력을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 해충 또는 병원체에 대한 내성은 해충 또는 병원체의 존재 또는 부하에 관계없이 식물이 그의 적합성(예를 들어, 산출량)을 유지하는 능력을 지칭한다.
구현예에서, 재조합 RNA 분자는 식물 또는 식물 세포에 직접 제공된다. 다른 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 분자를 식물 또는 식물 세포에서 발현시킴으로써 제공된다.
구현예에서, 해충 또는 병원체는 하기를 포함하는 군으로부터 선택된다: 박테리아, 진균, 난균류 및 무척추동물(예를 들어, 절지동물, 연체동물 또는 선충).
구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함하고/하거나; 3' 레플리카제 인식 서열은 표 11, 12 또는 13에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함한다. 다른 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 3' 레플리카제 인식 서열은 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열은 표 1에 제시된 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함한다. 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 1 내지 19, 372 내지 405, 465, 또는 483 내지 485에 의해 인코딩된 RNA 서열 중 적어도 하나, 또는 서열번호 580의 RNA 서열을 포함하고/하거나; 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 20 내지 38, 406 내지 454, 467, 또는 486 내지 488에 의해 인코딩된 RNA 서열 중 적어도 하나, 또는 서열번호 581의 RNA 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 1 내지 19, 372 내지 405, 465, 또는 483 내지 485 중 적어도 하나에 의해 인코딩된 RNA 서열, 또는 서열번호 580의 RNA 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고/하거나; 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 20 내지 38, 406 내지 454, 467, 또는 486 내지 488 중 적어도 하나, 또는 서열번호 581의 RNA 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래되고/되거나; 3' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래된다.
구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열은 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래된다.
다른 구현예에서, 해충 또는 병원체에 대한 식물의 저항성 및/또는 내성의 증가를 일으키는 RNA는 재조합 RNA 분자가 제공되지 않은 대조군 식물 또는 식물 세포에서의 표적 유전자의 발현에 비해 표적 유전자의 발현을 조절하기 위한 RNA를 포함하며, 표현형 변화는 조절의 결과이다.
구현예에서, 조절은 (a) 표적 유전자의 발현의 증가; 또는 (b) 표적 유전자의 발현의 감소이다.
다른 구현예에서, 해충 또는 병원체에 대한 식물의 저항성 및/또는 내성의 증가를 일으키는 RNA는 표적 유전자의 발현을 억제한다.
또 다른 구현예에서, 해충 또는 병원체에 대한 식물의 저항성 및/또는 내성의 증가를 일으키는 RNA는 siRNA 또는 siRNA 전구체, miRNA 또는 miRNA 전구체, 및 단계적 siRNA 또는 단계적 siRNA 전구체로부터 선택되는 적어도 하나의 RNA를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 해충 또는 병원체에 대한 식물의 저항성 및/또는 내성의 증가를 일으키는 RNA는 메신저 RNA를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 메신저 RNA는 식물 또는 식물 세포의 게놈에 부재하는 RNA 서열을 포함한다.
구현예에서, 해충 또는 병원체에 대한 식물의 저항성 및/또는 내성의 증가를 일으키는 RNA는 식물 또는 식물 세포의 게놈을 변형하기 위한 RNA(예를 들어, 게놈의 CRISPR Cas 뉴클레아제 편집을 위한 하나 이상의 가이드 RNA)를 포함한다.
전형적으로, 식물 세포는 엔도르나바이러스를 포함하고, RDRP 단백질은 엔도르나바이러스에 의해 식물 세포에 제공된다. 구현예에서, 엔도르나바이러스는 식물 세포에 풍토성이다. 다른 구현예에서, 엔도르나바이러스는 외인성 엔도르나바이러스, 예를 들어, 상이한 유기체, 종, 변종 또는 생식질에서 본래 발견되고 식물 세포 내로 도입될 때 자가 복제 가능한 엔도르나바이러스를 식물 세포 내로 도입함으로써 식물 세포에 외인성으로 제공된다. 일부 구현예에서, RDRP 단백질은, 예를 들어 식물 세포에서 RDRP 단백질의 트랜스제닉 발현에 의해 식물 세포에 외인성으로 제공된다.
또 다른 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 발효 시스템에서 생산된다. 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 식물 세포에서 기능적이고 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 작제물을 식물 세포에서 전사함으로써 식물 세포에 제공된다. 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 캡시드화 인식 서열을 추가로 포함하고, 식물 세포는 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 캡시드화할 수 있는 바이러스 외피 단백질을 추가로 포함한다.
구현예에서, 바이러스 외피 단백질은 식물 세포에 외인성으로 제공된다.
다른 구현예에서, 재조합 DNA 작제물은 바이러스 외피 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 재조합 DNA 작제물은 식물 세포에서 기능적이고 바이러스 외피 단백질을 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터를 추가로 포함한다. 구현예에서, 바이러스 외피 단백질은 식물 세포에서 발현되고 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 캡시드화한다.
또 다른 구현예에서, 식물 세포는 엔도르나바이러스를 포함하고, 엔도르나바이러스는 식물 세포에 RDRP 단백질을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 식물 세포를 재조합 RNA 분자를 포함하는 제형과 접촉시킴으로써 식물 세포에 제공되고, 재조합 RNA 분자는 발효 시스템에서 생산되었으며, 재조합 RNA 분자는 바이러스 외피 단백질에 의해 선택적으로 캡시드화된다.
구현예에서, 해충 또는 병원체에 대한 식물의 저항성 및/또는 내성은 카고 RNA 서열로 인해 재조합 RNA 분자가 제공되지 않은 식물에 비해 증가한다. 예를 들어, RNA 서열의 발현은 참조 수준(예를 들어, 재조합 분자가 제공되지 않은 대조군 식물 또는 식물 세포에서 발견되는 수준)에 비해 해충 또는 병원체에 대한 식물의 저항성 및/또는 내성을 약 1%, 2%, 3%, %, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 또는 100% 초과만큼 증가시킨다.
해충 또는 병원체에 대한 식물의 저항성 및/또는 내성이 증가하는 상기 언급된 또는 달리 개시된 방법 중 임의의 것에서, 재조합 RNA는 해충 또는 병원체의 유전자의 발현을 저해하고/하거나 해충 또는 병원체의 게놈의 복제를 저해하는 RNA를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 해충 또는 병원체는 하기를 포함하는 군으로부터 선택된다: 박테리아, 엔도르나바이러스 이외의 바이러스, 진균, 난균류 및 무척추동물(예를 들어, 절지동물 또는 선충). 엔도르나바이러스 이외의 표적 바이러스의 구현예는 (i) 비르가비리다에(Virgaviridae), 솔레모비리다에(Solemoviridae), 알파플렉시비리다에(Alphaflexiviridae), 브로모비리다에(Bromoviridae), 클로스테로비리다에(Closteroviridae), 루테오비리다에(Luteoviridae), 또는 포티비리다에(Potyviridae) 과의 양성 가닥 RNA 바이러스; (ii) 부니아비리다에(Bunyaviridae) 및 랍도비리다에(Rhabdoviridae) 과의 음성 가닥 RNA 바이러스; (iii) 카울리모비리다에(Caulimoviridae) 과의 dsDNA 바이러스; 및 (iii) 제미니비리다에(Geminiviridae) 과의 ssDNA 바이러스를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 표적 무척추동물 해충의 비제한적 구현예는 절지동물 해충(예를 들어, 딱정벌레목, 인시목 및 쌍시목 곤충, 및 거미류, 예컨대 응애) 및 선충 해충(예를 들어, 뿌리혹 선충 및 낭포 형성 선충)을 포함한다. 표적 진균 및 난균류 병원체의 비제한적 구현예는 마그나포르테(Magnaporthe) spp., 보트리티스 spp., 푹시니아(Puccinia) spp.; 푸사리움(Fusarium) spp., 블루메리아(Blumeria) spp., 마이코스파에렐라(Mycosphaerella) spp., 콜레토트리쿰(Colletotrichum) spp., 우스틸라고(Ustilago) spp., 멜람프소라(Melampsora) spp., 파코프소라(Phakopsora) spp., 파이토프토라(Phytophthora) spp., 및 리족토니아(Rhizoctonia) spp.를 포함한다. 구현예에서, 해충 또는 병원체에 대한 식물의 저항성 및/또는 내성은 카고 RNA 분자로 인해 재조합 RNA 분자가 제공되지 않은 식물에 비해 증가한다.
iv. 스트레스에 대한 식물의 저항성 증가
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 스트레스에 대한 식물의 저항성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 방법은 일반적으로 5'에서 3' 순서로, 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; 카고 RNA 서열; 및 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는 재조합 RNA 분자를 식물에 제공하는 단계를 포함하고, 식물 또는 식물 세포는 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 RDRP 단백질을 포함하고, 이에 의해 RDRP 단백질은 재조합 RNA 분자로부터 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA의 합성을 촉매하고, (직접적으로 또는 간접적으로) 카고 RNA 서열로 인해 스트레스에 대한 식물의 저항성은 재조합 RNA 분자가 제공되지 않은 식물에 비해 증가한다.
구현예에서, 재조합 RNA 분자는 식물 또는 식물 세포에 직접 제공된다. 다른 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 분자를 식물 또는 식물 세포에서 발현시킴으로써 제공된다.
구현예에서, 스트레스는 하기를 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 비생물적 스트레스를 포함한다: 양분 스트레스, 광 스트레스, 수분 스트레스, 열 스트레스 및 저온 스트레스.
다른 구현예에서, 스트레스는 하기를 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 생물적 스트레스를 포함한다: 군집, 쉐이딩 및 알렐로파시(예를 들어, 호두나무에 의해 생산되는 유글론과 같은 알렐로파시 화학물질(allelopathic chemicals)로 인한 것임).
구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함하고/하거나; 3' 레플리카제 인식 서열은 표 11, 12 또는 13에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함한다. 다른 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 3' 레플리카제 인식 서열은 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열은 표 1에 제시된 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함한다. 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 1 내지 19, 372 내지 405, 465, 또는 483 내지 485 중 적어도 하나에 의해 인코딩된 RNA 서열, 또는 서열번호 580의 RNA 서열을 포함하고/하거나; 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 20 내지 38, 또는 406 내지 454 중 적어도 하나에 의해 인코딩된 RNA 서열, 또는 서열번호 580의 RNA 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 1 내지 19, 372 내지 405, 465, 또는 483 내지 485에 의해 인코딩된 RNA 서열 중 적어도 하나, 또는 서열번호 580의 RNA 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고/하거나; 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 20 내지 38, 406 내지 454, 467, 또는 486 내지 488에 의해 인코딩된 RNA 서열 중 적어도 하나, 또는 서열번호 581의 RNA 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열은 본원에 개시된 재조합 RNA 분자에 존재하는 상기 언급된 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열 중 임의의 것을 포함한다.
구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래되고/되거나; 3' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래된다.
구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열은 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래된다.
다른 구현예에서, 식물 또는 식물 세포에서 스트레스에 대한 식물의 저항성의 증가를 일으키는 RNA는 재조합 RNA 분자가 제공되지 않은 대조군 식물 또는 식물 세포에서의 표적 유전자의 발현에 비해 표적 유전자의 발현을 조절하기 위한 RNA를 포함하며, 표현형 변화는 조절의 결과이다.
구현예에서, 조절은 (a) 표적 유전자의 발현의 증가; 또는 (b) 표적 유전자의 발현의 감소이다.
다른 구현예에서, 식물 또는 식물 세포에서 스트레스에 대한 식물의 저항성의 증가를 일으키는 RNA는 표적 유전자의 발현을 억제한다.
또 다른 구현예에서, 식물 또는 식물 세포에서 스트레스에 대한 식물의 저항성의 증가를 일으키는 RNA는 siRNA 또는 siRNA 전구체, miRNA 또는 miRNA 전구체, 및 단계적 siRNA 또는 단계적 siRNA 전구체로부터 선택되는 적어도 하나의 RNA를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 식물 또는 식물 세포에서 스트레스에 대한 식물의 저항성의 증가를 일으키는 RNA는 메신저 RNA를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 메신저 RNA는 식물 또는 식물 세포의 게놈에 부재하는 RNA 서열을 포함한다.
구현예에서, 식물 또는 식물 세포에서 스트레스에 대한 식물의 저항성의 증가를 일으키는 RNA는 식물 또는 식물 세포의 게놈을 변형하기 위한 RNA(예를 들어, 게놈의 CRISPR Cas 뉴클레아제 편집을 위한 하나 이상의 가이드 RNA)를 포함한다.
전형적으로, 식물 세포는 엔도르나바이러스를 포함하고, RDRP 단백질은 엔도르나바이러스에 의해 식물 세포에 제공된다. 구현예에서, 엔도르나바이러스는 식물 세포에 풍토성이다. 구현예에서, 식물 세포에 풍토성인 엔도르나바이러스는 식물 세포에 비병원성이고/이거나 편리공생한다. 다른 구현예에서, 엔도르나바이러스는 외인성 엔도르나바이러스, 예를 들어, 상이한 유기체, 종, 변종 또는 생식질에서 본래 발견되고 식물 세포 내로 도입될 때 자가 복제 가능한 엔도르나바이러스를 식물 세포 내로 도입함으로써 식물 세포에 외인성으로 제공된다. 일부 구현예에서, RDRP 단백질은, 예를 들어 식물 세포에서 RDRP 단백질의 트랜스제닉 발현에 의해 식물 세포에 외인성으로 제공된다.
또 다른 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 발효 시스템에서 생산된다. 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 식물 세포에서 기능적이고 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 작제물을 식물 세포에서 전사함으로써 식물 세포에 제공된다. 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 캡시드화 인식 서열을 추가로 포함하고, 식물 세포는 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 캡시드화할 수 있는 바이러스 외피 단백질을 추가로 포함한다.
구현예에서, 바이러스 외피 단백질은 식물 세포에 외인성으로 제공된다.
다른 구현예에서, 재조합 DNA 작제물은 바이러스 외피 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 재조합 DNA 작제물은 식물 세포에서 기능적이고 바이러스 외피 단백질을 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터를 추가로 포함한다. 구현예에서, 바이러스 외피 단백질은 식물 세포에서 발현되고 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 캡시드화한다.
또 다른 구현예에서, 식물 세포는 엔도르나바이러스를 포함하고, 엔도르나바이러스는 식물 세포에 RDRP 단백질을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 식물 세포를 재조합 RNA 분자를 포함하는 제형과 접촉시킴으로써 식물 세포에 제공되고, 재조합 RNA 분자는 발효 시스템에서 생산되었으며, 재조합 RNA 분자는 바이러스 외피 단백질에 의해 선택적으로 캡시드화된다.
구현예에서, 스트레스에 대한 식물의 저항성은 카고 RNA 서열로 인해 재조합 RNA 분자가 제공되지 않은 식물에 비해 증가한다. 예를 들어, RNA 서열의 발현은 참조 수준(예를 들어, 재조합 분자가 제공되지 않은 대조군 식물 또는 식물 세포에서 발견되는 수준)에 비해 스트레스에 대한 식물의 저항성을 약 1%, 2%, 3%, %, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 또는 100% 초과만큼 증가시킨다.
v. 식물 또는 식물 세포에서의 폴리펩티드의 발현
다른 양태에서, 본 개시내용은 식물 또는 식물 세포에서 외인성 폴리펩티드(예를 들어, 외인성 폴리펩티드)를 발현시키는 방법에 관한 것이다. 방법은 일반적으로 식물 또는 식물 세포에서 기능적이고, 5'에서 3' 순서로, (a) 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; (b) 폴리펩티드를 인코딩하는 번역 가능한 메신저 RNA를 포함하는 카고 RNA 서열; 및 (c) 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 분자를 식물 또는 식물 세포에서 발현시키는 단계를 포함하고; RNA 분자는 선택적으로, (d) 바이러스 MP를 인코딩하는 적어도 하나의 RNA; (e) 적어도 하나의 tRNA 유사 서열; 및 (f) 캡시드화 인식 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 요소를 추가로 포함하고, 식물 또는 식물 세포는 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 RDRP 단백질을 포함하고, 이에 의해 RDRP 단백질은 재조합 RNA 분자로부터 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA의 합성을 촉매하고, 폴리펩티드는 폴리펩티드를 인코딩하는 번역 가능한 메신저 RNA로부터 번역된다.
구현예에서, 재조합 RNA 분자는 식물 또는 식물 세포에 직접 제공된다. 다른 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 분자를 식물 또는 식물 세포에서 발현시킴으로써 제공된다.
구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함하고/하거나; 3' 레플리카제 인식 서열은 표 11, 12 또는 13에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함한다. 다른 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 3' 레플리카제 인식 서열은 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열은 표 1에 제시된 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함한다. 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 1 내지 19, 372 내지 405, 465, 또는 483 내지 485 중 적어도 하나에 의해 인코딩된 RNA 서열, 또는 서열번호 580의 RNA 서열을 포함하고/하거나; 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 20 내지 38, 406 내지 454, 467, 또는 486 내지 488 중 적어도 하나에 의해 인코딩된 RNA 서열, 또는 서열번호 581의 RNA 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 1 내지 19, 372 내지 405, 465, 또는 483 내지 485 중 적어도 하나에 의해 인코딩된 RNA 서열, 또는 서열번호 580의 RNA 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고/하거나; 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 20 내지 38, 406 내지 454, 467, 또는 486 내지 488 중 적어도 하나에 의해 인코딩된 RNA 서열, 또는 서열번호 581의 RNA 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열은 본원에 개시된 재조합 RNA 분자에 존재하는 상기 언급된 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열 중 임의의 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래되고/되거나; 3' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래된다. 전형적으로, 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열은 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열은 상이한 엔도르나바이러스로부터 유래된다.
구현예에서, 카고 RNA 서열은 폴리펩티드를 인코딩하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하고, 번역되어 식물에서 폴리펩티드를 생산한다.
구현예에서, 폴리펩티드는 단리된다.
구현예에서, 폴리펩티드는 정제된다.
vi. 합성 엔도르나바이러스 위성 입자의 제조
다른 양태에서, 본 개시내용은 합성 엔도르나바이러스 위성 입자를 제조하는 방법에 관한 것이다. 방법은 일반적으로 (a) 5'에서 3' 순서로, 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; 카고 RNA 서열; 및 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는 재조합 RNA 분자를 세포(예를 들어, 박테리아, 효모, 동물 또는 식물 세포)에 제공하는 단계로서, 식물 세포는 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 RDRP 단백질을 포함하고, 이에 의해 RDRP 단백질은 재조합 RNA 분자로부터 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA의 합성을 촉매하는, 단계; 및 (b) 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 바이러스 외피 단백질로 캡시드화함으로써 합성 엔도르나바이러스 위성 입자를 제공하는 단계를 포함한다.
구현예에서, 재조합 RNA 분자는 세포, 예를 들어 식물 또는 식물 세포에 직접 제공된다. 다른 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 분자를 세포, 예를 들어 식물 또는 식물 세포에서 발현시킴으로써 제공된다.
구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함하고/하거나; 3' 레플리카제 인식 서열은 표 11, 12 또는 13에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함한다. 다른 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 3' 레플리카제 인식 서열은 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열은 표 1에 제시된 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함한다. 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 1 내지 19, 372 내지 405, 465, 또는 483 내지 485 중 적어도 하나에 의해 인코딩된 RNA 서열, 또는 서열번호 580의 RNA 서열을 포함하고/하거나; 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 20 내지 38, 406 내지 454, 467, 또는 486 내지 488 중 적어도 하나에 의해 인코딩된 RNA 서열, 또는 서열번호 581의 RNA 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 1 내지 19, 372 내지 405, 465, 또는 483 내지 485에 의해 인코딩된 RNA 서열 중 적어도 하나, 또는 서열번호 580의 RNA 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고/하거나; 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 20 내지 38, 406 내지 454, 467, 또는 486 내지 488 중 적어도 하나에 의해 인코딩된 RNA 서열, 또는 서열번호 581의 RNA 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열은 본원에 개시된 재조합 RNA 분자에 존재하는 상기 언급된 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열 중 임의의 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래되고/되거나; 3' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래된다. 전형적으로, 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열은 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열은 상이한 엔도르나바이러스로부터 유래된다.
구현예에서, 바이러스 외피 단백질은 세포, 예컨대 식물 세포에 외인성으로 제공된다. 구현예에서, 식물 세포는 바이러스 외피 단백질을 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 바이러스 외피 단백질은 식물 세포에서 재조합적으로 발현된다.
다른 구현예에서, 카고 RNA 서열은 길이가 최대 약 14 kb이다.
구현예에서, 카고 RNA 서열은 하기를 포함한다: (a) 적어도 하나의 코딩 서열, (b) 적어도 하나의 비코딩 서열, 또는 (c) 적어도 하나의 코딩 서열과 적어도 하나의 비코딩 서열 둘 모두. 구현예에서, 카고 RNA 서열은 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하고, RNA 분자는 적어도 하나의 코딩 서열에 바로 인접하여 그의 5'에 위치하는 IRES를 추가로 포함한다. 구현예에서, 카고 RNA 서열은 다수의 코딩 서열을 포함하고, RNA 분자는 코딩 서열 각각에 바로 인접하여 그의 5'에 위치하는 IRES를 추가로 포함한다.
구현예에서, 카고 RNA 서열은 적어도 하나의 비코딩 서열을 포함하고, 적어도 하나의 비코딩 서열은 헤어핀 RNA(hpRNA); 다수의 줄기-루프를 형성하는 RNA; RNA 슈도노트; 적어도 부분적으로 이중 가닥 RNA를 형성하는 RNA 서열; 작은 간섭 RNA(siRNA) 또는 siRNA 전구체; 마이크로RNA(miRNA) 또는 miRNA 전구체; 자가 절단 리보자임; 리간드 반응성 자가 절단 리보자임(압타자임); RNA 앱타머; 및 긴 비코딩 RNA(lncRNA)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 재조합 DNA 작제물은 바이러스 외피 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 추가로 포함한다.
구현예에서, 재조합 DNA 작제물은 식물 세포에서 기능적이고 바이러스 식물 단백질을 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터를 추가로 포함한다.
다른 구현예에서, 세포, 예컨대 식물 세포는 엔도르나바이러스를 포함하고, 엔도르나바이러스는 식물 세포에 RDRP 단백질을 제공한다. 구현예에서, 엔도르나바이러스는 식물 세포에 풍토성이다. 구현예에서, 식물 세포에 풍토성인 엔도르나바이러스는 식물 세포에 비병원성이고/이거나 편리공생한다. 다른 구현예에서, 엔도르나바이러스는 외인성 엔도르나바이러스, 예를 들어, 상이한 유기체, 종, 변종 또는 생식질에서 본래 발견되고 식물 세포 내로 도입될 때 자가 복제 가능한 엔도르나바이러스를 식물 세포 내로 도입함으로써 식물 세포에 외인성으로 제공된다.
구현예에서, RDRP 단백질은, 예를 들어 식물 세포에서 RDRP 단백질의 트랜스제닉 발현에 의해 세포, 예컨대 식물 세포에 외인성으로 제공된다.
구현예에서, 재조합 RNA 분자는 식물 세포에서 기능적이고 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 작제물을 식물 세포에서 전사함으로써 세포, 예컨대 식물 세포에 제공된다.
구현예에서, 방법은 합성 엔도르나바이러스 위성 입자를 정제하는 단계를 포함한다.
구현예에서, 방법은 합성 엔도르나바이러스 위성 입자를 단리하는 단계를 포함한다.
구현예에서, 방법은 합성 엔도르나바이러스 위성 입자를 제형화하는 단계를 포함한다.
따라서 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 방법에 의해 제공되는 합성 엔도르나바이러스 위성 입자에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 합성 엔도르나바이러스 위성 입자를 식물에 제공하는 방법에 관한 것이고, 방법은 식물을 합성 엔도르나바이러스 위성 입자와 접촉시키는 단계(예를 들어, 분무, 살포, 주입, 침지 등)를 포함한다.
vii. 변형된 식물 번식체의 생산
다른 양태에서, 본 개시내용은 재조합 RNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 식물 세포를 포함하는 변형된 식물 번식체를 생산하는 방법에 관한 것이다. 방법은 일반적으로 재조합 RNA 분자를 포함하는 식물 세포와 재조합 RNA 분자를 결여한 식물 세포 둘 모두를 포함하는 식물 세포의 혼합 집단으로부터 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제(RDRP) 및 재조합 RNA 분자(예를 들어, 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA)를 포함하는 적어도 하나의 식물 세포를 포함하는 식물 번식체를 단리하는 단계를 포함하고, 재조합 RNA 분자는 5'에서 3' 순서로, 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; 카고 RNA 서열; 및 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함한다. 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA를 포함하는 재조합 DNA 작제물에 의해 식물 세포(예를 들어, 배양물, 캘러스, 배아 조직 또는 다른 외식편 물질, 뿌리, 축(axial) 또는 정단 분열조직, 식물 조직 또는 부분, 온전한 식물 내의 식물 세포 또는 원형질체)의 집단 내로 도입된다. 다른 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 RNA로서(예를 들어, 네이키드 RNA로서 또는 폴리펩티드, 예를 들어 바이러스 외피 단백질, 항체 또는 항체 단편, 또는 양이온성 폴리펩티드와 복합체화되거나 회합된 RNA로서) 식물 세포의 집단 내로 도입된다. 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA를 포함하는 재조합 DNA는 바이오리스틱(biolistic) 전달(예를 들어, "유전자 총"에 의해 가속되는 금 및 텅스텐 입자 상에서), 담체(예를 들어, 나노입자, 나노섬유, 나노튜브, 지질 소포, 마이셀 또는 나노입자, 계면활성제, 또는 점토 입자 또는 나노시트)를 사용한 전달, 및 박테리아 매개 형질전환(예를 들어, 아그로박테리움 sp., 시노리조비움 sp., 메소리조비움 sp., 브라디리조비움 sp., 리조비움 sp., 또는 엔시퍼 sp.를 사용함)을 포함하는 기법에 의해 식물 세포 내로 도입될 수 있다. 구현예에서, 예를 들어, 각각 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 공개 US20170369898호 및 US20180312854호에 기재된 바와 같이, 아그로박테리움 투메파시엔스는 재조합 RNA 분자(합성 엔도르나바이러스 위성)를 인코딩하는 DNA에 측접하는 좌측 및 우측 T-DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물을 이용하여 식물 세포를 형질전환하는 데 사용된다. 구현예에서, 박테리아 매개 형질전환 후, 재조합 RNA 분자(합성 엔도르나바이러스 위성)를 함유하는 식물 세포는 형질전환된 식물 세포의 집단으로부터 선택되고; 선택적으로, 선택되는 식물 세포는 재조합 DNA 작제물 또는 아그로박테리움 형질전환 프로세스로부터 생성된 임의의 다른 DNA, 예컨대 T-DNA 서열 또는 아그로박테리움 게놈으로부터의 다른 DNA를 함유하지 않는다. 구현예에서, 합성 엔도르나바이러스 위성은 선택 가능한 마커(예를 들어 가시적인 표현형을 제공하는 서열, 또는 항생제 또는 제초제와 같은 선택 제제에 대한 저항성을 제공하는 서열)를 인코딩하는 RNA를 포함하고, 선택은 선택 가능한 마커를 갖는 해당 식물 세포의 식별을 이용한다. 구현예에서, 합성 엔도르나바이러스 위성은 선택 제제에 대한 저항성을 제공하는 단백질을 인코딩하는 RNA를 포함하고, 형질전환된 식물 세포의 집단은 합성 엔도르나바이러스 위성을 함유하는 생존 식물 세포의 백분율을 증가시키기 위해 충분한 양의 선택 제제에 노출된다. 특정 구현예에서, 재조합 RNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 식물 세포를 포함하는 단리된 식물 번식체에는 재조합 RNA를 결여한 식물 세포가 없거나 실질적으로 없을 것이다. 재조합 RNA를 결여한 식물 세포가 실질적으로 없는 이러한 단리된 식물 번식체는, 특정 구현예에서 식물 번식체에서 식물 세포의 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%가 재조합 RNA 분자를 함유하는 식물 번식체를 포함할 수 있다. 구현예에서, 식물 세포의 혼합 집단은 원형질체의 집단 또는 캘러스, 외식편, 식물 부분 또는 전체 식물에서의 세포의 집단을 포함한다. 구현예에서, 식물 세포의 혼합 집단은 집단에서 식물 세포의 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 또는 1% 미만이 재조합 RNA 분자를 함유하는 식물 세포의 집단을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 식물 세포의 혼합 집단은 엔도르나바이러스 RDRP를 포함하는 식물 세포 및 엔도르나바이러스 RDRP를 결여한 식물 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 엔도르나바이러스 RDRP를 결여한 식물 세포는 재조합 RNA도 결여할 것이다. 다른 구현예에서, 식물 세포의 혼합 집단은 엔도르나바이러스 RDRP를 포함하는 식물 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 엔도르나바이러스 RDRP를 포함하는 식물 세포는 재조합 RNA를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 카고 RNA 서열은 선택 가능한 또는 스코어링 가능한 마커를 인코딩하는 RNA를 포함한다. 구현예에서, 식물 세포의 혼합 집단은 식물 번식체를 단리하기 전에 재조합 RNA 분자를 포함하는 식물 세포의 존재에 대해 스크리닝되거나 선택된다. 이러한 스크리닝에서, 세포의 혼합 집단 또는 이의 일부는 재조합 RNA 분자(예를 들어, 재조합 RNA 분자의 존재를 진단하는 RNA 서열 또는 재조합 RNA 분자에 의해 인코딩된 폴리펩티드)의 존재에 대한 스크리닝 가능한 마커에 대한 검정을 거치고, 재조합 RNA 분자를 결여한 식물 세포로부터 분리된다. 일부 구현예에서, 단리는 식물 번식체를 단리하기 전에 재조합 RNA 분자를 포함하는 식물 세포를 선택하는 단계를 포함한다. 재조합 RNA가 선택 가능한 마커(예를 들어, 제초제 또는 항생제와 같은 선택 제제에 대한 저항성을 부여하는 단백질)를 인코딩하는 경우 이러한 선택의 예는 식물 세포의 혼합 집단을 선택 제제(예를 들어, 제초제 또는 항생제)에 노출시키는 것 및 선택 제제에 대한 노출에도 불구하고 생존하는 식물 세포를 단리하는 것을 포함할 수 있다. 선택 가능한 마커/선택 제제 조합의 예는 글리포세이트 저항성 EPSPS 효소 및/또는 글리포세이트 옥시다제/글리포세이트, 비알라포스 저항성(bar) 또는 포스피노트리신 아실 트랜스퍼라제(pat) 효소/글루포시네이트, 또는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(npt)/네오마이신 또는 카나마이신을 포함한다. 특정 구현예에서, 선택 가능한 또는 스코어링 가능한 마커는 RNA 앱타머(예를 들어, 브로콜리 앱타머) 또는 조절 RNA(예를 들어, 식물에서 내인성 유전자의 발현을 하향조절하여 검출 가능한 표현형, 예를 들어 색소 생산 유전자의 하향조절에 의해 야기되는 표백을 초래하는 siRNA, siRNA 전구체, miRNA 또는 miRNA 전구체)이다. 구현예에서, 혼합 집단은 식물 또는 식물 부분 내에 위치한다. 일부 구현예에서, 식물 또는 식물 부분은 식물 번식체를 단리하기 전에 재조합 RNA 분자의 존재에 대해 스크리닝되거나 선택된다. 다른 구현예에서, 식물 또는 식물 부분은 식물 번식체를 단리하기 전에 재조합 RNA 분자의 전신 존재에 대해 스크리닝되거나 선택된다. 일부 구현예에서, 혼합 집단 내의 또는 단리된 식물 세포, 식물 또는 식물 부분은 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA를 결여하고 있다. 구현예에서, 재조합 RNA 분자를 포함하는 식물 번식체는 재조합 RNA 분자를 포함하는 하나 이상의 식물 세포에서 RNA 분자를 검출하고, 재조합 DNA 분자를 결여한 식물 세포로부터 재조합 RNA 분자를 포함하는 하나 이상의 식물 세포를 분리함으로써 단리된다. 일부 구현예에서, 식물 번식체는 재조합 RNA 분자를 포함하는 식물 세포와 재조합 RNA 분자를 결여한 식물 세포 둘 모두를 포함하는 모자이크이다. 다른 구현예에서, 변형된 식물 번식체는 엔도르나바이러스 RDRP를 포함하는 식물 세포와 엔도르나바이러스 RDRP를 결여한 식물 세포 둘 모두를 포함하는 모자이크이다. 특정 구현예에서, 모자이크 내 식물 세포의 적어도 99%, 98%, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 또는 1%가 재조합 RNA 분자를 포함할 수 있다. 적어도 규제상의 이유로 특히 유리한 특정 구현예에서, 식물 번식체는 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA를 결여하고 있다. 구현예에서, 변형된 식물 번식체는 재조합 RNA 분자를 포함하는 세포, 또는 재조합 RNA 분자를 포함하는 세포를 포함하는 종자, 묘목, 배주, 배아, 꽃가루, 뿌리, 줄기, 잎, 묘조, 덩이줄기, 뿌리줄기, 기는 줄기, 구근, 외식편 또는 캘러스를 포함한다. 상기 언급된 방법 중 임의의 것에 의해 제조되고/되거나 상기 언급된 특징 중 임의의 것을 혼입한 식물 번식체도 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 상기 언급된 방법 중 임의의 것은 세포, 종자, 묘목, 배주, 배아, 꽃가루, 뿌리, 줄기, 잎, 묘조, 덩이줄기, 뿌리줄기, 기는 줄기, 구근, 외식편 또는 캘러스를 증식시켜 자손을 얻는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 자손은 재조합 RNA 분자를 포함한다. 다른 구현예에서, 세포를 증식시키는 단계는 세포, 종자, 묘목, 배주, 배아, 꽃가루, 뿌리, 줄기, 잎, 묘조, 덩이줄기, 뿌리줄기, 기는 줄기, 구근, 외식편 또는 캘러스로부터 얻어진 복수의 외식편을 배양하는 단계로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 단리된 번식체는 세포를 포함하고 상기 언급된 방법은 세포로부터의 재조합 RNA를 포함하는 식물, 묘목, 배주, 배아, 꽃가루, 뿌리, 줄기, 잎, 묘조, 덩이줄기, 뿌리줄기, 기는 줄기, 구근, 외식편 또는 캘러스를 재생시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 단리된 번식체는 캘러스를 포함하고 상기 언급된 방법은 상기 캘러스로부터의 재조합 RNA를 포함하는 식물, 묘목, 배주, 배아, 꽃가루, 뿌리, 줄기, 잎, 묘조, 덩이줄기, 뿌리줄기, 기는 줄기, 구근 또는 외식편을 재생시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 구현예에서, 식물은 재생되고, 상기 언급된 방법은 식물로부터의 재조합 RNA를 포함하는 F1 종자 또는 F1 자손 또는 클론 자손을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
viii. 접목을 통해 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 식물에 제공
다른 양태에서, 본 개시내용은 하나의 식물 부분을 다른 식물 부분에 접목시킴으로써 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 식물 또는 식물 부분에 제공하는 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 방법은 상기 언급된 또는 달리 개시된 재조합 DNA 분자 및/또는 재조합 RNA 분자(예를 들어, 5'에서 3' 순서로, 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제(RDRP)에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; 카고 RNA 서열; 및 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는 재조합 RNA) 중 임의의 것을 포함하는 대목 상에 접가지를 접목시키는 단계를 포함할 수 있고, 대목 및/또는 접가지의 적어도 하나의 세포는 엔도르나바이러스 RDRP를 포함한다. 특정 구현예에서, 접가지는 식물 묘조, 정단 또는 다른 분열조직, 잎자루에 부착된 잎, 또는 다른 식물 부분을 포함할 수 있고, 대목은 식물의 원줄기, 이차 줄기, 잎 및/또는 생식 구조를 포함하는 식물의 뿌리 및 공중(aerial) 부분을 포함할 수 있다. 구현예에서, 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA는 접가지 및/또는 대목에 부재한다. 구현예에서, 접가지는 접목 이전에 재조합 RNA 분자를 결여하고 있다. 구현예에서, 대목은 엔도르나바이러스 RDRP를 포함한다. 일부 구현예에서, 엔도르나바이러스 RDRP는 대목에 풍토성인 엔도르나바이러스(예를 들어, 비병원성이고/이거나 편리공생하는 엔도르나바이러스)에 의해 제공된다. 다른 구현예에서, 엔도르나바이러스 RDRP는 대목에 외인성으로 제공된다(예를 들어, 대목의 염색체 또는 색소체 DNA에 통합되는 DNA 발현 카세트를 통해 또는 RDRP를 인코딩하는 DNA 또는 RNA를 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 통해). 구현예에서, 접가지는 엔도르나바이러스 RDRP를 포함한다. 일부 구현예에서, RDRP는 접가지에 풍토성인 엔도르나바이러스(예를 들어, 비병원성이고/이거나 편리공생하는 엔도르나바이러스)에 의해 제공된다. 다른 구현예에서, RDRP는 접가지에 외인성으로 제공된다(예를 들어, 접가지의 염색체 또는 색소체 DNA에 통합되는 DNA 발현 카세트를 통해 또는 RDRP를 인코딩하는 DNA 또는 RNA를 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 통해). 구현예에서, 대목 및/또는 접가지는 재조합 RNA 분자를 캡시드화할 수 있는 이종 바이러스 외피 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 대목 및/또는 접가지는 이종 바이러스 외피 단백질에 의해 캡시드화된 재조합 RNA 분자를 포함한다.
ix. 접목 식물의 생산
다른 양태에서, 본 개시내용은 5'에서 3' 순서로, 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제(RDRP)에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; 카고 RNA 서열; 및 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는 재조합 RNA 분자를 포함하는 접목 식물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 접목 식물에 대한 것이며, 접목 식물의 대목 및/또는 접가지는 재조합 RNA 및 엔도르나바이러스 RDRP를 포함하는 적어도 하나의 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 접목 식물은 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 접목 식물이다. 특정 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 접목 식물을 생산하기 위해 접가지를 대목 상에 접목시키기 전에 접가지, 대목, 또는 접가지와 대목 둘 모두를 재조합 RNA 분자를 포함하는 조성물과 접촉시킴으로써 제공된다. 특정 구현예에서, 대목 및/또는 접가지의 적어도 하나의 세포는 접가지, 대목, 또는 접가지와 대목 둘 모두를 조성물과 접촉시키기 전에 엔도르나바이러스 RDRP를 포함한다. 구현예에서, 대목은 엔도르나바이러스 RDRP를 포함한다. 일부 구현예에서, 엔도르나바이러스 RDRP는 대목에 풍토성인 엔도르나바이러스(예를 들어, 비병원성이고/이거나 편리공생하는 엔도르나바이러스)에 의해 제공된다. 다른 구현예에서, 엔도르나바이러스 RDRP는 대목에 외인성으로 제공된다(예를 들어, 대목의 염색체 또는 색소체 DNA에 통합되는 DNA 발현 카세트를 통해 또는 RDRP를 인코딩하는 DNA 또는 RNA를 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 통해). 구현예에서, 접가지는 엔도르나바이러스 RDRP를 포함한다. 일부 구현예에서, RDRP는 접가지에 풍토성인 엔도르나바이러스(예를 들어, 비병원성이고/이거나 편리공생하는 엔도르나바이러스)에 의해 제공된다. 다른 구현예에서, RDRP는 접가지에 외인성으로 제공된다(예를 들어, 접가지의 염색체 또는 색소체 DNA에 통합되는 DNA 발현 카세트를 통해 또는 RDRP를 인코딩하는 DNA 또는 RNA를 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 통해). 구현예에서, 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA는 접가지, 대목 및/또는 접목 식물에 부재한다. 조성물은 본원에 개시된 제형 중 임의의 것에 따라 접가지, 대목, 또는 접가지와 대목 둘 모두에 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 제형은 액체, 겔 또는 분말이다. 일부 구현예에서, 제형은 접가지, 대목, 또는 접가지와 대목 둘 모두 상에 분무되거나; 접가지, 대목, 또는 접가지와 대목 둘 모두 내로 주입되거나; 접가지, 대목, 또는 접가지와 대목 둘 모두 내로 침지되거나; 접가지, 대목, 또는 접가지와 대목 둘 모두 상에 코팅되도록 구성된다. 특정 구현예에서, 접촉은 접가지, 대목, 또는 접가지와 대목 둘 모두를 접목 이전에 조성물에 담그는 단계를 포함한다.
x. 재조합 RNA 분자를 자손 식물 또는 종자에 전파하는 식물의 생산
다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 제공된 상기 언급된 또는 달리 개시된 재조합 RNA 분자 중 임의의 것을 자손 식물 또는 종자에 전파하는 식물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 방법은 재조합 RNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 모 식물로부터 얻어진 F1 식물 또는 종자의 집단으로부터 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제(RDRP) 및 5'에서 3' 순서로, 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; 카고 RNA 서열; 및 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는 재조합 RNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 세포를 포함하는 F1 자손 식물 또는 종자를 단리하는 단계를 포함한다. 구현예에서, 식물 세포를 포함하는 모 식물 또는 이의 일부는 F1 자손 식물 또는 종자를 단리하기 전에 재조합 RNA 분자의 존재에 대해 스크리닝되거나 선택된다. 일부 구현예에서, 모 식물 또는 이의 하나 이상의 부분은 F1 자손 식물을 단리하기 전에 재조합 RNA 분자의 전신 존재에 대해 스크리닝된다. 다른 구현예에서, 모 식물의 꽃 조직(예를 들어, 전체 꽃 또는 싹, 악편, 꽃받침 또는 꽃잎), 웅성 생식 조직(예를 들어, 수술, 꽃밥 또는 꽃가루), 또는 자성 생식 조직(예를 들어, 전체 과일, 씨주머니, 과피, 배주, 종피, 배유 또는 배아)은 재조합 RNA 분자의 존재에 대해 스크리닝되거나 선택된다. 구현예에서, F1 종자는 과피 조직 내 재조합 RNA 분자의 존재에 대해 선택되는 모 식물로부터 얻어진다. 구현예에서, 세포를 포함하는 F1 자손 식물 또는 종자는 재조합 RNA 분자의 존재에 대해 모 식물로부터 얻어진 F1 식물 또는 종자의 집단을 스크리닝하고 재조합 RNA 분자를 포함하는 F1 자손 식물 또는 종자를 번식시킴으로써 단리된다. 이러한 스크리닝에서, 자손 식물 또는 이의 종자는 재조합 RNA(예를 들어, 재조합 RNA 분자의 존재를 진단하는 RNA 서열 또는 재조합 RNA 분자에 의해 인코딩된 폴리펩티드)의 존재에 대한 스크리닝 가능한 마커에 대한 검정을 거치고, 재조합 RNA 자손 식물을 결여한 자손 식물 및 종자 및 재조합 RNA를 결여한 종자로부터 분리된다. 이러한 스크리닝 검정은 자손 종자 또는 식물의 일부를 제거하고 재조합 RNA를 포함하는 종자 또는 식물 조직을 번식시키는 능력 또는 생존력의 손실 없이 검정하는 비파괴적 검정일 수 있다. 일부 구현예에서, 모 식물의 F1 종자는 재조합 RNA 분자의 존재에 대해 비파괴적으로 스크리닝된다. 다른 구현예에서, 모 식물의 F1 종자는 재조합 RNA 분자의 존재에 대해 종자의 모계 유래 또는 배유 조직을 검정함으로써 비파괴적으로 스크리닝된다. 이러한 스크리닝에 적합할 수 있는 종자 또는 다른 식물 조직의 비파괴적 검정을 위한 방법은 미국 특허 출원 US20220221377호 및 US20210259176호에 개시된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 이들 둘 모두는 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, 카고 RNA 서열은 선택 가능한 또는 스코어링 가능한 마커를 인코딩하는 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 선택 가능한 마커를 인코딩하고, 재조합 RNA 분자를 포함하는 F1 자손 식물 또는 종자는 선택 가능한 마커의 존재에 대해 재조합 RNA 분자를 포함하는 F1 자손 식물 또는 종자를 선택함으로써 단리된다. 재조합 RNA가 선택 가능한 마커(예를 들어, 제초제 또는 항생제와 같은 선택 제제에 대한 저항성을 부여하는 단백질)를 인코딩하는 경우 이러한 선택의 예는 자손 종자 또는 식물을 선택 제제(예를 들어, 제초제 또는 항생제)에 노출시키는 것 및 선택 제제에 대한 노출에도 불구하고 생존하는 자손 종자 또는 식물을 단리하는 것을 포함할 수 있다. 선택 가능한 마커/선택 제제 조합의 예는 글리포세이트 저항성 EPSPS 효소 및/또는 글리포세이트 옥시다제/글리포세이트, 비알라포스 저항성(bar) 또는 포스피노트리신 아실 트랜스퍼라제(pat) 효소/글루포시네이트, 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(npt)/네오마이신 또는 카나마이신을 포함한다. 특정 구현예에서, 선택 가능한 또는 스코어링 가능한 마커는 RNA 앱타머 또는 조절 RNA이다. 일부 구현예에서, 모 식물은 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA를 결여하고 있다. 적어도 규제상의 이유로 특히 유리한 특정 구현예에서, F1 자손 식물 또는 종자는 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA를 결여하고 있다. 구현예에서, 선택된 F1 자손 식물은 재조합 RNA 분자를 적어도 F2 자손에 전파한다. 일부 구현예에서, F1 자손 식물 또는 종자 집단은 꽃가루 수용자(pollen recipient)로서 사용되는 모 식물로부터 얻어진다. 다른 구현예에서, F1 자손 식물 또는 종자 집단은 꽃가루 공여자로서 사용되는 모 식물로부터 얻어진다. 구현예에서, F1 자손 식물 또는 종자 집단은 모 식물을 자가수분(자화수분)함으로써 얻어진다. 다른 구현예에서, F1 자손 식물 또는 종자 집단은 2개의 모 식물의 유성 교배(타가수분)로부터 얻어진다. 일부 구현예에서, 재조합 RNA 분자를 포함하는 모 식물은 자성 모 식물이다. 다른 구현예에서, 재조합 RNA 분자를 포함하는 모 식물은 웅성 모 식물이고, 재조합 RNA 분자는 웅성 모 식물의 꽃가루로 전파된다.
특정 구현예에서, 방법은 재조합 RNA 분자 또는 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 식물 세포 내로 도입하는 단계 및 식물 세포로부터 재조합 RNA 분자를 포함하는 모 식물을 얻는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 구현예에서, 재조합 RNA 분자는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 요소를 추가로 포함한다: (a) 바이러스 이동 단백질(MP)을 인코딩하는 적어도 하나의 RNA; (b) 적어도 하나의 tRNA 유사 서열; 및 c) 조립 기점 서열(OAS). 구현예에서, 모본식물 및/또는 식물은 재조합 RNA 분자를 캡시드화할 수 있는 이종 바이러스 외피 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 모 및/또는 자손 식물은 이종 바이러스 외피 단백질에 의해 캡시드화된 재조합 RNA 분자를 포함한다.
xi. 식물, 식물 세포, 이의 자손 또는 이의 일부의 바코드화
다른 양태에서, 본 개시내용은 식물, 식물 세포, 이의 자손 또는 이의 일부를 바코드화하는 방법에 관한 것이다. 방법은 본원에 제공된 상기 언급된 또는 달리 개시된 재조합 RNA 분자 중 임의의 것을 식물 또는 식물 세포에 제공하는 단계를 포함하며, 재조합 RNA 분자의 카고 RNA는 바코드 RNA 분자를 포함하고, 식물 또는 식물 세포는 엔도르나바이러스 RDRP를 포함한다. 구현예에서, 바코드 RNA 분자는 식물, 식물 세포, 이의 자손 또는 이의 일부를 고유하게 식별하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 바코드 RNA는 무작위로 생성된 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 바코드 RNA 분자는 동일한 종의 야생형 식물, 이의 병원체 또는 이의 공생체의 게놈 및/또는 전사체에 존재하지 않는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 바코드 RNA 분자는 바코드 RNA 분자의 검출을 위한 정방향 프라이머 결합 부위 및 역방향 프라이머 결합 부위를 포함한다. 구현예에서, 바코드 RNA 분자는 식물 또는 식물 세포의, 또는 식물 또는 식물 세포 내 소기관의 게놈에 존재하지 않고, 식물 또는 식물 세포의 해충, 병원체 또는 공생체의 세포에 존재하지 않는 서열을 포함하는 정방향 프라이머 결합 부위, 및/또는 식물 또는 식물 세포의, 또는 식물 또는 식물 세포 내 소기관의 게놈에 존재하지 않고, 식물 또는 식물 세포의 해충, 병원체 또는 공생체의 세포에 존재하지 않는 서열을 포함하는 역방향 프라이머 결합 부위를 포함한다. 구현예에서, 바코드 RNA 분자는 비단백질 코딩 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 바코드 RNA 서열은 길이가 최대 약 14 kb이다. 일부 구현예에서, 바코드 RNA는 10 내지 5000개 뉴클레오티드, 20 내지 1000개 뉴클레오티드, 또는 50 내지 500개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 특정 구현예에서, 바코드 RNA 분자는 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 또는 5000개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 구현예에서, 식물은 바코드 RNA를 포함하는 재조합 RNA 분자를 자손에 전파한다. 구현예에서, 식물, 식물 세포, 이의 자손 또는 이의 일부는 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA를 결여하고 있다. 일부 구현예에서, 방법은 엔도르나바이러스 RDRP 및 재조합 RNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 세포를 포함하는 F1 자손 식물 또는 종자를 단리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, F1 자손 식물 또는 종자는 꽃가루 수용자로서 사용되는 식물로부터 얻어진다. 다른 구현예에서, F1 자손 식물 또는 종자는 꽃가루 공여자로서 사용되는 식물로부터 얻어진다. 구현예에서, F1 자손 식물 또는 종자는 모 식물을 자가수분함으로써 얻어진다. 구현예에서, 방법은 식물 또는 식물 세포를 번식시켜 바코드 RNA 분자를 포함하는 식물 부분 또는 식물 번식체를 얻는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
xii. 바코드화된 식물, 식물 부분 또는 식물 세포의 식별
다른 양태에서, 본 개시내용은 바코드화된 식물, 식물 부분 또는 식물 세포를 식별하는 방법에 관한 것이다. 방법은 식물, 식물 부분 또는 식물 세포에서 바코드 RNA 분자의 존재에 대해 스크리닝하는 단계를 포함하고, 식물, 식물 부분 또는 식물 세포는 본원에 제공된 상기 언급된 또는 달리 개시된 재조합 RNA 분자 중 임의의 것을 포함하고, 재조합 RNA 분자의 카고 RNA는 바코드 RNA 분자를 포함한다. 특정 구현예에서, 방법은 식물, 식물 부분, 또는 식물 세포로부터 핵산 샘플을 얻는 단계; 및 샘플 내 바코드 RNA 분자의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 바코드 RNA의 검출을 위한 검정은 바코드 RNA 및/또는 바코드 RNA의 시퀀싱을 검출할 수 있는 핵산 프로브 및/또는 프라이머를 사용하는 RNA 검출 검정(예를 들어, RT-PCR 검정)을 포함한다. 이러한 스크리닝 검정은 종자 또는 식물의 일부를 제거하고 바코드 RNA를 포함하는 종자 또는 식물 조직을 번식시키는 능력 또는 생존력의 손실 없이 검정하는 비파괴적 검정일 수 있다. 이러한 스크리닝에 적합할 수 있는 종자 또는 다른 식물 조직의 비파괴적 검정을 위한 방법은 미국 특허 출원 US20220221377호 및 US20210259176호에 개시된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 이들 둘 모두는 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, 식물의 종자는 바코드 RNA 분자의 존재에 대해 비파괴적으로 스크리닝된다. 다른 구현예에서, 묘목, 배주, 배아, 꽃가루, 뿌리, 줄기, 잎, 묘조, 덩이줄기, 뿌리줄기, 기는 줄기, 구근, 외식편 또는 캘러스는 바코드 RNA 분자의 존재에 대해 스크리닝된다.
재조합 폴리뉴클레오티드의 제형
본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 및 다른 분자는 순수한 형태(예를 들어, 조성물은 재조합 폴리뉴클레오티드만을 함유함) 또는 조성물의 시용 또는 전달을 용이하게 하기 위해 하나 이상의 추가 제형 성분과 함께 제형화될 수 있다. 구현예에서, 추가 제형 성분은, 예를 들어 담체(즉, 활성제를 전달하는 데 활성 역할을 하는 성분(예를 들어, 재조합 폴리뉴클레오티드); 예를 들어 담체는 활성제의 전달을 개선하는 방식으로 활성제를 캡슐화하거나, 공유적으로 또는 비공유적으로 변형하거나, 달리 그와 회합시킬 수 있음) 또는 부형제(예를 들어, 전달 비히클, 아쥬반트, 희석제, 계면활성제, 안정화제 또는 장성제)를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 식물로의 전달을 위해 제형화된다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 조성물 중 임의의 것을 포함하는 제형을 제공한다. 일부 구현예에서, 제형은 액체, 겔 또는 분말이다. 일부 구현예에서, 제형은 식물 상에 분무되거나, 식물 내로 주입되거나, 잎 상에 마찰접종되거나, 식물 또는 종자 내로 침지되거나, 식물 상에 코팅되거나, 종자 상에 코팅되거나, 뿌리 흡수(예를 들어, 수경재배 시스템에서 또는 토양을 통해)를 통해 전달되도록 구성된다.
의도된 목적 및 일반적인 상황에 따라, 조성물은 유화 가능한 농축물, 현탁 농축물, 직접 분무 가능하거나 희석 가능한 용액, 코팅 가능한 페이스트, 희석된 에멀션, 분무 분말, 가용성 분말, 분산성 분말, 습윤성 분말, 분진, 과립, 폴리머 물질 내 캡슐화, 마이크로캡슐, 발포체, 에어로졸, 이산화탄소 가스 제제, 정제, 수지 제제, 종이 제제, 부직포 제제 또는 편직물 또는 직물 제제로 제형화될 수 있다. 일부 경우에, 조성물은 액체이다. 일부 경우에, 조성물은 고체이다. 일부 경우에, 조성물은 예컨대 가압 에어로졸 캔 내의 에어로졸이다.
일부 경우에, 재조합 폴리뉴클레오티드는 조성물의 약 0.1% 내지 약 100%, 예컨대, 약 0.01% 내지 약 100%, 약 1% 내지 약 99.9%, 약 0.1% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 25%, 약 10% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 99%, 또는 약 0.1% 내지 약 90%의 활성 성분(예를 들어, 재조합 폴리뉴클레오티드) 중 임의의 하나를 구성한다. 일부 경우에, 조성물은 적어도 0.1%, 0.5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상 중 임의의 것의 활성 성분(예를 들어, 재조합 폴리뉴클레오티드)을 포함한다. 일부 경우에, 농축된 제제가 상업적 생성물로 선호되지만, 최종 사용자는 일반적으로 활성 성분의 농도가 실질적으로 더 낮은 희석된 제제를 사용한다.
i. 국소 전달을 위한 제형
일부 구현예에서, 조성물은 식물로의 국소 전달을 위해 제형화된다. 일부 구현예에서, 국소 전달은 분무, 잎 마찰접종(leaf rubbing), 침지, 코팅(예를 들어, 미세 미립자 또는 나노 미립자를 사용한 코팅), 또는 뿌리 흡수를 통한 전달(예를 들어, 수경재배 시스템에서 또는 토양 또는 다른 성장 배지를 통한 전달)이다. 구현예에서, 조성물은, 예를 들어 코팅 또는 침지에 의한 종자로의 전달을 위해 제형화된다.
일부 구현예에서, 조성물은 담체 및/또는 부형제를 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 조성물은 담체 또는 부형제를 포함하지 않으며, 예를 들어 네이키드 폴리뉴클레오티드(예를 들어 네이키드 RNA)를 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 에이커당 적어도 0.1 그램, 예를 들어 에이커당 적어도 0.1, 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 그램의 농도로 전달된다. 일부 구현예에서는, 에이커당 120 리터 미만, 예를 들어 에이커당 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 또는 2 리터 미만 또는 에이커당 1 리터 미만이 전달된다.
ii. 담체
일부 양태에서, 제형은 담체를 포함한다. 일부 구현예에서 제형은 에멀션 또는 리버스 에멀션, 액체 또는 겔이다. 구현예에서, 제형은 물리적 지지체(예를 들어, 고체 또는 반고체 표면 또는 매트릭스, 분말, 또는 입자 또는 나노입자)로서의 역할을 하는 담체를 포함한다. 구현예에서, 활성제는 리포솜, 소포, 마이셀 또는 다른 유체 구획을 포함하는 담체에 캡슐화되거나 동봉되거나 부착되거나 그와 복합체화된다. 구현예에서, 활성제는 자연 발생 또는 합성, 분지형 또는 선형 폴리머(예를 들어, 펙틴, 아가로스, 키틴, 키토산, DEAE-덱스트란, 폴리비닐피롤리돈("PVP") 또는 폴리에틸렌이민("PEI"))를 포함하는 담체에 캡슐화되거나 동봉되거나 부착되거나 그와 복합체화된다. 구현예에서 담체는 양이온 또는 양이온성 전하, 예컨대 양이온성 리포솜 또는 양이온성 폴리머, 예컨대 폴리아민(예를 들어, 스페르민, 스페르미딘, 푸트레신)을 포함한다. 구현예에서, 담체는 폴리펩티드, 예컨대 효소(예를 들어 셀룰라제, 펙토리아제, 마세로엔자임(maceroenzyme), 펙티나제), 세포 침투성 또는 기공 형성 펩티드(예를 들어, 폴리-라이신, 폴리-아르기닌 또는 폴리-호모아르기닌 펩티드)를 포함한다. 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA)는 세포(예컨대, 식물 세포)로의 티올 매개 흡수를 촉진하기 위한 하나 이상의 시약과 함께 제형화되거나 전달되고; 이러한 시약의 구현예는 세포 침투성 폴리디설파이드(CPD), 사이클릭 올리고칼코게나이드(COC) 및 재조합 폴리뉴클레오티드에 대한 적어도 부분적인 혼성화를 가능하게 하고 폴리-디설파이드 단위(예를 들어 5 내지 20개의 디설파이드 단위)로 변형되는 서열을 갖는 "헬퍼" 올리고뉴클레오티드를 포함하며; 예를 들어, 문헌[Laurent et al. (2021), JACS Au, 1:710-728, DOI:10.1021/jacsau.1c00128]; 문헌[Mou et al. (2022) Science Advances, 8, eabo0902, DOI:10.1126/sciadv.abo0902]을 참조한다.
담체의 비제한적 예는 문헌[Zhang et al. (2007) J. Controlled Release, 123:1 - 10]에 의해 검토된 양이온성 리포솜 및 폴리머 나노입자, 및 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 공개 2014/0356414 Al호에 기재된 가교된 다층 리포솜을 포함한다. 구현예에서, 담체는 나노물질, 예컨대 탄소 또는 실리카 나노입자, 탄소 나노튜브, 탄소 나노섬유 또는 탄소 퀀텀닷을 포함한다. 담체의 비제한적 예는 다양한 크기 범위 및 형상의 입자 또는 나노입자(예를 들어, 탄소, 규소, 탄화규소, 금, 텅스텐, 폴리머 또는 세라믹과 같은 물질로 제조된 입자 또는 나노입자), 자성 입자 또는 나노입자(예를 들어, silenceMag Magnetotransfection TM 제제, OZ Biosciences, San Diego, CA), 연마제 또는 스캐리파잉 제제(scarifying agent), 바늘 또는 미세바늘, 매트릭스 및 그리드를 포함한다.
특정 구현예에서, 미립자 및 나노미립자는 폴리뉴클레오티드 조성물 또는 뉴클레아제 또는 둘 모두의 전달에 유용하다. 유용한 미립자 및 나노입자는 금속(예를 들어, 금, 은, 텅스텐, 철, 세륨), 세라믹(예를 들어, 산화알루미늄, 탄화규소, 질화규소, 탄화텅스텐), 폴리머(예를 들어, 폴리스티렌, 폴리디아세틸렌 및 폴리(3,4-에틸렌디옥시티오펜) 수화물), 반도체(예를 들어, 퀀텀닷), 규소(예를 들어, 탄화규소), 탄소(예를 들어, 흑연, 그래핀, 그래핀 옥사이드 또는 탄소 나노시트, 나노복합체 또는 나노튜브) 및 복합재(예를 들어, 폴리비닐카르바졸/그래핀, 폴리스티렌/그래핀, 백금/그래핀, 팔라듐/그래핀 나노복합재)로 제조된 것들을 포함한다. 특정 구현예에서, 이러한 미립자 및 나노미립자는 추가로 공유 또는 비공유적으로 작용화되거나, 개질제 또는 가교 물질, 예컨대 폴리머(예를 들어, 선형 또는 분지형 폴리에틸렌이민, 폴리-라이신), 폴리뉴클레오티드(예를 들어, DNA 또는 RNA), 다당류, 지질, 폴리글리콜(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 티올화 폴리에틸렌 글리콜), 폴리펩티드 또는 단백질, 및 검출 가능한 표지(예를 들어, 형광단, 항원, 항체 또는 퀀텀닷)를 추가로 포함한다. 다양한 구현예에서, 이러한 미립자 및 나노입자는 중성이거나 양전하를 운반하거나 음전하를 운반한다.
미립자를 포함하는 조성물의 구현예는, 예를 들어 액체, 콜로이드, 분산액, 현탁액, 에어로졸, 겔 및 고체로서 제형화된 것들을 포함한다. 구현예는 표면 또는 지지체, 예를 들어 규소 또는 구리 웨이퍼 기판에 수직으로 정렬된 탄소 나노튜브의 어레이에 부착된 나노입자를 포함한다. 구현예는 바이오리스틱 타입 기법에 의해 또는 자기력으로 전달되는 미립자(예를 들어, 금 또는 텅스텐 또는 자성 입자)를 포함하는 폴리뉴클레오티드 조성물을 포함한다. 바이오리스틱에 사용되는 입자의 크기는 일반적으로 "마이크로입자" 범위, 예를 들어 0.6, 1.0 및 1.6 마이크로미터 크기 범위의 금 미립담체이지만(예를 들어, Helios® 유전자 총 시스템, Bio-Rad, Hercules, CA에 대한 사용 매뉴얼; 문헌[Randolph-Anderson et al. (2015) "Submicron gold particles are superior to larger particles for efficient Biolistic® transformation of organelles and some cell types", Bio-Rad US/EG Bulletin 2015] 참조), 더 큰(40 - 48 - WO 2019/144124 PCT/0S2019/014559 나노미터) 나노입자를 사용한 성공적인 바이오리스틱 전달이, 배양된 동물 세포에서 보고되었으며; 문헌[O'Brian and Lummis (2011) BMC Biotechnol., 11 :66 - 71]을 참조한다.
유용한 미립자의 다른 구현예는 일반적으로 나노미터(nm) 크기 범위 또는 1 마이크로미터 미만, 예를 들어 약 1 nm 미만, 약 3 nm 미만, 약 5 nm 미만, 약 10 nm 미만, 약 20 nm 미만, 약 40 nm 미만, 약 60 nm 미만, 약 80 nm 미만 및 약 100 nm 미만의 직경을 갖는 나노입자이다. 상업적으로 이용 가능한 나노입자(모두 Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO)의 구체적인 비제한적 구현예는 5, 10 또는 15 nm의 직경을 갖는 금 나노입자; 10, 20, 40, 60 또는 100 nm의 입자 크기를 갖는 은 나노입자; 25 nm 미만의 입자 크기의 팔라듐 "나노분말"; 예를 들어, 0.7 내지 1.1, 1.3 내지 2.3, 0.7 내지 0.9 또는 O.7 내지 1.3 nm의 직경을 갖거나, 2 내지 10 nm × 1 내지 5 마이크로미터, 6 내지 9 nm × 5 마이크로미터, 7 내지 15 nm × 0.5 내지 10 마이크로미터, 7 내지 12 nm × 0.5 내지 10 마이크로미터, 110 내지 170 nm × 5 내지 9 마이크로미터, 6 내지 13 nm × 2.5 내지 20 마이크로미터의 나노튜브 번들 치수를 갖는 단일-, 이중- 및 다중-벽 탄소 나노튜브를 포함한다. 구현예는 금, 규소, 세륨 또는 탄소와 같은 물질, 예를 들어 금 또는 금-코팅된 나노입자, 탄화규소 위스커, 카보런덤, 다공성 실리카 나노입자, 젤라틴/실리카 나노입자, 나노세리아 또는 산화세륨 나노입자(CNP), 탄소 나노튜브(CNT), 예컨대 단일-, 이중- 또는 다중-벽 탄소 나노튜브 및 이들의 화학적으로 작용화된 버전(예를 들어, 아미드, 아미노, 카복실산, 설폰산 또는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티로 작용화된 탄소 나노튜브), 및 그래핀 또는 그래핀 옥사이드 또는 그래핀 복합체를 포함하는 폴리뉴클레오티드 조성물을 포함하며; 예를 들어, 문헌[Wong et al. (2016) Nano Lett., 16: 1161 - 1172]; 문헌[Giraldo et al. (2014) Nature Materials, 13:400-409]; 문헌[Shen et al. (2012) Theranostics, 2:283 - 294]; 문헌[Kim et al. (2011) Bioconjugate Chem., 22:2558 - 2567]; 문헌[Wang et al. (2010) J. Am. Chem. Soc. Comm., 132:9274 - 9276]; 문헌[Zhao et al. (2016) Nanoscale Res. Lett., 11: 195 - 203]; 문헌[Choi et al. (2016) J. Controlled Release, 235:222 - 235]을 참조한다. 또한, 예를 들어 미국 특허 출원 공개 2010/0311168호, 2012/0023619호, 2012/0244569호, 2013/0145488호, 2013/0185823호, 2014/0096284호, 2015/0040268호, 2015/0047074호 및 2015/0208663호에 개시된 다양한 타입의 입자 및 나노입자, 이들의 제조, 및 예를 들어 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 세포에 전달하는 데 이들을 사용하는 방법을 참조하며, 이들 모두는 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
iii. 부형제
일부 양태에서, 조성물은 부형제, 예를 들어 전달 비히클, 아쥬반트, 희석제, 계면활성제, 안정화제, 또는 장성제 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 부형제는 작물유 농축물, 식물유 농축물, 변형된 식물유, 질소원, 침적제(비산 방지) 및/또는 보유제(황산암모늄 및/또는 소포제 유무에 관계없이), 상용화제, 완충제 및/또는 산성화제, 물 컨디셔닝제, 기본 블렌드, 스프레더-스티커 및/또는 협력제, 아쥬반트 + 엽면 비료, 지포제, 발포체 마커(foam marker), 향료, 또는 탱크 세척제 및/또는 중화제이다. 일부 구현예에서, 부형제는 제초제 아쥬반트의 개론(Compendium of Herbicide Adjuvants)에 기재된 아쥬반트이다(Young et al. (2016). Compendium of Herbicide Adjuvants (13th ed.), Purdue University).
전달 비히클 및 희석제의 예는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아검, 인산칼슘, 알지네이트, 트라가칸트, 젤라틴, 규산칼슘, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 식염수 용액, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸- 및 프로필하이드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 광유를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 추가의 예시적인 전달 비히클은 고체 또는 액체 부형제 물질, 용매, 안정화제, 서방성 부형제, 착색제 및 표면 활성 물질(계면활성제)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에, 부형제(예를 들어, 전달 비히클)는 안정화 비히클이다. 구현예에서, 안정화 비히클은, 예를 들어 에폭시화 식물유, 지포제, 예를 들어 실리콘 오일, 보존제, 점도 조절제, 결합제 또는 점착부여제를 포함한다. 일부 경우에, 안정화 비히클은 재조합 폴리뉴클레오티드에 적합한 완충액이다. 일부 경우에, 조성물은 폴리머 비드 전달 비히클에 마이크로캡슐화된다. 일부 경우에, 안정화 비히클은 UV 및/또는 산성 조건으로부터 재조합 폴리뉴클레오티드를 보호한다. 일부 경우에, 전달 비히클은 pH 완충액을 함유한다. 일부 경우에, 조성물은, 예를 들어 약 5.0 내지 약 8.0, 약 6.5 내지 약 7.5, 또는 약 6.5 내지 약 7.0 중 임의의 하나의 pH 범위를 포함하는 약 4.5 내지 약 9.0 범위의 pH를 갖도록 제형화된다.
iv. 아쥬반트
일부 경우에, 본원에 제공된 조성물은 아쥬반트를 포함한다. 아쥬반트는 폴리뉴클레오티드 활성을 보유하지 않지만 제형에 유익한 특성을 부여하는 제제이다. 예를 들어, 아쥬반트는 제형에 사전 혼합되거나 분무 탱크에 첨가되어 혼합 또는 시용을 개선하거나 성능을 강화한다. 이는 엽면 시용을 위해 설계된 생성물에 광범위하게 사용된다. 아쥬반트는 특정 요구에 맞게 제형을 커스터마이징하고 현지 조건을 보완하는 데 사용될 수 있다. 아쥬반트는 습윤, 확산, 점착, 증발 감소, 휘발 감소, 완충, 유화, 분산, 분무액 비산 감소 및 거품 발생 감소를 포함하는 특정 기능을 수행하도록 설계될 수 있다. 단일 아쥬반트는 이러한 기능 모두를 수행할 수 없지만, 호환 가능한 아쥬반트는 대개 다수의 기능을 동시에 수행하기 위해 조합될 수 있다.
제형에 포함된 아쥬반트의 비제한적 예 중에는 결합제, 분산제 및 안정화제, 구체적으로 예를 들어 카제인, 젤라틴, 다당류(예를 들어, 전분, 아라비아검, 셀룰로스 유도체, 알긴산 등), 리그닌 유도체, 벤토나이트, 당, 합성 수용성 폴리머(예를 들어, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴산 등), PAP(산성 이소프로필 포스페이트), BHT(2,6-디-t-부틸-4-메틸페놀), BHA(2-t-부틸-4-메톡시페놀과 3-t-부틸-4-메톡시페놀의 혼합물), 식물유, 광유, 지방산 및 지방산 에스테르가 있다.
v. 액체 및 기체 제형
구현예에서, 본원에 제공된 조성물은 액체 제형으로 존재한다. 액체 제형은 일반적으로 물과 혼합되지만, 일부 경우에는 부형제로서 작물유, 디젤 연료, 등유 또는 다른 경유와 함께 사용된다. 활성 성분(예를 들어, 재조합 폴리뉴클레오티드)의 양은 대개 약 0.5 내지 약 80 중량 퍼센트 범위이다.
구현예에서, 유화 가능한 농축물 제형은 액체 활성 성분, 하나 이상의 석유계 용매, 및 제형이 물과 혼합되어 에멀션을 형성하는 것을 가능하게 하는 제제를 함유한다. 이러한 농축물은 농업, 관상용 및 잔디, 임업, 구조적, 식품 가공, 가축 및 공중 보건 해충 제형에 사용될 수 있다. 구현예에서, 이들은 소형 휴대용 분무기로부터 유압식 분무기, 저용량 지상 분무기, 미스트기 및 저용량 항공기 분무기에 이르는 시용 장비에 적용 가능하다. 일부 활성 성분은 액체 부형제에 쉽게 용해된다. 부형제와 혼합되는 경우, 침강되거나 분리되지 않는 용액, 예를 들어 균질한 용액이 형성된다. 구현예에서, 이러한 타입의 제형은 활성 성분, 담체 및/또는 부형제, 및 하나 이상의 다른 성분을 포함한다. 용액은 실내 및 실외에서, 임의의 타입의 분무기에 사용될 수 있다.
일부 경우에, 조성물은 역 에멀션으로 제형화된다. 역 에멀션은 오일 부형제에 분산된 수용성 활성 성분이다. 역 에멀션은 활성 성분이 대량의 석유계 부형제, 일반적으로 연료유와 혼합되는 것을 가능하게 하는 유화제를 필요로 한다. 역 에멀션은 비산을 감소시키는 데 도움이 된다. 다른 제형에서는 물 액적이 표적 표면에 도달하기 전에 증발하기 시작할 때 약간의 분무액 비산이 발생하며; 결과적으로 액적은 매우 작고 가벼워진다. 오일은 물보다 더 천천히 증발하기 때문에 역 에멀션 액적은 덜 수축되고 더 많은 활성 성분이 표적에 도달한다. 오일은 유거를 감소시키고 비에 대한 저항성을 개선하는 데 도움이 된다. 이는 추가로, 표면 커버리지 및 흡수를 개선함으로써 스티커-스프레더로서의 역할을 한다. 액적은 상대적으로 크고 무겁기 때문에, 잎의 밑면을 완전히 덮기는 어렵다. 역 에멀션은 가장 일반적으로는, 취약한 비표적 영역으로의 비산이 문제가 될 수 있는 공공 통행로를 따라 사용된다.
액상수화제 또는 액체 제형은 유화 가능한 농축물 및 습윤성 분말의 많은 특징을 조합한다. 제조업체는 활성 성분이 물 또는 오일에 용해되지 않는 고체인 경우 이러한 제형을 사용한다. 점토와 같은 물질에 함침된 활성 성분은 매우 미세한 분말로 분쇄된다. 이어서 분말은 소량의 액체에 현탁된다. 생성된 액체 생성물은 꽤 걸쭉하다. 액상수화제 및 액체는 유화 가능한 농축물의 많은 특징을 공유하며, 비슷한 단점을 갖는다. 이들은 습윤성 분말과 유사하게, 이들을 현탁액에 유지하고 가시적인 잔류물을 남기기 위해 적당한 교반을 필요로 한다.
액상수화제/액체는 취급 및 시용하기 쉽다. 이들은 액체이기 때문에 엎질러지거나 튀길 수 있다. 이들은 고체 입자룰 함유하고 있으므로, 노즐 및 펌프의 연마 마모의 원인이 된다. 액상수화제 및 액체 현탁액은 이들의 컨테이너에 침강된다. 액상수화제 및 액체 제형은 침강되는 경향이 있으므로 5 갤런 이하의 컨테이너에 포장하면 재혼합이 더 쉬워진다.
에어로졸 제형은 하나 이상의 활성 성분 및 용매를 함유한다. 대부분의 에어로졸은 낮은 백분율의 활성 성분을 함유한다. 에어로졸 제형에는 두 가지 타입, 즉 가압 밀봉 컨테이너에 일반적으로 이용 가능한 즉시 사용 가능한 타입, 및 연기 또는 안개로 제형을 방출하는 전기 또는 가솔린 구동 에어로졸 발생기에 사용되는 생성물이 있다.
즉시 사용 가능한 에어로졸 제형은 일반적으로 노즐 밸브가 트리거링될 때 제형을 방출하는 소형 자립형 유닛이다. 제형은 압력 하에서 불활성 가스에 의해 미세한 개구를 통해 유도되어 미세 액적을 생성한다. 이들 생성물은 온실, 건물 내부의 작은 영역 또는 국소적인 실외 영역에서 사용된다. 5 파운드의 활성 성분을 함유하는 상업적 모델은 일반적으로 리필이 가능하다.
연기 또는 안개 에어로졸 제형은 압력을 받지 않는다. 이들은 빠르게 도는 디스크 또는 가열된 표면을 사용하여 액체 제형을 미세한 미스트 또는 안개(에어로졸)로 분해하는 기계에 사용된다.
일부 구현예에서, 조성물은 액체 부형제를 포함한다. 구현예에서, 액체 부형제는, 예를 들어 방향족 또는 지방족 탄화수소(예를 들어, 자일렌, 톨루엔, 알킬나프탈렌, 페닐자일릴에탄, 등유, 가스유, 헥산, 사이클로헥산 등), 할로겐화 탄화수소(예를 들어, 클로로벤젠, 디클로로메탄, 디클로로에탄, 트리클로로에탄 등), 알코올(예를 들어, 메탄올, 에탄올, 이소프로필 알코올, 부탄올, 헥산올, 벤질 알코올, 에틸렌 글리콜 등), 에테르(예를 들어, 디에틸 에테르, 에틸렌 글리콜 디메틸 에테르, 디에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르, 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르, 프로필렌 글리콜 모노메틸 에테르, 테트라하이드로푸란, 디옥산 등), 에스테르(예를 들어, 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트 등), 케톤(예를 들어, 아세톤, 메틸 에틸 케톤, 메틸 이소부틸 케톤, 사이클로헥사논 등), 니트릴(예를 들어, 아세토니트릴, 이소부티로니트릴 등), 설폭사이드(예를 들어, 디메틸 설폭사이드 등), 아미드(예를 들어, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, 사이클릭 이미드(예를 들어, N-메틸피롤리돈), 알킬리덴 카보네이트(예를 들어, 프로필렌 카보네이트 등), 식물유(예를 들어, 대두유, 면실유 등), 식물성 에센셜 오일(예를 들어, 오렌지 오일, 히솝 오일, 레몬 오일 등) 또는 물을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 기체 부형제를 포함한다. 기체 부형제는, 예를 들어 부탄 가스, 플론 가스, 액화 석유 가스(LPG), 디메틸 에테르 및 이산화탄소 가스를 포함한다.
vi. 건조 또는 고체 제형
건조 제형은 2개의 타입으로 나눌 수 있다: 즉시 사용 가능, 및 분무로서 시용되도록 물과 혼합되어야 하는 농축물. 대부분의 분진 제형은 즉시 사용 가능하며 낮은 백분율의 활성 성분(약 10 중량 퍼센트 미만) + 활석, 초크, 점토, 견과류 겉껍질 또는 화산재로 제조된 매우 미세한 건조 불활성 부형제를 함유한다. 개별 분진 입자의 크기는 다양하다. 일부 분진 제형은 농축물이며 높은 백분율의 활성 성분을 함유한다. 이들은 시용하기 전에 건조 불활성 부형제와 혼합한다. 분진은 항상 건조한 상태로 사용되며 비표적 부위로 쉽게 비산할 수 있다.
vii. 과립 또는 펠릿 제형
일부 경우에, 조성물은 과립으로 제형화된다. 과립 제형은 과립 입자가 더 크고 더 무겁다는 점을 제외하면 분진 제형과 유사하다. 구현예에서, 거친 입자는 점토, 옥수수속대 또는 호두 껍데기와 같은 물질로 제조된다. 활성 성분은 과립 외부를 코팅하거나 그 안으로 흡수된다. 구현예에서, 활성 성분의 양은 비교적 낮으며, 일반적으로 약 0.5 내지 약 15 중량 퍼센트 범위이다. 과립 제형은 토양, 토양에 사는 곤충 또는 선충에 시용하거나 뿌리를 통해 식물에 흡수시키는 데 가장 많이 사용된다. 과립 제형은 때때로 비행기 또는 헬리콥터에 의해 시용되어 비산을 최소화하거나 빽빽한 초목에 침투한다. 일단 시용되면 과립은 활성 성분을 천천히 방출할 수 있다. 일부 과립은 활성 성분을 방출하기 위해 토양 수분을 필요로 한다. 과립 제형은 또한 모기 유충 및 다른 수생 해충을 방제하는 데 사용된다. 과립은 농업, 구조적, 관상용, 잔디, 수생, 공공 통행로 및 공중 보건(흡혈 곤충) 해충 방제 작업에 사용된다.
일부 경우에, 조성물은 펠릿으로 제형화된다. 대부분의 펠릿 제형은 과립 제형과 매우 유사하며; 용어는 상호교환적으로 사용된다. 그러나 펠릿 제형에서는 모든 입자의 중량 및 형상이 동일하다. 입자의 균일성은 정밀 시용 장비와 함께 사용하는 것을 가능하게 한다.
viii. 분말
일부 경우에, 조성물은 분말로 제형화된다. 일부 경우에, 조성물은 습윤성 분말로 제형화된다. 습윤성 분말은 분진처럼 보이는 건조하고 미세하게 분쇄된 제형이다. 이들은 분무로서 시용하기 위해 일반적으로 물과 혼합되어야 한다. 그러나 일부 생성물은 분진 또는 습윤성 분말로 시용할 수 있으며, 이는 시용자의 선택에 달려 있다. 습윤성 분말은 중량 기준으로 약 1 내지 약 95 퍼센트; 일부 경우에는 약 50 퍼센트 초과의 활성 성분을 갖는다. 입자는 물에 용해되지 않는다. 이들을 현탁 상태로 유지하기 위해 지속적으로 교반하지 않는 한, 이들은 신속하게 침강된다. 이들은 대부분의 해충 문제, 및 교반이 가능한 대부분의 타입의 분무 장비에 사용할 수 있다. 습윤성 분말은 잔효성이 탁월하다. 이들의 물리적 특성으로 인해, 대부분의 제형은 콘크리트, 석고, 및 미처리 목재와 같은 처리된 다공성 물질의 표면 상에 남아 있다. 이러한 경우에, 물만 물질에 침투한다.
일부 경우에, 조성물은 가용성 분말로 제형화된다. 가용성 분말 제형은 습윤성 분말처럼 보인다. 그러나 물과 혼합되는 경우, 가용성 분말은 쉽게 용해되고 참용액을 형성한다. 이들이 완전히 혼합된 후에는 추가로 교반할 필요가 없다. 가용성 분말 내 활성 성분의 양은 중량 기준으로 약 15 내지 약 95 퍼센트; 일부 경우에는 약 50 퍼센트 초과의 범위이다. 가용성 분말은 습윤성 분말의 모든 장점을 갖고 있으며 혼합 중 흡입 위험을 제외하면 단점이 없다.
일부 경우에, 조성물은 수분산성 과립으로 제형화된다. 건조 액상수화제로도 공지된 수분산성 과립은 분진과 같은 것이 아니라 작고 쉽게 측정되는 과립으로 제형화된다는 점을 제외하면 습윤성 분말과 비슷하다. 수분산성 과립은 물과 혼합하여 시용해야 한다. 물에 들어가면 과립은 습윤성 분말과 유사한 미세한 입자로 분해된다. 제형을 물에 현탁 상태로 유지하기 위해서는 지속적인 교반이 필요하다. 활성 성분의 백분율은 높으며, 대개 90 중량 퍼센트 정도이다. 수분산성 과립은 더 쉽게 측정 및 혼합될 수 있다는 점을 제외하면 습윤성 분말과 동일한 장점 및 단점을 많이 공유한다. 먼지가 적기 때문에 이들은 취급 중에 시용자가 흡입할 위험이 적다.
일부 구현예에서, 조성물은 고체 부형제를 포함한다. 고체 부형제는 점토의 미분말 또는 과립(예를 들어, 카올린 점토, 규조토, 벤토나이트, 후바사미 점토(Fubasami clay), 산성 점토 등), 합성 수화 산화규소, 활석, 세라믹, 다른 무기 광물(예를 들어, 견운모, 석영, 황, 활성탄, 탄산칼슘, 수화 실리카 등), 승화될 수 있고 실온에서 고체 형태로 존재하는 물질(예를 들어, 2,4,6-트리이소프로필-1,3,5-트리옥산, 나프탈렌, p-디클로로벤젠, 캠퍼, 아다만탄 등); 울; 실크; 면; 대마; 펄프; 합성 수지(예를 들어, 폴리에틸렌 수지, 예컨대 저밀도 폴리에틸렌, 직선형 저밀도 폴리에틸렌 및 고밀도 폴리에틸렌; 에틸렌-비닐 에스테르 코폴리머, 예컨대 에틸렌-비닐 아세테이트 코폴리머; 에틸렌-메타크릴산 에스테르 코폴리머, 예컨대 에틸렌-메틸 메타크릴레이트 코폴리머 및 에틸렌-에틸 메타크릴레이트 코폴리머; 에틸렌-아크릴산 에스테르 코폴리머, 예컨대 에틸렌-메틸 아크릴레이트 코폴리머 및 에틸렌-에틸 아크릴레이트 코폴리머; 에틸렌-비닐카복실산 코폴리머, 예컨대 에틸렌-아크릴산 코폴리머; 에틸렌-테트라사이클로도데센 코폴리머; 폴리프로필렌 수지, 예컨대 프로필렌 호모폴리머 및 프로필렌-에틸렌 코폴리머; 폴리-4-메틸펜텐-1, 폴리부텐-1, 폴리부타디엔, 폴리스티렌; 아크릴로니트릴-스티렌 수지; 스티렌 엘라스토머, 예컨대 아크릴로니트릴-부타디엔-스티렌 수지, 스티렌-컨쥬게이션된 디엔 블록 코폴리머, 및 스티렌-컨쥬게이션된 디엔 블록 코폴리머 수소화물; 플루오로수지; 아크릴 수지, 예컨대 폴리(메틸 메타크릴레이트); 폴리아미드 수지, 예컨대 나일론 6 및 나일론 66; 폴리에스테르 수지, 예컨대 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리에틸렌 나프탈레이트, 폴리부틸렌 테레프탈레이트, 및 폴리사이클로헥실렌디메틸렌 테레프탈레이트; 폴리카보네이트, 폴리아세탈, 폴리아크릴설폰, 폴리아릴레이트, 하이드록시벤조산 폴리에스테르, 폴리에테르이미드, 폴리에스테르 카보네이트, 폴리페닐렌 에테르 수지, 폴리염화비닐, 폴리염화비닐리덴, 폴리우레탄, 및 다공성 수지, 예컨대 발포 폴리우레탄, 발포 폴리프로필렌, 또는 발포 에틸렌 등), 유리, 금속, 세라믹, 섬유, 천, 편직물, 시트, 종이, 얀, 발포체, 다공성 물질, 및 멀티필라멘트를 포함한다.
ix. 나노캡슐/마이크로캡슐화/리포솜
일부 경우에, 조성물은 마이크로캡슐화된 제형으로 제공된다. 마이크로캡슐화된 제형은 물과 혼합되고, 다른 분무 가능한 제형과 동일한 방식으로 분무된다. 분무 후, 플라스틱 코팅은 분해되고 활성 성분을 천천히 방출한다.
일부 경우에, 조성물은 리포솜으로 제공된다. 일부 경우에, 조성물은 소포로 제공된다.
x. 계면활성제
일부 경우에, 본원에 제공된 조성물은 계면활성제를 포함한다. 습윤제 및 스프레더로도 불리는 계면활성제는 분무 액적의 표면 장력을 물리적으로 변경한다. 제형이 그 기능을 적절하게 수행하기 위해서는, 분무 액적이 엽을 습윤시키고 잎 전체에 고르게 확산될 수 있어야 한다. 계면활성제는 제형 커버리지 영역을 확대함으로써 활성제에 대한 노출을 증가시킨다. 계면활성제는 왁스 같은 또는 털이 많은 잎에 제형을 시용할 때 특히 중요하다. 적절한 습윤 및 확산이 없으면, 분무 액적은 대개 유거되거나 잎 표면을 적절하게 덮지 못한다. 그러나 너무 많은 계면활성제는 과도한 유거를 야기하고 효능을 감소시킬 수 있다.
계면활성제는, 이온화되는 방식 또는 전기적으로 하전된 원자 또는 이온으로 불리는 분자로 분할되는 방식에 의해 분류된다. 음전하를 갖는 계면활성제는 음이온성이다. 양전하를 갖는 것은 양이온성이고, 전하를 갖지 않는 것은 비이온성이다. 비이온성 계면활성제의 존재 하에서의 제형 활성은 양이온성 또는 음이온성 계면활성제의 존재 하에서의 활성과는 꽤 상이할 수 있다. 잘못된 계면활성제를 선택하면, 생성물의 효능이 감소하고 표적 식물에 손상이 생길 수 있다. 음이온성 계면활성제는 접촉성 농약(전신적으로 흡수되는 것이 아니라 직접 접촉에 의해 해충을 방제하는 농약)과 함께 사용할 때 가장 효과적이다. 양이온성 계면활성제는 일반적으로 식물독성이 있으므로 절대로 독립형 계면활성제로 사용해서는 안 된다.
대개 전신 농약과 함께 사용되는 비이온성 계면활성제는 분무가 식물 큐티클에 침투하는 것을 돕는다. 비이온성 계면활성제는 대부분의 농약과 호환 가능하고, 계면활성제를 필요로 하는 대부분의 EPA 등록 농약은 비이온성 타입을 권장한다. 아쥬반트는 스티커, 협력제, 식물 침투제, 상용화제, 완충액 또는 pH 조절제, 비산 방지 첨가제, 소포 제제 및 증점제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 기재된 조성물에 포함된 계면활성제의 비제한적 예 중에는 알킬 설페이트 에스테르 염, 알킬 설포네이트, 알킬 아릴 설포네이트, 알킬 아릴 에테르 및 이의 폴리옥시에틸렌화 생성물, 폴리에틸렌 글리콜 에테르, 다가 알코올 에스테르 및 당 알코올 유도체가 있다. 일부 구현예에서, 계면활성제는 비이온성 계면활성제, 계면활성제 + 질소원, 오가노-실리콘 계면활성제, 또는 고농도 계면활성제 오일 농축물이다.
xi. 조합
제형 및 용도, 이들 제형으로부터 제조된 형태에 있어서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 구현예에서 농약 제제(예를 들어, 살충제, 멸균제, 살비제, 살선충제, 연체동물 살충제, 살진균제, 유인제, 페로몬, 성장 조절 물질 또는 제초제와 같은 다른 활성 화합물과의 혼합물로 존재할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "농약 제제"는 임의의 해충을 예방, 파괴, 퇴치, 또는 방제 또는 완화하기 위한 임의의 물질 또는 물질의 혼합물을 지칭한다. 농약은 식량을 두고 인간과 경쟁하거나, 재산을 파괴하거나, 질병을 확산시키거나, 성가신, 곤충, 연체동물, 병원체, 잡초, 선충, 및 미생물을 포함하는 해충에 대해 사용되는 화학 물질 또는 생물학적 제제일 수 있다. 용어 "농약 제제"는 항생제, 항바이러스 농약, 항진균제, 구충제, 영양소, 꽃가루, 수크로스, 및/또는 곤충 이동을 쇠약해지게 하거나 느리게 하는 제제와 같은 다른 생물활성 분자를 추가로 포함한다.
재조합 폴리뉴클레오티드가 식물에 시용되는 경우, 제초제, 비료, 성장 조절제, 완화제, 신호화학물질과 같은 다른 공지된 화합물, 또는 식물 특성을 개선하기 위한 다른 제제와의 혼합물도 가능하다.
구현예
본원에 기재된 조성물, 시스템 및 방법의 다양한 구현예는 하기 번호가 매겨진 구현예의 세트에 제시되어 있다.
1. 세포에서 기능적이고 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 분자로서, RNA 분자는 5'에서 3' 순서로, (a) 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제(RDRP)에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; (b) 카고 RNA 서열; 및 (c) 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하고; RNA 분자는 선택적으로, (d) 바이러스 이동 단백질(MP)을 인코딩하는 적어도 하나의 RNA; (e) 적어도 하나의 tRNA 유사 서열; 및 (f) 캡시드화 인식 서열(ERS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 요소를 추가로 포함하는, 재조합 DNA 분자.
2. 구현예 1에 있어서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함하고/하거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 표 11, 12 또는 13에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함하는, 재조합 DNA 분자.
3. 구현예 1 또는 2에 있어서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 1 내지 19, 372 내지 405, 465, 또는 483 내지 485 중 적어도 하나에 의해 인코딩된 RNA 서열, 또는 서열번호 580의 RNA 서열, 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 RNA를 포함하고/하거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 20 내지 38, 406 내지 454, 467, 또는 486 내지 488 중 적어도 하나에 의해 인코딩된 RNA 서열, 또는 서열번호 581의 RNA, 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 RNA 서열을 포함하고/하거나; (c) 엔도르나바이러스 RDRP는 서열번호 367, 355 내지 366, 368 내지 371, 456, 또는 534 내지 577 중 임의의 하나와 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 재조합 DNA 분자.
4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래되고/되거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래되고/되거나; (c) 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열은 표 1에 제시된 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는, 재조합 DNA 분자.
5. 구현예 4에 있어서, 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열은 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래되거나, 표 15에 제시된 동일한 엔도르나바이러스로부터의 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열 쌍을 포함하거나, 서로 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 엔도르나바이러스 게놈으로부터 얻어지거나, 2개의 엔도르나바이러스 게놈으로부터 얻어지고, 5' RNA 레플리카제 인식 서열, 3' RNA 레플리카제 인식 서열 및/또는 RDRP 코딩 서열의 각 쌍의 구성원은 서로 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는, 재조합 DNA 분자.
6. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 세포는 박테리아 세포, 식물 세포, 진균 세포 또는 동물 세포인, 재조합 DNA 분자.
7. 구현예 4 또는 5에 있어서, 5' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스의 5' UTR 서열을 포함하는, 재조합 DNA 분자.
8. 구현예 7에 있어서, 5' 레플리카제 인식 서열은 5' UTR 서열에 인접하여 그의 3'에 본래 위치하는 엔도르나바이러스의 게놈 서열을 추가로 포함하는, 재조합 DNA 분자.
9. 구현예 4 또는 5에 있어서, 3' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스의 3' UTR 서열을 포함하는, 재조합 DNA 분자.
10. 구현예 9에 있어서, 3' 레플리카제 인식 서열은 3' UTR 서열에 인접하여 그의 5'에 본래 위치하는 엔도르나바이러스의 게놈 서열을 추가로 포함하는, 재조합 DNA 분자.
11. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, RNA 분자는 바이러스 MP를 인코딩하는 적어도 하나의 RNA 서열을 추가로 포함하고, MP를 인코딩하는 적어도 하나의 RNA 서열은 (a) 카고 RNA 서열 앞, (b) 카고 RNA 서열 뒤, 또는 (c) 카고 RNA 서열 앞과 뒤 둘 모두에 위치하는, 재조합 DNA 분자.
12. 구현예 11에 있어서, MP를 인코딩하는 적어도 하나의 RNA 서열은 상이한 MP를 인코딩하는 적어도 2개의 RNA 서열 또는 MP의 다수의 카피를 인코딩하는 단일 RNA 서열을 포함하는, 재조합 DNA 분자.
13. 구현예 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 세포에서 기능적이고 적어도 하나의 바이러스 이동 단백질을 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터, 및 선택적으로 종결자 요소를 포함하는 별개의 발현 카세트를 추가로 포함하는, 재조합 DNA 분자.
14. 구현예 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, RNA 분자는 ERS를 추가로 포함하고, ERS는 3' 레플리카제 인식 서열에 가깝게 또는 인접하여 위치하며, 선택적으로 3' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스의 3' UTR 서열을 포함하는, 재조합 DNA 분자.
15. 구현예 14에 있어서, ERS는 바이러스 조립 기점 서열(OAS)을 포함하는, 재조합 DNA 분자.
16. 구현예 15에 있어서, 바이러스 OAS 서열은 담배 모자이크 바이러스 OAS(TMV-OAS)인, 재조합 DNA 분자.
17. 구현예 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, RNA 분자는 적어도 하나의 tRNA 유사 서열을 추가로 포함하고, 적어도 하나의 tRNA 유사 서열은 아라비돕시스 FT mRNA로부터의 tRNA 유사 서열을 포함하거나, 서열번호 114 내지 160, 및 161의 DNA 서열에 의해 인코딩된 RNA 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 tRNA 유사 서열을 포함하는, 재조합 DNA 분자.
18. 구현예 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, RNA 분자는 바이러스 MP를 인코딩하는 적어도 하나의 RNA, 아라비돕시스 FT mRNA로부터의 tRNA 유사 서열, 및 TMV-OAS를 포함하는 캡시드화 인식 서열을 추가로 포함하는, 재조합 DNA 분자.
19. 구현예 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 카고 RNA 서열은 길이가 최대 약 14 kb인, 재조합 DNA 분자.
20. 구현예 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 카고 RNA 서열은 (a) 적어도 하나의 코딩 서열, (b) 적어도 하나의 비코딩 서열, 또는 (c) 적어도 하나의 코딩 서열과 적어도 하나의 비코딩 서열 둘 모두를 포함하는, 재조합 DNA 분자.
21. 구현예 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 카고 RNA 서열은 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하고, RNA 분자는 적어도 하나의 코딩 서열에 바로 인접하여 그의 5'에 위치하는 내부 리보솜 유입 부위(IRES)를 추가로 포함하는, 재조합 DNA 분자.
22. 구현예 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 카고 RNA 서열은 다수의 코딩 서열을 포함하고, RNA 분자는 코딩 서열 각각에 바로 인접하여 그의 5'에 위치하는 IRES를 추가로 포함하는, 재조합 DNA 분자.
23. 구현예 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 카고 RNA 서열은 적어도 하나의 비코딩 서열을 포함하고, 적어도 하나의 비코딩 서열은 헤어핀 RNA(hpRNA); 다수의 줄기-루프를 형성하는 RNA; RNA 슈도노트; 적어도 부분적으로 이중 가닥 RNA를 형성하는 RNA 서열; 작은 간섭 RNA(siRNA) 또는 siRNA 전구체; 마이크로RNA(miRNA) 또는 miRNA 전구체; 자가 절단 리보자임; 리간드 반응성 자가 절단 리보자임(압타자임); RNA 앱타머; 및 긴 비코딩 RNA(lncRNA)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 DNA 분자.
24. 구현예 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 자가 절단 리보자임을 인코딩하는 DNA 서열을 추가로 포함하는, 재조합 DNA 분자.
25. 구현예 24에 있어서, 적어도 하나의 자가 절단 리보자임은 5' 레플리카제 인식 서열의 5' 또는 3' 레플리카제 인식 서열의 3'에 위치하는, 재조합 DNA 분자.
26. 구현예 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 리간드 반응성 자가 절단 리보자임(압타자임)을 인코딩하는 DNA 서열을 추가로 포함하는, 재조합 DNA 분자.
27. 구현예 26에 있어서, 적어도 하나의 리간드 반응성 자가 절단 리보자임은 5' 레플리카제 인식 서열의 5' 또는 3' 레플리카제 인식 서열의 3'에 위치하는, 재조합 DNA 분자.
28. 구현예 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 인트론 서열을 추가로 포함하는, 재조합 DNA 분자.
29. 구현예 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, (a) 전사될 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터, 및 선택적으로 종결자 요소를 포함하는 별개의 발현 카세트; (b) 발현 강화 요소; (c) 마커를 인코딩하는 DNA 서열; (d) DNA 앱타머; (e) RNA 앱타머를 인코딩하는 DNA 서열; (f) T-DNA 좌측 및 우측 경계 DNA 서열; (g) 스페이서 DNA 서열; (h) 전사 인자 결합 부위를 인코딩하는 DNA 서열; (i) 국소화 서열을 인코딩하는 DNA 서열; (j) 적어도 하나의 서열-특이적 재조합효소 인식 부위를 인코딩하는 DNA 서열; 및 (k) 전사물 안정화 또는 전사물 불안정화 서열을 인코딩하는 DNA 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 요소를 추가로 포함하는, 재조합 DNA 분자.
30. 구현예 1 내지 29 중 어느 하나의 재조합 DNA 분자를 발현시킴으로써 생산된 RNA 분자.
31. 구현예 1 내지 29 중 어느 하나의 재조합 DNA 분자를 포함하는 세포.
32. 구현예 31에 있어서, 원핵 세포 또는 진핵 세포인, 세포.
33. 구현예 1 내지 29 중 어느 하나의 재조합 DNA 분자를 포함하는 박테리아 매개 식물 형질전환을 위한 벡터.
34. 구현예 33에 있어서, 식물 형질전환을 매개하는 박테리아는 아그로박테리움이고, 벡터는 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 분자에 측접하는 T-DNA를 추가로 포함하는, 벡터.
35. 구현예 33 또는 34에 있어서, 식물 세포 내에 함유된, 벡터.
36. (a) 세포에서 기능적이고, 5'에서 3' 순서로, (i) 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; (ii) 카고 RNA 서열; 및 (iii) 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하고; 선택적으로, (iv) 바이러스 이동 단백질(MP)을 인코딩하는 적어도 하나의 RNA; (v) 적어도 하나의 tRNA 유사 서열; 및 (vi) 캡시드화 인식 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 요소를 추가로 포함하는 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 분자; 및 (b) 엔도르나바이러스로부터 유래된 5' 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 RDRP 단백질을 함유하는 세포를 포함하는 발현 시스템.
37. 구현예 36에 있어서, (i) 5' 레플리카제 인식 서열은 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함하고/하거나; (ii) 3' 레플리카제 인식 서열은 표 11, 12 또는 13에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함하는, 발현 시스템.
38. 구현예 36 또는 37에 있어서, (i) 5' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 1 내지 19, 372 내지 405, 465, 또는 483 내지 485 중 적어도 하나에 의해 인코딩된 RNA 서열, 또는 서열번호 580의 RNA 서열, 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 RNA를 포함하고/하거나; (ii) 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 20 내지 38, 406 내지 454, 467, 또는 486 내지 488 중 적어도 하나에 의해 인코딩된 RNA, 또는 서열번호 581의 RNA 서열, 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 RNA를 포함하고/하거나; (c) 엔도르나바이러스 RDRP는 서열번호 367, 355 내지 366, 368 내지 371, 456, 또는 534 내지 577 중 임의의 하나와 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 발현 시스템.
39. 구현예 36 내지 38 중 어느 하나에 있어서, (i) 5' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래되고/되거나; (ii) 3' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래되는, 발현 시스템.
40. 구현예 39에 있어서, 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열은 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래되거나, 표 15에 제시된 동일한 엔도르나바이러스로부터의 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열 쌍을 포함하거나, 서로 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 엔도르나바이러스 게놈으로부터 얻어지거나, 2개의 엔도르나바이러스 게놈으로부터 얻어지고, 5' RNA 레플리카제 인식 서열, 3' RNA 레플리카제 인식 서열 및/또는 RDRP 코딩 서열의 각 쌍의 구성원은 서로 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는, 발현 시스템.
41. 구현예 36 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 세포는 박테리아 세포, 식물 세포, 진균 세포 또는 동물 세포인, 발현 시스템.
42. 구현예 36 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 캡시드화 인식 서열에 의해 인식되고 RNA 분자를 캡시드화하는 바이러스 외피 단백질을 추가로 포함하는, 발현 시스템.
43. 구현예 42에 있어서, 바이러스 외피 단백질은 (a) 세포에서 재조합 DNA 분자에 의해 발현되거나, (b) 세포에서 제2 재조합 DNA 분자에 의해 공동 발현되거나; (c) 세포에 외인성으로 제공되거나; (d) 세포에서 바이러스에 의해 발현되는, 발현 시스템.
44. 구현예 36 내지 43 중 어느 하나에 있어서, RDRP 단백질은 세포에 대해 이종성인, 발현 시스템.
45. 구현예 36 내지 43 중 어느 하나에 있어서, RDRP 단백질은 세포에 외인성으로 제공되는, 발현 시스템.
46. 구현예 36 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 세포는 식물 세포인, 발현 시스템.
47. 구현예 46에 있어서, 5' 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 RDRP 단백질은 엔도르나바이러스에 의해 식물 세포에서 내인성으로 발현되는, 발현 시스템.
48. 구현예 46 또는 47에 있어서, 엔도르나바이러스는 식물 세포에서 자연적으로 발생하는, 발현 시스템.
49. 구현예 36 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 재조합 DNA 분자는 바이러스 MP를 인코딩하는 적어도 하나의 RNA, 아라비돕시스 FT mRNA로부터의 tRNA 유사 서열, 및 TMV-OAS를 포함하는 캡시드화 인식 서열을 추가로 포함하는, 발현 시스템.
50. 구현예 36 내지 49 중 어느 하나의 발현 시스템을 포함하는 농업용 제형.
51. 5'에서 3' 순서로, (a) 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; (b) 카고 RNA 서열; 및 (c) 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열(선택적으로 카고 RNA 서열은 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열에 대해 이종성임)을 포함하고; 선택적으로, (d) 바이러스 이동 단백질("MP")을 인코딩하는 적어도 하나의 RNA; (e) 적어도 하나의 tRNA 유사 서열; 및 (f) 조립 기점 서열("OAS")로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 요소를 추가로 포함하는 재조합 RNA 분자.
52. 구현예 51에 있어서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함하고/하거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 표 11, 12 또는 13에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함하는, 재조합 RNA 분자.
53. 구현예 51 또는 52에 있어서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 1 내지 19, 372 내지 405, 465, 또는 483 내지 485 중 적어도 하나에 의해 인코딩된 RNA 서열, 또는 서열번호 580의 RNA 서열, 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 RNA 서열을 포함하고/하거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 20 내지 38, 406 내지 454, 467, 486 내지 488 중 적어도 하나에 의해 인코딩된 RNA 서열, 또는 서열번호 581의 RNA 서열, 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 RNA 서열을 포함하고/하거나; (c) 엔도르나바이러스 RDRP는 서열번호 367, 355 내지 366, 368 내지 371, 456, 또는 534 내지 577 중 임의의 하나와 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 재조합 RNA 분자.
54. 구현예 51 내지 53 중 어느 하나에 있어서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래되고/되거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래되고/되거나; (c) 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열은 표 1에 제시된 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는, 재조합 RNA 분자.
55. 구현예 54에 있어서, 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열은 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래되거나, 표 15에 제시된 동일한 엔도르나바이러스로부터의 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열 쌍을 포함하거나, 서로 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 엔도르나바이러스 게놈으로부터 얻어지고; 선택적으로, 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제는 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래되거나, 엔도르나바이러스 게놈으로부터 선택적으로 얻어지고, 5' RNA 레플리카제 인식 서열, 3' RNA 레플리카제 인식 서열 및/또는 RDRP는 상응하는 5' RNA 레플리카제 인식 서열, 3' RNA 레플리카제 인식 서열 및/또는 RDRP와 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는, 재조합 RNA 분자.
56. 구현예 51 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 외피 단백질에 의해 캡시드화된, 재조합 RNA 분자.
57. 구현예 56에 있어서, 바이러스 외피 단백질은 엔도르나바이러스에 대해 이종성인, 재조합 RNA 분자.
58. 구현예 51 내지 57 중 어느 하나의 재조합 RNA 분자를 포함하는 농업용 제형.
59. 구현예 58에 있어서, 재조합 RNA 분자가 캡시드화 인식 서열을 추가로 포함하는, 농업용 제형.
60. 구현예 59에 있어서, 캡시드화 인식 서열을 포함하는 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA는 캡시드화 인식 서열에 의해 인식되는 바이러스 외피 단백질에 의해 캡시드화되는, 농업용 제형.
61. 구현예 51 내지 57 중 어느 하나의 재조합 RNA 분자를 포함하는 세포.
62. 구현예 61에 있어서, 박테리아 세포, 진균 세포, 식물 세포, 또는 동물 세포인, 세포.
63. 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 식물 세포에 제공하는 방법으로서, 5'에서 3' 순서로, 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; 카고 RNA 서열; 및 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는 재조합 RNA 분자를 식물 세포에 제공하는 단계를 포함하고, 식물 세포는 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 RDRP 단백질을 포함하고, 이에 의해 RDRP 단백질은 재조합 RNA 분자로부터 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA의 합성을 촉매하는, 방법.
64. 구현예 63에 있어서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함하고/하거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 표 11, 12 또는 13에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함하는, 방법.
65. 구현예 63 또는 64에 있어서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 1 내지 19, 372 내지 405, 465, 또는 483 내지 485의 DNA 서열에 의해 인코딩된 RNA 서열 중 적어도 하나, 또는 서열번호 580의 RNA 서열, 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 RNA 서열을 포함하거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 20 내지 38, 406 내지 454, 467, 또는 486 내지 488의 DNA 서열에 의해 인코딩된 RNA 서열 중 적어도 하나, 또는 서열번호 581의 RNA 서열, 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 RNA 서열을 포함하거나; (c) 엔도르나바이러스 RDRP는 서열번호 355 내지 371, 456, 또는 534 내지 577 중 임의의 하나와 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
66. 구현예 63 내지 65 중 어느 하나에 있어서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래되고/되거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래되고/되거나; (c) 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열은 표 1에 제시된 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는, 방법.
67. 구현예 66에 있어서, 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열은 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래되거나, 표 15에 제시된 동일한 엔도르나바이러스로부터의 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열 쌍을 포함하거나, 서로 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 엔도르나바이러스 게놈으로부터 얻어지고; 선택적으로, 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제는 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래되거나, 엔도르나바이러스 게놈으로부터 선택적으로 얻어지고, 5' RNA 레플리카제 인식 서열, 3' RNA 레플리카제 인식 서열 및/또는 RDRP는 상응하는 5' RNA 레플리카제 인식 서열, 3' RNA 레플리카제 인식 서열 및/또는 RDRP와 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는, 방법.
68. 구현예 67에 있어서, 식물 세포는 엔도르나바이러스를 포함하고, RDRP 단백질은 엔도르나바이러스에 의해 식물 세포에 제공되는, 방법.
69. 구현예 68에 있어서, 엔도르나바이러스는 식물 세포에 풍토성이고, 선택적으로 풍토성 엔도르나바이러스는 비병원성이고/이거나 편리공생하는, 방법.
70. 구현예 69에 있어서, 엔도르나바이러스는 식물 세포에 외인성으로 제공되고, 선택적으로 엔도르나바이러스는 상이한 종, 변종 또는 생식질에 풍토성이거나 고유한, 방법.
71. 구현예 68에 있어서, RDRP 단백질은 식물 세포에 외인성으로 제공되는, 방법.
72. 구현예 63 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 재조합 RNA 분자는 발효 시스템에서 생산된, 방법.
73. 구현예 63 내지 72 중 어느 하나에 있어서, 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA는 식물 세포에서 기능적이고 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 작제물을 식물 세포에서 전사함으로써 식물 세포에 제공되는, 방법.
74. 구현예 63 내지 73 중 어느 하나에 있어서, 재조합 RNA 분자는 캡시드화 인식 서열을 추가로 포함하고, 식물 세포는 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 캡시드화할 수 있는 바이러스 외피 단백질을 추가로 포함하는, 방법.
75. 구현예 74에 있어서, 바이러스 외피 단백질은 식물 세포에 외인성으로 제공되는, 방법.
76. 구현예 73 내지 75 중 어느 하나에 있어서, 재조합 DNA 작제물은 바이러스 외피 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 추가로 포함하는, 방법.
77. 구현예 76에 있어서, 재조합 DNA 작제물은 식물 세포에서 기능적이고 바이러스 식물 단백질을 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터를 추가로 포함하는, 방법.
78. 구현예 77에 있어서, 바이러스 외피 단백질은 식물 세포에서 발현되고 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 캡시드화하는, 방법.
79. 구현예 63 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 식물 세포는 엔도르나바이러스를 포함하고, 엔도르나바이러스는 식물 세포에 RDRP 단백질을 제공하는, 방법.
80. 식물 또는 식물 세포에서 표현형 변화를 얻는 방법으로서, 5'에서 3' 순서로, 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; 카고 RNA 서열; 및 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는 재조합 RNA 분자를 식물 또는 식물 세포에 제공하는 단계를 포함하고, 카고 RNA 서열은 식물 또는 식물 세포에서 표현형 변화를 일으키는 RNA를 포함하고; 식물 또는 식물 세포는 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 RDRP 단백질을 포함하고, 이에 의해 RDRP 단백질은 재조합 RNA 분자로부터 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA의 합성을 촉매하고 카고 RNA 서열은 표현형 변화를 일으키는, 방법.
81. 구현예 80에 있어서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함하고/하거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 표 11, 12 또는 13에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함하는, 방법.
82. 구현예 80 또는 81에 있어서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 1 내지 19, 372 내지 405, 465, 또는 483 내지 485에 의해 인코딩된 RNA 서열 중 적어도 하나, 또는 서열번호 580의 RNA 서열, 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 RNA 서열을 포함하고/하거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 20 내지 38, 406 내지 454, 467, 486 내지 488, 467, 또는 486 내지 488 중 적어도 하나에 의해 인코딩된 RNA 서열, 또는 서열번호 581의 RNA 서열, 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 RNA 서열을 포함하고/하거나; (c) 엔도르나바이러스 RDRP는 서열번호 367, 355 내지 366, 368 내지 371, 456, 또는 534 내지 577 중 임의의 하나와 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
83. 구현예 80 내지 82 중 어느 하나에 있어서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래되고/되거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래되고/되거나; (c) 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열은 표 1에 제시된 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는, 방법.
84. 구현예 83에 있어서, 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열은 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래되거나, 표 15에 제시된 동일한 엔도르나바이러스로부터의 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열 쌍을 포함하거나, 서로 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 엔도르나바이러스 게놈으로부터 얻어지고; 선택적으로, 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제는 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래되거나, 엔도르나바이러스 게놈으로부터 선택적으로 얻어지고, 5' RNA 레플리카제 인식 서열, 3' RNA 레플리카제 인식 서열 및/또는 RDRP는 상응하는 5' RNA 레플리카제 인식 서열, 3' RNA 레플리카제 인식 서열 및/또는 RDRP와 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는, 방법.
85. 구현예 80 내지 84 중 어느 하나에 있어서, 식물 또는 식물 세포에서 표현형 변화를 일으키는 RNA는 재조합 RNA 분자가 제공되지 않은 대조군 식물 또는 식물 세포에서의 표적 유전자의 발현에 비해 표적 유전자의 발현을 조절하기 위한 RNA를 포함하며, 표현형 변화는 조절의 결과인, 방법.
86. 구현예 85에 있어서, 조절은 (a) 표적 유전자의 발현의 증가; 또는 (b) 표적 유전자의 발현의 감소인, 방법.
87. 구현예 85에 있어서, 식물 또는 식물 세포에서 표현형 변화를 일으키는 RNA는 표적 유전자의 발현을 억제하는, 방법.
88. 구현예 80 내지 87 중 어느 하나에 있어서, 식물 또는 식물 세포에서 표현형 변화를 일으키는 RNA는 siRNA 또는 siRNA 전구체, miRNA 또는 miRNA 전구체, 및 단계적 siRNA 또는 단계적 siRNA 전구체로부터 선택되는 적어도 하나의 RNA를 포함하는, 방법.
89. 구현예 80 내지 87 중 어느 하나에 있어서, 식물 또는 식물 세포에서 표현형 변화를 일으키는 RNA는 메신저 RNA를 포함하는, 방법.
90. 구현예 89에 있어서, 메신저 RNA는 식물 또는 식물 세포의 게놈에 부재하는 RNA 서열을 포함하는, 방법.
91. 구현예 80 내지 87 중 어느 하나에 있어서, 식물 또는 식물 세포에서 표현형 변화를 일으키는 RNA는 식물 또는 식물 세포의 게놈을 변형하기 위한 RNA를 포함하는, 방법.
92. 구현예 83 내지 91 중 어느 하나에 있어서, 식물 세포는 엔도르나바이러스를 포함하고, RDRP 단백질은 엔도르나바이러스에 의해 식물 세포에 제공되는, 방법.
93. 구현예 92에 있어서, 엔도르나바이러스는 식물 세포에 풍토성이고, 선택적으로 풍토성 엔도르나바이러스는 비병원성이고/이거나 편리공생하는, 방법.
94. 구현예 92에 있어서, 엔도르나바이러스는 식물 세포에 외인성으로 제공되고, 선택적으로 엔도르나바이러스는 상이한 종, 변종 또는 생식질에 풍토성이거나 고유한, 방법.
95. 구현예 80 내지 91 중 어느 하나에 있어서, RDRP 단백질은 식물 세포에 외인성으로 제공되는, 방법.
96. 구현예 95에 있어서, 재조합 RNA 분자는 발효 시스템에서 생산된, 방법.
97. 구현예 80 내지 91, 95 및 96 중 어느 하나에 있어서, 재조합 RNA 분자는 식물 세포에서 기능적이고 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 작제물을 식물 세포에서 전사함으로써 식물 세포에 제공되는, 방법.
98. 구현예 80 내지 97 중 어느 하나에 있어서, 재조합 RNA 분자는 캡시드화 인식 서열을 추가로 포함하고, 식물 세포는 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 캡시드화할 수 있는 바이러스 외피 단백질을 추가로 포함하는, 방법.
99. 구현예 98에 있어서, 바이러스 외피 단백질은 식물 세포에 외인성으로 제공되는, 방법.
100. 구현예 80 내지 99 중 어느 하나에 있어서, 재조합 DNA 작제물은 바이러스 외피 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 추가로 포함하는, 방법.
101. 구현예 100에 있어서, 재조합 DNA 작제물은 식물 세포에서 기능적이고 바이러스 식물 단백질을 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터를 추가로 포함하는, 방법.
102. 구현예 98 내지 101 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 외피 단백질은 식물 세포에서 발현되고 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 캡시드화하는, 방법.
103. 구현예 80 내지 91 중 어느 하나에 있어서, 식물 세포는 엔도르나바이러스를 포함하고, 엔도르나바이러스는 식물 세포에 RDRP 단백질을 제공하는, 방법.
104. 구현예 80 내지 103 중 어느 하나에 있어서, 재조합 RNA 분자는 식물 세포를 재조합 RNA 분자를 포함하는 제형과 접촉시킴으로써 식물 세포에 제공되고, 재조합 RNA 분자는 발효 시스템에서 생산되었으며, 재조합 RNA 분자는 바이러스 외피 단백질에 의해 선택적으로 캡시드화되는, 방법.
105. 해충 또는 병원체에 대한 식물의 저항성 및/또는 내성을 증가시키는 방법으로서, 5'에서 3' 순서로, 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; 카고 RNA 서열; 및 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는 재조합 RNA 분자를 식물에 제공하는 단계를 포함하고, 카고 RNA 서열로 인해 해충 또는 병원체에 대한 식물의 저항성 및/또는 내성은 재조합 RNA 분자가 제공되지 않은 식물에 비해 증가하고, 식물 또는 식물 세포는 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 RDRP 단백질을 포함하고, 이에 의해 RDRP 단백질은 재조합 RNA 분자로부터 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA의 합성을 촉매하는, 방법.
106. 구현예 105에 있어서, 해충 또는 병원체는 박테리아, 진균, 난균류 및 무척추동물을 포함하는 군으로부터 선택되고, 선택적으로 진균은 보트리티스 sp.인, 방법.
107. 스트레스에 대한 식물의 저항성을 증가시키는 방법으로서, 5'에서 3' 순서로, 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; 카고 RNA 서열; 및 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는 재조합 RNA 분자를 식물에 제공하는 단계를 포함하고, 식물 또는 식물 세포는 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 RDRP 단백질을 포함하고, 이에 의해 RDRP 단백질은 재조합 RNA 분자로부터 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA의 합성을 촉매하고, 카고 RNA 서열로 인해 스트레스에 대한 식물의 저항성은 재조합 RNA 분자가 제공되지 않은 식물에 비해 증가하는, 방법.
108. 구현예 107에 있어서, 스트레스는 양분 스트레스, 광 스트레스, 수분 스트레스, 열 스트레스 및 저온 스트레스를 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 비생물적 스트레스를 포함하는, 방법.
109. 구현예 107 또는 108에 있어서, 스트레스는 군집, 쉐이딩 및 알렐로파시를 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 생물적 스트레스를 포함하는, 방법.
110. 식물 또는 식물 세포에서 외인성 폴리펩티드를 발현시키는 방법으로서, 식물 또는 식물 세포에서 기능적이고, 5'에서 3' 순서로, (a) 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; (b) 외인성 폴리펩티드를 인코딩하는 번역 가능한 메신저 RNA를 포함하는 카고 RNA 서열; 및 (c) 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 분자를 식물 또는 식물 세포에서 발현시키는 단계를 포함하고; RNA 분자는 선택적으로, (d) 바이러스 이동 단백질("MP")을 인코딩하는 적어도 하나의 RNA; (e) 적어도 하나의 tRNA 유사 서열; 및 (f) 캡시드화 인식 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 요소를 추가로 포함하고, 식물 또는 식물 세포는 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 RDRP 단백질을 포함하고,
이에 의해 RDRP 단백질은 재조합 RNA 분자로부터 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA의 합성을 촉매하고, 외인성 폴리펩티드는 외인성 폴리펩티드를 인코딩하는 번역 가능한 메신저 RNA로부터 번역되는, 방법.
111. 구현예 105 내지 110 중 어느 하나에 있어서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함하고/하거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 표 11, 12 또는 13에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함하는, 방법.
112. 구현예 105 내지 111 중 어느 하나에 있어서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 1 내지 19, 372 내지 405, 465, 또는 483 내지 485 중 적어도 하나에 의해 인코딩된 RNA 서열, 또는 서열번호 580의 RNA 서열, 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 RNA 서열을 포함하고/하거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 20 내지 38, 406 내지 454, 467, 또는 486 내지 488 중 적어도 하나에 의해 인코딩된 RNA 서열, 또는 서열번호 581의 RNA 서열, 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 RNA 서열을 포함하고/하거나; (c) 엔도르나바이러스 RDRP는 서열번호 367, 355 내지 366, 368 내지 371, 456, 또는 534 내지 577 중 임의의 하나와 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
113. 구현예 105 내지 112 중 어느 하나에 있어서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래되고/되거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래되고/되거나; (c) 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열은 표 1에 제시된 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는, 방법.
114. 구현예 113에 있어서, 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열은 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래되거나, 표 15에 제시된 동일한 엔도르나바이러스로부터의 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열 쌍을 포함하거나, 서로 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 엔도르나바이러스 게놈으로부터 얻어지고; 선택적으로, 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제는 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래되거나, 엔도르나바이러스 게놈으로부터 선택적으로 얻어지고, 5' RNA 레플리카제 인식 서열, 3' RNA 레플리카제 인식 서열 및/또는 RDRP는 상응하는 5' RNA 레플리카제 인식 서열, 3' RNA 레플리카제 인식 서열 및/또는 RDRP와 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는, 방법.
115. 합성 엔도르나바이러스 위성 입자를 제조하는 방법으로서, (a) 5'에서 3' 순서로, 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; 카고 RNA 서열; 및 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는 재조합 RNA 분자를 식물 세포에 제공하는 단계로서, 식물 세포는 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 RDRP 단백질을 포함하고, 이에 의해 RDRP 단백질은 재조합 RNA 분자로부터 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA의 합성을 촉매하는, 단계; 및 (b) 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 바이러스 외피 단백질로 캡시드화함으로써 합성 엔도르나바이러스 위성 입자를 제공하는 단계를 포함하는 방법.
116. 구현예 115에 있어서, 바이러스 외피 단백질은 식물 세포에 외인성으로 제공되는, 방법.
117. 구현예 115에 있어서, 식물 세포는 바이러스 외피 단백질을 추가로 포함하는, 방법.
118. 구현예 115에 있어서, 바이러스 외피 단백질은 식물 세포에서 재조합적으로 발현되는, 방법.
119. 구현예 115 내지 118 중 어느 하나에 있어서, 카고 RNA 서열은 길이가 최대 약 14 kb인, 방법.
120. 구현예 115 내지 119 중 어느 하나에 있어서, 카고 RNA 서열은 (a) 적어도 하나의 코딩 서열, (b) 적어도 하나의 비코딩 서열, 또는 (c) 적어도 하나의 코딩 서열과 적어도 하나의 비코딩 서열 둘 모두를 포함하는, 방법.
121. 구현예 115 내지 120 중 어느 하나에 있어서, 카고 RNA 서열은 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하고, RNA 분자는 적어도 하나의 코딩 서열에 바로 인접하여 그의 5'에 위치하는 IRES를 추가로 포함하는, 방법.
122. 구현예 115 내지 121 중 어느 하나에 있어서, 카고 RNA 서열은 다수의 코딩 서열을 포함하고, RNA 분자는 코딩 서열 각각에 바로 인접하여 그의 5'에 위치하는 IRES를 추가로 포함하는, 방법.
123. 구현예 115 내지 122 중 어느 하나에 있어서, 카고 RNA 서열은 적어도 하나의 비코딩 서열을 포함하고, 적어도 하나의 비코딩 서열은 헤어핀 RNA(hpRNA); 다수의 줄기-루프를 형성하는 RNA; RNA 슈도노트; 적어도 부분적으로 이중 가닥 RNA를 형성하는 RNA 서열; 작은 간섭 RNA(siRNA) 또는 siRNA 전구체; 마이크로RNA(miRNA) 또는 miRNA 전구체; 자가 절단 리보자임; 리간드 반응성 자가 절단 리보자임(압타자임); RNA 앱타머; 및 긴 비코딩 RNA(lncRNA)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
124. 구현예 115 내지 123 중 어느 하나에 있어서, 재조합 RNA 분자는 식물 세포에서 기능적이고 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 작제물을 식물 세포에서 전사함으로써 식물 세포에 제공되는, 방법.
125. 구현예 124에 있어서, 재조합 DNA 작제물은 바이러스 외피 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 추가로 포함하는, 방법.
126. 구현예 124 또는 125에 있어서, 재조합 DNA 작제물은 식물 세포에서 기능적이고 바이러스 식물 단백질을 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터를 추가로 포함하는, 방법.
127. 구현예 115 내지 126 중 어느 하나에 있어서, 식물 세포는 엔도르나바이러스를 포함하고, 엔도르나바이러스는 식물 세포에 RDRP 단백질을 제공하는, 방법.
128. 구현예 127에 있어서, 엔도르나바이러스는 식물 세포에 풍토성이고, 선택적으로 풍토성 엔도르나바이러스는 비병원성이고/이거나 편리공생하는, 방법.
129. 구현예 127에 있어서, 엔도르나바이러스는 식물 세포에 외인성으로 제공되고, 선택적으로 엔도르나바이러스는 상이한 종, 변종 또는 생식질에 풍토성이거나 고유한, 방법.
130. 구현예 127에 있어서, RDRP 단백질은 식물 세포에 외인성으로 제공되는, 방법.
131. 구현예 115 내지 130 중 어느 하나에 있어서, 합성 엔도르나바이러스 위성 입자를 단리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
132. 구현예 115 내지 131 중 어느 하나에 있어서, 합성 엔도르나바이러스 위성 입자를 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
133. 구현예 131 또는 132에 있어서, 합성 엔도르나바이러스 위성 입자를 제형화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
134. 구현예 115 내지 133 중 어느 하나의 방법에 의해 제공되는 합성 엔도르나바이러스 위성 입자.
135. 구현예 115 내지 133 중 어느 하나의 방법에 의해 제공되는 합성 엔도르나바이러스 위성 입자를 포함하는 농업용 제형.
136. 합성 엔도르나바이러스 위성 입자를 식물에 제공하는 방법으로서, 식물을 구현예 134의 합성 엔도르나바이러스 위성 입자와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
137. 구현예 136에 있어서, 접촉시키는 단계는 분무, 살포, 주입 또는 침지를 포함하는, 방법.
138. 구현예 115 내지 137 중 어느 하나에 있어서, 카고 RNA 서열은 폴리펩티드를 인코딩하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하고, 번역되어 식물에서 폴리펩티드를 생산하는, 방법.
139. (a) 5'에서 3' 순서로, (i) 엔도르나바이러스로부터 유래된 5' 레플리카제 인식 서열; (ii) 카고 RNA 서열; 및 (iii) 엔도르나바이러스로부터 유래된 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하고; 선택적으로, (iv) 바이러스 이동 단백질("MP")을 인코딩하는 적어도 하나의 RNA; (v) 적어도 하나의 tRNA 유사 서열; 및 (vi) 조립 기점 서열("OAS")로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 요소를 추가로 포함하는 RNA 분자: 및 (b) 엔도르나바이러스로부터 5' 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 RDRP 단백질을 포함하는 무세포 발현 시스템.
140. 구현예 139에 있어서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함하고/하거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 표 11, 12 또는 13에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함하는, 발현 시스템.
141. 구현예 139 또는 140에 있어서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 1 내지 19, 372 내지 405, 465, 또는 483 내지 485 중 적어도 하나에 의해 인코딩된 RNA 서열, 서열번호 580의 RNA 서열, 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 RNA 분자를 포함하고/하거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 20 내지 38, 406 내지 454, 467, 또는 486 내지 488 중 적어도 하나에 의해 인코딩된 RNA 서열, 서열번호 581의 RNA 서열, 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 RNA 서열을 포함하고/하거나; (c) 엔도르나바이러스 RDRP는 서열번호 367, 355 내지 366, 368 내지 371, 456, 또는 534 내지 577 중 임의의 하나와 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 발현 시스템.
142. 구현예 139 내지 141 중 어느 하나에 있어서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래되고/되거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래되고/되거나; (c) 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열은 표 1에 제시된 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는, 발현 시스템.
143. 구현예 142에 있어서, 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열은 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래되거나, 표 15에 제시된 동일한 엔도르나바이러스로부터의 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열 쌍을 포함하거나, 서로 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 엔도르나바이러스 게놈으로부터 얻어지고; 선택적으로, 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제는 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래되거나, 엔도르나바이러스 게놈으로부터 선택적으로 얻어지고, 5' RNA 레플리카제 인식 서열, 3' RNA 레플리카제 인식 서열 및/또는 RDRP는 상응하는 5' RNA 레플리카제 인식 서열, 3' RNA 레플리카제 인식 서열 및/또는 RDRP와 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는, 발현 시스템.
144. 구현예 139 내지 143 중 어느 하나에 있어서, RDRP 단백질은 엔도르나바이러스에 의해 제공되는, 발현 시스템.
145. 구현예 139 내지 144 중 어느 하나의 발현 시스템을 포함하는 농업용 제형.
146. 구현예 30, 또는 51 내지 57 중 어느 하나의 재조합 RNA 분자 및 엔도르나바이러스 RDRP를 포함하는 식물로서, 선택적으로 식물은 접목 식물이고, 접목 식물의 대목 및/또는 접가지는 재조합 RNA 및 엔도르나바이러스 RDRP를 포함하는 적어도 하나의 세포를 포함하는, 식물.
147. 구현예 146에 있어서, 외떡잎 식물 또는 쌍자엽 식물인, 식물.
148. 구현예 146 또는 147에 있어서, 국화과, 박과, 콩과, 녹나무과, 벼과 또는 가지과에 속하는, 식물.
149. 구현예 146 내지 148 중 어느 하나에 있어서, 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA를 결여하고 있는, 식물.
150. 구현예 146 내지 149 중 어느 하나에 있어서, 식물은 엔도르나바이러스를 포함하고, 엔도르나바이러스 RDRP는 엔도르나바이러스에 의해 식물 세포에 제공되는, 식물.
151. 구현예 146 내지 150 중 어느 하나에 있어서, 엔도르나바이러스는 식물에 풍토성이고, 선택적으로 풍토성 엔도르나바이러스는 비병원성이고/이거나 편리공생하는, 식물.
152. 구현예 146 내지 151 중 어느 하나에 있어서, 엔도르나바이러스 RDRP, 5' 레플리카제 인식 서열, 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열은 벨 페퍼 엔도르나바이러스(BPEV), 파세올루스 불가리스 알파엔도르나바이러스 1(PvEV-1), 파세올루스 불가리스 엔도르나바이러스 2(PvEV-2) 및 헬리안투스 아누스 알파엔도르나바이러스 분리주 BJ로 이루어진 군으로부터 선택되는 엔도르나바이러스로부터 유래되는, 식물.
153. 구현예 51 내지 57 중 어느 하나의 재조합 RNA 분자 및 엔도르나바이러스 RDRP를 포함하는 식물 번식체.
154. 구현예 153에 있어서, 세포, 또는 세포를 포함하는 종자, 묘목, 배주, 배아, 꽃가루, 뿌리, 줄기, 잎, 묘조, 덩이줄기, 뿌리줄기, 기는 줄기, 구근, 외식편 또는 캘러스를 포함하는, 식물 번식체.
155. 구현예 153 또는 154에 있어서, 재조합 RNA 분자를 포함하는 식물 세포와 재조합 RNA 분자를 결여한 식물 세포 둘 모두를 포함하는 모자이크인, 식물 번식체.
156. 구현예 153 내지 155 중 어느 하나에 있어서, 엔도르나바이러스 RDRP를 포함하는 식물 세포와 엔도르나바이러스 RDRP를 결여한 식물 세포 둘 모두를 포함하는 모자이크인, 식물 번식체.
157. 구현예 153 내지 156 중 어느 하나에 있어서, 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA를 결여하고 있는, 식물 번식체.
158. 재조합 RNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 식물 세포를 포함하는 변형된 식물 번식체를 생산하는 방법으로서, 재조합 RNA 분자를 포함하는 식물 세포와 재조합 RNA 분자를 결여한 식물 세포 둘 모두를 포함하는 식물 세포의 혼합 집단으로부터 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제(RDRP) 및 재조합 RNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 식물 세포를 포함하는 식물 번식체를 단리하는 단계를 포함하고, 재조합 RNA 분자는 5'에서 3' 순서로, 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; 카고 RNA 서열; 및 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는, 방법.
159. 구현예 158에 있어서, 식물 세포의 혼합 집단은 원형질체의 집단 또는 캘러스 또는 외식편에서의 세포의 집단을 포함하는, 방법.
160. 구현예 158 또는 159에 있어서, 식물 세포의 혼합 집단은 엔도르나바이러스 RDRP를 포함하는 식물 세포 및 엔도르나바이러스 RDRP를 결여한 식물 세포를 포함하는, 방법.
161. 구현예 158 내지 160 중 어느 하나에 있어서, 식물 세포의 혼합 집단은 엔도르나바이러스 RDRP를 포함하는 식물 세포를 포함하는, 방법.
162. 구현예 158 내지 161 중 어느 하나에 있어서, 식물 세포의 혼합 집단은 식물 번식체를 단리하기 전에 재조합 RNA 분자를 포함하는 식물 세포의 존재에 대해 스크리닝되거나 선택되는, 방법.
163. 구현예 158 내지 162 중 어느 하나에 있어서, 단리는 식물 번식체를 단리하기 전에 재조합 RNA 분자를 포함하는 식물 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
164. 구현예 158 내지 163 중 어느 하나에 있어서, 혼합 집단은 식물 또는 식물 부분 내에 위치하는, 방법.
165. 구현예 164에 있어서, 식물 또는 식물 부분은 식물 번식체를 단리하기 전에 재조합 RNA 분자의 존재에 대해 스크리닝되거나 선택되는, 방법.
166. 구현예 164 또는 165에 있어서, 식물 또는 식물 부분은 식물 번식체를 단리하기 전에 재조합 RNA 분자의 전신 존재에 대해 스크리닝되거나 선택되는, 방법.
167. 구현예 158 내지 166 중 어느 하나에 있어서, 카고 RNA 서열은 선택 가능한 또는 스코어링 가능한 마커를 인코딩하는 RNA를 포함하는, 방법.
168. 구현예 167에 있어서, 선택 가능한 또는 스코어링 가능한 마커는 RNA 앱타머 또는 조절 RNA인, 방법.
169. 구현예 168에 있어서, 조절 RNA는 siRNA 또는 siRNA 전구체, miRNA 또는 miRNA 전구체, 트랜스-작용 siRNA 또는 트랜스-작용 siRNA 전구체, siRNA 또는 miRNA 디코이, siRNA 또는 miRNA 절단 차단제, siRNA 또는 miRNA 인식 및 절단 서열, 리보스위치 및 리보자임으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
170. 구현예 167에 있어서, 선택 가능한 마커 또는 스코어링 가능한 마커는 폴리펩티드를 인코딩하는 RNA 서열인, 방법.
171. 구현예 170에 있어서, 폴리펩티드는 식물 세포에서 항생제 또는 제초제에 대한 저항성을 부여하는, 방법.
172. 구현예 158 내지 171 중 어느 하나에 있어서, 카고 RNA 서열은 선택 가능한 마커를 인코딩하는 RNA를 포함하고, 재조합 RNA 분자를 포함하는 식물 번식체는 선택 가능한 마커의 존재를 선택함으로써 단리되는, 방법.
173. 구현예 172에 있어서, 재조합 RNA 분자를 포함하는 식물 번식체를 선택하는 단계를 추가로 포함하고, 선택 가능한 마커는 제거된, 방법.
174. 구현예 158 내지 173 중 어느 하나에 있어서, 재조합 RNA 분자를 포함하는 식물 번식체는 재조합 RNA 분자를 포함하는 하나 이상의 식물 세포에서 RNA 분자를 검출하고, 재조합 DNA 분자를 결여한 식물 세포로부터 재조합 RNA 분자를 포함하는 하나 이상의 식물 세포를 분리함으로써 단리되는, 방법.
175. 구현예 158 내지 174 중 어느 하나에 있어서, 식물 번식체는 재조합 RNA 분자를 포함하는 식물 세포와 재조합 RNA 분자를 결여한 식물 세포 둘 모두를 포함하는 모자이크인, 방법.
176. 구현예 158 내지 175 중 어느 하나에 있어서, 식물 번식체는 엔도르나바이러스 RDRP를 포함하는 식물 세포와 엔도르나바이러스 RDRP를 결여한 식물 세포 둘 모두를 포함하는 모자이크인, 방법.
177. 구현예 158 내지 176 중 어느 하나에 있어서, 식물 번식체는 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA를 결여하고 있는, 방법.
178. 구현예 164 내지 177 중 어느 하나에 있어서, 식물 또는 식물 부분은 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA를 결여하고 있는, 방법.
179. 구현예 158 내지 178 중 어느 하나에 있어서, 식물 번식체는 세포, 또는 세포를 포함하는 종자, 묘목, 배주, 배아, 꽃가루, 뿌리, 줄기, 잎, 묘조, 덩이줄기, 뿌리줄기, 기는 줄기, 구근, 외식편 또는 캘러스를 포함하는, 방법.
180. 구현예 179에 있어서, 세포, 종자, 묘목, 배주, 배아, 꽃가루, 뿌리, 줄기, 잎, 묘조, 덩이줄기, 뿌리줄기, 기는 줄기, 구근, 외식편 또는 캘러스를 증식시켜 자손을 얻는 단계를 추가로 포함하고, 자손은 재조합 RNA 분자를 포함하는, 방법.
181. 구현예 180에 있어서, 세포를 증식시키는 단계는 세포, 종자, 묘목, 배주, 배아, 꽃가루, 뿌리, 줄기, 잎, 묘조, 덩이줄기, 뿌리줄기, 기는 줄기, 구근, 외식편 또는 캘러스로부터 얻어진 복수의 외식편을 배양하는 단계로 이루어지는, 방법.
182. 구현예 158 내지 181 중 어느 하나에 있어서, 단리된 번식체는 세포를 포함하고 방법은 세포로부터의 재조합 RNA를 포함하는 식물, 묘목, 배주, 배아, 꽃가루, 뿌리, 줄기, 잎, 묘조, 덩이줄기, 뿌리줄기, 기는 줄기, 구근, 외식편 또는 캘러스를 재생시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
183. 구현예 158 내지 182 중 어느 하나에 있어서, 단리된 번식체는 캘러스를 포함하고 방법은 상기 캘러스로부터의 재조합 RNA를 포함하는 식물, 묘목, 배주, 배아, 꽃가루, 뿌리, 줄기, 잎, 묘조, 덩이줄기, 뿌리줄기, 기는 줄기, 구근 또는 외식편을 재생시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
184. 구현예 158 내지 183 중 어느 하나에 있어서, 식물은 재생되고, 방법은 식물로부터의 재조합 RNA를 포함하는 F1 종자 또는 F1 자손 또는 클론 자손을 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
185. 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 식물에 제공하는 방법으로서, 5'에서 3' 순서로, 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제(RDRP)에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; 카고 RNA 서열; 및 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는 재조합 RNA 분자를 포함하는 대목 상에 접가지를 접목시키는 단계를 포함하고, 대목 및/또는 접가지의 적어도 하나의 세포는 엔도르나바이러스 RDRP를 포함하는, 방법.
186. 구현예 185에 있어서, 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA는 대목에 부재하는, 방법.
187. 구현예 185 또는 186에 있어서, 접가지는 접목 이전에 재조합 RNA 분자를 결여하고 있는, 방법.
188. 구현예 185 내지 187 중 어느 하나에 있어서, 대목은 엔도르나바이러스 RDRP를 포함하는, 방법.
189. 구현예 185 내지 188 중 어느 하나에 있어서, 엔도르나바이러스 RDRP는 대목에 풍토성인 엔도르나바이러스에 의해 제공되고, 선택적으로 대목에 풍토성인 엔도르나바이러스는 비병원성이고/이거나 편리공생하는, 방법.
190. 구현예 185 내지 189 중 어느 하나에 있어서, 엔도르나바이러스 RDRP는 대목에 외인성으로 제공되는, 방법.
191. 구현예 185 내지 190 중 어느 하나에 있어서, 접가지는 엔도르나바이러스 RDRP를 포함하는, 방법.
192. 구현예 185 내지 191 중 어느 하나에 있어서, RDRP는 접가지에 풍토성인 엔도르나바이러스에 의해 제공되고/되거나 RDRP는 접가지에 외인성으로 제공되고, 선택적으로 접가지에 풍토성인 엔도르나바이러스는 비병원성이고/이거나 편리공생하는, 방법.
193. 5'에서 3' 순서로, 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제(RDRP)에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; 카고 RNA 서열; 및 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는 재조합 RNA 분자를 포함하는 접목 식물을 생산하는 방법으로서, 재조합 RNA 분자는 접목 식물을 생산하기 위해 접가지를 대목 상에 접목시키기 전에 접가지, 대목, 또는 접가지와 대목 둘 모두를 재조합 RNA 분자를 포함하는 조성물과 접촉시킴으로써 제공되는, 방법.
194. 구현예 193에 있어서, 조성물은 액체, 겔 또는 분말인, 방법.
195. 구현예 193 또는 194에 있어서, 접촉은 접가지, 대목, 또는 접가지와 대목 둘 모두를 접목 이전에 조성물에 담그는 단계를 포함하는, 방법.
196. 구현예 193 내지 195 중 어느 하나에 있어서, 엔도르나바이러스 RDRP는 접가지, 대목, 또는 접가지와 대목 둘 모두에 풍토성인 엔도르나바이러스에 의해 제공되는, 방법.
197. 구현예 193 내지 196 중 어느 하나에 있어서, 엔도르나바이러스 RDRP는 접목 식물에 외인성으로 제공되는, 방법.
198. 구현예 193 내지 197 중 어느 하나에 있어서, 접가지, 대목 및 접목 식물은 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA를 결여하고 있는, 방법.
199. 재조합 RNA 분자를 자손 식물 또는 종자에 전파하는 식물을 생산하는 방법으로서, 재조합 RNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 모 식물로부터 얻어진 F1 식물 또는 종자의 집단으로부터 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제(RDRP) 및 5'에서 3' 순서로, 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; 카고 RNA 서열; 및 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는 재조합 RNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 세포를 포함하는 F1 자손 식물 또는 종자를 단리하는 단계를 포함하는 방법.
200. 구현예 199에 있어서, 세포를 포함하는 F1 자손 식물 또는 종자는 재조합 RNA 분자의 존재에 대해 모 식물로부터 얻어진 F1 식물 또는 종자의 집단을 스크리닝하고 재조합 RNA 분자를 포함하는 F1 자손 식물 또는 종자를 번식시킴으로써 단리되는, 방법.
201. 구현예 199 또는 200에 있어서, 카고 RNA 서열은 선택 가능한 또는 스코어링 가능한 마커를 인코딩하는 RNA를 포함하는, 방법.
202. 구현예 201에 있어서, 선택 가능한 또는 스코어링 가능한 마커는 RNA 앱타머 또는 조절 RNA인, 방법.
203. 구현예 202에 있어서, 조절 RNA는 siRNA 또는 siRNA 전구체, miRNA 또는 miRNA 전구체, 트랜스-작용 siRNA 또는 트랜스-작용 siRNA 전구체, siRNA 또는 miRNA 디코이, siRNA 또는 miRNA 절단 차단제, siRNA 또는 miRNA 인식 및 절단 서열, 리보스위치 및 리보자임으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
204. 구현예 201에 있어서, 선택 가능한 마커 또는 스코어링 가능한 마커는 폴리펩티드를 인코딩하는 RNA 서열인, 방법.
205. 구현예 204에 있어서, 폴리펩티드는 식물 세포에서 항생제 또는 제초제에 대한 저항성을 부여하는, 방법.
206. 구현예 199 내지 205 중 어느 하나에 있어서, 카고 RNA 서열은 선택 가능한 마커를 인코딩하는 RNA를 포함하고, 재조합 RNA 분자를 포함하는 F1 자손 식물 또는 종자는 선택 가능한 마커의 존재에 대해 재조합 RNA 분자를 포함하는 F1 자손 식물 또는 종자를 선택함으로써 단리되는, 방법.
207. 구현예 199 내지 206 중 어느 하나에 있어서, F1 자손 식물 또는 종자는 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA를 결여하고 있는, 방법.
208. 구현예 199 내지 207 중 어느 하나에 있어서, 모 식물은 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA를 결여하고 있는, 방법.
209. 구현예 199 내지 208 중 어느 하나에 있어서, 선택된 F1 자손 식물은 재조합 RNA 분자를 적어도 F2 자손에 전파하는, 방법.
210. 구현예 199 내지 209 중 어느 하나에 있어서, F1 자손 식물 또는 종자 집단은 꽃가루 수용자로서 사용되는 모 식물로부터 얻어지는, 방법.
211. 구현예 199 내지 210 중 어느 하나에 있어서, F1 자손 식물 또는 종자 집단은 꽃가루 공여자로서 사용되는 모 식물로부터 얻어지는, 방법.
212. 구현예 199 내지 211 중 어느 하나에 있어서, F1 자손 식물 또는 종자 집단은 모 식물을 자가수분함으로써 얻어지는, 방법.
213. 구현예 199 내지 211 중 어느 하나에 있어서, F1 식물 또는 종자 집단은 2개의 모 식물의 유성 교배로부터 얻어지는, 방법.
214. 구현예 199 내지 213 중 어느 하나에 있어서, 재조합 RNA 분자를 포함하는 모 식물은 자성 모 식물인, 방법.
215. 구현예 199 내지 214 중 어느 하나에 있어서, 재조합 RNA 분자를 포함하는 모 식물은 웅성 모 식물이고, 재조합 RNA 분자는 웅성 모 식물의 꽃가루로 전파되는, 방법.
216. 구현예 199 내지 215 중 어느 하나에 있어서, 식물 세포를 포함하는 모 식물 또는 이의 일부는 F1 자손 식물 또는 종자를 단리하기 전에 재조합 RNA 분자의 존재에 대해 스크리닝되거나 선택되고, 선택적으로 일부는 꽃 조직 또는 웅성 또는 자성 생식 조직을 포함하는, 방법.
217. 구현예 199 내지 216 중 어느 하나에 있어서, 모 식물 또는 이의 하나 이상의 부분은 F1 자손 식물을 단리하기 전에 재조합 RNA 분자의 전신 존재에 대해 스크리닝되는, 방법.
218. 구현예 199 내지 217 중 어느 하나에 있어서, 모 식물의 과피는 재조합 RNA 분자의 존재에 대해 스크리닝되거나 선택되는, 방법.
219. 구현예 199 내지 218 중 어느 하나에 있어서, F1 종자는 과피 조직 내 재조합 RNA 분자의 존재에 대해 선택되는 모 식물로부터 얻어지는, 방법.
220. 구현예 199 내지 219 중 어느 하나에 있어서, 모 식물의 F1 종자는 재조합 RNA 분자의 존재에 대해 비파괴적으로 스크리닝되는, 방법.
221. 구현예 199 내지 220 중 어느 하나에 있어서, 모 식물의 F1 종자는 재조합 RNA 분자의 존재에 대해 종자의 모계 유래 또는 배유 조직을 검정함으로써 비파괴적으로 스크리닝되는, 방법.
222. 구현예 199 내지 221 중 어느 하나에 있어서, 재조합 RNA 분자 또는 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 식물 세포 내로 도입하는 단계 및 식물 세포로부터 재조합 RNA 분자를 포함하는 모 식물을 얻는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
223. 구현예 158 내지 222 중 어느 하나에 있어서, 재조합 RNA 분자는 (a) 바이러스 이동 단백질(MP)을 인코딩하는 적어도 하나의 RNA; (b) 적어도 하나의 tRNA 유사 서열; 및 (c) 조립 기점 서열(OAS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 요소를 추가로 포함하는, 방법.
224. 구현예 158 내지 223 중 어느 하나에 있어서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 표 8, 9 또는 10에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함하고/하거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 표 11, 12 또는 13에 제공된 적어도 하나의 이차 구조를 포함하는, 방법.
225. 구현예 158 내지 224 중 어느 하나에 있어서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 1 내지 19, 372 내지 405, 465, 또는 483 내지 485 중 적어도 하나에 의해 인코딩된 RNA 서열, 또는 서열번호 580의 RNA 서열, 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 RNA 서열을 포함하고/하거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 20 내지 38, 406 내지 454, 467, 또는 486 내지 488 중 적어도 하나에 의해 인코딩된 RNA 서열, 또는 서열번호 581의 RNA 서열, 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 RNA 서열을 포함하고/하거나; (c) 엔도르나바이러스 RDRP는 서열번호 367, 355 내지 366, 368 내지 371, 456, 또는 534 내지 577 중 임의의 하나와 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
226. 구현예 158 내지 225 중 어느 하나에 있어서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래되고/되거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래되고/되거나; (c) 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열은 표 1에 제시된 5' 레플리카제 인식 서열 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는, 방법.
227. 구현예 226에 있어서, 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열은 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래되거나, 표 15에 제시된 동일한 엔도르나바이러스로부터의 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열 쌍을 포함하거나, 서로 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 엔도르나바이러스 게놈으로부터 얻어지고; 선택적으로, 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제는 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래되거나, 엔도르나바이러스 게놈으로부터 선택적으로 얻어지고, 5' RNA 레플리카제 인식 서열, 3' RNA 레플리카제 인식 서열 및/또는 RDRP는 상응하는 5' RNA 레플리카제 인식 서열, 3' RNA 레플리카제 인식 서열 및/또는 RDRP와 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는, 방법.
228. 구현예 158 내지 227 중 어느 하나에 있어서, 엔도르나바이러스 RDRP, 5' 레플리카제 인식 서열, 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열은 벨 페퍼 엔도르나바이러스(BPEV), 파세올루스 불가리스 알파엔도르나바이러스 1(PvEV-1), 파세올루스 불가리스 엔도르나바이러스 2(PvEV-2) 및 헬리안투스 아누스 알파엔도르나바이러스 분리주 BJ로 이루어진 군으로부터 선택되는 엔도르나바이러스로부터 유래되는, 방법.
229. 구현예 158 내지 228 중 어느 하나에 있어서, 번식체, 식물, 식물 부분, 접가지 및/또는 대목은 재조합 RNA 분자를 캡시드화할 수 있는 이종 바이러스 외피 단백질을 포함하고/하거나 이종 바이러스 외피 단백질에 의해 캡시드화된 재조합 RNA 분자를 포함하는, 방법.
230. 식물, 식물 세포, 이의 자손 또는 이의 일부를 바코드화하는 방법으로서, 구현예 30, 또는 51 내지 57 중 어느 하나의 재조합 RNA 분자를 식물 또는 식물 세포에 제공하는 단계를 포함하고, 재조합 RNA 분자의 카고 RNA는 바코드 RNA 분자를 포함하고, 식물 또는 식물 세포는 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제(RDRP)를 포함하는, 방법.
231. 구현예 230에 있어서, 바코드 RNA 분자는 식물, 식물 세포, 이의 자손 또는 이의 일부를 고유하게 식별하는 서열을 포함하는, 방법.
232. 구현예 230 또는 231에 있어서, 바코드 RNA 분자는 동일한 종의 야생형 식물, 이의 병원체 또는 이의 공생체의 게놈 및/또는 전사체에 존재하지 않는 서열을 포함하는, 방법.
233. 구현예 230 내지 232 중 어느 하나에 있어서, 바코드 RNA 분자는 무작위 서열을 포함하는, 방법.
234. 구현예 230 내지 233 중 어느 하나에 있어서, 바코드 RNA 분자는 동일한 종의 야생형 식물, 이의 병원체, 또는 이의 공생체의 게놈 및/또는 전사체에 존재하지 않는 정방향 프라이머 결합 부위 및 역방향 프라이머 결합 부위를 포함하는, 방법.
235. 구현예 230 내지 234 중 어느 하나에 있어서, 바코드 RNA 분자는 길이가 최대 약 14 kb인, 방법.
236. 구현예 230 내지 235 중 어느 하나에 있어서, 바코드 RNA 분자는 10 내지 5000개 뉴클레오티드, 20 내지 1000개 뉴클레오티드, 또는 50 내지 500개 뉴클레오티드의 길이를 갖고, 선택적으로 바코드 RNA 분자는 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 또는 5000개 뉴클레오티드의 길이를 갖는, 방법.
237. 구현예 230 내지 236 중 어느 하나에 있어서, 바코드 RNA 분자는 비단백질 코딩 서열을 포함하는, 방법.
238. 구현예 230 내지 237 중 어느 하나에 있어서, 식물은 재조합 RNA 분자를 자손에 전파하는, 방법.
239. 구현예 230 내지 238 중 어느 하나에 있어서, 식물, 식물 세포, 이의 자손 또는 이의 일부는 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA를 결여하고 있는, 방법.
240. 구현예 230 내지 239 중 어느 하나에 있어서, 엔도르나바이러스 RDRP 및 재조합 RNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 세포를 포함하는 F1 자손 식물 또는 종자를 단리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
241. 구현예 240에 있어서, F1 자손 식물 또는 종자는 꽃가루 수용자로서 사용되는 식물로부터 얻어지는, 방법.
242. 구현예 240에 있어서, F1 자손 식물 또는 종자는 꽃가루 공여자로서 사용되는 식물로부터 얻어지는, 방법.
243. 구현예 230 내지 242 중 어느 하나에 있어서, F1 자손 식물 또는 종자는 식물을 자가수분함으로써 얻어지는, 방법.
244. 구현예 230 내지 243 중 어느 하나에 있어서, 식물 또는 식물 세포를 번식시켜 바코드 RNA 분자를 포함하는 식물 부분 또는 식물 번식체를 얻는 단계를 추가로 포함하고, 선택적으로 상기 번식체는 캘러스, 덩이줄기 및/또는 대목을 포함하는, 방법.
245. 바코드화된 식물, 식물 부분 또는 식물 세포를 식별하는 방법으로서, 식물, 식물 부분 또는 식물 세포에서 바코드 RNA 분자의 존재에 대해 스크리닝하는 단계를 포함하고, 식물, 식물 부분 또는 식물 세포는 구현예 30 또는 51 내지 57 중 어느 하나의 재조합 RNA 분자를 포함하고, 재조합 RNA 분자의 카고 RNA는 바코드 RNA 분자를 포함하는, 방법.
246. 구현예 245에 있어서, 바코드 RNA 분자는 식물, 식물 부분, 또는 식물 세포를 고유하게 식별하는 서열을 포함하는, 방법.
247. 구현예 245 또는 246에 있어서, 바코드 RNA 분자는 동일한 종의 야생형 식물, 이의 병원체 또는 이의 공생체의 게놈 및/또는 전사체에 존재하지 않는 서열을 포함하는, 방법.
248. 구현예 245 내지 247 중 어느 하나에 있어서, 바코드 RNA 분자는 무작위 서열을 포함하는, 방법.
249. 구현예 245 내지 248 중 어느 하나에 있어서, 바코드 RNA 분자는 동일한 종의 야생형 식물, 이의 병원체, 또는 이의 공생체의 게놈 및/또는 전사체에 존재하지 않는 정방향 프라이머 결합 부위 및 역방향 프라이머 결합 부위를 포함하는, 방법.
250. 구현예 245 내지 249 중 어느 하나에 있어서, 바코드 RNA 분자는 길이가 최대 약 14 kb인, 방법.
251. 구현예 245 내지 250 중 어느 하나에 있어서, 바코드 RNA 분자는 10 내지 5000개 뉴클레오티드, 20 내지 1000개 뉴클레오티드, 또는 50 내지 500개 뉴클레오티드의 길이를 갖고, 선택적으로 바코드 RNA 분자는 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 또는 5000개 뉴클레오티드의 길이를 갖는, 방법.
252. 구현예 245 내지 251 중 어느 하나에 있어서, 바코드 RNA 분자는 비단백질 코딩 서열을 포함하는, 방법.
253. 구현예 245 내지 252 중 어느 하나에 있어서, 식물, 식물 부분, 또는 식물 세포로부터 핵산 샘플을 얻는 단계; 및 샘플 내 바코드 RNA 분자의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
254. 구현예 245 내지 253 중 어느 하나에 있어서, 스크리닝하는 단계는 바코드 RNA 분자의 증폭 및/또는 시퀀싱을 포함하는, 방법.
255. 구현예 245 내지 254 중 어느 하나에 있어서, 스크리닝하는 단계는 바코드 RNA 분자의 적어도 일부에 혼성화되는 혼성화 프로브로 바코드 RNA 분자를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
256. 구현예 255에 있어서, 혼성화 프로브는 검출 가능한 표지를 포함하는, 방법.
257. 구현예 245 내지 256 중 어느 하나에 있어서, 식물 부분은 종자, 묘목, 배주, 배아, 꽃가루, 뿌리, 줄기, 잎, 묘조, 덩이줄기, 뿌리줄기, 기는 줄기, 구근, 외식편 또는 캘러스를 포함하는, 방법.
258. 구현예 257에 있어서, 종자는 바코드 RNA 분자의 존재에 대해 비파괴적으로 스크리닝되는, 방법.
259. 구현예 245 내지 259 중 어느 하나에 있어서, 식물, 식물 부분, 또는 식물 세포는 엔도르나바이러스 RDRP를 포함하는, 방법.
260. 식물 또는 식물 세포 내로 도입될 때 자가 복제되는 엔도르나바이러스 위성 시스템으로서, (a) 5'에서 3' 순서로, (i) 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제(RDRP)에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; (ii) 카고 RNA 서열; 및 (iii) 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는 재조합 엔도르나바이러스 위성 RNA로서, 선택적으로, (iv) 바이러스 이동 단백질(MP)을 인코딩하는 적어도 하나의 RNA; (v) 적어도 하나의 tRNA 유사 서열(TLS); 및 (vi) 캡시드화 인식 서열(ERS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 요소를 추가로 포함하는 재조합 엔도르나바이러스 위성 RNA; 및 (b) 식물 또는 식물 세포에서 풍토성이거나 고유하지 않고, 식물 또는 식물 세포에서 복제 가능하고, 재조합 엔도르나바이러스 위성 RNA의 5' 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 엔도르나바이러스 RDRP를 인코딩하는 외인성 엔도르나바이러스를 포함하는, 엔도르나바이러스 위성 시스템.
261. 구현예 260에 있어서, 외인성 엔도르나바이러스는 상이한 종, 변종 또는 생식질에 풍토성이거나 고유한, 자가 복제 엔도르나바이러스 위성 시스템.
262. 5'에서 3' 순서로, (a) 엔도르나바이러스 RNA 의존성 RNA 폴리머라제(RDRP)에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열; (b) 카고 RNA 서열; 및 (c) 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하고, 카고 RNA 서열은 5' 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열에 대해 이종성인, 재조합 RNA 분자.
263. 구현예 262에 있어서, (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래되고/되거나; (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래되는, 재조합 RNA 분자.
264. 구현예 262 또는 263에 있어서, 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열은 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래되거나 서로 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 엔도르나바이러스 게놈으로부터 얻어지는, 재조합 RNA 분자.
265. 구현예 262 내지 264 중 어느 하나에 있어서, 5' 레플리카제 인식 서열, 3' 레플리카제 인식 서열 및 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제는 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래되거나 엔도르나바이러스 게놈으로부터 얻어지고, 5' RNA 레플리카제 인식 서열, 3' RNA 레플리카제 인식 서열 및/또는 RDRP 서열은 상응하는 5' RNA 레플리카제 인식 서열, 3' RNA 레플리카제 인식 서열 및/또는 RDRP 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는, 재조합 RNA 분자.
266. 구현예 262 내지 265 중 어느 하나에 있어서, (i) 5' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 14에 의해 인코딩된 RNA와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 RNA를 포함하고, 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 33에 의해 인코딩된 RNA와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 RNA를 포함하거나; (ii) 5' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 580과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 RNA를 포함하고, 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 581과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 RNA를 포함하는, 재조합 RNA 분자.
267. 구현예 266에 있어서, RDRP는 서열번호 367과 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 재조합 RNA 분자.
268. 구현예 262 내지 267 중 어느 하나에 있어서, 카고 RNA 서열은 길이가 최대 약 14 kb이며, (a) 적어도 하나의 단백질 코딩 서열, (b) 적어도 하나의 비코딩 서열, 또는 (c) 적어도 하나의 단백질 코딩 서열과 적어도 하나의 비코딩 서열 둘 모두를 포함하는, 재조합 RNA 분자.
269. 구현예 262 내지 268 중 어느 하나에 있어서, 엔도르나바이러스 RNA 의존성 RNA 폴리머라제(RDRP)는 서열번호 367, 355 내지 366, 368 내지 370, 또는 371, 456, 또는 534 내지 577 중 임의의 하나와 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 재조합 RNA 분자.
270. 구현예 262 내지 269 중 어느 하나의 재조합 RNA 분자를 포함하는 농업용 제형.
271. 구현예 262 내지 269 중 어느 하나의 재조합 RNA 분자, 및 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 엔도르나바이러스 RDRP를 포함하는 식물.
272. 구현예 271에 있어서, 국화과, 박과, 콩과, 녹나무과, 벼과 또는 가지과에 속하는, 식물.
273. 구현예 271 또는 272에 있어서, 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA를 결여하고 있는, 식물.
274. 구현예 262 내지 269 중 어느 하나의 재조합 RNA 분자, 및 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 엔도르나바이러스 RDRP를 포함하는 식물 번식체.
275. 구현예 274에 있어서, 세포, 또는 세포를 포함하는 종자, 묘목, 배주, 배아, 꽃가루, 뿌리, 줄기, 잎, 묘조, 덩이줄기, 뿌리줄기, 기는 줄기, 구근, 외식편 또는 캘러스를 포함하는, 식물 번식체.
276. 구현예 274 또는 275에 있어서, 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA를 결여하고 있는, 식물 번식체.
277. 구현예 262 내지 269 중 어느 하나의 재조합 RNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 식물 세포를 포함하는 변형된 식물 번식체를 생산하는 방법으로서, 재조합 RNA 분자를 포함하는 식물 세포와 재조합 RNA 분자를 결여한 식물 세포 둘 모두를 포함하는 식물 세포의 혼합 집단으로부터 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제(RDRP) 및 재조합 RNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 식물 세포를 포함하는 식물 번식체를 단리하는 단계를 포함하는 방법.
278. 구현예 277에 있어서, 식물 세포의 혼합 집단은 식물 번식체를 단리하기 전에 재조합 RNA 분자를 포함하는 식물 세포의 존재에 대해 스크리닝되거나 선택되는, 방법.
279. 구현예 277 또는 278에 있어서, 단리하는 단계는 식물 번식체를 단리하기 전에 재조합 RNA 분자를 포함하는 식물 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
280. 구현예 277 내지 278 중 어느 하나에 있어서, 혼합 집단은 원형질체의 집단 또는 캘러스, 외식편, 식물 부분 또는 전체 식물에서의 세포의 집단인, 방법.
281. 구현예 280에 있어서, 혼합 집단은 식물 번식체를 단리하기 전에 재조합 RNA 분자의 존재 또는 전신 존재에 대해 스크리닝되거나 선택되는, 방법.
282. 해충 또는 병원체에 대한 식물의 저항성 및/또는 내성을 증가시키는 방법으로서, 구현예 262 내지 269 중 어느 하나의 재조합 RNA 분자를 식물에 제공하는 단계를 포함하고, 식물은 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 RDRP 단백질을 포함하며, 이에 의해 RDRP 단백질은 재조합 RNA 분자로부터 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA의 합성을 촉매하고, 카고 RNA 서열로 인해 해충 또는 병원체에 대한 식물의 저항성 및/또는 내성은 재조합 RNA 분자가 제공되지 않은 식물에 비해 증가하는, 방법.
283. 구현예 282에 있어서, 해충 또는 병원체는 박테리아, 진균, 난균류 또는 무척추동물이고, 선택적으로 진균은 보트리티스 sp.인, 방법.
284. 구현예 262 내지 269 중 어느 하나의 재조합 RNA 분자를 자손 식물 또는 종자에 전파하는 F1 식물을 생산하는 방법으로서, 재조합 RNA 분자, 및 재조합 RNA 분자 및 RDRP를 포함하는 적어도 하나의 모 식물로부터 얻어진 F1 식물 또는 종자의 집단으로부터 재조합 RNA 분자의 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제(RDRP)를 포함하는 적어도 하나의 식물 세포를 포함하는 F1 자손 식물 또는 종자를 단리하는 단계를 포함하는 방법.
285. 구현예 284에 있어서, 모 식물 또는 이의 하나 이상의 부분은 F1 자손 식물을 단리하기 전에 재조합 RNA 분자의 존재에 대해 스크리닝되거나 선택되는, 방법.
286. 구현예 284 또는 285에 있어서, 하나 이상의 부분은 꽃 조직 또는 웅성 또는 자성 생식 조직을 포함하는, 방법.
287. 구현예 284 내지 286 중 어느 하나에 있어서, F1 자손 식물 또는 종자는 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA를 결여하고 있는, 방법.
288. 구현예 284 내지 287 중 어느 하나에 있어서, RDRP는 적어도 하나의 모 식물에서 편리공생 비병원성 엔도르나바이러스 풍토병에 의해 F1 자손 식물 또는 종자에 제공되는, 방법.
289. 구현예 284 내지 288 중 어느 하나에 있어서, F1 자손 식물 또는 종자 집단은 모 식물을 자가수분함으로써 얻어지는, 방법.
290. 구현예 284 내지 288 중 어느 하나에 있어서, F1 식물 또는 종자 집단은 2개의 모 식물의 유성 교배로부터 얻어지는, 방법.
실시예
다음 실시예에는, 본 명세서에 상세히 기재된 바와 같이, 재조합 DNA 분자 및 내부에서 인코딩된 재조합 RNA 분자를 제공하기 위한 조성물 및 기법의 비제한적 구현예가 예시되어 있다.
재조합 RNA 분자는, 예를 들어 지속적인 및/또는 편리공생 엔도르나바이러스 집단으로서 식물에서 본래 또는 풍토성으로 발견되거나 식물 내로 외인성으로 도입된 것들과 같은 엔도르나바이러스로부터의 서열을 기반으로 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA("엔도르나바이러스 위성")를 생성하는 데 유용하며, 식물에 비병원성일 수 있다. 이들 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA는 적어도 하나의 코딩 또는 비코딩 카고 RNA 서열을 운반하도록 설계되고, 예를 들어 식물 또는 식물 세포에서 지속적인 RNA 벡터로서의 역할을 하며, 이들은 특정 구현예에서는 다음 세대 또는 자손 식물에 전파된다. 따라서 합성 엔도르나바이러스 위성은 유전성 DNA, 예컨대 전이유전자 또는 다른 유전성 DNA 벡터 또는 작제물을 사용하지 않고 원하는 카고(예를 들어, 비코딩 RNA, 메신저 RNA, RNA 바코드)의 유전성 발현을 식물(연속적인 식물의 세대를 포함함)에 제공하기 위한 수단을 제공한다. 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA는 폴리펩티드, 당 또는 탄수화물, 지질 또는 추가 폴리뉴클레오티드와 같은 다른 생물학적 물질과 추가로 복합체화될 수 있다. 구현예에서, 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA는 적합한 바이러스 외피 단백질로 캡시드화되어 합성 엔도르나바이러스 위성 바이러스 입자를 형성하고; 이러한 캡시드화된 위성 RNA는, 예를 들어 카고 RNA(들)에 의해 영향을 받는 표현형을 야기하기 위해 식물에 전달될 수 있다.
합성 엔도르나바이러스 위성 RNA 또는 합성 엔도르나바이러스 위성 입자는 전형적으로 표적 식물의 내인성 엔도르나바이러스 바이러스체의 복제 기계를 이용하고(대안적으로, 복제 기계, 예를 들어 적절한 RDRP는, 예를 들어 RDRP를 인코딩하는 작제물과의 공동 형질전환 또는 외인성 엔도르나바이러스의 도입에 의해 외인성으로 첨가됨), 그에 따라 합성 엔도르나바이러스 위성은 초기 전달 후 스스로를 유지할 수 있다. 이는 식물의 내인성 엔도르나바이러스 바이러스체 또는 외인성으로 제공된 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 표적 식물에서 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA의 복제를 가능하게 하는 레플리카제 인식 서열의 엔도르나바이러스 위성 서열에 포함시킴으로써 달성된다. 비-망라적인 범위의 엔도르나바이러스 및 이들의 숙주 식물에 대한 레플리카제 인식 서열의 목록이 표 1에 제공된다. 구현예에서, 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA는, 예를 들어 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA에 적절한 바이러스 캡시드화 신호를 혼입함으로써, 그리고 적절한 바이러스 외피 단백질과의 접촉에 의해 안정성을 증가시키기 위해 폴리펩티드(예를 들어, 바이러스 외피 단백질)에 캡시드화되거나 그와 복합체화된다. 캡시드화 서열 및 회합된 외피 단백질의 목록은 표 2에 나열되어 있다. 대안적으로, 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA는 단층 또는 다층 소포 또는 리포솜 또는 지질 나노- 또는 마이크로입자와 같은 지질 기반 조성물에 캡슐화되거나 그와 복합체화된다. 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA는, 예를 들어 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA에 바이러스 이동 단백질 및/또는 tRNA 유사 서열을 혼입함으로써 전달 지점의 원위에 있는 식물의 부분으로 전신적으로 이동하도록 설계될 수 있다. 바이러스 이동 단백질 및 tRNA 유사 서열의 목록은 각각 표 3 및 4에 제공된다.
본원에 제공된 일반적인 설명을 고려하면 다양한 다른 구현예가 실시될 수 있다는 것이 이해된다.
실시예의 내용
실시예 1. 아그로침윤 전달을 통한 페퍼에서의 지속적인 유전자 발현을 위한 엔도르나바이러스 위성
본 실시예에는 페퍼 식물에서 카고 유전자의 발현을 지속하기 위해 엔도르나바이러스 위성을 구축하는 방법이 기재되어 있다.
T-DNA 벡터를, 5'에서 3'으로, 벨 페퍼 엔도르나바이러스(BPEV)로부터의 5' 레플리카제 인식 서열, 반딧불이 루시퍼라제(카고 서열), 및 BPEV로부터의 3' 레플리카제 인식 서열의 발현을 유도하는 강력한 구성적 프로모터-종결자 쌍, 예컨대 p35S 및 tNos로 구축한다(표 7, 작제물 1).
이 T-DNA 벡터를 이어서 아그로박테리움 투메파시엔스의 GV3101 균주로 형질전환하고, 내인성 BPEV 감염이 있는 페퍼 식물에 침윤시킨다. 예를 들어, 문헌[Park et al. (2021) Int. J. Mol. Sci., 22:3921; doi: 10.3390/ijms22083921]을 참조한다. 접종 3주 후, 전달된 카고 서열 RNA를 정량화하기 위해 표적화된 RNA가 전달된 조직으로부터 추출된 RNA에 대해 수행되는 qPCR 검정을 통해 전달된 벡터의 지속성을 확인한다. 루시퍼라제 검정도 사용하여 배경에 대한 단백질 수준을 정량화한다.
실시예 2. 아그로침윤 전달을 통한 페퍼에서의 지속적인 다중유전자 발현을 위한 엔도르나바이러스 위성
본 실시예에는 페퍼 식물에서 다수의 카고 유전자의 발현을 지속하기 위해 엔도르나바이러스 위성을 구축하는 방법이 기재되어 있다. 구현예에서, 다수의 단백질 인코딩 카고 서열을 전달하기 위한 엔도르나바이러스 위성 작제물은 제2(및 임의의 추가) 단백질 인코딩 카고 서열의 시작 코돈에 인접하여 그의 5'에 추가 내부 리보솜 유입 부위(IRES)를 포함한다.
T-DNA 벡터를, 5'에서 3'으로, 벨 페퍼 엔도르나바이러스(BPEV)로부터의 5' 레플리카제 인식 서열, 반딧불이 루시퍼라제(제1 카고 서열), 내부 리보솜 유입 부위(표 5), 녹색 형광 단백질(GFP) 리포터 유전자(제2 카고 서열), 및 BPEV로부터의 3' 레플리카제 인식 서열의 발현을 유도하는 강력한 구성적 프로모터-종결자 쌍, 예컨대 p35S 및 tNos로 구축한다(표 7, 작제물 2).
이 T-DNA 벡터를 이어서 아그로박테리움 투메파시엔스의 GV3101 균주로 형질전환하고, 내인성 BPEV 감염이 있는 페퍼 식물에 침윤시킨다. 접종 3주 후, 전달된 카고 서열 RNA를 정량화하기 위해 표적화된 RNA가 전달된 조직으로부터 추출된 RNA에 대해 수행되는 qPCR 검정을 통해 전달된 벡터의 지속성을 확인할 수 있다. 루시퍼라제 검정도 사용하여 배경에 대한 단백질 수준을 정량화한다. Leica 형광 현미경을 사용하여, 전달된 조직에서 배경에 대한 GFP 신호를 정량화한다.
실시예 3. 아그로침윤 전달을 통한 페퍼에서의 지속적인 비코딩 RNA 전달을 위한 엔도르나바이러스 위성
본 실시예에는 페퍼 식물에서 비코딩 RNA의 전달을 지속하기 위해 엔도르나바이러스 위성을 구축하는 방법이 기재되어 있다.
T-DNA 벡터를, 5'에서 3'으로, 벨 페퍼 엔도르나바이러스(BPEV)로부터의 5' 레플리카제 인식 서열, 트랜스-절단 망치머리형 리보자임, 및 BPEV로부터의 3' 레플리카제 인식 서열의 발현을 유도하는 강력한 구성적 프로모터-종결자 쌍, 예컨대 p35S 및 tNos로 구축한다(표 7, 작제물 3). 트랜스-절단 망치머리형 리보자임을 Ribosoft 알고리즘을 사용하여 내인성 페퍼 유전자(피토엔 디새튜라제, PDS)의 mRNA에 어닐링하고 이를 절단하도록 설계한다(Khan AA, Fox EK,
Figure pct00005
, et al (2013) pH Control of the Electrostatic Binding of Gold and Iron Oxide Nanoparticles to Tobacco Mosaic Virus. Langmuir 29:2094-2098).
이 T-DNA 벡터를 이어서 아그로박테리움 투메파시엔스의 GV3101 균주로 형질전환하고, 내인성 BPEV 감염이 있는 페퍼 식물에 침윤시킨다. 접종 3주 후, 전달된 카고 서열 RNA를 정량화하기 위해 표적화된 RNA가 전달된 조직으로부터 추출된 RNA에 대해 수행되는 qPCR 검정을 통해 전달된 벡터의 지속성을 확인한다. 트랜스-절단 리보자임에 의해 표적화된 PDS 유전자에 대한 다른 qPCR 검정은 대조군 처리와 비교하여 PDS mRNA의 절단으로 인한 PDS 전사물 감소 정도를 정량화한다.
실시예 4. 바이오리스틱 전달을 통한 페퍼에서의 지속적인 유전자 발현을 위한 엔도르나바이러스 위성
본 실시예에는 엔도르나바이러스 위성의 바이오리스틱 전달, 및 페퍼 식물에서의 카고 유전자의 지속적인 발현이 기재되어 있다.
벡터를, 5'에서 3'으로, 벨 페퍼 엔도르나바이러스(BPEV)로부터의 5' 레플리카제 인식 서열, 반딧불이 루시퍼라제(카고 서열), 및 BPEV로부터의 3' 레플리카제 인식 서열의 발현을 유도하는 T7 프로모터를 갖는 pACYC 백본을 사용하여 구축하였다(표 7, 작제물 4). 플라스미드를 PCR 반응을 위한 주형으로 사용하여 T7 프로모터를 갖는 발현 카세트를 증폭시켰다. 이 앰플리콘을 Lucigen의 T7 플래시 Ampliscribe 키트를 사용한 시험관내 전사 반응을 위한 주형으로 사용하였다.
이어서 시험관내 전사된 RNA를 Helios 유전자 총 매뉴얼에 명시된 가이드라인에 따라 Bio-Rad의 0.6 마이크로몰 금 나노입자 상에 로딩하였다. RNA-코팅된 금 나노입자를 100 psi 압력으로 설정된 Bio-Rad Helios 유전자 총을 이용하여 페퍼 식물의 확장된 잎 조직에 발사하였다. 접종 3주 후, 포격된(bombarded) 조직으로부터 추출된 RNA에 대해 수행되는 qPCR 검정을 통해 전달된 벡터의 지속성을 확인하였다. 음성 가닥 특이적 cDNA에 대해 수행된 RT-PCR 반응의 겔 분석도 수행하였고; 정확한 크기의 밴드는 포격된 복제 샘플로부터의 샘플에서는 관찰되었지만 비포격된 대조군으로부터의 샘플에서는 관찰되지 않았으며, 이는 포격된 조직에서 엔도르나바이러스 위성이 복제되었다는 증거이다. 루시퍼라제 검정도 사용하여 배경에 대한 카고 단백질 수준을 정량화하였다.
실시예 5. 바이오리스틱 전달을 통한 페퍼에서의 지속적인 유전자 발현 및 이동 단백질-보조 이동을 위한 엔도르나바이러스 위성
본 실시예에는 페퍼 식물에서의 카고 서열의 지속적인 발현 및 전신 확산을 위한 엔도르나바이러스 위성의 바이오리스틱 전달이 기재되어 있다.
벡터를, 5'에서 3'으로, 벨 페퍼 엔도르나바이러스(BPEV)로부터의 5' 레플리카제 인식 서열, 반딧불이 루시퍼라제, 내부 리보솜 유입 부위(표 5), 바이러스 이동 단백질(표 3), 및 BPEV로부터의 3' 레플리카제 인식 서열의 발현을 유도하는 T7 프로모터를 갖는 pACYC 백본을 사용하여 구축하였다(표 7, 작제물 5). 플라스미드를 PCR 반응을 위한 주형으로 사용하여 T7 프로모터를 갖는 발현 카세트를 증폭시켰다. 이 앰플리콘을 Lucigen의 T7 플래시 Ampliscribe 키트를 사용한 시험관내 전사 반응을 위한 주형으로 사용하였다.
이어서 시험관내 전사된 RNA를 Helios 유전자 총 매뉴얼에 명시된 가이드라인에 따라 BioRad의 0.6 마이크로몰 금 나노입자 상에 로딩하였다. RNA-코팅된 금 나노입자를 100 psi 압력으로 설정된 Bio-Rad Helios 유전자 총을 이용하여 페퍼 식물의 확장된 잎 조직에 발사하였다. 접종 후 다양한 시점에서, 카고 서열 RNA의 존재 또는 부재를 포격된 잎, 포격된 잎의 원위에 있는 (비포격된) 잎(카고 서열의 이동 및/또는 전신 발현을 검출하기 위한 것임), 및 과일로부터 추출된 RNA 샘플에 대해 수행되는 qPCR 검정을 통해 검출하였다.
실시예 6. 바이오리스틱 전달을 통한 페퍼에서의 지속적인 유전자 발현 및 tRNA-보조 이동을 위한 엔도르나바이러스 위성
본 실시예에는 페퍼 식물에서의 카고 서열의 지속적인 발현 및 전신 확산을 위한 엔도르나바이러스 위성의 바이오리스틱 전달이 기재되어 있다.
벡터를, 5'에서 3'으로, 벨 페퍼 엔도르나바이러스(BPEV)로부터의 5' 레플리카제 인식 서열, 반딧불이 루시퍼라제, tRNA 유사 서열(표 4), 및 BPEV로부터의 3' 레플리카제 인식 서열의 발현을 유도하는 T7 프로모터로 구축하였다(표 7, 작제물 6). 플라스미드를 PCR 반응을 위한 주형으로 사용하여 T7 프로모터를 갖는 발현 카세트를 증폭시켰다. 이 앰플리콘을 Lucigen의 T7 플래시 Ampliscribe 키트를 사용한 시험관내 전사 반응을 위한 주형으로 사용하였다.
시험관내 전사된 RNA를 Helios 유전자 총 매뉴얼에 명시된 가이드라인에 따라 BioRad의 0.6 마이크로몰 금 나노입자 상에 로딩하였다. RNA-코팅된 금 나노입자를 100 psi 압력으로 설정된 Bio-Rad Helios 유전자 총을 이용하여 페퍼 식물의 확장된 잎 조직에 발사하였다. 페퍼 식물은 RT-PCR을 통해 내인성 BPEV 감염이 있는 것으로 이전에 확인되었다. 접종 후 다양한 시점에서, 카고 서열 RNA의 존재 또는 부재를 포격된 잎, 포격된 잎의 원위에 있는 (비포격된) 잎(카고 서열의 이동 및/또는 전신 발현을 검출하기 위한 것임), 및 과일로부터 추출된 RNA 샘플에 대해 수행되는 qPCR 검정을 통해 검출하였다. 접종 후 16일째에, 원위 잎으로부터의 샘플에서 희미한 양성 신호(증폭된 카고 서열 생성물의 예상 분자량에 상응하는 밴드)가 관찰되었다. 접종 후 36일째에, 원위 잎으로부터의 샘플에서 강한 양성 밴드가 관찰되었다. 접종 후 72일째에, 원위 잎으로부터의 샘플에서 강한 양성 밴드가 관찰되었고, 과일로부터의 샘플에서 희미한 양성 밴드가 관찰되었다.
실시예 7. 바이오리스틱 전달을 통한 벼에서의 지속적인 유전자 발현 및 tRNA-보조 이동을 위한 엔도르나바이러스 위성.
본 실시예에는 벼 식물에서의 카고 서열의 지속적인 발현 및 전신 확산을 위한 엔도르나바이러스 위성의 바이오리스틱 전달이 기재되어 있다.
벡터를, 5'에서 3'으로, 오리자 사티바 엔도르나바이러스(OsEV)로부터의 5' 레플리카제 인식 서열, 반딧불이 루시퍼라제, tRNA 유사 서열(표 4), 및 OsEV로부터의 3' 레플리카제 인식 서열의 발현을 유도하는 T7 프로모터로 구축한다(표 7, 작제물 7). 플라스미드를 PCR 반응을 위한 주형으로 사용하여 T7 프로모터를 갖는 발현 카세트를 증폭시킨다. 이 앰플리콘을 Lucigen의 T7 플래시 Ampliscribe 키트를 사용한 시험관내 전사 반응을 위한 주형으로 사용한다.
이어서 시험관내 전사된 RNA를 Helios 유전자 총 매뉴얼에 명시된 가이드라인에 따라 BioRad의 0.6 마이크로몰 금 나노입자 상에 로딩한다. RNA-코팅된 금 나노입자를 100 psi 압력으로 설정된 Bio-Rad Helios 유전자 총을 이용하여 벼 식물의 확장된 잎 조직에 발사한다. 벼 식물은 RT-PCR을 통해 내인성 OsEV 감염이 있는 것으로 이전에 확인되었다. 접종 후 다양한 시점에서, 카고 서열 RNA의 존재 또는 부재를 포격된 잎, 포격된 잎의 원위에 있는 (비포격된) 잎(카고 서열의 이동 및/또는 전신 발현을 검출하기 위한 것임), 및 선택적으로 곡물(종자)로부터 추출된 RNA 샘플에 대해 수행되는 qPCR 검정을 통해 확인한다.
실시예 8. 바이오리스틱 전달을 통한 페퍼에서의 지속적인 유전자 발현을 위한 측접 리보자임을 갖는 엔도르나바이러스 위성.
본 실시예에는 페퍼 식물에서의 카고 서열의 지속적인 발현 및 전신 확산을 위한 엔도르나바이러스 위성의 바이오리스틱 전달이 기재되어 있다.
벡터를, 5'에서 3'으로, 망치머리형 리보자임, 벨 페퍼 엔도르나바이러스(BPEV)로부터의 5' 레플리카제 인식 서열, 반딧불이 루시퍼라제, 및 BPEV로부터의 3' 레플리카제 인식 서열, 및 HDV 리보자임의 발현을 유도하는 T7 프로모터로 구축한다(표 7, 작제물 8). 플라스미드를 PCR 반응을 위한 주형으로 사용하여 T7 프로모터를 갖는 발현 카세트를 증폭시킨다. 이 앰플리콘을 Lucigen의 T7 플래시 Ampliscribe 키트를 사용한 시험관내 전사 반응을 위한 주형으로 사용한다.
이어서 시험관내 전사된 RNA를 Helios 유전자 총 매뉴얼에 명시된 가이드라인에 따라 BioRad의 0.6 마이크로몰 금 나노입자 상에 로딩한다. RNA-코팅된 금 나노입자를 100 psi 압력으로 설정된 Bio-Rad Helios 유전자 총을 이용하여 페퍼 식물의 확장된 잎 조직에 발사한다. 접종 후 다양한 시점에서, 카고 서열 RNA의 존재 또는 부재를 포격된 잎으로부터 추출된 RNA 샘플에 대해 수행되는 qPCR 검정을 통해 확인한다. 루시퍼라제 검정도 사용하여 배경에 대한 단백질 수준을 정량화한다.
실시예 9. 고압 분무 기반 전달을 통한 페퍼에서의 지속적인 유전자 발현 및 이동을 위한 캡시드화된 엔도르나바이러스 위성
본 실시예에는 페퍼 식물에서의 카고 서열의 지속적인 발현 및 전신 확산을 위한 캡시드화된 엔도르나바이러스 위성의 분무 전달이 기재되어 있다. 2개의 상이한 발현 카세트를 포함하도록 T-DNA 벡터를 설계된다. 첫 번째 것은 토바모바이러스 외피 단백질의 발현을 유도하는 강력한 구성적 프로모터-종결자 쌍, 예컨대 p35S 및 t35S를 포함한다(표 2). 제2 발현 카세트는 5'에서 3'으로, 망치머리형 리보자임, 벨 페퍼 엔도르나바이러스(BPEV)로부터의 5' 레플리카제 인식 서열, 반딧불이 루시퍼라제 코딩 서열, 내부 리보솜 유입 부위(표 5), 바이러스 이동 단백질(표 3), tRNA 유사 서열(표 4), 다른 발현 카세트에서의 토바모바이러스 외피 단백질에 대한 OAS 서열(표 2), BPEV로부터의 3' 레플리카제 인식 서열, 및 HDV 리보자임으로 이루어진 작제물(표 7, 작제물 9)의 발현을 유도하는 중간 강도 프로모터-종결자 쌍, 예컨대 pAtUBQ1 및 tHSP를 갖는다.
이 T-DNA 벡터를 이어서 아그로박테리움 투메파시엔스의 GV3101 균주로 형질전환하고, 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 식물의 잎에 침윤시킨다. 3일 후, 침윤된 조직을 균질화하고, 캡시드화된 위성 RNA를 표준 PEG 침전 프로토콜을 통해 단리한다(Mueller, A., Kadri, A., Jeske, H., and Wege, C. (2010). In vitro assembly of Tobacco mosaic virus coat protein variants derived from fission yeast expression clones or plants. J Virol Methods 166, 77-85.). 이어서 이러한 단리된 비리온 또는 미정제 용해물은 공개된 프로토콜에 따라 2 내지 3주령 페퍼 식물의 잎 표면 상에 변형된 에어 브러시를 이용하여 약 8 bar 압력으로 분무함으로써 페퍼 식물에 전달된다(Dalakouras, A., Wassenegger, M., McMillan, J. N., Cardoza, V., Maegele, I., Dadami, E., et al. (2016). Induction of Silencing in Plants by High-Pressure Spraying of In vitro-Synthesized Small RNAs. Front Plant Sci 07, 1327).
접종 후 다양한 시점에서, 카고 서열 RNA의 존재 또는 부재를 분무-접종된 잎 또는 접종 후 성장한 원위 조직(예를 들어, 새로운 잎 성장)으로부터 추출된 RNA 샘플에 대해 수행되는 qPCR 검정을 통해 확인한다. 루시퍼라제 검정도 사용하여 배경에 대한 단백질 수준을 정량화한다. 분무되지 않은(원위) 조직에서 카고 서열 RNA의 존재는 카고 서열 RNA의 전신 발현 및/또는 이동을 나타냈다.
실시예 10. 고압 분무 기반 전달을 통한 페퍼에서의 지속적인 유전자 발현 및 이동을 위한 인트론을 함유하는 캡시드화된 엔도르나바이러스 위성
본 실시예에는 페퍼 식물에서의 카고 서열의 지속적인 발현 및 전신 확산을 위한 인트론을 함유하는 엔도르나바이러스 위성의 분무 전달이 기재되어 있다.
2개의 상이한 발현 카세트를 포함하도록 T-DNA 벡터를 설계된다. 첫 번째 것은 토바모바이러스 외피 단백질의 발현을 유도하는 강력한 구성적 프로모터-종결자 쌍, 예컨대 p35S 및 tNos를 포함한다(표 2). 제2 발현 카세트는 5'에서 3'으로, 망치머리형 리보자임, 벨 페퍼 엔도르나바이러스(BPEV)로부터의 5' 레플리카제 인식 서열, 반딧불이 루시퍼라제 코딩 서열, 내부 리보솜 유입 부위(표 5), 바이러스 이동 단백질(표 3), tRNA 유사 서열(표 4), 다른 발현 카세트에서의 토바모바이러스 외피 단백질에 대한 OAS 서열(표 2), BPEV로부터의 3' 레플리카제 인식 서열, 및 HDV 리보자임으로 이루어진 작제물(표 7, 작제물 10)의 발현을 유도하는 중간 강도 프로모터-종결자 쌍, 예컨대 pAtUBQ1 및 tHSP를 갖는다. 식물로부터의 인트론(예를 들어, 표 6 참조)은 위성 코딩 서열에 삽입되어, 스플라이싱 예측 알고리즘에 의해 높은 효율로 정확하게 스플라이싱될 것으로 예측된다.
이 T-DNA 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스의 GV3101 균주로 형질전환하고, 니코티아나 벤타미아나 식물의 잎에 침윤시킨다. 3일 후, 침윤된 조직을 균질화하고, 캡시드화된 위성 RNA를 표준 PEG 침전 프로토콜을 통해 단리한다(Mueller, A., Kadri, A., Jeske, H., and Wege, C. (2010). In vitro assembly of Tobacco mosaic virus coat protein variants derived from fission yeast expression clones or plants. J Virol Methods 166, 77-85.). 이러한 단리된 비리온 또는 미정제 용해물을 공개된 프로토콜에 따라 2 내지 3주령 페퍼 식물의 잎 표면 상에 변형된 에어 브러시를 이용하여 약 8 bar 압력으로 분무함으로써 페퍼 식물에 전달한다(Dalakouras, A., Wassenegger, M., McMillan, J. N., Cardoza, V., Maegele, I., Dadami, E., et al. (2016). Induction of Silencing in Plants by High-Pressure Spraying of In vitro-Synthesized Small RNAs. Front Plant Sci 07, 1327).
접종 후 다양한 시점에서, 카고 서열 RNA의 존재 또는 부재를 분무-접종된 잎 또는 접종 후 성장한 원위 조직(예를 들어, 새로운 잎 성장)으로부터 추출된 RNA 샘플에 대해 수행되는 qPCR 검정을 통해 확인한다. 루시퍼라제 검정도 사용하여 배경에 대한 단백질 수준을 정량화한다. 분무되지 않은(원위) 조직에서 카고 서열 RNA의 존재는 카고 서열 RNA의 전신 발현 및/또는 이동을 나타냈다.
실시예 11. 바이오리스틱 전달을 통한 페퍼에서의 지속적인 유전자 발현 및 이동을 위한 캡시드화된 엔도르나바이러스 위성의 시험관내 생산
본 실시예에는 페퍼 식물에서의 카고 서열의 지속적인 발현 및 전신 확산을 위한 시험관내 합성된 캡시드화된 엔도르나바이러스 위성의 바이오리스틱 전달이 기재되어 있다.
작제물을, 5'에서 3'으로, T7 프로모터, 벨 페퍼 엔도르나바이러스(BPEV)로부터의 5' 레플리카제 인식 서열, 반딧불이 루시퍼라제 코딩 서열, 내부 리보솜 유입 부위(표 5), 바이러스 이동 단백질(표 3), tRNA 유사 서열(표 4), OAS 서열(표 2), BPEV로부터의 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하는 TWIST 바이오사이언스에 의해 합성된 유전자 단편의 골든 게이트 어셈블리(Golden Gate assembly)를 통해 구축한다(표 7, 작제물 11). 이를 Lucigen의 T7 플래시 Ampliscribe 키트를 사용한 시험관내 전사 반응을 위한 주형으로 사용한다.
동시에, 공개된 PEG 침전 프로토콜을 통해 토바모바이러스에 감염된 니코티아나 벤타미아나 식물로부터 토바모바이러스 외피 단백질을 정제한 후, 외피 단백질로부터 바이러스 핵산을 분리하기 위해 바이러스 캡시드의 빙초산 매개 해리를 행한다(Smith ML, Corbo T, Bernales J, et al (2007) Assembly of trans-encapsidated recombinant viral vectors engineered from Tobacco mosaic virus and Semliki Forest virus and their evaluation as immunogens. Virology 358:321-333). 이어서, 정제된 외피 단백질을 4℃에서 0.1 M 인산염 pH 7.0에 대해 투석하고, 20,000×g로 30분 동안 원심분리하여, 실온에서 36 내지 48시간 동안 형성되고 사전 평형화된 임의의 침전물을 제거하고, 20 S 디스크 형성을 가능하게 한다. 이어서 이를 48:1 비로 시험관내 전사된 RNA와 공동-인큐베이션시키고 실온에서 밤새 인큐베이션시켜 RNA의 캡시드화를 가능하게 한다. RNA 캡시드화 프로세스는 310 nm에서 흡광도의 증가에 의해 나타나며, 이는 Thermo Fisher Scientific NanoDropTM 마이크로볼륨 분광광도계로 모니터링할 수 있다.
이어서 캡시드화된 위성을 PEG 침전을 통해 테프젤 튜빙(tefzel tubing) 상에 직접 침적(deposit)시키거나(Smith ML, Corbo T, Bernales J, et al. (2007) Assembly of trans-encapsidated recombinant viral vectors engineered from Tobacco mosaic virus and Semliki Forest virus and their evaluation as immunogens. Virology 358:321-333), 공개된 프로토콜에 따라 먼저 6 나노몰 금 나노입자와 회합시킨 다음(Khan AA, Fox EK,
Figure pct00006
, et al. (2013) pH Control of the Electrostatic Binding of Gold and Iron Oxide Nanoparticles to Tobacco Mosaic Virus. Langmuir 29:2094-2098), Bio-Rad Helios 유전자 총 매뉴얼 내의 침적을 위한 공개된 프로토콜에 따라 테프젤 튜빙 상에 침적시킬 수 있다. 이어서 이 튜빙을 사용하여 100 psi 압력으로 설정된 Bio-Rad Helios 유전자 총을 이용한 페퍼 식물의 확장된 잎 조직 내로의 캡시드화된 위성 RNA의 바이오리스틱 전달을 위한 카트리지를 조립한다.
실시예 12. 진균 섀시에서의 캡시드화된 엔도르나바이러스 위성 생산
스키조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)(분열 효모) 생산 섀시에서 엔도르나바이러스 위성을 생성하기 위해, 발현 플라스미드를 S. 폼베로부터의 애드 프로모터 및 액틴 종결자를 갖는 벡터(pMB332)를 기반으로 설계한다(
Figure pct00007
, Michael, and Oskar
Figure pct00008
. "New expression vectors for the fission yeast Schizosaccharomyces pombe." FEBS letters 248.1-2 (1989): 105-110.)9. 이 플라스미드는 실시예 6에 이전에 기재된 엔도르나바이러스 위성 및 담배 모자이크 바이러스(TMV) 외피 단백질에 대한 발현 카세트를 인코딩한다. 공개된 프로토콜에 따라 이 플라스미드를 사용하여 S. 폼베를 형질전환하고, 생성된 균주를 컨플루언시(confluency)까지 성장시키고 세포에서 엔도르나바이러스 위성 RNA 및 TMV 외피 단백질을 생산하도록 유도한다. 위성 RNA는 세포내로 TMV 외피 단백질에 의해 캡시드화되어, 캡시드화된 입자를 생성한다. 이어서 이들 입자를 PEG 침전 프로토콜에 따라 세포의 용해를 통해 단리한다(Mueller, A., Kadri, A., Jeske, H., and Wege, C. (2010). In vitro assembly of Tobacco mosaic virus coat protein variants derived from fission yeast expression clones or plants. J Virol Methods 166, 77-85). 이어서, 단리된 캡시드화된 RNA 또는 미정제 용해물을 공개된 프로토콜에 따라 2 내지 3주령 페퍼 식물의 잎 표면 상에 변형된 에어 브러시를 사용하여 약 8 bar 압력으로 분무함으로써 식물에 전달한다(Dalakouras, A., Wassenegger, M., McMillan, J. N., Cardoza, V., Maegele, I., Dadami, E., et al. (2016). Induction of Silencing in Plants by High-Pressure Spraying of In vitro-Synthesized Small RNAs. Front Plant Sci 07, 1327).
실시예 13. 박테리아 섀시에서의 캡시드화된 엔도르나바이러스 위성 생산
에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)생산 섀시에서 엔도르나바이러스 위성을 생성하기 위해, 발현 플라스미드를 T7 프로모터 및 T7 종결자를 갖는 높은 카피 pUC 벡터를 기반으로 설계한다. 이 플라스미드는 실시예 6에 이전에 기재된 엔도르나바이러스 위성에 대한 발현 카세트를 인코딩한다. 공개된 프로토콜에 따라 이 플라스미드를 사용하여 E. 콜라이를 형질전환하였고, 생성된 균주를 컨플루언시까지 성장시킨 후 용해시켰다. 위성 RNA를 3% 우레아 PAGE 겔로부터 절제를 통해 단리하였다. 또한 미정제 용해물을 직접 사용할 수 있다.
위성 RNA를 실시예 11에 기재된 바와 같이 TMV에 감염된 식물로부터 단리된 TMV 외피 단백질로 코팅하였다. 이어서 이들 캡시드화된 RNA를 공개된 PEG 침전 프로토콜에 의해 단리하였다(Mueller, A., Kadri, A., Jeske, H., and Wege, C. (2010). In vitro assembly of Tobacco mosaic virus coat protein variants derived from fission yeast expression clones or plants. J Virol Methods 166, 77-85). 이어서, 단리된 캡시드화된 RNA를 공개된 프로토콜에 따라 2 내지 3주령 페퍼 식물의 잎 표면 상에 변형된 에어 브러시를 사용하여 약 8 bar 압력으로 분무함으로써 식물에 전달하였다(Dalakouras, A., Wassenegger, M., McMillan, J. N., Cardoza, V., Maegele, I., Dadami, E., et al. (2016). Induction of Silencing in Plants by High-Pressure Spraying of In vitro-Synthesized Small RNAs. Front Plant Sci 07, 1327).
실시예 14. 곤충 세포 섀시에서의 캡시드화된 엔도르나바이러스 위성 생산
스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포 배양물에서 엔도르나바이러스 위성을 생성하기 위해, OpIE1 프로모터 및 IE1종결자를 갖는 pFastBac 공여자 플라스미드를 설계한다. 이 플라스미드는 실시예 6에 이전에 기재된 엔도르나바이러스 위성에 대한 발현 카세트를 인코딩한다. 스포도프테라 프루기페르다 SF9 또는 SF21 세포를 셀펙틴(CELLFECTIN) 시약(ThermoFisher, USA) 및 이 플라스미드로 공동 형질감염시킨다. RNA를 수집하기 전에 SF9 또는 SF21 세포를 단층 또는 현탁액에서 배양한다. 이어서 위성 RNA를 3% 우레아 PAGE 겔로부터 절제를 통해 단리한다. 또한 미정제 용해물을 직접 사용할 수 있다.
이어서 위성 RNA를 실시예 11에 기재된 바와 같이 TMV에 감염된 식물로부터 단리된 TMV 외피 단백질로 코팅한다. 이들 캡시드화된 RNA를 표준 PEG 침전 프로토콜에 따라 단리한다(Mueller, A., Kadri, A., Jeske, H., and Wege, C. (2010). In vitro assembly of Tobacco mosaic virus coat protein variants derived from fission yeast expression clones or plants. J Virol Methods 166, 77-85. (2010)). 단리된 캡시드화된 RNA를 공개된 프로토콜에 따라 2 내지 3주령 페퍼 식물의 잎 표면 상에 변형된 에어 브러시를 사용하여 약 8 bar 압력으로 분무함으로써 식물에 전달한다(Dalakouras, A., Wassenegger, M., McMillan, J. N., Cardoza, V., Maegele, I., Dadami, E., et al. (2016). Induction of Silencing in Plants by High-Pressure Spraying of In vitro-Synthesized Small RNAs. Front Plant Sci 07, 1327).
실시예 15. 페퍼 식물에서의 항-보트리티스 카고 RNA의 수직 전파
본 실시예는 유전자도입을 필요로 하지 않으면서 진균 저항성 생식질을 생성하기 위해 엔도르나바이러스 위성이 사용될 수 있는 방법을 보여준다.
다음 작제물(5'에서 3'으로 나열됨)을 인코딩하는 시험관내 전사된 RNA 분자를 12개의 "Ace F1" 잡종 페퍼 식물의 잎 내로 탄도적으로(ballistically) 전달하였다(도 15): (보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea) 유전자 DCL1 및 DCL2를 표적화하는 dsRNA를 인코딩하는 카고 RNA를 운반하는 작제물 1) 5'UTR_226bp-BcDCL1_dsRNA-BcDCL2_dsRNA-ZmHSP101_IRES-TMVMP-Ile-3'UTR_113bp_w_PolyC_tail(서열번호 578); (박테리아 및 진균 병원체 감염에 대한 저항성을 강화하는 이종 병원성 관련(PR) 단백질, 파낙스 진셍(Panax ginseng) 병원성 관련 단백질 패밀리 10 유전자, "PgPR10"을 인코딩하는 카고 RNA를 운반하는 작제물 2) 5'UTR_226bp-HCRSV_IRES-PgPR10_1-ZmHSP101_IRES-TMVMP-Ile-3'UTR_113bp_w_PolyC_tail(서열번호 579).
이들 분자의 전신 이동성 및 지속성을 전신 조직(처리 부위의 원위에 있는 식물의 부분으로부터 취한 조직 샘플)에서 RT-PCR을 사용하여 이들 식물 전체에 걸쳐 추가로 입증하였다. 이어서 식물을 성숙할 때까지 성장시키고 이의 과일을 수확하였다. 페퍼 과일의 과피를 전달된 RNA의 존재에 대해 RT-PCR을 사용하여 스크리닝하였으며, 검정된 모든 과일의 32%가 양성이었다.
이들 식물의 RT-PCR 양성 숙과로부터 종자를 수집하고, 춘화처리한 다음, 토양에 심었다. 이어서 이들 2세대 묘목으로부터 자엽을 수집하고 개별 묘목으로부터 RNA를 추출하였다. 8개의 묘목으로부터의 RNA가 조합된 풀링 스크리닝 전략을 사용하였으며, RT-PCR을 사용하여 이러한 조직에서 전달된 RNA 분자의 존재를 찾았다. 12개 풀링 그룹 중 4개에서 양성 신호가 관찰되었다. 이들 4개의 양성 풀링 그룹 중 2개에서 8개 개체 각각을 RT-PCR로 분석하여 풀당 1개의 양성 개체를 식별하였다. 따라서, 이들 결과는 적어도 1/24(즉, 약 4%)의 수직 전파율을 나타낸다.
수직 전파에 성공한 2개의 2세대 식물을 성숙할 때까지 성장시켰다. 여기서 RNA 위성에서 항진균 카고는 바이러스 독력의 감소를 야기해야 한다. 이들 식물로부터의 잎을 수확하고 야생형 식물로부터의 잎을 대조군으로 사용하여 보트리티스 시험감염 검정(botrytis challenge assay)을 수행하는 데 사용하였다. 야생형 대조군 식물의 잎과 비교하여 양성 수직 전파가 있는 2세대 식물의 절단엽에서 보트리티스 감염(절단엽 상의 진균 병변의 크기 및 중증도)의 유의한 감소가 관찰되었다. 또한, RT-PCR은 양성 수직 전파가 있는 2세대 식물에서 위성 PgPR10 폴리펩티드 인코딩 카고 RNA의 존재를 확인하였다. 도 15에 도시된 바와 같이 작제물 1(COM1) 또는 작제물 2(COM2)의 전신 분포를 갖는 대조군 페퍼 식물 및 2세대 페퍼 식물의 절단엽에 시험감염시킨 결과를 도 16에 나타낸다. 작제물 1(COM1) 또는 작제물 2(COM2)의 전신 분포를 갖는 2세대 식물의 절단엽에서 보트리티스 감염에 대한 저항성이 관찰되었다.
실시예 16. 벼 엔도르나바이러스 서열의 식별
본 실시예에는 벼(오리자 사티바) 엔도르나바이러스 서열의 식별 및 이러한 서열로부터 유래된 합성 엔도르나바이러스 위성의 구현예가 기재되어 있다. 본 실시예에는 벼 엔도르나바이러스 게놈 서열과의 상동성에 의해 식별된 존슨그래스(Johnsongrass)(소르굼 할레펜세(Sorghum halepense))로부터의 엔도르나바이러스 서열이 추가로 기재되어 있다.
생어 시퀀싱을 사용하여 벼(오리자 사티바) 품종 M-102 및 Colusa로부터 추정 엔도르나바이러스 RdRP 서열을 얻었고, 이들로부터 컨센서스(consensus) 오리자 사티바 엔도르나바이러스 RdRP 부분 서열(서열번호 455) 및 아미노산 서열(서열번호 456)을 식별하였다. 벼 품종으로부터 식별된 추가 서열은 오리자 사티바 Colusa 엔도르나바이러스 RdRP 단편(서열번호 457), 엔도르나바이러스 폴리단백질에서 고도로 보존된 비-RdRP 도메인으로 식별된 오리자 사티바 M-102 엔도르나바이러스 서열(서열번호 458), 및 오리자 사티바 M102 엔도르나바이러스 RdRP 단편(서열번호 459)을 포함하였다. 추가적인 NGS 시퀀싱을 통해 벼 품종 M-102로부터 추정 오리자 사티바 엔도르나바이러스 게놈(서열번호 460)을 식별하였다.
구현예에서, 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA는 이 신규한 오리자 사티바 M-102 엔도르나바이러스 게놈의 5' 말단 영역 및 3' 말단 영역을 각각 포함하거나 그로부터 유래된 5' 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하고, 5' 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스 RdRP(예를 들어, 동족 오리자 사티바 엔도르나바이러스 RdRP)에 의한 인식 및 복제를 허용한다. 이러한 구현예는, 예를 들어 오리자 사티바 M-102 엔도르나바이러스 게놈의 5' 또는 3' 말단 영역에 위치하는 적어도 50개, 적어도 100개, 적어도 150개, 적어도 200개, 적어도 250개, 적어도 300개, 적어도 350개, 적어도 400개, 적어도 450개, 또는 적어도 500개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 레플리카제 인식 서열을 포함한다. 다른 구현예는 길이가 적어도 30개 뉴클레오티드(예를 들어, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 또는 적어도 100개 뉴클레오티드)이고, 오리자 사티바 M-102 엔도르나바이러스 게놈의 가장 5'측 또는 가장 3'측 500개 뉴클레오티드 내에 위치하는 등가 길이의 세그먼트와 적어도 80%(예를 들어, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%) 서열 동일성을 갖는 레플리카제 인식 서열을 포함한다.
공개적으로 이용 가능한 NCBI 뉴클레오티드 데이터베이스에 대한 오리자 사티바 M-102 엔도르나바이러스 게놈(서열번호 460)의 BLAST 검색은 존슨그래스(소르굼 할레펜세)의 풀잎으로부터 단리된 2개의 추정 엔도르나바이러스 서열을 포함하는 다수의 히트를 산출하였다. 제1 소르굼 할레펜세 엔도르나바이러스(NCBI 수탁 MW756210.1)는 서열번호 461의 서열을 갖고, 하기 유전 요소를 포함하였다: (a) 5'UTR(뉴클레오티드 1 내지 159); (b) 헬리카제(뉴클레오티드 4684 내지 5433), 협막다당 합성 단백질(뉴클레오티드 8476 내지 8913), 글리코실 트랜스퍼라제(뉴클레오티드 9412 내지 10425), 및 RdRP(뉴클레오티드 12685 내지 13590)를 포함하는 폴리단백질(뉴클레오티드 160 내지 13881); 및 (c) 3' UTR(뉴클레오티드 13882 내지 13959); 인코딩된 폴리단백질은 서열번호 462의 아미노산 서열을 갖는다.
제2 소르굼 할레펜세 엔도르나바이러스(NCBI 수탁 MW756211.1)는 서열번호 463의 등가 RNA 서열을 갖고, 하기 유전 요소를 포함하였다: (a) 5'UTR(뉴클레오티드 1 내지 159); (b) 헬리카제(뉴클레오티드 4684 내지 5433), 협막다당 합성 단백질(뉴클레오티드 8476 내지 8913), 글리코실 트랜스퍼라제(뉴클레오티드 9412 내지 10425), 및 RdRP(뉴클레오티드 12616 내지 13608)를 포함하는 폴리단백질(뉴클레오티드 160 내지 13881); 및 (c) 3' UTR(뉴클레오티드 13882 내지 13950); 인코딩된 폴리단백질은 서열번호 464의 아미노산 서열을 갖는다.
구현예에서, 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA는 본 실시예에 개시된 두 가지와 같은 소르굼 할레펜세 엔도르나바이러스 게놈의 5' 말단 영역 및 3' 말단 영역을 각각 포함하거나 그로부터 유래된 5' 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하고, 5' 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스 RdRP(예를 들어, 동족 소르굼 할레펜세 엔도르나바이러스 RdRP)에 의한 인식 및 복제를 허용한다. 이러한 구현예는, 예를 들어 소르굼 할레펜세 엔도르나바이러스 게놈의 5' 또는 3' 말단 영역에 위치하는 적어도 50개, 적어도 100개, 적어도 150개, 적어도 200개, 적어도 250개, 적어도 300개, 적어도 350개, 적어도 400개, 적어도 450개, 또는 적어도 500개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 레플리카제 인식 서열을 포함한다. 다른 구현예는 길이가 적어도 30개 뉴클레오티드(예를 들어, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 또는 적어도 100개 뉴클레오티드)이고, 소르굼 할레펜세 엔도르나바이러스 게놈의 가장 5'측 또는 가장 3'측 500개 뉴클레오티드 내에 위치하는 등가 길이의 세그먼트와 적어도 80%(예를 들어, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%) 서열 동일성을 갖는 레플리카제 인식 서열을 포함한다.
실시예 17. 토마토 엔도르나바이러스 서열의 식별
본 실시예에는 토마토 엔도르나바이러스 서열의 식별 및 이러한 서열로부터 유래된 합성 엔도르나바이러스 위성의 작제가 기재되어 있다. NGS 시퀀싱을 통해 토마토(솔라눔 리코페르시쿰) 품종 "루트거스(Rutgers)" 및 "얼리 걸(Early Girl)"(F1 잡종)로부터 추정 솔라눔 리코페르시쿰 엔도르나바이러스 서열을 식별하였다. 루트거스 토마토로부터 식별된 엔도르나바이러스 5' UTR 서열은 서열번호 465의 서열을 포함하였고, 이는 특히 서열번호 466의 서열을 갖는 세그먼트를 포함하며, 이는 벨 페퍼 엔도르나바이러스(BPEV) 게놈의 세그먼트와 100% 서열 동일성을 갖는다. 루트거스 토마토로부터 식별된 엔도르나바이러스 3' UTR 서열은 서열번호 467의 서열을 가졌다. 루트거스 토마토로부터 식별된 엔도르나바이러스 RdRP 서열은 서열번호 468의 서열을 가졌다. 얼리 걸(F1) 토마토로부터 식별된 엔도르나바이러스 RdRP 서열은 서열번호 469의 서열을 가졌다.
구현예에서, 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA는 솔라눔 리코페르시쿰 엔도르나바이러스 게놈의 5' 말단 영역 및 3' 말단 영역을 각각 포함하거나 그로부터 유래된 5' 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하고, 5' 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스 RdRP(예를 들어, 동족 솔라눔 리코페르시쿰 엔도르나바이러스 RdRP)에 의한 인식 및 복제를 허용한다. 이러한 구현예는, 예를 들어 솔라눔 리코페르시쿰 엔도르나바이러스 게놈의 5' 또는 3' 말단 영역에 위치하는 적어도 50개, 적어도 100개, 적어도 150개, 적어도 200개, 적어도 250개, 적어도 300개, 적어도 350개, 적어도 400개, 적어도 450개, 또는 적어도 500개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 레플리카제 인식 서열을 포함한다. 다른 구현예는 길이가 적어도 30개 뉴클레오티드(예를 들어, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 또는 적어도 100개 뉴클레오티드)이고, 솔라눔 리코페르시쿰 엔도르나바이러스 게놈의 가장 5'측 또는 가장 3'측 500개 뉴클레오티드 내에 위치하는 등가 길이의 세그먼트와 적어도 80%(예를 들어, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%) 서열 동일성을 갖는 레플리카제 인식 서열을 포함한다.
실시예 18: 캡시드화된 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA의 안정성
본 실시예에는, 예를 들어 이종 또는 비동족 바이러스 외피 단백질로 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 캡시드화함으로써 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA와 단백질을 회합시키거나 복합체화하는 것이 기재되어 있다. 본 실시예에는 또한 단백질 회합된 엔도르나바이러스 위성 RNA 분자의 안정성을 결정하는 방법이 예시되어 있다.
합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 인코딩하는 DNA 작제물을 다음과 같이 설계하였다. DNA 작제물 "F53"(pT7-5UTR_226bp-ZmHSP101_IRES-Luc-ZmHSP101_IRES-PMMoVMP-FT-TMVOAS-3UTR_113bp_w_PolyC_tail, 서열번호 470) 및 DNA 작제물 "F54"(pT7-5UTR_226bp-ZmHSP101_IRES-Luc-ZmHSP101_IRES-TMVMP-Ile-3UTR_113bp_w_PolyC_tail, 서열번호 471) 둘 모두는 5'에서 3' 배향으로 226개 염기쌍의 5' 레플리카제 인식 서열을 인코딩하는 RNA에 작동 가능하게 연결된 T7 프로모터, 및 113개 염기쌍의 3' 레플리카제 인식 서열을 인코딩하는 RNA를 포함하였으며, 5' 및 3' 레플리카제 인식 서열은 루시퍼라제(Luc)를 인코딩하는 mRNA 서열을 포함하는 카고 RNA에 측접하였다. 유사하게 루시퍼라제를 인코딩하는 mRNA 서열에 작동 가능하게 연결된 T7 프로모터를 포함하는 DNA 작제물 "F52"(pT7-kozac-Luc, 서열번호 472)도 전사하였다.
RNA 샘플을 작제물 F52, F53 및 F54의 시험관내 전사에 의해 생성하였다. 생성된 RNA 샘플을 단리된 담배 모자이크 바이러스 외피 단백질(TMV CP)과 함께 밤새 인큐베이션시켰다. TMV CP-인큐베이션된 RNA 샘플을 RNase I로 섭씨 37도에서 15분 동안 처리한 후, 효소 열 불활성화를 섭씨 70도에서 20분 동안 행하고, 이어서 프로테이나제 K로 섭씨 42도에서 1시간 동안 처리하였다. 샘플로부터 RNA를 추출하고, 1% 아가로스 TBE 겔 상에 로딩하고, 110 V에서 30분간 실행하고, 에티듐 브로마이드 염색으로 시각화하였다. F52 RNA는 TMV OAS를 결여하고 그에 따라 TMV CP에 의한 캡시드화가 불가능했기 때문에 음성 대조군으로서의 역할을 하였다. TMV 게놈 RNA는 그의 동족 외피 단백질에 의해 캡시드화된 양성 대조군으로서의 역할을 하였다. TMV OAS를 함유하고 TMV CP로 처리된 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA는 짐작건대 TMV CP에 의한 캡시드화에 의해 RNase I에 의한 분해로부터 보호되었다. TMV OAS를 결여한 비캡시드화된 RNA를 RNase I에 의해 분해하였다. 이는 단백질과 복합체화되는, 예를 들어 TMV CP와 같은 바이러스 외피 단백질에 의해 캡시드화되는 엔도르나바이러스 위성 RNA가 TMV CP와 같은 단백질과 복합체화되지 않는 RNA(엔도르나바이러스 위성 RNA를 포함함)와 비교하여 시험관내에서 리보뉴클레아제 분해로부터 보호되고 개선된 안정성을 나타냄을 입증하였다.
별도로, 이종 바이러스 외피 단백질에 의한 엔도르나바이러스 위성 RNA의 캡시드화를 식물내 안정성 실험에서 테스트하였다. F53 및 F54 엔도르나바이러스 위성 RNA뿐만 아니라 음성 대조군 F52 RNA의 샘플을 0.1 M 인산염 완충액에서 제조하고, 단리된 담배 모자이크 바이러스 외피 단백질(TMV CP)과 함께 밤새 인큐베이션시켰다. 이어서 샘플을 1:10으로 희석하고 Silwet L-77을 0.05%로 첨가하고 RNA 제제를 벨 페퍼(캡시쿰 안눔, "Ace" F1) 잎 상에 마찰접종함으로써 시용하였다. 잎 샘플을 RNA 시용 후 주기적으로 수집하였다. 테스트 RNA 작제물로부터 안티센스 Dig-표지 프로브를 생성하였으며 잎 샘플로부터 얻어진 RNA로부터 제조된 노던 블롯을 프로브하는 데 사용하였다. 노던 블롯 결과는 TMV CP-캡시드화된 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA가 잎에서 적어도 5일 동안 안정하다는 것을 나타냈다.
실시예 19: 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA
본 실시예에는, 예를 들어 해충(예컨대 곤충)의 방제를 초래하거나, 미생물 병원체(예컨대 진균 또는 박테리아 병원체)의 방제를 초래하거나, 선택 방법(예를 들어, 제초제와 같은 선택 제제에 대한 저항성을 초래함으로써)을 제공하는 하나 이상의 기능을 갖는 카고 RNA를 운반하는 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA의 비제한적 예가 예시되어 있다. 다양한 구현예에서, 카고 RNA는 코딩 서열(들), 비코딩 서열(들), 또는 코딩 서열과 비코딩 서열 둘 모두를 포함한다. 본 실시예에서 카고 RNA는 벨 페퍼(캡시쿰 안눔) 엔도르나바이러스("BPEV") 게놈을 기반으로 하는 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA에 운반되고 동족 BPEV RdRP에 의해 증폭될 것으로 예상될 것이며; 당업자는 유사한 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA가 대안적 엔도르나바이러스와 함께(즉, 대안적 엔도르나바이러스 RDRP와 함께) 기능하도록 설계될 수 있음을 인식할 것이다.
일 실시예에서, 항진균 카고 RNA를 운반하는 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 벨 페퍼 엔도르나바이러스에 대한 5' 및 3' 레플리카제 인식 서열(서열번호 580 및 581)을 포함하도록 설계하였으며, 3242개 뉴클레오티드를 포함하였다(서열번호 473). 이 작제물의 성분은 표 16에 제공된다.
[표 16]
다른 실시예에서, 이중 작용 방식 살충 카고 RNA를 운반하는 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA(콜로라도 감자잎벌레, 렙티노타르사 데셈리네아타(Leptinotarsa decemlineata)의 필수 유전자를 표적화하는 비코딩 dsRNA 서열, 및 바실러스 투링기엔시스 살충 단백질 Cry3a에 대한 코딩 서열을 포함함)를 벨 페퍼 엔도르나바이러스에 대한 5' 및 3' 레플리카제 인식 서열(각각 서열번호 580 및 581)을 포함하도록 설계하였으며, 4004개 뉴클레오티드를 포함하였다(서열번호 474). 이 작제물의 성분은 표 17에 제공된다.
[표 17]
다른 실시예에서, 다중유전자 카고 RNA를 운반하는 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA(파밤나방("BAW", 스포도프테라 엑시구아(Spodoptera exigua))을 표적화하는 다수의 비코딩 dsRNA 서열, 및 진균 보트리티스 시네레아를 표적화하는 다수의 비코딩 dsRNA 서열을 포함함)를 벨 페퍼 엔도르나바이러스에 대한 5' 및 3' 레플리카제 인식 서열(각각 서열번호 580 및 581)을 포함하도록 설계하였으며, 3034개 뉴클레오티드를 포함하였다(서열번호 475). 이 작제물의 성분은 표 18에 제공된다.
[표 18]
다른 실시예에서, 카고 RNA를 운반하는 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA(제초제 글리포세이트에 대한 저항성을 제공하는 EPSPS 단백질을 인코딩하는 RNA를 포함함)를 벨 페퍼 엔도르나바이러스에 대한 5' 및 3' 레플리카제 인식 서열(각각 서열번호 580 및 581)을 포함하도록 설계하였으며, 3119개 뉴클레오티드를 포함하였다(서열번호 476). 이 작제물의 성분은 표 19에 제공된다.
[표 19]
실시예 20: 제초제 저항성 단백질을 인코딩하는 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA
본 실시예에는 위성 RNA를 함유하는 세포 또는 조직 또는 식물의 식별 및 선택을 가능하게 하는, 선택 가능한 마커를 운반하는 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA의 사용이 예시되어 있다. 보다 구체적으로, 본 실시예에는 엔도르나바이러스 위성 RNA를 함유하는 세포, 조직 또는 식물을 식별하는 데, 선택 가능한 제초제 저항성 마커(글루포시네이트 저항성을 제공하는 단백질) 및 제초제 선택 제제(글루포시네이트) 조합을 사용하는 것이 예시되어 있다. 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 사용하여 제초제 저항성 단백질을 인코딩하는 카고 RNA를 전달한다. 상응하는 제초제에 대한 노출과 조합된, 식물, 또는 식물 세포, 조직, 또는 캘러스에서 제초제 저항성 단백질의 발현은 식물(또는 식물 세포, 조직, 또는 캘러스)의 집단으로부터 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 함유하는 식물(또는 식물 세포, 조직, 또는 캘러스)을 식별 및/또는 선택하는 방법을 제공한다. 이러한 비제한적 예에서 카고 RNA는 벨 페퍼(캡시쿰 안눔) 엔도르나바이러스("BPEV") 게놈을 기반으로 하는 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA에 운반되고 동족 BPEV RdRP에 의해 증폭될 것으로 예상될 것이며; 당업자는 유사한 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA가 대안적 엔도르나바이러스와 함께(즉, 대안적 엔도르나바이러스 RDRP와 함께), 예를 들어 상이한 식물 종의 내인성 엔도르나바이러스와 함께 기능하도록 설계될 수 있음을 인식할 것이다.
비특이적 제초제 글루포시네이트(예를 들어, BASF에 의해 "Basta®"로 판매되는 글루포시네이트-암모늄 제형)는 효소 글루타민 합성효소를 저해하는데, 이는 광합성의 실패를 포함하여 식물 대사의 다수의 방해를 통해 식물 사멸을 야기한다. 처리된 식물은 일반적으로 글루포시네이트 시용 후 1일 이내에 성장을 멈추고, 이어서 약 2주 후에 사멸한다. 비알라포스 저항성(bar) 또는 포스피노트리신 아실 트랜스퍼라제(pat) 효소를 발현시키는 트랜스제닉 식물은 글루포시네이트에 대해 저항성이다. 대안적인 접근법에서, 식물 전체에 걸쳐 글루포시네이트 저항성을 제공하는 단백질(예를 들어, bar 또는 pat)을 인코딩하는 카고 RNA를 전달하기 위해 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 이용하였다.
카고 RNA를 운반하는 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA(비선택적 제초제 글루포시네이트에 대한 저항성을 제공하는 단백질을 인코딩하는 RNA를 포함함)를 벨 페퍼 엔도르나바이러스에 대한 5' 및 3' 레플리카제 인식 서열(각각 서열번호 580 및 581)을 포함하도록 설계하였으며, 2090개 뉴클레오티드를 포함하였다(서열번호 477). 이 작제물의 성분은 표 20에 제공된다.
[표 20]
식물을 통한 위성 RNA의 이동을 가능하게 하기 위해 TMV 이동 단백질 및 이소류신 tRNA 요소를 포함시켰다. 유전자 총을 사용하여 벨 페퍼(캡시쿰 안눔) Ace F1 잡종 식물의 잎 내로의, 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA의 바이오리스틱 전달을 행하였다. 처리 2주 후, 처리된 잎의 위쪽(n=5개의 잎)과 아래쪽(n=2개의 잎) 둘 모두의 잎 샘플을 취하고 RNA를 추출하였다. 카고 글루포시네이트 저항성 단백질의 존재를 검출하기 위한 정방향 프라이머(CATCGAGACAAGCACGGTCA, 서열번호 478) 및 역방향 프라이머(CCAGGGACTTCAGCAGATGG, 서열번호 479)를 사용하여 RNA 샘플을 증폭시켰다.
증폭된 RNA 샘플에 대해 노던 블롯 분석을 수행하였다. 처리된 잎 아래쪽의 두 잎 모두로부터 취한 RNA 샘플, 및 처리된 잎 위쪽의 5개의 잎 중 4개로부터 취한 RNA 샘플의 경우에는, 예측된 카고 RNA 앰플리콘에 상응하는 강한 밴드가 관찰되었으며, 처리된 잎의 위쪽으로 다섯 번째 잎으로부터의 RNA의 경우에는, 밴드가 약하기는 하지만 여전히 존재하는 것으로 관찰되었다. 이러한 결과는 카고 서열이 벨 페퍼 식물 전체에 걸쳐 증폭되고 전신적으로 분포되었음을 나타낸다.
선택 마커(본 실시예에서는 제초제 글루포시네이트에 대한 내성을 제공하는 단백질)의 제공은 엔도르나바이러스 위성 RNA를 함유하는 세포, 조직, 식물 부분, 온전한 식물 또는 번식체의 선택을 가능하게 한다. 예를 들어, 외식편 물질 또는 번식체(예를 들어, 잎 디스크, 종자, 배아 조직, 또는 뿌리 또는 축 또는 정단 분열 조직)는 엔도르나바이러스 위성 RNA가 도입된 식물로부터 취해질 수 있다(예를 들어 바이오리스틱 전달, 분무, 마찰접종 또는 주입에 의해). 이러한 외식편 또는 번식체는 선택 마커에 대한 저항성을 선택하는 조건(본 실시예에서는 제초제 글루포시네이트의 존재 하에서)에서 배양할 수 있다. 적절한 선택 압력 하에서 생존하는 외식편 또는 번식체는 선택 마커(본 실시예에서는 글루포시네이트 저항성 단백질), 및 짐작건대 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 함유할 것으로 예상된다. 이러한 방식으로, 세포, 조직, 식물 부분, 온전한 식물 또는 번식체에 대한 선택은 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA를 함유하는 식물 또는 번식체의 생산의 효율을 크게 증가시킬 것으로 예상된다.
본 실시예에서, 잎 디스크 외식편을 엔도르나바이러스 위성 RNA의 바이오리스틱 전달 후 2주째에 처리된 벨 페퍼 식물로부터 취하였다. 사용된 캘러스 유도 및 번식 프로토콜은 문헌[Kim and Lim (2019) Plant Signaling & Behav., 14:7, DOI: 10.1080/15592324.2019.1604016]에 의해 캡시쿰 안눔에 대해 설명된 것을 기반으로 하였다. 글루포시네이트(0.5 내지 8 mg/L) 선택 하에 잎 디스크 외식편을 캘러스 유도 배지(3% 수크로스, 2 mg/L의 6-벤질아미노퓨린, 및 1 mg/L의 알파-나프탈렌 아세트산을 함유하는 B5 배지)에 배치함으로써 캘러스 형성을 유도하였다. 배축 잎 표면보다는 향축 잎 표면으로부터 더 많은 캘러스가 형성된다는 것이 관찰되었다. 미세-캘러스를 잎 디스크로부터 분리하고 캘러스 증식을 위해 신선한 캘러스 유도 배지로 옮겼다. 이어서 캘러스를 묘조 성장 및 발달을 위해 묘조 유도 배지(3% 수크로스, 2 mg/L의 6-벤질아미노퓨린, 500 mg/L의 2-모르폴리노에탄설폰산 및 1.5 mg/L의 알파-나프탈렌 아세트산을 함유하는 B5 배지)로 옮긴다. 글루포시네이트 선택은 엔도르나바이러스 위성 RNA를 함유하는 외식편의 백분율을 증가시킬 것으로 예상된다.
실시예 21: 변형된 5' 레플리카제 인식 서열을 포함하는 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA
본 실시예에는 엔도르나바이러스 위성 RNA 설계의 변형이 예시되어 있고, 5' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스 게놈에서의 내인성 "닉"까지 및/또는 이를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고/하거나 예측된 폴리단백질 코딩 영역 내로 연장되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
구현예에서, 더 길거나(예를 들어, 적어도 400개, 적어도 500개, 적어도 600개, 적어도 700개, 적어도 800개, 적어도 900개, 또는 적어도 1000개 뉴클레오티드) 연장된 5' 레플리카제 인식 서열을 포함하는 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA는 더 짧은(예를 들어, 약 225개 뉴클레오티드 또는 약 300개 미만의 뉴클레오티드 또는 약 400개 미만의 뉴클레오티드) 5' 레플리카제 인식 서열을 갖는 위성 RNA보다 그들의 동족 엔도르나바이러스 RdRP에 의해 더 효율적으로 복제된다.
비제한적 예에서, 합성 벨 페퍼 엔도르나바이러스(BPEV) 위성 RNA를 인코딩하는 DNA 작제물은 내인성 "닉"의 위치(BPEV 게놈에서의 뉴클레오티드 위치 880)를 포함할 뿐만 아니라 폴리단백질 코딩 영역 내로 연장되는 1069개 뉴클레오티드 길이의 연장된 5' 레플리카제 인식 서열을 포함하였으며; 폴리단백질 시작 코돈을 제거하기 위해 뉴클레오티드 변화가 이루어졌다. 이 엔도르나바이러스 위성 RNA는 다중유전자 카고 RNA(내인성 캡시쿰 안눔 피토엔 디새튜라제(PDS) 유전자를 표적화하는 비코딩 dsRNA, 및 콜로라도 감자잎벌레, 렙티노타르사 데셈리네아타를 표적화하는 비코딩 dsRNA를 포함함)를 포함하였다. 엔도르나바이러스 위성 RNA를 인코딩하는 DNA 작제물은 2906개 뉴클레오티드를 포함하였다(서열번호 480). 이 작제물의 성분은 표 21에 제공된다.
[표 21]
캡시쿰 안눔 PDS dsRNA는 선택 가능한 마커로서의 역할을 하며(예를 들어 실시예 20 참조), 이 경우 이는 PDS dsRNA가 발현되는 표백 표현형을 생산할 것으로 예상된다. 표백 표현형은 엔도르나바이러스 위성 RNA의 전신 이동에 대한 시각적 마커로서 유용하며, 추가로 위성 RNA를 함유하는 세포 또는 조직 또는 식물의 식별 및 선택에 유용하다.
실시예 22: 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA 카고 dsRNA 서열의 항진균 활성
본 실시예에는 중요한 식물 병원체인 보트리티스 시네레아 진균의 성장을 저해하도록 설계된 카고 RNA 서열의 예비 시험관내 테스트가 기재되어 있다. 기재된 검정은 활성 항진균 분자(예를 들어, 특정 표적 유전자의 억제를 위한 dsRNA, 또는 항진균 활성을 갖는 폴리펩티드)를 선택하는 데 이용할 수 있으며, 이는 엔도르나바이러스 위성 카고로서 인코딩 및 전달할 수 있다.
레자주린 염료(PrestoBlue® 세포 생존력 시약, ThermoScientific 카탈로그 번호 A13261) 비색 검정을 사용하여 항진균 활성을 평가하였다. PrestoBlue® 염료는 살아있는 세포 내 세포 환원효소에 의해 형광 유도체로 환원되는 세포 투과성 정량적 세포 생존력 지표이다. 일반적인 프로토콜은 다음과 같다. 보트리티스 시네레아의 분생포자(균주 bc1)를 2주령 사부로드 말토스 한천(Sabouraud Maltose Agar, SMA) 배양물로부터 단리하고, 10% 포도 주스에 현탁하고, 3000개의 분생포자를 함유하는 5 마이크로리터 분취량을 96-웰 플레이트의 웰 내로 옮겼으며, 각 웰은 50 마이크로리터/웰의 최종 부피에 대해 25 마이크로리터의 1% 사부로드 말토스 브로스(Sabouraud Maltose Broth, SMB), 15 마이크로리터의 증류수, 및 5 마이크로리터의 테스트 용액(또는 음성 대조군으로서 뉴클레아제가 없는 물)을 추가로 함유하였다. 상업적 살진균제인 캡탄(1:20으로 희석)을 양성 대조군으로 사용한다. 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고 진탕기(100 rpm)에서 섭씨 23도에서 24시간 인큐베이션시킨다. 포자 발아를 현미경으로 평가한 후 레자주린 처리를 행하였다. 10 마이크로리터 PrestoBlue™ 세포 생존력 시약(ThermoScientific Cat # A13261) 및 40 마이크로리터의 SMB를 웰마다 첨가하고 플레이트를 진탕기에서 12 내지 15시간 동안 추가로 인큐베이션시켰다. 웰의 색상 변화를 이미징에 의해 기록하였으며 형광을 560 nm의 여기 파장 및 600 nm의 방출 파장으로 측정하였다.
이중 가닥 RNA를 실시예 19의 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA로부터 선택된 PCR 앰플리콘의 시험관내 전사에 의해 합성하였다. dsRNA를 정제하고, 섭씨 70도에서 10분간 변성시킨 후, 테스트 전 실온에서 5분간 인큐베이션시켜 어닐링하였다.
dsRNA는 (1) 보트리티스 시네레아 DCL1&2 dsRNA, (2) 콜로라도 감자잎벌레(렙티노타르사 데셈리네아타), 파밤나방(스포도프테라 엑시구아) 및 보트리티스 시네레아를 개별적으로 표적화하는 dsRNA 서열을 포함하는 다중유전자 카고("MGC") dsRNA, 및 (3) 대조군 dsRNA로서 녹색 형광 단백질(GFP) dsRNA를 포함하였다.
하나의 실험에서, 테스트 제제와 함께 24시간 인큐베이션시킨 후 레자주린과 함께 17시간 인큐베이션시켰다. 보트리티스 시네레아 DCL1&2 dsRNA(10 마이크로그램/웰)는 B. 시네레아 분생포자 발아 및 성장을 억제하는 것으로 관찰되었다. 동일한 양(10 마이크로그램/웰)의 MGC dsRNA는 진균 성장을 저해하지 못하였으며, 이는 아마도 B. 시네레아 dsRNA 서열이 전체 dsRNA의 일부에 불과하기 때문일 수 있다. 테스트 제제와 함께 36시간 인큐베이션, 이어서 레자주린과 함께 15시간 인큐베이션시키는 것을 이용한 두 번째 실험에서도 유사한 결과가 관찰되었다. 그러나 보트리티스 시네레아 DCL1&2 dsRNA(10 마이크로그램/웰)를 이용하여 더 긴 시간(48 내지 63시간) 동안 인큐베이션시키는 것은 진균 성장을 억제하지 못하였다. 추가 실험에서, 더 높은 용량(20 마이크로그램/웰)의 MGC dsRNA와 함께 24시간 인큐베이션시킨 후 레자주린과 함께 17시간 인큐베이션시키는 것은 진균 성장의 저해를 초래하였다.
다른 실험에서, 10 또는 20 마이크로그램/웰의 MGC dsRNA로 15시간 동안 처리한 B. 시네레아 분생포자(2000/웰)의 현미경 이미지 분석에 의해 진균 성장의 지연을 평가하였다. dsRNA 처리 15일 후, 처리당 3개의 기술적 복제 웰을 이용하여 각 웰에서 적어도 10개의 필라멘트에 대해 균사 필라멘트 길이를 측정하였다. 블랭크(물) 대조군의 경우 평균 균사 길이는 195.7(SD = 4) 마이크로미터였고 GFP dsRNA(음성 대조군)로 처리된 웰의 경우 197.3(SD = 24.1) 마이크로미터였다. 진균 균사 길이의 용량 의존성 감소가 관찰되었으며, 평균 균사 길이는 15 마이크로그램/웰 처리의 경우 159.3(SD = 16.6) 마이크로미터였고, 20 마이크로그램/웰 처리의 경우 105.7(SD = 29.2) 마이크로미터였으며, 이는 MGC dsRNA가 적어도 더 높은 농도에서 진균 성장률을 감소시켰음을 나타낸다. 20 마이크로그램/웰의 MGC dsRNA와 함께 24시간 인큐베이션, 이어서 레자주린과 함께 15시간 인큐베이션시키는 것을 이용하여 레자주린 검정을 수행하였으며; 이러한 더 높은 용량의 MGC dsRNA는 진균 성장을 감소시키는 것으로 다시 관찰되었다.
이러한 결과는 레자주린 검정 및 균사 성장 측정을 이용하여 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA에 의해 카고로서 운반되는 dsRNA 서열의 활성을 평가할 수 있음을 나타낸다.
실시예 23: 강화된 발현을 위한 유전 요소를 포함하는 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA
본 실시예에는 발현을 강화하기 위한 유전 요소를 포함하는 엔도르나바이러스 위성 RNA의 구현예가 예시되어 있다. 코딩 서열(예를 들어, 메신저 RNA 서열)의 번역을 강화하는 발현 강화 요소는 "번역 인핸서"로 공지되어 있다. 본 개시내용의 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA와 함께 사용될 수 있는 번역 인핸서의 비제한적 예는 식물 바이러스 및 동물 바이러스로부터의 서열을 포함하며; 예를 들어, 문헌[Gallie et al. (1987) Nucleic Acids Res., 15:3257 - 3273; DOI:10.1093/nar/15.8.3257; Pfeiffer et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109_6626-6631; DOI: 10.1073/pnas.1204520109]을 참조한다.
비제한적 예에서, 합성 벨 페퍼 엔도르나바이러스(BPEV) 위성 RNA를 인코딩하는 DNA 작제물은 담배 모자이크 바이러스의 5' UTR로부터의 번역 인핸서 "오메가" 리더 서열을 포함하였으며(문헌[Gallie et al. (1987) Nucleic Acids Res., 15:3257 - 3273; DOI:10.1093/nar/15.8.3257] 참조), 이는 인접한 이종 카고 RNA 서열의 발현을 추가로 강화할 것으로 예상되며, 본 실시예에서는 "슈퍼폴더" 녹색 형광 단백질(sfGFP; 문헌[P
Figure pct00015
delacq et al. (2006) Nature Biotechnol., 24:79-88; DOI: 10.1038/nbt1172] 참조)에 대한 코딩 서열을 포함하였다. 엔도르나바이러스 위성 RNA를 인코딩하는 DNA 작제물은 2242개 뉴클레오티드를 포함하였다(서열번호 481). 이 작제물의 성분은 표 22에 제공된다.
[표 22]
다른 비제한적 예에서, 합성 벨 페퍼 엔도르나바이러스(BPEV) 위성 RNA를 인코딩하는 DNA 작제물은 인접한 이종 카고 RNA 서열의 발현을 강화하기 위해 담배 식각 바이러스(TEV) IRES를 포함하였으며, 본 실시예에서는 "슈퍼폴더" 녹색 형광 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하였다. 엔도르나바이러스 위성 RNA를 인코딩하는 DNA 작제물은 2330개 뉴클레오티드를 포함하였다(서열번호 482). 이 작제물의 성분은 표 23에 제공된다.
[표 23]
생물학적 서열의 목록
[표 1]
엔도르나바이러스 5' 및 3' UTR을 포함하는 엔도르나바이러스 5' 및 3' 레플리카제 인식 서열
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
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Figure pct00026
Figure pct00027
1 서열번호는 본원에 제공된 특정 재조합 RNA 분자에 존재하는 상응하는 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 분자에 상응한다.
[표 2]
바이러스 외피 단백질 및 조립 기점 서열
[표 3]
이동 단백질
[표 4]
tRNA 유사 서열
1 서열번호는 본원에 제공된 특정 재조합 RNA 분자에 존재하는 상응하는 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 분자에 상응한다.
[표 5]
IRES 서열
1 서열번호는 본원에 제공된 특정 재조합 RNA 분자에 존재하는 상응하는 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 분자에 상응한다.
[표 6]
인트론 서열
[표 7]
작제물 1 내지 11
[표 8]
5' 보존 모티프 1
[표 9]
5' 보존 모티프 2
[표 10]
5' 보존 모티프 3
[표 11]
3' 보존 모티프 1
[표 12]
3' 보존 모티프 2
[표 13]
3' 보존 모티프 3
[표 14]
엔도르나바이러스 RDRP
[표 15]
동일한 엔도르나바이러스로부터의 쌍을 이루는 엔도르나바이러스 5' 및 3' 레플리카제 인식 서열
1 서열번호는 본원에 제공된 특정 재조합 RNA 분자에 존재하는 상응하는 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 분자에 상응한다.
다른 구현예
전술한 개시내용은 이해의 명확성을 위해 예시 및 실시예를 통해 어느 정도 상세하게 기재되었지만, 설명 및 실시예는 본 개시내용의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 그 전체 내용이 명시적으로 참고로 포함된다.
다른 구현예는 청구범위 내에 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (29)

  1. 5'에서 3' 순서로,
    (a) 엔도르나바이러스 RNA 의존성 RNA 폴리머라제(RDRP)에 의해 인식될 수 있는 5' 레플리카제 인식 서열;
    (b) 카고 RNA 서열; 및
    (c) 엔도르나바이러스 RDRP에 의해 인식될 수 있는 3' 레플리카제 인식 서열을 포함하고, 카고 RNA 서열은 5' 및/또는 3' 레플리카제 인식 서열에 대해 이종성인, 재조합 RNA 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) 5' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래되고/되거나;
    (b) 3' 레플리카제 인식 서열은 엔도르나바이러스로부터 유래되는, 재조합 RNA 분자.
  3. 제1항에 있어서, 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열은 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래되거나 서로 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 엔도르나바이러스 게놈으로부터 얻어지는, 재조합 RNA 분자.
  4. 제5항에 있어서, 5' 레플리카제 인식 서열, 3' 레플리카제 인식 서열 및 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제는 동일한 엔도르나바이러스로부터 유래되거나 엔도르나바이러스 게놈으로부터 얻어지고, 5' RNA 레플리카제 인식 서열, 3' RNA 레플리카제 인식 서열 및/또는 RDRP 서열은 상응하는 5' RNA 레플리카제 인식 서열, 3' RNA 레플리카제 인식 서열 및/또는 RDRP 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는, 재조합 RNA 분자.
  5. 제1항에 있어서,
    (i) 5' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 14에 의해 인코딩된 RNA와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 RNA를 포함하고, 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 33에 의해 인코딩된 RNA와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 RNA를 포함하거나;
    (ii) 5' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 580과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 RNA를 포함하고, 3' 레플리카제 인식 서열은 서열번호 581과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 RNA를 포함하는, 재조합 RNA 분자.
  6. 제5항에 있어서, RDRP는 서열번호 367과 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 재조합 RNA 분자.
  7. 제1항에 있어서, 카고 RNA 서열은 길이가 최대 약 14 kb이며, (a) 적어도 하나의 단백질 코딩 서열, (b) 적어도 하나의 비코딩 서열, 또는 (c) 적어도 하나의 단백질 코딩 서열과 적어도 하나의 비코딩 서열 둘 모두를 포함하는, 재조합 RNA 분자.
  8. 제1항에 있어서, 엔도르나바이러스 RNA 의존성 RNA 폴리머라제(RDRP)는 서열번호 367, 355 내지 366, 368 내지 371, 456, 또는 534 내지 577 중 임의의 하나와 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 재조합 RNA 분자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 재조합 RNA 분자를 포함하는 농업용 제형.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 재조합 RNA 분자, 및 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 엔도르나바이러스 RDRP를 포함하는 식물.
  11. 제10항에 있어서, 국화과(Asteraceae), 박과(Cucurbitaceae), 콩과(Fabaceae), 녹나무과(Lauraceae), 벼과(Poaceae) 또는 가지과(Solanaceae)에 속하는, 식물.
  12. 제11항에 있어서, 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA를 결여하고 있는, 식물.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 재조합 RNA 분자, 및 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 엔도르나바이러스 RDRP를 포함하는 식물 번식체.
  14. 제13항에 있어서, 세포, 또는 세포를 포함하는 종자, 묘목, 배주, 배아, 꽃가루, 뿌리, 줄기, 잎, 묘조, 덩이줄기, 뿌리줄기, 기는 줄기, 구근, 외식편 또는 캘러스를 포함하는, 식물 번식체.
  15. 제13항에 있어서, 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA를 결여하고 있는, 식물 번식체.
  16. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 재조합 RNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 식물 세포를 포함하는 변형된 식물 번식체를 생산하는 방법으로서, 재조합 RNA 분자를 포함하는 식물 세포와 재조합 RNA 분자를 결여한 식물 세포 둘 모두를 포함하는 식물 세포의 혼합 집단으로부터 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제(RDRP) 및 재조합 RNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 식물 세포를 포함하는 식물 번식체를 단리하는 단계를 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 식물 세포의 혼합 집단은 식물 번식체를 단리하기 전에 재조합 RNA 분자를 포함하는 식물 세포의 존재에 대해 스크리닝되거나 선택되는, 방법.
  18. 제16항에 있어서, 단리하는 단계는 식물 번식체를 단리하기 전에 재조합 RNA 분자를 포함하는 식물 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
  19. 제16항에 있어서, 혼합 집단은 원형질체의 집단 또는 캘러스, 외식편, 식물 부분 또는 전체 식물에서의 세포의 집단인, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 혼합 집단은 식물 번식체를 단리하기 전에 재조합 RNA 분자의 존재 또는 전신 존재에 대해 스크리닝되거나 선택되는, 방법.
  21. 해충 또는 병원체에 대한 식물의 저항성 및/또는 내성을 증가시키는 방법으로서, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 재조합 RNA 분자를 식물에 제공하는 단계를 포함하고, 식물은 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 RDRP 단백질을 포함하며, 이에 의해 RDRP 단백질은 재조합 RNA 분자로부터 합성 엔도르나바이러스 위성 RNA의 합성을 촉매하고, 카고 RNA 서열로 인해 해충 또는 병원체에 대한 식물의 저항성 및/또는 내성은 재조합 RNA 분자가 제공되지 않은 식물에 비해 증가하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 해충 또는 병원체는 박테리아, 진균, 난균류(oomycete) 또는 무척추동물이고, 선택적으로 진균은 보트리티스(Botrytis) sp.인, 방법.
  23. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 재조합 RNA 분자를 자손 식물 또는 종자에 전파하는 F1 식물을 생산하는 방법으로서, 재조합 RNA 분자, 및 재조합 RNA 분자 및 RDRP를 포함하는 적어도 하나의 모 식물로부터 얻어진 F1 식물 또는 종자의 집단으로부터 재조합 RNA 분자의 5' 레플리카제 인식 서열 및 3' 레플리카제 인식 서열을 인식하는 엔도르나바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제(RDRP)를 포함하는 적어도 하나의 식물 세포를 포함하는 F1 자손 식물 또는 종자를 단리하는 단계를 포함하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 모 식물 또는 이의 하나 이상의 부분은 F1 자손 식물을 단리하기 전에 재조합 RNA 분자의 존재에 대해 스크리닝되거나 선택되는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 하나 이상의 부분은 꽃 조직 또는 웅성 또는 자성 생식 조직을 포함하는, 방법.
  26. 제23항에 있어서, F1 자손 식물 또는 종자는 재조합 RNA 분자를 인코딩하는 DNA를 결여하고 있는, 방법.
  27. 제23항에 있어서, RDRP는 적어도 하나의 모 식물에서 편리공생 비병원성 엔도르나바이러스 풍토병에 의해 F1 자손 식물 또는 종자에 제공되는, 방법.
  28. 제23항에 있어서, F1 자손 식물 또는 종자 집단은 모 식물을 자가수분함으로써 얻어지는, 방법.
  29. 제23항에 있어서, F1 식물 또는 종자 집단은 2개의 모 식물의 유성 교배로부터 얻어지는, 방법.
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