ES2667335T3 - Elementos reguladores de plantas y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Una molécula de ADN que presenta la actividad promotora de SEQ ID NO: 29, que comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de: a) una secuencia con al menos 85 por ciento de identidad de secuencia con la longitud completa de SEQ ID NO: 29; b) una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 29; y c) un fragmento que comprende al menos 250 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 29; en la que dicha molécula de ADN está unida operativamente a una molécula de polinucleótido transcribible heteróloga.

Description

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Elementos reguladores de plantas y usos de los mismos Campo de la invención

La invención se refiere al campo de la biología molecular de plantas y de la ingeniería genética de plantas, y a moléculas de ADN útiles para modular la expresión génica en plantas.

Antecedentes

Los elementos reguladores son elementos genéticos que regulan la actividad genética modulando la transcripción de una molécula de polinucleótido transcribible a la que se unen operativamente. Dichos elementos incluyen promotores, líderes, intrones y regiones no traducidas 3', que son útiles en el campo de la biología molecular de plantas y en el de modificación de plantas mediante ingeniería genética.

Sumario

La presente invención se refiere a nuevos elementos reguladores de genes de Cucumis melo, una especie de planta comúnmente conocida como melón almizcleño, para su uso en plantas. En el presente documento también se describen construcciones de ADN, células de plantas transgénicas, plantas y semillas que comprenden los elementos reguladores. Las secuencias se proporcionan unidas operativamente a una molécula de polinucleótido transcribible que es heteróloga con respecto a una secuencia reguladora proporcionada en este documento. También se describen procedimientos de creación y uso de los elementos reguladores, las construcciones de ADN que comprenden los elementos reguladores, y las células de plantas transgénicas, plantas y semillas que comprenden los elementos reguladores unidos operativamente a una molécula de polinucleótido transcribible.

Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ADN, que presenta la actividad promotora de SEQ ID NO: 29, que comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de: a) una secuencia con al menos 85 por ciento de identidad de secuencia con la longitud completa de SEQ ID NO: 29; b) una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 29; y c) un fragmento de al menos 250 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 29, en la que dicha molécula de ADN está unida operativamente a una molécula de polinucleótido transcribible heteróloga. En aspectos específicos descritos en el presente documento, una molécula de ADN es al menos 90 porciento, al menos 95 por ciento, al menos 98 por ciento, o al menos 99 por ciento, idéntica a la SEQ ID NO: 29. En realizaciones particulares, la molécula de polinucleótido transcribible heteróloga comprende un gen de interés agronómico, un gen capaz de proporcionar resistencia a los herbicidas en las plantas, o un gen capaz de proporcionar resistencia a las plagas de las plantas en las plantas.

La invención también proporciona una célula de planta transgénica que contiene una molécula de ADN heteróloga que presenta la actividad promotora de SEQ ID NO: 29, que comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de: a) una secuencia con al menos 85 por ciento de identidad de secuencia con la longitud completa de SEQ ID NO: 29; b) una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 29; y c) un fragmento de al menos 250 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 29, en la que dicha molécula de ADN está unida operativamente a una molécula de polinucleótido transcribible heteróloga. Además, la molécula de ADN regula la expresión de un gen. La célula de planta transgénica puede ser una célula de planta monocotiledónea o dicotiledónea.

Además, la invención proporciona una planta transgénica, o parte de la planta transgénica que contiene una molécula de ADN que presenta la actividad promotora de la SEQ ID NO: 29 que comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de:

a) una secuencia con al menos 85 por ciento de identidad de secuencia con la longitud completa de SEQ ID NO: 29;

b) una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 29; y c) un fragmento de al menos 250 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 29, en la que dicha molécula de ADN está unida operativamente a una molécula de polinucleótido transcribible heteróloga. En realizaciones específicas, la planta transgénica puede ser una planta descendiente de cualquier generación que contenga la molécula de ADN.

Además, también se proporciona una semilla transgénica que contiene una molécula de ADN que presenta la actividad promotora de la SEQ ID NO: 29, que comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de: a) una secuencia con al menos 85 por ciento de identidad de secuencia con la longitud completa de SEQ ID NO: 29; b) una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 29; y c) un fragmento de al menos 250 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 29, en la que dicha molécula de ADN está unida operativamente a una molécula de polinucleótido transcribible heteróloga.

En otro aspecto más, en este documento se divulga un procedimiento de producción de un producto básico de la planta transgénica, de parte de la planta transgénica o semilla transgénica que contiene una molécula de ADN que presenta la actividad promotora de la SEQ ID NO: 29, que comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de: a) una secuencia con al menos 85 por ciento de identidad de secuencia con la longitud completa de SEQ ID NO: 29; b) una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 29; y c) un fragmento de al menos 250

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nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 29, en la que dicha molécula de ADN está unida operativamente a una molécula de polinucleótido transcribible heteróloga. El producto básico puede ser un concentrado de proteína, aislado de proteína, grano, almidón, semillas, harina, fécula, biomasa o aceite de semilla.

En otro aspecto, en el presente documento se desvela un producto básico que comprende una molécula de ADN que presenta la actividad promotora de la SEC ID N°: 29, que comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de: a) una secuencia con al menos 85 por ciento de identidad de secuencia con la longitud completa de SEQ ID NO: 29; b) una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 29; y c) un fragmento de al menos 250 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 29, en la que dicha molécula de ADN está unida operativamente a una molécula de polinucleótido transcribible heteróloga.

En otro aspecto adicional, la invención proporciona un procedimiento para expresar una molécula de polinucleótido transcribible en una planta transgénica utilizando una molécula de ADN que presenta la actividad promotora de SEQ ID NO: 29 que tiene una secuencia de ADN con al menos 85 por ciento de identidad de secuencia con la longitud completa de SEQ ID NO: 29, o que comprende la SEQ ID NO: 29, o que comprende un fragmento de al menos 250 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 29; en el que dicha molécula de ADN está unida operativamente a una molécula de polinucleótido transcribible heteróloga; y cultivar dicha planta transgénica, en la que se expresa el polinucleótido transcribible.

Breve descripción de las secuencias

las SEQ ID NO: 1, 5, 7, 9, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 159, 162, 167, 168, 172, 175, 176, 177, 178, 181, 182, 183, 184, 185, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 211 y 212 son secuencias EXP o grupos de elementos de expresión reguladores de la transcripción de Cucumis que comprenden un elemento promotor, unido operativamente a un elemento líder; o un elemento promotor, unido operativamente a un elemento líder y un elemento intrón, o un elemento promotor, unido operativamente a un elemento líder, unido operativamente a un elemento intrón, unido operativamente a un elemento líder.

Las SEQ ID NO: 2, 6, 8, 10, 12, 163 y 169 son elementos promotores.

Las SEQ ID NO: 3, 164, 166 y 170 son secuencias líder.

Las SEQ ID NO: 4, 165 y 171 son secuencias intrónicas.

Las SEQ ID NO: 157, 160, 173, 179 y 186 son secuencias en las que un promotor está unido operativamente a un elemento líder.

Las SEQ ID NO: 158, 161, 174, 180 y 187 son secuencias en las que un intrón está unido operativamente a un elemento líder.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1a-1f representan alineamientos de segmentos variantes de promotor correspondientes a elementos promotores aislados de Cucumis melo. En particular, Las figuras 1a-1f muestran alineamientos de la secuencia promotora de 2068 pb P-CUCme.Ubq1-1: 1: 15 (SEC ID NO: 2), encontrada en el grupo de elementos de expresión reguladores de la transcripción EXP-CuCme.Ubq1: 1: 1 (SEQ ID NO: 1), frente a secuencias promotoras obtenidas por deleciones del promotor en 5', P-CUCme.Ubq1-1:1:15. La deleción, por ejemplo del extremo 5' de P- CUCme.Ubq1-1: 1: 15, produjo los promotores, P-CuCme.Ubq1-1:1:16 (SEQ iD NO: 6) un promotor de 1459 pb que se encuentra en EXP-CUCme.Ubq1: 1:2 (SEQ ID NO: 5); P-cUcme.Ubq1-1:1:17 (SEQ ID NO: 8), una secuencia de 964 pb comprendida en EXP-CUCme.Ubq1:1:3 (SEQ ID NO: 7); P-CUCme.Ubq1-1:1:18 (SEQ ID NO: 10), una secuencia de 479 pb comprendida en EXp-CUCme.Ubq1:1:4 (sEq ID NO: 9); y P-CUCme.Ubq1-1:1:19 (sEq ID NO: 12), una secuencia de 173 pb comprendida en EXP-CuCme.Ubq1:1:5 (SeQ ID NO: 11.

Descripción detallada

La invención desvelada en este documento proporciona moléculas de ADN obtenidas de Cucumis melo que tienen actividad reguladora de genes beneficiosos. Se describe el diseño, la construcción y el uso de estas moléculas de ADN Las secuencias de nucleótidos de estas moléculas de ADN se proporcionan como SEQ ID NO: 29. Estas moléculas de ADN son, por ejemplo, capaces de afectar a la expresión de una molécula de polinucleótido transcribible unida operativamente en tejidos de plantas, y por lo tanto regular selectivamente la expresión génica, o la actividad de un producto génico codificado, en plantas transgénicas. En el presente documento se desvelan también procedimientos de modificación, producción y uso de los mismos. La invención también proporciona células de plantas transformadas, plantas transgénicas y semillas que contienen las moléculas de ADN, y se desvelan procedimientos de preparación y uso de las mismas.

Se proporcionan las siguientes definiciones y procedimientos. A menos que se indique otra cosa, los términos se entienden de acuerdo al uso convencional de los expertos habituados en la técnica relevante.

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Moléculas de ADN

Como se usa en el presente documento, el término “ADN”, o la expresión “molécula de ADN”, se refiere a una molécula de ADN bicatenario de origen genómico o sintético, es decir, un polímero de bases desoxirribonudeotídicas o una molécula de polinucleótido, que se lee desde el extremo 5' (corriente arriba) al extremo 3' (corriente abajo). Como se usa en el presente documento, la expresión “secuencia de ADN” se refiere a la secuencia de nucleótidos de una molécula de ADN.

Como se usa en el presente documento, la expresión “molécula de ADN aislada” se refiere a una molécula de ADN que está separada al menos parcialmente de otras moléculas a las que está asociada normalmente en su estado nativo o natural. El término “aislado” puede referirse a una molécula de ADN que está separada al menos parcialmente de algunos de los ácidos nucleicos que flanquean normalmente la molécula de ADN en su estado nativo o natural. Por lo tanto, en el presente documento, las moléculas de ADN fusionadas con secuencias reguladoras o codificantes con las que no se asocian normalmente, por ejemplo, como resultado de técnicas recombinantes, se consideran aisladas. Dichas moléculas se consideran aisladas incluso cuando se integran en el cromosoma de una célula hospedadora o están presentes en una solución de ácido nucleico con otras moléculas de ADN, ya que no están en su estado nativo.

Se puede utilizar cualquiera de varios procedimientos conocidos en la técnica que son adecuados para aislar y manipular una molécula de ADN, o un fragmento de la misma, que se desvela en la presente invención. Por ejemplo, se puede utilizar la tecnología PCR (reacción en cadena de polimerasa) para amplificar una molécula particular de ADN de partida y/o producir variantes de la molécula original. Las moléculas de ADN, o fragmentos de las mismas, también pueden obtenerse por otras técnicas tales como por síntesis directamente del fragmento por medios químicos, como se practica comúnmente utilizando un sintetizador de oligonucleótidos automático.

Como se usa en el presente documento, la expresión “identidad de secuencia” se refiere al grado al cual dos secuencias de polinucleótidos, o de polipéptidos, alineadas óptimamente, son idénticas. Un alineamiento de secuencias óptimo se crea alineando manualmente dos secuencias, por ejemplo, una secuencia de referencia y otra secuencia, maximizando el número de coincidencias de nucleótidos en el alineamiento de secuencias con inserciones, deleciones apropiadas de nucleótidos internos, o huecos. Como se usa en el presente documento, la expresión “secuencia de referencia” se refiere a una secuencia proporcionada como la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 29.

Como se usa en el presente documento, la expresión “porcentaje de identidad de secuencia” o “porcentaje de identidad” o “% de identidad”, es la fracción de identidad 100 veces. La “fracción de identidad” de una secuencia que está alineada óptimamente con una secuencia de referencia es el número de coincidencias de nucleótidos en el alineamiento óptimo, dividido entre el número total de nucleótidos de la secuencia de referencia, por ejemplo, el número total de nucleótidos en la longitud completa de toda la secuencia de referencia. Por lo tanto, un aspecto es una molécula de ADN que comprende una secuencia que, cuando se alinea óptimamente con una secuencia de referencia, proporcionada como SEQ ID NO:29 en el presente documento, tiene al menos 85 por ciento de identidad, al menos 90 por ciento de identidad, al menos 95 por ciento de identidad, al menos 96 por ciento de identidad, al menos 97 por ciento de identidad, al menos 98 por ciento de identidad, o al menos 99 por ciento de identidad, con la secuencia de referencia. Las secuencias descritas en el presente documento pueden definirse como que tienen actividad reguladora de genes o que codifican un péptido que funciona para localizar un polipéptido unido operativamente dentro de una célula.

Elementos reguladores

Un elemento regulador es una molécula de ADN que tiene actividad reguladora, es decir, una que tiene la capacidad de afectar a la transcripción y/o a la traducción de una molécula de polinucleótido transcribible a la que está unida operativamente. Por lo tanto, la expresión "actividad génica reguladora" se refiere a la capacidad para afectar al patrón de expresión de una molécula de polinucleótido transcribible a la que está unida operativamente al afectar a la transcripción y/o traducción de esa molécula de polinucleótido transcribible a la que se une operativamente. Como se usa en el presente documento, un grupo de elementos de expresión reguladores de la transcripción (EXP) puede comprender elementos de expresión, tales como potenciadores, promotores, líderes e intrones, unidos operativamente. Por lo tanto, un grupo de elementos de expresión reguladores de la transcripción puede comprender, por ejemplo, un promotor unido operativamente en 5' a una secuencia líder, que a su vez está unido operativamente en 5' a una secuencia intrónica. La secuencia intrónica puede comprender una secuencia que comience en el punto de la primera unión de corte y empalme del intrón/exón de la secuencia nativa y además puede comprender un pequeño fragmento líder que comprenda la segunda unión de corte y empalme del intrón/exón, para proporcionar el procesamiento del intrón/exón adecuado para facilitar la transcripción y el procesamiento adecuado del transcrito resultante. Los líderes e intrones pueden afectar positivamente a la transcripción de una molécula de polinucleótido transcripcional unida operativamente, así como a la traducción del ARN transcrito resultante. La molécula de ARN reprocesada comprende líderes e intrones, que pueden afectar al procesamiento postranscripcional del ARN transcrito y/o a la exportación de la molécula de ARN transcrita desde el núcleo de la célula al citoplasma. Después del procesamiento postranscripcional de la molécula de ARN transcrita, la secuencia líder puede conservarse como parte del ARN mensajero final y puede afectar positivamente a la

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traducción de la molécula de ARN mensajero.

Los elementos reguladores, tales como promotores, líderes, intrones y las regiones de terminación de la transcripción, son moléculas de ADN que tienen actividad reguladora de genes y juegan un papel integral en la expresión global de genes en células vivas. La expresión "elemento regulador" se refiere a una molécula de ADN que tiene actividad reguladora de genes, es decir, una que tiene la capacidad de afectar a la transcripción y/o a la traducción de una molécula de polinucleótido transcribible a la que está unida operativamente. Los elementos reguladores aislados, tales como los promotores y líderes que funcionan en las plantas, son por tanto útiles para modificar los fenotipos de las plantas a través de procedimientos de modificación por ingeniería genética.

Los elementos reguladores se pueden caracterizar por sus efectos (desde un punto de vista cualitativo y/o cuantitativo) del patrón de expresión, por ejemplo, efectos positivos o negativos y/o constitutivos u otros efectos, tales como por su patrón de expresión temporal, espacial, de desarrollo, tisular, ambiental, fisiológico, patológico, de ciclo celular, y/o de reaccionar químicamente, y cualquier combinación de los mismos, así como por las indicaciones cuantitativas o cualitativas. Un promotor es útil como elemento regulador para modular la expresión de una molécula de polinucleótido transcribible a la que está unido operativamente.

Como se usa en el presente documento, un “patrón de expresión génica” es cualquier patrón de transcripción de una molécula de ADN unida operativamente en una molécula de ARN que se transcribe. La molécula de ARN que se ha transcrito se puede traducir para producir una molécula de proteína o puede proporcionar una molécula de ARN antisentido u otra molécula reguladora, tal como un ARNbc (bicatenario), un ARNt, un ARNr y un miARN.

Como se usa en el presente documento, la expresión “expresión proteica” es cualquier patrón de traducción de una molécula de ARN que se transcribe en una molécula de proteína. La expresión proteica se puede caracterizar por sus cualidades temporales, espaciales, de desarrollo, o morfológicas, así como por indicaciones cuantitativas o cualitativas.

Como se usa en el presente documento, el término “promotor” se refiere generalmente a una molécula de ADN que está implicada en el reconocimiento y unión de la ARN polimerasa II y otras proteínas (factores de transcripción que actúan en trans) para iniciar la transcripción. Un promotor se puede aislar inicialmente de la región no traducida (UTR, del inglés untranslated región) 5', de una copia genómica de un gen. Como alternativa, los promotores pueden ser moléculas de ADN producidas o manipuladas sintéticamente. Los promotores también pueden ser quiméricos, es decir, un promotor producido a través de la fusión de dos o más moléculas de ADN heterólogas. Los promotores útiles en la práctica de la presente memoria descriptiva incluyen el elemento promotor comprendido en la SEC ID NO: 29, o en fragmentos o variantes de la misma.

Como se describe en el presente documento, dichas moléculas y cualquiera de sus variantes o derivados, se definen además como que comprenden actividad promotora, es decir, son capaces de actuar como un promotor en una célula hospedadora, tal como en una planta transgénica. Un fragmento puede definirse como que presenta actividad promotora que posee la molécula promotora de partida de la que procede, o un fragmento puede comprender un "promotor mínimo" que proporciona un nivel de transcripción inicial y está compuesto de una caja TATA o secuencia equivalente para el reconocimiento y la unión del complejo de ARN polimerasa II para iniciar la transcripción.

En un aspecto descrito en el presente documento, se proporcionan fragmentos de una molécula promotora. Como se describe anteriormente, los fragmentos de un promotor proporcionan actividad promotora, y pueden ser útiles solos o en combinación con otros promotores y fragmentos de promotor, tal como en la construcción de promotores quiméricos. Se describen fragmentos de un promotor que comprenden al menos 250, 500, 750, o al menos 1000, o más, nucleótidos contiguos, de la molécula de SEQ ID NO: 29 que tiene la actividad promotora de SEQ ID NO: 29.

Para mejorar o alterar la expresión, pueden producirse composiciones procedentes del elemento promotor comprendido en la SEC ID N°: 29, tal como, por ejemplo, deleciones internas o en 5', incluso eliminando elementos que tienen efectos positivos o negativos en la expresión; duplicando elementos que tienen efectos positivos o negativos en la expresión; y/o duplicando o eliminando elementos que tienen efectos específicos de tejidos o células en la expresión. Se pueden utilizar composiciones procedentes del elemento promotor comprendido en la SEQ ID NO: 29 que comprende deleciones en 3' en las que se elimina el elemento de caja TATA o su secuencia equivalente y la secuencia corriente abajo, por ejemplo, para crear elementos potenciadores. Se pueden realizar deleciones adicionales para eliminar cualquier elemento que tenga efectos positivos o negativos; específicos de tejido; específicos de célula; o específicos de tiempo (tal como los ritmos circadianos) sobre la expresión. El elemento promotor comprendido en la SEQ ID NO: 29, y los fragmentos o potenciadores procedentes del mismo, pueden utilizarse para crear composiciones de elemento regulador de la transcripción quimérico que comprenden el elemento promotor comprendido en la SEQ ID NO: 29, y los fragmentos o potenciadores procedentes de los mismos, unidos operativamente a otros potenciadores y promotores. La eficacia de las modificaciones, duplicaciones o deleciones, descritas en el presente documento sobre los aspectos de expresión deseados de un transgén particular, puede analizarse empíricamente en ensayos de plantas estables y transitorios, tales como los descritos en los ejemplos de trabajo en el presente documento, para validar los resultados, que pueden variar dependiendo de los cambios realizados y del objetivo del cambio en la molécula de partida.

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Como se usa en el presente documento, el término “líder” se refiere a una molécula de ADN que se aísla de la región no traducida 5' (UTR 5') de una copia genómica de un gen y se define generalmente como un segmento de nucleótido entre el sitio de inicio de la transcripción (SIT) y el sitio de inicio de la secuencia que codifica la proteína. Como alternativa, los líderes pueden ser elementos de ADN producidos o manipulados sintéticamente. Un líder se puede utilizar como un elemento regulador 5' para modular la expresión de una molécula de polinucleótido transcribible a la que está unido operativamente. Las moléculas líderes se pueden utilizar con un promotor heterólogo o con su promotor nativo Por lo tanto, las moléculas promotoras de las moléculas de ADN de la presente invención pueden estar unidas operativamente unidas a su líder nativo o a un líder heterólogo. Los líderes útiles en la práctica de la presente invención incluyen el elemento líder comprendido en la SEC ID NO: 29, o fragmentos o variantes de la misma. Dichas secuencias se pueden definir como capaces de actuar como un líder en una célula hospedadora, incluyendo, por ejemplo, una célula de planta transgénica. Dichas secuencias se pueden decodificar ya que comprenden actividad de líder.

El elemento líder comprendido en la SEQ ID NO: 29 puede estar compuesto por elementos reguladores o puede adoptar estructuras secundarias que pueden tener un efecto sobre la transcripción o traducción de un transgén. El elemento líder comprendido en la SEQ ID NO: 29 puede utilizarse para crear elementos reguladores quiméricos que afectan a la transcripción o traducción de un transgén. Además, el elemento líder comprendido en la SEQ ID NO: 29 puede utilizarse para crear secuencias líder quiméricas que afecten a la transcripción o traducción de un transgén.

La introducción de un gen exógeno en un nuevo hospedador de planta no siempre da como resultado una alta expresión del gen entrante. Además, si se trata de rasgos complejos, a veces es necesario modular varios genes con un patrón de expresión espacial o temporalmente diferente. Los intrones pueden proporcionar principalmente dicha modulación. Sin embargo, el uso múltiple del mismo intrón en una planta transgénica ha demostrado presentar desventajas. En esos casos, es necesario tener una colección de elementos de control básicos para la construcción de elementos apropiados de ADN recombinante. Como la colección disponible de intrones conocidos en la técnica con propiedades de mejora de la expresión es limitada, se necesitan alternativas.

Las composiciones que proceden de un elemento intrón pueden comprender deleciones o duplicaciones internas de elementos reguladores en cis; y/o las alteraciones de las secuencias 5' y 3' que comprenden las uniones de corte y empalme de intrón/exón pueden utilizarse para mejorar la expresión o especificidad de expresión cuando se unen operativamente a un promotor + líder o promotor quimérico + líder y secuencia codificante. También pueden hacerse alteraciones de las regiones 5' y 3' que comprenden la unión de corte y empalme de intrón/exón para reducir el potencial de introducción de codones de inicio y de finalización falsos que se producen en el transcrito resultante después del procesamiento y corte y empalme del ARN mensajero. Como se describe en los ejemplos de trabajo, para determinar el efecto del intrón sobre la expresión de un transgén, los intrones se pueden ensayar empíricamente.

Un promotor o fragmento promotor puede analizarse para detectar la presencia de elementos promotores conocidos, es decir, características de la secuencia de ADN, tal como una caja TATA y otros motivos conocidos de sitios de unión de factores de transcripción. Un experto en la técnica puede utilizar la identificación de dichos elementos promotores conocidos para diseñar variantes que tengan un patrón de expresión similar al del promotor original.

Como se usa en el presente documento, el término "potenciador" o la expresión "elemento potenciador" se refiere a un elemento regulador transcripcional que actúa en cis, también conocido como elemento cis, que confiere un aspecto del patrón de expresión general, pero que normalmente es insuficiente solo para conducir la transcripción, de una secuencia de polinucleótidos unida operativamente. A diferencia de los promotores, generalmente, los elementos potenciadores no incluyen un sitio de inicio de la transcripción (SIT) o una caja TATA o secuencia equivalente. Un promotor puede comprender, de manera natural, uno o más elementos potenciadores que afectan a la transcripción de una secuencia de polinucleótidos unida operativamente. Un elemento potenciador aislado también puede fusionarse con un promotor para producir un promotor quimérico.elemento cis, que confiere un aspecto de la modulación global de la expresión génica. Un promotor o fragmento promotor puede comprender uno o más elementos potenciadores que efectúan la transcripción de genes unidos operativamente. Se cree que muchos elementos potenciadores del promotor se unen a proteínas de unión al ADN y/o afectan a la topología del ADN produciendo conformaciones locales que permiten o restringen selectivamente el acceso de la aRn polimerasa al molde de ADN o que facilitan la apertura selectiva de la doble hélice en el sitio de inicio de la transcripción. Un elemento potenciador puede funcionar para unir factores de transcripción que regulan la transcripción. Algunos elementos potenciadores se unen a más de un factor de transcripción, y los factores de transcripción pueden interaccionar, con diferentes afinidades, con más de un dominio potenciador. Los elementos potenciadores se pueden identificar mediante diversas técnicas, incluido el análisis de deleción, es decir, la deleción de uno o más nucleótidos del extremo 5' o internos de un promotor; análisis de proteína de unión a ADN utilizando la huella de DNasa I, interferencia por metilación, ensayos de electroforesis de cambio de movilidad, huella genómica in vivo por PCR mediada por ligamiento, y otros ensayos convencionales; o por análisis de similitud de secuencia de ADN utilizando motivos de elementos cis conocidos o elementos potenciadores como secuencia diana o motivo diana con procedimientos convencionales de comparación de secuencias de ADN, tal como BLAST. La estructura detallada de un dominio potenciador se puede estudiar adicionalmente por mutagénesis (o sustitución) de uno o más nucleótidos o por otros procedimientos convencionales. Los elementos potenciadores se pueden obtener por síntesis química o por aislamiento a partir de elementos reguladores que incluyen dichos elementos, y se pueden sintetizar con

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nucleótidos adicionales flanqueantes que contienen sitios de enzimas de restricción útiles para facilitar la manipulación posterior. Por lo tanto, en el presente documento, para modular la expresión de moléculas de polinucleótidos transcribibles unidas operativamente, se contempla el diseño, la construcción y el uso de elementos potenciadores según los procedimientos desvelados en el presente documento.

En plantas, la inclusión de algunos intrones en construcciones génicas conduce a una mayor acumulación de ARNm y proteínas en relación con construcciones que carecen del intrón. Este efecto se ha denominado "mejora mediada por intrones" (MMI) de la expresión génica (Mascarenhas y col., (1990) Plant Mol. Biol. 15: 913-920). Se han identificado intrones que se sabe que estimulan la expresión en plantas en genes de maíz (por ejemplo, tubA1, Adh1, Sh1, Ubi1 (Jeon y col. (2000) Plant Physiol. 123:1005-1014; Callis y col. (1987) Genes Dev. 1:1183-1200; Vasil y col. (1989) Plant Physiol. 91:1575-1579; Christiansen y col. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689) y en genes de arroz (por ejemplo, salt, tpi: McElroy y col., Plant Cell 2:163-171 (1990); Xu y col., Plant Physiol. 106:459-467 (1994)). Asimismo, se ha descubierto que los intrones de genes de plantas dicotiledóneas, como los de petunia (por ejemplo, rbcS), patata (por ejemplo, st-ls1) y de Arabidopsis thaliana (por ejemplo, ubq3 y patl), elevan las tasas de expresión génica (Dean y col. (1989) Plant Cell 1: 201-208; Leon y col. (1991) Plant Physiol. 95: 968 - 972; Norris y col.(1993) Plant Mol Biol 21: 895 - 906; Rose y Last (1997) Plant J.11: 455 - 464). Se ha demostrado que las deleciones o mutaciones dentro de los sitios de corte y empalme de un intrón, reducen la expresión génica, lo que indica que para la mejora mediada por intrones (MMI) podría ser necesario el corte y empalme (Mascarenhas y col., (1990) Plant Mol Biol. 15:913-920; Clancy y Hannah (2002) Plant Physiol. 130: 918-929). Sin embargo, a través de mutaciones puntuales dentro de los sitios de corte y empalme del gen patl de A. thaliana, se ha demostrado que ese corte y empalme de por sí no es necesario para una determinada mMi en plantas dicotiledóneas (Rose y Beliakoff (2000) Plant Physiol. 122: 535-542).

La mejora de la expresión génica por intrones no es un fenómeno general porque algunas inserciones de intrones en casetes de expresión recombinantes no mejoran la expresión (por ejemplo, intrones de genes de dicotiledóneas (el gen rbcS del guisante, el gen de faseolina del frijol y el gen stls-1 de Solanum tuberosum) e intrones de genes de maíz (el gen adhl el noveno intrón, el gen hsp81 el primer intrón)) (Chee y col. (1986) Gene 41: 47-57; Kuhlemeier y col. (1988) Mol Gen Genet 212:405-411; Mascarenhas y col. (1990) Plant Mol. Biol. 15:913-920; Sinibaldi y Mettler (1992) En WE Cohn, K Moldave, eds, Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, Vol 42. Academic Press, Nueva York, págs. 229-257; Vancanneyt y col. 1990 Mol. Gen. Genet. 220: 245-250). Por lo tanto, no todos los intrones pueden emplearse para manipular el nivel de expresión génica de genes no endógenos o genes endógenos en plantas transgénicas. En la técnica anterior se desconocen cuáles son las características o rasgos de secuencias específicos que deben estar presentes en una secuencia intrónica para mejorar la tasa de expresión de un gen dado y, por lo tanto, a partir de la técnica anterior no es posible predecir si un intrón de planta dado, cuando se utiliza de forma heteróloga, causará una MMI.

Como se usa en el presente documento, el término “quimérico” se refiere a una sola molécula de ADN producida por la fusión de una primera molécula de ADN con una segunda molécula de ADN, en la que ni la primera ni la segunda molécula de ADN se encuentran de otra manera normalmente en esa configuración, es decir, fusionadas entre sí. Por lo tanto, la molécula de ADN quimérico es una nueva molécula de ADN que normalmente no se encuentra en la naturaleza. Como se usa en el presente documento, la expresión “promotor quimérico” se refiere a un promotor que se produce por medio de dicha manipulación de moléculas de ADN. Un promotor quimérico puede combinar dos o más fragmentos de ADN; un ejemplo sería la fusión de un elemento promotor con un elemento potenciador. Por lo tanto, en el presente documento, para modular la expresión de moléculas de polinucleótidos transcribibles unidas operativamente, se contempla el diseño, la construcción y el uso de promotores quiméricos según los procedimientos desvelados en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, el término “variante” se refiere a una segunda molécula de ADN que tiene una composición similar, pero no idéntica, a una primera molécula de ADN y la segunda molécula de ADN mantiene aún la funcionalidad general, es decir, el mismo patrón de expresión, o similar, de la primera molécula de ADN. Una variante puede ser una versión más corta o truncada de la primera molécula de ADN y/o una versión alterada de la secuencia de la primera molécula de ADN, tal como una que tiene diferentes sitios de enzimas de restricción y/o deleciones, sustituciones, y/o inserciones internas. Una "variante" también puede abarcar un elemento regulador que tiene una secuencia de nucleótidos que comprende una sustitución, deleción y/o inserción de uno o más nucleótidos de una secuencia de referencia, en la que el elemento regulador derivado tiene más o menos actividad transcripcional o traduccional, o equivalente, que la molécula reguladora precursora correspondiente. Las "variantes" de elemento regulador también pueden abarcar variantes que surgen de mutaciones que se producen de forma natural en la transformación de células de bacterias y plantas. Una secuencia de ADN proporcionada como SEQ ID NO: 29 puede utilizarse para crear variantes que tienen una composición similar, pero no idéntica, a la secuencia de ADN del elemento regulador original, aunque aún mantiene la funcionalidad general, es decir, el mismo patrón de expresión, o similar, del elemento regulador original. Las "variantes" de elemento regulador quimérico comprenden los mismos elementos constituyentes que los de una secuencia de elemento regulador quimérico de referencia, pero los elementos constituyentes que comprenden el elemento regulador quimérico se pueden unir operativamente mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica tales como, digestión con enzimas de restricción y ligamiento, clonación independiente de ligamiento, ensamblaje modular de productos de PCR durante la amplificación, o síntesis química directa del elemento regulador quimérico, así como otros procedimientos conocidos en la técnica. El elemento regulador quimérico "variante" resultante está compuesto por los mismos, o variantes de

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los mismos, elementos constituyentes que los de la secuencia de referencia, pero difieren en la secuencia o secuencias que se utilizan para unir operativamente los elementos constituyentes. La secuencia de ADN proporcionada como SEQ ID NO: 29 proporciona una secuencia de referencia en la que los elementos constituyentes de la secuencia de referencia se pueden unir por procedimientos conocidos en la técnica y pueden consistir en sustituciones, deleciones y/o inserciones de uno o más nucleótidos o mutaciones que se producen de forma natural en la transformación de células de bacterias y plantas.

Construcciones

Como se usa en el presente documento, el término “construcción” significa cualquier molécula de polinucleótido recombinante tal como un plásmido, cósmido, virus, molécula de polinucleótido que se replica autónomamente, fago, o molécula de polinucleótido de ADN o ARN mono o bicatenario, circular o lineal, procedente de cualquier fuente, con capacidad de integración genómica o replicación autónoma, que comprende una molécula de polinucleótido en la que se han unido una o más moléculas de polinucleótido de una manera funcionalmente operativa, es decir, se han unido operativamente. Como se usa en el presente documento, el término “vector” significa cualquier construcción de polinucleótido recombinante que se puede utilizar con el fin de realizar una transformación, es decir, la introducción de ADN heterólogo en una célula hospedadora. El término incluye un casete de expresión aislado de cualquiera de las moléculas mencionadas anteriormente.

Como se usa en el presente documento, la expresión "unida operativamente" se refiere a una primera molécula que se une a una segunda molécula, disponiéndose las moléculas de forma que la primera molécula afecta a la función de la segunda molécula. Las dos moléculas pueden ser parte o no de una sola molécula contigua y pueden estar adyacentes o no. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente a una molécula de polinucleótido transcribible si el promotor modula la transcripción de la molécula de polinucleótido transcribible de interés en una célula. Un líder, por ejemplo, está unido operativamente a la secuencia codificante cuando puede actuar como un líder para el polipéptido codificado por la secuencia codificante.

Las moléculas de ADN de la presente invención se pueden proporcionar como construcciones de ADN en plásmidos Ti con doble borde que tienen las regiones de borde derecho (del inglés Right Border) (RB o AGRtu.RB) y de borde izquierdo (del inglés Left Border) (LB o AGRtu.LB) del plásmido Ti, aisladas de Agrobacterium tumefaciens que comprenden un T-ADN, que junto con las moléculas de transferencia proporcionadas por las células de Agrobacterium tumefaciens, permiten la integración del T-ADN en el genoma de una célula de planta (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 6.603.061). Las construcciones también pueden contener los segmentos estructurales del ADN del plásmido que proporcionan la función de replicación y selección por antibióticos en células de bacterias, por ejemplo, un origen de replicación en Escherichia coli, tal como, ori322, un origen de replicación con amplio intervalo de hospedador, tal como oriV u oriRi, y una región codificante de un marcador de selección, tal como Espec/Estrp, que codifica la Tn7 aminoglucósido adeniltransferasa (aadA) que confiere resistencia a la espectinomicina o estreptomicina, o un gen marcador de selección de gentamicina (Gm, Gent). Para la transformación de plantas, la cepa bacteriana hospedadora es frecuentemente Agrobacterium tumefaciens ABI, C58 o LBA4404; sin embargo, en la presente invención pueden funcionar otras cepas conocidas en la técnica de transformación de plantas.

Se dispone de procedimientos para ensamblar e introducir construcciones en una célula de tal manera que la molécula de polinucleótido transcribible se transcriba en una molécula funcional de ARNm que se traduce y se expresa como un producto proteico. Para la práctica de la presente invención, composiciones y procedimientos convencionales para preparar y utilizar construcciones y células hospedadoras pueden encontrarse, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edición, volúmenes 1, 2 y 3 (2000) J.F. Sambrook, D.W. Russell, y N. Irwin, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Los procedimientos para producir vectores recombinantes, particularmente adecuados para la transformación de plantas incluyen los descritos en las Patentes de Estados Unidos 4.971.908, 4.940.835, 4.769.061 y 4.757.011. Estos tipos de vectores se han revisado también en la bibliografía científica (véase, por ejemplo, Rodriguez, y col., Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston, (1988) y Glick, y col., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, Boca Raton, FL. (1993). Los vectores típicos útiles para la expresión de ácidos nucleicos en plantas superiores son muy conocidos en la técnica e incluyen vectores procedentes del plásmido (Ti) inductor de tumores de Agrobacterium tumefaciens (Rogers, y col., Methods in Enzymology 153: 253-277 (1987)). Otros vectores recombinantes útiles para la transformación de plantas, incluyendo el vector de control de transferencia pCAMVCN, también se han descrito en la bibliografía científica (véase, por ejemplo, Fromm, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5824-5828 (1985)).

En una construcción se pueden incluir diversos elementos reguladores, incluyendo los proporcionados en el presente documento. Cualquiera de dichos elementos reguladores se puede proporcionar en combinación con otros elementos reguladores. Dichas combinaciones se pueden diseñar o modificar para producir rasgos reguladores deseables. Las moléculas de ADN de la presente invención pueden comprender al menos un elemento regulador unido operativamente a una molécula de polinucleótido transcribible unida operativamente a una molécula de terminación de la transcripción en 3'.

Las moléculas de ADN de la presente invención pueden incluir cualquier promotor o líder proporcionado en el

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presente documento o conocido en la técnica Por ejemplo, un promotor de la presente invención puede estar unido operativamente a un líder 5' no traducido heterólogo, tal como uno que procede de un gen de proteína de choque térmico (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos 5.659.122 y 5.362.865). Como alternativa, un líder puede estar unido operativamente a un promotor heterólogo tal como el promotor 35S de transcripción del Virus del Mosaico de la Coliflor (véase, la patente de Estados Unidos 5.352.605). Las propiedades de expresión que confieren dichas uniones operativas de elementos heterólogos no son necesariamente aditivas de las propiedades esclarecidas de cada promotor y líder sino que se determinan a través de análisis empíricos de la expresión dirigida por el promotor y líder heterólogo unido operativamente.

Como se usa en el presente documento, el término “intrón” se refiere a una molécula de ADN que se puede aislar o identificar a partir de la copia genómica de un gen y se puede definir generalmente como una región que se corta y empalma durante el procesamiento del ARNm antes de la traducción. Como alternativa, un intrón puede ser un elemento de ADN producido o manipulado sintéticamente. Un intrón puede contener elementos potenciadores que efectúan la transcripción de genes unidos operativamente. Para modular la expresión de una molécula de polinucleótido transcribible unida operativamente, se puede utilizar un intrón como elemento regulador. Una construcción de ADN puede comprender un intrón, y el intrón puede ser, o no, heterólogo con respecto a la secuencia de la molécula de polinucleótido transcribible. Como ejemplos de intrones en la técnica se incluyen el intrón de actina de arroz (patente de Estados Unidos 5.641.876) y el intrón de maíz HSP70 (patente de Estados Unidos 5.859.347).

Como se usa en el presente documento, la expresión "molécula de terminación de la transcripción en 3'" o ''UTR 3''', se refiere a una molécula de ADN que se utiliza durante la transcripción para producir la región no traducida 3' (UTR 3') de una molécula de ARNm. La región no traducida 3' de una molécula de ARNm puede generarse por escisión específica y poliadenilación 3', también conocida como cola de poliA. Una UTR 3' puede estar unida operativamente a, y localizarse corriente abajo de, una molécula de polinucleótido transcribible y puede incluir polinucleótidos que proporcionan una señal de poliadenilación y otras señales reguladoras capaces de afectar a la transcripción, al procesamiento de ARNm, o a la expresión génica. Se cree que las colas de poliA funcionan en la estabilidad del ARNm y en el inicio de la traducción. Son ejemplos de moléculas de terminación de la transcripción 3', la región 3' de la nopalina sintasa (véase, Fraley, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 4803-4807 (1983)); la región 3' de hsp17 de trigo; la región 3' de la subunidad pequeña de la rubisco de guisante; la región 3' E6 de algodón (patente de Estados Unidos 6.096.950); las regiones 3' desveladas en el documento WO0011200A2; y la UTR 3' de coixina (patente de Estados Unidos 6.635.806).

Las UTR 3' típicamente encuentran uso beneficioso para la expresión recombinante de genes específicos. En sistemas animales, se ha definido bien una maquinaria de UTR 3' (por ejemplo, Zhao y col., Microbiol. Mol Biol. Rev 63: 405-445 (1999). Proudfoot, Nature 322:562-565 (1986); Kim y col., Biotechnology Progress 19:1620-1622 (2003); Yonaha y Proudfoot, EMBO J. 19:3770-3777 (2000); Cramer y col., FEBS Letters 498:179-182 (2001); Kuerstem y Goodwin, Nature Reviews Genetics 4:626-637 (2003)). La terminación eficaz de la transcripción de ARN es necesaria para impedir la transcripción no deseada de secuencias (corriente abajo) no relacionadas con rasgo, que pueden interferir con el rendimiento del rasgo. La disposición de múltiples casetes de expresión génica en proximidad local entre sí (por ejemplo, dentro de un T-ADn) puede causar la supresión de la expresión génica de uno o más genes en dicha construcción en comparación con inserciones independientes (Padidam y Cao, BioTechniques 31: 328-334 (2001). Esto puede interferir con la obtención de niveles de expresión adecuados, por ejemplo, en los casos en que se desea una fuerte expresión génica de todos los casetes.

En plantas, no se conocen secuencias de señal de poliadenilación claramente definidas. Hasegawa y col., Plant J. 33:1063-1072, (2003)) no pudieron identificar secuencias de señal de poliadenilación conservadas en sistemas tanto in vitro como in vivo en Nicotiana sylvestris ni determinar la longitud real del transcrito primario (no poliadenilado). Una UTR 3' débil tiene el potencial de generar ultralectura, que puede afectar a la expresión de los genes localizados en los casetes de expresión contiguos Padidam y Cao, BioTechniques 31: 328-334 (2001)). El control apropiado de la terminación de la transcripción puede impedir la ultralectura en secuencias (por ejemplo, otros casetes de expresión) localizados corriente abajo y además puede permitir el reciclado eficaz de la ARN polimerasa, para mejorar la expresión génica. La terminación eficaz de la transcripción (liberación de la ARN polimerasa II del ADN) es un requisito previo para el reinicio de la transcripción y, por lo tanto, afecta directamente al nivel global de transcripción. Después de la terminación de la transcripción, el ARNm maduro se libera del sitio de síntesis y del molde al citoplasma. Los ARNm eucariotas se acumulan como formas poli (A) in vivo, de modo que es difícil detectar sitios de terminación transcripcional por procedimientos convencionales. Sin embargo, la predicción de UTR 3' funcionales y eficaces mediante procedimientos bioinformáticos es difícil ya que no hay secuencias conservadas que permitan realizar una predicción fácil de una UTR 3' eficaz.

Desde un punto de vista práctico, es típicamente beneficioso que una UTR 3' utilizada en un casete transgénico posea las siguientes características. La UTR 3' debería ser capaz de terminar eficaz y efectivamente la transcripción del transgén e impedir la ultralectura del transcrito en cualquier secuencia de ADN contigua que pueda estar compuesta por otro casete transgénico como en el caso de múltiples casetes que residen en un T-ADN, o el ADN cromosómico contiguo en el que se ha insertado el T-ADN. La UTR 3' no debe causar una reducción en la actividad transcripcional impartida por el promotor, el líder y los intrones que se utilizan para dirigir la expresión del transgén. En biotecnología de plantas, la UTR 3' se usa a menudo para cebar las reacciones de amplificación del ARN

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transcrito inverso extraído de la planta transformada y se usa para (1) evaluar la actividad transcripcional o la expresión del casete del transgén una vez integrado en el cromosoma de la planta; (2) evaluar el número de copias de las inserciones dentro del ADN de la planta; y (3) evaluar la cigosidad de la semilla resultante después de la reproducción. La UTR 3' también se utiliza en reacciones de amplificación de ADN extraído de la planta transformada para caracterizar la integridad del casete insertado.

La UTR 3' útiles para proporcionar la expresión de un transgén en plantas pueden identificarse basándose en la expresión de etiquetas de secuencias expresadas (EST, del inglés expressed sequence tags) en bibliotecas de ADNc obtenidas de ARN mensajero aislado de tejido de semilla, de flor y de otros tejidos procedentes de mijo de cola de zorro (Setaria italica (L.) Beauv). Las bibliotecas de ADNc se obtienen de tejidos aislados de especies de plantas seleccionadas utilizando tejido de flor, semilla, hoja y raíz. Los ADNc resultantes se secuencian utilizando diversos procedimientos de secuenciación. Las EST resultantes se ensamblan en grupos utilizando software de bioinformática, tal como clc_ref assemble_complete versión 2.01.37139 (CLC bio USA, Cambridge, Massachusetts 02142). La abundancia de la transcripción de cada grupo se determina contando el número de lecturas de ADNc para cada grupo. Las UTR 3' identificadas pueden estar compuestos por una secuencia procedente de una secuencia de ADNc, así como una secuencia procedente de ADN genómico. La secuencia de ADNc se utiliza para diseñar cebadores, que después se utilizan con bibliotecas de GenomeWalker™ (Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, CA) construidas siguiendo el protocolo del fabricante para clonar la región 3' de la secuencia de ADN genómico correspondiente para proporcionar una secuencia de terminación más larga. El análisis de la abundancia relativa de transcritos, ya sea mediante recuentos directos o recuentos normalizados de lecturas de secuencia observadas para cada biblioteca de tejidos, puede utilizarse para deducir propiedades sobre patrones de expresión. Por ejemplo, algunas UTR 3' se pueden encontrar en transcripciones observadas en mayor abundancia en tejido de raíz en comparación con el de hoja. Esto sugiere que la transcripción está muy expresada en la raíz y que las propiedades de expresión de la raíz pueden ser atribuibles a la regulación transcripcional del promotor, líder, los intrones o la UTR 3' Pruebas empíricas de las UTR 3' identificadas mediante las propiedades de expresión dentro de tipos específicos de órganos, tejidos o células, pueden dar como resultado la identificación de las UTR 3' que mejoran la expresión en esos tipos específicos de órganos, tejidos o células.

Las construcciones y vectores también pueden incluir una secuencia codificante de un péptido de tránsito que expresa un péptido ligado que es útil para dirigirse a un producto proteico, particularmente a un cloroplasto, leucoplasto, u otro orgánulo plastídico; mitocondria; peroxisoma; vacuola; o una localización extracelular. Para descripciones del uso de péptidos de tránsito al cloroplasto, véanse las patentes de Estados Unidos 5.188.642 y 5.728.925. Muchas proteínas localizadas en los cloroplastos se expresan a partir de genes nucleares como precursores y están dirigidas al cloroplasto por un péptido de tránsito al cloroplasto (PTC). Como ejemplos de dichas proteínas de cloroplastos aisladas se incluyen las asociadas con la subunidad pequeña (SSU, small subunit) de la ribulosa-1,5,-bifosfato carboxilasa, ferredoxina, ferredoxina oxidorreductasa, la proteína I y la proteína II del complejo de absorción lumínica, tiorredoxina F, enolpiruvil shikimato fosfato sintasa (EPSPS), y péptidos de tránsito descritos en la patente de Estados Unidos 7.193.133. Se ha demostrado in vivo e in vitro que las proteínas no cloroplásticas se pueden dirigir a los cloroplastos utilizando fusiones proteicas con un PTC heterólogo y que el PTC es suficiente para dirigir una proteína al cloroplasto. Se ha demostrado que la incorporación de un péptido de transito al cloroplasto adecuado, tal como el PTC de EPSPS (PTC2) de Arabidopsis thaliana (véase, Klee y col., Mol. Gen. Genet., 210:437-442 (1987)) o el PTC de EPSPS (pTc4) de Petunia hybrida (véase, della-Cioppa y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:6873-6877 (1986)) dirige secuencias proteicas de EPSPS heterólogas a los cloroplastos en plantas transgénicas (véanse, las patentes de Estados Unidos 5.627.061, 5.633.435, y 5,312,910 y los documentos EP 0218571, EP 189707, EP 508909, y EP 924299).

Moléculas de polinucleótido transcribibles

Como se usa en el presente documento, la expresión “molécula de polinucleótido transcribible” se refiere a cualquier molécula de ADN capaz de transcribirse en una molécula de ARN, incluyendo las que tienen secuencias codificantes de proteínas y las que tienen secuencias útiles para la supresión génica. Un “transgén” se refiere a una molécula de polinucleótido transcribible heteróloga a una célula hospedadora al menos con respecto a su ubicación en el genoma y/o a una molécula de polinucleótido transcribible incorporada artificialmente en un genoma de una célula hospedadora en la generación actual o anterior de la célula.

Un promotor de la molécula de ADN está unido operativamente a una molécula de polinucleótido transcribible que sea heteróloga con respecto a la molécula promotora. Como se usa en el presente documento, el término “heterólogo” se refiere a la combinación de dos o más moléculas de polinucleótido cuando dicha combinación no se encontraría normalmente en la naturaleza. Por ejemplo, las dos moléculas pueden proceder de diferentes especies y/o las dos moléculas pueden proceder de diferentes genes, por ejemplo, genes diferentes de la misma especie o los mismos genes de diferentes especies. Por lo tanto, un promotor es heterólogo con respecto a una molécula de polinucleótido transcribible unida operativamente si dicha combinación no se encuentra normalmente en la naturaleza, es decir, esta molécula de polinucleótido transcribible no se produce de forma natural unida operativamente en combinación con esa molécula promotora.

La molécula de polinucleótido transcribible puede ser generalmente cualquier molécula de ADN para la cual se desea la expresión de un transcrito de ARN. Dicha expresión de un transcrito de ARN puede dar como resultado la

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traducción de la molécula de ARNm resultante y, por lo tanto, la expresión de proteínas. Como alternativa, por ejemplo, una molécula de polinucleótido transcribible puede diseñarse para que finalmente produzca la disminución de la expresión de un gen específico o de una proteína específica. Esto se puede conseguir utilizando una molécula de polinucleótido transcribible que se oriente en la dirección antisentido. En resumen, a medida que se transcribe la molécula de polinucleótido transcribible en orientación antisentido, el producto de ARN se hibrida y secuestra una molécula de ARN complementaria en el interior de la célula. Esta molécula de ARN dúplex no se puede traducir en una proteína mediante la maquinaria de traducción de la célula y se degrada en la célula. De esta manera, cualquier gen puede regularse negativamente.

En un aspecto descrito en el presente documento, una molécula de ADN, tal como la proporcionada como SEQ ID NO: 29, está unida operativamente a una molécula de polinucleótido transcribible para modular la transcripción de la molécula de polinucleótido transcribible a un nivel deseado o en un patrón deseado cuando la construcción se integra en el genoma de una célula de planta. La molécula de polinucleótido transcribible puede comprender una región codificante de la proteína de un gen, y el promotor afecta a la transcripción de una molécula de ARN que se traduce y expresa como un producto proteico. En otro caso, la molécula de polinucleótido transcribible comprende una región antisentido de un gen, y el promotor afecta a la transcripción de una molécula de ARN antisentido, ARN bicatenario u otra molécula de ARN inhibidora similar, para inhibir la expresión de una molécula de ARN específica de interés en una célula hospedadora diana.

Genes de interés agronómico

Las moléculas de polinucleótido transcribibles pueden ser genes de interés agronómico. Como se usa en el presente documento, la expresión “gen de interés agronómico” se refiere a una molécula de polinucleótido transcribible que, cuando se expresa en un tejido, célula o tipo celular de planta particular, confiere una característica deseable, que se asocia con la morfología, fisiología, crecimiento, desarrollo, rendimiento, producto, perfil nutricional, resistencia a enfermedades o plagas y/o tolerancia ambiental o química de la planta. Los genes de interés agronómico incluyen aquellos que codifican una proteína de rendimiento, una proteína de resistencia al estrés, una proteína de control del desarrollo, una proteína de diferenciación tisular una proteína del meristemo, una proteína ambientalmente sensible, una proteína de senescencia, una proteína sensible a hormonas, una proteína de abscisión, una proteína productora, una proteína de consumo, una proteína de control de la floración, una proteína de semilla, una proteína de resistencia a herbicidas, una proteína de resistencia a enfermedades, una enzima biosintética de ácidos grasos, una enzima biosintética de tocoferol, una enzima biosintética de aminoácidos, una proteína pesticida, o cualquier otro agente, tal como una molécula antisentido o ARNi que se dirige a un gen particular para su supresión. El producto de un gen de interés agronómico puede actuar en la planta para producir un efecto en la fisiología o metabolismo de la planta o puede actuar como un agente pesticida en la dieta de una plaga que se alimenta de la planta.

Un promotor de la molécula de ADN de la presente memoria descriptiva se incorpora en una construcción de tal manera que el promotor está unido operativamente a una molécula de polinucleótido transcribible heteróloga que es un gen de interés agronómico. La expresión del gen de interés agronómico es deseable para conferir un rasgo agronómicamente beneficioso. Un rasgo agronómicamente beneficioso puede ser, por ejemplo, tolerancia a herbicidas, control de insectos, rendimiento modificado, resistencia a enfermedades fúngicas, resistencia a virus, resistencia a nematodos, resistencia a enfermedades bacterianas, crecimiento y desarrollo de la planta, producción de almidón, producción de aceites modificados, producción elevada de aceite, contenido de ácidos grasos modificado, producción elevada de proteínas, maduración del fruto, nutrición animal y humana potenciada, biopolímeros, resistencia al estrés ambiental, péptidos farmacéuticos y péptidos secretables, rasgos de procesamiento mejorados, digestibilidad mejorada, producción de enzimas, aromas, fijación de nitrógeno, producción de semillas híbridas, producción de fibra, y producción de biocombustibles. Como ejemplos de genes de interés agronómico se incluyen los de la resistencia a herbicidas (patentes de Estados Unidos 6.803.501; 6.448.476, 6.248.876, 6.225.114, 6.107.549, 5.866.775, 5.804.425, 5.633.435, y 5.463.175), rendimiento aumentado (patentes de Estados Unidos USRE38.446; 6.716.474, 6.663.906, 6.476.295, 6.441.277, 6.423.828, 6.399.330, 6.372.211, 6.235.971, 6.222.098, y 5.716.837), control de insectos (patentes de Estados Unidos 6.809.078; 6.713.063,

6.686.452, 6.657.046; 6.645.497; 6.642.030; 6.639.054; 6.620.988; 6.593.293; 6.555.655; 6.538.109; 6.537.756,

6.521.442; 6.501.009; 6.468.523, 6.326.351; 6.313.378; 6.284.949; 6.281.016; 6.248.536; 6.242.241; 6.221.649;

6.177.615; 6.156.573; 6.153.814; 6.110.464; 6.093.695; 6.063.756; 6.063.597; 6.023.013; 5.959.091; 5.942.664;

5.942.658, 5.880.275; 5.763.245, y 5.763.241), resistencia a enfermedades fúngicas (patentes de Estados Unidos 6.653.280, 6.573.361, 6.506.962; 6.316.407; 6.215.048, 5.516.671; 5.773.696; 6.121.436; 6.316.407; y 6.506.962), resistencia a virus (patentes de Estados Unidos 6.617.496; 6.608.241, 6.015.940; 6.013.864; 5.850.023; y 5.304.730), resistencia a nematodos (patente de Estados Unidos 6.228.992), resistencia a enfermedades bacterianas (patente de Estados Unidos 5.516.671), crecimiento y desarrollo de plantas (patentes de Estados Unidos 6.723.897 y 6.518.488), producción de almidón (patentes de Estados Unidos 6.538.181, 6.538.179, 6.538.178; 5.750.876; 6.476.295), producción de aceites modificados (patentes de Estados Unidos 6.444.876, 6.426.447, y 6.380.462), producción elevada de aceite (patente de Estados Unidos 6.495.739, 5.608.149, 6.483.008 y 6.476.295), contenido de ácidos grasos modificado (patentes de Estados Unidos 6.828.475; 6.822.141, 6.770.465, 6.706.950; 6.660.849; 6.596.538, 6.589.767; 6.537.750; 6.489.461 y 6.459.018), producción elevada de proteínas (patente de Estados Unidos 6.380.466), maduración del fruto (patente de Estados Unidos 5.512.466), nutrición animal y humana potenciada (patentes de Estados Unidos 6.723.837, 6.653.530, 6.5412.59, 5.985.605 y 6.171.640), biopolímeros

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(patentes de Estados Unidos USRE37.543, 6.228.623, 5.958.745 y 6.946,588), resistencia al estrés ambiental (patente de Estados Unidos 6.072.103), péptidos farmacéuticos y péptidos secretables (patentes de Estados unidos 6.812.379, 6.774.283, 6.140.075 y 6.080.560), rasgos de procesamiento mejorados (Patente de Estados Unidos 6.476.295), mejora de la digestibilidad (Patente de Estados Unidos 6.531.648), baja rafinosa (Patente de Estados Unidos 6.166.292), producción industrial de enzimas (Patente de Estados Unidos 5.543.576), mejora del sabor (Patente de Estados Unidos 6.011.199), fijación de nitrógeno (Patente de Estados Unidos 5.229.114), producción de semillas híbridas (Patente de Estados Unidos 5.689.041), producción de fibra (Patentes de Estados Unidos 6.576.818 6.271.443, 5.981.834 y 5.869.720) y producción de biocombustible (patente de Estados Unidos 5.998.700).

Como alternativa, un gen de interés agronómico puede afectar a las características o al fenotipo de las plantas anteriormente mencionado codificando una molécula de ARN que produce la modulación dirigida de la expresión génica de un gen endógeno, por ejemplo, por la vía antisentido (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 5.107.065); ARN inhibidor (“ARNi”, que incluye la modulación de la expresión genética mediante mecanismos mediados por miARN, ARNip, ARNip que actúa en trans y ARNs en fase, por ejemplo, como se describe en las solicitudes publicadas US 2006/0200878, US 2008/0066206 y US 2009/0070898); o mecanismos mediados por cosupresión. El ARN podría ser también una molécula de ARN catalítico (por ejemplo, una ribozima o un riborregulador; véase, por ejemplo, el documento US 2006/0200878) diseñada mediante ingeniería genética para escindir un producto de ARNm endógeno deseado. Por lo tanto, cualquier molécula de polinucleótido transcribible que codifica una molécula de ARN transcrito que afecta a un fenotipo o cambio de morfología agronómicamente importante de interés puede ser útil para la práctica de la presente invención. En la técnica se conocen procedimientos para la construcción e introducción de construcciones en una célula, de tal manera que la molécula de polinucleótido transcribible se transcriba en una molécula que sea capaz de producir la supresión génica. Por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos 5.107.065 y 5.759.829 se desvela la supresión génica postranscripcional utilizando una construcción con una molécula de polinucleótido transcribible en orientación antisentido para regular la expresión génica en células de plantas, y en las patentes de Estados Unidos 5.283.184 y 5.231.020 se desvela la supresión génica postranscripcional utilizando una construcción con una molécula de polinucleótido transcribible orientada en sentido para regular la expresión génica en plantas. La expresión de un polinucleótido transcribible en una célula de planta también se puede utilizar para suprimir las plagas de las plantas que se alimentan de las células de las plantas, por ejemplo, composiciones aisladas de plagas de coleópteros (publicación de patente de Estados Unidos US20070124836) y composiciones aisladas de plagas de nematodos (publicación de patente de Estados unidos US20070250947). Las plagas de plantas incluyen plagas de artrópodos, plagas de nematodos y plagas fúngicas o microbianas. Como ejemplos ilustrativos de moléculas de polinucleótido transcribibles para la incorporación en moléculas de ADN de la presente invención se incluyen, por ejemplo, moléculas de ADN o genes de especies distintas a las especies diana o genes que se originan con o están presentes en la misma especie, pero que se incorporan en células receptoras por procedimientos de modificación genética más que por técnicas de cruce y reproducción clásicas. El tipo de molécula de polinucleótido puede incluir una molécula de polinucleótido que ya esté presente en la célula de la planta, una molécula de polinucleótido de otra planta, una molécula de polinucleótido de un organismo diferente, o una molécula de polinucleótido generada externamente, tal como una molécula de polinucleótido que contiene un mensaje antisentido de un gen, o una molécula de polinucleótido que codifica un transgén artificial, sintético, o versión modificada de otra manera.

Marcadores de selección

Como se usa en el presente documento, el término "marcador" se refiere a cualquier molécula de polinucleótido transcribible cuya expresión, o ausencia de la misma, puede explorarse o puntuarse de alguna manera. Los genes marcadores para su uso en la práctica de la presente invención, incluyen moléculas de polinucleótido transcribibles que codifican la p-glucuronidasa (GUS, descrita en la patente de Estados Unidos 5.599.670), la proteína fluorescente verde y variantes de la misma (GFP descrita en las patentes de Estados Unidos 5.491.084 y 6.146.826), proteínas que confieren resistencia a antibióticos, o proteínas que confieren tolerancia a herbicidas. En la técnica se conocen marcadores útiles de resistencia a antibióticos, que incluyen los que codifican proteínas que confieren resistencia a kanamicina (nptlI), higromicina B (aph IV), estreptomicina o espectinomicina (aad, espec/estrep) y gentamicina (aac3 y aacC4). Los herbicidas para los que se ha demostrado tolerancia en plantas transgénicas incluyen: ácido amino-metil-fosfónico, glifosato, glufosinato, sulfonilureas, imidazolinonas, bromoxinil, delapon, dicamba, ciclohezanodiona, inhibidores de protoporfirinógeno oxidasa y herbicidas de isoxasflutol. En la técnica se conocen moléculas de polinucleótido transcribibles que codifican proteínas implicadas en la tolerancia a herbicidas, e incluyen una molécula de polinucleótido transcribible que codifica la 5-enolpiruvilsikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS para la tolerancia al glifosato descrita en las patentes de Estados Unidos 5.627.061, 5.633.435, 6.040.497; y 5.094.945); una molécula de polinucleótido transcribible que codifica una glifosato oxidorreductasa y una glifosato-N-acetil transferasa (GOX descrita en la patente de Estados Unidos 5.463.175; GAT, descrita en la publicación de patente de Estados Unidos 20030083480, y la dicamba monooxigenasa de la publicación de patente de Estados Unidos 20030135879); una molécula de polinucleótido transcribible que codifica la bromoxinil nitrilasa (Bxn para la tolerancia al bromoxinilo descrita en la patente de Estados Unidos 4.810.648); una molécula de polinucleótido transcribible que codifica la fitoeno desaturasa (crtI) descrita en Misawa, y col., Plant Journal 4:833- 840 (1993) y Misawa, y col., Plant Journal 6:481-489 (1994) para la tolerancia a norflurazón; una molécula de polinucleótido transcribible que codifica la acetohidroxiácido sintasa (AHAS, aka ALS) descrita en Sathasiivan, y

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col., Nucl. Acids Res. 18:2188-2193 (1990) para la tolerancia a los herbicidas de sulfonilurea; y el gen bar descrito en DeBlock, y col., EMBO Journal 6:2513-2519 (1987) para la tolerancia a glufosinato y a bialafos. Las moléculas promotoras de las moléculas de ADN descritas en el presente documento pueden expresar moléculas de polinucleótido transcribibles unidas que codifican la fosfinotricin acetiltransferasa, EPSPS resistente a glifosato, aminoglicósido fosfotransferasa, hidroxifenil piruvato deshidrogenasa, higromicin fosfotransferasa, neomicin fosfotransferasa, dalapón deshalogenasa, nitrilasa resistente a bromoxinilo, antranilato sintasa, ariloxialcanoato dioxigenasas, acetil CoA carboxilasa, glifosato oxidorreductasa y glifosato-N-acetil transferasa.

En la expresión "marcadores de selección" también se incluyen genes que codifican un marcador secretable cuya secreción puede detectarse como un medio para identificar o seleccionar células transformadas. Los ejemplos incluyen marcadores que codifican un antígeno secretable que se puede identificar por la interacción de anticuerpos, o incluso enzimas secretables que pueden detectarse catalíticamente. Las proteínas marcadoras secretadas seleccionables se encuentran en diversas clases, que incluyen proteínas pequeñas que se pueden difundir que son detectables (por ejemplo, por ELISA), enzimas pequeñas y activas que son detectables en una solución extracelular (por ejemplo, alfa-amilasa, betalactamasa, fosfinotricin transferasa), o proteínas que se insertan o atrapan en la pared celular (tal como proteínas que incluyen una secuencia líder tal como la que se encuentra en la expresión de la unidad de extensión o en las proteínas relacionadas con la patogénesis del tabaco, conocidas también como PR-S del tabaco). Otros posibles genes marcadores de selección serán obvios para los expertos en la técnica.

Transformación celular

En el presente documento también se desvela un procedimiento para producir células y plantas transformadas que comprenden un promotor unido operativamente a una molécula de polinucleótido transcribible heteróloga.

El término "transformación" se refiere a la introducción de ácido nucleico en un hospedador receptor. Como se usa en el presente documento, el término "hospedador" se refiere a una bacteria, hongo o planta, incluyendo cualquier célula, tejido, órgano, o descendencia de la bacteria, hongo o planta. Los tejidos y células de las plantas de particular interés incluyen protoplastos, callos, raíces, tubérculos, semillas, tallos, hojas, plántulas, embriones y polen.

Como se usa en el presente documento, el término "transformado" se refiere a una célula, tejido, órgano u organismo en el que en el que se ha introducido una molécula de polinucleótido exógena, tal como una construcción. La molécula de polinucleótido introducida puede integrarse en el ADN genómico de la célula, tejido, órgano u organismo receptor, de tal manera que la progenie posterior hereda la molécula de polinucleótido que se introduce. Un célula u organismo "transgénico o "transformado" también incluye la descendencia de la célula u organismo y la descendencia producida a partir de un programa de cultivo que emplea dicho organismo transgénico como un precursor en un cruce y que presenta un fenotipo alterado resultante de la presencia de una molécula de polinucleótido exógena. El término "transgénico" se refiere a una bacteria, a un hongo o a una planta que contiene una o más moléculas de ácido polinucleico heterólogo.

Existen muchos procedimientos para introducir moléculas de ácido polinucleico en las células de las plantas. El procedimiento comprende generalmente las etapas de seleccionar una célula hospedadora adecuada, transformar la célula hospedadora con un vector recombinante, y obtener la célula hospedadora transformada. Los procedimientos adecuados incluyen infección bacteriana (por ejemplo, con Agrobacterium), vectores cromosómicos artificiales bacterianos binarios, suministro directo de ADN (por ejemplo, por medio de transformación mediada por PEG, captación de ADN mediada por desecación/inhibición, electroporación, agitación con fibras de carburo de silicio, y aceleración de partículas revestidas de ADN (revisado en Potrykus, y col., Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 205 (1991)).

Para transformar una célula hospedadora con uno o más promotores y/o construcciones desvelados en la presente invención, puede utilizarse cualquier procedimiento de transformación. Las células hospedadoras pueden ser cualquier célula u organismo tal como una célula de planta, célula de alga, alga, célula fúngica, hongo, célula bacteriana o célula de insecto. Las células hospedadoras y transformadas preferidas incluyen células de plantas de Aspergillus, levaduras, insectos, bacterias y algas.

Las plantas transgénicas regeneradas pueden autopolinizarse para proporcionar plantas transgénicas homocigotas. Como alternativa, el polen obtenido de las plantas transgénicas regeneradas puede cruzarse con plantas no transgénicas, preferentemente líneas endógamas de especies agronómicamente importantes. Pueden encontrarse descripciones de los procedimientos de cruce que se utilizan comúnmente para diferentes rasgos y cultivos en uno de varios libros de referencia, véase, por ejemplo, Allard, Principles of Plant Breeding, John Wiley & Sons, NY, U. de CA, Davis, CA, 50-98 (1960) Simmonds, Principles of crop improvement, Longman, Inc., NY, 369-399 (1979); Sneep y Hendriksen, Plant breeding perspectives, Wageningen (ed), Center for Agricultural Publishing and Documentation (1979); Fehr, Soybeans: Improvement, Production and Uses, 2a edición, Monografía, 16:249 (1987)); Fehr, Principles of variety development, Theory and Technique, (Vol. 1) and Crop Species Soybean (Vol 2), lowa State Univ., Macmillan Pub. Co., NY, 360-376 (1987). Por el contrario, para polinizar plantas transgénicas regeneradas se puede utilizar polen de plantas no transgénicas.

Las plantas transformadas se pueden analizar para determinar la presencia de los genes de interés y el nivel de

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expresión y/o perfil conferido por las moléculas de ADN de la presente invención. Los expertos en la materia conocen numerosos procedimientos disponibles para el análisis de plantas transformadas. Por ejemplo, como procedimientos para el análisis de plantas se incluyen transferencias de Southern o transferencias northern, estrategias basadas en PCR, análisis bioquímicos, procedimientos de exploración fenotípica, evaluaciones de campo y ensayos inmunodiagnósticos. La expresión de una molécula de polinucleótido transcribible se puede medir utilizando reactivos y procedimientos TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA) como describe el fabricante y tiempos de ciclo de pCr determinados utilizando la matriz de ensayoTaqMan®. Como alternativa, para la expresión transgénica se pueden utilizar reactivos y procedimientos de Invader® (Third Wave Technologies, Madison, WI) como describe el fabricante.

Las semillas de las plantas de la presente invención se pueden recolectar a partir de plantas transgénicas fértiles y se pueden utilizar para cultivar generaciones de plantas transformadas descendientes de la presente invención, incluyendo líneas de plantas híbridas que comprenden la molécula de ADN de la presente invención y que expresan un gen de interés agronómico.

La presente invención también proporciona partes de plantas de la presente invención. Las partes de plantas incluyen hojas, tallos, raíces, tubérculos, semillas, endosperma, óvulos y polen. La invención también incluye y proporciona células de plantas que comprenden una molécula de ADN de la presente invención.

La planta transgénica puede pasar junto con la molécula de polinucleótido transgénica a su descendencia. La descendencia incluye cualquier parte de planta o semilla regenerable que comprende el transgén procedente de una planta antecesora. La planta transgénica es preferentemente homocigota para la molécula de polinucleótido transformada y trasmite la secuencia a todos los descendientes como resultado de la reproducción sexual. La descendencia se puede cultivar a partir de semillas producidas por la planta transgénica. Después, estas plantas adicionales pueden autopolinizarse para generar una línea de plantas por cruce verdadero. La descendencia de estas plantas se evalúa, entre otras cosas, por la expresión génica. La expresión génica se puede detectar mediante diversos procedimientos habituales, tales como transferencia western, transferencia northern, inmunoprecipitación y ELISA.

Habiendo ya descrito en general la invención, la misma se entenderá más fácilmente por referencia a los siguientes ejemplos. Los ejemplos que no están cubiertos por el ámbito de las reivindicaciones son con fines ilustrativos.

Ejemplos

Ejemplo 1: Identificación y clonación de elementos reguladores

Se identificaron nuevos elementos reguladores de la transcripción, o secuencias del grupo de elementos de expresión (EXP) reguladores de la transcripción y se aislaron del ADN genómico de la especie dicotiledónea Cucumis melo WSH-39-1070AN.

Basándose en datos patentados y públicos de micromatrices, obtenidos de experimentos de perfil transcripcional realizados en soja (Glycine max) y Arabidopsis, así como en búsquedas basadas en homología utilizando como consulta secuencias conocidas de dicotiledóneas frente a secuencias de Cucumis melo patentadas, se seleccionaron los elementos reguladores de la transcripción.

Utilizando las secuencias identificadas, se llevó a cabo un análisis bioinformático para identificar los elementos reguladores en el ADN amplificado, seguido de la identificación del sitio de inicio de la transcripción (SIT) y cualquier secuencia codificante en ambas direcciones, intrones, o corriente arriba presente en la secuencia. Utilizando los resultados de este análisis, se definieron los elementos reguladores en las secuencias de ADN y los cebadores diseñados para amplificar los elementos reguladores. La molécula de ADN correspondiente para cada elemento regulador se amplificó utilizando reacción en cadena de la polimerasa con condiciones estándar y cebadores que contenían sitios de enzimas de restricción únicos y ADN genómico aislado de la especie Cucumis melo. Los fragmentos de ADN resultantes se ligaron en vectores de expresión base de plantas, utilizando digestión con enzimas de restricción estándar.

El análisis del elemento regulador SIT y las uniones de corte y empalme de intrón/exón se puede realizar utilizando protoplastos de plantas transformadas. En resumen, los protoplastos se transformaron con los vectores de expresión de plantas que comprendían los fragmentos de aDn clonado unidos operativamente a una molécula de polinucleótido transcribible heteróloga y se utilizó el sistema 5' RACE (siglas del inglés rapid amplification of cDNA ends) de amplificación rápida de extremos de ADNc, versión 2.0 (Invtrogen, Carlsbad, California 92008), para confirmar el elemento regulador SIT y las uniones de corte y empalme de intrón/exón analizando la secuencia de los transcritos de ARNm producidos de ese modo.

Las secuencias que codifican grupos de elementos de expresión reguladores de la transcripción (EXP) de ubiquitina 1, se analizaron como se describe anteriormente y cada grupo de elementos de expresión reguladores de la transcripción ("EXP") también se dividió en los promotores, líderes e intrones correspondientes que comprenden cada grupo de elemento de expresión regulador de la transcripción.

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En el presente documento las secuencias de los grupos de elementos de expresión reguladores de la transcripción ("EXP") de ubiquitina 1 identificadas, se proporcionan como SEC ID N°: 1, 5, 7, 9 y 11 y se enumeran más adelante en la Tabla 1. En el presente documento los promotores de ubiquitina 1 correspondientes se proporcionan como SEC ID N°: 2, 6, 8, 10 y 12. El líder e intrón de ubiquitina se proporcionan como sEq ID NO: 3 y 4, respectivamente.

Las secuencias que codifican otras secuencias EXP o grupos de elementos de expresión reguladores de la transcripción de Cucumis que comprenden cualquiera de un elemento promotor, unido operativamente a un elemento líder; o un elemento promotor, unido operativamente a un elemento líder y un elemento intrón, o un elemento promotor, unido operativamente a un elemento líder, unido operativamente a un elemento intrón, unido operativamente a un elemento líder, se proporcionan como SEC ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 159, 162, 167, 168, 172, 175, 176, 177, 178, 181, 182, 183, 184, 185, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 211 y 212 y también se enumeran más adelante en la Tabla 1. Los elementos promotores adicionales de proporcionan como SEQ ID NO: 163 y 169. Los elementos líder adicionales de proporcionan como SEC ID NO: 164, 166 y 170. Los elementos intrón adicionales se proporcionan como SEC ID NO: 165 y 171. Los elementos en los que un promotor está unido operativamente a un elemento líder se proporcionan como SEQ ID NO: 157, 160, 173, 179 y 186. Los elementos en los que un intrón está unido operativamente a un elemento líder se proporcionan como SEQ ID NO: 158, 161, 174, 180 y 187. Con respecto al subconjunto de secuencias proporcionadas como SEQ ID NO: 13 a 199, 211 y 212, estas secuencias se seleccionaron y se clonaron en función de los resultados de experimentos tales como el perfil de la transcripción o la expresión dirigida por promotores de genes homólogos de una especie diferente que sugerían patrones de expresión deseables tales como la expresión constitutiva, la expresión en raíces, la expresión sobre la superficie o la expresión en semillas. La actividad real impartida por las secuencias de Cucumis se determina empíricamente y no es necesariamente la misma que la de un elemento regulador procedente de un gen homólogo de una especie distinta de Cucumis melo cuando se utiliza en una planta hospedadora transformada y en una planta transgénica completa.

Anotación

SEQID NO: Descripción Tipo de Composición Tamaño (P*>) Composición Coordenadas de Elementos entre EXP

EXP-CUCme.Ubq1:1:1

1 Ubiquitina 1 EXP 2611 Promotor;Líder; Intrón 1-2068:2069-2150; 2151-2608

P-CUCme.übq1-1: 1:15

2 Ubiquitina 1 P 2068 Promotor

L-CUCme.Ubq1-1:1:1

3 Ubiquitina 1 L 82 Líder

L-CUCme.Ubq1 1 1:1

4 Ubiquitina 1 I 461 Intrón

EXP-CUCme.Ubq1:1:2

5 Ubiquitina 1 EXP 2002 Promotor;Líder; Intrón 1 1459; 1460-1541: 1542-1999

P-CUCme.übq 1-1:1:16

6 Ubiquitina 1 P 1459 Promotor

EXP-CUCme.Ubq1:1:3

7 Ubiquitina 1 EXP 1507 Promotor;Lider; Intrón 1 964;965-1046; 1047 1504

P-CUCme.Ubq1-1: 1:17

8 Ubiquitina 1 P 964 Promotor

EXP-CUCme.Ubq 1:1:4

9 Ubiquitina 1 EXP 1022 Promotor;Líder; Intrón 1-479;480-561; 562-1019

P-CUCme.Ubq1-1: 1:18

10 Ubiquitina 1 P 479 Promotor

EXP-CUCme.Ubq1:1:5

11 Ubiquitina 1 EXP 716 Promotor;Lider; Intrón 1-173; 174-255; 256-713

P-CUCme.Ubq1-1: 1:19

12 Ubiquitina 1 P 173 Promotor

P-CUCme.1-1 1:1

13 Fosfatasa 2A EXP 2000 Promotor;Líder; Intrón; Líder Complemento inverso; véase la SEQ ID NO; 155

P-CUCme.2-1:1:1

14 Actina 1 EXP 2000 Promotor;Lider; Intrón; Líder 1 964:965 1028: 1029 1991 ;1992-2003

P-CUCme.3-1:1:3

15 Actina 2 EXP 1990 Promotor; Líder; Intrón; Líder 1 1243; 1244 1319; 1320-1982; 1983-1990

P-CUCme.4-1:1:2

16 Ubiquitina 2 EXP 2005 Promotor;Líder; Intrón; Líder 1-1646; 1647-1704: 1705- 2005:2006-2008

P-CUCme.5-1:1:2

17 Ubiquitina 3 EXP 2004 Promotor;Lider; Intrón 1-748;749 819; 820-2004

P-CUCme.6-1:1:1

18 Cadena beta de tubulina EXP 1935 Promotor;Líder; Intrón; Líder 1-1436; 1437-1482; 1483-1919; 1920-1935

Anotación

SEQ ID NO: Descripción Tipo de Composición Tamaño (Pb) Composición Coordenadas de Elementos entre EXP

P-CUCme.8-1:1:2

19 Cadena beta de tubulina EXP 1606 Promotor;Líder; 1-1527; 1528- 1606

P-CUCme.9-1:1:2

20 Cadena beta de tubulina EXP 1487 Promotor; Líder; 1-1384; 1385- 1487

P-CUCme. 10-1:1:1

21 Cadena beta de tubulina EXP 1448 Promotor;Líder; 1-1363; 1364- 1448

P-CUCme. 11-1:1:2

22 Factor de Elongación 1 alfa EXP 1235 Promotor; Líder; Intrón 1-617;618-677; 678-1213:1214- 1235

P-CUCme. 15-1:1:2

23 Factor de Elongación 1 alfa EXP 2003 Promolor;Lider; Intrón; Líder 1-1330:1331- 1435; 1430- 1975:1976-2002

P-CUCme.16a-1:1:2

24 Ubiquitina 7 EXP 2015 Promotor;Líder;

P-CUCme. 16b-1:1:1

25 Ubiquitina 6 EXP 2006 Promotor,Líder;

P-CUCme. 17-1:1:2

26 proteína rlbosómica S27a de ubiquitina 40S EXP 2017 Promotor; Líder; 1-1969:1970-2017

P-CUCme.18-1:1:2

27 proteína ribosómica S27a de ubiquitina 40S EXP 1353 Promo1or;Líder; 1-1308:1309-1353

P-CUCme.19-1:1:2

28 Proteina de unión a clorofila a/b EXP 2005 Promotor;Líder; 1-1960:1961-2005

P-CUCme.20-1:1:2

29 Proteina de unión a clorofila a/b EXP 1445 Promotor;Líder; 1-1390:1391-1445

P-CUCme.21-1:1:1

30 Proteina de unión a clorofila a/b EXP 1282 Promo1or;Líder; 1-1233:1234-1282

P-CUCme.22-1:1:3

31 Factor de Elongación 4 alfa EXP 2002

P-CUCme.24-1:1:2

32 S-Adenosilme1ionina Sinletasa EXP 2003 Promotor;Líder; lntrón:Líder 1-1067:1068- 1165; 1166- 2001:2002-2003

P-CUCme.26-1:1:2

33 Proteina sensible a estrés EXP 1372 Promotor;Líder; Intrón; Líder 1-577:576-654: 655-1366;1367- 1372

P-CUCme.28-1:1:2

34 Proteina ribosómica S5a EXP 1122

P-CUCme.29-1:1:2

35 Proteina ribosómica S5a EXP 2017 Promotor;Líder; Intrón; Líder 1-490:491-571; 572-2012:2013- 2017

CumMe_WSM_SF 14398 1.G5150

36 LHCB6 (COMPLEJO DE ABSORCIÓN LUMÍNICA PSII SUBUNIDAD 6) EXP 2000

CumMe_WSM_SF 14483 9.G5080

37 factor de inicio de la traducción EIF2 EXP 1760

Anotación

SEQ ID NO: Descripción Tipo de Composición Tamaño (pb) Composición Coordenadas de Elementos entre EXP

GAMMA

CumMe_WSM_SF 14604 0.G5050

38 factor de inicio de la traducción EIF2 EXP 1767

CumMe_WSM_SF 16408.G5350

39 factor de elongación Tu EXP 2000

CumMe_WSM_SF16429.G5670

40 proteína desconocida EXP 2000

CumMe_WSM_SF 16444 .G5140

41 histona FI4 EXP 2000 Promotor; Líder, 1-1947,1948-2000

CumMe_WSM_SF16530.G6000

42 factor de transcripción FIMGB2 (GRUPO B 2 DE ALTA MOVILIDAD) EXP 2000

CumMe_WSM_SF 16553.G5090

43 PBG1, endopeptidasa de tipo treonina EXP 1115

CumMe_WSM_SF16563.G5560

44 ATARFB1A (factor de ADP-ribosiladón B1A) EXP 2000 Promotor;Llder; Intrón; Líder 1-1329:1330- 1427; 1428- 1988:1989-2000

CumMe_WSM_SF16675.G5720

45 familia de proteínas de la cromatlna EXP 2000

CumMe_WSM_SF 16920.G5650

46 CSD1 (SUPERÓXIDO DISMUTASA 1 DE COBRE/CINC) EXP 2000

CumMe_WSM_SF169S3.G5180

47 SCE1 (ENZIMA 1 DE CONJUGACIÓN DE SUMO); Ligasade SUMO EXP 2000

CumMe_WSM_SF17051 .G5470

48 proteina ribosómica de 60S L9 (RPL90D) EXP 2000

CumMe_WSM_SF17111 .G5790

49 proteina de unión a ublquinona del complejo ubiquinol-citocromo C reductasa EXP 2000 Promotor;Líder; 1-1895;1896-2000

CumMe_WSM_SF17142 .G5920

50 peptidil-prolil cis-trans isomerasa, cloroplasto EXP 2000

CumMe_WSM_SF17190.G6200

51 PRK (FOSFORRIBULOQUINASA) EXP 2000

CumMe_WSM_SF17250.G5910

52 LHCB5 (COMPLEJO DE ABSORCIÓN LUMÍNICA DE FOTOSISTEMA II 5) EXP 2000

CumMe_WSM_SF 17252 .G7330

53 proteína que contiene el dominio del complejo asociado a polipéptido naciente (NAC) EXP 2000 Promotor;Líder: Intrón 1-1195:1196- 1297, 1298-2000

CumMe_WSM_SF17253.G5150

54 RPS9 (PROTEINA RIBOSÓMICA S9) EXP 1547

CumMe_WSM_SF 17322 .G5110

55 proteina ribosómica de 60S L22 (RPL22A) EXP 2000

CumMe_WSM_SF17349.G5770

56 PGRL1B (PGR5 de tipo B) EXP 2000

CumMe_WSM_SF17357.G5630

57 proteína ribosómica de 40S S10 (RPS10B) EXP 2000

CumMe_WSM_SF 17494 .G5140

58 MEE34 (detención de embriones con efecto materno 34) EXP 1591

Anotación

SEQ ID NO: Descripción Tipo de Composición Tamaño (Pb) Composición Coordenadas de Elementos entre EXP

CumMe_WSM_SF 17524 .G6410

59 SUS2 (SUSPENSOR ANÓMALO 2) EXP 2000

CumMe_WSM_SF17672 .G5610

60 PSAK (fotosistema I subunidad K) EXP 2000

CumMe_WSM_SF17773.G6620

61 proteína que contiene el dominio C terminal de acorhasa EXP 2000

CumMe_WSM_SF17866.G6050

62 ATPDIL5-1 (5-1 similar a PDI) EXP 2000

CumMe_WSM_SF 18004 .G6600

63 proteína de la familia de glicoproteína rica en hídroxiprolína EXP 2000

CumMe_WSM_SF18045.G6670

64 EXP 2000

CumMe_WSM_SF 18053 .G5410

65 proteina de endcmembrana 70 EXP 2000

CumMe_WSM_SF18287.G5380

66 CP12-1 EXP 2000

CumMe_WSM_SF18488.G5340

67 cafeoll-CoA 3-O-metiltransferasa EXP 2000 Promotor;Líder; 1-1923:1924-2000

CumMe_WSM_SF 18504 .G5030

68 proteina de la familia de la subunidad Fl de la ATP sintasa vacuolar EXP 2000

CumMe_WSM_SFl8530,G5750

69 GUN5(GENOMESUNCOUPLED5); magnesio quelatasa EXP 2000

CumMe_WSM_SF18536.G6480

70 Coactivador de transcripción MBF1A (FACTOR 1A COMUNICANTE DE MULTIPROTEINA) EXP 2000

CumMe_WSM_SF 18575 .G6410

71 proteina desconocida EXP 2000

CumMe_WSM_SF 18634 G5190

72 proteína ríbosómica de 60S L23 (RPL23A) EXP 2000 PromotorLíder; 1-1971:1972-2000

CumMe_WSM_SF18645.G5380

73 GS2 (GLUTAMINA SINTETASA 2) EXP 2000

CumMe_WSM_SF18716.G5860

74 proteina ríbosómica de 40S 12 (RPS12A); Complemento inverso: proteína similar a X10A inducida porauxina EXP 2000 Promotor;Líder; Complemento inverso; véase la SEQ ID NO: 184

CumMe_WSM_SF18801 G5040

75 EXP 2000

CumMe_WSM_SF18806.G6220

76 proteína desconocida EXP 2000

CumMe_WSM_SF18850.G5630

77 PAC1, endopeptidasa de tipo treonina EXP 2000

CumMe_WSM_SF18863.G7550

78 cadena gamma de ATP sintasa, milocondrial (ATPC) EXP 2000

CumMe_WSM_SF18986.G6110

79 GER1 (PROTEINA 1 SIMILAR A GERMINA) oxalato oxidasa EXP 2000

CumMe_WSM_SF 19064 .G5690

80 histona H3.2 EXP 2000 PromotorLíder, Intrón 1-1581,1582- 1670; 1671-2000

Anotación

SEQ ID NO: Descripción Tipo de Composición Tamaño <pb> Composición Coordenadas de Elementos entre EXP

Cu m Me_WSM_SF19323 G5120

81 proteína de unión a GTP de la envoltura exterior del cloroplasto, hipotética EXP 2000

CumMe_WSM_SF 19452 G5090

82 glucano fosforilasa, hipotética EXP 1072

CumMe_WSM_SF19631 G5170

83 RuBisCO activasa, hipotética EXP 1730

Cu m Me_WSM_SF19647 .G5760

84 proteína de la familia de la 6-fosfogluconato deshidrogenasa EXP 2000 Promotor;Líder; Intrón; Líder 1-936:937-1021; 1022-1992:1993- 2000

Cu m Me_WSM_SF19839 G5090

85 ATPDX1.1 (bíosintesis de piridoxina 1.1) EXP 1020 Promotor;Líder; 1-928:929-1020

CumMe_WSM_SF19850.G5130

86 factor de transcripción HMGB2 (GRUPO B 2 DE ALTA MOVILIDAD) EXP 2000

CumMe_WSM_SF 19902 .G5260

87 proteínas de la familia de proteínas de estrés universal (USP)Zproteínas de la familia ENOD18 de nodulina temprana EXP 2000

CumMe_WSM_SF 19992 .G6100

88 proteína desconocida EXP 2000

CumMe_WSM_SF20132.G5560

89 peroxidasa 21 EXP 2000 Promotor; Líder; 1-1962:1963-2000

CumMe_WSM_SF20147.G7910

90 CSD1 (SUPERÓXIDO DISMUTASA 1 DE COBRE/CINC) EXP 2000

Cu m Me_WSM_SF20355,G5130

91 familia de ATP sintasa EXP 2000

CumMe_WSM_SF20359.G5870

92 NADFI-ubiquinona oxidorreductasa subunidad de 20 kDa, mitocondrial EXP 2000

Cu m Me_WSM_SF20368 G5700

93 PGR5 (regulación de gradiente de protones 5) EXP 2000

Cu m Me_WSM_SF20409. G5240

94 subunidad 1 del factor de elongación 1B alfa (eEFIBalphal) EXP 2000

CumMe_WSM_SF20431 .G6340

95 DFIS2 (3-desoxi-d-arabino-heptulosonato 7- fosfato sintasa) EXP 2000

CumMe_WSM_SF20505.G5440

96 THIC (Tiamina C); ADP-ribosa pirofosfohidrolasa EXP 1373

CumMe_WSM_SF20509.G5920

97 Y14. proteína de unión / unión a ARN EXP 2000

CumMe_WSM_SF20645 8.G5970

98 FAD2 (ÁCIDO GRASO DESATURASA 2) EXP 2000 Promotor 1-2000

CumMe_WSM_SF20653 4.G5200

99 proteina desconocida EXP 2000

CumMe_WSM_SF20997.G6990

100 ALD1 (PROTEINA 1 DE RESPUESTA A DEFENSA SIMILAR A AGD2) EXP 2000

Anotación

SEQ ID NO: Descripción Tipo de Composición Tamaño (Pt>) Composición Coordenadas de Elementos entre EXP

CumMe_WSM_SF21035.G5090

101 proteína de la familia de intercambiadores de sodio/calcio EXP 1078

CumMe_WSM_SF21117.G5370

102 proteína ribosómica 30S hipotética EXP 2000

CumMe_WSM_SF21141 .G5630

103 proteína ribosómica de 40S S24 (RPS24A) EXP 2000

CumMe_WSM_SF21198.G5180

104 EXP 1974

CumMe_UVSM_SF21366.G5980

105 GRF12 ( FACTOR 12 REGULADOR GENERAL) EXP 2000

CumMe_WSM_SF21828.G5150

106 cphlsc70-1 (proteína de choque térmico de cloroplasto 70-1) EXP 1643

CumMe_WSM_SF21886.G5080

107 NPQ4 (INACTIVACIÓN NO FOTOQUIMICA) EXP 2000

CumMe_WSM_SF22008.G5670

108 NAP1 ;2 (PROTEÍNA 1 ;2 DE ENSAMBLAJE AL NUCLEOSOMA) EXP 2000

CumMe_WSM_SF22070.G5280

109 frudosa-bisfosfato aldolasa, hipotética EXP 2000

CumMe_WSM_SF22097.G5540

110 APX3 (ASCORBATO PEROXIDASA 3) EXP 2000

CumMe_WSM_SF22254.G5760

111 proteína ribosómica de 40S S7 (RPS7B) EXP 2000

CumMe_WSM_SF22275.G5780

112 proteína de la familia de proteínas ribosómicas L17 EXP 1027

CumMe_WSM_SF22355.G5310

113 EXP 2000

CumMe_WSM_SF22531 .G5120

114 factor de inicio de la traducción eucariota 1 A; hipotético EXP 2000 PromotorLider; Intrón: Líder 1-759;760-858; 859-1979:1980- 2000

CumMe_WSM_SF22870,G5370

115 ATSARA1A (SUPERFAMILIA 1 DE RAS ASOCIADA CON LA SECRECIÓN DE ARABIDOPSIS THALIANA) EXP 2000

CumMe_WSM_SF22934.G5290

116 subunídad épsilon de la proteina 1 del complejo T hipotética EXP 2000

CumMe_WSM_SF23181 .G5100

117 CEV1 (EXPRESIÓN CONSTITUTIVA DE VSP 1) EXP 1025

CumMe_WSM_SF23186.G6160

118 proteína de 14 kDa del complejo ubiquinol- citocromo C reductasa, hipotética EXP 2000

CumMe_WSM_SF23397.G5210

119 RPL27 (SUBUNIDAD GRANDE DE LA PROTEINA RIBISÓMICA 27) EXP 2000

CumMe_WSM_SF23760.G5200

120 NDPK1; nudeósldo difosfato quinasa de unión a ATP EXP 2000 Promotor;Líder; 1-1901;1902-2000

Anotación

3EQ ID NO: Descripción Tipo de Composición Tamaño <pb> Composición Coordenadas de Elementos entre EXP

CumMe_WSM_SF23906,G6180

121 PSBX (subunidad X de fotosistema II) EXP 2000

CumMe_WSM_SF24040.G5450

122 RPS17 (PROTEiNA RIBOSÓMICA S17) EXP 2000

CumMe_WSM_SF24045.G5400

123 EXL3 (EXORDIUM SIMILAR A 3) EXP 2000

CumMe_W5M_SF24117.G5600

124 proteina ribosómica de 605 L26 (RPL26A) EXP 2000

CumMe_WSM_SF25084.G5580

125 EXP 2000

CumMe_WSM_SF25l41.G5180

126 isocitrato deshidrogenasa, hipotética EXP 1397 Promotor;Líder; 1-1322 1323-1397

CumMe_WSM_SF25355.G5000

127 LOS1. factor de elongación de la traducción de unión a iones de cobre EXP 2000 Promotor;Líder; Intrón; Lider;CDS 1-734:735-811; 812-1340:1341- 1360; 1361-2000

CumMe_WSM_SF25370.G5000

128 PSBP-1 (SUBUNIDAD P-1 DE FOTOSISTEMA II) EXP 1657

CumMe_WSM_SF25455,G5370

129 GLY3 (GLIOXALASA II 3) EXP 2000

CumMe_WSM_SF25936.G5450

130 proteína de la familia transportadora de sustralo mitocondrial EXP 2000 Promotor;Lider; 1-1878:1879-2000

CumMe_WSM_SF27080.G5510

131 LIP1 (ÁCIDO LIPOICO SINTASA 1} EXP 2000

CumMe_WSM_SF27222 .G5150

132 DRT112, transportador de electrones de unión a iones de cobre EXP 2000

CumMe_WSM_SF27957.G5450

133 SMAP1 (PROTEINA 1 ACIDA PEQUEÑA) EXP 2000

CumMe_WSM_SF28729.G5340

134 proteína cp29 de unión a ARN, hipotética EXP 1696

CumMe_WSM_SF28805.G6200

135 proteina desconocida EXP 2000

CumMe_WSM_SF31264.G5380

136 ATPH1 (HOMOLOGO 1 DE PLECKSTRINA DE ARABIDOPSIS THALIANA) EXP 2000

CumMe_WSM_SF35856.G5150

137 TIP4; 1 (proteina 4 intrínseca del tonoplasto; D EXP 1575

CumMe_WSM_SF40859.G5250

138 SMT2 (ESTEROL METILTRANSFERASA 2) EXP 2000

CumMe_WSM_SF41124.G5080

139 proteína ribosómica de 40S S2 (RPS2C) EXP 1006 Promotor;Lider; 1-883:884-1006

CumMe_WSM_SF41128.G5410

140 CRY2 (CRIPTOCROMO 2) EXP 2000

CumMe_WSM_SF41254.G5160

141 GDP-D-glucosa fosforilasa EXP 1556

CumMe_WSM_SF41588.G5470

142 PRPL11 (PROTEINA RIBOSÓMICA PLASTIDIAL L11) EXP 2000

CumMe_WSM_SF41644 .G6400

143 SHD(SHEPHERD) EXP 2000

CumMe_WSM_SF41983.G5000

144 unión a coenzima/catalítica EXP 1337

Anotación

SEQ ID NO: Descripción Tipo de Composición Tamaño (pb) Composición Coordenadas de Elementos entre EXP

CumMe_WSM_SF42075.G5100

145 CPN60B (CHAPERONINA 60 BETA) EXP 2000

CumMe_WSM_SF42141 .G5110

146 cisteína proteasa similar a catepsina B, hipotética EXP 1212

CumMe_WSM_SF44933.G5290

147 proteina ubiquitina ligasa EBF1 (PROTEÍNA 1 DE CAJA F DE UNIÓN A EIN3) EXP 2000

CumMe_WSM_SF44977.G5000

148 PAP25 (FOSFATASA ÁCIDA PÚRPURA 26) EXP 1254

CumMe_WSM_SF45441 .G5510

149 GAPA-2 (GLICERALDEH¡DO 3-FOSFATO DESHIDROGENASA A SUBUNIDAD 2) EXP 2000

CumMe_WSM_SF45882.G5120

150 fructosa-1,6-bisfosfatasa, hipotética EXP 1680

C u mMe_WSM_SF4 7806.G5070

151 cadena épsilon de ATP sintasa, mitocondrial EXP 1524

CumMe_WSM_SF53106.G5190

152 CPN60A (CHAPERONINA-6OALFA) EXP 1851

CumMe_WSM_SF65588.G5230

153 relacionada con la proteina de unión a calcio vacuolar EXP 2000

CumMe_WSM_SF9060, G5120

154 APE2 (ACLIMATACIÓN DE LA FOTOSÍNTESIS AL ENTORNO 2) EXP 1288

P-CUCme.1-1:1:1rc

155 Fosfatasa 2A EXP 2000 Promotor;Líder; Intrón; Líder 1-1135;1136- 1249; 1250- 1990:1991-2000

EXP-CUCme.4:1:1

156 Ubiquitina 2 EXP 2011 PromotorLíder; Intrón; Líder 1-1646:1647- 1704; 1705- 2005:2006-2008

P-CUCme.4-1:1:4

157 Ubiquitina 2 P;L 1698 PromotorLíder;

L-CUCme.4-1:1:1

158 Ubiquitina 2 l;L 313 lntrón;Líder

EXP-CUCme,5:1:1

159 Ubiquitina 3 EXP 2010 PromotorLíder; Intrón; Líder 1-748:749-819, 820-2004:2005- 2007

P-CUCme,5-1:1:3

160 Ubiquitina 3 P,L 1107 Promotor,Líder,

L-CUCme.5-1:1:1

161 Ubiquitina 3 l;L 903 lntrón;Lider

EXP-CUCme.eEF1a:1:1

162 Factor de Elongación 1 alfa EXP 1235 Promotor,Líder; Intrón; Líder 1 -G17 ;618-S77; 678-1213:1214- 1235

P-CUCme.eEF1a-1:1:

163 Factor de Elongación 1 alta P 617 Promotor

L-CUCme.eEF1a-1:1:1

164 Factor de Elongación 1 alfa L 54 Líder

Anotación

SEQ ID NO: Descripción Tipo de Composición Tamaño (pb) Composición Coordenadas de Elementos entre EXP

l-CUCme eEF1a-1:1:1:

165 Factor de Elongación 1 alfa i 545 Intrón

L-CUCme.eEF1a-1:1:2

166 Factor de Elongación 1 alfa L 19 Líder

P-CUCme. 19-1:1:3

167 Proteina de unión a clorofila a/b EXP 2003 Promotor;Líder; 1-1958:1959-2003

EXP-CUCme.SAMS2:1:1

168 S-Adenosilmetionina Sintetasa EXP 2004 Promotor;Lider; Intrón 1-1067:1068 1165; 1166-2003

P-CUCme SAMS2-1:1:1

169 S-Adenosilmetionina Sintetasa P 1067 Promotor

L-CUCme.SAMS2-1:1:1

170 S-Adenosilmetionina Sintetasa L 92 Lider

L-CUCme.SAMS2-1:1:1

171 S-Adenosilmetionina Sintetasa I 845 Intrón

EXP-CUCme.29:1:1

172 Proteína ribosómica S5a EXP 2018 Promotor;Lider; Intrón; Líder 1-490:491-571; 572-2012:2013- 2018

P-CUCme. 29-1 1:4

173 Proteina ribosómica S5a P;L 565 Promotor;Lider;

L-CUCme.29-1:1:1

174 Proteina ribosómica S5a l;L 1453 lntrón;Líder

P- CUCme.CumMe WSM SF16444.G5140- 1:1:1

175 histona FH4 EXP 1999 PromotonLíder, Intrón 1-1946:947-1999

P- CUCme.CumMe WSM SF16563.G5560- 1:1:1

176 ATARFB1A (factor de ADP-ribosilación B1 A) EXP 2004 Promotor;Lider; Intrón; Líder 1-1331:1332- 1429; 1430- 1992;1993-2004

P-CUCme.CumMe WSM SF17111 ,G5790-1:1:1

177 proteína de unión a ubiquinona del complejo ubiquinol-citocromo C reductasa EXP 2005 Promotor;Lider; 1-1901:1902-2005

EXP-CumMe.WSM_SF17252. G7330;1:1

178 proteina que contiene el dominio del complejo asociado a polipéptido naciente (NAC) EXP 1978 Promotor;Lider; Intrón, Líder 1-1167;1168- 1269, 1270- 1972:1973-1975

P-CUCme.WSM_SF 17252. G7330-1:1: 1

179 proteina que contiene el dominio del complejo asociado a polipéptido naciente (NAC) P;L 1263 Promotor;Lider;

l-CUCme,WSM_SF 17252. G7330-1:1: 1

180 proteina que contiene el dominio del complejo asociado a polipéptido naciente (NAC) I; L 715 lntrón;Líder

P- CUCme.CumMe WSM SF18488.G5340- 1:1:1

181 cafeoil-CoA 3-O-meliltransferasa EXP 2000 PromotonLídier; 1-923; 1924-2000

P-CUCme.CumMe_WSM_SF

182 Coactivador de transcripción MBF1A EXP 2000 Promotor;Lider;

Anotación

SEQ ID NO: Descripción Tipo de Composición Tamaño (Pb) Composición Coordenadas de Elementos entre EXP

18536.G6480-1:1:1

(FACTOR 1A COMUNICANTE DE MULTIPROTEINA) Intrón

P- CUCme.CumMe WSM SF18634.G5190- 1:1:1

183 proleína ribosómica de 60S L23 (RPL23A) EXP 1989 Promotor,Líder: 1-1960; 1961- 1989

P- CUCme.CumMe WSM SF18716.G5860- 1:1:1

184 proleína similar a X10A inducida por auxina EXP 1463 Promotor:Líder; 1-1392; 1393- 1463

EXP-CUCme.WSM_SF 19064. G5690:1: 1

185 historia H3.2 EXP 2006 Promotor:Líder; Intrón; Líder 1-1581; 1582- 1670; 1671 - 2000;2001 -2003

P-CUCme.WSM_SF 19064. G5690-1:1 1

186 historia H3.2 P;L 1664 Promotor;Líder;

l-CUCme.WSM_SF 19064. G5690-1:1: 1

187 histona H3.2 l;L 342 lntrón;Líder

P-CUCme.CumMe WSM^SF 19647.G5760-1:1:1

188 proteina de la familia de la 6-fosfogluconato deshidrogenasa EXP 2003 Promotor;Líder; Intrón: Líder 1-939:940-1024; 1025-1995: 1996- 2003

P-CUCme.CumMe WSM SF 19839.05090-1:1:1

189 ATPDX1.1 (biosíntesis de piridoxina 1.1) EXP 1024 Promotor; Líder; 1-904;905-1024

P- CUCme.CumMe WSM SF20132.G5560- 1:1:1

190 peroxidasa 21 EXP 2001 Promotor;Líder; 1-1962; 1963- 2001

P- CUCme CumMe WSM SF206458.G5970- 1:1:1

191 FAD2 (ACIDO GRASO DESATURASA 2) EXP 4175 Promotor;Líder; Intrón; Líder 1-2171;2172- 2325, 2326- 4155:4156-4175

P- CUCme.CumMe WSM SF22531.G5120- 1:1:1

192 factor de inicio de la traducción eucariota 1A, hipotético EXP 1999 Promotor;Líder; Intrón: Líder 1-759:760-858; 859-1978:1979- 1999

P- CUCme.CumMe_WSM_SF23760.G5200- 1:1:1

193 NDPK1, nucleósido difosfato quinasa de unión a ATP EXP 2000 Promotor;Líder; 1-1901:1902-2000

P- CUCme.CumMe WSM SF23906.G6180- 1:1:1

194 PSBX (subunidad X de fotosistema II) EXP 2000 Promotor; Líder;

P- CUCme.CumMe WSM SF25141.G5160- 1:1:2

195 isocitrato deshidrogenasa, hipotética EXP 1400 Promotor;Líder; 1-1325:1326-1400

Anotación

SEQ ID NO: Descripción Tipo de Composición Tamaño (Pb) Composición Coordenadas de Elementos entre EXP

P- CUCme.CumMe WSM SF25355.G5000- 1:1:1

196 LOS1, factor de elongación de la traducción de unión a iones de cobre EXP 2019 Promotor;Líder; Intrón; Líder;CDS 1-734;735-811; 812-1340;1341- 1360; 1361-2019

P- CUCme.CumMe WSM SF25936.G5450- 1:1:1

197 proteína de la familia transportadora de sustrato mitocondrial EXP 1999 Promotor; Líder; 1-1877;1878-1999

P- CUCme.CumMe WSM SF35856.G5150- 1:1:1

198 TIP4. 1 (proteína 4 intrínseca del tonoplasto; 1) EXP 1578

P- CUCme.CumMe WSM SF41124.G5080- 1:1:1

199 proteína ribosómica de 40S S2 (RPS2C) EXP 1023 Promotor; Líder; 1-945;946-1023

P-CUCme.20-1:3

211 Proteína de unión a clorofila a/b EXP 1446 Promotor; Líder; 1-1390;1391-1446

EXP-CUCme.29:1:2

212 Proteina ribosómica S5a EXP 2018 Promotor;Líder; Intrón; Líder 1-490;491-571; 572-2011;2013- 2018

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Como se muestra en la Tabla 1, por ejemplo, el grupo de elemento de expresión regulador de la transcripción (EXP) denominado EXP-CUCme.Ubq1:1:1 (SEQ ID NO: 1), con componentes aislados de C. melo, comprende un elemento promotor del tamaño de 2068 pares de bases (pb), P-CUCme.Ubq1-1:1:15 (SEQ ID NO: 2), unido operativamente en 5' a un elemento líder, L-CUCme.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 3) unido operativamente en 5' a un elemento intrón, I-CUCme.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 4). El grupo de elementos de expresión reguladores de la transcripción (EXP) denominado EXP-CUCme.Ubq1:1:2 (SEQ ID NO: 5), con componentes aislados de C. melo, comprende un elemento promotor de 1459 pb, P-CUCme.Ubq1-1:1:16 (SEQ ID NO: 6), unido operativamente en 5' a un elemento líder, L-CUCme.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 3) unido operativamente en 5' a un elemento intrón, I- CUCme.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 4). El grupo de elementos de expresión reguladores de la transcripción (EXP) denominado EXP-CUCme.Ubq1:1:3 (SEQ ID NO: 7), con componentes aislados de C. melo, comprende un elemento promotor de 964 pb, P-CUCme.Ubq1-1:1:17 (SEQ ID NO: 8), unido operativamente en 5' a un elemento líder, L-CUCme.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 3) unido operativamente en 5' a un elemento intrón, I-CUCme.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 4). El grupo de elementos de expresión reguladores de la transcripción (EXP) denominado EXP- CUCme.Ubq1:1:4 (SEQ ID NO: 9), con componentes aislados de C. melo, comprende un elemento promotor de 479 pb, P-CUCme.Ubq1-1:1:18 (SEQ ID NO: 10), unido operativamente en 5' a un elemento líder, L-CUCme.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 3) unido operativamente en 5' a un elemento intrón, I-CUCme.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 4). El grupo de elementos de expresión reguladores de la transcripción (EXP) denominado EXP-CUCme.Ubq1:1:5 (SEQ ID NO: 11), con componentes aislados de C. melo, comprende un elemento promotor de 173 pb, P-CUCme.Ubq1-1:1:19 (SEQ ID NO: 12), unido operativamente en 5' a un elemento líder, L-CUCme.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 3) unido operativamente en 5' a un elemento intrón, 1-CUCme.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 4).

En las figuras 1a-1f se proporciona un alineamiento de las secuencias promotoras de ubiquitina 1. Los elementos promotores, P-CUCme.Ubq1-1:1:16 (SEQ ID NO: 6), P-CUCme.Ubq1-1:1:17 (SEQ ID NO: 8), P-CUCme.Ubq1- 1:1:18 (SEQ ID NO: 10) y P-CUCme.Ubq1-1:1:19 (SEQ ID NO: 12), se construyeron introduciendo diferentes longitudes de deleciones desde el extremo 5' del promotor, P-CUCme.Ubq1-1:1:15 (SEQ ID NO: 2).

Ejemplo 2: Análisis de elementos reguladores que dirigen la GUS en protoplastos de cotiledón de soja.

Protoplastos de cotiledón de soja se transformaron con vectores de expresión de plantas que contenían un grupo de elementos de expresión reguladores de la transcripción de ensayo que dirigía la expresión del transgén de la □- glucuronidasa (GUS), y se compararon con la expresión de GUS en protoplastos de hoja en los que la expresión de GUS estaba dirigida por promotores constitutivos conocidos.

La expresión de un transgén dirigida por EXP-CUCme.Ubq1:1:1 (SEQ ID NO: 1), EXP-CUCme.Ubq1:1:2 (SEQ ID NO: 5), EXP-CUCme.Ubq1:1:3 (SEQ ID NO: 7), EXP-CUCme.Ubq1:1:4 (SEQ ID NO: 9) y EXP-CUCme.Ubq1:1:5 (SEQ ID NO: 11), se comparó con la expresión de promotores constitutivos conocidos. Cada vector de expresión de planta comprendía una región de borde derecho de Agrobacterium tumefaciens, un primer casete transgénico que comprendía una secuencia EXP o un promotor constitutivo conocido unido operativamente en 5' a una secuencia codificante de la p-glucuronidasa (GUS, SEQ ID NO: 206) que contenía un intrón procesable procedente del gen ST- LS1 de patata específico de tejido inducible por luz (n.° de registro del GenBank: X04753), unido operativamente en 5' a una región de terminación en 3' del gen E6 de Gossypium barbadense (T-Gb.E6-3b:1:1, SEQ ID NO: 204), del gen RbcS2-E9 de Pisum sativum (T-Ps.RbcS2-E9-1:1:6, SEQ ID NO: 203), o del gen FbLate-2 de Gossypium barbadense (T-Gb.FbL2-1:1:1, SEQ ID NO: 205); un segundo casete de selección transgénico utilizado para la selección de las células de plantas transformadas que confiere resistencia al herbicida glifosato (dirigida por el promotor de Actina 7 de Arabidopsis) o al antibiótico kanamicina y a una región del borde izquierdo de A. tumefaciens. Un vector de expresión de planta de control sin promotor (pMON124912) sirvió como un control negativo para la expresión. Los grupos de ensayo anteriores y los de los elementos de expresión constitutiva, se clonaron en vectores de expresión de plantas como se muestra a continuación en la Tabla 2.

Tabla 2. Vectores de expresión de plantas y grupo de elemento de expresión correspondiente y UTR 3'

Vector de Expresión

Elemento regulador SEQ ID NO: UTR 3'

pMON80585

EXP-At.Atntt1:1:2 200 T-Ps.RbcS2-E9-1:1:6

pMON109584

EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3 201 T-Gb.E6-3b:1:1

pMON118756

EXP-At.Act7:1:11 202 T-Gb.E6-3b:1:1

pMON124912

Sin promotor T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON138776

EXP-CUCme.Ubq1:1:1 1 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON138777

EXP-CUCme.Ubq1:1:2 5 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON138778

EXP-CUCme.Ubq1:1:3 7 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON138779

EXP-CUCme.Ubq1:1:4 9 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON138780

EXP-CUCme.Ubq1:1:5 11 T-Gb.FbL2-1:1:1

También se construyeron dos plásmidos para su uso en la cotransformación y normalización de datos. Un plásmido de control de transformación comprendía un promotor constitutivo, que dirigía la expresión de la secuencia codificante de luciferasa de luciérnaga (Photinus pyralis) (FLuc, SEQ ID NO: 207), unido operativamente en 5' a una región de terminación en 3' del gen de la nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ 5 ID NO: 209). El otro plásmido de control de transformación comprendía un promotor constitutivo, que dirigía la expresión de la secuencia codificante de luciferasa del pensamiento de mar (Renilla reniformis) (RLuc, SEQ ID NO: 208), unido operativamente en 5' a una región de terminación en 3' del gen de la nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens.

Los vectores de expresión de plantas, pMON80585, pMON109584, pMON118756, pMON124912, pMON138776, 10 pMON138777, pMON138778, pMON138779 y pMON138780, se utilizaron para transformar células de protoplasto

de cotiledón de soja utilizando procedimientos de transformación con PEG. Las células de protoplastos se transformaron con cantidades equimolares de cada uno de los dos plásmidos de control de transformación y un vector de expresión de planta de ensayo. Se evaluó la actividad de GUS y luciferasa. Se realizaron mediciones de GUS y luciferasa colocando alícuotas de una preparación de células sometidas a lisis, transformadas como se indicó 15 anteriormente, en dos bandejas diferentes de pocillos pequeños. Una bandeja se utilizó para las mediciones de GUS, y una segunda bandeja se utilizó para realizar un doble ensayo de luciferasa utilizando el sistema de doble ensayo indicador de luciferasa (Promega Corp., Madison, WI; véase, por ejemplo, Promega Notes Magazine, N.°: 57, 1996; p.02) Las mediciones de las muestras se realizaron utilizando 3 o 4 repeticiones por transformación. Los valores promedio de GUS y luciferasa se presentan a continuación en la Tabla 3.

20 Tabla 3. Valores de expresión promedio de GUS y luciferasa y proporciones de GUS/luciferasa.

Construcción

Elemento regulador SEQ ID NO: GUS promedio FLuc promedio RLuc promedio GUS/FLuc GUS/RLuc

pMON80585

EXP-At.Atntt1:1:2 200 55173 6498 30503 8,49 1,81

pMON109584

EXP-CaMV.35S- enh+Ph.DnaK:1:3 200 24940 5050,75 35495 4,94 0,70

pMON118756

EXP-At.Act7:1:11 201 9871 6880 40850 1,43 0,24

pMON124912

Sin promotor 2000 11670 73187 0,17 0,03

pMON138776

EXP- CUCme.Ubq1:1:1 1 26972 6467,25 37200 4,17 0,73

pMON138777

EXP- CUCme.Ubq1:1:2 5 41307 5902,5 24396 7,00 1,69

pMON138778

EXP- CUCme.Ubq1:1:3 7 90140 10710,5 60983 8,42 1,48

pMON138779

EXP- CUCme.Ubq1:1:4 9 35526 5590 28001 6,36 1,27

pMON138780

EXP- CUCme.Ubq1:1:5 11 23298 4483,25 19075 5,20 1,22

Para comparar la actividad relativa de cada promotor en protoplastos de cotiledón de soja, los valores de GUS se expresaron como una proporción de actividad de GUS frente a luciferasa y se normalizaron con respecto a los niveles de expresión observados para los grupos de elementos de expresión constitutiva, EXP-At.Act7:1:11 y EXP- CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3. La Tabla 4 a continuación muestra las proporciones de GUS frente a luciferasa de 25 luciérnaga (FLuc) normalizadas con respecto a EXP-At.Act7:1:11 y ExP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3. La Tabla 5 a continuación muestra las proporciones de GUS frente a luciferasa de Renilla (RLuc) normalizadas con respecto a EXP-At.Act7:1:11 y EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3.

Tabla 4. Proporciones de GUS frente a luciferasa de luciérnaga (FLuc) normalizadas con respecto a EXP-

At.Act7: 1: 11 y EXP-CaMV.35S-enh + Ph.DnaK: 1: 3.

Construcción

Elemento Regulador SEQ ID NO: proporción GUS/FLuc normalizada con respecto a EXP- At.Act7:1:11 proporción GUS/FLuc normalizada con respecto a EXP-CaMV.35S- enh+Ph.DnaK:1:3

pMON80585

EXP-At.Atntt1:1:2 200 5,92 1,72

pMON109584

EXP-CaMV.35S- enh+Ph.DnaK:1:3 201 3,44 1,00

pMON118756

EXP-At.Act7:1:11 202 1,00 0,29

pMON124912

Sin promotor 0,12 0,03

pMON138776

EXP-CUCme.Ubq1:1:1 1 2,91 0,84

5

10

15

20

25

30

Construcción

Elemento Regulador SEQ ID NO: proporción GUS/FLuc normalizada con respecto a EXP- At.Act7:1:11 proporción GUS/FLuc normalizada con respecto a EXP-CaMV.35S- enh+Ph.DnaK:1:3

pMON 138777

EXP-CUCme.Ubq1:1:2 5 4,88 1,42

pMON138778

EXP-CUCme.Ubq1:1:3 7 5,87 1,70

pMON138779

EXP-CUCme.Ubq1:1:4 9 4,43 1,29

pMON138780

EXP-CUCme.Ubq1: 1:5 11 3,62 1,05

Tabla 5. Proporciones de GUS frente a luciferasa de Renilla (RLuc) normalizadas con respecto a EXP-

At.Act7:1:11 y EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3.

Construcción

Elemento Regulador SEQ ID NO: proporción GUS/RLuc normalizada con respecto a EXP- At.Act7:1:11 proporción GUS/RLuc normalizada con respecto a EXP-CaMV.35S- enh+Ph.DnaK:1:3

pMON80585

EXP-At.Atntt1:1:2 200 7,49 2,57

pMON109584

EXP-CaMV.35S- enh+Ph.DnaK:1:3 201 2,91 1,00

pMON118756

EXP-At.Act7:1:11 202 1,00 0,34

pMON124912

Sin promotor 0,11 0,04

pMON138776

EXP-CUCme.Ubq1:1:1 1 3,00 1,03

pMON138777

EXP-CUCme.Ubq1:1:2 5 7,01 2,41

pMON138778

EXP-CUCme.Ubq1:1:3 7 6,12 2,10

pMON138779

EXP-CUCme.Ubq1:1:4 9 5,25 1,81

pMON138780

EXP-CUCme.Ubq1:1:5 11 5,05 1,74

Como se puede observar en las Tablas 4 y 5 anteriores, cada uno de los grupos de elementos de expresión EXP- CUCme.Ubq1:1:1 (SEQ ID NO: 1), EXP-CUCme.Ubq1:1:2 (SEQ ID NO: 5, EXP-CUCme.Ubq1:1:3 (SEQ ID NO: 7, EXP-CUCme.Ubq1:1:4 (SEQ ID NO: 9) y EXP-CUCme.Ubq1:1:5 (SEQ ID NO: 11) demostraron la capacidad de dirigir la expresión transgénica en protoplastos de cotiledón de soja. En este ensayo, los niveles de expresión fueron mayores que los de EXP-At.Act7:1:11 y fueron de 2,9 a 5,8 (FLuc) o de 3 a 7 (RLuc) veces mayor que EXP- At.Act7:1:11. La expresión fue equivalente o superior a la expresión observada para EXP-CaMv.35S-enh + Ph.DnaK:1:3 Los niveles de expresión fueron de 0,8 a 1,7 (FLuc) o de 1 a 2,4 (RLuc) veces más altos que los niveles de expresión observados para EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3.

Ejemplo 3: Análisis de elementos reguladores que dirigen la GUS en hojas y raíces de soja bombardeadas.

Hojas y raíces de soja se transformaron con vectores de expresión de plantas que contenían un grupo de elementos de expresión reguladores de la transcripción de ensayo que dirigían la expresión del transgén de la D-glucuronidasa (GUS), y se compararon con la expresión de GUS en raíces y hojas en los que la expresión de GUS estaba dirigida por promotores constitutivos conocidos.

La expresión de un transgén dirigida por EXP-CUCme.Ubq1:1:1 (SEQ ID NO: 1), EXP-CUCme.Ubq1:1:2 (SEQ ID NO: 5, EXP-CUCme.Ubq1:1:3 (SEQ ID NO: 7, EXP-CUCme.Ubq1:1:4 (SEQ ID NO: 9) y EXP-CUCme.Ubq1:1:5 (SEQ ID NO: 11) se comparó con la expresión de promotores constitutivos conocidos en hojas y raíces de soja bombardeadas con partículas. Los vectores de expresión de plantas utilizados para la transformación de hojas y raíces fueron los mismos que los presentados en la Tabla 2 del Ejemplo 2 anterior.

Los vectores de expresión de plantas, pMON80585, pMON109584, pMON118756, pMON124912, pMON138776, pMON138777, pMON138778, pMON138779 y pMON138780, se utilizaron para transformar hojas y raíces de soja utilizando procedimientos de transformación por bombardeo de partículas.

En resumen, Semillas de soja A3244 se esterilizaron superficialmente y se dejaron germinar en bandejas con un fotoperiodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad. Después de aproximadamente 13 días, el tejido de hoja y raíz se recogió de las plántulas en condiciones estériles y se utilizó para el bombardeo. Las muestras de tejido se colocaron aleatoriamente en una placa de Petri que contenía medio de cultivo de plantas. Para el bombardeo, se utilizaron diez microgramos de aDn plasmídico para revestir partículas de oro de 0,6 micrómetros (n° de catálogo 165-2262, Bio-Rad., Hercules, CA). Se cargaron macro-portadores con las partículas de oro revestidas de ADN (n° de catálogo 165-2335 Bio-Rad, Hercules, CA). Para la transformación se utilizó un arma biolística PDS 1000/He (n° de catálogo 165-2257 Bio-Rad, Hercules, CA). Los tejidos de raíz y hoja bombardeados se dejaron incubar en la

oscuridad durante 24 horas a 26 grados Celsius. Después de esta incubación durante la noche, los tejidos se tiñeron en solución para la expresión de GUS durante la noche a 37 grados Celsius. Después de teñir durante la noche, los tejidos se sumergieron en etanol al 70% durante la noche para eliminar la clorofila y revelar la tinción de GUS.

Después, los tejidos se fotografiaron y a cada construcción se le asignó una escala de calificación de "0", "+" a

5 "++++++" que refleja el nivel de expresión de GUS (0 - sin expresión, de + a ++++++ - de nivel bajo a nivel alto,

respectivamente).

La expresión del transgén de GUS demostrada en cada tejido se utiliza para deducir el nivel de potencial relativo y la especificidad de la capacidad de cada elemento para dirigir la expresión transgénica en plantas de maíz

transformadas de manera estable. A continuación en la Tabla 6 se proporcionan los índices de expresión promedio

10 de GUS.

Tabla 6. Índices de expresión de GUS en hojas y raíces bombardeadas con partículas.

Construcción

Elemento regulador SEQ ID NO: Índices de expresión en hojas Índices de expresión en raíces

pMON80585

EXP-At.Atntt1:1:2 200 + + + + ++

pMON109584

EXP-CaMV.35S- enh+Ph.DnaK:1:3 201 + + + + + +++

pMON118756

EXP-At.Act7:1:11 202 + + + + ++

pMON124912

Sin promotor 0 0

pMON138776

EXP-CUCme.Ubq1:1:1 1 + + + + +++

pMON138777

EXP-CUCme.Ubq1:1:2 5 + + + ++

pMON138778

EXP-CUCme.Ubq1:1:3 7 + + + ++

pMON138779

EXP-CUCme.Ubq1:1:4 9 + + + ++

pMON138780

EXP-CUCme.Ubq1:1:5 11 + + +

Como se puede observar en la Tabla 6 anterior, cada uno de los grupos de elementos de expresión EXP- CUCme.Ubq1:1:1 (SEQ ID NO: 1, EXP-CUCme.Ubq1:1:2 (SEQ ID NO: 5, EXP-CUCme.Ubq1:1:3 (SEQ ID NO: 7, EXP-CUCme.Ubq1:1:4 (SEQ ID NO: 9) y EXP-CUCme.Ubq1:1:5 (SEQ ID NO: 11) demostró la capacidad de dirigir 15 la expresión transgénica en tejidos de hoja y raíz transformados, bombardeados con partículas.

Ejemplo 4: Análisis de elementos reguladores que dirigen la GUS en protoplastos de cotiledón de soja.

Protoplastos de cotiledón de soja se transformaron con vectores de expresión de plantas que contenían un grupo de elementos de expresión reguladores de la transcripción de ensayo que dirigía la expresión del transgén de la □- glucuronidasa (GUS), y se compararon con la expresión de GUS en protoplastos de hoja en los que la expresión de 20 GUS estaba dirigida por promotores constitutivos conocidos.

La expresión de un transgén dirigida por P-CUCme.1-1:1:1rc (SEQ ID NO: 155), P-CUCme.2-1:1:1 (SEQ ID NO: 14), P-CUCme.3-1:1:3 (SEQ ID NO: 15), EXP-CUCme.4:1:1 (SEQ ID NO: 156), EXP-CUCme.5:1:1 (SEQ ID NO: 159), P- CUCme.6-1:1:1 (SEQ ID NO: 18), P-CUCme.8-1:1:2 (SEQ ID NO: 19), P-CUCme.9-1:1:2 (SEQ ID NO: 20), P- CUCme.10-1:1:1 (SEQ ID NO: 21), EXP-CUCme.eEF1a:1:1 (SEQ ID NO: 162), P-CUCme.15-1:1:2 (SEQ ID NO: 25 23), P-CUCme.16a-1:1:2 (SEQ ID NO: 24), P-CUCme.17-1:1:2 (SEQ ID NO: 26), P-CUCme.18-1:1:2 (SEQ ID NO:

27), P-CUCme.19-1:1:3 (SEQ ID NO: 167), P-CUCme.20-1:3 (SEQ ID NO: 211), P-CUCme.21-1:1:1 (SEQ ID NO: 30), P-CUCme.22-1:1:3 (SEQ ID NO: 31), EXP-CUCme.SAMS2:1:1 (SEQ ID NO: 168), P-CUCme.26-1:1:2 (SEQ ID NO: 33), P-CUCme.28-1:1:2 (SEQ ID NO: 34) y EXP-CUCme.29:1:2 (SEQ ID NO: 212) se comparó con la expresión de grupos de elementos de expresión constitutiva conocidos. Cada vector de expresión de planta comprendía una 30 región de borde derecho de Agrobacterium tumefaciens, un primer casete transgénico que comprendía un promotor de ensayo o un promotor constitutivo conocido, unido operativamente en 5' a una secuencia codificante de la p- glucuronidasa (GUS, SEQ ID NO: 206), que contenía un intrón procesable procedente del gen ST-LS1 de patata específico de tejido, inducible por luz (n.° de registro del GenBank: X04753), unido operativamente en 5' a una región de terminación en 3' del gen E6 de Gossypium barbadense (T-Gb.E6-3b:1:1, SEQ ID NO: 204), el gen 35 RbcS2-E9 de Pisum sativum (T-Ps.RbcS2-E9-1:1:6, SEQ ID NO: 203), o el gen FbLate-2 de Gossypium barbadense (T-Gb.FbL2-1:1:1, SEQ ID NO: 205); un segundo casete de selección transgénico utilizado para la selección de las células de plantas transformadas que confiere resistencia al herbicida glifosato (dirigida por el promotor de Actina 7 de Arabidopsis) o al antibiótico kanamicina y a una región del borde izquierdo de A. tumefaciens. Un vector de expresión de planta de control sin promotor (pMON124912) sirvió como un control negativo para la expresión. Los 40 grupos de ensayo anteriores y los de los elementos de expresión constitutiva, se clonaron en vectores de expresión de plantas como se muestra a continuación en la Tabla 7.

Tabla 7. Vectores de expresión de plantas y grupo de elemento de expresión correspondiente y UTR 3'

Construcción

Elemento regulador SEQ ID NO: UTR 3'

pMON80585

EXP-At.Atntt1:1:2 200 T-Ps.RbcS2-E9-1:1:6

pMON109584

EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3 201 T-Gb.E6-3b:1:1

pMON118756

EXP-At.Act7:1:11 202 T-Gb.E6-3b:1:1

pMON124912

Sin promotor T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140818

P-CUCme.1-1:1:1rc 155 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140819

P-CUCme.2-1:1:1 14 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140820

P-CUCme.3-1:1:3 15 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140821

EXP-CUCme.4:1:1 156 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140822

EXP-CUCme.5:1:1 159 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140823

P-CUCme.6-1:1:1 18 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140824

P-CUCme.8-1:1:2 19 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140825

P-CUCme.9-1:1:2 20 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140826

P-CUCme.10-1:1:1 21 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140827

EXP-CUCme.eEF1a:1:1 162 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140828

P-CUCme.15-1:1:2 23 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140829

P-CUCme.16a-1:1:2 24 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140830

P-CUCme.17-1:1:2 26 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140831

P-CUCme.18-1:1:2 27 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140832

P-CUCme.19-1:1:3 167 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140833

P-CUCme.20-1:3 211 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140834

P-CUCme.21-1:1:1 30 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140835

P-CUCme.22-1:1:3 31 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140836

EXP-CUCme.SAMS2:1:1 168 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140837

P-CUCme.26-1:1:2 33 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140838

P-CUCme.28-1:1:2 34 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140839

EXP-CUCme.29:1:2 212 T-Gb.FbL2-1:1:1

También se construyeron dos plásmidos para su uso en la cotransformación y normalización de datos. Un plásmido de control de transformación comprendía un promotor constitutivo, que dirigía la expresión de la secuencia codificante de luciferasa de luciérnaga (Photinus pyralis) (FLuc, SEQ ID NO: 207), unido operativamente en 5' a una 5 región de terminación en 3' del gen de la nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 209. El otro plásmido de control de transformación comprendía un promotor constitutivo, que dirigía la expresión de la secuencia codificante de luciferasa del pensamiento de mar (Renilla reniformis) (RLuc, SEQ ID NO: 208), unido operativamente en 5' a una región de terminación en 3' del gen de la nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens.

10 Los vectores de expresión de plantas, pMON80585, pMON109584, pMON118756, pMON124912, pMON140818, pMON140819, pMON140820, pMON140821, pMON140822, pMON140823, pMON140824, pMON140825,

pMON140826, pMON140827, pMON140828, pMON140829, pMON140830, pMON140831, pMON140832,

pMON140833, pMON140834, pMON140835, pMON140836, pMON140837, pMON140838 y pMON140839, se utilizaron para transformar células de protoplasto de cotiledón de soja utilizando procedimientos de transformación 15 con PEG. Las células de protoplastos se transformaron con cantidades equimolares de cada uno de los dos plásmidos de control de transformación y un vector de expresión de planta de ensayo. Se evaluó la actividad de GUS y luciferasa. Se realizaron mediciones de GUS y luciferasa colocando alícuotas de una preparación de células sometidas a lisis, transformadas como se indicó anteriormente, en dos bandejas diferentes de pocillos pequeños. Una bandeja se utilizó para las mediciones de GUS, y una segunda bandeja se utilizó para realizar un doble ensayo 20 de luciferasa utilizando el sistema de doble ensayo indicador de luciferasa (Promega Corp., Madison, WI; véase, por ejemplo, Promega Notes Magazine, n.°: 57, 1996; p.02) Las mediciones de las muestras se realizaron utilizando 3 o 4 repeticiones por transformación. Los valores promedio de GUS y luciferasa se presentan a continuación en la Tabla 8.

Tabla 8. Valores de expresión promedio de GUS y luciferasa y proporciones de GUS/luciferasa.

Construcción

Elemento regulador SEQ ID NO: GUS promedio FLuc promedio RLuc promedio GUS/FLuc GUS/RLuc

pMON80585

EXP-At.Atntt1:1:2 200 586 5220,7 8323 0,1100 0,0700

pMON109584

EXP-CaMV.35S- enh+Ph.DnaK:1:3 201 5768 4275 15098 1,3500 0,3800

pMON118756

EXP-At.Act7:1:11 202 773 7722 10545 0,1000 0,0700

pMON124912

Sin promotor 48 9746,5 13905 0,0000 0,0000

pMON140818

P-CUCme.1-1:1:1rc 155 194 4772 6363 0,0400 0,0300

pMON140819

P-CUCme.2-1:1:1 14 171 6855 10123 0,0200 0,0200

pMON140820

P-CUCme.3-1:1:3 15 37 7089,3 9593 0,0100 0,0000

pMON140821

EXP-CUCme.4:1:1 156 4211 7626,8 13935 0,5500 0,3000

pMON140822

EXP-CUCme.5:1:1 159 626 15609,3 21140 0,0400 0,0300

pMON140823

P-CUCme.6-1:1:1 18 331 15178,5 22818 0,0200 0,0100

pMON140824

P-CUCme.8-1:1:2 19 238 17514,5 28429 0,0100 0,0100

pMON140825

P-CUCme.9-1:1:2 20 510 13208 19567 0,0400 0,0300

pMON140826

P-CUCme.10-1:1:1 21 352 14805,3 22200 0,0200 0,0200

pMON140827

EXP- CUCme.eEF1a:1:1 162 724 9326,8 14476 0,0800 0,0500

pMON140828

P-CUCme. 15-1:1:2 23 304 11798 17486 0,0300 0,0200

pMON140829

P-CUCme. 16a-1:1:2 24 88 5429 9596 0,0200 0,0100

pMON140830

P-CUCme.17-1:1:2 26 180 10477,8 15291 0,0200 0,0100

pMON140831

P-CUCme. 18-1:1:2 27 111 5059,3 6778 0,0200 0,0200

pMON140832

P-CUCme.19-1:1:3 167 121 3765 6032 0,0300 0,0200

pMON140833

P-CUCme.20-1:3 211 155 10458,8 14748 0,0100 0,0100

pMON140834

P-CUCme.21-1:1:1 30 582 7760 11440 0,0800 0,0500

pMON140835

P-CUCme.22-1:1:3 31 400 11393,8 18654 0,0400 0,0200

pMON140836

EXP- CUCme.SAMS2:1: 1 168 568 9466,3 13962 0,0600 0,0400

pMON140837

P-CUCme.26-1:1:2 33 87 6683 8494 0,0100 0,0100

pMON140838

P-CUCme.28-1:1:2 34 171 19104,8 29619 0,0100 0,0100

pMON140839

EXP-CUCme.29:1:2 212 90 11247,3 15919 0,0100 0,0057

Para comparar la actividad relativa de cada promotor en protoplastos de cotiledón de soja, los valores de GUS se expresaron como una proporción de actividad de GUS frente a luciferasa y se normalizaron con respecto a los niveles de expresión observados para los grupos de elementos de expresión constitutiva, EXP-At.Act7:1:11 y EXP- 5 CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3. La Tabla 9 a continuación muestra las proporciones de GUS frente a luciferasa de luciérnaga (FLuc) normalizadas con respecto a EXP-At.Act7: 1: 11 y EXP-CaMV.35S-enh + Ph.DnaK: 1: 3 La Tabla 10 a continuación muestra las proporciones de GUS frente a luciferasa de Renilla (RLuc) normalizadas con respecto a EXP-At.Act7:1:11 y EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3.

Tabla 9. Proporciones de GUS frente a luciferasa de luciérnaga (FLuc) normalizadas con respecto a EXP- 10 At.Act7:1:11 y EXP-CaMV.35S-enh + Ph.DnaK:1:3.

Construcción

Elemento regulador SEQ ID NO: proporción GUS/FLuc normalizada con respecto a EXP-At.Act7:1:11 proporción GUS/FLuc normalizada con respecto a EXP-CaMV.35S- enh+Ph.DnaK: 1:3

pMON80585

EXP-At.Atntt1:1:2 200 1,12 0,08

pMON109584

EXP-CaMV.35S- enh+Ph.DnaK:1:3 201 13,48 1,00

pMON118756

EXP-At.Act7:1:11 202 1,00 0,07

pMON124912

Sin promotor 0,05 0,00

pMON140818

P-CUCme.1-1:1:1rc 155 0,41 0,03

Construcción

Elemento regulador SEQ ID NO: proporción GUS/FLuc normalizada con respecto a EXP-At.Act7:1:11 proporción GUS/FLuc normalizada con respecto a EXP-CaMV.35S- enh+Ph.DnaK: 1:3

pMON140819

P-CUCme.2-1:1:1 14 0,25 0,02

pMON140820

P-CUCme.3-1:1:3 15 0,05 0,00

pMON140821

EXP-CUCme.4:1:1 156 5,52 0,41

pMON140822

EXP-CUCme.5:1:1 159 0,40 0,03

pMON140823

P-CUCme.6-1:1:1 18 0,22 0,02

pMON140824

P-CUCme.8-1:1:2 19 0,14 0,01

pMON140825

P-CUCme.9-1:1:2 20 0,39 0,03

pMON140826

P-CUCme.10-1:1:1 21 0,24 0,02

pMON140827

EXP- CUCme.eEF1a:1:1 162 0,78 0,06

pMON140828

P-CUCme.15-1:1:2 23 0,26 0,02

pMON140829

P-CUCme.16a-1:1:2 24 0,16 0,01

pMON140830

P-CUCme.17-1:1:2 26 0,17 0,01

pMON140831

P-CUCme.18-1:1:2 27 0,22 0,02

pMON140832

P-CUCme.19-1:1:3 167 0,32 0,02

pMON140833

P-CUCme.20-1:3 211 0,15 0,01

pMON140834

P-CUCme.21-1:1:1 30 0,75 0,06

pMON140835

P-CUCme.22-1:1:3 31 0,35 0,03

pMON140836

EXP- CUCme.SAMS2:1:1 168 0,60 0,04

pMON140837

P-CUCme.26-1:1:2 33 0,13 0,01

pMON140838

P-CUCme.28-1:1:2 34 0,09 0,01

pMON140839

EXP-CUCme.29:1:2 212 0,08 0,01

Tabla 10. Proporciones de GUS frente a luciferasa de Renilla (RLuc) normalizadas con respecto a EXP-

At.Act7:1:11 y EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3.

Construcción

Elemento regulador SEQ ID NO: proporción GUS/RLuc normalizada con respecto a EXP- At.Act7:1:11 proporción GUS/RLuc normalizada con respecto a EXP-CaMV.35S- enh+Ph.DnaK: 1:3

pMON80585

EXP-At.Atntt1:1:2 200 0,96 0,18

pMON109584

EXP-CaMV.35S- enh+Ph.DnaK:1:3 201 5,21 1,00

pMON118756

EXP-At.Act7:1:11 202 1,00 0,19

pMON124912

Sin promotor 0,05 0,01

pMON140818

P-CUCme.1-1:1:1rc 155 0,42 0,08

pMON140819

P-CUCme.2-1:1:1 14 0,23 0,04

pMON140820

P-CUCme.3-1:1:3 15 0,05 0,01

pMON140821

EXP-CUCme.4:1:1 156 4,12 0,79

pMON140822

EXP-CUCme.5:1:1 159 0,40 0,08

pMON140823

P-CUCme.6-1:1:1 18 0,20 0,04

pMON140824

P-CUCme.8-1:1:2 19 0,11 0,02

pMON140825

P-CUCme.9-1:1:2 20 0,36 0,07

pMON140826

P-CUCme.10-1:1:1 21 0,22 0,04

pMON140827

EXP-CUCme.eEF1a:1:1 162 0,68 0,13

pMON140828

P-CUCme.15-1:1:2 23 0,24 0,05

pMON140829

P-CUCme.16a-1:1:2 24 0,13 0,02

5

10

15

20

25

30

35

40

Construcción

Elemento regulador SEQ ID NO: proporción GUS/RLuc normalizada con respecto a EXP- At.Act7:1:11 proporción GUS/RLuc normalizada con respecto a EXP-CaMV.35S- enh+Ph.DnaK: 1:3

pMON140830

P-CUCme.17-1:1:2 26 0,16 0,03

pMON140831

P-CUCme.18-1:1:2 27 0,22 0,04

pMON140832

P-CUCme.19-1:1:3 167 0,27 0,05

pMON140833

P-CUCme.20-1:3 211 0,14 0,03

pMON140834

P-CUCme.21-1:1:1 30 0,69 0,13

pMON140835

P-CUCme.22-1:1:3 31 0,29 0,06

pMON140836

EXP-CUCme.SAMS2:1:1 168 0,55 0,11

pMON140837

P-CUCme.26-1:1:2 33 0,14 0,03

pMON140838

P-CUCme.28-1:1:2 34 0,08 0,02

pMON140839

EXP-CUCme.29:1:2 212 0,08 0,01

Como se puede observar en las Tablas 9 y 10, la mayoría de los grupos de elementos de expresión ensayados, demostraron la capacidad de dirigir la expresión transgénica en células de protoplasto de cotiledón de soja. En este ensayo, un grupo de elemento de expresión, EXP-CUCme.4:1:1 (SEQ ID NO: 156), demostró niveles de expresión transgénica superiores a los de EXP-At.Act7:1:11.

Ejemplo 5: Análisis de elementos reguladores que dirigen la GUS en hojas y raíces de soja bombardeadas.

Hojas y raíces de soja se transformaron con vectores de expresión de plantas que contenían un grupo de elementos de expresión reguladores de la transcripción de ensayo que dirigía la expresión del transgén de la D-glucuronidasa (GUS), y se compararon con la expresión de GUS en raíces y hojas en los que la expresión de GUS estaba dirigida por promotores constitutivos conocidos.

La expresión de un transgén dirigida por P-CUCme.1-1:1:1rc (SEQ ID NO: 155, P-CUCme.2-1:1:1 (SEQ ID NO: 14, P-CUCme.3-1:1:3 (SEQ ID NO: 15, EXP-CUCme.4:1:1 (SEQ ID NO: 156, EXP-CUCme.5:1:1 (SEQ ID NO: 159, P- CUCme.6-1:1:1 (SEQ ID NO: 18, P-CUCme.8-1:1:2 (SEQ ID NO: 19, P-CUCme.9-1:1:2 (SEQ ID NO: 20, P- CUCme.10-1:1:1 (SEQ ID NO: 21, EXP-CUCme.eEF1a:1:1 (SEQ ID NO: 162, P-CUCme.15-1:1:2 (SEQ ID NO: 23, P-CUCme.16a-1:1:2 (SEQ ID NO: 24, P-CUCme.17-1:1:2 (SEQ ID NO: 26, P-CUCme.18-1:1:2 (SEQ ID NO: 27, P- CUCme.19-1:1:3 (SEQ ID NO: 167, P-CUCme.20-1:3 (SEQ ID NO: 211, P-CUCme.21-1:1:1 (SEQ ID NO: 30, P- CUCme.22-1:1:3 (SEQ ID NO: 31, EXP-CUCme.SAMS2:1:1 (SEQ ID NO: 168, P-CUCme.26-1:1:2 (SEQ ID NO: 33, P-CUCme.28-1:1:2 (SEQ ID NO: 34) y EXP-CUCme.29:1:2 (SEQ ID NO: 212) se comparó con la expresión de grupos de elementos de expresión constitutiva conocidos en hojas y raíces de soja bombardeadas con partículas. Los vectores de expresión de plantas utilizados para la transformación de hojas y raíces fueron los mismos que los presentados en la Tabla 7 del Ejemplo 4 anterior.

Los vectores de expresión de plantas, pMON80585, pMON109584, pMON118756, pMON124912, pMON140818, pMON140819, pMON140820, pMON140821, pMON140822, pMON140823, pMON140824, pMON140825,

pMON140826, pMON140827, pMON140828, pMON140829, pMON140830, pMON140831, pMON140832,

pMON140833, pMON140834, pMON140835, pMON140836, pMON140837, pMON140838 y pMON140839, se utilizaron para transformar hojas y raíces de soja utilizando procedimientos de transformación por bombardeo de partículas.

En resumen, Semillas de soja A3244 se esterilizaron superficialmente y se dejaron germinar en bandejas con un fotoperiodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad. Después de aproximadamente 13 días, el tejido de hoja y raíz se recogió de las plántulas en condiciones estériles y se utilizó para el bombardeo. Las muestras de tejido se colocaron aleatoriamente en una placa de Petri que contenía medio de cultivo de plantas. Para el bombardeo, se utilizaron diez microgramos de aDn plasmídico para revestir partículas de oro de 0,6 micrómetros (n° de catálogo 165-2262, Bio-Rad, Hercules, CA). Se cargaron macro-portadores con las partículas de oro revestidas de ADN (n° de catálogo 165-2335 Bio-Rad, Hercules, CA). Para la transformación se utilizó un arma biolística PDS 1000/He (n° de catálogo 165-2257 Bio-Rad, Hercules, CA). Los tejidos de raíz y hoja bombardeados se dejaron incubar en la oscuridad durante 24 horas a 26 grados Celsius. Después de esta incubación durante la noche, los tejidos se tiñeron en solución para la expresión de GUS durante la noche a 37 grados Celsius. Después de teñir durante la noche, los tejidos se sumergieron en etanol al 70% durante la noche para eliminar la clorofila y revelar la tinción de GUS. Después, los tejidos se fotografiaron y a cada construcción se le asignó una escala de calificación de "0", "+" a "++++++" que refleja el nivel de expresión de GUS (0 - sin expresión, de + a ++++++ - de nivel bajo a nivel alto, respectivamente).

La expresión del transgén de GUS demostrada en cada tejido se utiliza para deducir el nivel de potencial relativo y la

especificidad de la capacidad de cada elemento para dirigir la expresión transgénica en plantas de maíz transformadas de manera estable. En la Tabla 11 mostrada a continuación, se proporcionan los índices de expresión promedio de GUS.

Tabla 11. Índices de expresión de GUS en hojas y raíces bombardeadas con partículas.

Construcción

Elemento regulador SEQ ID NO: Expresión en hojas Expresión en raíces

pMON80585

EXP-At.Atntt1:1:2 200 + + + + + +

pMON109584

EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3 201 + + + + + + +

pMON118756

EXP-At.Act7:1:11 202 + + + + + + +

pMON124912

Sin promotor 0 0

pMON140818

P-CUCme.1-1:1:1rc 155 + + + +

pMON140819

P-CUCme.2-1:1:1 14 + + +

pMON140820

P-CUCme.3-1:1:3 15 0 0

pMON140821

EXP-CUCme.4:1:1 156 ++++++ +++

pMON140822

EXP-CUCme.5:1:1 159 ++ +

pMON140823

P-CUCme.6-1:1:1 18 + + +

pMON140824

P-CUCme.8-1:1:2 19 + +

pMON140825

P-CUCme.9-1:1:2 20 + + +

pMON140826

P-CUCme.10-1:1:1 21 +++ +++

pMON140827

EXP-CUCme.eEF1a:1:1 162 ++++ +++

pMON140828

P-CUCme.15-1:1:2 23 + +

pMON140829

P-CUCme.16a-1:1:2 24 + -

pMON140830

P-CUCme.17-1:1:2 26 ++++ +

pMON140831

P-CUCme.18-1:1:2 27 +++ +

pMON140832

P-CUCme.19-1:1:3 167 + +

pMON140833

P-CUCme.20-1:3 211 + +

pMON140834

P-CUCme.21-1:1:1 30 + +

pMON140835

P-CUCme.22-1:1:3 31 ++++ +

pMON140836

EXP-CUCme.SAMS2:1:1 168 +++++ +++

pMON140837

P-CUCme.26-1:1:2 33 + +

pMON140838

P-CUCme.28-1:1:2 34 + +

pMON140839

EXP-CUCme.29:1:2 212 + +

5 Como se puede observar en la Tabla 11 anterior, todos menos uno de los grupos de elementos de expresión demostraron la capacidad de dirigir la expresión transgénica en tejido de hoja y raíz de soja bombardeado. En este ensayo, dos grupos de elementos de expresión, P-CUCme.28-1:1:2 (SEQ ID NO: 34) y EXP-CUCme.4:1:1 (SEQ ID NO: 156), demostraron niveles de expresión similares o superiores en relación con la expresión dirigida por EXP- CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3

10 Ejemplo 6: Análisis de elementos reguladores que dirigen la GUS en protoplastos de cotiledón de soja utilizando amplicones de casete transgénico

Protoplastos de cotiledón de soja se transformaron con amplicones de casete transgénico que contenían un grupo de elementos de expresión reguladores de la transcripción que dirigen la expresión del transgén de la p- glucuronidasa (GUS) y se compararon con la expresión de GUS en protoplastos de hoja en los que la expresión de 15 GUS está dirigida por promotores constitutivos conocidos. Los amplicones del casete transgénico comprendían una secuencia EXP, unida operativamente a una secuencia codificante de GUS (GUS, SEQ ID NO: 206), unida

operativamente a una UTR en 3' (T-Gb.FbL2-1:1:1, SEQ ID NO: 205). La expresión promedio de GUS se comparó con la de los elementos EXP de control, P-CaMV.35S-enh-1:1:102/L-CaMV.35S-1:1:2 (SEQ ID NO: 210) y EXP- At.Atntt1:1:2 (SEQ ID NO: 200).

De manera similar a la descrita en el ejemplo 2 anterior, también se utilizó un plásmido para su uso en la 5 cotransformación y normalización de datos. El plásmido de control de transformación comprendía un promotor

constitutivo, que dirigía la expresión de la secuencia codificante de luciferasa de luciérnaga (Photinus pyralis) (FLuc, SEQ ID NO: 205), unida operativamente en 5' a una región de terminación en 3' del gen de la nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 209).

La Tabla 12 a continuación muestra los valores medios de expresión de GUS conferidos por cada amplicón 10 transgénico. La Tabla 13 a continuación muestra las proporciones de GUS frente a luciferasa de luciérnaga (FLuc)

normalizadas con respecto a EXP-At.Atntt1:1:2 y P-CaMV.35S-enh-1:1:102/L-CaMV.35S-1:1:2

Tabla 12. Valores de expresión promedio de GUS y luciferasa y proporciones de GUS/luciferasa.

ID de amplicón

Elemento regulador SEQ ID NO: Media de GUS Media de Fluc GUS/Fluc

Sin ADN

0,00 0,00 0,00

pMON124912

Sin promotor 54,67 34905,00 0,00

pMON33449

P-CaMV.35S-enh-1:1:102/L-CaMV.35S- 1:1: 2 210 107064,67 21757,67 4,92

pMON80585

EXP-At.Atntt1:1:2 200 4962,33 40778,67 0,12

56969

CumMe_WSM_SF16429.G5670 40 283,67 53452,00 0,01

56877

P- CUCme.CumMe WSM SF16444.G5140- 1:1:1 175 5297,67 46576,67 0,11

56749

P- CUCme.CumMe WSM SF16563.G5560- 1:1:1 176 280,67 41958,33 0,01

56918

CumMe_WSM_SF17051.G5470 48 1088,00 36321,00 0,03

56849

P- CUCme.CumMe WSM SF17111.G5790- 1:1:1 177 196,00 48128,00 0,00

56754

P-CUCme.WSM_SF17252.G7330-1:1:1 179 175,67 45427,00 0,00

56892

CumMe_WSM_SF17349.G5770 56 34,00 38016,00 0,00

56477

CumMe_WSM_SF17866.G6050 62 862,00 52203,33 0,02

56842

P- CUCme.CumMe WSM SF18488.G5340- 1:1:1 181 2892,67 49144,33 0,06

56852

P- CUCme.CumMe WSM SF188536.G6480- 1:1:1 182 3462,67 46549,33 0,07

56497

CumMe_WSM_SF18575.G6410 71 92,67 47628,33 0,00

56847

P- CUCme.CumMe WSM SF18634.G5190- 1:1:1 183 122,33 36815,33 0,00

56746

P- CUCme.CumMe WSM SF18716.G5860- 1:1:1 184 14,33 62483,33 0,00

56883

CumMe_WSM_SF18986.G6110 79 863,33 54379,33 0,02

56734

EXP-CUCme.WSM_SF19064.G5690:1:1 185 142,00 46962,67 0,00

56912

P- CUCme.CumMe WSM SF19647.G5760- 1:1:1 188 7659,00 46935,67 0,16

56482

P- CUCme.CumMe WSM SF19839.G5090- 1:1:1 189 3279,00 37070,67 0,09

56963

CumMe_WSM_SF19902.G5260 87 1629,00 55649,00 0,03

ID de amplicón

Elemento regulador SEQ ID NO: Media de GUS Media de Fluc GUS/Fluc

56747

P- CUCme.CumMe WSM SF20132.G5560- 1:1:1 190 340,33 40577,00 0,01

56479

CumMe_WSM_SF20359.G5870 92 192,00 61341,67 0,00

56744

CumMe_WSM_SF206458.G5970 98 154,67 33139,33 0,00

56948

CumMe_WSM_SF206534.G5200 99 62,00 52118,00 0,00

56896

CumMe_WSM_SF22008.G5670 108 1585,00 53540,00 0,03

56919

CumMe_WSM_SF22275.G5780 112 8,33 48546,33 0,00

56967

CumMe_WSM_SF22355.G5310 113 74,33 36202,67 0,00

56837

P-CUCme.CumMe WSM- SF22531.G5120-1:1:1 192 1526,67 52799,33 0,03

56940

CumMe_WSM_SF22870.G5370 115 14,67 53663,33 0,00

56495

P- CUCme.CumMe WSM SF23760.G5200- 1:1:1 193 196,33 49870,67 0,00

56868

P- CUCme.CumMe WSM SF23906.G6180- 1:1:1 194 1584,33 42532,33 0,04

56998

CumMe_WSM_SF24045.G5400 123 80,67 47553,00 0,00

56976

P- CUCme.CumMe WSM SF25141.G5160- 1:1:2 195 4506,00 57213,00 0,08

56742

P- CUCme.CumMe WSM SF25355.G5000- 1:1:1 196 4,00 41114,33 0,00

56915

P- CUCme.CumMe WSM SF25936.G5450- 1:1:1 197 965,33 34494,67 0,03

56854

CumMe_WSM_SF28729.G5340 134 208,33 53956,00 0,00

56936

CumMe_WSM_SF31264.G5380 136 292,67 42320,67 0,01

56863

P- CUCme.CumMe WSM SF35856.G5150- 1:1:1 198 125,00 48705,33 0,00

56751

P- CUCme.CumMe WSM SF41124.G5080- 1:1:1 199 31,33 53595,00 0,00

56921

CumMe_WSM_SF41254.G5160 141 11,67 52643,67 0,00

56884

CumMe_WSM_SF42141.G5110 146 48,33 40556,67 0,00

Tabla 13. Proporciones de GUS frente a luciferasa de luciérnaga (FLuc) normalizadas con respecto a EXP- At.Atntt1:1:2 y P-CaMV.35S-enh-1:1:102/L-CaMV.35S-1:1:2.

ID de amplicón

Elemento regulador SEQ ID NO: proporción GUS/FLuc normalizada con respecto a EXP- At.Atntt1:1:2 proporción GUS/FLuc normalizada con respecto a P- CaMV.35S-enh-1: 1:102/L-CaMV.35S- 1:1:2

Sin ADN

0,00 0,00

pMON124912

Sin promotor 0,01 0,00

pMON33449

P-CaMV.35S-enh-1:1:102/L-CaMV.35S- 1:1:2 210 40,44 1,00

pMON80585

EXP-At.Atntt1:1:2 200 1,00 0,02

56969

CumMe_WSM_SF16429.G5670 40 0,04 0,00

ID de amplicón

Elemento regulador SEQ ID NO: proporción GUS/FLuc normalizada con respecto a EXP- At.Atntt1:1:2 proporción GUS/FLuc normalizada con respecto a P- CaMV.35S-enh-1: 1:102/L-CaMV.35S- 1:1:2

56877

P- CUCme.CumMe WSM SF16444.G5140- 1:1:1 175 0,93 0,02

56749

P- CUCme.CumMe WSM SF16563.G5560- 1:1:1 176 0,05 0,00

56918

CumMe_WSM_SF17051.G5470 48 0,25 0,01

56849

P- CUCme.CumMe WSM SF17111.G5790- 1:1:1 177 0,03 0,00

56754

P-CUCme.WSM_SF17252.G7330-1:1:1 179 0,03 0,00

56892

CumMe_WSM_SF17349.G5770 56 0,01 0,00

56477

CumMe_WSM_SF17866.G6050 62 0,14 0,00

56842

P- CUCme.CumMe WSM SF18488.G5340- 1:1:1 181 0,48 0,01

56852

P- CUCme.CumMe WSM SF18536.G6480- 1:1:1 182 0,61 0,02

56497

CumMe_WSM_SF18575.G6410 71 0,02 0,00

56847

P- CUCme.CumMe WSM SF18634.G5190- 1:1:1 183 0,03 0,00

56746

P- CUCme.CumMe WSM SF18716.G5860- 1:1:1 184 0,00 0,00

56883

CumMe_WSM_SF18986.G6110 79 0,13 0,00

56734

EXP-CUCme.WSM_SF19064.G5690:1:1 185 0,02 0,00

56912

P- CUCme.CumMe WSM SF19647.G5760- 1:1:1 188 1,34 0,03

56482

P- CUCme.CumMe WSM SF19839.G5090- 1:1:1 189 0,73 0,02

56963

CumMe_WSM_SF19902.G5260 87 0,24 0,01

56747

P- CUCme.CumMe WSM SF20132.G5560- 1:1:1 190 0,07 0,00

56479

CumMe_WSM_SF20359.G5870 92 0,03 0,00

56744

CumMe_WSM_SF206458.G5970 98 0,04 0,00

56948

CumMe_WSM_SF206534.G5200 99 0,01 0,00

56896

CumMe_WSM_SF22008.G5670 108 0,24 0,01

56919

CumMe_WSM_SF22275.G5780 112 0,00 0,00

56967

CumMe_WSM_SF22355.G5310 113 0,02 0,00

56837

P- CUCme.CumMe WSM SF22531.G5120- 1:1:1 192 0,24 0,01

ID de amplicón

Elemento regulador SEQ ID NO: proporción GUS/FLuc normalizada con respecto a EXP- At.Atntt1:1:2 proporción GUS/FLuc normalizada con respecto a P- CaMV.35S-enh-1: 1:102/L-CaMV.35S- 1:1:2

56940

CumMe_WSM_SF22870.G5370 115 0,00 0,00

56495

P- CUCme.CumMe WSM SF23760.G5200- 1:1:1 193 0,03 0,00

56868

P- CUCme.CumMe WSM SF23906.G6180- 1:1:1 194 0,31 0,01

56998

CumMe_WSM_SF24045.G5400 123 0,01 0,00

56976

P- CUCme.CumMe WSM SF25141.G5160- 1:1:2 195 0,65 0,02

56742

P- CUCme.CumMe WSM SF25355.G5000- 1:1:1 196 0,00 0,00

56915

P- CUCme.CumMe WSM SF25936.G5450- 1:1:1 197 0,23 0,01

56854

CumMe_WSM_SF28729.G5340 134 0,03 0,00

56936

CumMe_WSM_SF31264.G5380 136 0,06 0,00

56863

P- CUCme.CumMe WSM SF35856.G5150- 1:1:1 198 0,02 0,00

56751

P- CUCme.CumMe WSM SF41124.G5080- 1:1:1 199 0,00 0,00

56921

CumMe_WSM_SF41254.G5160 141 0,00 0,00

56884

CumMe_WSM_SF42141.G5110 146 0,01 0,00

Como se puede observar en la Tabla 12 anterior, no todas las secuencias de EXP demostraron la capacidad de dirigir la expresión transgénica en comparación con el control sin promotor. Sin embargo, las secuencias EXP, CumMe_WSM_SF16429.G5670 (SEQ ID NO: 40, P-CUCme.CumMe_WSM_SF16444.G5140-1:1:1 (SEQ ID NO: 175, P-CUCme.CumMe_WSM_SF16563.G5560-1:1:1 (SEQ ID NO: 176, CumMe_WSM_SF17051.G5470 (SEQ ID 5 NO: 48, P-CUCme.CumMe_WSM_SF17111.G5790-1:1:1 (SEQ ID NO: 177, P-CUCme.WSM_SF17252.G7330-1:1:1 (SEQ ID NO: 179, CumMe_WSM_SF17866.G6050 (SEQ ID NO: 62, P-CUCme.CumMe_WSM_SF18488.G5340- 1:1:1 (SEQ ID NO: 181, P-CUCme.CumMe_WSM_SF18536.G6480-1:1:1 (SEQ ID NO: 182,

CumMe_WSM_SF18575.G6410 (SEQ ID NO: 71, P-CUCme.CumMe_WSM_SF18634.G5190-1:1:1 (SEQ ID NO: 183, CumMe_WSM_SF18986.G6110 (SEQ ID NO: 79, EXP-CUCme.WSM_SF19064.G5690:1:1 (SEQ ID NO: 185, 10 P-CUCme.CumMe_WSM_SF19647.G5760-1:1:1 (SEQ ID NO: 188, P-CUCme.CumMe_WSM_SF19839.G5090-

1:1:1 (SEQ ID NO: 189, CumMe_WSM_SF19902.G5260 (SEQ ID NO: 87, P-

CUCme.CumMe_WSM_SF20132.G5560-1:1:1 (SEQ ID NO: 190, CumMe_WSM_SF20359.G5870 (SEQ ID NO: 92, CumMe_WSM_SF206458.G5970 (SEQ ID NO: 98, CumMe_WSM_SF206534.G5200 (SEQ ID NO: 99,

CumMe_WSM_SF22008.G5670 (SEQ ID NO: 108, CumMe_WSM_SF22355.G5310 (SEQ ID NO: 113, P- 15 CUCme.CumMe_WSM_SF22531.G5120-1:1:1 (SEQ ID NO: 192, EXP-CUCme.WSM_SF19064.G5690:1:1 (SEQ ID

NO: 193, P-CUCme.CumMe_WSM_SF23906.G6180-1:1:1 (SEQ ID NO: 194, CumMe_WSM_SF24045.G5400 (SEQ ID NO: 123, P-CUCme.CumMe_WSM_SF25141.G5160-1:1:2 (SEQ ID NO: 195, P-

CUCme.CumMe_WSM_SF25936.G5450-1:1:1 (SEQ ID NO: 197, CumMe_WSM_SF28729.G5340 (SEQ ID NO: 134, CumMe_WSM_SF31264.G5380 (SEQ ID NO: 136) y P-CUCme.CumMe_WSM_SF35856.G5150-1:1:1 (SEQ ID 20 NO: 198) demostraron la capacidad de conducir la expresión transgénica en protoplastos de cotiledón de soja a un nivel similar o superior al de EXP-At.Atntt1:1:2. Tal como se muestra en la Tabla 13 anterior, la secuencia EXP P- CUCme.CumMe_WSM_SF19647.G5760-1:1:1 (SEQ ID NO: 188) demostró la capacidad de dirigir la expresión transgénica en este ensayo a un nivel superior que el de EXP-At.Atntt1:1:2.

Ejemplo 7: Análisis de elementos reguladores que dirigen la GUS en los protoplastos de hoja de algodón.

5

10

15

20

25

Protoplastos de hoja de algodón se transformaron con vectores de expresión de plantas que contenían un grupo de elementos de expresión reguladores de la transcripción de ensayo que dirigía la expresión del transgén de la □- glucuronidasa (GUS), y se compararon con la expresión de GUS en protoplastos de hoja en los que la expresión de GUS estaba dirigida por promotores constitutivos conocidos.

La expresión de un transgén dirigida por P-CUCme.1-1:1:1rc (SEQ ID NO: 155, P-CUCme.2-1:1:1 (SEQ ID NO: 14, P-CUCme.3-1:1:3 (SEQ ID NO: 15, EXP-CUCme.4:1:1 (SEQ ID NO: 156, P-CUCme.6-1:1:1 (SEQ ID NO: 18, P- CUCme.8-1:1:2 (SEQ ID NO: 19, P-CUCme.9-1:1:2 (SEQ ID NO: 20, P-CUCme.10-1:1:1 (SEQ ID NO: 21, EXP- CUCme.eEF1a:1:1 (SEQ ID NO: 162, P-CUCme.15-1:1:2 (SEQ ID NO: 23, P-CUCme.16a-1:1:2 (SEQ ID NO: 24, P- CUCme.17-1:1:2 (SEQ ID NO: 26, P-CUCme.18-1:1:2 (SEQ ID NO: 27, P-CUCme.19-1:1:3 (SEQ ID NO: 167, P- CUCme.20-1:3 (SEQ ID NO: 211, P-CUCme.21-1:1:1 (SEQ ID NO: 30, P-CUCme.22-1:1:3 (SEQ ID NO: 31, EXP- CUCme.SAMS2:1:1 (SEQ ID NO: 168, P-CUCme.26-1:1:2 (SEQ ID NO: 33, P-CUCme.28-1:1:2 (SEQ ID NO: 34) y EXP-CUCme.29:1:2 (SEQ ID NO: 212) se comparó con la expresión de grupos de elementos de expresión constitutiva conocidos. Cada vector de expresión de planta comprendía una región de borde derecho de Agrobacterium tumefaciens, un primer casete transgénico que comprendía un promotor de ensayo o un promotor constitutivo conocido unido operativamente en 5' a una secuencia codificante de la p-glucuronidasa (GUS, SEQ ID NO: 206) que contenía un intrón procesable procedente del gen ST-LS1 de patata específico de tejido inducible por luz (n.° de registro del GenBank: X04753), unido operativamente en 5' a una región de terminación en 3' del gen E6 de Gossypium barbadense (T-Gb.E6-3b:1:1, SEQ ID NO: 204), el gen RbcS2-E9 de Pisum sativum (T-Ps.RbcS2-E9- 1:1:6, SEQ ID NO: 203), o el gen FbLate-2 de Gossypium barbadense (T-Gb.FbL2-1:1:1, SEQ ID NO: 205); un segundo casete de selección transgénico utilizado para la selección de las células de plantas transformadas que confiere resistencia al herbicida glifosato (dirigida por el promotor de Actina 7 de Arabidopsis) o al antibiótico kanamicina y a una región del borde izquierdo de A. tumefaciens. Un vector de expresión de planta de control sin promotor (pMON124912) sirvió como un control negativo para la expresión. Los grupos de ensayo anteriores y los de los elementos de expresión constitutiva, se clonaron en vectores de expresión de plantas como se muestra a continuación en la Tabla 14.

Tabla 14. Vectores de expresión de plantas y grupo de elemento de expresión correspondiente y UTR 3'

Construcción

Elemento regulador SEQ ID NO: UTR 3'

pMON109584

EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK: 1:3 201 T-Gb.E6-3b:1:1

pMON118756

EXP-At.Act7:1:11 202 T-Gb.E6-3b:1:1

pMON124912

Sin promotor T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140818

P-CUCme.1-1:1:1rc 155 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140819

P-CUCme.2-1:1:1 14 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140820

P-CUCme.3-1:1:3 15 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140821

EXP-CUCme.4:1:1 156 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140823

P-CUCme.6-1:1:1 18 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140824

P-CUCme.8-1:1:2 19 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140825

P-CUCme.9-1:1:2 20 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140826

P-CUCme.10-1:1:1 21 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140827

EXP-CUCme.eEF1a:1:1 162 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140828

P-CUCme.15-1:1:2 23 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140829

P-CUCme.16a-1:1:2 24 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140830

P-CUCme.17-1:1:2 26 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140831

P-CUCme.18-1:1:2 27 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140832

P-CUCme.19-1:1:3 167 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140833

P-CUCme.20-1:3 211 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140834

P-CUCme.21-1:1:1 30 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140835

P-CUCme.22-1:1:3 31 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140836

EXP-CUCme.SAMS2:1:1 168 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140837

P-CUCme.26-1:1:2 33 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140838

P-CUCme.28-1:1:2 34 T-Gb.FbL2-1:1:1

pMON140839

EXP-CUCme.29:1:2 212 T-Gb.FbL2-1:1:1

También se construyeron dos plásmidos para su uso en la cotransformación y normalización de datos. Un plásmido de control de transformación comprendía un promotor constitutivo, que dirigía la expresión de la secuencia codificante de luciferasa de luciérnaga (Photinus pyralis) (FLuc, SEQ ID NO: 205), unido operativamente en 5' a una región de terminación en 3' del gen de la nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ 5 ID NO: 209). El otro plásmido de control de transformación comprendía un promotor constitutivo, que dirigía la expresión de la secuencia codificante de luciferasa del pensamiento de mar (Renilla reniformis) (RLuc, SEQ ID NO: 206), unido operativamente en 5' a una región de terminación en 3' del gen de la nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens.

Los vectores de expresión de plantas, pMON80585, pMON109584, pMON118756, pMON124912, pMON140818, 10 pMON140819, pMON140820, pMON140821, pMON140823, pMON140824, pMON140825, pMON140826,

pMON140827, pMON140828, pMON140829, pMON140830, pMON140831, pMON140832, pMON140833,

pMON140834, pMON140835, pMON140836, pMON140837, pMON140838 y pMON140839, se utilizaron para transformar células de protoplasto de hojas de algodón utilizando procedimientos de transformación con PEG. Las células de protoplastos se transformaron con cantidades equimolares de cada uno de los dos plásmidos de control 15 de transformación y un vector de expresión de planta de ensayo. Se evaluó la actividad de GUS y luciferasa. Se realizaron mediciones de GUS y luciferasa colocando alícuotas de una preparación de células sometidas a lisis, transformadas como se indicó anteriormente, en dos bandejas diferentes de pocillos pequeños. Una bandeja se utilizó para las mediciones de GUS, y una segunda bandeja se utilizó para realizar un doble ensayo de luciferasa utilizando el sistema de doble ensayo indicador de luciferasa (Promega Corp., Madison, WI; véase, por ejemplo, 20 Promega Notes Magazine, n.°: 57, 1996; p.02) Las mediciones de las muestras se realizaron utilizando 4 repeticiones por transformación. Los valores promedio de GUS y luciferasa se presentan a continuación en la Tabla 15.

Tabla 15. Valores de expresión promedio de GUS y luciferasa y proporciones de GUS/luciferasa.

Construcción

Elemento regulador SEQ ID NO: promedio de GUS promedio de Fluc promedio de RLuc GUS/FLuc GUS/RLuc

pMON109584

EXP-CaMV.35S- enh+Ph.DnaK:1:3 201 5322,8 14842,8 27990,5 0,3586 0,1902

pMON118756

EXP-At.Act7:1:11 202 1006,3 19746,8 25582,3 0,0510 0,0393

pMON124912

Sin promotor 21 19248,5 25012 0,0011 0,0008

pMON140818

P-CUCme.1-1:1:1rc 155 170,3 17796,8 22026,3 0,0096 0,0077

pMON140819

P-CUCme.2-1:1:1 14 34,8 16326,3 21407,5 0,0021 0,0016

pMON140820

P-CUCme.3-1:1:3 15 51,5 17356,8 21523,8 0,0030 0,0024

pMON140821

EXP-CUCme.4:1:1 156 3497,8 18745,3 26065,3 0,1866 0,1342

pMON140823

P-CUCme.6-1:1:1 18 40,8 19533,8 26361,5 0,0021 0,0015

pMON140824

P-CUCme.8-1:1:2 19 22 19701 26278 0,0011 0,0008

pMON140825

P-CUCme.9-1:1:2 20 372,5 21972,3 28755 0,0170 0,0130

pMON140826

P-CUCme.10-1:1:1 21 198 21362,8 28902 0,0093 0,0069

pMON140827

EXP- CUCme.eEF1a:1:1 162 725 21589 27635,3 0,0336 0,0262

pMON140828

P-CUCme.15-1:1:2 23 55,3 17706 28846 0,0031 0,0019

pMON140829

P-CUCme.16a-1:1:2 24 14 23289,5 30190 0,0006 0,0005

pMON140830

P-CUCme.17-1:1:2 26 155,5 23178,3 31602,8 0,0067 0,0049

pMON140831

P-CUCme.18-1:1:2 27 86,8 19085,8 22396,5 0,0045 0,0039

pMON140832

P-CUCme.19-1:1:3 167 130 21520,3 27270,5 0,0060 0,0048

pMON140833

P-CUCme.20-1:3 211 88,5 22223,8 30786 0,0040 0,0029

pMON140834

P-CUCme.21-1:1:1 30 98,5 18579 20506,3 0,0053 0,0048

pMON140835

P-CUCme.22-1:1:3 31 363 21780,3 28816,3 0,0167 0,0126

pMON140836

EXP- CUCme.SAMS2:1 : 1 168 515 17906 23031 0,0288 0,0224

pMON140837

P-CUCme.26-1:1:2 33 125 15529,3 15169,3 0,0080 0,0082

pMON140838

P-CUCme.28-1:1:2 34 115,8 17013,5 22236,5 0,0068 0,0052

pMON140839

EXP-CUCme.29:1:2 212 15,5 16370,3 20409 0,0009 0,0008

Para comparar la actividad relativa de cada promotor en protoplastos de hoja de algodón, los valores de GUS se

expresaron como una proporción de actividad de GUS frente a luciferasa y se normalizaron con respecto a los niveles de expresión observados para los grupos de elementos de expresión constitutiva, EXP-At.Act7:1:11 y EXP- CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3. La Tabla 16 a continuación muestra las proporciones de GUS frente a luciferasa de luciérnaga (FLuc) normalizadas con respecto a EXP-At.Act7:1:11 y EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3 La Tabla 17 a 5 continuación muestra las proporciones de GUS frente a luciferasa de Renilla (RLuc) normalizadas con respecto a EXP-At.Act7:1:11 y EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3.

Tabla 16. Proporciones de GUS frente a luciferasa de luciérnaga (FLuc) normalizadas con respecto a EXP-

At.Act7:1:11 y EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3.

Construcción

Elemento Regulador SEQ ID NO: proporción GUS/FLuc normalizada con respecto a EXP- At.Act7:1:11 proporción GUS/FLuc normalizada con respecto a EXP- CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3

pMON109584

EXP-CaMV.35S- enh+Ph.DnaK:1:3 201 7,037 1,000

pMON118756

EXP-At.Act7:1:11 202 1,000 0,142

pMON124912

Sin promotor 0,021 0,003

pMON140818

P-CUCme.1-1:1: 1rc 155 0,188 0,027

pMON140819

P-CUCme.2-1:1:1 14 0,042 0,006

pMON140820

P-CUCme.3-1:1:3 15 0,058 0,008

pMON140821

EXP-CUCme.4:1: 1 156 3,662 0,520

pMON140823

P-CUCme.6-1:1:1 18 0,041 0,006

pMON140824

P-CUCme.8-1:1:2 19 0,022 0,003

pMON140825

P-CUCme.9-1:1:2 20 0,333 0,047

pMON140826

P-CUCme.10-1:1: 1 21 0,182 0,026

pMON140827

EXP- CUCme.eEF1a:1: 1 162 0,659 0,094

pMON140828

P-CUCme.15-1:1: 2 23 0,061 0,009

pMON140829

P-CUCme.16a-1: 1:2 24 0,012 0,002

pMON140830

P-CUCme.17-1:1: 2 26 0,132 0,019

pMON140831

P-CUCme.18-1:1: 2 27 0,089 0,013

pMON140832

P-CUCme.19-1:1: 3 167 0,119 0,017

pMON140833

P-CUCme.20-1:3 211 0,078 0,011

pMON140834

P-CUCme.21-1:1: 1 30 0,104 0,015

pMON140835

P-CUCme.22-1:1: 3 31 0,327 0,046

pMON140836

EXP- CUCme.SAMS2: 1:1 168 0,564 0,080

pMON140837

P-CUCme.26-1:1: 2 33 0,158 0,022

pMON140838

P-CUCme.28-1:1: 2 34 0,134 0,019

pMON140839

EXP-CUCme.29: 1:2 212 0,019 0,003

Tabla 17. Proporciones de GUS frente a luciferasa de Renilla (RLuc) normalizadas con respecto a EXP- 10 At.Act7:1:11 y EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3.

Construcción

Elemento Regulador SEQ ID NO: proporción GUS/RLuc normalizada con respecto a EXP- At.Act7:1:11 proporción GUS/RLuc normalizada con respecto a EXP-CaMV.35S- enh+Ph.DnaK:1:3

pMON109584

EXP-CaMV.35S- enh+Ph.DnaK:1: 3 201 4,83 1,00

pMON118756

EXP-At.Act7:1:11 202 1,00 0,21

pMON124912

Sin promotor 0,02 0,00

pMON140818

P-CUCme.1-1:1: 1rc 155 0,20 0,04

pMON140819

P-CUCme.2-1:1: 1 14 0,04 0,01

5

10

15

20

25

Construcción

Elemento Regulador SEQ ID NO: proporción GUS/RLuc normalizada con respecto a EXP- At.Act7:1:11 proporción GUS/RLuc normalizada con respecto a EXP-CaMV.35S- enh+Ph.DnaK:1:3

pMON140820

P-CUCme.3-1:1: 3 15 0,06 0,01

pMON140821

EXP-CUCme.4: 1:1 156 3,41 0,71

pMON140823

P-CUCme.6-1:1: 1 18 0,04 0,01

pMON140824

P-CUCme.8-1:1: 2 19 0,02 0,00

pMON140825

P-CUCme.9-1:1: 2 20 0,33 0,07

pMON140826

P-CUCme.10-1: 1:1 21 0,17 0,04

pMON140827

EXP-CUCme.eEF1a: 1:1 162 0,67 0,14

pMON140828

P-CUCme.15-1: 1:2 23 0,05 0,01

pMON140829

P-CUCme.16a-1: 1:2 24 0,01 0,00

pMON140830

P-CUCme.17-1: 1:2 26 0,13 0,03

pMON140831

P-CUCme.18-1: 1:2 27 0,10 0,02

pMON140832

P-CUCme.19-1: 1:3 167 0,12 0,03

pMON140833

P-CUCme.20-1:3 211 0,07 0,02

pMON140834

P-CUCme.21-1: 1:1 30 0,12 0,03

pMON140835

P-CUCme.22-1: 1:3 31 0,32 0,07

pMON140836

EXP-CUCme.SAMS2: 1:1 168 0,57 0,12

pMON140837

P-CUCme.26-1: 1:2 33 0,21 0,04

pMON140838

P-CUCme.28-1: 1:2 34 0,13 0,03

pMON140839

EXP-CUCme.29: 1:2 212 0,02 0,00

Como se puede observar en las Tablas 16 y 17, la mayoría de los grupos de elementos de expresión ensayados, demostraron la capacidad de dirigir la expresión transgénica en células de protoplasto de hoja de algodón. En este ensayo, un grupo de elementos de expresión, EXP-CUCme.4:1:1 (SEQ ID NO: 156), demostró niveles de expresión transgénica superiores a los de EXP-At.Act7:1:11.

Ejemplo 8: Análisis de elementos reguladores que dirigen la GUS en protoplastos de hoja de algodón utilizando amplicones de casete transgénico

Protoplastos de hoja de algodón se transformaron con amplicones de casete transgénico que contenían un grupo de elementos de expresión reguladores de la transcripción que dirigen la expresión del transgén de la p-glucuronidasa (GUS) y se compararon con la expresión de GUS en protoplastos de hoja en los que la expresión de GUS está dirigida por promotores constitutivos conocidos. Los amplicones del casete transgénico comprendían una secuencia EXP, unida operativamente a una secuencia codificante de GUS (GUS, SEQ ID NO: 206), unida operativamente a una UTR en 3' (T-Gb.FbL2-1:1:1, SEQ ID NO: 205). La expresión promedio de GUS se comparó con la de los elementos EXP de control, P-CaMV.35S-enh-1:1:102/L-CaMV.35S-1:1:2 (SEQ ID NO: 210) y EXP-At.Atntt1:1:2 (SEQ ID NO: 200).

De manera similar a la descrita en el ejemplo 2 anterior, también se utilizó un plásmido para su uso en la cotransformación y normalización de datos. El plásmido de control de transformación comprendía un promotor constitutivo, que dirigía la expresión de la secuencia codificante de luciferasa de luciérnaga (Photinus pyralis) (FLuc, SEQ ID NO: 205), unido operativamente en 5' a una región de terminación en 3' del gen de la nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 209).

La Tabla 18 a continuación muestra los valores medios de expresión de GUS conferidos por cada amplicón transgénico. La Tabla 19 a continuación muestra las proporciones de GUS frente a luciferasa de luciérnaga (FLuc) normalizadas con respecto a EXP-At.Atntt1:1:2 y P-CaMV.35S-enh-1:1:102/L-CaMV.35S-1:1:2.

Tabla 18. Valores de expresión promedio de GUS y luciferasa y proporciones de GUS/luciferasa.

ID de amplicón

Elemento regulador SEQ ID NO: Media de GUS Media de Fluc GUS/FLuc

Vector vacío

Sin ADN 32,8 14087,5 0,002

pMON124912

Sin promotor 12 20486,3 0,001

ID de amplicón

Elemento regulador SEQ ID NO: Media de GUS Media de Fluc GUS/FLuc

pMON80585

EXP-At.Atntt1:1:2 200 55,5 18811 0,003

pMON33449

P-CaMV.35S-enh-1:1:102/L-CaMV.35S- 1:1: 2 210 12472,5 19126,3 0,652

56741

CumMe_WSM_SF143981.G5150 36 5,8 17449,5 0,000

56492

CumMe_WSM_SF144839.G5080 37 27,5 16674 0,002

56877

P- CUCme.CumMe WSM SF16444.G5140- 1:1:1 175 96,3 17237,8 0,006

56485

CumMe_WSM_SF16530.G6000 42 27,3 17858,5 0,002

56844

CumMe_WSM_SF16953.G5180 47 22,3 19398,5 0,001

56500

CumMe_WSM_SF17250.G5910 52 12,3 23980,3 0,001

56754

P-CUCme.WSM_SF17252.G7330-1:1:1 179 16 13848,8 0,001

56740

CumMe_WSM_SF17672.G5610 60 12 16646,8 0,001

56870

CumMe_WSM_SF18287.G5380 66 39,3 13930,5 0,003

56478

CumMe_WSM_SF18504.G5090 68 11,8 15830,5 0,001

56481

CumMe_WSM_SF18530.G5750 69 6,5 15211,3 0,000

56498

CumMe_WSM_SF18645.G5380 73 36 14569,8 0,002

56746

P- CUCme.CumMe WSM SF18716.G5860- 1:1:1 184 11 18054,5 0,001

56490

CumMe_WSM_SF18801.G5040 75 21,5 14147,3 0,002

56488

CumMe_WSM_SF19323.G5120 81 15,3 11985,3 0,001

56499

CumMe_WSM_SF19631.G5170 83 12,5 20140,5 0,001

56482

P- CUCme.CumMe WSM SF19839.G5090- 1:1:1 189 75 18690,5 0,004

56489

CumMe_WSM_SF19850.G5130 86 38,3 19756,5 0,002

56476

CumMe_WSM_SF20355.G5130 91 10,5 27901,8 0,000

56895

CumMe_WSM_SF20431.G6340 95 34,8 16283,8 0,002

56744

CumMe_WSM_SF206458.G5970 98 11 19659 0,001

56480

CumMe_WSM_SF21366.G5980 105 10,8 17367 0,001

56930

CumMe_WSM_SF22070.G5280 109 25,3 14210,5 0,002

56484

CumMe_WSM_SF23181.G5100 117 20,3 13506 0,002

56495

P- CUCme.CumMe WSM SF23760.G5200- 1:1:1 193 7,8 15138,5 0,001

56971

CumMe_WSM_SF25084.G5580 125 16 16135,3 0,001

56742

P- CUCme.CumMe WSM SF25355.G5000- 1:1:1 196 18 13782,8 0,001

56494

CumMe_WSM_SF25455.G5370 129 10,5 16089,8 0,001

56751

P- 199 24,3 17884,3 0,001

CUCme.CumMe WSM SF41124.G5080- 1: 1:1

56483

CumMe_WSM_SF41644.G6400 143 14,5 13130,5 0,001

56904

CumMe_WSM_SF44933.G5290 147 33 13369 0,002

56743

CumMe_WSM_SF9060.G5120 154 11,3 15230,8 0,001

Tabla 19. Proporciones de GUS frente a luciferasa de luciérnaga (FLuc) normalizadas con respecto a EXP- At.Atntt1:1:2 y P-CaMV.35S-enh-1:1:102/L-CaMV.35S-1:1:2.

ID de amplicón

Elemento regulador SEQ ID NO: proporción GUS/FLuc normalizada con respecto a EXP- At.Atntt1:1:2 proporción GUS/FLuc normalizada con respecto a P- CaMV.35S-enh-1: 1:102/L-CaMV.35S-1:1:2

Vector vacío

Sin ADN

pMON124912

Sin promotor

pMON80585

EXP-At.Atntt1:1:2 200 1,000 0,005

pMON33449

P-CaMV.35S-enh-1:1: 102/L-CaMV.35S- 1:1:2 210 221,025 1,000

56741

CumMe_WSM_SF143981.G5150 36 0,113 0,001

56492

CumMe_WSM_SF 144839.G5080 37 0,559 0,003

56877

P- CUCme.CumMe WSM SF16444.G5140- 1:1:1 175 1,893 0,009

56485

CumMe_WSM_SF16530.G6000 42 0,518 0,002

56844

CumMe_WSM_SF16953.G5180 47 0,390 0,002

56500

CumMe_WSM_SF17250.G5910 52 0,174 0,001

56754

P-CUCme.WSM_SF17252.G7330-1:1:1 179 0,392 0,002

56740

CumMe_WSM_SF17672.G5610 60 0,244 0,001

56870

CumMe_WSM_SF18287.G5380 66 0,956 0,004

56478

CumMe_WSM_SF18504.G5090 68 0,253 0,001

56481

CumMe_WSM_SF18530.G5750 69 0,145 0,001

56498

CumMe_WSM_SF18645.G5380 73 0,837 0,004

56746

P- CUCme.CumMe WSM SF18716.G5860- 1:1:1 184 0,207 0,001

56490

CumMe_WSM_SF18801.G5040 75 0,515 0,002

56488

CumMe_WSM_SF19323.G5120 81 0,433 0,002

56499

CumMe_WSM_SF19631.G5170 83 0,210 0,001

56482

P- CUCme.CumMe WSM SF19839.G5090- 1:1:1 189 1,360 0,006

56489

CumMe_WSM_SF19850.G5130 86 0,657 0,003

56476

CumMe_WSM_SF20355.G5130 91 0,128 0,001

56895

CumMe_WSM_SF20431.G6340 95 0,724 0,003

56744

CumMe_WSM_SF206458.G5970 98 0,190 0,001

56480

CumMe_WSM_SF21366.G5980 105 0,211 0,001

56930

CumMe_WSM_SF22070.G5280 109 0,603 0,003

56484

CumMe_WSM_SF23181.G5100 117 0,509 0,002

56495

P- CUCme.CumMe WSM SF23760.G5200- 1:1:1 193 0,175 0,001

56971

CumMe_WSM_SF25084.G5580 125 0,336 0,002

56742

P- CUCme.CumMe WSM SF25355.G5000- 1:1:1 196 0,443 0,002

5

10

15

20

25

30

35

40

45

ID de amplicón

Elemento regulador SEQ ID NO: proporción GUS/FLuc normalizada con respecto a EXP- At.Atntt1:1:2 proporción GUS/FLuc normalizada con respecto a P- CaMV.35S-enh-1: 1:102/L-CaMV.35S-1:1:2

56494

CumMe_WSM_SF25455.G5370 129 0,221 0,001

56751

P- CUCme.CumMe WSM SF41124.G5080- 1:1:1 199 0,461 0,002

56483

CumMe_WSM_SF41644.G6400 143 0,374 0,002

56904

CumMe_WSM_SF44933.G5290 147 0,837 0,004

56743

CumMe_WSM_SF9060.G5120 154 0,251 0,001

Como se puede observar en la Tabla 18 anterior, no todas las secuencias de EXP demostraron la capacidad de dirigir la expresión transgénica al compararse con el control sin promotor. Sin embargo, las secuencias EXP, P- CUCme.CumMe_WSM_SF16444.G5140-1:1:1 (SEQ ID NO: 175) y P-CUCme.CumMe_WSM_SF19839.G5090-1:1:1 (SEQ ID NO: 189) demostraron la capacidad de conducir la expresión transgénica en protoplastos de cotiledón de soja a un nivel similar o superior al de EXP-At.Atntt1:1:2. Como se muestra en la Tabla 19 anterior, la secuencia EXP, P-CUCme.CumMe_WSM_SF19839.G5090-1:1:1 (SEQ ID NO: 189) demostró la capacidad de dirigir la expresión transgénica en este ensayo a un nivel superior que el de EXP-At.Atntt1:1:2.

Ejemplo 9: Análisis de elementos reguladores que dirigen la GUS en soja transformada de manera estable

Plantas de soja se transformaron con vectores de expresión de plantas que contenían una secuencia EXP que dirige la expresión del transgén de la p-glucuronidasa (GUS).

La expresión del transgén de GUS dirigida por EXP-CUCme.Ubq1:1:1 (SEQ ID NO: 1), EXP-CUCme.Ubq1:1:3 (SEQ ID NO: 7), P-CUCme.1-1:1:1rc (SEQ ID NO: 155), P-CUCme.2-1:1:1 (SEQ ID NO: 14), P-CUCme.3-1:1:3 (SEQ ID NO: 15), EXP-CUCme.4:1:1 (SEQ ID NO: 156), EXP-CUCme.5:1:1 (SEQ ID NO: 159), P-CUCme.6-1:1:1 (SEQ ID NO: 18), P-CUCme.8-1:1:2 (SEQ ID NO: 19), P-CUCme.9-1:1:2 (SEQ ID NO: 20), P-CUCme.10-1:1:1 (SEQ ID NO: 21), EXP-CUCme.eEF1a:1:1 (SEQ ID NO: 162), P-CUCme.15-1:1:2 (SEQ ID NO: 23), P-CUCme.17-1:1:2 (SEQ ID NO: 26), P-CUCme.18-1:1:2 (SEQ ID NO: 27), P-CUCme.19-1:1:3 (SEQ ID NO: 167), P-CUCme.20-1:3 (SEQ ID NO: 211), P-CUCme.21-1:1:1 (SEQ ID NO: 30), EXP-CUCme.SAMS2:1:1 (SEQ ID NO: 168), P-CUCme.26-1:1:2 (SEQ ID NO: 33), EXP-CUCme.29:1:2 (SEQ ID NO: 212), P-CUCme.CumMe_WSM_SF25355.G5000-1:1:1 (SEQ ID NO: 196), P-CUCme.CumMe_WSM_SF17111.G5790-1:1:1 (SEQ ID NO: 177), P-

CUCme.CumMe_WSM_SF22531.G5120-1:1:1 (SEQ ID NO: 192), P-CUCme.CumMe_WSM_SF18488.G5340-1:1:1 (SEQ ID NO: 181), P-CUCme.CumMe_WSM_SF23760.G5200-1:1:1 (SEQ ID NO: 193), EXP-

CUCme.WSM_SF19064.G5690:1:1 (SEQ ID NO: 185), P-CUCme.WSM_SF17252.G7330-1:1:1 (SEQ ID NO: 179), P-CUCme.CumMe_WSM_SF18634.G5190-1:1:1 (SEQ ID NO: 183), P-CUCme.CumMe_WSM_SF19647.G5760- 1:1:1 (SEQ ID NO: 188), P-CUCme.CumMe_WSM_SF25936.G5450-1:1:1 (SEQ ID NO: 197), P-

CUCme.CumMe_WSM_SF19839.G5090-1:1:1 (SEQ ID NO: 189), CumMe_WSM_SF206458.G5970 (SEQ ID NO: 98) y P-CUCme.CumMe_WSM_SF18716.G5860-1:1:1 (SEQ ID NO: 184) se evaluó de manera cualitativa, mediante inspección de secciones de tejido teñidas, así como cuantitativa. Cada vector de expresión de planta comprendía una región de borde derecho de Agrobacterium tumefaciens, un primer casete transgénico que comprendía una secuencia EXP unida operativamente en 5' a una secuencia codificante de la p-glucuronidasa (GUS, SEQ ID NO: 206) que contenía un intrón procesable procedente del gen ST-LS1 de la patata, específico de tejido, inducible por luz (n.° de registro del GenBank: X04753), unido operativamente en 5' a una región de terminación en 3' del gen FbLate-2 de Gossypium barbadense (T-Gb.FbL2-1:1:1, SEQ ID NO: 205); un segundo casete de selección transgénico utilizado para la selección de las células de plantas transformadas que confiere resistencia al herbicida glifosato (dirigida por el promotor de Actina 7 de Arabidopsis), y una región del borde izquierdo de A. tumefaciens.

Las secuencias EXP anteriores se clonaron en construcciones de expresión de plantas como se muestra a continuación en las Tablas 20 a 23 y se utilizaron para transformar plantas de soja utilizando un procedimiento de transformación mediado por Agrobacterium. La expresión de GUS se evaluó de manera cualitativa, utilizando secciones histológicas de tejidos seleccionados, así como cuantitativa.

El análisis histoquímico de GUS se utilizó para el análisis de expresión cualitativa de plantas transformadas. Durante un periodo de tiempo adecuado, se incubaron secciones enteras de tejido con la solución de tinción X-Gluc (5- bromo-4-cloro-3-indolil-b-glucurónido) (1 miligramo/mililitro) específica de GUS, se aclararon y se observó visualmente para determinar la coloración azul. La actividad de GUS se determinó de manera cualitativa mediante observación visual directa o al microscopio utilizando órganos y tejidos de plantas seleccionados. Las plantas de generación R0 se observaron para determinar su expresión en Raíz Vn5, Raíz R1, Hoja Consumidora Vn5, Hoja Productora Vn5, Hoja Productora R1, Peciolo R1, Embrión de Vaina de color amarillo, Cotiledón de vaina de color

amarillo, Semilla Inmadura R3 Vaina R3, Cotiledón R5 y Flor R1.

Para el análisis cuantitativo, la proteína total se extrajo de tejidos seleccionados de plantas de maíz transformadas. Se usó un microgramo de proteína total con el sustrato fluorogénico 4-metileumbeliferil-p-D-glucurónido (MUG) en un volumen de reacción total de 50 microlitros. El producto de reacción, 4-metilumbeliferona (4-MU), tiene fluorescencia 5 máxima a pH elevado, donde el grupo hidroxilo está ionizado. La adición de una solución básica de carbonato de sodio detiene simultáneamente el ensayo y ajusta el pH para cuantificar el producto fluorescente. La fluorescencia se midió con una excitación a 365 nm, y una emisión a 445 nm, utilizando un Fluoromax-3 (Horiba; Kioto, Japón) con un lector Micromax, con una anchura de rendija configurada para una excitación de 2 nm y una emisión de 3 nm.

Las tablas 20 y 21 a continuación muestran los niveles medios de expresión cuantitativa medidos en los tejidos de 10 plantas de la generación Rq. En ambas tablas los tejidos no analizados se muestran como celdas en blanco.

Tabla 20. Niveles medios de expresión de GUS en Raíz Vn5, Raiz R1, Hoja Consumidora Vn5, Hoja Productora Vn5, Hoja Productora R1 y Peciolo R1 de plantas

de soja transformadas de la generación Ro

Construcción

Elemento regulador SEQ ID NO: Vn5_Raíz R1_Raíz Vn5_Hoja_consumidora Vn5_Hoja_Productora RI_Hoja_Productora Ri_Peciolo

pMON138776

EXP-CUCme.Ubq1:1:1 1 4 4 4

pMON138778

EXP-CUCme.Ubq1:1:3 7 16 1 2 13 23

pMON140818

P-CUCme.1-1:1:1rc 155 48,21 22,35 20,24 33,01 78,17

pMON140819

P-CUCme.2-1:1:1 14

pMON140820

P-CUCme.3-1:1:3 15

pMON140821

EXP-CUCme.4:1:1 156 96,82 28,32 39,17 322,98 280,03

pMON140822

EXP-CUCme.5 1:1 159 28,88 41,11

pMON140823

P-CUCme.6-1:1:1 18 23,94 32,14 30,22

pMON140824

P-CUCme.8-1:1:2 19

PMON14C825

P-CUCme.9-1:1:2 20 22,06 21,22 23,08

pMON140826

P-CUCme.10-1:1:1 21

pMON140827

EXP-CUCme.eEF1a:1:1 162 189,24 153,52 59,6 37,44 103,01 130,6

pMON140828

P-CUCme. 15-1 1:2 23 30,53

pMON140830

P-CUCme. 17-1:1:2 26 51,62 30,07 31,08 30,49 60,14

pMON140831

P-CUCme. 18-1:1:2 27 57,38 30,03

pMON140832

P-CUCme.19-1:1:3 167 23,07 50,21 59,73 65,58 137,42

pMON140833

P-CUCme.20-1:3 211 23,15 61,6 118,76 502,55 119,46

pMON140834

P-CUCme.21-1:1:1 30 25,49

pMON140836

EXP-CUCme.SAMS2:1:1 168 230,89 184,88 65,44 53,36 118,82 351,49

pMON140837

P-CUCme.26-1:1:2 33 56,21 26,81 45,07 51,61 47,42

PMON140839

EXP-CUCme.29:1:2 212 82,17 45,2 28,27 64,96 109,9

pMON144926

P-CUCme.CumMe WSM S F25355.G5000-1:1:1 196 28,53

pMON144927

P-CUCme.CumMe WSM S F17111 ,G5790-1:1:1 177 23,62

pMON144928

P-CUCme.CumMe WSM S F22531 .05120-1:1:1 192 75,62 23 20,46 21,78 39,77

Construcción

Elemento regulador SEQ ID NO: Vn5_Raiz R1_Raíz Vn5_Hoja_consumidora Vn5_Hoja_Productora RI_Hoja_Productora RI_Peciolo

pMON 144931

P-CUCme.CumMe WSM S F18488.G5340-1:1:1 181 43,2 52,55

pMON 144933

P-CUCme.CumMe WSM S F23760.G5200-1:1:1 193 25,61 20,45 0 0 28,69

pMON 146941

EXP-CUCme.WSM SF 19064.G 5690:1:1 185 33,5 0 0 24,27 47,82

pMON 144932

P-CUCme.WSM SF17252.G 7330-1:1:1 179 32,54 23,76 21,5 0 22,21

pMON 146940

P-CUCme.CumMe WSM S F18634.G5190-1:1:1 183 0 0 0 0 0

pMON147340

P-CUCme.CumMe WSM S F19647.G5760-1:1:1 188 28,9 0 0 29,77 25,82

pMON147342

P-CUCme.CumMe WSM S F25936.G5450-1:1:1 197 50,15 24,26 0 29,38 29,91

pMON147343

P-CUCme.CumMe WSM S F19839.G5090-1:1:1 189 36,05 25,7 27,54 22.85 37,15

pMON 144929

CumMe WSM SF206458, G5970 98

pMON 147304

P-CUCme.CumMe WSM S F18716.G5860-1:1:1 184 35,01 21,17 21,23 22 44,57

Construcción

Elemento regulador SEQ ID NO: Embrión_Vaina_Amarillo Cotiledón_Vaina_Amarillo Semilla_R3_lnmadura R3_Vaina R5_Cotiledón R1_Flor

pMON138776

EXP-CUCme.Ubq 1:1.1 1 12 9 13 11 10 7

pMON138778

EXP-CÜCme.Ubq1:1:3 7 3 1 13 9 13 27

PMON140818

P-CUCme.1-1:1:1rc 155 100,79 117,5 38,31 84,72 132,27 66,8

pMON140819

P-CUCme.2-1:1:1 14 20,35 36,18

PMON140820

P-CUCme.3-1:1:3 15

pMON140821

EXP-CUCme.4; 1:1 156 86,68 225,53 105,62 342,07 119,08 184,92

pMON140822

EXP-CUCme.5:1:1 159 21,48 32,27 21,47 21,66 36,88

PMON140823

P-CUCme.6-1:1:1 18 38,75 23,03 25,32 58,7

pMON140824

P-CUCme.8-1:1:2 19 90,33 25,77

pMON140825

P-CUCme.9-1:1:2 20 132,04 20,56 34,78

pMON140826

P-CUCme.10-1:1:1 21 22,34

pMON140827

EXP-CUCme.eEF1a:1:1 162 200,28 291,26 58,21 131,17 114,29 130,38

pMON140828

P-CUCme.15-1:1:2 23 142,24 26,2

pMON140830

P-CUCme.17-1:1:2 26 343,34 302,94 65,55 80,94 137,02 62,7

pMON140831

P-CUCme.18-1:1:2 27 103,17 135,97 30 34,62 88 14 23,73

pMON140832

P-CUCme. 19-1:1:3 167 30,96 64,46 316,66 53,46

PMON140833

P-CUCme.20-1:3 211 174,62 524,88 222,04 59,43 124,68

PMON140834

P-CUCme.21-1:1:1 30 28,15 20,52 23,89

pMON140836

EXP-CUCme.SAMS2:1:1 168 110,23 159,43 61,99 248.96 49,17 224,24

PMON140837

P-CUCme.26-1:1:2 33 56,73 50,06 70 143,05 25,06 49,92

PMON140839

EXP-CUCme.29:1:2 212 251,76 237,2 49,16 89,28 114,92 57,84

PMON144926

P- CUCme.CumMe WSM S F25355.G5000-1:1:1 196 21,41 22,23

PMON144927

P- CUCme.CumMe WSM S F17111 ,G5790-1:1:1 177 58,84 28,94 20,97

pMON144928

P- CUCme.CiimMe WSM S F22531 ,G5120-T:1:1 192 135,62 152,48 30,45 51,71 129,72 42,2

Construcción

Elemento regulador SEQ ID NO: Embr¡ón_Vaina_Amar¡llo Cotlledón_Vaina_Amarillo Semilla_R3_lnmadura R3_Vaina R5_Cotiledón R1_Flor

pMON144931

P- CUCme.CumMe WSM S F18488.G5340-1:1:1 181 866,94 23,26 21,49

pMON144933

P- CUCme.CumMe WSM S F23760.G5200-1:1:1 193 29,03 349 69,63 24,42

PMON146941

EXP- CUCme.WSM SF19064.G 5690:1:1 185 36,69 8308 89,81 33,99

pMON144932

P- CUCme.WSM SF17252.G 7330-1:1 1 179 34,29 39 89 113,83 0

pMON146940

P- CUCme.CumMe WSM S F18634.G5190-1:1:1 183 30,25 0 0 0

PMON147340

P- CUCme.CumMe WSM S F19647.G5760-1:1:1 188 25,73 28,28 24,04 23,35

pMON147342

P- CUCme.CumMe WSM S F25936-G5450-1:1:1 197 104,02 80,27 31,06 26,8

pMON147343

P- CUCme.CumMe WSM S F19839.G5090-1:1:1 189 29,09

pMON 144929

CumMe WSM SF206458, G5970 98 24,42 25,33

PMOM147304

P- CUCme.CumMe WSM $ F18716.G5860-1:1:1 184 283,49 61,43

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Como se puede observar en las Tablas 20 y 21, las secuencias EXP, EXP-CUCme.Ubq1:1:1 (SEQ ID NO: 1, EXP- CUCme.Ubq1:1:3 (SEQ ID NO: 7, P-CUCme.1-1:1:1rc (SEQ ID NO: 155, P-CUCme.2-1:1:1 (SEQ ID NO: 14, EXP- CUCme.4:1:1 (SEQ ID NO: 156, EXP-CUCme.5:1:1 (SEQ ID NO: 159, P-CUCme.6-1:1:1 (SEQ ID NO: 18, P- CUCme.8-1:1:2 (SEQ ID NO: 19, P-CUCme.9-1:1:2 (SEQ ID NO: 20, P-CUCme.10-1:1:1 (SEQ ID NO: 21, EXP- CUCme.eEF1a:1:1 (SEQ ID NO: 162, P-CUCme.15-1:1:2 (SEQ ID NO: 23, P-CUCme.17-1:1:2 (SEQ ID NO: 26, P- CUCme.18-1:1:2 (SEQ ID NO: 27, P-CUCme.19-1:1:3 (SEQ ID NO: 167, P-CUCme.20-1:3 (SEQ ID NO: 211, P- CUCme.21-1:1:1 (SEQ ID NO: 30, EXP-CUCme.SAMS2:1:1 (SEQ ID NO: 168, P-CUCme.26-1:1:2 (SEQ ID NO: 33, EXP-CUCme.29:1:2 (SEQ ID NO: 212, P-CUCme.CumMe_WSM_SF25355.G5000-1:1:1 (SEQ ID NO: 196, P- CUCme.CumMe_WSM_SF17111.G5790-1:1:1 (SEQ ID NO: 177, P-CUCme.CumMe_WSM_SF22531.G5120-1:1:1 (SEQ ID NO: 192, P-CUCme.CumMe_WSM_SF18488.G5340-1:1:1 (SEQ ID NO: 181, P-

CUCme.CumMe_WSM_SF23760.G5200-1:1:1 (SEQ ID NO: 193, EXP-CUCme.WSM_SF19064.G5690:1:1 (SEQ ID NO: 185, P-CUCme.WSM_SF17252.G7330-1:1:1 (SEQ ID NO: 179, P-CUCme.CumMe_WSM_SF18634.G5190- 1:1:1 (SEQ ID NO: 183, P-CUCme.CumMe_WSM_SF19647.G5760-1:1:1 (SEQ ID NO: 188, P-

CUCme.CumMe_WSM_SF25936.G5450-1:1:1 (SEQ ID NO: 197, P-CUCme.CumMe_WSM_SF19839.G5090-1:1:1 (SEQ ID NO: 189, CumMe_WSM_SF206458.G5970 (SEQ ID NO: 98) y P-CUCme.CumMe_WSM_SF18716.G5860- 1:1:1 (SEQ ID NO: 184) demostraron de manera cuantitativa la capacidad de dirigir la expresión transgénica en algunos o todos los tejidos evaluados, dependiendo de la secuencia de EXP utilizada para dirigir la expresión.

El análisis histológico de secciones de tejido seleccionadas proporcionó pruebas de expresión adicionales para muchas de las secuencias EXP. EXP-CUCme.Ubq1:1:1 (SEQ ID NO: 1) y EXP-CUCme.Ubq1:1:3 (SEQ ID NO: 7) demostraron un patrón de expresión constitutiva observándose tinción en todos los tejidos, a pesar de que el análisis cuantitativo mostró niveles de expresión bastante bajos. Este tipo de patrón de expresión puede ser muy inesperado para dirigir la expresión de transgenes que requieren un bajo nivel de expresión constitutiva. La expresión dirigida por P-CUCme.1-1:1:1rc (SEQ ID NO: 155) demostró expresión en haces vasculares de hojas consumidoras y productoras y en el xilema y la corteza de la raíz, floema, xilema, endodermis, estela y ápice. La expresión dirigida por EXP-CUCme.4:1:1 (SEQ ID NO: 156) se observó en todos los tejidos, con los niveles de expresión más altos en la fase reproductora de la planta. La expresión dirigida por P-CUCme.10-1:1:1 (SEQ ID NO: 21) solo se observó en Hojas Consumidoras V5 y en anteras de Flores R1. La expresión dirigida por EXP-CUCme.eEF1a:1:1 (SEQ ID NO: 162) demostró un patrón de expresión constitutiva observándose niveles de expresión más altos en los cotiledones y los embriones de vaina de color amarillo. La actividad del embrión de vaina amarilla fue 5 veces mayor en la generación R1 que en la generación R0 (véase la Tabla 23 a continuación). La expresión dirigida por P-CUCme.15- 1:1:2 (SEQ ID NO: 23), P-CUCme.17-1:1:2 (SEQ ID NO: 26) y P-CUCme.18-1:1:2 (SEQ ID NO: 27) demostró desde el punto de vista histológico, un nivel de expresión constitutiva. La expresión dirigida por P-CUCme.19-1:1:3 (SEQ ID NO: 167) demostró un patrón de expresión constitutiva desde el punto de vista histológico con la excepción de la raíz V5 y pecíolo R1. La vaina R3 mostró el nivel de expresión más alto.

La expresión dirigida por P-CUCme.20-1:3 (SEQ ID NO: 211) demostró un patrón de expresión constitutiva desde el punto de vista histológico con la excepción de la expresión en raíces V5. La expresión fue más alta en el cotiledón del estadio R8. La expresión dirigida por EXP-cUcme.SAMS2:1:1 (SEQ ID NO: 168) demostró un patrón de expresión constitutiva observándose expresión desde el punto de vista histológico en todos los tejidos. Se observó que la expresión de GUS aumentaba en la generación R1 (véanse las Tablas 22 y 23 a continuación). Las flores y los pecíolos del estadio R1 demostraron los niveles de expresión más altos en la soja. La expresión dirigida por P- CuCme.CumMe_WSM_SF22531.G5120-1:1:1 (SEQ ID No: 192) demostró un patrón de expresión constitutiva desde el punto de vista histológico con niveles de expresión más altos en el cotiledón y el embrión del estadio R8. La expresión dirigida por P-CUCme.CumMe_WSM_SF18488.G5340-1:1:1 (SEQ ID NO: 181) demostraron un nivel de expresión constitutiva, mientras que se observó una expresión cuantitativamente alta en el embrión de la vaina de color amarillo.

A plantas de generación Ro, transformadas con las construcciones de plásmido que comprendían EXP- CUCme.eEF1a: 1: 1 (SEQ ID NO: 162) y EXP-CUCme.SAMS2:1:1 (SEQ ID NO: 168), se les permitió establecer la semilla y las plantas de generación R1 se analizaron para determinar la expresión de GUS. Las plantas de generación R1 se analizaron para determinar la expresión en Raíz Vn5, Hoja Consumidora Vn5, Hoja Productora Vn5, Hoja Productora R1, Peciolo R1 y Embrión de Vaina de color amarillo, Cotiledón de vaina de color amarillo, Semilla Inmadura R3 Vaina R3, Cotiledón R5 y Flor R1. Las tablas 22 y 23 muestran la expresión media de GUS medida en cada tejido de las plantas transformadas de generación R1

Tabla 22. Niveles medios de expresión de GUS en Raíz Vn5, Hoja Consumidora Vn5, Hoja Productora Vn5, Hoja Productora R1, Peciolo R1 de plantas de soja transformadas de generación R1

Construc ción

Elemento Regulador SEQ ID NO: Vn5_R aíz Vn5_Hoja_Consu midora Vn5_Hoja_Prod uctora R1_Hoja_Prod uctora R1_Peci olo

pMON140 827

EXP- CUCme.eE F1a:1:1 162 145,84 50,24 43,73 107,98 357,67

pMON140 836

EXP- CUCme.SA MS2:1:1 168 260,41 65,52 51,12 129,86 623,42

Construcción

Elemento regulador SEQ ID NO: Embrión_Vaina_Amarillo Cotiledón_Vaina_Amarillo SemillaJnmadura_R3 Vaina_R3 Cotiledón_R5 Flor_R1

pMON140827

EXP- CUCme.eEF1a:1: 1 162 1098,51 764,83 288,77 214,6 459,62 394,77

pMON140836

EXP- CUCme.SAMS2: 1:1 168 219,04 291,58 241,48 382,73 397,91 653,23

ai

4^

Claims (12)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   1. Una molécula de ADN que presenta la actividad promotora de SEQ ID NO: 29, que comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de:

   a) una secuencia con al menos 85 por ciento de identidad de secuencia con la longitud completa de SEQ ID NO:

   29;

   b) una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 29; y

   c) un fragmento que comprende al menos 250 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 29;

   en la que dicha molécula de ADN está unida operativamente a una molécula de polinucleótido transcribible heteróloga.
2. 2. La molécula de ADN de la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de polinucleótidos tiene al menos 90 por ciento de identidad de secuencia con la longitud completa de la secuencia de polinucleótidos como se expone en la SEC ID N°: 29, preferentemente tiene al menos 95 por ciento de identidad de secuencia con la longitud completa de la secuencia de polinucleótidos como se expone en la SEC ID N°: 29.
3. 3. La molécula de ADN de la reivindicación 1, en la que la molécula de polinucleótido transcribible heteróloga comprende un gen de interés agronómico.
4. 4. La molécula de ADN de la reivindicación 3, en la que el gen de interés agronómico confiere tolerancia a herbicidas en las plantas.
5. 5. La molécula de ADN de la reivindicación 4, en la que el gen de interés agronómico confiere resistencia a las plagas en las plantas.
6. 6. Una célula de planta transgénica que comprende una molécula de ADN heteróloga que muestra la actividad promotora de SEC ID N°: 29, que comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de:

   a) una secuencia con al menos 85 por ciento de identidad de secuencia con la longitud completa de SEQ ID NO:

   29;

   b) una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 29; y

   c) un fragmento que comprende al menos 250 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 29;

   en la que dicha molécula de ADN está unida operativamente a una molécula de polinucleótido transcribible heteróloga.
7. 7. La célula de planta transgénica de la reivindicación 6, en la que dicha célula de planta transgénica es una célula de planta monocotiledónea.
8. 8. La célula de planta transgénica de la reivindicación 6, en la que dicha célula de planta transgénica es una célula de planta dicotiledónea.
9. 9. Una planta transgénica, o parte de la misma, que comprende una molécula de ADN que presenta la actividad promotora de SEQ ID NO: 29, que comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de:

   a) una secuencia con al menos 85 por ciento de identidad de secuencia con la longitud completa de SEQ ID NO:

   29;

   b) una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 29; y

   c) un fragmento que comprende al menos 250 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 29;

   en la que dicha molécula de ADN está unida operativamente a una molécula de polinucleótido transcribible heteróloga.
10. 10. Una planta descendiente de la planta transgénica de la reivindicación 9, o parte de la misma, en la que la planta descendiente o parte de la misma comprende una molécula de ADN que presenta la actividad promotora de SEQ ID NO: 29, que comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de:

    a) una secuencia con al menos 85 por ciento de identidad de secuencia con la longitud completa de SEQ ID NO:

    29;

    b) una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 29; y

    c) un fragmento que comprende al menos 250 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 29; en la que dicha molécula de ADN está unida operativamente a una molécula de polinucleótido transcribible heteróloga.
11. 11. Una semilla transgénica que comprende una molécula de ADN que presenta la actividad promotora de SEQ ID NO: 29, que comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de:

    a) una secuencia con al menos 85 por ciento de identidad de secuencia con la longitud completa de SEQ ID NO:

    10

    15

    b) una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 29; y

    c) un fragmento que comprende al menos 250 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 29;

    en la que dicha molécula de ADN está unida operativamente a una molécula de polinucleótido transcribible heteróloga.
12. 12. Un procedimiento de expresión de una molécula de polinucleótido transcribible que comprende:

    a) obtener una planta transgénica que comprende una molécula de ADN que presenta la actividad promotora de SEQ ID NO: 29, que comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de:

    (1) una secuencia con al menos 85 por ciento de identidad de secuencia con la longitud completa de SEQ ID NO: 29;

    (2) una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 29; y

    (3) un fragmento que comprende al menos 250 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 29;

    en el que dicha molécula de ADN está unida operativamente a una molécula de polinucleótido transcribible heteróloga; y

    b) cultivar dicha planta transgénica, en la que se expresa el polinucleótido transcribible.