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CN106047916A - 生产5‑氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株及构建及应用 - Google Patents

生产5‑氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株及构建及应用 Download PDF

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CN106047916A
CN106047916A CN201610408674.4A CN201610408674A CN106047916A CN 106047916 A CN106047916 A CN 106047916A CN 201610408674 A CN201610408674 A CN 201610408674A CN 106047916 A CN106047916 A CN 106047916A
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ala
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王智文
冯丽丽
陈涛
赵学明
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Tianjin University
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Abstract

本发明公开了生产5‑氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株及构建及应用，构建方法为：(1)在谷氨酸棒杆菌中敲除乳酸脱氢酶编码基因ldhA和乙酸生成基因pta‑ackA、pqo和cat，得到的菌株命名为CB4；在CB4菌株中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc前面插入强的sod启动子，得到菌株CB5；在CB5菌株中敲除基因pck，得到菌株CB6；(2)将质粒pXA和质粒pEP2tuf‑rhtA转入到CB6菌株中。本发明构建的菌株在以10g/L葡萄糖为碳源的培养基中能够生产2.78g/L 5‑氨基乙酰丙酸，这为后续发酵罐连续补料提高5‑氨基乙酰丙酸的产量和产率奠定了基础。

Description

生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株及构建及应用
技术领域
本发明属生物工程技术与应用领域，具体地涉及一种生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株及构建及应用。
背景技术
5-氨基乙酰丙酸，分子量为131.13，熔点为118℃。是一种非蛋白氨基酸。5-氨基乙酰丙酸具有副作用小、渗透性好的的特点，已经被广泛的应用于皮肤癌、膀胱癌、消化道癌、肺癌的诊断以及光动力治疗(PDT)中。同时，5-氨基乙酰丙酸在农业上也有很重要的应用如作为植物生长调节剂、除草剂和绿色农药等。
在自然界中，5-氨基乙酰丙酸生物合成主要有以下两条途径：即C4途径和C5途径。C4途径是由琥珀酰CoA和甘氨酸在5-氨基乙酰丙酸合酶作用下缩合生成5-氨基乙酰丙酸，这条途径存在于动物、真菌和非硫光合细菌中。而C5途径则是在tRNA参与下，经过三步反应催化生成5-氨基乙酰丙酸，该途径广泛存在于植物、藻类以及细菌中，包括大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌。
目前，仅有少量关于谷氨酸棒杆菌利用C5途径生产5-氨基乙酰丙酸的报道，但是该途径比较复杂，5-氨基乙酰丙酸的产量和得率都很低。
据检索，现在尚未有关于谷氨酸棒杆菌利用C4途径生产5-氨基乙酰丙酸的报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株的构建方法。
本发明的第二个目的是提供一种生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株。
本发明的第三个目的是提供一种生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株的应用。
本发明的技术方案概述如下：
一种生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株的构建方法，包括如下步骤：
(1)在谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)ATCC 13032中敲除乳酸脱氢酶编码基因ldhA和乙酸生成基因pta-ackA、pqo和cat，得到的菌株命名为CB4；在CB4菌株中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc前面插入强的sod启动子，得到菌株CB5；在CB5菌株中敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pck，得到菌株CB6；
(2)将构建好的过表达5-氨基乙酰丙酸合酶基因的质粒pXA和过表达RhtA运输蛋白的质粒pEP2tuf-rhtA转入到CB6菌株中，获得生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株AL2。
上述方法构建的生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株AL2。
上述生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株AL2发酵生产5-氨基乙酰丙酸的用途。有益效果
本发明构建了一株利用C4途径生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株，该菌株在以10g/L葡萄糖为碳源的培养基中能够生产2.78g/L 5-氨基乙酰丙酸，这为后续发酵罐连续补料提高5-氨基乙酰丙酸的产量和产率奠定了基础。
附图说明
图1为基因操作靶点。
图2A为质粒pXA的酶切验证图谱，图2B为质粒pEP2tuf-rhtA酶切验证图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但对本发明不作任何限制。
本发明所用到的：
原始菌株谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)ATCC 13032购于ATCC(American TypeCulture Collection，http://www.atcc.org/)；
E.coli MG1655购于CGSC(Coli Genetic Stock Center，http://cgsc.biology.yale.edu/)。
原始质粒pK18mobsacB、pEC-XK99E、pXMJ19和pEP2购买于BioVector NTCC公司(http://www.biovector.net/)。
5-氨基乙酰丙酸标准品从sigma公司(http://www.sigmaaldrich.com/sigma-aldrich)购买。所用限制性内切酶、去磷酸化酶、DNA连接酶等分子生物学试剂从Thermo公司购买(http://www.thermoscientificbio.com/fermentas)，所用其他生化试剂从生工生物工程(上海)股份有限公司购买(http://www.sangon.com/)。
实施例1：敲除质粒pD-sacB的构建
首先以HindIII切割后的pK18mobsacB线性片段作为模板，用如下引物sacB-1(SEQID NO.1)/sacB-2(SEQ ID NO.2)扩增sacB基因。将sacB基因片段经过MunI/EcoRV双酶切后与经过EcoRI/SmalI双酶切后的质粒pEC-XK99E进行连接，得到质粒pEC-XK99E-sacB。用如下的引物trcsacB-1(SEQ ID NO.3)/trcsacB-2(SEQ ID NO.4)，以pEC-XK99E-sacB质粒作为模板扩增含有trc启动子的trcsacB片段。
用如下的引物pD-1(SEQ ID NO.5)/pD-2(SEQ ID NO.6)，以pK18mobsacB质粒作为模板扩增含有卡那霉素抗性和大肠杆菌复制子的pD片段，最后将经过AatII酶切的片段trcsacB和经过相同酶切的pD片段进行连接，得到质粒pD-sacB。
实施例2：乳酸脱氢酶编码基因ldhA的敲除和乙酸生成途径基因pta-ackA、pqo和cat的敲除
乳酸脱氢酶编码基因ldhA的敲除：
以谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)ATCC 13032基因组为模板，以ldh-1(SEQ IDNO.7)/ldh-2(SEQ ID NO.8)为引物扩增基因ldhA的上游片段，ldh-3(SEQ ID NO.9)/ldh-4(SEQ ID NO.10)为引物扩增基因ldhA的下游片段。将两个片段切胶回收后，以等摩尔比例的片段为模板，以ldh-1/ldh-4为引物，扩增得到两个片段的融合产物。将融合后的片段用EcoRI/HindIII双酶切与经过同样双酶切后的pD-sacB连接，得到质粒pD-ldhA。
将pD-ldhA质粒转入到谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)ATCC 13032中，用卡那霉素筛选重组成功的阳性克隆，挑出的转化子接种于5mL BHIS液体培养基中，30℃，220rpm过夜培养，将菌液稀释一定的倍数涂布在BHIS-Sucrose固体平板上。将平板上长出的菌落对点无抗的BHIS固体平板和含有25μg/mL卡那霉素的BHIS固体平板。选择在无抗平板上生长而卡那霉素平板不生长的菌落接种到5mL BHIS液体培养基中，提取基因组，使用引物ldh-1/ldh-4进行PCR验证，得到ldhA基因敲除菌株CB1。
pta-ackA操纵子的敲除
以C.glutamicum ATCC13032基因组为模板，以ackA-1(SEQ ID NO.11)/ackA-2(SEQ ID NO.12)为引物扩增操纵子pta-ackA的上游片段，ackA-3(SEQ ID NO.13)/ackA-4(SEQ ID NO.14)为引物扩增操纵子pta-ackA的下游片段。将两个片段切胶回收后，以等摩尔比例的片段为模板，以ackA-1/ackA-4为引物，扩增得到两个片段的融合产物。将融合后的片段用SalI/XbaI双酶切与经过同样双酶切后的pD-sacB质粒连接，得到pta-ackA操纵子敲除质粒pD-pta。
将pD-pta质粒转入到菌株CB1中，用卡那霉素筛选重组成功的阳性克隆，挑出的转化子接种于5mL BHIS液体培养基中，30℃，220rpm过夜培养，将菌液稀释一定的倍数涂布在BHIS-Sucrose固体平板上。将平板上长出的菌落对点无抗的BHIS固体平板和含有25μg/mL卡那霉素的BHIS固体平板。选择在无抗平板上生长而卡那霉素平板不生长的菌落接种到5mL BHIS液体培养基中，提取基因组，使用引物ackA-1/ackA-4进行PCR验证，得到pta-ackA操纵子敲除菌株CB2。
pqo基因的敲除
以C.glutamicum ATCC13032基因组为模板，以pqo-1(SEQ ID NO.15)/pqo-2(SEQID NO.16)为引物扩增pqo基因的上游片段，pqo-3(SEQ ID NO.17)/pqo-4(SEQ ID NO.18)为引物扩增pqo的下游片段。将两个片段切胶回收后，以等摩尔比例的片段为模板，以pqo-1/pqo-4为引物，扩增得到两个片段的融合产物。将融合后的片段用XbaI/PstI双酶切与经过同样双酶切后的pD-sacB连接，得到pqo基因的敲除质粒pD-pqo。
将pD-pqo质粒转入到菌株CB2中，用卡那霉素筛选重组成功的阳性克隆，挑出的转化子接种于5mL BHIS液体培养基中，30℃，220rpm过夜培养，将菌液稀释一定的倍数涂布在BHIS-Sucrose固体平板上。将平板上长出的菌落对点无抗的BHIS固体平板和含有25μg/mL卡那霉素的BHIS固体平板。选择在无抗平板上生长而卡那霉素平板不生长的菌落接种到5mL BHIS液体培养基中，提取基因组，使用引物pqo-1/pqo-4进行PCR验证，得到pqo基因的敲除菌株CB3。
cat基因的敲除
以C.glutamicum ATCC13032基因组为模板，以cat-1(SEQ ID NO.19)/cat-2(SEQID NO.20)为引物扩增cat基因的上游片段，cat-3(SEQ ID NO.21)/cat-4(SEQ ID NO.22)为引物扩增cat的下游片段。将两个片段切胶回收后，以等摩尔比例的片段为模板，以cat-1/cat-4为引物，扩增得到两个片段的融合产物。将融合后的片段用XbaI/SalI双酶切与经过同样双酶切后的pD-sacB连接，得到cat基因的敲除质粒pD-cat。
将pD-cat质粒转入到菌株CB3中，用卡那霉素筛选重组成功的阳性克隆，挑出的转化子接种于5mL BHIS液体培养基中，30℃，220rpm过夜培养，将菌液稀释一定的倍数涂布在BHIS-Sucrose固体平板上。将平板上长出的菌落对点无抗的BHIS固体平板和含有25μg/mL卡那霉素的BHIS固体平板。选择在无抗平板上生长而卡那霉素平板不生长的菌落接种到5mL BHIS液体培养基中，提取基因组，使用引物cat-1/cat-4进行PCR验证，得到cat基因的敲除菌株CB4。
其中BHIS培养基成分为(g/L)：牛脑心浸粉37，山梨醇91。
BHIS固体培养基成分为(g/L)：牛脑心浸粉37，山梨醇91，琼脂2％(W/V)
BHIS-Sucrose固体培养基(g/L)：牛脑心浸粉37，山梨醇91，琼脂2％(W/V)，蔗
糖10％(W/V)。
实施例3：在ppc基因前面插入强的sod启动子和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pck基因的敲除
ppc基因前面插入强的sod启动子
以C.glutamicum ATCC13032基因组为模板，以ppc-1(SEQ ID NO.23)/ppc-2(SEQID NO.24)为引物扩增基因ppc的上游片段。sod-1(SEQ ID NO.25)/sod-2(SEQ ID NO.26)用于扩增sod基因的启动子。ppc-3(SEQ ID NO.27)/ppc-4(SEQ ID NO.28)用于扩增ppc基因的下游片段，分别将3个片段切胶回收后，以等摩尔比例的片段为模板，用ppc-1/ppc-4为引物，扩增得到三个片段的融合产物。将融合后的片段用XbaI/HindIII双酶切后与经过同样双酶切后的质粒载体pD-sacB连接。得到质粒pD-ppc。
将构建好的质粒利用电转转入到菌株CB4中，用卡那霉素筛选重组成功的阳性克隆，挑出的转化子接种于5mL BHIS液体培养基中，30℃，220rpm过夜培养，将菌液稀释一定的倍数涂布在BHIS-Sucrose固体平板上。将平板上长出的菌落对点无抗的BHIS固体平板和含有25μg/mL卡那霉素的BHIS固体平板。将在无抗平板上生长而卡那霉素平板不生长的菌落接种到5mL BHIS液体培养基中，提取基因组，送测序，得到在ppc基因前面插入sod启动子的菌株CB5。
pck基因的敲除
以C.glutamicum ATCC 13032基因组为模板，用如下引物进行PCR扩增。pck-1(SEQID NO.29)/pck-2(SEQ ID NO.30)用于扩增基因pck的上游片段。pck-3(SEQ ID NO.31)/pck-4(SEQ ID NO.32)用于扩增基因pck的下游片段。将上游片段经过EcoRI/XbaI双酶切后与经过相同双酶切后的pD-sacB质粒连接，得到质粒pD-pck(F)，将构建的质粒pD-pck(F)经过PstI/HindIII双酶切后与经过PstI/HindIII双酶切的下游片段进行连接，得到pD-pck质粒。
将该质粒转入到菌株CB5中，用卡那霉素筛选重组成功的阳性克隆，挑出的转化子接种于5mL BHIS液体培养基中，30℃，220rpm过夜培养，将菌液稀释一定的倍数涂布在BHIS-Sucrose固体平板上。将平板上长出的菌落对点无抗的BHIS固体平板和含有25μg/mL卡那霉素的BHIS固体平板。将在无抗平板上生长而卡那霉素平板不生长的菌落接种到5mLBHIS液体培养基中，提取基因组，使用引物pck-1/pck-4进行PCR验证，得到pck基因的敲除菌株CB6。
实施例4：质粒pXA和pEP2tuf-rhtA的构建
pXA质粒的构建
将类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的5-氨基乙酰丙酸合酶基因hemA根据谷氨酸棒杆菌的密码子偏好性进行密码子优化，将优化后的基因用全基因合成的方法进行合成(如SEQ ID NO.39所示)，利用引物hemA-1(SEQ ID NO.33)/hemA-2(SEQ ID NO.34)扩增优化后的hemA片段，将得到的hemA片段经过PstI/XbaI双酶切后与经过相同双酶切后的穿梭质粒pXMJ19连接，得到pXA质粒，图2A为质粒pXA的酶切验证图谱。
以C.glutamicum ATCC 13032基因组为模板，用tuf-1(SEQ ID NO.35)/tuf-2(SEQID NO.36)为引物扩增tuf启动子，将tuf片段用EcoRI/SalI酶切后与经过相同酶切的pEP2质粒连接，得到带有tuf启动子的低拷贝质粒pEP2tuf。以E.coli MG1655基因组为模板，用rhtA-1(SEQ ID NO.37)/rhtA-2(SEQ ID NO.38)为引物扩增rhtA片段，将片段用XbaI/BamHI双酶切后与经过相同酶切的pEP2tuf质粒进行连接，得到pEP2tuf-rhtA质粒，图2B为质粒pEP2tuf-rhtA酶切验证图谱。
将构建好的pXA质粒导入到菌株CB6中，利用氯霉素进行筛选，得到带有pXA质粒的菌株AL1。将构建好的pEP2tuf-rhtA质粒利用电转导入到AL1中，利用氯霉素和卡那霉素进行筛选，得到最终的5-氨基乙酰丙酸生产菌株AL2。
本发明涉及的基因操作见图1，图1中“X”表示敲除，下划线表示过表达。
表1菌株构建所用引物序列
实施例5：利用构建的菌株进行5-氨基乙酰丙酸的摇瓶发酵
将构建好的菌株AL2在摇瓶中进行发酵。
具体发酵方式如下
接种方式为：首先在BHIS固体平板上活化菌株，在30℃培养至菌落可视时，挑单菌落接种至装有5mL终浓度为25μg/mL的硫酸卡那霉素和终浓度为10μg/mL的氯霉素的BHIS液体培养基中培养15h后，转接到M1培养基中，在培养至对数中后期时，将种子接种到M2培养基中。培养基中添加终浓度为0.5mM的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷作为诱导剂。发酵结束后检测生成5-ALA的产量为2.78g/L。
M1培养基成分为(g/L)：葡萄糖10，酵母抽提物10，胰蛋白胨10，NaCl 2.5。
M2培养基成分为(g/L)：葡萄糖10，酵母抽提物10，胰蛋白胨10，NaCl 2.5，3-(N-吗啉)丙磺酸21，甘氨酸7.5。

Claims (3)

1.一种生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株的构建方法，其特征是包括如下步骤：
(1)在谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)ATCC 13032中敲除乳酸脱氢酶编码基因ldhA和乙酸生成基因pta-ackA、pqo和cat，得到的菌株命名为CB4；在CB4菌株中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc前面插入强的sod启动子，得到菌株CB5；在CB5菌株中敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pck，得到菌株CB6；
(2)将构建好的过表达5-氨基乙酰丙酸合酶基因的质粒pXA和过表达RhtA运输蛋白的质粒pEP2tuf-rhtA转入到CB6菌株中，获得生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株AL2。
2.权利要求1所述的方法构建的生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株AL2。
3.权利要求2的生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株AL2的用途。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106434513A (zh) * 2016-11-09 2017-02-22 天津大学 生产5‑氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌重组菌株
CN106434514A (zh) * 2016-11-09 2017-02-22 天津大学 生产5‑氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌工程菌株
CN107012161A (zh) * 2017-04-03 2017-08-04 天津大学 利用秸秆水解液高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌及构建及应用
CN108517327A (zh) * 2018-04-20 2018-09-11 中国科学院天津工业生物技术研究所 5-氨基乙酰丙酸高产菌株及其制备方法和应用
WO2020186326A1 (pt) * 2019-03-21 2020-09-24 De Leao Rosenmann Bernardo Formulações cosméticas constituídas por uma mistura nutritiva proveniente de um processo fermentativo
WO2020232519A1 (pt) * 2019-05-22 2020-11-26 De Leao Rosenmann Bernardo Composto nutritivo formado pelo conteúdo de fermentação bacteriana para uso como suplemento ou aditivo para ração animal
CN115044602A (zh) * 2022-05-23 2022-09-13 天津大学 厌氧合成5-氨基乙酰丙酸谷氨酸棒杆菌的菌株及构建方法
CN115747125A (zh) * 2022-08-07 2023-03-07 中国科学院天津工业生物技术研究所 高产5-氨基乙酰丙酸的工程菌株及5-氨基乙酰丙酸高产菌株的构建方法
CN115975831A (zh) * 2022-09-29 2023-04-18 天津大学 一种高产5-氨基乙酰丙酸酿酒酵母工程菌株及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103710374A (zh) * 2014-01-14 2014-04-09 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种5-氨基乙酰丙酸产生菌株及其制备方法与应用
CN103981203A (zh) * 2013-02-07 2014-08-13 中国科学院天津工业生物技术研究所 5-氨基乙酰丙酸高产菌株及其制备方法和应用
CN104928226A (zh) * 2015-07-17 2015-09-23 山东大学 一株重组谷氨酸棒杆菌及其在生产5-氨基乙酰丙酸中的应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103981203A (zh) * 2013-02-07 2014-08-13 中国科学院天津工业生物技术研究所 5-氨基乙酰丙酸高产菌株及其制备方法和应用
CN103710374A (zh) * 2014-01-14 2014-04-09 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种5-氨基乙酰丙酸产生菌株及其制备方法与应用
CN104928226A (zh) * 2015-07-17 2015-09-23 山东大学 一株重组谷氨酸棒杆菌及其在生产5-氨基乙酰丙酸中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LILI FENG ET AL: "Metabolic Engineering of Corynebacterium glutamicum for Efficient Production of 5-Aminolevulinic Acid", 《BIOTECHNOL. BIOENG》 *
ZHEN KANG ET AL: "Engineering Escherichia coli for efficientproductionof5-aminolevulinicacid from glucose", 《METABOLIC ENGINEERING》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106434513A (zh) * 2016-11-09 2017-02-22 天津大学 生产5‑氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌重组菌株
CN106434514A (zh) * 2016-11-09 2017-02-22 天津大学 生产5‑氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌工程菌株
CN107012161A (zh) * 2017-04-03 2017-08-04 天津大学 利用秸秆水解液高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌及构建及应用
CN108517327A (zh) * 2018-04-20 2018-09-11 中国科学院天津工业生物技术研究所 5-氨基乙酰丙酸高产菌株及其制备方法和应用
WO2020186326A1 (pt) * 2019-03-21 2020-09-24 De Leao Rosenmann Bernardo Formulações cosméticas constituídas por uma mistura nutritiva proveniente de um processo fermentativo
WO2020232519A1 (pt) * 2019-05-22 2020-11-26 De Leao Rosenmann Bernardo Composto nutritivo formado pelo conteúdo de fermentação bacteriana para uso como suplemento ou aditivo para ração animal
CN115044602A (zh) * 2022-05-23 2022-09-13 天津大学 厌氧合成5-氨基乙酰丙酸谷氨酸棒杆菌的菌株及构建方法
CN115747125A (zh) * 2022-08-07 2023-03-07 中国科学院天津工业生物技术研究所 高产5-氨基乙酰丙酸的工程菌株及5-氨基乙酰丙酸高产菌株的构建方法
CN115975831A (zh) * 2022-09-29 2023-04-18 天津大学 一种高产5-氨基乙酰丙酸酿酒酵母工程菌株及其应用

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