CN108883201A

CN108883201A - Rna指导的治疗hiv感染的方法和组合物

Info

Publication number: CN108883201A
Application number: CN201780007643.0A
Authority: CN
Inventors: K·哈利利; 托马斯·马尔科姆
Original assignee: Resection Biotherapy Co; Temple University of Commonwealth System of Higher Education
Current assignee: Resection Biotherapy Co; Temple University of Commonwealth System of Higher Education
Priority date: 2016-01-25
Filing date: 2017-01-24
Publication date: 2018-11-23
Also published as: US20190032057A1; EP3407918A4; RU2018130640A3; RU2018130640A; WO2017132112A1; JP2019506156A; AU2017211062A1; EP3407918A1; CA3011874A1

Abstract

一种通过如下方式使整合到被逆转录病毒潜伏感染的宿主细胞基因组中的前病毒DNA失活的方法：用包含规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)相关内切核酸酶和两种或更多种不同指导RNA(gRNA)的组合物处理所述宿主细胞，其中所述至少两种gRNA中的每一种与所述前病毒DNA中的长末端重复序列(LTR)中的不同靶核酸序列互补；和使所述前病毒DNA失活。一种用于使整合到被逆转录病毒潜伏感染的宿主细胞基因组中的前病毒DNA失活的组合物，所述组合物包含含有CRISPR相关内切核酸酶和指导RNA的分离的核酸序列，其中所述指导RNA与人免疫缺陷病毒中的靶序列互补。

Description

RNA指导的治疗HIV感染的方法和组合物

关于联邦政府资助研究的声明

本发明是在由国立卫生研究院授予的授权号R01MH093271、R01NS087971、和P30MH092177下在美国政府支持下完成的。美国政府在本发明中拥有某些权利。

技术领域

本发明涉及特异性切割逆转录病毒(例如人免疫缺陷病毒(HIV))中的靶序列的组合物。这样的组合物可以施用于患有HIV感染或有感染HIV感染风险的受试者，所述组合物可以包括编码规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)相关内切核酸酶的核酸和与人免疫缺陷病毒中的靶序列互补的指导RNA序列。

背景技术

自发现HIV-1以来的三十多年里，艾滋病仍然是一个主要的公共健康问题，影响全球超过3530万人。由于HIV-1永久整合到宿主基因组中，艾滋病仍然无法治愈。目前用于控制HIV-1感染和阻止AIDS发展的治疗(高效抗逆转录病毒疗法或HAART)极度减少了支持HIV-1感染的细胞中的病毒复制并将血浆病毒血症降低至最低水平。但是HAART不能抑制组织中的低水平病毒基因组表达和复制，并且不能靶向充当HIV-1的储库的潜伏感染的细胞，例如休眠记忆T细胞、脑巨噬细胞、小神经胶质细胞和星形胶质细胞、肠道相关的淋巴细胞。持续性HIV-1感染也与共病(包括心脏和肾脏疾病、骨质减少和神经障碍)有关。持续需要针对持续性病毒储库的有疗效的治疗策略。

发明内容

本文提供了涉及治疗和预防逆转录病毒感染的组合物和方法。逆转录病毒可以是慢病毒，例如人免疫缺陷病毒、猿猴免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒或牛免疫缺陷病毒。人免疫缺陷病毒可以是HIV-1或HIV-2。在一个实施例中，这些组合物包含含有编码CRISPR相关内切核酸酶的序列的核酸序列和一种或多种指导RNA，其中指导RNA与人免疫缺陷病毒中的靶序列互补。在一些实施例中，核酸包含在表达载体内。在一个实施例中，这些组合物包含CRISPR相关内切核酸酶多肽和一种或多种指导RNA，其中所述指导RNA与人免疫缺陷病毒中的靶序列互补。还提供了包含本文披露的核酸、表达载体或多肽的药物组合物。本文还提供了治疗患有人免疫缺陷病毒感染或具有患上人免疫缺陷病毒感染风险的受试者的方法，其中所述治疗方法包括向受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含编码CRISPR相关内切核酸酶的载体和一种或多种指导RNA，其中所述指导RNA与人免疫缺陷病毒中的靶序列互补。还提供了通过将细胞暴露于包含编码含有CRISPR相关内切核酸酶和一种或多种指导RNA的基因编辑复合物的分离的核酸的组合物使该人类细胞中的逆转录病毒失活的方法，其中所述指导RNA与逆转录病毒中的靶核酸序列互补。基因编辑复合物向前病毒DNA中引入一个或多个突变。在一些实施例中，这些突变可以包括缺失，所述缺失可以包含前病毒DNA序列中的全部或基本上全部。在另一方面，还提供了包含测量量的本文披露的组合物的试剂盒。

在以下的附图和说明中阐述本发明的一个或多个实施例的细节。本发明的其他特征、目的和优点会从说明书和附图以及权利要求书中显而易见。

附图说明

本专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。在请求并支付必要的费用后，官方将会提供带有一幅或多幅彩色附图的本专利或专利申请公开物的副本。

图1A、图1B、图1C、图1D、图1E、图1F、图1G和图1H显示Cas9/LTR-gRNA抑制被HIV-1潜伏感染的CHME5小神经胶质细胞中HIV-1报告病毒的产生。图1A显示EGFP流式细胞术的代表性门控图，显示通过稳定表达的Cas9加LTR-A或-B对比空U6驱动的gRNA表达载体(U6-CAG)的TSA诱导的潜在pNL4-3-ΔGag-d2EGFP报告病毒的再活化显著减少。图1B显示来自选定的表达LTR-A-或-B-的稳定的克隆的PCR产物(LTR内-453至+43)的SURVEYOR Cel-I核酸酶测定，显示显著的插入缺失突变模式(箭头)。图1C显示LTR A和B切割位点(图1D中的箭头和箭头)之间精确缺失190-bp区域的PCR片段分析，留下通过TA克隆和测序结果验证的306-bp片段(图1C中的箭头)。图1D分别按出现顺序披露了SEQ ID NO 1-3。图1E是显示LTR-A/B稳定的克隆的亚克隆的图，揭示了通过EGFP流式细胞术测定的报告子再活化的完全丧失，并且图1F显示通过标准品检测的pNL4-3-ΔGag-d2EGFP前病毒基因组的消除，以及图1G显示EGFP和HIV-1Rev应答元件(RRE)的基因组DNA的实时(1G)PCR扩增；β-肌动蛋白是DNA纯化和加载对照。图1H显示使用引物扩增覆盖HIV-1LTR U3/R/U5区(-411至+129)的DNA片段的LTR-A/B亚克隆(#8,13)的PCR基因分型，显示插入缺失(a，缺失；c，插入)和“完整”或组合的LTR(b)。

图2A、图2B和图2C显示Cas9/LTR-gRNA有效根除来自U1单核细胞的潜伏HIV-1病毒。图2A显示了一张图，该图显示染色体Xp11.4中HIV-1全基因组切除。使用Genome-Walkerlink PCR试剂盒鉴定HIV-1整合位点。左侧，使用靶向X染色体整合位点侧翼序列的引物对(P1/P2)对PCR扩增子长度进行分析显示消除了整个HIV-1基因组(9709bp)，留下两个片段(833bp和670bp)。图2B显示LTR片段(833bp)的TA克隆和测序，显示了宿主基因组序列(小写字母，226bp)和5'-LTR(用破折号强调)和3'-LTR(第一个下划线部分)的部分序列(634-27＝607bp)，在LTR-A靶向位点周围有27bp的缺失(第二个下划线部分)。在底部，从15个测序的克隆扩增子中鉴定出两个缺失突变等位基因。在通过在LTR-A和B靶位点处的同时切割的190bp切除后，670bp片段由宿主序列(226bp)和剩余的LTR序列(634-190＝444bp)组成。加下划线和突出显示的序列表示gRNA LTR-A靶位点和PAM。图2B分别按出现顺序披露了SEQID NO 4-13。图2C显示LTR-A/B诱导的HIV-1基因组根除的功能分析，显示TSA/PMA再活化诱导的p24病毒体释放的实质性阻断。用pX260-LTRs-A、-B或-A/B转染U1细胞。在2周的嘌呤霉素选择后，在进行p24Gag ELISA之前用TSA(250nM)/PMA处理细胞2天。

图3A、图3B和图3C显示Cas9加LTR-A/B的稳定表达接种TZM-bI细胞以抵抗新的HIV-1病毒感染。图3A显示使用抗Flag抗体的免疫组织化学(ICC)和蛋白质印迹(WB)分析确认在TZM-bI稳定的克隆嘌呤霉素(2μg/ml)中选择2周的Flag-Cas9的表达。图3B显示Cas9/LTR-A/B稳定的克隆(c1-c7)的PCR基因分型，揭示了LTR切除与LTR萤光素酶报告子活化的抑制密切相关。倍数变化表示TSA/PMA诱导的水平超过相应的非诱导水平。图3C显示用假型pNL4-3-Nef-EGFP慢病毒以指定的感染复数(MOI)感染Cas9/LTR-A/B表达细胞(c4)，并在感染后2d，通过EGFP流式细胞术测量感染效率。图3D显示的相位对比/荧光显微照片显示LTR-A/B稳定，但不是对照(U6-CAG；黑色)细胞，对pNL4-3-ΔE-EGFP HIV-1报告病毒(灰色)引起的新型感染具有抗性。

图4A、图4B、图4C和图4D说明了Cas9/LTR-A/B对人类基因组的脱靶效应。图4A是SURVEYOR测定，其在人TZM-bI和U1细胞的经预测/潜在脱靶区域中未显示插入缺失突变。使用LTR-A的中靶区域(A)作为阳性对照并使用空U6-CAG载体(U6)作为阴性对照。图4B显示LTR-A/B稳定的TZM-bI亚克隆的全基因组测序，显示了U6-CAG对照和LTR-A/B样品中所谓的插入缺失的数目，图4C显示了两个样品中gRNA靶位点附近10个调用的插入缺失的详细信息，并且图4D显示了称为插入缺失的脱靶的分布。图4C按出现顺序分别披露了SEQ ID NO14和15。

图5显示了通过对来自人TZM-bI细胞的基因组DNA的PCR产物(-411至-10)进行TA克隆和测序鉴定的整合的慢病毒LTR-萤火虫萤光素酶报告子的LTR U3序列。突出显示4种gRNA(LTR-A至D)的原型间隔子和PAM(NGG)序列和所示转录因子的预测结合位点。精确的切割位点用剪刀标记。+1表示转录起始位点。图5披露了SEQ ID NO:16。

图6A、图6B和图6C显示LTR-C和LTR-D显著抑制TSA诱导的CHME5小神经胶质细胞中潜在的pNL4-3-ΔGag-d2EGFP病毒的再活化。图6A是示意性显示含有Tat、Rev、Env、Vpu和Nef以及报告基因d2EGFP的pNL4-3-ΔGag-d2EGFP载体的图。图6B显示SURVEYOR测定，其显示Cas9/LTR-D而非Cas9/LTR-C转染细胞中的中靶LTR基因组中的插入缺失突变。图6C显示EGFP流式细胞术的代表性门控图，显示与空U6驱动的gRNA表达载体(U6-CAG)相比，通过稳定表达Cas9/LTR-C或LTR-D的TSA诱导的潜在pNL4-3-ΔGag-d2EGFP报告病毒的再活化显著减少。

图7A、图7B、图7C、图7D、图7E和图7F显示稳定合并HIV-1LTR萤火虫萤光素酶报告基因的TZM-bI细胞中LTR-C和LTR-D两者均诱导插入缺失突变并显著降低组成型和TSA/PMA诱导的萤光素酶活性。图7A显示了功能性萤光素酶报告子测定，揭示了通过LTR-C、LTR-D或两者的LTR再活化的显著减少。图7B显示SURVEYOR测定，其显示了由LTR-C和LTR-D(上面的箭头)诱导的LTR DNA中的插入缺失突变(-453至+43)。LTR-C和LTR-D的组合产生由LTR-C和LTR-D之间的302bp区域缺失产生的194bp片段(下面的箭头)。图7C和图7D显示30个克隆的Sanger测序，验证了LTR-C的23％和LTR-D的13％的插入缺失效率；以及显示插入/缺失的实例色谱图。图7C按出现顺序分别披露了SEQ ID NO 17-25。图7D按出现顺序分别披露了SEQID NO 26-30。图7E显示使用BsaJ I切割PCR产物的5个位点(96、102、372、386、482)的PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)分析，所述PCR产物覆盖LTR的-453至+43，其显示U6-CAG对照样品中两条主要条带(96bp和270bp)，而不显示在96/102位点处LTR-C诱导的插入缺失突变后的另外的372bp条带(上面的箭头)、在372位点处LTR-D诱导的突变后的290bp条带(中间的箭头)和在LTR-C/D诱导的切除后的180bp片段(下面的箭头)。图7F显示色谱图，其显示LTR-C和LTR-D之间302bp片段的缺失(上图)和另外的17bp缺失(下图)。红色箭头指示接合位点。与U6-CAG对照相比，*P<0.05指示LTR-C或LTR-D介导的萤光素酶活化显著降低。图7F按出现顺序分别披露了SEQ ID NO 31和32。

图8A、图8B和图8C说明使用覆盖HIV-1LTR U3/R/U5区(-411到+129)的引物对来自LTR-A/B的CHME5亚克隆和空U6-CAG对照的PCR产物进行TA克隆和Sanger测序。图8A显示了LTR-A和LTR-B切割在产生潜在片段a-c的5'和3'LTR二者上的可能组合，如所示。图8B显示了在LTR-A和LTR-B切割位点之间显示190bp缺失的片段a(351bp)的blasting。图8C显示片段c(682bp)的blast，其显示了在LTR-A切割位点处175bp插入和LTR-B切割位点处27bp缺失。图8C按出现顺序分别披露了SEQ ID NO 33和34。

图9A、图9B、图9C和图9D显示Cas9/LTR-gRNA有效消除来自U1单核细胞的潜伏HIV-1病毒。图9A显示了使用靶向染色体2整合位点侧翼序列(小写字母，467-bp)的引物对(T492/T493)对来自长片段PCR的1.1kb片段进行的Sanger测序，其揭示了整个HIV-1基因组(9709-bp)的消除，留下组合的5'-LTR(用破折号加划线表示)和3'-LTR，其中具有精确位于来自PAM(TGG)LTR-A靶向位点(加下划线表示)的第三核苷酸处的6-bp插入(加框表示)和4-bp缺失(nnnn)。图9A披露了SEQ ID NO:35。图9B是显示HIV-1基因组的特定消除的代表性DNA凝胶图。NS，非特异性带。图9C和图9D是显示使用靶向Gag基因的引物对(T457/T458)的定量PCR分析的图，其显示在表达Cas9/LTR-A/B的U1细胞中整个HIV-1基因组消除效率为85％。将U1细胞用pX260空载体(U6-CAG)或编码LTR-A/B的载体转染。2周的嘌呤霉素选择后，使用掺入的pNL4-3-ΔE-EGFP人基因组DNA作为标准，将细胞基因组DNA用于绝对定量qPCR分析。与U6-CAG对照相比，**P<0.01指示显著降低。

图10A、图10B和图10C显示Cas9/LTR gRNA在J-Lat潜伏感染的T细胞中有效消除HIV-1前病毒。图10A显示通过EGFP流式细胞术进行的功能分析揭示了PMA和TNFα诱导的EGFP报告病毒再活化减少约50％。图10B是在Cas9/LTR-A/B转染的细胞的中靶LTR基因组中显示插入缺失突变(箭头)的SURVEYOR测定。将J-Lat细胞用pX260空载体或LTR-A和-B转染。2周的嘌呤霉素选择后，将细胞用PMA或TNFα处理24h。使用覆盖HIV-1LTRU3/R/U5区(-411至+129)的引物对使基因组DNA进行PCR并进行SURVEYOR测定。与U6-CAG对照相比，**P<0.01指示显著降低。(10C)图10C显示使用覆盖HIV-1LTR(-374至+43)的引物进行的PCR片段分析，其显示了LTR A和B切割位点之间的190-bp区域的精确缺失，留下227-bp片段(箭头)。管家基因β-肌动蛋白用作DNA纯化和加载对照。

图11A、图11B、图11C和图11D显示基因组编辑效率取决于Cas9和gRNA的存在。显示PCR基因分型的图11A揭示不存在U6驱动的LTR-A或LTR-B表达盒，以及图11B显示在嘌呤霉素选择的TZM-bI亚克隆中不存在/减少CMV驱动的Cas9DNA，没有任何基因组编辑的指示。使用覆盖U6启动子(T351)和LTR-A(T354)或-B(T356)并靶向Cas9(T477/T491)的引物对，将来自所示亚克隆的基因组DNA进行常规(图11A)或实时(图11B)PCR分析。图11C和图11D显示无效TZM-bI亚克隆中不存在Cas9蛋白表达。图11C显示通过具有抗Flag单克隆抗体的蛋白质印迹(WB)和免疫细胞化学(ICC)检测有Flag标签的Cas9融合蛋白。使用稳定表达Flag-Cas9的HEK293T细胞系作为WB的阳性对照。GAPDH用作蛋白质加载对照。克隆c6含有Cas9DNA但不含Cas9蛋白表达，提示嘌呤霉素选择后表观遗传抑制的潜在机制。克隆c5和c3可以表示截短的Flag-Cas9(tCas9)。图11D显示核用赫斯特(Hoechst)33258染色。

图12A、图12B、图12C和图12D证明在TZM-bI细胞中的Cas9/LTR-A/BgRNA的稳定表达针对假型或天然HIV-1病毒预防接种。图12显示，流式细胞术显示表达Cas9/LTR-A/B的TZM-bI亚克隆中天然pNL4-3-ΔE-EGFP报告病毒感染效率的显著降低。实时PCR分析揭示了通过Cas9/LTR-A/B gRNA，如图12B所示的病毒RNA和如图12C所示的DNA的抑制或消除。图12D显示，萤火虫荧光素酶发光测定显示Cas9/LTR-A/B gRNA显著抑制病毒感染刺激的LTR启动子活性。用指示的天然HIV-1病毒感染稳定的表达Cas9/LTR-A/B gRNA的TZM-bI细胞2小时，并用PBS洗涤两次。在感染后2天，收集细胞、固定并通过流式细胞术分析EGFP表达(在图12A中)，或进行裂解用于总RNA提取和RT-qPCR(在图12B中)，进行基因组DNA纯化用于qPCR(在图12C中)和发光测量(在图12D中)。与U6-CAG对照相比，*P<0.05和**P<0.01指示显著降低。

图13显示预测的LTR gRNA及其脱靶数(100％匹配)。使用Jack Lin的CRISPR/Cas9gRNA发现工具(http://spot.colorado.edu/～slin/cas9.html)，利用pHR'-CMV-LacZ慢病毒载体(AF105229)的5'-LTR正义和反义序列(分别为SEQ ID NO 79-111和112-141)(634bp)来搜索含有20-bp指导序列(原型间隔子)加上原型间隔子邻近基序序列(NGG)的Cas9/gRNA靶位点。针对可获得的人类基因组和转录物序列对每个gRNA加上NGG(AGG、TGG、GGG、CGG)进行blast，显示出1000个比对的序列。按Control+F后，复制/粘贴靶序列(1-23至9-23个核苷酸)，并找到具有100％匹配的基因组靶标数。由于重复的基因组文库，将每次搜索的脱靶数除以3。显示的数字指示总共4次搜索(NGG)。顶部数字(例如，对于gRNA序列(正义)：20、19、19、17、16、15、14、13、12)指示离NGG最远的gRNA靶序列。选定的LTR-A/B和LTR-C/D的序列号和脱靶数分别以红色和绿色突出显示。

图14描述了用于PCR和测序的gRNA靶向位点和引物(按出现顺序，分别为SEQ IDNO:36-78)的寡核苷酸。

图15显示了LTR-A和LTR-B的预测的gRNA靶向位点的位置，并且按出现顺序，分别披露“查询Seq”序列为SEQ ID NO 142-252，以及“ref Seq”序列为SEQ ID NO 253-363。

图16A、图16B、图16C、图16D、图16E、图16F、图16G和图16H显示LTR-C和LTR-D均降低了稳定合并HIV-1LTR萤火虫萤光素酶报告基因的TZMBI细胞中组成型和TSA/PMA诱导的萤光素酶活性和组合诱导的精确的基因组切除。图16A显示针对HIV-LTR的启动子区设计6个gRNA靶标。图16A披露了SEQ ID NO:16。通过lipofectamine 2000将TZMBI细胞与Cas9-EGFP和嵌合体gRNA表达盒(PCR产物)共转染。图16B是图，其显示在3天后，通过FACS分选EGFP阳性细胞并收集2000个细胞/组用于荧光素酶测定。图16B披露了SEQ ID：31。图16C是图，其显示在萤光素酶测定之前将群体分选的细胞培养2天并用TSA/PMA处理1天。将单细胞分选到96孔板中，并在TSA/PMA不存在(在图16D的图中显示)(1d)或TSA/PMA存在(在图1E的图中显示)(1d)情况下，进行培养直至融合用于荧光素酶测定。图16F和图16G显示将来自群体分选细胞的PCR产物用Surveyor Cel-I核酸酶测定并且BsajI(图16G)的限制性片段长度多态性显示突变(图16F)或未切割(图16G)条带(红色箭头)。将如预测的(图16A，红色箭头)由LTR-C和LTR-D之间的321bp区域的缺失产生的200bp片段(图16F，图16G，黑色箭头)通过显示精确的基因组切除(图16H)的TA克隆和测序验证。来自单独的LTR-C和-D的PCR产物的Sanger测序分别鉴定％和％插入缺失突变效率。*p<0.05指示与相应的U6-CAG对照相比，使用学生t检验的统计学显著降低。原型间隔子(E)、原型间隔子(C)、原型间隔子(A)、原型间隔子(B)、原型间隔子(D)和原型间隔子(F)分别对应于SEQ ID NO 365、367、369、371、373和375(按出现顺序)。

图17A、图17B、图17C、图17D、图17E、图17F、图17G和图17H显示，Cas9/LTR-gRNA抑制HIV-1潜伏感染的CHME5小神经胶质细胞系中通过EGFP流式细胞术测量的HIV-1病毒的组成型和诱导型产生。将含有Tat、Rev、Env、Vpu和Nef以及报告的基因d2EGFP的pHR'慢病毒载体转导入人胎儿小神经胶质细胞细胞系CHME5中，并且示出了3'-LTR的U3区域中的400bp缺失(示于图17A)。图17B是显示Cas9/gRNA的瞬时转染的图；由于LTR启动子活性的抑制，单独的或组合的人HIV-1LTR-A和-B降低了EGFP的强度但不降低其百分比。图17C是显示Cas9/gRNA的瞬时转染的图；由于LTR启动子活性的抑制，单独的或组合的人HIV-1LTR-C和-D降低了EGFP的强度但不降低其百分比。图17D和图18是显示在抗生素选择1-2周后，EGFP细胞百分比也降低的图。图17F和图17G显示用Surveyor Cel-I核酸酶测定分析来自稳定选择的克隆的PCR产物，所述测定在LTR-A和LTR-B中显著显示出插入缺失突变，但在LTR-A/B的组合(红色箭头)中显示弱的突变。将如预测的(图17H，红色箭头)由LTR-A和LTR-B之间的190bp区域的缺失产生的331bp片段(示于图17F和图17G，黑色箭头)通过显示精确的基因组切除(图17H)的TA克隆和测序验证。图17H按出现顺序分别披露了SEQ ID NO 1-3。

图18显示了代表性HIV-1序列(SEQ ID NO:376)的LTR。U3区从核苷酸1延伸至核苷酸432(SEQ ID NO:377)，R区从核苷酸432延伸至核苷酸559(SEQ ID NO:378)，并且U5区从560延伸至核苷酸634(SEQ ID NO:379)。

图19显示了代表性SIV序列(SEQ ID NO:380)的LTR。U3区从核苷酸1延伸至核苷酸517(SEQ ID NO:381)，R区从核苷酸518延伸至核苷酸693(SEQ ID NO:382)，并且U5区从694延伸至核苷酸818(SEQ ID NO:383)。

具体实施方式

本发明部分基于我们的发现，即我们可以通过使用RNA指导的规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)-Cas 9核酸酶系统(Cas9/gRNA)以单一和多重配置从HIV-1感染的细胞中消除整合的HIV-1基因组。我们鉴定了被Cas9/gRNA有效编辑的HIV-1LTR U3区域内的高度特异性靶标，所述靶标在潜伏感染的小神经胶质细胞、前单核细胞和T细胞中使病毒基因表达和复制失活。Cas9/gRNA对宿主细胞既不造成基因毒性也不造成脱靶编辑，并且完全切除跨越5'-至3'-LTR的整合前病毒DNA的9709bp片段。此外，表达的Cas9的细胞内多重gRNA的存在预防HIV-1感染。我们的结果表明，Cas9/gRNA可以被工程化以提供针对艾滋病的特异性的、有效的、预防的和治疗性方法。

因此，本发明的特征在于包含编码CRISPR相关内切核酸酶的核酸和与逆转录病毒，例如HIV中的靶序列互补的指导RNA的组合物，以及包含编码CRISPR相关内切核酸酶的核酸和与HIV中的靶序列互补的指导RNA的药物配制品。特征还在于包含CRISPR相关内切核酸酶多肽和与HIV中的靶序列互补的指导RNA的组合物，以及包含CRISPR相关内切核酸酶多肽和与HIV中的靶序列互补的指导RNA的药物配制品。

特征还在于施用组合物以治疗逆转录病毒感染例如HIV感染的方法，消除病毒复制的方法，以及预防HIV感染的方法。本文所述的治疗方法可以与其他抗逆转录病毒治疗(例如HAART)联合进行。

HIV感染的临床过程可以根据多种因素而变化，包括受试者的遗传背景、年龄、一般健康状况、营养状况、接受的治疗和HIV亚型。一般来说，大多数个体在感染的数周或数月内会出现流感样症状。这些症状包括发热、头痛、肌肉酸痛、皮疹、发冷、喉咙痛、口腔或生殖器溃疡、淋巴腺肿胀、关节痛、盗汗和腹泻。取决于个体，这些症状的强度可以从轻微到严重不等。在急性期，HIV病毒颗粒被吸引并进入表达合适的CD4受体分子的细胞。一旦病毒进入宿主细胞，HIV编码的逆转录酶就会产生HIV RNA的前病毒DNA拷贝，并且该前病毒DNA会整合到宿主细胞基因组DNA中。正是这种HIV前病毒被宿主细胞复制，导致新的HIV病毒体释放，然后可以感染其他细胞。本发明的方法和组合物广泛和多方面地用于切除整合的HIV前病毒DNA，尽管本发明不限于此，并且这些组合物可以在感染的任何阶段施用于受试者或施用于处于HIV感染风险中的未被感染的受试者。

主要的HIV感染会在数周到数月内消退，并且通常会伴随一个长达10年的临床“潜伏期”。潜伏期也被称为无症状HIV感染或慢性HIV感染。受试者的CD4淋巴细胞数量反弹，但不是反弹至感染前水平，并且大多数受试者进行血清转化，即在感染的2至4周内其血液中具有可检测水平的抗HIV抗体。在该潜伏期期间，在外周血单核细胞中不存在可检测的病毒复制，并且在外周血中几乎不存在可培养的病毒。在潜伏期(也称为临床潜伏期)期间，感染HIV的人可能不经历HIV相关症状，或只经历轻微症状。但是，HIV病毒继续以非常低的水平繁殖。在用抗逆转录病毒疗法进行治疗的受试者中，该潜伏期可能延续数十年或更长时间。然而，即使接受抗逆转录病毒治疗，此阶段的受试者仍能够将HIV传播给其他人，尽管抗逆转录病毒疗法可降低传播风险。如上所述，抗逆转录病毒疗法不抑制低水平的病毒基因组表达，也不有效靶向潜伏感染的细胞，如休眠记忆T细胞、脑巨噬细胞、小神经胶质细胞、星形胶质细胞和肠相关淋巴样细胞。

AIDS(获得性免疫缺陷综合征)的临床体征和症状表现为CD4淋巴细胞数量减少，导致对免疫系统产生不可逆转的损害。许多患者也出现艾滋病相关并发症，包括，例如，机会性感染，如肺结核、沙门氏菌病、巨细胞病毒、念珠菌症、隐球菌脑膜炎、弓形体病和隐孢子虫病，以及某些种类的癌症，包括例如，卡波西肉瘤和淋巴瘤，以及消瘦综合征，神经系统并发症，和HIV相关肾病。

组合物

本发明的组合物包括编码CRISPR相关内切核酸酶(例如Cas9)的核酸和与逆转录病毒(例如HIV)中的靶序列互补的指导RNA。在细菌中，CRISPR/Cas基因座编码针对移动遗传元件(病毒、转座元件和接合质粒)的RNA指导的适应性免疫系统。已经鉴定了三种类型(I-III)的CRISPR系统。CRISPR簇包含间隔子，即与先前的移动元件互补的序列。CRISPR簇被转录并加工成成熟的CRISPR(成簇规则间隔短回文重复序列)RNA(crRNA)。CRISPR相关内切核酸酶Cas9属于II型CRISPR/Cas系统，并具有强的切割靶DNA的内切核酸酶活性。Cas9由成熟的crRNA(其包含约20个碱基对(bp)的独特靶序列(称为间隔子))和反式激活的小RNA(tracrRNA)(其可用作前crRNA的核糖核酸酶III辅助的加工的指导)指导。crRNA:tracrRNA双链体通过crRNA上的间隔子和靶DNA上的互补序列(称为原型间隔子)之间的互补碱基配对，指导Cas9靶向DNA。Cas9识别三核苷酸(NGG)原型间隔子相邻基序(PAM)以指定切割位点(来自PAM的第3核苷酸)。crRNA和tracrRNA可以单独表达或通过合成的茎环(AGAAAU)工程化到人工融合小指导RNA(sgRNA)中以模拟天然crRNA/tracrRNA双链体。这种sgRNA，如shRNA，可被合成或体外转录用于直接RNA转染或者从U6或H1促进的RNA表达载体表达，尽管人工sgRNA的切割效率低于具有单独表达的crRNA和tracrRNA的系统的切割效率。

本发明的组合物可以包括编码CRISPR相关内切核酸酶的核酸。在一些实施例中，CRISPR相关内切核酸酶可以是Cas9核酸酶。Cas9核酸酶可以具有与野生型酿脓链球菌(Streptococcus pyrogenes)序列相同的核苷酸序列。在一些实施例中，CRISPR相关内切核酸酶可以是来自其他物种的序列，例如其他链球菌属(Streptococcus)物种，例如嗜热链球菌；铜绿假单胞菌(Psuedomona aeruginosa)，大肠杆菌(Escherichia coli)，或其他经测序的细菌基因组和古细菌，或其他原核微生物。可替代地，可以修饰野生型酿脓链球菌Cas9序列。可以对核酸序列进行密码子优化以在哺乳动物细胞中有效表达，即“人源化”。人源化Cas9核酸酶序列可以是例如由基因库登录号KM099231.1GI:669193757；KM099232.1GI:669193761；或KM099233.1GI:669193765中列出的表达载体中的任何一种编码的Cas9核酸酶序列。可替代地，Cas9核酸酶序列可以是例如包含在可商购载体(例如来自Addgene公司(坎布里奇(Cambridge)，马萨诸塞州)的PX330或PX260)内的序列。在一些实施例中，Cas9内切核酸酶可以具有作为基因库登录号KM099231.1GI:669193757；KM099232.1GI:669193761；或KM099233.1GI:669193765的Cas9内切核酸酶序列中任一项的变体或片段的氨基酸序列，或者PX330或PX260(Addgene公司，坎布里奇(Cambridge)，马萨诸塞州)的Cas9氨基酸序列。可以修饰Cas9核苷酸序列以编码Cas9的生物活性变体，并且这些变体可以具有或可以包含例如由于含有一个或多个突变(例如，添加、缺失或取代突变、或这些突变的组合)而不同于野生型Cas9的氨基酸序列。这些取代突变中的一个或多个可以是取代(例如，保守的氨基酸取代)。例如，Cas9多肽的生物活性变体可以具有与野生型Cas9多肽具有至少或约50％序列同一性(例如，至少或约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。保守性氨基酸取代典型地包括在下组内的取代：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸、组氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。Cas9氨基酸序列中的氨基酸残基可以是非天然存在的氨基酸残基。天然存在的氨基酸残基包括由遗传密码天然编码的氨基酸残基以及非标准氨基酸(例如具有D-构型而不是L-构型的氨基酸)。本发明的肽还可以包括氨基酸残基，其是标准残基的修饰版本(例如吡咯赖氨酸可以用来代替赖氨酸，以及硒代半胱氨酸可以用来代替半胱氨酸)。非天然存在的氨基酸残基是那些在自然界中未被发现，但符合氨基酸的基本化学式并可以掺入肽中的氨基酸残基。这些包括D-别异亮氨酸(2R,3S)-2-氨基-3-甲基戊酸和L-环戊基甘氨酸(S)-2-氨基-2-环戊基乙酸。对于其他实例，可以查阅教科书或浏览万维网(该网站目前由加利福尼亚理工学院维护并显示已经成功掺入功能性蛋白质中的非天然氨基酸的结构)。

Cas9核酸酶序列可以是突变序列。例如，Cas9核酸酶可以在保守的HNH和RuvC结构域中突变，所述结构域参与链特异性切割。例如，RuvC催化结构域中的天冬氨酸-丙氨酸(D10A)突变允许Cas9切口酶突变体(Cas9n)使DNA产生缺口而不是切割DNA，以产生单链断裂，并且随后通过HDR进行的优先修复可以潜在地减少不希望的来自脱靶双链断裂的indel突变的频率。

除了先前描述的野生型和变体Cas9内切核酸酶之外，本发明还涵盖CRISPR系统，该系统包括“增强的特异性”酿脓链球菌Cas9变体(eSpCas9)，其显著减少脱靶切割。将这些变体用丙氨酸取代来工程化以中和与DNA的非靶链相互作用的沟中的带正电荷的位点。该修饰减少了Cas9与非靶链的相互作用，从而促进了靶链与非靶链之间的重新杂交。此修饰的效果是切割需要gRNA与靶DNA链之间更严格的沃森-克里克配对，这限制了脱靶切割(Slaymaker等人，2015)。

本发明还包括根据Joung及其同事公开的原理设计的另一种类型的增强的特异性Cas9变体，“高保真”spCas9变体(HF-Cas9)(Kleinstiver等人，2016,以其全文结合在此)。HF-Cas9变体中的一些由Kleinstiver等人(2009)披露。本发明代表这些变体的首次利用，用于失活病毒DNA和消除病毒感染。本发明还包括先前未披露的HF-Cas9变体。

Cas9与靶DNA之间的gRNA介导的复合物涉及Cas9与靶DNA之间的许多接触，包括氢键和疏水性碱基堆积。本发明的HF-Cas9变体产生于这样的概念，即这些接触具有比稳定用于Cas9切割DNA的复合物所需的能量更多的能量。即使错配部分地中断gRNA与其靶序列的结合，这也允许形成稳定的复合物。HF-Cas9变体包括破坏Cas9与靶DNA之间的一些接触的氨基酸取代。破坏将接触能量降低如下点，在该点时，稳定的复合物将仅由gRNA与其靶序列之间的完美匹配或接近完美匹配而产生。

Kleinstiver等人披露的HF-Cas9变体之一包括四个丙氨酸取代，N497A、R661A、Q695A和Q926A。这些取代均减少了残基与碱基之间的氢键合，N497A也影响了通过肽骨架的氢键合。发现该变体具有与野生型Cas9相当的中靶切割活性，但在具有培养的人骨肉瘤细胞的实验中在故意错配的位点显著减少了脱靶切割。该变体作为变体1(SpCas9N497A，R661A，Q695A，Q926A)包括在本发明的表1中。测试了另外三种变体。它们均包括前面提到的四种取代，即spCas9-HF-1的N497A、R661A、Q695A和Q926A，并且另外还包括第五种取代，即D1135E、L169A或Y450A。另外的取代是参与碱基对堆积的所有氨基酸。这些变体显示与野生型Cas9相当的中靶活性，其中脱靶切割降低至如下水平，该水平甚至低于变体1中所观察到的水平。本发明在抗病毒CRISPR/Cas系统的上下文中包括这些变体。在表1中，将它们命名为变体2(SpCas9N497A、R661A、Q695A、Q926A、D1135E)、变体3(SpCas9N497A、R661A、Q695A、Q926A、L169A)和变体4(SpCas9N497A、R661A、Q695A、Q926A、Y450A)。

Kleinstiver等人还披露了仅包含变体1的取代中的三种，即R661A、Q695A和Q926A的变体。该变体产生与野生型Cas9中所见的相当的中靶切割，但未针对脱靶效应进行测试。因为预计会减少脱靶效应，所以该3-取代变体作为表1中的变体13(SpCas9R661A、Q695A、Q926A)包括在本发明中。

本发明还包括未被Kleinstiver等人披露的Cas9变体。预计这些变体均具有与野生型Cas9相当的中靶活性，同时相对于野生型Cas9具有降低的脱靶活性。

以前未披露的变体中的三种，14、15和16，代表对变体13添加第四种取代。变体14包括D113E取代，并被命名为SpCas9R661A、Q695A、Q926A、D1135E。变体15包括L169A取代，并被命名为SpCas9R661A、Q695A、Q926A、L169A。L169A突变影响疏水性碱基对堆积。变体16包括Y450A取代，并被命名为SpCas9R661A、Q695A、Q926A、Y450A。Y540A取代影响疏水性碱基对堆积。

这些变体中的两种，5和17，代表将取代M495A分别添加到变体1和13中。因此，变体5被命名为SpCas9N497A、R661A、Q695A、Q926A、M495A，并且变体17被命名为SpCas9R661A、Q695A、Q926A、M495A。M495A取代影响残基与碱基之间的氢键合和通过肽骨架的氢键合。

这些变体中的两种，6和18，代表将取代M695A分别添加到变体1和13中。因此，变体6被命名为SpCas9N497A、R661A、Q695A、Q926A、M695A，并且变体18被命名为SpCas9R661A、Q695A、Q926A、M694A。M694A取代影响疏水性碱基对堆积。

这些变体中的两种，7和19，代表将取代H698A分别添加到变体1和13中。因此，变体7被命名为SpCas9N497A、R661A、Q695A、Q926A、H698A，并且变体19被命名为SpCas9R661A、Q695A、Q926A、H698A。H698A取代影响疏水性碱基对堆积。

这些变体中的五个，8-12，代表对五取代的变体2添加第六种取代。添加的取代分别是L169A、Y450A、M495A、M694A和M698A。因此，变体8被命名为SpCas9N497A、R661A、Q695A、Q926A、D1135E、L169A；变体9被命名为SpCas9N497A、R661A、Q695A、Q926A、D1135E、Y450A；变体10被命名为SpCas9N497A、R661A、Q695A、Q926A、D1135E、Y495A；变体11被命名为SpCas9N497A、R661A、Q695A、Q926A、D1135E、M694A；以及变体12被命名为SpCas9N497A、R661A、Q695A、Q926A、D1135E、M698A。

这些变体中的四个，20-23，代表对四取代的变体13添加第五种取代。添加的取代分别是L169A、Y450A、M495A和M694A。因此，变体20被命名为SpCas9R661A、Q695A、Q926A、D1135E、L169A；变体21被命名为SpCas9R661A、Q695A、Q926A、D1135E、Y450A；变体22被命名为SpCas9R661A、Q695A、Q926A、D1135E、M495A；以及变体23被命名为SpCas9R661A、Q695A、Q926A、D1135E、M694A。

表1

超出靶上eGFP中断测定测试(Kleinstiver等人，2009).

应该理解，表1中披露的变体本身可以含有另外的氨基酸取代和其他突变以进一步改变它们的功能。例如，可将Cas9序列突变成起“切口酶”作用，该酶使DNA产生缺口而不切割DNA，以产生单链断裂。在Cas9中，切口酶活性通过保守的HNH和RuvC结构域中的突变来实现，所述结构域参与链特异性切割。例如，RuvC催化结构域中的天冬氨酸盐至丙氨酸(D10A)突变允许Cas9切口酶突变体(Cas9n)使DNA产生缺口而不切割DNA产生单链断裂(Sander和Joung，2014)。任何或全部HF-Cas9的核酸序列可以被密码子优化用于在哺乳动物细胞中有效表达，即“人源化”。

在一些实施例中，本发明的组合物可以包括由上述任何核酸序列编码的CRISPR相关内切核酸酶多肽。术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，但通常它们是指不同大小的肽序列。我们可以将本发明的基于氨基酸的组合物称为“多肽”以表达它们是氨基酸残基的线性聚合物，并且有助于将它们与全长蛋白质区分开来。本发明的多肽可以“构成”或“包括”CRISPR相关内切核酸酶的片段，并且本发明包括构成或包括CRISPR相关内切核酸酶的生物活性变体的多肽。应该理解的是，多肽因此可以仅包括CRISPR相关内切核酸酶(或其生物活性变体)的片段，但也可以包括另外的残基。生物活性变体将保留足够的活性来切割靶DNA。

氨基酸残基之间的键可以是常规的肽键或另一种共价键(例如酯键或醚键)，并且可以通过酰胺化、磷酸化或糖基化对多肽进行修饰。修饰可以影响多肽骨架和/或一个或多个侧链。化学修饰可以是在翻译编码多肽的mRNA(例如细菌宿主中的糖基化)或体外制备的合成修饰之后在体内进行的天然存在的修饰。CRISPR相关内切核酸酶的生物活性变体可以包括由天然存在的(即，体内天然制备的)和合成修饰(即体外制备的天然存在的或非天然存在的修饰)的任何组合产生的一种或多种结构修饰。修饰的实例包括但不限于酰胺化(例如，C-末端处的游离羧基基团被氨基基团代替)；生物素化(例如用生物素分子酰化赖氨酸或其他反应性氨基酸残基)；糖基化(例如，向天冬酰胺、羟赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基中添加糖基基团以产生糖蛋白或糖肽)；乙酰化(例如，通常在多肽的N-末端添加乙酰基基团)；烷基化(例如添加烷基基团)；异戊二烯化(例如，添加类异戊二烯基团)；脂酰化(例如，硫辛酸部分的附接)；和磷酸化(例如，将磷酸盐基团添加到丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸或组氨酸)。

生物活性变体中的氨基酸残基中的一个或多个可以是非天然存在的氨基酸残基。天然存在的氨基酸残基包括由遗传密码天然编码的氨基酸残基以及非标准氨基酸(例如具有D-构型而不是L-构型的氨基酸)。本发明的肽还可以包括氨基酸残基，其是标准残基的修饰版本(例如吡咯赖氨酸可以用来代替赖氨酸，以及硒代半胱氨酸可以用来代替半胱氨酸)。非天然存在的氨基酸残基是那些在自然界中未被发现，但符合氨基酸的基本化学式并可以掺入肽中的氨基酸残基。这些包括D-别异亮氨酸(2R,3S)-2-氨基-3-甲基戊酸和L-环戊基甘氨酸(S)-2-氨基-2-环戊基乙酸。对于其他实例，可以查阅教科书或浏览万维网(该网站目前由加利福尼亚理工学院维护并显示已经成功掺入功能性蛋白质中的非天然氨基酸的结构)。

可替代地或另外，生物活性变体中的氨基酸残基中的一个或多个可以是与野生型序列中相应位置中发现的天然存在残基不同的天然存在的残基。换句话说，生物活性变体可以包括一个或多个氨基酸取代。我们可以将氨基酸残基的取代、添加或缺失称为野生型序列的突变。正如指出那样，取代可以用非天然存在的残基或只是不同的天然存在的残基替代天然存在的氨基酸残基。此外，取代可以构成保守或非保守取代。保守性氨基酸取代典型地包括在下组内的取代：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸、组氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。

作为CRISPR相关内切核酸酶的生物活性变体的多肽可以根据它们的序列与相应的野生型多肽相似或相同的程度来表征。例如，生物活性变体的序列可以与野生型多肽中的相应残基至少或约80％相同。例如，CRISPR相关内切核酸酶的生物活性变体可具有与CRISPR相关内切核酸酶或其同系物或直系同源物具有至少或约80％序列同一性(例如，至少或约85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性)的氨基酸序列。

CRISPR相关内切核酸酶多肽的生物活性变体将保留足够的生物学活性以用于本发明的方法中。生物活性变体将保留足够的活性以在靶向DNA切割中发挥功能。可以以本领域普通技术人员已知的方式评估生物活性，并且包括但不限于体外切割测定或功能测定。

多肽可以通过多种方法产生，包括例如重组技术或化学合成。一旦产生，可以通过本领域公知的方法将多肽分离并纯化至任何希望的程度。例如，随后可以使用例如反相(优选)或正相HPLC、或在多糖凝胶介质例如Sephadex G-25上的尺寸排阻或分配层析来冻干。通过标准方式、通过氨基酸测序或通过FAB-MS技术降解肽后，通过氨基酸分析可以确认最终多肽的组成。可以使用本领域已知的方法制备盐，包括多肽的氨基基团的酸盐、酯、酰胺和N-酰基衍生物，并且这类肽可用于本发明的上下文中。

本发明的组合物包括编码包含与逆转录病毒中的靶序列互补的序列的指导RNA(gRNA)的序列。逆转录病毒可以是慢病毒，例如人免疫缺陷病毒、猿猴免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒或牛免疫缺陷病毒。人免疫缺陷病毒可以是HIV-1或HIV-2。靶序列可以包括来自任何HIV(例如HIV-1和HIV-2)的序列，及其任何循环重组形式。HIV的遗传变异性反映在已经描述的多个组和亚型中。洛斯阿拉莫斯(Los Alamos)HIV数据库和纲要汇编了HIV序列的集合。本发明的方法和组合物可以应用于来自那些不同组、亚型和循环重组形式中的任何的HIV。这些包括例如HIV-1主要组(通常称为组M)和次要组，组N、O和P，以及(但不限于)以下HIV的亚型A、B、C、D、F、G、H、J和K或组(例如但不限于以下组N、O和P中的任一组)中的任一种。这些方法和组合物也可以应用于HIV-2和A、B、C、F或G进化枝(也称为“亚型”或“组”)中的任一种，以及应用于任何循环重组形式的HIV-2。

指导RNA可以是与编码序列或非编码序列互补的序列。例如，指导RNA可以是HIV序列，例如长末端重复序列(LTR)、蛋白质编码序列或调控序列。在一些实施例中，指导RNA包含与HIV长末端重复序列(LTR)区域互补的序列。HIV-1LTR长度约为640bp。示例性HIV-1LTR是SEQ ID NO:376的序列。示例性SIV LTR是SEQ ID NO:380的序列。HIV-1长末端重复序列(LTR)分为U3、R和U5区域。示例性HIV-1LTR U3、R和U5区域分别为SEQ ID NO:377、378和379。示例性SIV LTR U3、R和U5区域分别是SEQ ID NO:381、382和383。示例性HIV-1和SIV序列的U1、R、U5区域的构型分别显示在图18和19中。LTR含有所有基因表达所需的信号，并参与前病毒整合入宿主细胞的基因组中。例如，在U3内发现基础或核心启动子、核心增强子和调节区域，而在R内发现反式激活应答元件。在HIV-1中，U5区域包括几个亚区域，例如TAR或反式作用应答元件，其参与转录激活；Poly A，其参与二聚化和基因组包装；PBS或引物结合位点；Psi或包装信号；DIS或二聚体起始位点。

有用的指导序列与LTR的U3、R或U5区域互补。靶向HIV-1的U3区域的示例性指导RNA序列显示在图13中。指导RNA序列可包含例如与以下的靶原型间隔子序列互补的序列：

LTR A：ATCAGATATCCACTGACCTTTGG(SEQ ID NO:96)、

LTR B：CAGCAGTTCTTGAAGTACTCCGG(SEQ ID NO:121)、

LTR C：GATTGGCAGAACTACACACCAGG(SEQ ID NO:87)、或

LTR D：GCGTGGCCTGGGCGGGACTGGGG(SEQ ID NO:110)。

U3(SEQ ID NO:16)区域内的LTR A(SEQ ID NO:96)、LTR B(SEQ ID NO:121)、LTRC(SEQ ID NO:87)和LTR D(SEQ ID NO:110)的位置如图5所示。靶向U3区域的其他示例性指导RNA序列列于图13所示的表中，并且可以具有SEQ ID NO:79-111和SEQ ID NO:111-141中任一个的序列。在一些实施例中，指导序列可以包含与SEQ ID NO:79-111和SEQ ID NO:111-141中的任一个具有95％同一性的序列。因此，指导RNA序列可以包含例如与以下的靶原型间隔子序列互补的序列具有95％同一性的序列：

LTR A：ATCAGATATCCACTGACCTTTGG(SEQ ID NO:96)、

LTR B：CAGCAGTTCTTGAAGTACTCCGG(SEQ ID NO:121)、

LTR C GATTGGCAGAACTACACACCAGG(SEQ ID NO:87)、或

LTR D：GCGTGGCCTGGGCGGGACTGGGG(SEQ ID NO:110)。

我们也可以将指导RNA序列称为间隔子，例如间隔子(A)、间隔子(B)、间隔子(C)和间隔子(D)。

指导RNA序列可以与在HIV-1U3、R或U5区域参考序列或共有序列内发现的序列互补。然而，本发明不限于此，并且可以选择指导RNA序列以靶向任何变体或突变的HIV序列。在一些实施例中，使用多于一个指导RNA序列，例如第一指导RNA序列和第二指导RNA序列，其中第一和第二指导RNA序列与任何上述逆转录病毒区域中的靶序列互补。在一些实施例中，指导RNA可以包含变体序列或准物种序列。在一些实施例中，指导RNA可以是与正在进行治疗的受试者所携带的病毒的基因组中的序列对应的序列。因此，例如，可以获得受试者携带的HIV病毒中的特定U3、R或U5区域的序列，并且可以使用与患者的特定序列互补的指导RNA。

在一些实施例中，指导RNA可以是与蛋白质编码序列互补的序列，例如编码一种或多种病毒结构蛋白(例如gag、pol、env和tat)的序列。因此，该序列可以与gag多聚蛋白内的序列互补，例如MA(基质蛋白，p17)；CA(衣壳蛋白，p24)；SP1(间隔子肽1，p2)；NC(核衣壳蛋白，p7)；SP2(间隔子肽2，p1)和P6蛋白；pol，例如逆转录酶(RT)和RNA酶H、整合酶(IN)和HIV蛋白酶(PR)；env，例如gp160，或gp160的切割产物，例如gp120或SU，以及gp41或TM；或tat，例如72个氨基酸的一外显子Tat或86-101个氨基酸的两外显子Tat。在一些实施例中，指导RNA可以是与编码辅助蛋白(包括例如vif、nef(阴性因子)、vpu(病毒蛋白U)和tev)的序列互补的序列。

在一些实施例中，该序列可以是与如上所述的结构或调控元件(例如LTR)互补的序列；TAR(病毒反式激活的靶序列)，其为Tat蛋白和细胞蛋白的结合位点，由HIV-1中的病毒mRNA的大约前45个核苷酸(或HIV-2中的前100个核苷酸)组成，形成发夹茎-环结构；RRE(Rev应答元件)，其为在HIV-1的env区域内编码的RNA元件，由大约200个核苷酸组成(从HIV-1中的转录起点开始的位置7710至8061，跨越gp120和gp41的边界)；PE(Psi元件)，在Gag起始密码子之前和与之重叠的一组4个茎-环结构；SLIP，TTTTTT“滑动位点”，其后为茎-环结构；CRS(顺式作用抑制序列)；例如在HIV-1的gag区域中的核苷酸414至631处发现INS抑制性/不稳定性RNA序列。

指导RNA序列可以是正义或反义序列。指导RNA序列通常包括原型间隔子邻近基序(PAM)。PAM的序列可以根据所使用的CRISPR内切核酸酶的特异性要求而变化。在来自化脓链球菌(S.pyogenes)的CRISPR-Cas系统中，靶DNA通常紧接在5'-NGG原型间隔子邻近基序(PAM)之前。因此，对于化脓链球菌Cas9，PAM序列可以是AGG、TGG、CGG或GGG。其他Cas9直系同源物可能具有不同的PAM特异性。例如，来自嗜热链球菌(S.Thermophiles)的Cas9需要CRISPR 1的5'-NNAGAA和CRISPR 3的5'-NGGNG并且来自脑膜炎奈瑟菌(Neiseriamenigiditis)的Cas9需要5'-NNNNGATT。指导RNA的特定序列可以有所不同，但无论序列如何，有用的指导RNA序列都是那些可最大限度地减少脱靶效应，同时实现基因组整合型HIV-1前病毒的高效和完全消融的那些指导RNA序列。指导RNA序列的长度可以为从约20至约60或更多个核苷酸不等，例如约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约45、约50、约55、约60或更多个核苷酸。有用的选择方法鉴定外源病毒基因组与宿主细胞基因组(包括内源性逆转录病毒DNA)之间具有极低同源性的区域，包括使用12-bp+NGG靶标选择标准以排除脱靶人类转录组或(甚至很少的)非翻译基因组位点的生物信息学筛选；避免HIV-1LTR启动子(可能在宿主基因组中是保守的)内的转录因子结合位点；选择LTR-A-和-B-指导的30-bp gRNA以及反映原始细菌免疫机制的前crRNA系统以提高对比基于20-bp gRNA的嵌合crRNA-tracRNA的系统的特异性/效率；以及WGS、Sanger测序和SURVEYOR测定，以鉴定和排除潜在的脱靶效应。

指导RNA序列可以被配置为单个序列或者被配置为一个或多个不同序列的组合，例如多重配置。多重配置可以包括二、三、四、五、六、七、八、九、十种或更多种不同指导RNA的组合，例如U3、R或U5中的序列的任何组合。在一些实施例中，可以使用LTR A、LTR B、LTRC和LTR D的组合。在一些实施例中，可以使用序列LTR A(SEQ ID NO:96)、LTR B(SEQ IDNO:121)、LTR C(SEQ ID NO:87)和LTR D(SEQ ID NO:110)中的任何的组合。在一些实施例中，可以使用具有SEQ ID NO:79-111和SEQ ID NO:111-141的序列的序列的任何组合。当组合物以表达载体施用时，指导RNA可以由单个载体编码。可替代地，可以工程化多种载体，每种载体包括两种或更多种不同的指导RNA。有用的配置将导致切割位点之间的病毒序列的切除，导致HIV基因组或HIV蛋白质表达的消除。因此，使用两种或更多种不同的指导RNA促进由CRISPR内切核酸酶识别的切割位点之间病毒序列的切除。切除的区域可以在大小上有从单个核苷酸到几千个核苷酸的差异。实例中描述了示例性的切除区域。

当组合物作为核酸施用或包含在表达载体内时，CRISPR内切核酸酶可以由与指导RNA序列相同的核酸或载体编码。可替代地或另外地，CRISPR内切核酸酶可以在来自指导RNA序列的物理分离的核酸中或在单独的载体中编码。

在一些实施例中，RNA分子(例如crRNA、tracrRNA、gRNA)被工程化以包含一个或多个经修饰的核碱基。例如，RNA分子的已知修饰可见于例如Genes VI，第9章(“解释遗传密码”)，Lewis编辑(1997，牛津大学出版社，纽约)以及RNA的修饰和编辑，Grosjean和Benne编辑(1998，ASM出版社，华盛顿特区)。经修饰的RNA组分包括以下：2'-O-甲基胞苷；N⁴-甲基胞苷；N⁴-2'-O-二甲基胞苷；N⁴-乙酰基胞苷；5-甲基胞苷；5,2'-O-二甲基胞苷；5-羟基甲基胞苷；5-甲酰基胞苷；2'-O-甲基-5-formayl胞苷；3-甲基胞苷；2-硫代胞苷；赖胞苷；2'-O-甲基尿苷；2-硫代尿苷；2-硫代-2'-O-甲基尿苷；3,2'-O-二甲基尿苷；3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷；4-硫代尿苷；核糖基胸腺嘧啶；5,2'-O-二甲基尿苷；5-甲基-2-硫代尿苷；5-羟基尿苷；5-甲氧基尿苷；尿苷5-氧基乙酸；尿苷5-氧基乙酸甲基酯；5-羧基甲基尿苷；5-甲氧基羰基甲基尿苷；5-甲氧基羰基甲基-2'-O-甲基尿苷；5-甲氧基羰基甲基-2'-硫代尿苷；5-氨基甲酰基甲基尿苷；5-氨基甲酰基甲基-2'-O-甲基尿苷；5-(羧基羟基甲基)尿苷；5-(羧基羟基甲基)尿苷甲基酯；5-氨基甲基-2-硫代尿苷；5-甲基氨基甲基尿苷；5-甲基氨基甲基-2-硫代尿苷；5-甲基氨基甲基-2-硒尿苷；5-羧基甲基氨基甲基尿苷；5-羧基甲基氨基甲基-2'-O-甲基-尿苷；5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷；二氢尿苷；二氢核糖基胸腺嘧啶；2'-甲基腺苷；2-甲基腺苷；N.sup.6N-甲基腺苷；N⁶,N⁶-二甲基腺苷；N⁶,2'-O-三甲基腺苷；2-甲基硫代-N⁶N-异戊烯基腺苷；N⁶-(顺式-羟基异戊烯基)-腺苷；2-甲基硫代-N⁶-(顺式--羟基异戊烯基)-腺苷；N⁶-甘氨酰氨基甲酰基)腺苷；N⁶-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷；N⁶-甲基-N⁶-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷；2-甲基硫代-N⁶-甲基-N⁶-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷；N⁶-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基腺苷；2-甲基硫代-N⁶-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基腺苷；2'-O-核糖基腺苷(磷酸盐)；肌苷；2'O-甲基肌苷；1-甲基肌苷；1；2'-O-二甲基肌苷；2'-O-甲基鸟苷；1-甲基鸟苷；N²-甲基鸟苷；N²,N²-二甲基鸟苷；N²,2'-O-二甲基鸟苷；N²,N²,2'-O-三甲基鸟苷；2'-O-核糖基鸟苷(磷酸盐)；7-甲基鸟苷；N²；7-二甲基鸟苷；N²；N²；7-三甲基鸟苷；怀俄苷；甲基怀俄苷；修饰不足的羟基怀丁苷；怀丁苷；羟基怀丁苷；过氧基怀丁苷；辫苷；环氧基辫苷；半乳糖基-辫苷；甘露糖基-辫苷；7-氰基-7-脱氮杂鸟苷；arachaeosine[也称为7-甲酰胺-7-脱氮杂鸟苷]；和7-氨基甲基-7-脱氮杂鸟苷。

我们可以互换地使用术语“核酸”和“多核苷酸”来指RNA和DNA二者，包括cDNA、基因组DNA、合成DNA和含有核酸类似物的DNA(或RNA)，以上中的任何一种可以编码本发明的多肽，并且以上所有都包含在本发明中。多核苷酸可以具有基本上任何三维结构。核酸可以是双链或单链的(即，正义链或反义链)。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)及其部分、转移RNA、核糖体RNA、siRNA、微RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支化型多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物，以及核酸类似物。在本发明的上下文中，核酸可以编码天然存在的Cas9的片段或其生物活性变体和指导RNA，其中指导RNA与HIV中的序列互补。

“分离的”核酸可以是例如天然存在的DNA分子或其片段，条件是在天然存在的基因组中紧密侧接该DNA分子的被正常发现的核酸序列中的至少一个被去除或不存在。因此，分离的核酸包括但不限于作为单独的分子存在的DNA分子，不依赖于其他序列(例如化学合成的核酸，或由聚合酶链式反应(PCR)或限制性内切核酸酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)。分离的核酸还指被整合到载体、自主复制性质粒、病毒中或者原核生物或真核生物的基因组DNA中的DNA分子。另外，分离的核酸可以包括工程化的核酸，例如作为杂交体或融合核酸的一部分的DNA分子。存在于例如cDNA文库或基因组文库中的或含有基因组DNA限制性消化的凝胶切片中的许多(例如数十或数百至数百万)其他核酸不是分离的核酸。

分离的核酸分子可以通过标准技术生产。例如，聚合酶链式反应(PCR)技术可用于获得含有本文所述核苷酸序列(包括编码本文所述多肽的核苷酸序列)的分离的核酸。PCR可用于扩增来自DNA以及RNA的特定序列，包括来自总基因组DNA或总细胞RNA的序列。各种PCR方法描述于例如PCR Primer:A Laboratory Manual[PCR引物：实验室手册]，Dieffenbach和Dveksler编辑，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratorypress)，1995中。通常，来自目的区域的末端或更远端的序列信息被用来设计与待扩增的模板的相反链的序列相同或相似的寡核苷酸引物。各种PCR策略也可用于将位点特异性核苷酸序列修饰引入模板核酸中。

分离的核酸也可以是化学合成的，作为单个核酸分子(例如，使用亚磷酰胺技术在3'至5'方向使用自动化DNA合成)或作为一系列寡核苷酸。例如，可以合成含有所需序列的一对或多对长寡核苷酸(例如，>50-100个核苷酸)，其中每对含有具有互补性的短区段(例如约15个核苷酸)，使得寡核苷酸对退火时形成双链体。使用DNA聚合酶来延伸寡核苷酸，产生单个双链核酸分子/寡核苷酸对，然后可以将其连接到载体中。本发明的分离的核酸也可以通过诱变例如编码Cas9的DNA的天然存在部分(根据例如上式)而获得。

它们编码的两种核酸或多肽可被描述为彼此具有一定程度的同一性。例如，可以将Cas9蛋白及其生物活性变体描述为表现出一定程度的同一性。可以通过在蛋白质信息研究(PIR)站点中定位短Cas9序列来组装比对，然后用“短几乎相同的序列”进行分析。NCBI网站上的基本局部比对搜索工具(BLAST)算法。

如本文所用，术语“百分比序列同一性”是指任何给定查询序列和主题序列之间的同一性程度。例如，天然存在的Cas9可以是查询序列，并且Cas9蛋白质的片段可以是主题序列。类似地，Cas9蛋白的片段可以是查询序列，并且其生物活性变体可以是主题序列。

为了确定序列同一性，可以使用计算机程序ClustalW(版本1.83，默认参数)将查询核酸或氨基酸序列分别与一个或多个主题核酸或氨基酸序列比对，这允许核酸或蛋白质序列跨越其整个长度进行比对(全局比对)。参见Chenna等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]31:3497-3500,2003。

ClustalW计算查询序列与一个或多个主题序列之间的最佳匹配，并对齐它们，以确定同一性、相似性和差异。可以将一个或多个残基的空位插入到查询序列、主题序列或两者中，以最大化序列比对。为了快速成对比对核酸序列，使用以下默认参数：字长：2；窗口大小：4；评分方法：百分数；顶部对角线数：4；以及空位罚分：5。为了核酸序列的多重比对，使用以下参数：空位开放罚分：10.0；空位延伸罚分：5.0；和权重转移(weight transition)：是。为了快速成对比对蛋白序列，使用以下参数：字长：1；窗口大小：5；评分方法：百分数；顶部对角线数：5；空位罚分：3。对于蛋白质序列的多重比对，使用以下参数：权重矩阵：blosum；空位开放罚分：10.0；空位延伸罚分：0.05；亲水性空位：开；亲水性残基：Gly、Pro、Ser、Asn、Asp、Gln、Glu、Arg、和Lys；残基特异性空位罚分：开。输出是反映序列之间关系的序列比对。例如，ClustalW可以在贝勒医学院的搜索启动器站点(searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html)以及万维网上的欧洲生物信息学研究所站点(ebi.ac.uk/clustalw)上运行。

为了确定查询序列和主题序列之间的同一性百分比，ClustalW将最佳比对中的同一性数量除以比较的残基数(排除空位位置)，并将结果乘以100。输出是主题序列相对于查询序列的百分比同一性。值得注意的是，百分比同一性值可以舍入为最接近的十分之一。例如，78.11、78.12、78.13和78.14舍为78.1，而78.15、78.16、78.17、78.18和78.19入为78.2。

本文所述的核酸和多肽可被称为“外源的”。术语“外源的”表示核酸或多肽是重组核酸构建体的一部分或由重组核酸构建体编码或不在其天然环境中。例如，外源核酸可以是来自被引入另一物种中的一种物种的序列，即异源核酸。通常，这种外源核酸通过重组核酸构建体被引入到其他物种中。外源核酸也可以是对生物体而言天然的并且已经被重新引入到该生物体的细胞中的序列。包含天然序列的外源性核酸通常可以通过与外源核酸连接的非天然序列的存在而区别于天然存在的序列，例如重组核酸构建体中天然序列侧翼的非天然调控序列。另外，稳定转化的外源核酸通常被整合在除了发现天然序列的位置之外的位置。

本文还提供了重组构建体，并且其可用于转化细胞以表达Cas9和/或与HIV靶上序列互补的指导RNA。重组核酸构建体包含编码如本文所述的Cas9和/或与HIV靶序列互补的指导RNA的核酸，该核酸有效地连接至适合用于表达Cas9和/或与细胞中HIV中的靶序列互补的指导RNA的调控区域。应该理解，许多核酸可以编码具有特定氨基酸序列的多肽。遗传密码的简并性在本领域中是众所周知的。对于许多氨基酸，存在不止一个作为氨基酸的密码子的核苷酸三联体。例如，可以修饰Cas9的编码序列中的密码子，从而使用对该生物体来说适当的密码子偏好表获得特定生物体中的最佳表达。

还提供了含有核酸的载体，例如本文所述的那些核酸。“载体”是复制子，例如质粒、噬菌体或粘粒，向其中可插入另一个DNA片段以引起插入片段的复制。通常，载体在与适当控制元件缔合时能够复制。合适的载体骨架包括例如本领域常规使用的那些，例如质粒、病毒、人造染色体、BAC、YAC或PAC。术语“载体”包括克隆和表达载体，以及病毒载体和整合载体。“表达载体”是包含调控区域的载体。多种宿主/表达载体组合可用于表达本文所述的核酸序列。合适的表达载体包括但不限于衍生自例如噬菌体、杆状病毒和逆转录病毒的质粒和病毒载体。许多载体和表达系统可从诺瓦根公司(Novagen)(麦迪逊，威斯康辛州)、克隆科技公司(Clontech)(帕洛阿尔托，加利福尼亚州)、斯图特基因公司(Stratagene)(拉荷亚，加利福尼亚州)和英杰公司/生命技术公司(卡尔斯巴德，加利福尼亚州)等公司商购。

本文提供的载体还可以包括例如复制起点、支架附着区(SAR)和/或标记。标记基因可赋予宿主细胞可选择的表型。例如，标记可赋予杀生物剂抗性，例如对抗生素(例如卡那霉素、G418、博来霉素或潮霉素)的抗性。如上所指出，表达载体可以包括标签序列，该标签序列被设计成促进表达的多肽的操作或检测(例如纯化或定位)。标签序列，例如绿色荧光蛋白(GFP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、多组氨酸、c-myc、血凝素或Flag^TM标签(柯达公司，纽黑文，康涅狄格州)序列通常表达为与编码的多肽的融合体。这样的标签可以插入多肽内的任何位置，包括羧基或氨基末端处。

另外的表达载体也可以包括例如染色体、非染色体和合成的DNA序列的区段。合适载体包括SV40的衍生物和已知细菌质粒，例如大肠杆菌质粒col E1、pCR1、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX、pMB9及其衍生物，质粒例如RP4；噬菌体DNA，例如，噬菌体1的众多衍生物，例如，NM989、及其他噬菌体DNA，例如，M13和丝状单链噬菌体DNA；酵母质粒例如2μ质粒或其衍生物；在真核细胞中有用的载体，例如在昆虫或哺乳动物细胞中有用的载体；衍生自质粒和噬菌体DNA组合的载体，例如已修饰为采用噬菌体DNA或其他表达控制序列的质粒。

还可以使用酵母表达系统。根据本发明可以采用例如，非融合pYES2载体(XbaI、SphI、ShoI、NotI、GstXI、EcoRI、BstXI、BamH1、SacI、Kpn1、和HindIII克隆位点；英杰公司)或融合pYESHisA、B、C(XbaI、SphI、ShoI、NotI、BstXI、EcoRI、BamH1、SacI、KpnI、和HindIII克隆位点，用ProBond树脂纯化的并用肠激酶切割的N-末端肽；英杰公司)，仅提及两种。根据本发明也可以制备酵母双杂交表达系统。

该载体还可以包括调控区域。术语“调控区域”是指影响转录或翻译起始和速率以及转录或翻译产物的稳定性和/或移动性的核苷酸序列。调控区域包括但不限于启动子序列、增强子序列、应答元件、蛋白质识别位点、诱导型元件、蛋白质结合序列、5'和3'非翻译区(UTR)、转录起始位点、终止序列、聚腺苷酸化序列、核定位信号和内含子。

如本文所用，术语“有效地连接”是指将调控区域和待转录的序列定位在核酸中以影响这种序列的转录或翻译。例如，为了使编码序列处于启动子的控制之下，多肽的翻译阅读框的翻译起始位点通常位于启动子下游1至约50个核苷酸之间。然而，启动子可位于翻译起始位点上游约5,000个核苷酸处或转录起始位点上游约2,000个核苷酸处。启动子通常包含至少一个核心(基础)启动子。启动子还可以包括至少一个控制元件，例如增强子序列、上游元件或上游活化区域(UAR)。待包括的启动子的选择取决于几个因素，包括但不限于效率、可选择性、可诱导性、期望的表达水平以及细胞或组织优先表达。本领域技术人员通过适当选择和定位相对于编码序列的启动子和其他调控区域来调节编码序列的表达是常规问题。

载体包括，例如病毒载体(例如腺病毒(“Ad”)、腺病毒相关病毒(AAV)、以及水泡性口炎病毒(VSV)和逆转录病毒)，脂质体和其他含脂质的复合物，以及其他能够介导多核苷酸到宿主细胞的递送的大分子复合物。载体还可以包含进一步调节基因递送和/或基因表达或者以其他方式对靶细胞有益特性的其他组分或功能性。如以下所述以及更详细所示，这样的其他组分包括，例如，影响与细胞结合或靶向的组分(包括介导细胞型或组织特异性结合的组分)；影响细胞吸收载体核酸的组分；影响吸收后多核苷酸在细胞内的定位的组分(例如介导核定位的试剂)；和影响多核苷酸表达的组分。此种组分还可能包括标记物，例如可以用来检测或选择细胞的可检测和/或可选择的标记物，这些细胞已经摄取并且正在表达由该载体递送的核酸。此类组分可以作为载体(例如使用某些具有或介导结合以及摄取的组分或功能性的病毒载体)的自然特征而提供，或者载体可以被改性为提供此种功能性。其他载体包括例如由Chen等人，BioTechniques[生物技术]，34:167-171(2003)描述的那些。大量的不同的此类载体是在本领域中已知的，并且总体上是可得的。

“重组病毒载体”是指含有一种或多种异源基因产物或序列的病毒载体。由于许多病毒载体表现出与包装(packaging)相关的尺寸限制，所以这些异源基因产物或序列典型地通过替代该病毒基因组的一个或多个部分而引入。此种病毒可能变成复制缺陷型的，从而要求在病毒的复制和包封过程中以反式提供一种或多种删除功能(通过使用，例如一种带复制和/或包封所必须的基因产物的辅助病毒或包装细胞系)。已经对其中在病毒颗粒外面上携带有待递送的多核苷酸的改性病毒载体进行了描述(参见，例如Curiel,D T等人，PNAS 88:8850-8854,1991)。

适合的核酸递送系统包括重组病毒载体，典型地是来自腺病毒、腺病毒相关的病毒(AAV)、依赖辅助病毒的腺病毒载体、逆转录病毒、或日本脂质体(HVJ)复合物的血凝病毒中至少一种的序列。在这样的情况中，该病毒载体包含有效地连接到该多核苷酸上的强真核启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子。重组病毒载体可以在其中包含一个或多个多核苷酸，优选约一个多核苷酸。在一些实施例中，在本发明的方法中所使用的病毒载体具有从约10⁸至约5x 10¹⁰pfu的pfu(斑形成单位)。在其中多核苷酸与一种非病毒载体一起施用的实施例中，使用从约0.1纳克至约4000微克经常是有用的，例如约1纳克至约100微克。

其他载体包括病毒载体、融合蛋白和化学缀合物。逆转录病毒载体包括莫洛尼鼠白血病病毒以及基于HIV的病毒。一种基于HIV的病毒载体包括至少两种载体，其中gag和pol基因来自HIV基因组并且env基因来自另一种病毒。DNA病毒载体包括pox载体，例如orthopox或avipox载体，疱疹病毒载体，例如单纯疱疹病毒I(HSV)载体[Geller,A.I.等人，J.Neurochem[神经化学],64:487(1995)；Lim,F.等人，DNA Cloning:Mammalian Systems[DNA克隆：哺乳动物系统]，D.Glover编辑(Oxford Univ.Press,Oxford England[牛津大学出版社，英格兰牛津])(1995)；Geller,A.I.等人，Proc Natl.Acad.Sci.:U.S.A.[美国国家科学院院刊]:90 7603(1993)；Geller,A.I.等人，Proc Natl.Acad.Sci USA[美国国家科学院院刊]:87:1149(1990)]；腺病毒载体[LeGal LaSalle等人，Science[科学]，259:988(1993)；Davidson等人，Nat.Genet.[自然基因学]3:219(1993)；Yang等人，J.Virol.[病毒学杂志]69:2004(1995)]；以及腺相关的病毒载体[Kaplitt,M.G.等人，Nat.Genet.[自然基因学]8:148(1994)]。

Pox病毒载体将该基因引入到细胞质中。Avipox病毒载体仅导致了核酸的短期表达。腺病毒载体、腺-相关的病毒载体以及单纯疱疹病毒(HSV)载体可以是一些发明实施例的指示。腺病毒载体导致了比腺-相关的病毒更短期的表达(例如，小于约一个月)，在一些实施例中可以显示远远更长的表达。所选择的具体载体将取决于靶细胞以及正在治疗的病况。适当的启动子的选择可以很容易地完成。适合的启动子的一个实例是763-碱基对巨细胞病毒(CMV)启动子。可用于基因表达的其他合适的启动子包括但不限于劳斯氏肉瘤病毒(RSV)(Davis等人，Hum Gene Ther[人类基因治疗]4:151(1993))、SV40早期启动子区域、疱疹胸苷激酶启动子、金属硫蛋白(MMT)基因的调控序列、原核表达载体(如β-内酰胺酶启动子)、tac启动子、来自酵母或其他真菌的启动子元件(如Gal 4启动子)、ADC(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子；以及表现组织特异性且已用于转基因动物中的动物转录控制区：在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区，在胰岛β细胞中有活性的胰岛素基因控制区、在淋巴细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区、在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区、在肝中有活性的白蛋白基因控制区、在肝中有活性的甲胎蛋白基因控制区、在肝中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区、在髓样细胞中有活性的β-球蛋白基因控制区、在脑中的少突胶质细胞中有活性的髓磷脂碱性蛋白基因控制区、在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区、和在下丘脑中有活性的促性腺激素释放激素基因控制区。某些蛋白可以使用其天然启动子表达。还可以包括其他的增强表达的元件，例如导致高水平表达的增强子或系统，例如一种tat基因和tar元件。这种盒然后可以插入到载体中，例如质粒载体，如pUC19、pUC118、pBR322或其他已知的质粒载体，该盒包括例如大肠杆菌复制起点。参见，Sambrook等人，MolecularCloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册]，冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory press)，(1989)。这种质粒载体还可以包括一种可选择的标记物，例如用于氨苄青霉素耐药性的β-内酰胺酶基因，条件是这种标记物多肽不会不利地影响正在治疗的有机体的新陈代谢。该盒还可以在合成递送系统，例如在WO 95/22618中披露的系统中结合到核酸结合的部分上。

如果需要，本发明的多核苷酸还可以与微量递送媒介物例如阳离子脂质体和腺病毒载体一起使用。对于脂质体制备、内容物的靶向和递送程序的综述，参见Mannino和Gould-Fogerite,BioTechniques(生物技术公司)，6:682(1988)。还参见Felgner和Holm，贝塞斯达研究实验室焦点杂志(Bethesda Res.Lab.Focus)，11(2):21(1989)和Maurer,R.A.，贝塞斯达研究实验室焦点杂志，11(2):25(1989)。

复制缺陷型重组腺病毒载体可以根据已知技术生产。参见Quantin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[[美国国家科学院院刊]]，89:2581-2584(1992)；Stratford-Perricadet等人，J.Clin.Invest.[临床调查杂志]，90:626-630(1992)；以及Rosenfeld等人，Cell[细胞]，68:143-155(1992)。

另一种递送方法是使用产生单链DNA的载体，这些载体可以在细胞内生产生表达的产物。参见，例如Chen(陈)等人，BioTechniques(生物技术)，34:167-171(2003)，将其通过引用以其全文结合在此。

载体的传递也可以由外排体介导。外排体是由许多细胞类型释放的脂质纳米囊泡。它们通过在细胞之间转运核酸和蛋白来介导细胞间通讯。外排体含有RNA、miRNA、和来自内吞途径的蛋白。它们可能通过内吞作用、融合、或两者被靶细胞吸收。典型地，内体内容物的接收改变了接受细胞的功能(Lee等人，2012)。

可以利用外排体将核酸递送至靶细胞。在优选的方法中，外排体由生产细胞在体外产生、纯化、并通过电穿孔或通过脂质转染剂装载核酸货物(Marcus和Leonard，2013，Shtam等人，2013)。货物(cargo)可以包括针对Cas内切核酸酶和一种或多种gRNA的表达构建体。合适的技术可以在Kooijmans等人(2012)、Lee等人(2012)、Marcus和Leonard(2013)、Shtam等人(2013)、或其中的参考文献中找到。用于产生和装载外排体的示例性试剂盒是ExoFectTM试剂盒(系统生物科学有限公司(System Biosciences,Inc.)，美国加州山景城)。

也可以针对特定细胞类型的优先吸收来靶向外排体。Alvarez-Ervitti等人(2011)披露了对本发明尤其有用的靶向策略。使用其中披露的技术，外排体可以用狂犬病病毒糖蛋白(RVG)肽修饰。携带RVG的外排体特异地积聚于大脑，尤其是神经元、少突胶质细胞和小胶质细胞中，其他组织中的非特异性积聚很少。

本发明的表达构建体也可以通过纳米线团(nanoclew)的方式递送。纳米线团是一种茧样DNA纳米复合材料(Sun等人，2014)。它们可以装载核酸供靶细胞吸收并释放到靶细胞的细胞质中。在Sun等人(2014)和Sun等人(2015)的文章中可以找到构建纳米线团、装载它们、和设计释放分子的方法。

本发明的基因编辑构建体也可以不通过宿主细胞的诱导表达而通过直接递送递送，即递送Cas核酸酶蛋白，例如Cas9蛋白，加上一种或多种gRNA。外排体是用于直接递送的优选媒介物，因为它们可以同时装载蛋白和RNA(Alvarez-Ervitti等人，2011；Marcus和Leonard，2013)。蛋白装载到外排体中的示例性方法是通过在外排体生产细胞中表达蛋白，所述蛋白为与内体蛋白如乳凝集素的融合物。如前所述，外排体的另一个有利特征是它们对特异性位点如脑的靶向性。可以将gRNA装载到与Cas核酸酶蛋白相同的外排体中，优选地，以Cas/gRNA复合物的形式装载。可以将Cas内切核酸酶和gRNA可替代地装载到单独的外排体中，用于同时或分阶段递送。

基因编辑复合物的直接传递也可以通过纳米线团的方式完成。Sun等人(2015)披露了用于将Cas9/gRNA复合物装载到纳米线团中以吸收和释放到接收细胞中的技术。

直接递送媒介物可以通过合适的途径施用，包括但不限于静脉内、腹膜内、直肠、鞘内、颅内、吸入和口服，包括丸剂形式。

药物组合物

如上所述，本发明的组合物可以以本领域普通技术人员已知的各种方式制备。无论其原始来源或获得其的方式如何，本发明的组合物都可以根据它们的用途来配制。例如，可将上述核酸和载体配制在组合物中以施用于组织培养中的细胞或施用患者或受试者。可以配制本发明的任何药物组合物用于制备药物，并且具体用途在治疗的上下文中如下所示，例如治疗患有HIV感染或处于感染HIV感染的风险中的患者。当用作药物时，任何核酸和载体可以以药物组合物的形式施用。这些组合物可以按制药领域中熟知的方式制备，并且可以通过多种途径施用，取决于希望局部治疗还是全身性治疗并且取决于有待治疗的部位。施用可以是局部的(包括眼的和至粘膜，包括鼻内、阴道和直肠递送)、肺部的(例如，通过吸入或吹入粉末或气溶胶，包括通过喷雾器；气管内、鼻内、表皮和经皮肤)、眼部的、口腔的或肠胃外的。用于眼部递送的方法可以包括局部施用(滴眼剂)，结膜下、眼周或玻璃体内注射或者通过用手术方法放置在结膜囊中的气囊式导管或眼科插入件引入。肠胃外施用包括静脉内的、动脉内的、皮下的、腹膜内的或肌内的注射或输注；或颅内的，例如鞘内的或心室内的施用。肠胃外施用可以处于单次推注剂量的形式，或者可以例如通过连续灌注泵。用于局部施用的药物组合物和配制品可以包括透皮贴剂、软膏剂、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体、粉剂等。常规的药物载体、水性基质、粉末或油性基质、增稠剂等可以是必要的或希望的。

本发明还包括药物组合物，其含有与一种或多种药学上可接受的载体组合的作为活性成分的本文所述的核酸和载体。我们使用术语“药学上可接受的”(或者“药理学上可接受的”)指当施用于适当的动物或人类时，不产生不利的、过敏的或者其他不良反应的分子实体和组合物。如在此所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、赋形剂、黏合剂、润滑剂、凝胶、表面活性剂等，其可以用作用于药学上可接受的物质的介质。在制备本发明的组合物中，典型地将活性成分与赋形剂混合，用赋形剂稀释或封装在这样一种载体之内，该载体呈例如胶囊、片剂、药袋(sachet)、纸或其他容器的形式。当赋形剂用作稀释剂时，其可以是固体、半固体、或液体材料(例如，生理盐水)，用作活性成分的媒介、载体或介质。因此，这些组合物可以呈片剂、丸剂、粉剂、锭剂、药袋、扁囊剂、酏剂、悬浮液、乳液、溶液、糖浆剂、气溶胶(作为固体或在液体介质中)、洗剂、乳膏、软膏、凝胶剂、软和硬明胶胶囊剂、栓剂、无菌可注射溶液以及无菌包装粉剂的形式。如本领域已知的，稀释剂的类型可以根据预期的施用途径而变化。所得组合物可包括另外的试剂，例如防腐剂。在一些实施例中，载体可以是或可以包括基于脂质或基于聚合物的胶体。在一些实施例中，载体材料可以是配制成脂质体、水凝胶、微粒、纳米颗粒或嵌段共聚物胶束的胶体。如指出的，载体材料可以形成胶囊，并且该材料可以是基于聚合物的胶体。

本发明的核酸序列可以被递送至受试者的合适的细胞。这可以通过例如使用聚合的，生物可降解的微粒或微胶囊递送媒介物来实现，其尺寸被设计成通过吞噬细胞如巨噬细胞优化吞噬作用。例如，可以使用直径约1-10μm的PLGA(聚-乳酸-共-乙交酯)微粒。将多核苷酸包封在这些微粒中，这些微粒被巨噬细胞吸收并在细胞内逐渐生物降解，由此释放多核苷酸。一旦释放，DNA在细胞内表达。第二种类型的微粒意图不被细胞直接吸收，而是主要起核酸的缓释储库的作用，其仅在通过生物降解从微粒释放时才被细胞吸收。因此这些聚合物颗粒应该足够大以排除吞噬作用(即大于5μm并且优选地大于20μm)。实现核酸吸收的另一种方式是使用通过标准方法制备的脂质体。核酸可以单独掺入这些递送媒介物中或与组织特异性抗体共同掺入，例如靶向HIV感染常见的潜伏感染储库(例如脑巨噬细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞和肠相关淋巴细胞)的细胞类型的抗体。可替代地，可以通过静电或共价力制备由质粒或附接至聚-L-赖氨酸的其他载体构成的分子复合物。聚-L-赖氨酸结合可结合靶细胞受体的配体。将“裸DNA”(即不含递送媒介物)递送到肌内、皮内或皮下位点是实现体内表达的另一种方式。在相关多核苷酸(例如表达载体)中，对包含CRISPR相关内切核酸酶编码序列的分离的核酸序列和指导RNA进行编码的核酸序列与启动子或增强子-启动子组合有效连接。上面描述了启动子和增强子。

在一些实施例中，本发明的组合物可以被配制成纳米颗粒，例如纳米颗粒由与DNA复合的高分子量直链聚乙烯亚胺(LPEI)的核心构成，并被聚乙二醇修饰的(聚乙二醇化的)低分子量LPEI的壳包围。如前所述，外排体和纳米线团也可用于根据本发明的药物组合物中。

核酸和载体也可以应用于装置(例如导管)的表面或包含在泵、贴片或其他药物递送装置内。本发明的核酸和载体可以是在药学上可接受的赋形剂或载体(例如生理盐水)的存在下单独或以混合物的形式施用。根据施用方式和途径选择赋形剂或载体。用于药物配制品的合适的药物载体以及药物必需品描述于本领域公知的参考文献雷明顿的药学科学(E.W.Martin)，以及USP/NF(美国药典和国家处方集)中。

在一些实施例中，组合物可以配制成用于阻断HIV的性传播的外用凝胶。外用凝胶可以在性行为之前直接应用于男性或女性生殖区域的皮肤或粘膜。可替代地或另外地，外用凝胶可以施用到表面上或包含在男性或女性避孕套或隔膜内。

在一些实施例中，可以将组合物配制成纳米颗粒，该纳米颗粒包封编码Cas9或变体Cas9的核酸和与靶HIV互补的指导RNA序列或者包封包含编码Cas9的核酸和与靶HIV互补的指导RNA序列的载体。可替代地，可将组合物配制成包封CRISPR相关内切核酸酶多肽例如Cas9或变体Cas9和与靶标互补的指导RNA序列的纳米颗粒。

本发明的配制品可以包含编码Cas9和与靶HIV互补的指导RNA序列的载体。指导RNA序列可以包括与单个区域互补的序列，例如，LTR A、B、C或D，或者可以包括与LTR A、B、C和D互补的序列的任何组合。可替代地，编码Cas9的序列和编码指导RNA序列的序列可以位于不同的载体上。

治疗方法

本文披露的组合物通常地以及多方面地用于治疗患有逆转录病毒感染(例如HIV感染)的受试者。我们可以互换地指代受试者、患者或个体。这些方法可用于靶向任何HIV，例如HIV-1、HIV-2及其任何循环重组形式。每当有临床有效的结果发生，受试者就得到有效治疗。例如，这可能意味着完全消除疾病症状、降低疾病症状的严重程度或减缓疾病进展。这些方法可以进一步包括以下步骤：a)鉴定具有HIV感染的受试者(例如患者，更具体地说，人类患者)；和b)向受试者提供包含编码CRISPR相关核酸酶(例如Cas9)的核酸和与HIV靶序列(例如HIV LTR)互补的指导RNA的组合物。可以使用标准临床测试(例如免疫测定)以检测受试者血清中HIV抗体或HIV多肽p24的存在，或通过HIV核酸扩增测定，来鉴定受试者。导致完全消除感染症状、降低感染症状的严重程度或减缓感染进展的提供给受试者的这种组合物的量被认为是治疗有效量。本方法还可以包括监测步骤以帮助优化施用和安排以及预测结果。在本发明的一些方法中，可以首先确定患者是否具有潜伏的HIV-1感染，并且然后确定是否用本文所述的组合物中的一种或多种治疗患者。监测也可用于检测耐药性的发生，并快速区分应答性患者和非应答性患者。在一些实施例中，这些方法可以进一步包括确定由患者所携带的特定HIV的核酸序列，并且然后将指导RNA设计为与那些特定序列互补的步骤。例如，可以确定受试者的LTR U3、R或U5区域的核酸序列，并且然后设计一个或多个指导RNA以与患者的序列精确互补。

这些组合物还可用于处于患有逆转录病毒感染(例如HIV感染)风险的受试者的治疗，例如作为预防性治疗。这些方法可以进一步包括以下步骤：a)鉴定处于患有HIV感染风险的受试者；b)向受试者提供包含编码CRISPR相关核酸酶(例如Cas9)的核酸和与HIV靶序列(例如HIV LTR)互补的指导RNA的组合物。例如，处于患有HIV感染风险的受试者可以是例如进行无保护的性行为的任何性活跃的个体，即不使用避孕套进行性行为；患有另一种性传播感染的性活跃的个体；静脉用药者；或未受割礼的男人。处于患有HIV感染风险的受试者可以是例如其职业可能使其与HIV感染人群接触的个体(例如医疗工作者或第一响应者)。处于患有HIV感染风险的受试者可以是例如监禁场所中的囚犯或性工作者，即将性活动用于收入性就业或非货币性项目(例如食品、药品或住所)的个体。

这些组合物还可以向患有HIV感染的怀孕或哺乳期妇女施用，以减少HIV从母亲传播给其后代的可能性。感染HIV的孕妇可以在通过产道分娩经胎盘传播给子宫内的后代或分娩后通过母乳将病毒传播给后代。本文披露的组合物可以在母乳喂养期间在产前、围产期和产后或以产前、围产期或产后施用的任何组合向HIV感染的母亲施用。如下所述，组合物可以与标准抗逆转录病毒疗法一起施用于母亲。在一些实施例中，本发明的组合物还在分娩后立即施用于婴儿，并且在一些实施例中，分娩后每隔一段时间施用。婴儿还可以接受标准的抗逆转录病毒疗法。

本文披露的方法和组合物可用于治疗逆转录病毒感染。示例性逆转录病毒包括人免疫缺陷病毒，例如HIV-1、HIV-2；猿猴免疫缺陷病毒(SIV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；和山羊关节炎/脑炎病毒(CAEV)。本文披露的方法可以应用于广泛范围的物种，例如人类、非人类灵长类动物(例如猴子)、马或其他家畜；作为宠物饲养的狗、猫、雪貂或其它哺乳动物；大鼠，小鼠或其他实验室用动物。

本发明的方法可以根据药物的制备来表达。因此，本发明包括本文所述的试剂和组合物在制备药物中的用途。本文所述的化合物可用于治疗性组合物和方案或用于制造用于治疗如本文所述的疾病或病症的药物。

本文所述的任何组合物可以向宿主身体的任何部位施用以用于随后递送至靶细胞。组合物可递送至但不限于哺乳动物的脑、脑脊髓液、关节、鼻粘膜、血液、肺、肠、肌肉组织、皮肤或腹膜腔。就递送途径而言，可以通过以下方式施用组合物：静脉内、颅内、腹膜内、肌内、皮下、肌内、直肠内、阴道内、鞘内、气管内、皮内或经皮注射；通过口服或鼻腔施用；或通过随时间逐渐灌注。在另外的实例中，组合物的气溶胶制剂可通过吸入给予宿主。

所需剂量将取决于施用途径，配制品的性质，患者疾病的性质，患者的身高、体重、表面积、年龄和性别，所施用的其他药物以及主治医生的判断。鉴于细胞靶标的多样性和各种施用途径的不同效率，预期所需剂量有广泛变化。正如本领域完全领会的，可使用标准经验性路径来调整这些剂量水平的变化以进行优化。施用可以是单次或多次(例如2或3、4、6、8、10、20、50、100、150或更多倍)。将化合物包封在合适的递送载体(例如聚合物微粒或可植入装置)中以增加递送效率。

用本文提供的任何组合物的治疗的持续时间可以是从短至一天至长至宿主寿命(例如多年)的任何时间长度。例如，化合物可以每周施用一次(例如，持续4周至几个月或几年)；每月一次(例如，持续三到十二个月或多年)；或者每年一次，为期5年、十年或更长时间。还应注意的是治疗的频率可以变化。例如，本发明化合物可以每天、每周、每月或每年施用一次(或两次、三次等)。

有效量的本文提供的任何组合物可以施用于需要治疗的个体。如本文所使用的，术语“有效的”是指诱导希望的应答而不诱导患者显著毒性的任何量。这种量可以通过在施用已知量的特定的组合物后评估患者的应答来确定。此外，毒性水平(如果有的话)可以通过在施用已知量的特定组合物之前和之后评估患者的临床症状来确定。应当指出，可以根据希望的结果以及患者的应答和毒性水平来调整施用于患者的特定组合物的有效量。对每个特定患者的显著毒性可能不同，且取决于多种因素，包括但不限于患者的疾病状态、年龄和对副作用的耐受性。

可以使用本领域技术人员已知的任何方法来确定是否诱发了特定应答。能够评估特定疾病状态程度的临床方法可以用于确定是否诱发了应答。用于评估应答的具体方法将取决于患者病症的性质、患者的年龄和性别、所施用的其他药物以及主治医师的判断。

组合物也可以与另一种治疗剂(例如HAART中使用的抗逆转录病毒剂)一起施用。示例性抗逆转录病毒剂包括逆转录酶抑制剂(例如，核苷/核苷酸逆转录酶抑制剂、齐多夫定、恩曲他滨、拉米夫定和替诺福韦；和非核苷逆转录酶抑制剂，如依法韦仑(efavarenz)、奈韦拉平、利匹韦林)；蛋白酶抑制剂，例如替吡瑞(tipiravir)、地瑞那韦、茚地那韦；进入抑制剂，例如马拉韦罗；融合抑制剂，例如恩夫韦肽(enfuviritide)；或整合酶抑制剂，例如雷特格韦、度鲁特韦。示例性抗逆转录病毒剂还可以包括多种类的组合试剂，例如恩曲他滨、依法韦仑和替诺福韦的组合；恩曲他滨、利匹韦林和替诺福韦的组合；或埃替格韦、可比司他、恩曲他滨和替诺福韦的组合。

两种或更多种治疗剂的同时施用不要求这些试剂同时或通过相同的途径施用，只要在这些试剂发挥其治疗效果的时间段内存在重叠即可。考虑同时或顺序施用，如在不同天或星期施用。治疗剂可以在有节奏的方案下施用，例如连续低剂量的治疗剂。

这类组合物的剂量、毒性和疗效可以通过在细胞培养物或实验用动物中的标准药物程序来确定，例如用于确定LD₅₀(致死50％的群体的剂量)和ED₅₀(对于50％的群体具有治疗有效性的剂量)。在毒性和治疗效果之间的剂量比为治疗指数，它可以表示为LD₅₀/ED₅₀。

从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于配制一系列的用于在人类中使用的剂量。优选地这类组合物的剂量处于包括ED₅₀在内的循环浓度范围内，有很少的毒性或没有毒性。剂量可以在该范围内变化，这取决于所使用的剂型和使用的施用途径。对于用于本发明方法的任何组合物，均可根据细胞培养试验初步估计治疗有效剂量。在动物模型中可以将剂量配制为达到循环血浆浓度范围，该范围包括如在细胞培养中确定的IC₅₀(即，实现症状的半最大抑制时的测试化合物浓度)。这种信息可以用于更准确地确定人类中有用的剂量。可以例如通过高效液相色谱法来测量血浆中的水平。

如所述，组合物的治疗有效量(即有效剂量)是指足以产生治疗(例如临床)期望结果的量。这些组合物可以每天一次或多次至每周一次或多次施用；包括隔日一次。本领域技术人员将理解，某些因子可以影响有效治疗一个受试者所需的剂量和时间安排，这些因子包括(但不局限于)疾病或病症的严重性、之前的治疗、该受试者的总体健康和/或年龄、以及其他存在的疾病。另外，用治疗有效量的本发明组合物治疗受试者可以包括单次治疗或系列治疗。

本文所述的组合物适用于上述各种药物递送系统。另外，为了增加所施用组合物的体内血清半衰期，可以将组合物装入胶囊，引入到脂质体的腔中，制备为胶体，或者可以采用提供延长组合物血清半衰期的其他常规技术。多种方法可用于制备脂质体，如在例如Szoka(索卡)等人的美国专利号4,235,871、4,501,728和4,837,028中所述的，将各自通过引用结合在此。另外，能以靶向药物递送系统进行该药物的施用，例如，在用组织特异性抗体包衣的脂质体中。所述脂质体靶向于所述器官并由所述器官选择性地吸收。

还提供了在哺乳动物细胞中使逆转录病毒(例如慢病毒，如人免疫缺陷病毒、猿猴免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒或牛免疫缺陷病毒)失活的方法。人免疫缺陷病毒可以是HIV-1或HIV-2。人免疫缺陷病毒可以是染色体整合的前病毒。哺乳动物细胞可以是被HIV感染的任何细胞类型，包括但不限于CD4+淋巴细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、单核细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞、树突细胞(如朗格汉斯细胞和滤泡树突状细胞)、造血干细胞、内皮细胞、脑小神经胶质细胞和胃肠上皮细胞。这样的细胞类型包括在初次感染期间通常被感染的那些细胞类型，例如CD4+淋巴细胞、巨噬细胞或朗格汉斯细胞、以及构成潜伏HIV储库(即潜伏感染的细胞)的那些细胞类型。

这些方法可以包括将细胞暴露于包含编码基因编辑复合物的分离的核酸的组合物，该组合物含有CRISPR相关内切核酸酶和一种或多种指导RNA，其中所述指导RNA与逆转录病毒中的靶核酸序列互补。在优选的实施例中，如前所述，使整合到被逆转录病毒潜伏感染的宿主细胞的基因组中的前病毒DNA失活的方法包括用包含CRISPR相关内切核酸酶和两种或更多种不同的指导RNA(gRNA)的组合物处理宿主细胞的步骤，其中所述至少两种gRNA中的每一种与所述前病毒DNA中的不同靶核酸序列互补；并使前病毒DNA失活。所述至少两种gRNA可以被配置为单个序列或者被配置为一个或多个不同序列的组合，例如多重配置。多重配置可以包括二、三、四、五、六、七、八、九、十种或更多种不同gRNA的组合，例如U3、R或U5中的序列的任何组合。在一些实施例中，可以使用LTR A、LTR B、LTR C和LTR D的组合。在一些实施例中，可以使用序列LTR A(SEQ ID NO:96)、LTR B(SEQ ID NO:121)、LTR C(SEQID NO:87)和LTR D(SEQ ID NO:110)中的任何的组合。在实例中描述的实验中，使用两种不同的gRNA导致由CRISPR内切核酸酶识别的切割位点之间的病毒序列的切除。切除的区域可以包括整个HIV-1基因组。处理步骤可以在体内进行，也就是说，组合物可以直接向患有HIV感染的受试者施用。然而，这些方法不限于此，并且处理步骤可以离体进行。例如，可将细胞或多个细胞或组织外植体从具有HIV感染的受试者中移出并置于培养物中，并且然后用包含CRISPR相关内切核酸酶和指导RNA的组合物处理，其中指导RNA与人免疫缺陷病毒中的核酸序列互补。如上所述，组合物可以是编码CRISPR相关内切核酸酶和指导RNA的核酸，其中所述指导RNA与人免疫缺陷病毒中的核酸序列互补；包含所述核酸序列的表达载体；或包含编码CRISPR相关内切核酸酶和指导RNA的核酸的药物组合物，其中所述指导RNA与人免疫缺陷病毒中的核酸序列互补；或包含所述核酸序列的表达载体。在一些实施例中，基因编辑复合物可以包含CRISPR相关内切核酸酶多肽和指导RNA，其中所述指导RNA与人免疫缺陷病毒中的核酸序列互补。

无论组合物是作为核酸还是多肽施用，它们都以促进哺乳动物细胞摄取的方式配制。以上描述了有用的载体系统和配制品。在一些实施例中，载体可以将组合物递送至特定的细胞类型。然而，本发明不限于此，还设想了其他DNA递送方法，例如使用如磷酸钙、DEAE葡聚糖、脂质体、脂质复合物、表面活性剂和全氟化学液体的化学转染，物理递送方法，如电穿孔、微量注射、弹道颗粒和“基因枪”系统也是如此。

可以使用标准方法，例如检测CRISPR相关内切核酸酶的免疫测定法或基于核酸的测定如检测gRNA的PCR来证实该复合物已被其所引入的细胞吸收和表达。然后可以将工程化细胞重新引入如下所述的衍生其的受试者中。

基因编辑复合物包含CRISPR相关核酸酶(例如Cas9)和与逆转录病毒靶序列(例如HIV靶序列)互补的指导RNA。基因编辑复合物可将各种突变引入前病毒DNA中。这类突变使病毒失活的机制可以变化，例如突变可影响前病毒复制、病毒基因表达或前病毒切除。这些突变可能位于调控序列或结构基因序列中，并导致缺陷HIV产生。该突变可以包含缺失。缺失的大小可以在单个核苷酸碱基对与约10,000个碱基对变化。在一些实施例中，缺失可以包括前病毒序列中的全部或基本上全部。在一些实施例中，缺失可以包括整个前病毒序列。突变可以包含插入；即向前病毒序列中添加一个或多个核苷酸碱基对。插入的序列的大小也可以变化，例如从约一个碱基对到约300个核苷酸碱基对。该突变可以包含点突变，即用另一个核苷酸置换单个核苷酸。有用的点突变是那些具有功能性结果的点突变，例如导致氨基酸密码子转换成终止密码子或导致产生非功能性蛋白质的突变。

在用于失活整合到宿主细胞基因组中的前病毒DNA的示例性多重方法中，如实例2-5所示，使用两种不同的gRNA序列，每种gRNA序列靶向前病毒DNA中的不同位点。也就是说，所述方法包括如下步骤：将宿主细胞暴露于如下组合物，该组合物包含编码CRISPR相关内切核酸酶的分离的核酸；编码具有第一间隔子序列的第一gRNA的分离的核酸序列，所述第一间隔子序列与前病毒DNA中的第一靶前间隔子序列互补；和编码具有第二间隔子序列的第二gRNA的分离的核酸，所述第二间隔子序列与前病毒DNA中的第二靶前间隔子序列互补；在宿主细胞中表达CRISPR相关内切核酸酶、第一gRNA和第二gRNA；在宿主细胞中组装包含CRISPR相关内切核酸酶和第一gRNA的第一基因编辑复合物；和包含CRISPR相关内切核酸酶和第二gRNA的第二基因编辑复合物；通过第一间隔子序列和第一靶前间隔子序列之间的互补碱基配对将第一基因编辑复合物引导至第一靶前间隔子序列；通过第二间隔子序列和第二靶前间隔子序列之间的互补碱基配对将第二基因编辑复合物引导至第二靶前间隔子序列；用CRISPR相关内切核酸酶切割第一靶前间隔子序列处的前病毒DNA；用CRISPR相关内切核酸酶切割第二靶前间隔子序列处的前病毒DNA；以及在前病毒DNA中诱导至少一个突变。将相同的多重方法容易地并入用于治疗患有人免疫缺陷病毒的受试者并降低人免疫缺陷病毒感染的风险的方法中。应该理解，术语“组合物”不仅可以包括组分的混合物，而且还可以包括不必同时施用的单独组分。作为非限制性实例，根据本发明的组合物可以包括编码Cas9核酸酶、第一gRNA和第二gRNA的核酸序列的单独组分制剂，其中在导致宿主细胞暴露于所有三种组分的时间框架内，将每种组分按顺序地以输注方式施用。

在其他实施例中，组合物包含已经用一种或多种Cas/gRNA载体转化或转染的细胞。在一些实施例中，本发明的方法可以离体应用。也就是说，受试者的细胞可以从人体去除并且用培养物中的组合物处理以切除HIV序列，并将处理的细胞返回到受试者的身体。细胞可以是受试者的细胞，或者它们可以是单体型匹配的或细胞系。可以对这些细胞进行辐照以防止复制。在一些实施例中，这些细胞是人白细胞抗原(HLA)-匹配的自体的细胞系或其组合。在其他实施例中，细胞可以是干细胞。例如，胚胎干细胞或人造多能干细胞(诱导的多能干细胞(iPS细胞))。已经从包括人在内的许多动物物种建立了胚胎干细胞(ES细胞)和人造多能干细胞(诱导的多能干细胞，iPS细胞)。这些类型的多能干细胞将成为用于再生医学的细胞的最有用的来源，因为这些细胞能够通过适当诱导几乎所有的器官的分化而分化为几乎所有的器官，同时保持其活跃分裂的能力并维持其多能性。特别是iPS细胞可以由自体衍生的体细胞建立，并且因此与通过破坏胚胎产生的ES细胞相比，不太可能引起伦理和社会问题。此外，iPS细胞，一种自体衍生的细胞，可以避免排斥反应(再生医学或移植治疗的最大障碍)。

可以通过本领域已知的方法(例如递送siRNA的方法)将gRNA表达盒容易地递送至受试者。在一些方面，Cas可以是一个片段(其中包含Cas分子的活性结构域)，由此减小所述分子的大小。因此，Cas9/gRNA分子可以临床使用，类似于目前基因疗法所采用的方法。具体而言，将开发用于细胞移植治疗以及HIV-1疫苗接种的Cas9/多重gRNA稳定表达干细胞或iPS细胞以用于受试者。

根据已建立的方法制备转导的细胞用于再输注。在培养中约2-4周后，细胞数量可以在1×10⁶和1×10¹⁰之间。在这方面，细胞的生长特征因患者以及细胞类型而异。在再输注转导的细胞之前约72小时，取等分试样以分析表型和表达治疗剂的细胞的百分比。对于施用，如应用于大众和患者的整体健康，本发明的细胞可以以由细胞类型的LD₅₀和不同浓度的细胞类型的副作用确定的速率施用。施用可以经由单次或多次剂量实现。成人干细胞还可以使用外源性施用的因子来移动，所述因子刺激所述干细胞从组织或空间(可包括但不限于骨髓或脂肪组织)中产生和排出。

制品

本文所述的组合物可以包装在标记的合适容器中，例如，用作治疗患有逆转录病毒感染(例如HIV感染)的受试者或用于感染逆转录病毒感染(例如HIV感染)的受试者的疗法。这些容器可以包括如下组合物，该组合物包含编码CRISPR相关内切核酸酶(例如Cas9内切核酸酶)的核酸序列，和与人免疫缺陷病毒中的靶序列互补的指导RNA，或编码该核酸的载体，以及如适合于预期用途的一种或多种合适的稳定剂、载体分子、调味剂和/或类似物。因此，经包装的产品(例如含有一种或多种本文所述的组合物并被包装用于以浓缩或即用浓度存储、运输或销售的无菌容器)和试剂盒(其包括至少一种本发明的组合物，例如编码CRISPR相关内切核酸酶(例如Cas9内切核酸酶)的核酸序列，和与人免疫缺陷病毒中的靶序列互补的指导RNA，或编码该核酸的载体，以及使用说明)也在本发明的范围内。产品可以包括含有一种或多种本发明组合物的容器(例如，小瓶、罐子、瓶子、袋子等)。另外，制品还可以包括例如包装材料、使用说明书、注射器、递送装置、缓冲液或其他对照试剂，用于治疗或监测需要预防或治疗的病症。

在一些实施例中，试剂盒可以包括一种或多种另外的抗逆转录病毒剂，例如逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂或进入抑制剂。这些另外的试剂可以一起包装在与编码CRISPR相关内切核酸酶(例如Cas9内切核酸酶)的核酸序列和与人免疫缺陷病毒中的靶序列互补的指导RNA、或编码该核酸的载体相同的容器中，或者它们可以分开包装。可以将编码CRISPR相关内切核酸酶(例如Cas9内切核酸酶)的核酸序列和与人免疫缺陷病毒中的靶序列互补的指导RNA、或编码该核酸的载体、以及这些另外的试剂在将要使用前进行组合或分开施用。

产品还可以包括图例(例如，印刷标签或插入物或描述产品使用的其他介质(例如录音带或录像带))。该图例可以与容器相关联(例如贴在容器上)，并且可以描述其中的组合物应该被施用的方式(例如施用频率和途径)、其适应症和其他用途。这些组合物可以准备好用于施用(例如以剂量合适的单位存在)，并且可以包含一种或多种另外的药学上可接受的佐剂、载体或其他稀释剂和/或另外的治疗剂。可替代地，这些组合物可以以具有稀释剂和稀释说明的浓缩形式提供。

实例1：材料与方法

质粒制备：使用含有人类Cas9和gRNA表达盒的载体、pX260和pX330(Addgene公司)来产生各种构建体，LTR-A、B、C和D。

细胞培养和稳定的细胞系：TZM-b1报告子和U1细胞系获得自NIH艾滋病试剂项目(NIH AIDS Reagent Program)，并且CHME5小神经胶质细胞在本领域中是已知的。

免疫组织化学和蛋白质印迹：利用免疫细胞化学观察细胞的标准方法和通过蛋白质印迹评估蛋白质表达。

萤火虫-荧光素酶测定：根据制造商的方案，使用被动裂解缓冲液(PassiveLysisBuffer)(普洛麦格公司(Promega))在处理后24小时细胞裂解并用萤光素酶报告基因测定试剂盒(Luciferase Reporter Gene Assay kit)(普洛麦格公司)进行测定。将荧光素酶活性归一化为通过平行MTT测定(维布兰提(Vybrant)，英杰公司(Invitrogen))测定的细胞数量。

p24 ELISA：感染或再活化后，按照制造商的方案，通过p24Gag ELISA(先进生物科学实验室公司(Advanced BioScience Laboratories，Inc))定量上清液中HIV-1病毒载荷的水平。为了评估处理后的细胞活力，根据制造商手册(维布兰提，英杰公司)平行进行MTT测定。

EGFP流式细胞术：将细胞用胰蛋白酶消化，用PBS洗涤并在室温下在2％多聚甲醛中固定10分钟，然后用PBS洗涤两次并使用Guava EasyCyte Mini流式细胞仪(Guava技术公司)进行分析。

HIV-1报告病毒制备和感染：使用Lipofectamine 2000试剂(英杰公司)和pNL4-3-ΔE-EGFP(NIH AIDS研究和参考试剂计划(NIH AIDS Research and Reference ReagentProgram))转染HEK293T细胞。48h后，收集上清液，0.45μm过滤并使用EGFP作为感染标记物在HeLa细胞中滴定。对于病毒感染，将稳定的Cas9/gRNA TZM-bI细胞与稀释的病毒原液一起孵育2h，并且然后用PBS洗涤两次。在感染后2d和4d，收集细胞，进行固定并通过流式细胞术分析EGFP表达，或者进行基因组DNA纯化用于PCR和全基因组测序。

基因组DNA扩增、PCR、TA-克隆和Sanger测序，GenomeWalker link PCR：使用用于克隆和测序的DNA操作的标准方法。为了鉴定HIV-1的整合位点，使用了Lenti-XTM整合位点分析试剂盒。

Surveyor测定：使用SURVEYOR突变检测试剂盒(Transgenomic公司)根据制造商的方案检查PCR产物中突变的存在。简而言之，异源PCR产物在95℃变性10分钟，并通过使用热循环仪逐渐冷却进行杂交。接下来，在0.25μl SURVEYOR Enhancer S和15mM MgCl2存在下，在42℃下，用0.25μl SURVEYOR核酸酶消化300ng杂交的DNA(9μl)4h。然后添加终止溶液，并将样品与等量的未经消化的PCR产物对照一起溶解于2％琼脂糖凝胶中。

一些PCR产物用于限制性片段长度多态性分析。将等量的PCR产物用BsaJI消化。将经消化的DNA在含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶(2％)上分离。为了测序，使用具有pCR^TMII载体(英杰公司)的TA试剂盒双启动子克隆PCR产物。将插入物通过用EcoRI消化来证实，并将阳性克隆送至Genewiz进行Sanger测序。

LTR靶位点的选择、全基因组测序和生物信息学以及统计分析。我们利用Jack Lin的CRISPR/Cas9gRNA发现工具初步鉴定LTR内的潜在靶位点。

质粒制备。将表达前crRNA的LTR-A或LTR-B的DNA片段克隆到含有嘌呤霉素选择基因(Addgene公司，质粒#42229)的pX260载体中。将表达嵌合crRNA-tracrRNA的LTR-C或LTR-D的DNA片段克隆到pX330载体(Addgene公司，质粒#42230)中。两种载体均含有由CAG启动子驱动的人源化Cas9编码序列和由人类U6启动子驱动的gRNA表达盒。将这些载体用BbsI消化并用南极磷酸酶(Antarctic Phosphatase)处理，并将线性化载体用Quick核苷酸去除试剂盒(凯杰公司(Qiagen))纯化。将每个靶向位点的一对寡核苷酸(图14，AlphaDNA)退火，磷酸化并连接至线性化载体。用GENEWIZ中的U6测序引物(图14)对gRNA表达盒进行测序。对于pX330载体，我们设计了一对带有突出消化位点的通用PCR引物(图14)，该引物可以挑出用于直接转染或亚克隆至其他载体的gRNA表达盒(U6-gRNA-crRNA-stem-tracrRNA)。

细胞培养。来自John C.Kappes博士、Xiaoyun Wu博士和Tranzyme公司的TZM-bI报告细胞系，来自Thomas Folks博士的U1/Hiv-1细胞系，以及来自Eric Verdin博士的J-Lat全长克隆通过NIH AIDS试剂计划(AIDS部门，NIAID,NIH)获得。如前所述产生CHME5/HIV胎儿小胶质细胞系。将TZM-bI和CHME5细胞在补充有10％热灭活的胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素的Dulbecco的最小必需培养基高葡萄糖中培养。将U1和J-Lat细胞在含有2.0mML-谷氨酰胺、10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI 1640中培养。

稳定的细胞系和亚克隆。将TZM-bI或CHME5/HIV细胞以1.5x10⁵个细胞/孔接种在6孔板中并使用Lipofectamine 2000试剂(英杰公司)和1μg pX260(对于LTR-A和B)或1μg/0.1μg的pX330/pX260(对于LTR-C和D)质粒进行转染。第二天，将细胞转移至100-mm培养皿中并与含有1μg/ml嘌呤霉素(Sigma公司)的生长培养基一起孵育。两周后，使用克隆圆筒(康宁公司(Corning))分离存活的细胞菌落。在Neon^TM转染系统(英杰公司)上，使用10μl枪头、3x 10ms 1400V脉冲，用1μg DNA电穿孔U1细胞(1.5x10⁵)。用0.5μg/ml嘌呤霉素选择细胞2周。将稳定克隆在96孔板中使用有限的稀释法进行继代培养，并保留单细胞衍生的亚克隆用于进一步研究。

免疫组织化学和蛋白质印迹。将Cas9/gRNA稳定表达TZM-bI细胞在8孔室载玻片中培养2天，并在4％多聚甲醛/PBS中固定10min。三次漂洗后，将细胞用0.5％Triton X-100/PBS处理20min并在10％驴血清中封闭1h。将细胞与小鼠抗Flag M2一级抗体(1:500，Sigma公司)在4℃下孵育过夜。漂洗三次后，将细胞与驴抗小鼠Alexa-Fluor-594二级抗体一起孵育1h，并与Hoechst 33258一起孵育5min。用PBS冲洗三次后，将细胞用抗褪色水性安装介质(Biomeda公司)加盖玻片并在Leica DMI6000B荧光显微镜下分析。

将在6孔板中培养的TZM-bI细胞溶解于200μl基于Triton X-100的裂解缓冲液中，该裂解缓冲液包含20mM Tris-HCl(pH 7.4)、1％Triton X-100、5mM乙二胺四乙酸、5mM二硫苏糖醇、150mM NaCl、1mM苯甲基磺酰氟、1×核提取蛋白酶抑制剂混合物(Cayman Chemical公司，安阿伯市(Ann Arbor)，密歇根州)、1mM原钒酸钠和30mM NaF。将细胞裂解物在4℃旋转30min。通过在4℃下以20,000g离心20min来清除核和细胞碎片。通过在十二烷基硫酸钠(SDS)样品缓冲液中煮沸5min来使等量的裂解物蛋白质(20μg)变性，通过在tris-甘氨酸缓冲液中的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分级并转移至硝酸纤维素膜(伯乐公司(BioRad))。使用SeeBlue预染色的标准物(英杰公司)作为分子量参考。将印迹在5％BSA/tris-缓冲盐水(pH7.6)加0.1％Tween-20(TBS-T)中封闭1h，并且然后在4℃用小鼠抗Flag M2单克隆抗体(1:1000，Sigma公司)或小鼠抗GAPDH单克隆抗体(1:3000，圣克鲁兹生物技术公司(Santa CruzBiotechnology))一起孵育过夜。用TBS-T洗涤后，将印迹与IRDye680LT缀合的抗小鼠抗体一起在室温下孵育1h。使用奥德赛(Odyssey)红外成像系统(LI-COR生物科学公司)对膜进行扫描和分析。

萤火虫-荧光素酶测定。根据制造商的方案，使用被动裂解缓冲液(Passive LysisBuffer)(普洛麦格公司(Promega))在处理后24小时裂解细胞并用萤光素酶报告基因测定试剂盒(Luciferase Reporter Gene Assay kit)(普洛麦格公司)进行测定。将荧光素酶活性归一化为通过平行MTT测定(维布兰提(Vybrant)，英杰公司(Invitrogen))测定的细胞数量。

p24 ELISA感染或再活化后，按照制造商的方案，通过p24Gag ELISA(先进生物科学实验室公司(Advanced BioScience Laboratories，Inc))定量上清液中HIV-1病毒载荷水平。为了评估处理后的细胞活力，根据制造商的方案(维布兰提，英杰公司)平行进行MTT测定。

EGFP流式细胞术。将细胞用胰蛋白酶消化，用PBS洗涤并在室温下在2％多聚甲醛中固定10分钟，然后用PBS洗涤两次并使用Guava EasyCyte Mini流式细胞仪(Guava技术公司)进行分析。

Hiv-1报告病毒制备和感染。使用Lipofectamine 2000试剂(英杰公司)和pNL4-3-ΔE-EGFP、SF162以及JRFL(NIH AIDS研究和参考试剂计划(NIH AIDS Research andReference Reagent Program))转染HEK293T细胞。对于假型pNL4-3-ΔE-EGFP，共转染VSVG载体。48h后，收集上清液，0.45μm过滤并使用表达的EGFP作为感染标记物在HeLa细胞中滴定。对于病毒感染，将稳定的Cas9/gRNA TZM-bI细胞与稀释的病毒原液一起孵育2h，并用PBS洗涤两次。在感染后2天和4天，收集细胞，进行固定并通过流式细胞术分析EGFP表达，或者针对PCR和全基因组测序进行基因组DNA纯化。

基因组DNA纯化、PCR、TA-克隆和Sanger测序。根据制造商推荐的方案，使用ArchivePure DNA细胞/组织纯化试剂盒(5PRIME)从细胞分离基因组DNA。使用高保真FailSafe PCR试剂盒(Epicentre公司)，使用图14中列出的引物对100ng提取的DNA进行PCR。将标准PCR的三个步骤进行30个循环，其中在55℃退火和在72℃延伸。将产物溶解于2％琼脂糖凝胶中。将目的条带进行凝胶纯化并克隆到pCRII T-A载体(英杰公司)中，并且通过使用通用T7和/或SP6引物在金唯智公司(Genewiz)的测序确定单个克隆的核苷酸序列。

常规和实时逆转录(RT)-PCR。对于总RNA提取，按照制造商的说明用RNeasy Mini试剂盒(凯杰公司)处理细胞。通过用无RNA酶的DNA酶组(凯杰公司)进行柱上DNA酶消化来去除可能残留的基因组DNA。使用随机六核苷酸引物和高容量cDNA逆转录试剂盒(英杰公司，格兰德岛，纽约州)将每个样品的1μg RNA逆转录成cDNA。使用标准方案进行常规PCR。使用Green PCR预混合物试剂盒(应用生物系统公司(Applied Biosystems))在LightCycler480(罗氏公司)中进行定量PCR(qPCR)分析。将RT反应稀释至5ng的总RNA/微升反应，并将2μl用于20μl PCR反应。对于HIV-1原病毒的qPCR分析，使用50ng的基因组DNA。在AlphaDNA中合成引物并显示于图14中。人类持家基因(housekeeping gene)GAPDH和RPL13A的引物从RealTimePrimers(宾州艾金公园市)获得。每个样品测试三个重复。循环阈值(Ct)是针对靶基因和持家基因以图表方式获得的。持家基因和靶基因之间在Ct值上的差异表示为ΔCt值。ΔΔCt值是通过从实验样品的ΔCt值中减去对照样品的ΔCt值而获得的。相对倍数或百分比变化计算为2-ΔΔCt。在某些情况下，使用掺入人基因组DNA中的pNL4-3-ΔE-EGFP质粒作为标准物进行绝对定量。用持家基因标准化后，基于标准曲线计算HIV-1病毒拷贝数。

GenomeWalker link PCR和长片段(long-range)PCR。使用Lenti-X^TM整合位点分析试剂盒(克隆科技公司(Clontech))按照制造商的说明鉴定HIV-1在宿主细胞中的整合位点。简而言之，使用NucleoSpin Tissue试剂盒(克隆科技公司)从U1细胞中提取高质量的基因组DNA。为了构建病毒整合文库，每个基因组DNA样品分别用产生平末端的消化酶Dra I、Ssp I或Hpal在37℃消化过夜。通过在0.6％琼脂糖上的电泳来验证消化效率。使用NucleoSpin凝胶和PCR Clean-Up试剂盒纯化消化的DNA，随后在16℃过夜将消化的基因组DNA片段连接到GenomeWalker^TM衔接子。通过在70℃下孵育5min来终止连接反应并用TE缓冲液稀释5次。使用Advantage 2聚合酶混合物，用衔接子引物1(AP1)和LTR特异性引物1(LSP1)对DNA片段进行初步PCR，然后使用AP2和LSP2引物进行第二次(巢式)PCR(图14)。将第二次PCR产物在1.5％含溴化乙锭的琼脂糖凝胶上分离。将主要条带进行凝胶纯化并克隆到pCRII T-A载体(英杰公司)中，并且通过使用通用T7和SP6引物在金唯智公司(Genewiz)的测序确定单个克隆的核苷酸序列。通过NCBI BLAST搜索来分析序列读数。在染色体X和2中鉴定了U1细胞中HIV-1的两个整合位点。在AlphaDNA中合成覆盖每个整合位点的一对引物(图14)。用Phusion高保真性PCR试剂盒(新英格兰生物实验室(New England Biolabs))按照生产商的方案进行使用U1基因组DNA的长片段PCR。将PCR产物在1％琼脂糖凝胶上可视化并通过Sanger测序验证。

Surveyor测定。使用SURVEYOR突变检测试剂盒(Transgenomic公司)根据制造商的方案测试PCR产物中突变的存在。简而言之，将异源PCR产物在95℃变性10分钟，并通过使用热循环仪逐渐冷却进行杂交。接下来，在0.25μl SURVEYOR Enhancer S和15mM MgCl2存在下，在42℃下，用0.25μl SURVEYOR核酸酶消化300ng杂交的DNA(9μl)4h。然后添加终止溶液，并将样品与等量的未经消化的PCR产物一起溶解于2％琼脂糖凝胶中。

一些PCR产物用于限制性片段长度多态性分析。将等量的PCR产物用BsaJI消化。将经消化的DNA在含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶(2％)上分离。为了测序，使用具有pCR^TMII载体(英杰公司)的TA试剂盒双启动子克隆PCR产物。将插入物通过用EcoRI消化来证实，并将阳性克隆送至Genwiz进行Sanger测序。

LTR靶位点的选择和潜在脱靶位点的预测。对于初始研究，由于在传代期间潜在的LTR突变，我们通过对来自人类TZM-bI细胞基因组的PCR产物进行TA克隆测序来获得整合的慢病毒LTR-萤光素酶报告子的LTR启动子序列(-411至-10)。该启动子序列与pHR'-CMV-LacZ慢病毒载体(AF105229)的5'-LTR具有100％匹配。因此，使用Jack Lin的CRISPR/Cas9gRNA发现工具，利用全长pHR'5'-LTR(634bp)的正义和反义序列来搜索含有20bp gRNA靶向序列加PAM序列(NRG)的Cas9/gRNA靶位点。使用NCBI/blastn套件(E值截止值为1000并且字长为7)，通过针对所有可用的人基因组和转录物序列，对每个gRNA靶向序列加NRG(AGG、TGG、GGG和CGG；AAG、TAG、GAG、CAG)进行blast来预测具有精确匹配的潜在脱靶的数量。按Control+F后，复制/粘贴靶序列(1-23至9-23个核苷酸)，并找到与靶序列具有100％匹配的基因组靶标数。由于重复的基因组文库，将每次搜索的脱靶数除以3。

全基因组测序和生物信息分析。验证了TZM-bI细胞的对照亚克隆C1和实验亚克隆AB7的靶切割效率和LTR-荧光素酶报告子的功能性抑制。用NucleoSpin Tissue试剂盒(Clontech公司)分离基因组DNA。将DNA样品提交给天普大学福克斯蔡斯癌症中心(TempleUniversity Fox Chase Cancer Center)的NextGen测序设施。使用依诺米那公司(Illumina)的NEBNext超DNA文库制备试剂盒(NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit)(新英格兰生物实验室(New England Biolab))按照制造商的说明从每个亚克隆制备复制的基因组DNA文库。在HiSeq 2500仪器(依诺米那公司)上的两个依诺米那公司快速运行流动池中，所有文库都用配对末端141bp读数进行测序。将来自测序文库的多路解编读数数据发送给AccuraScience有限责任公司进行专业生物信息学分析。简言之，通过使用Bowtie2将原读数映射到人类基因组(hg19)和HIV-1基因组。将基因组分析工具包(GATK，版本2.8.1)用于去除重复读数、局部比对、碱基质量重新校准和插入缺失调用。置信度得分10和30是低质量(LowQual)和高置信度调用(PASS)的阈值。如上所述和通过CRISPR设计工具，通过NCBI/blastn套件预测在各种错配情况下LTR-A和LTR-B的潜在脱靶位点。使用所有潜在的gRNA靶位点(图15)来绘制由GATK鉴定的每个插入缺失周围±300bp区域。比较对照C1和实验AB7之间人类基因组和HIV-1基因组中重叠区域的位置。

统计分析。定量数据代表来自3-5次独立实验的平均值±标准偏差，并且通过学生t检验或ANOVA和纽曼-科伊尔斯多重比较检验(Newman-Keuls multiple comparisontest)进行评估。P值<0.05或0.01被认为是统计学上显著的差异。

实例2：Cas9/LTR-gRNA抑制潜伏感染HIV-1的CHME5小神经胶质细胞中的HIV-1报告病毒产生

我们评估了HIV-1指导的指导RNA(gRNA)废除LTR转录活性并消除来自潜伏感染的髓样细胞的基因组的前病毒DNA的能力，所述髓样细胞在大脑(特别难治的靶标群体)中作为HIV-1储库。我们的策略集中在靶向HIV-1LTR启动子U3区域。通过生物信息学筛选和效率/脱靶预测，我们鉴定了四个避免保守的转录因子结合位点的gRNA靶标(原型间隔子；LTRA-D)，从而最小化改变宿主基因表达的可能性(图5和13)。我们将与gRNA A-D互补的DNA片段插入人源化Cas9表达载体(pX260中的A/B；pX330中的C/D)并测试它们单独和组合的改变整合的HIV-1基因组活性的能力。我们首先利用了小神经胶质细胞系CHME5，其含有包含5'和3'LTR的单轮HIV-1载体的整合拷贝，以及替代Gag的编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的基因(pNL4-3-ΔGag-d2EGFP)。用曲古抑菌素A(TSA)(一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂)处理CHME5细胞，再激活来自整合的前病毒的大多数的转录，并导致EGFP和剩余HIV-1蛋白质组的表达。表达gRNA加Cas9显著降低了TSA诱导的EGFP阳性CHME5细胞的分数(图1A和6)。我们使用基于Cel I核酸酶的异源双链体特异性SURVEYOR测定法检测LTR A-D(图1B和6B)的插入/缺失基因突变(插入缺失)。类似地，在HeLa衍生的TZM-bI细胞(其含有驱动萤火虫荧光素酶报告基因的稳定合并的HIV-1LTR拷贝)中表达靶向LTR C和D的gRNA抑制病毒启动子活性(图7A)，并在由SURTRYOR和Sanger测序显示的LTR U3区域内引起插入缺失(图7B-D)。此外，这些细胞中靶向LTR C/D的gRNA的组合表达导致预测的302-bp病毒DNA序列的切除和残留194-bp片段的出现(图7E-F)。

在混合的克隆CHME5细胞中的LTR-A/B gRNA的多重表达导致A和B靶位点之间的190-bp片段的缺失并导致不同程度的插入缺失(图1C-D)。在20个嘌呤霉素选择的稳定亚克隆中，我们发现具有通过流式细胞术测定的EGFP的TSA诱导的HIV-1前病毒再活化的完全阻断的细胞群(图1E)。基于PCR的前病毒基因组中的EGFP和HIV-1Rev应答元件(RRE)的分析验证了HIV-1基因组的消除(图1F、G)。此外，PCR产物的测序揭示了缺失跨越整个5'-3'LTR的病毒基因组，经由切割位点A和B之间的190-bp切除产生351-bp片段(图1G和8)，和分别在LTR-A和-B位点具有175-bp插入和27-bp缺失的682-bp片段(图8C)。残留的HIV-1基因组(图1F-H)可以反映痕量Cas9/gRNA阴性细胞的存在。这些结果表明靶向LTR的Cas9/gRNA A/B消除HIV-1基因组并阻断其在潜伏感染的小神经胶质细胞中的再活化。

实例3：Cas9/LTR-gRNA抑制潜伏感染HIV-1的CHME5小神经胶质细胞中的HIV-1报告病毒产生

前单核细胞U-937细胞亚克隆U1(感染的血管周围巨噬细胞和单核细胞的HIV-1潜伏期模型)长期受HIV-1感染，并表现出低水平的组成型病毒基因表达和复制。GenomeWalker映射在U1细胞中的染色体Xp11-4(图2A)和2p21(图9A)处检测到两个整合的前病毒DNA拷贝。将代表整个9709-bp前病毒HIV-1DNA加侧翼226-bp X染色体衍生的序列的9935-bp DNA片段(图2A)，和含有9709-bp HIV-1基因组加上其侧翼2染色体衍生的467-bp的10176-bp片段(图9A、B)通过亲本对照或空载体(U6-CAG)U1细胞的长片段PCR分析鉴定。226-bp和467-bp片段分别代表来自染色体X和2的其他拷贝(其缺乏整合的前病毒DNA)的预测区段。在表达LTR-A/B gRNA和Cas9的U1细胞中，我们在染色体X中发现了两个另外的833bp和670bp的DNA片段，并且在染色体2中发现了一个另外的1102-bp片段。因此，gRNA A/B使Cas9能够切除两条染色体中的跨越HIV-1 5'-3'LTR的病毒基因组区段。833-bp片段包括来自宿主基因组的预期的226-bp和在LTR-A位点周围具有27-bp缺失的607-bp病毒LTR序列(图2A-B)。670-Bp片段包括226-bp宿主序列和190-bp片段切除后残留的444-bp病毒LTR序列(图1D)，这由两个LTR处的gRNA-A/B指导的切割引起(图2A)。由于环状LTR在亲本U1细胞中不存在所以这些另外的片段不通过环状LTR整合出现，并且这种环状LTR病毒基因组构型在HIV-1感染后立即发生，但是存在短暂并且不能耐受重复传代。通过功能性p24ELISA复制测定(图2C)和实时PCR分析(图9C，图9D)显示，这些细胞表现出显著降低的HIV-1病毒载荷。可检测但低残留的病毒载荷和再活化可能由细胞群体异质性和/或不完整的基因组编辑引起。我们还使用流式细胞术分析、SURVEYOR测定和PCR基因分型(图10)，验证了含有整合的HIV-R7/E-/EGFP的潜伏感染的J-Lat T细胞中由Cas9/LTR-A/B gRNA造成的HIV-1基因组的消融，支持以前关于Cas9/gRNA和ZFN在Jurkat T细胞中HIV-1前病毒缺失的报道结果。总而言之，我们的结果表明，多重LTR-gRNA/Cas9系统有效地抑制典型的具有人类潜伏HIV-1感染的潜伏HIV-1感染的“储库”(小神经胶质、单核和T)细胞中和TZM-bI细胞中对检测HIV-1转录和再活化高度敏感的HIV-1复制和再活化。靶向5'-和3'-LTR的单一或多重gRNA有效地消除了整个HIV-1基因组。

实例4：Cas9加LTR-A/B的稳定表达接种TZM-bI细胞对抗新的HIV-1病毒感染

我们接下来测试了使用稳定的表达Cas9/gRNA-A和-B的基于TZM-bI克隆，组合的Cas9/LTR gRNA是否可以来使细胞免疫对抗HIV-1感染(图3A)。7个嘌呤霉素选择的亚克隆中的两个展示了跨越190-bp LTR-A/B位点的DNA片段的有效切除(图3B)。然而，剩余的5个亚克隆没有显示出切除(图3B)，并且没有显示出通过Sanger测序证实的插入缺失突变。使用靶向Cas9和U6-LTR的引物进行的PCR基因分型表明，这些无效亚克隆均没有保留Cas9/LTR-A/B gRNA表达盒的整合拷贝(图11A，图11B)。结果，没有检测到全长Cas9的表达(图11C，图11D)。Cas9/LTR-A/B gRNA的长期表达不会不利地影响细胞生长或活力，表明在该模型中对宿主基因组的脱靶干扰或Cas9诱导的毒性的发生率低。我们通过用VSVG-假型pNL4-3-ΔE-EGFP报告病毒感染细胞来评估从头HIV-1复制，通过流式细胞术的EGFP阳性指示HIV-1复制。与对照U6-CAG细胞不同，稳定表达Cas9/gRNA LTR-A/B的细胞在感染后2天不能支持HIV-1复制，表明针对新的HIV-1感染对它们进行了免疫(图3C和图3D)。在用天然T-嗜性X4菌株pNL4-3-ΔE-EGFP报告病毒(图12A)或天然M-嗜性R5菌株(例如SF162和JRFL)感染的表达Cas/LTR-A/B gRNA的细胞中观察到对抗HIV-1类似的免疫力(图12B、图12C和图12D)。

实例5：Cas9/LTR-A/B对人类基因组的脱靶效应

Cas9/gRNA作为介入途径的吸引力取决于其高度特异的中靶产生插入缺失的切割，但多重gRNA可能潜在地导致宿主基因组诱变发生和染色体病症、细胞毒性、基因毒性或肿瘤发生。相当低的病毒-人类基因组同源性降低了这种风险，但人类基因组含有大量内源性逆转录病毒基因组，这些基因组对HIV-1指导的gRNA有潜在的易感性。因此，我们评估了选定的HIV-1LTR gRNA对人类基因组的脱靶效应。因为离原型间隔子邻近基序(PAM)区域(NGG)最近的12-14bp种子序列对于切割特异性是关键的，所以我们搜索了>14-bp种子+NGG，并且没有发现LTR gRNA A-D的脱靶候选位点(图13)。不足为奇的是，逐渐缩短的gRNA片段产生与相应的中靶序列100％匹配的增加的脱靶切割位点(即NGG+13bp分别产生6个、0个、2个和9个脱靶位点，而NGG+12、bp产生16个、5个、16个和29个；图13)。从人类基因组DNA中，我们使用高保真PCR获得覆盖预测的脱靶位点之一的500-800-bp序列，并通过SURVEYOR和Sanger测序分析潜在的突变。我们未发现突变(参见TZM-bI和U1细胞中的代表性脱靶位点#1、5和6；图4A)。

为了全面评估脱靶效应的风险，我们使用稳定的表达Cas9/gRNA A/B的细胞和对照U6-CAG TZM-bI细胞(图4B、图4C和图4D)进行全基因组测序(WGS)。我们使用具有人类(hg19)和HIV-1基因组作为参考序列使用基因组分析工具包(GATK，v.2.8.1)，鉴定了676,105个插入缺失。在这些插入缺失中，24％在U6-CAG对照中发生，26％在LTR-A/B亚克隆中发生，并且50％在两者中发生(图4B)。这种实质性的样品间插入缺失-调用差异表明可能的脱靶效应，但最可能表明来自其有限的置信度、有限的WGS覆盖率(15-30X)和细胞异质性的结果。GATK只报告了确信地确认的插入缺失：一些在U6-CAG对照而不是LTR-A/B亚克隆中被发现，而其他的在LTR-A/B而不是在U6-CAG中被发现。由于有限的WGS覆盖，我们预计这两个样品都会有大量错失的插入缺失调用。这种有限的插入缺失-调用置信度也意味着可能出现假阴性：在LTR-A/B中而不是U6-CAG对照中发生了错失的插入缺失。细胞异质性可能反映了Cas9/gRNA编辑效率的变异性和传代效应。因此，我们通过针对HIV-1基因组的LTR-A/-B靶位点和宿主基因组的经预测/潜在的gRNA脱靶位点分析侧翼于每个插入缺失的±300bp来测试每个插入缺失是否是LTR-A/B gRNA-诱导的(图15)。对于与包含种子(12-bp)加NRG的序列100％匹配的序列，针对676,105个插入缺失我们仅鉴定了92个潜在脱靶位点的8个重叠区域:6个插入缺失发生在两样品中，并且仅2个发生在U6-CAG对照中(图4C，图4D)。我们还鉴定了2个仅在LTR-A/B亚克隆中发生而正如预期的那样不在U6-CAG对照中发生的HIV-1LTR上的插入缺失(图4C)。结果表明，LTR-A/B gRNA诱导所示的中靶插入缺失而不是脱靶插入缺失，这与使用覆盖预测的/潜在脱靶位点的PCR产物的深度测序的先前发现一致。

我们的组合的方法最大限度地减少了脱靶效应，同时实现了基因组整合的HIV-1前病毒的高效和完全消融。除了外源病毒基因组与宿主细胞基因组(包括内源性逆转录病毒DNA)之间极低的同源性之外，我们研究中的关键设计属性还包括：生物信息学筛选，使用最严格的12-bp+NGG靶标选择标准以排除脱靶人转录组或(甚至很少的)未翻译的基因组位点；避免HIV-1LTR启动子(可能在宿主基因组中是保守的)内的转录因子结合位点；选择LTR-A-和-B-指导的30-bp gRNA以及反映原始细菌免疫机制的前crRNA系统以提高对比基于20-bp gRNA的嵌合crRNA-tracRNA的系统的特异性/效率；以及WGS、Sanger测序和SURVEYOR测定，以鉴定和排除潜在的脱靶效应。事实上，使用新开发的Cas9双切口和RNA指导的FokI核酸酶可以进一步帮助识别具有减少的脱靶效应的HIV-1的各种保守区域内的新靶标。

我们的研究表明，HIV-1Cas9/gRNA系统具有靶向位于不同染色体上的LTR的不止一个拷贝的能力，表明该基因组编辑系统可以改变具有多种前病毒DNA的潜伏感染的患者细胞中HIV-1的DNA序列。为了进一步确保高编辑效率和我们技术的一致性，可以将HIV-1基因组最稳定的区域作为消除患者样本中HIV-1的靶标，这些样本可能不止携带一种HIV-1菌株。或者，可以在工程化治疗性Cas9/gRNA分子之前基于来自患者衍生的病毒基因组的深度测序的数据开发个性化治疗方式。

我们的结果还表明，Cas9/gRNA基因组编辑可用于使细胞免疫对抗HIV-1感染。预防性疫苗接种不依赖于HIV-1菌株的多样性，因为系统靶向基因组序列，而不管病毒如何进入感染的细胞。细胞中Cas9/gRNA系统的先前存在导致新的HIV-1在整合入宿主基因组之前被迅速消除。可以探索用于免疫高风险受试者的Cas9/LTR-gRNA的递送(例如基因疗法(病毒载体和纳米颗粒))和用于消除HIV-1感染的自体Cas9/gRNA修饰的骨髓干/祖细胞或诱导性多能干细胞的移植的各种系统。

在这里，我们展示了Cas9/gRNA在编辑HIV-1靶基因组中的高特异性。来自亚克隆数据的结果揭示了基因组编辑对Cas9和gRNA二者都存在的严格依赖性。此外，设计的gRNA靶标中的仅一个核苷酸错配将使编辑效力失效。此外，我们所设计的4种LTR gRNA均可与不同的细胞系配合使用，表明编辑在HIV-1基因组中的效率高于宿主细胞基因组，其中并非所有设计的gRNA都是功能性的，这可能是由于不同的表观遗传调节、可变的基因组可及性或其他原因。考虑到Cas9/gRNA开发的简易性和快速性，即使HIV-1突变赋予对一种基于Cas9/gRNA的疗法的抗性，如上所述，可以对HIV-1变体进行基因分型以使针对个体患者的另一种个性化疗法成为可能。

已经描述了本发明的许多实施例。然而，应理解的是，在不偏离本发明主旨和范围的情况下，可做出诸多改变。因此，其他实施例也处于以下权利要求书的范围内。

参考文献

Alvarez-Erviti L,Seow Y,Yin H,Betts C,Lakhal S,MJA Wood.Delivery ofsiRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes.NatureBiotechnol.2011,29:341-345.

Kleinstiver BP,Pattanayak,Prew MS,Tsai SQ,Nguyen NT,Zheng Z,JoungJK.High-fidelity CRISPR–Cas9nucleases with no detectable genome-wide off-target effects,Nature(2016).DOI:10.1038/nature16526.

Kooijmans SAA,Vader P,Dommelen SM,van Solinge WW,Raymond MSchiffelers RM.Exosome mimetics:a novel class of drug deliverysystems.Int.J.Nanomed.2012,7:1525-1541.

Marcus ME,and Leonard JN.FedExosomes:Engineering therapeuticbiological nanoparticles that truly deliver.Pharmaceuticals 2103,6:659-680.

Shtam TA,Kovalev RA,Varfolomeeva EY,Makarov EM,Kil YV,FilatovMV.Exosomes are natural carriers of exogenous siRNA to human cells invitro.Cell Communication and Signaling 2013,11:88(http://www.biosignaling.com/content/11/1/88).

Slaymaker IM,Gao L,Zetsche B,Scott DA,Yan WX,Feng Zhang F.Rationallyengineered Cas9nucleases with improved specificity.Published online 1December 2015[DOI:10.1126/science.aad5227].

Sun W,Jiang T,Yue Lu Y,Reiff M,Mo R,Zhen Gu Z.Cocoon-like self-degradable DNA nanoclew for anticancer drug delivery.J.Am.Chem.Soc.2014,136:14722–14725.

Sun W,Ji W,Hall JM,Hu Q,Wang C,Beisel CL,Gu Z.Self-assembled DNAnanoclews for the efficient delivery of CRISPR-Cas9for genomeediting.Angew.Chem.Int.Ed.2015:12029-12033.

Claims

1.一种使整合到被逆转录病毒潜伏感染的宿主细胞基因组中的前病毒DNA失活的方法，所述方法包括以下步骤：

用包含规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)相关内切核酸酶和两种或更多种不同指导RNA(gRNA)的组合物处理所述宿主细胞，其中所述至少两种gRNA中的每一种与所述前病毒DNA的长末端重复序列(LTR)中的不同靶核酸序列互补；和

使所述前病毒DNA失活。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述处理宿主细胞的步骤包括以下步骤：

将所述宿主细胞暴露于组合物，所述组合物包含编码所述CRISPR相关内切核酸酶的分离的核酸；编码具有第一间隔子序列的第一gRNA的分离的核酸序列，所述第一间隔子序列与前病毒DNA中的第一靶前间隔子序列互补；和编码具有第二间隔子序列的第二gRNA的分离的核酸，所述第二间隔子序列与所述前病毒DNA中的第二靶前间隔子序列互补；

在所述宿主细胞中表达所述CRISPR相关内切核酸酶、所述第一gRNA和所述第二gRNA；

在所述宿主细胞中组装包含所述CRISPR相关内切核酸酶和所述第一gRNA的第一基因编辑复合物；和包含所述CRISPR相关内切核酸酶和所述第二gRNA的第二基因编辑复合物；

通过所述第一间隔子序列和所述第一靶前间隔子序列之间的互补碱基配对将所述第一基因编辑复合物引导至所述第一靶前间隔子序列；

通过所述第二间隔子序列和所述第二靶前间隔子序列之间的互补碱基配对将所述第二基因编辑复合物引导至所述第二靶前间隔子序列；

用所述CRISPR相关内切核酸酶切割所述第一靶前间隔子序列处的所述前病毒DNA；

用所述CRISPR相关内切核酸酶切割所述第二靶前间隔子序列处的所述前病毒DNA；和

在所述前病毒DNA中诱导至少一个突变。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一靶前间隔子序列和所述第二靶前间隔子序列中的至少一个位于所述LTR的U3区域内。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述逆转录病毒选自由HIV-1、HIV-2和SIV组成的组。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述逆转录病毒是HIV-1，并且所述第一间隔子序列和所述第二间隔子序列各自包括与选自下组的靶前间隔子序列互补的序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:87、和SEQ ID NO:110。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述逆转录病毒是HIV-1，并且所述第一间隔子序列和所述第二间隔子序列分别包括与靶前间隔子序列SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:121互补的序列。

7.根据权利要求4所述的方法，其中所述逆转录病毒是HIV-1，并且所述第一间隔子序列和所述第二间隔子序列各自分别包括与靶前间隔子序列SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:110互补的序列。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述CRISPR相关内切核酸酶选自野生型Cas9；人优化的Cas9；切口酶突变型Cas9，SpCas9(K855A)；SpCas9(K810A/K1003A/R1060A)；SpCas9(K848A/K1003A/R1060A)；SpCas9 N497A，R661A，Q695A，Q926A；SpCas9 N497A，R661A，Q695A，Q926A，D1135E；SpCas9 N497A，R661A，Q695A，Q926A L169A；SpCas9 N497A，R661A，Q695A，Q926A Y450A；SpCas9 N497A，R661A，Q695A，Q926A M495A；SpCas9 N497A，R661A，Q695A，Q926A M694A；SpCas9 N497A，R661A，Q695A，Q926A H698A；SpCas9 N497A，R661A，Q695A，Q926A，D1135E，L169A；SpCas9 N497A，R661A，Q695A，Q926A，D1135E，Y450A；SpCas9N497A，R661A，Q695A，Q926A，D1135E，M495A；SpCas9 N497A，R661A，Q695A，Q926A，D1135E，M694A；SpCas9 N497A，R661A，Q695A，Q926A，D1135E，M698A；SpCas9R661A，Q695A，Q926A；SpCas9 R661A，Q695A，Q926A，D1135E；SpCas9 R661A，Q695A，Q926A，L169A；SpCas9 R661A，Q695A，Q926A Y450A；SpCas9 R661A，Q695A，Q926A M495A；SpCas9 R661A，Q695A，Q926AM694A；SpCas9 R661A，Q695A，Q926A H698A；SpCas9 R661A，Q695A，Q926A D1135E L169A；SpCas9 R661A，Q695A，Q926A D1135E Y450A；SpCas9 R661A，Q695A，Q926A D1135E M495A；或SpCas9 R661A，Q695A，Q926A，D1135E，M694A。

9.根据权利要求2所述的方法，其中编码CRISPR相关内切核酸酶、所述第一gRNA和所述第二gRNA的分离的核酸在至少一种表达载体中编码。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述至少一种表达载体选自下组，该组由以下组成：质粒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述gRNA中的至少一种包含CRISPR RNA(crRNA)和反式激活的小RNA(tracrRNA)，二者作为单独的核酸表达。

12.根据权利要求1所述的方法，其中将所述gRNA中的至少一种工程化为由crRNA和tracrRNA组成的人工融合小指导RNA(sgRNA)。

13.根据权利要求2所述的方法，其中所述在前病毒RNA中诱导至少一个突变的步骤被进一步定义为诱导至少一个插入、至少一个缺失、至少一个点突变、或其组合。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述在前病毒RNA中诱导至少一个突变的步骤被进一步定义为诱导切除在所述第一靶前间隔子序列和所述第二靶前间隔子序列之间延伸的前病毒DNA序列。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述在宿主细胞中表达所述CRISPR相关内切核酸酶、所述第一gRNA和所述第二gRNA的步骤被进一步定义为在所述宿主细胞中稳定表达所述CRISPR相关内切核酸酶、所述第一gRNA和所述第二gRNA，并且所述方法另外包括免疫所述宿主细胞以对抗新的逆转录病毒感染的步骤。

16.根据权利要求1所述的方法，其中被逆转录病毒潜伏感染的所述宿主细胞是CD4+T细胞、巨噬细胞、单核细胞、肠相关淋巴样细胞、小神经胶质细胞或星形胶质细胞。

17.一种用于使整合到被逆转录病毒潜伏感染的宿主细胞基因组中的前病毒DNA失活的组合物，所述组合物包含：

编码规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)相关内切核酸酶的分离的核酸；

编码具有第一间隔子序列的第一指导RNA(gRNA)的分离的核酸序列，所述第一间隔子序列与前病毒DNA中的第一靶前间隔子序列互补；和

编码具有第二间隔子序列的第二gRNA的分离的核酸序列，所述第二间隔子序列与所述前病毒DNA中的第二靶前间隔子序列互补，其中所述第一靶前间隔子序列和所述第二靶前间隔子序列位于所述前病毒DNA的长末端重复序列(LTR)中。

18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述第一间隔子序列和所述第二间隔子序列各自包括与选自下组的靶前间隔子序列互补的序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:96、SEQID NO:121、SEQ ID NO:87、和SEQ ID NO:110。

19.根据权利要求17所述的组合物，其中所述第一间隔子序列和所述第二间隔子序列分别包括与靶前间隔子序列SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:121互补的序列。

20.根据权利要求17所述的组合物，其中所述第一间隔子序列和所述第二间隔子序列各自分别包括与靶前间隔子序列SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:110互补的序列。

21.根据权利要求17所述的组合物，其中所述CRISPR相关内切核酸酶选自野生型Cas9；人优化的Cas9；切口酶突变型Cas9，SpCas9(K855A)；SpCas9(K810A/K1003A/R1060A)；SpCas9(K848A/K1003A/R1060A)；SpCas9 N497A，R661A，Q695A，Q926A；SpCas9 N497A，R661A，Q695A，Q926A，D1135E；SpCas9 N497A，R661A，Q695A，Q926A L169A；SpCas9 N497A，R661A，Q695A，Q926A Y450A；SpCas9 N497A，R661A，Q695A，Q926A M495A；SpCas9 N497A，R661A，Q695A，Q926A M694A；SpCas9 N497A，R661A，Q695A，Q926A H698A；SpCas9 N497A，R661A，Q695A，Q926A，D1135E，L169A；SpCas9 N497A，R661A，Q695A，Q926A，D1135E，Y450A；SpCas9 N497A，R661A，Q695A，Q926A，D1135E，M495A；SpCas9 N497A，R661A，Q695A，Q926A，D1135E，M694A；SpCas9 N497A，R661A，Q695A，Q926A，D1135E，M698A；SpCas9 R661A，Q695A，Q926A；SpCas9 R661A，Q695A，Q926A，D1135E；SpCas9 R661A，Q695A，Q926A，L169A；SpCas9R661A，Q695A，Q926A Y450A；SpCas9 R661A，Q695A，Q926A M495A；SpCas9 R661A，Q695A，Q926A M694A；SpCas9 R661A，Q695A，Q926A H698A；SpCas9 R661A，Q695A，Q926A D1135EL169A；SpCas9 R661A，Q695A，Q926A D1135E Y450A；SpCas9 R661A，Q695A，Q926A D1135EM495A；和SpCas9 R661A，Q695A，Q926A，D1135E，M694A。