CN103403147B - 产腐胺的微生物以及使用此微生物生产腐胺的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种产腐胺的微生物以及一种使用该微生物生产腐胺的方法。更具体来说，本发明涉及一种具有腐胺生产能力的微生物，通过阻断自鸟氨酸至精氨酸的生物合成途径、增加细胞内谷氨酸水平、增强自谷氨酸至鸟氨酸的生物合成途径并引入细胞外鸟氨酸脱羧酶生产腐胺；以及通过使用此微生物生产腐胺的方法。

Description

产腐胺的微生物以及使用此微生物生产腐胺的方法

技术领域

本发明涉及一种产腐胺的微生物以及使用此微生物生产腐胺的方法。

背景技术

多胺是一种在大多数活细胞中存在的物质。属于多胺的亚精胺或精胺可在不同物种例如细菌、真菌和动物中发现。腐胺或1,4-丁二胺是亚精胺或精胺代谢中的前体，可在革兰氏阴性菌或真菌中发现，它在不同物种中以很宽的浓度范围存在，表明其在代谢通路中具有很重要的作用。

腐胺是多胺尼龙-4,6合成中的基本材料，通过腐胺与脂肪酸的反应可生成多胺尼龙-4,6。腐胺在加工塑料的生产中作为原料被使用，它通常通过包括丙烯转换为丙烯腈和琥珀腈的化学合成来生产得到。此化学合成由三步工艺组成，包括消耗大量能量的催化氧化反应、使用有毒化学品例如氰化物的反应以及使用高压氢气的加氢反应。通过化学合成生产腐胺是不环保的，并且还会消耗大量能量导致石油资源枯竭。因此，需要开发涉及生物量利用的更为环保和高能效的方法来进行腐胺生产。

在微生物中，腐胺的生物合成途径与L-精氨酸生物合成途径中自谷氨酸至鸟氨酸的合成步骤相同。腐胺可通过两条途径例如鸟氨酸脱羧或精氨酸脱羧进行合成。这两条途径生成了代谢所需的能量或使细胞获得了对氧化刺激的抗性。现已报道了一种通过转化大肠杆菌和棒状杆菌以高浓度生产腐胺的方法。大肠杆菌中腐胺的生产可通过增加鸟氨酸脱羧酶和谷氨酸乙酰转移酶的表达水平来实现。此外，腐胺可通过去除降解或使用腐胺的亚精胺和乙酰腐胺合成途径以高浓度生产（Qian.ZD等人，Biotechol.Bioeng.104:4,651-662,2009，国际专利公开号WO06/005603，国际专利公开号WO09/125924）。同时，在缺乏腐胺合成途径的棒状杆菌菌株中，腐胺可通过插入来源于大肠杆菌的鸟氨酸脱羧酶基因自鸟氨酸生成，或是腐胺可通过插入来源于大肠杆菌的L-精氨酸脱羧酶和凝集酶基因自L-精氨酸生成。鸟氨酸途径基本上可生产比L-精氨酸途径高大约50倍量的腐胺（Schneider等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.88:4,859-868,2010）。

同时，发现大肠杆菌在44g/L腐胺存在下可正常生长，而谷氨酸棒状杆菌在66g/L腐胺存在下可正常生长。因此，对于开发生产腐胺的微生物来说，与大肠杆菌相比使用可在更高腐胺浓度下生存的棒状杆菌菌株似乎更为有效。

棒状杆菌菌株是可商业购买的微生物，广泛使用于氨基酸、核酸、酶和抗生素类似物的生产。在棒状杆菌菌株中，可通过argCJBDFRGH组成的精氨酸操纵子基因表达的酶由谷氨酸合成L-精氨酸。在L-精氨酸的生物合成中发挥最重要作用的精氨酸操纵子基因使用细胞内合成的L-谷氨酸作为精氨酸合成的底物。图2显示了棒状杆菌菌株中由谷氨酸至精氨酸的合成途径示意图。在精氨酸合成途径中，ArgJ将谷氨酸转换为N-乙酰谷氨酸、ArgB将N-乙酰谷氨酸转换为N-乙酰谷酰磷酸，ArgC将N-乙酰谷酰磷酸转换为N-乙酰谷氨酸半醛，ArgD将N-乙酰谷氨酸半醛转换为N-乙酰鸟氨酸，ArgJ将N-乙酰鸟氨酸转换为鸟氨酸，ArgF将鸟氨酸转换为L-瓜氨酸，ArgG将L-瓜氨酸转换为精氨酸代琥珀酸，而ArgH将精氨酸代琥珀酸转换为精氨酸。

此前已知通过诱导精氨酸操纵子的突变或诱导启动子的突变以增加精氨酸生物合成中所涉及的酶的表达水平而开发了精氨酸生产菌株。在精氨酸操纵子的基因中，调节并抑制精氨酸操纵子基因表达的argR和被精氨酸浓度抑制的argB已经成为了多项增加精氨酸生产水平的研究的靶点（韩国专利公开号2012-0060909）。

腐胺的生物合成途径与精氨酸生物合成途径中自谷氨酸至鸟氨酸的合成步骤相同。然后通过鸟氨酸脱羧酶（ODC）由合成的鸟氨酸生产腐胺。因此，为了制备能够生产大量腐胺的菌株，必须先获得足量的鸟氨酸。当在野生型大肠杆菌W3110的argF^-和argR^-缺失菌株中加入谷氨酸时，鸟氨酸的生产水平提高了20%。此外，除了自谷氨酸至鸟氨酸的途经之外，当自谷氨酸至脯氨酸的合成途径由于敲除了编码第一步中涉及的γ-谷氨酰激酶的proB基因而受到阻断时，鸟氨酸的生产水平也会增加。这表明当谷氨酸的细胞内水平升高时，它对细胞中的鸟氨酸生产具有正向作用。在一项高产量生产鸟氨酸的前体即谷氨酸的研究中，已对谷氨酸棒状杆菌进行了长期研究。在这方面，已报道了当细胞缺少生物素时或当使用青霉素G或脂肪酸酯表面活性剂处理细胞时，谷氨酸棒状杆菌的谷氨酸运出活性得到了增强。此结果表明当细胞壁损伤时，谷氨酸可更好地穿过细胞质运出。

来源于谷氨酸棒状杆菌野生型菌株（ATCC13032）的NCg11221蛋白已知可促进甜菜碱运出，并且与编码机械敏感通道蛋白质的yggB具有相似的氨基酸序列（韩国专利公开号2010-0017581）。

发明内容

技术问题

本发明人付出了大量努力以开发一种能够生产较高产量腐胺的菌株，现已得到一种可生产高水平腐胺的菌株，该菌株通过阻断自鸟氨酸至精氨酸的生物合成途径、增加细胞内谷氨酸水平、增强自谷氨酸至鸟氨酸的生物合成途径并且通过引入一个可自鸟氨酸合成腐胺的鸟氨酸脱羧酶外源基因，从而完成了本发明。

技术方案

本发明的一个目的是提供一种具有生产腐胺能力的微生物。

本发明的另一个目的是提供一种使用此微生物生产腐胺的方法。

有益作用

本发明的具有生产腐胺能力的微生物可广泛用于更高效的腐胺生产。

附图说明

图1显示了腐胺的生物合成途径以及本发明的转化的谷氨酸棒状杆菌中的相关基因。

图2显示了在已知谷氨酸棒状杆菌中精氨酸的生物合成途径。

图3显示了插入至棒状杆菌菌株染色体中的载体pDZ。

具体实施方式

为了达到本发明的目的，一方面本发明提供了一种产腐胺的微生物，其中该微生物中的鸟氨酸氨甲酰基转移酶和一个谷氨酸运出相关蛋白即NCg11221与其内源活性相比经修饰活性减弱，并且在此微生物中引入了鸟氨酸脱羧酶（ODC）的活性。

本文所用的“鸟氨酸氨甲酰基转移酶（OCT）”是指介导氨甲酰磷酸和鸟氨酸之间反应以合成瓜氨酸和磷酸的催化酶。OCT在尿素排泄动物的肝中以及植物和微生物中存在，并且在微生物中，它与精氨酸合成相关。OCT酶包含催化区和调节区，当鸟氨酸与调节区结合时，该酶的活性被抑制。

大肠杆菌K12菌株具有两种OCT（ArgF和ArgI），而包括大肠杆菌B和W菌株的肠内微生物具有与ArgI类似的OCT蛋白。argF和argI编码的OCTs相互之间具有不同的氨基酸序列，但是它们被认为是具有相同功能的同工酶（EMBO J.(1982)1：853-857）。棒状杆菌菌株仅具有argF基因编码的OCT。OCT仅在自鸟氨酸至精氨酸的合成途径中发挥作用，因此如果减弱OCT的活性，则可增加细胞内鸟氨酸的水平。

本发明提供了一种棒状杆菌菌株，其中自鸟氨酸至精氨酸的合成途径被阻断以抑制腐胺前体即鸟氨酸至精氨酸的转换。为了达到此目的，通过删除编码鸟氨酸氨甲酰基转移酶的基因制备了一种转化菌株。

鸟氨酸氨甲酰基转移酶可能是一种具有SEQ ID No.28的氨基酸序列的蛋白质或是一种具有与该序列同源性为70%或更高、优选与该序列同源性为80%或更高、更优选与该序列同源性为90%或更高的氨基酸序列的蛋白质，但不限于此。

本文所用的“同源性”是指编码蛋白质的基因的核苷酸序列或氨基酸序列的相似性。当同源性足够高时，相应基因的产物可以是相同的或是具有相似的活性。

本文所用的“谷氨酸运出相关蛋白”是指功能为将细胞内生成的谷氨酸运出至细胞外环境的一类机械敏感通道。

本发明提供了一种具有腐胺生产能力的棒状杆菌菌株。为了达到此目的，通过删除一个编码谷氨酸运出相关蛋白的基因来制备了一种能够维持细胞内高水平谷氨酸的转化菌株，该谷氨酸运出相关蛋白是腐胺前体即鸟氨酸的底物。

通过增加谷氨酸即鸟氨酸前体的细胞内水平，可刺激鸟氨酸生物合成途径。在本发明中，可通过降低NCg11221活性来减少或抑制谷氨酸运出。

去除的谷氨酸运出相关蛋白可以是具有SEQ ID No.30的氨基酸序列或是具有与该序列同源性为70%或更高、更优选同源性为80%或更高、最优选同源性为90%或更高的氨基酸序列的蛋白质，但不限于此。

鸟氨酸氨甲酰基转移酶和谷氨酸运出相关蛋白质的活性可通过选自以下组的方法降低，该组包括（1）部分或完全删除编码该蛋白质的基因，（2）修改表达调控序列以抑制该基因表达，（3）修改染色体的核苷酸序列以降低蛋白质活性，和（4）以上的组合，但是不限于此。

部分或完全删除编码此蛋白质的多核苷酸可通过引入一个插入微生物染色体的载体，从而用部分删除的多核苷酸或标记基因代替染色体中编码内源靶蛋白质的多核苷酸来完成。“部分”长度可根据多核苷酸的种类而不同，但它特指1至300个核苷酸的长度，优选1至100个核苷酸，更优选1至50个核苷酸。

此外，可以通过核苷酸序列的删除、插入、非保守或保守取代以及它们的组合在表达调控序列上引入变化来降低表达调控序列的活性，或是通过用活性较弱的核苷酸序列替代表达调控序列来完成表达调控序列的修改以降低多核苷酸的表达。表达调控序列包括一个启动子、一个操纵子序列、一个编码核糖体结合位点的序列以及一个调控转录和翻译终点的序列。

此外，可以通过多核苷酸序列的删除、插入、非保守或保守取代以及它们的组合来诱导序列突变以降低酶活性，或是通过用改变后活性较弱的多核苷酸序列替代原序列来完成染色体上编码本发明的酶的多核苷酸序列的改变。

通过此前鸟氨酸生产菌株建立的不同方法（韩国专利公开号2010-0060909）来制备一种细胞中蓄积腐胺前体鸟氨酸的转化微生物，即使用一种通过消除或减弱精氨酸生物合成途径的转录抑制剂ArgR的功能，并且还通过删除鸟氨酸氨甲酰基转移酶基因并引入未调节的N-乙酰谷氨酸合成酶来增加鸟氨酸生产的方法。

本文所用的“内源活性”是指微生物在天然状态下具有的酶活性。在本发明中，内源活性是指微生物天然具有的鸟氨酸氨甲酰转移酶和谷氨酸运出相关蛋白即NCg11221的活性。此外，本文所用的“修饰以获得比内源活性弱的活性”是指鸟氨酸氨甲酰转移酶和谷氨酸运出相关蛋白即NCg11221由于基因缺失或突变不能正确发挥功能，因此微生物天然具有的鸟氨酸氨甲酰转移酶和谷氨酸运出相关蛋白即NCg11221的活性减弱的状态。

本文所用的“鸟氨酸脱羧酶（ODC）”是指使用鸟氨酸生产腐胺的酶。ODC需要5’-磷酸吡哆醛（PLP）作为辅酶。ODC在大多数革兰氏阴性菌中存在，但它还可能在革兰氏阳性菌中的一些肠细菌例如乳酸菌中存在。大肠杆菌具有两类编码ODC的基因。其中一种是speC，它以恒定浓度结构性表达，另一个基因是speF，它仅在特定条件（鸟氨酸水平高于特定浓度且低pH）下被诱导表达。根据物种不同，一些物种例如大肠杆菌具有两类ODC酶，或仅具有一类ODC。具体来说，包括埃希杆菌属、志贺杆菌属、柠檬酸杆菌属、沙门氏菌属和肠杆菌属的物种具有两类ODC（即spcC和speF），而包括耶尔森菌属、克雷伯杆菌属和欧文氏菌属的物种仅具有一类ODC（spcC）。在乳酸菌中，ODC由一类基因（speF）表达，该基因由低pH或高浓度鸟氨酸和组氨酸诱导。

ODC可以是被SEQ ID No.41的氨基酸序列，或是与该序列同源性为70%或更高、更优选同源性为80%或更高、最优选同源性为90%或更高的氨基酸序列编码的蛋白质，但不限于此。

如上所述，鸟氨酸脱羧酶（ODC）的活性可通过使用本领域公知的不同方法来诱导，例如在染色体上插入包含编码ODC的核苷酸序列的多核苷酸、在引入微生物的载体系统上插入该多核苷酸、在编码ODC的核苷酸序列上游插入活性提高的启动子或插入带有改良启动子的ODC编码基因和插入编码ODC的核苷酸序列的变异体。更优选的是，当插入编码ODC的核苷酸序列时，可以使用SEQ ID No.42的CJ7启动子以调节ODC的表达。

在本发明的实施例中，提供了一种具有腐胺生产能力的棒状杆菌菌株。为了制备能够生产腐胺的转化株，在该微生物的染色体中插入编码鸟氨酸脱羧酶的核苷酸序列，它可自鸟氨酸合成腐胺。

微生物生产的腐胺可能被降解，在大肠杆菌中是通过细胞内降解途径，降解为亚精胺、乙酰腐胺和γ-氨基丁酸（GABA）。已知ODC在大多数革兰氏阴性菌中存在，但在棒状杆菌属中不存在。因此，当使用棒状杆菌菌株生成生产腐胺的菌株时，需要引入外源ODC。

本文所用的“具有腐胺生产能力的微生物”或“产腐胺的微生物”是指通过对并无内源性生产腐胺能力的母菌株赋予腐胺生产能力而生成的微生物。得到生产腐胺能力的微生物或腐胺生产微生物可以是但不限于，将谷氨酸转化为N-乙酰谷氨酸的乙酰谷氨酸合成酶，将乙酰鸟氨酸转化为鸟氨酸的鸟氨酸乙酰转移酶（ArgJ）、将乙酰谷氨酸转化为N-乙酰谷氨酰磷酸的乙酰谷氨酸激酶（ArgB）、将乙酰谷氨酸磷酸转化为N-乙酰谷氨酸半醛的N-乙酰-γ-谷氨酸磷酸还原酶（ArgC）、将乙酰谷氨酸半醛转化为N-乙酰鸟氨酸的乙酰鸟氨酸氨基转移酶（ArgD）的活性与其内在活性相比得到增强，以加强自谷氨酸至鸟氨酸合成的生物合成途径，从而增强作为腐胺合成的起始原料即鸟氨酸生成能力的微生物，以及转化引入编码鸟氨酸脱羧酶（speC）的基因，从而获得自鸟氨酸生产脯氨酸能力的微生物。

在此，N-乙酰基-γ-谷氨酰磷酸还原酶（ArgC）、乙酰谷氨酸合成酶或鸟氨酸乙酰转移酶（ArgJ）、乙酰谷氨酸激酶（ArgB）和乙酰鸟氨酸氨基转移酶（ArgD）可优选分别具有但不限于SEQ ID No.33、35、37和39的氨基酸序列，或是分别具有与这些序列同源性为70%或更高、更优选同源性为80%或更高、最优选同源性为90%或更高的氨基酸序列。ArgC、ArgJ、ArgB和ArgD的活性可通过选自以下组中的方法来增强，该组包括1）增加编码该蛋白质的多核苷酸的拷贝数，2）修改表达调控序列以增加多核苷酸的表达，3）修改染色体上的多核苷酸序列以增强酶活性，和和4）以上方法的组合。

具体而言，通常可以使用多种方法来增加微生物的酶活性。例如，可通过转化相关的质粒插入、同源重组、结合和转位以增加多核苷酸的拷贝数；改变多核苷酸的表达调控序列；扩增编码刺激多核苷酸表达的调控因子的基因；或是删除或抑制编码抑制多核苷酸表达的调控因子的基因来提高多核苷酸的表达水平。更具体来说，通过可操作地连接一个包含多核苷酸的基因片段和一个可在棒状杆菌菌株中复制的多拷贝载体、在染色体中引入一个或多个拷贝的多核苷酸、或是用活性增加的序列代替包含多核苷酸启动子的表达调控序列来提高多核苷酸的表达水平。

例如，可使用pHC139T载体将argCJBD基因组转化至一个微生物中以制备与野生型菌株相比具有显著改善的鸟氨酸生产能力的微生物。或者，可通过改进调控微生物染色体中的argCJBD基因表达的启动子区域，或是使用具有更强活性的启动子代替启动子区域，来制备鸟氨酸生物合成途径得到了增强的微生物。特别是，一种改进启动子区域的方法可包括制备一个基因片段来代替染色体内的启动子，这个基因片段包含但是不限于染色体上与靶部位相邻的两个末端部位的核苷酸序列以及一个将以与原始染色体相同的形式并且使用pDZ载体按照相同的基因删除方法插入的启动子序列，其中pDZ载体发表于韩国专利2009-0082702。在本发明中，改进的启动子可优选但是不限于具有SEQ ID No.42的核苷酸序列的pcj7（或P(CJ7)）启动子（韩国专利申请号0620092）。pDZ载体可优选但是不限于图3显示的断裂谱图代表的载体。

本文所用的“载体”是指包含一段可操作地连接至适合的表达调控序列以在合适的宿主细胞中表达靶基因的核苷酸序列的DNA构建体。表达调控序列包含一个可起始转录的启动子，一个可选的调控转录的操纵子序列，一个编码适合的mRNA核糖体结合位点的序列，以及一个调控转录和翻译终点的序列。常用载体的实例包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，pWE15、M13、λEMBL3、λEMBL4、λFIXII、λDASHII、λZAPII、λgt10、λgt11、Charon4A和Charon21A可用作噬菌体载体或粘粒载体。pDZ载体、pBR类型、pUC类型、pBluescriptII类型、pGEM类型、pTZ类型、pCL类型和pET类型可用作质粒载体。可用载体没有特别限制，可使用任何已知表达载体，优选pDZ载体。

同时，本发明的微生物可以是但不限于由属于埃希杆菌属、志贺杆菌属、柠檬酸杆菌属、沙门氏菌属、肠道细菌属、耶尔森菌属、克雷伯杆菌属、欧文氏菌属、棒状杆菌属、短杆菌属、乳酸菌属、单胞菌属或是弧菌属的微生物的转化菌株，其不具有腐胺代谢途径，同时具有鸟氨酸氨甲酰基转移酶和谷氨酸运出相关蛋白即NCg11221的活性。

本发明的微生物可优选为通过降低或钝化鸟氨酸氨甲酰基转移酶活性来蓄积鸟氨酸的转化菌株，细胞内的谷氨酸水平通过降低或钝化谷氨酸运出相关蛋白的活性而增高，鸟氨酸通过提高与精氨酸生物合成有关的argCJBD基因组的表达水平而过度生产，引入编码将鸟氨酸转化为腐胺的鸟氨酸脱羧酶（ODC）的外源基因，从而使得该细胞能够生产腐胺。

本发明的腐胺生产微生物可优选为棒状杆菌属菌株，更优选为谷氨酸棒状杆菌。更具体来说，可使用但是不限于野生型菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC13032或谷氨酸过度生产菌株KCCM-10785P（韩国专利公开号2008-0034334）。KCCM-10785P菌株是通过在谷氨酸生产菌株（KFCC-11074）中删除cg2624（NCBI LOCUS ID YP_226636）和cg2115（NCBI LOCUS IDYP_226173）基因形成的谷氨酸过度生产菌株，该谷氨酸生产菌株是使用诱变剂例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍（NTG）生成的。

尽管在上述出版物之前没有鉴别出通过删除cg2624和cg2115引起的谷氨酸过度生产，但cg2524经鉴别为pcaR，是一种IclR家族调控蛋白，而cg2115经鉴别为sugR，是一种糖代谢的转录调控因子。

如图2中的鸟氨酸合成途径所示，为了增加鸟氨酸的生产水平，需要增加起始原料谷氨酸的数量，阻断将合成的鸟氨酸转化为精氨酸的途径并增加鸟氨酸生物合成相关酶的数量并增强其活性。同样，可通过增强鸟氨酸生产能力，引入一个编码鸟氨酸脱羧酶（ODC）的基因使缺乏腐胺代谢途径的微生物可自鸟氨酸合成腐胺，从而诱导鸟氨酸的过度生产，来制备一种具有腐胺生产能力的转化微生物。

根据本发明的实例，制备以下菌株：argF缺失的谷氨酸棒状杆菌菌株（ATCC13032ΔargF和KCCM-10785PΔargF）（实施例1）、argF和NCg11221缺失的谷氨酸棒状杆菌菌株（ATCC13032ΔargFΔNCg11221和KCCM-10785PΔargFΔNCg11221）（实施例2）、argF和NCg11221缺失且插入argCJBD的谷氨酸棒状杆菌菌株（ATCC13032ΔargFΔNCg11221/pHC139T-argCJBD(Cgl) 和 KCCM-10785P ΔargFΔNCg11221/pHC139T-argCJBD(Cgl)）（实施例3-1）、在染色体中用argCJBD基因组启动子代替的argF和NCg11221缺失的谷氨酸棒状杆菌菌株（ATCC13032ΔargFΔNCg11221P(CJ7)-argCJBD和KCCM-10785PΔargFΔNCg11221P(CJ7)-argCJBD）（实施例3-2）、在染色体中插入编码ODC的speC基因的argF和NCg11221缺失的谷氨酸棒状杆菌菌株（ATCC13032ΔargFΔNCg11221bioAD::P(CJ7)-speC(Ec)和KCCM-10785PΔargFΔNCg11221bioAD::P(CJ7)-speC(Ec)）、在染色体中插入编码ODC的speC基因和argCJBD基因组的argF和NCg11221缺失的谷氨酸棒状杆菌菌株（ATCC13032ΔargFΔNCg11221bioAD::P(CJ7)-speC(Ec)/pHC139T-argCJBD(Cgl)和KCCM-10785PΔargFΔNCg11221bioAD::P(CJ7)-speC(Ec)/pHC139T-argCJBD(Cgl)）以及在染色体中用argCJBD基因组启动子代替且插入speC基因的argF和NCg11221缺失的谷氨酸棒状杆菌菌株（ATCC13032ΔargFΔNCg11221P(CJ7)-argCJBD bioAD::P(CJ7)-speC(Ec)和KCCM-10785PΔargFΔNCg11221P(CJ7)-argCJBD bioAD::P(CJ7)-speC(Ec)）。当对这些菌株的腐胺生产能力进行比较时，发现在染色体中用argCJBD基因组启动子代替且插入speC基因的argF和NCg11221缺失的谷氨酸棒状杆菌菌株（ATCC13032ΔargFΔNCg11221P(CJ7)-argCJBD bioAD::P(CJ7)-speC(Ec)和KCCM-10785PΔargFΔNCg11221P(CJ7)-argCJBDbioAD::P(CJ7)-speC(Ec)）显示了出色的腐胺生产能力（表7和表8）。

因此，本发明者将具有最高生产能力的腐胺生产菌株命名为“CC01-0064（ATCC13032ΔargFΔNCg11221P(CJ7)-argCJBD bioAD::P(CJ7)-speC(Ec)）”，并按照布达佩斯条约于2010年11月24日将一份菌株样品放置于位于首尔，西大门区，弘济－1－洞的韩国微生物保藏中心（KCCM）保存，登记号为KCCM1138P。

在本发明完成上述目标的另一个方面，本发明提供了一种生产腐胺的方法，包括以下步骤(i)培养一种腐胺生产微生物以获得培养物；和(ii)从培养的微生物或细胞培养物中回收腐胺。

在此腐胺生产方法中，优选但不限于通过本领域公知的分批培养、连续培养和分批补料培养来完成微生物的培养。此外，对于培养条件，可使用碱性化学品（例如：氢氧化钠、氢氧化钾或氨水）或酸性化学品（例如：磷酸或硫酸）维持最佳pH5至9，优选6至8，最优选pH6.8。此外，可通过在细胞培养基中加入氧气或含氧气体混合物来维持需氧条件。培养温度可维持在20℃至45℃，优选25℃至40℃。此外，优选培养大约10至160小时。按照上述培养条件生产的腐胺可分泌至培养基中或仍留在细胞内。

此外，培养所用介质可包含糖和碳水化合物（例如：葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素）、油和脂肪（例如：豆油、葵花籽油、花生油和椰子油）、脂肪酸（例如：软脂酸、硬脂酸和亚油酸）、醇类（例如：丙三醇和乙醇）和有机酸（例如：乙酸）单独或组合作为碳源；含氮有机化合物（例如：蛋白胨、酵母提取物、肉汤、麦芽浸膏、玉米溶液、大豆粉和尿素）或无机化合物（例如：硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵）单独或组合作为氮源；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或对应的含钠盐单独或组合作为磷源；其他必需的生长刺激物质包括金属盐（例如：硫酸镁或硫酸亚铁）、氨基酸和维生素。

实施例

在下文中，本发明通过实施例进行了更为详细的描述。但是，这些实施例仅用于说明，而不用于限制本发明的。

实施例1：制备argF-缺失的谷氨酸棒状杆菌菌株

在此实施例中，由野生型谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC13032和谷氨酸过度生产菌株KCCM-10785P制备了一种argF-缺失菌株，谷氨酸过度生产菌株KCCM-10785P是通过在谷氨酸生产菌株KFCC-11074中删除cg2624和cg2115基因而生成的，而KFCC-11074是通过使用诱变剂例如NTG（韩国专利公开号2008-0034334）以阻断自鸟氨酸至精氨酸的合成途径制成的。谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的精氨酸生物合成基因被安排在具有argCJBDFRGH形式的操纵子上，而删除的靶基因argF（SEQ ID No.27）与染色体上编码鸟氨酸合成途径有关酶的基因相邻。因此，根据位置与删除的靶基因argF相邻的argD和argR的核苷酸序列制备删除基因argF的质粒。

具体来说，根据ATCC13032菌株的argD和argR的核苷酸序列，构建邻近argF的N-末端序列的同源重组片段和邻近argF的C-末端序列的同源重组片段。为此，通过使用引物（SEQ ID No.1和2）和ATCC13032菌株的基因组DNA作为模板进行PCR（28个循环，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒）来获得邻近argF的N-末端序列的片段。同样，通过使用引物（SEQ ID No.3和4）和ATCC13032菌株的基因组DNA作为模板在相同PCR条件下获得邻近argF的C-末端序列的片段（表1）。

表1

制备argF缺失菌株（ΔargF）的引物

使用BamHI和SalI对以上制备的邻近argF的N-末端序列的同源重组片段进行限制酶切消化，使用SalI和XbaI对邻近argF的C-末端序列的同源重组片段进行限制酶切消化。然后将每个断开的片段插入至也用BamHI和XbaI限制酶切消化的pDZ载体，从而生成质粒pDZ-argF（K/O）。

将以上制备的质粒pDZ-argF（K/O）转化至ATCC13032菌株和KCCM-10785P菌株。然后，在含有卡那霉素（25μg/ml）和X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚林-β-D-半乳糖苷）的BHIS平板（Braine心脏浸出液37g/l，山梨醇91g/l，琼脂2%）上进行转化菌株的铺板和培养，使菌落在平板上生长。在平板上形成的菌落之中，收集蓝色的菌落以选择插入了质粒pDZ-argF（K/O）的菌株。

以上选择的菌株于30℃在CM培养基（葡萄糖10g/l，多价蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，牛肉浸膏5g/l，NaCl2.5g/l，尿素2g/l，pH6.8）中振摇培养8小时。随后，将每个细胞培养物自10^-4连续稀释至10^-10。然后在含有X-gal的固体培养基上铺板并培养稀释的样品，使菌落生长。在平板上形成的菌落之中，仅收集以相对较低频率出现的白色菌落，以选择argF缺失菌株。

通过使用上述选择菌株的染色体DNA作为模板以及SEQ ID No.1和4的引物一起进行PCR来验证质粒pDZargF（K/O）成功插入至上述选择的菌株之中。通过PCR确认后，可以证明上述选择的菌株是argF缺失菌株（即ATCC13032ΔargF和KCCM-10785PΔargF）。

实施例2：制备argF-和NCg11221-缺失的谷氨酸棒状杆菌菌株

在实施例1中获得的ATCC13032ΔargF菌株和KCCM-10785PΔargF菌株中还进一步删除了编码谷氨酸运出相关蛋白的NCg11221基因，以增加鸟氨酸前体谷氨酸的细胞内水平。

具体来说，根据ATCC13032菌株NCg11221的核苷酸序列（SEQ ID No.29），构建一个邻近NCg11221的N-末端序列的同源重组片段和一个邻近NCg11221的C-末端序列的同源重组片段。为此，通过使用引物（SEQ ID No.5和6）和ATCC13032菌株的基因组DNA作为模板进行PCR来获得邻近NCg11221的N-末端附近序列的片段，通过使用引物（SEQ ID No.7和8）和ATCC13032菌株的基因组DNA作为模板进行PCR以获得邻近NCg11221的C-末端序列的片段，PCR条件与实施例1相同（表2）。

表2

制备NCg11221缺失菌株的引物

使用BamHI和SalI对以上制备的邻近NCg11221的N-末端序列的同源重组片段进行限制酶切消化。同样，使用SalI和XbaI对邻近NCg11221的C-末端序列的同源重组片段进行限制酶切消化。然后将每个断开的片段插入至也用BamHI和XbaI断裂的pDZ载体，从而生成质粒pDZ-NCg11221（K/O）。

将以上制备的质粒pDZ-NCg11221（K/O）转化至ATCC13032ΔargF菌株和KCCM-10785PΔargF菌株。然后，在含有卡那霉素（25μg/ml）和X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚林-β-D-半乳糖苷）的BHIS平板（Braine心脏浸出液37g/l，山梨醇91g/l，琼脂2%）上进行转化菌株的铺板和培养，使菌落在平板上生长。在平板上形成的菌落之中，收集蓝色的菌落以选择插入了质粒pDZ-NCg11221（K/O）的菌株。

以上选择的菌株于30℃在CM培养基中振摇培养8小时。随后，将每个细胞培养物自10^-4连续稀释至10^-10。然后在含有X-gal的固体培养基上铺板并培养稀释的样品，使菌落生长。在平板上形成的菌落之中，仅收集以相对较低频率出现的白色菌落，以选择NCg11221缺失菌株。

通过使用上述选择菌株的染色体DNA作为模板以及SEQ ID No.5和8的引物一起进行PCR来验证质粒pDZ-NCg11221（K/O）成功插入至上述选择的菌株之中。选择的NCg11221缺失菌株对应命名为ATCC13032ΔargFΔNCg11221和KCCM-10785PΔargFΔNCg11221。

实施例3：argCJBD基因插入的谷氨酸棒状杆菌菌株的制备

实施例3-1：argCJBD基因的克隆和转化菌株的制备

在此实施例中，制备一个插入了argC、argJ、argB和argD基因（SEQ ID No.32、34、36和38）的载体，并且通过引入相同基因来制备转化株，从而通过增加argCJBD操纵子（SEQID No.31，包含启动子区域）的拷贝数来增强鸟氨酸合成途径，其中argCJBD操纵子编码了自谷氨酸至鸟氨酸的合成途径中的相关酶。

首先，进行PCR以获得argCJBD基因，使用引物（SEQ ID No.9和10）和ATCC13032菌株的染色体作为模板进行PCR（30个循环，95℃变性40秒，55℃退火40秒，72℃延伸150秒），从而获得大小为4900bp的基因片段。

表3

获得ATCC13032的argCJBD基因片段的引物

在0.8%琼脂糖凝胶上对以上制备的基因片段进行凝胶电泳，切出目标大小的条带并从中分离出DNA样品。使用KpnI和XbaI对分离的DNA进行限制酶切消化以获得片段，然后将断裂的片段克隆至pHC139T-gfp载体（韩国专利公开号2008-0074286），从而生成表达载体pHC139T-argCJBD(Cgl)。

随后，通过电穿孔将制备用于增加细胞中鸟氨酸生产水平的表达载体pHC139T-argCJBD(Cgl)引入ATCC13032ΔargFΔNCg11221菌株和KCCM-10785PΔargFΔNCg11221菌株。然后，将转化的细胞在含有25μg/ml卡那霉素的BHIS平板上进行铺板，选择成功的转化株。最后，将每个选择的转化株对应命名为ATCC13032ΔargFΔNCg11221/pHC139T-argCJBD(Cgl)和KCCM-10785PΔargFΔNCg11221/pHC139T-argCJBD(Cgl)。

实施例3-2：取代染色体中argCJBD基因的启动子

在此实施例中，使用本申请人新近开发的CJ7启动子代替染色体中argCJBD的启动子，目的是通过去除argCJBD基因的调控而增加表达水平，其中argCJBD基因编码自谷氨酸至鸟氨酸的合成途径有关酶。

首先，制备一个包含CJ7启动子和该启动子两个末端区域的核苷酸序列的同源重组片段。

具体来说，通过使用引物（SEQ ID No.11和12）和ATCC13032菌株的基因组DNA作为模板进行PCR（28个循环，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒）来获得CJ7启动子的5’-末端区域的核苷酸序列。同样，通过使用引物（SEQ ID No.13和14）在相同PCR条件下获得CJ7启动子区域的核苷酸序列，通过使用引物（SEQ ID No.15和16）在相同PCR条件下进行PCR获得CJ7启动子的3’-末端区域的核苷酸序列。

表4

取代argCJBD基因启动子的引物

使用BamHI和EcoRI对以上制备的启动子5’-末端区域片段（argC-L）进行限制酶切消化，使用EcoRI和XbaI对CJ7启动子区域片段进行限制酶切消化，使用XbaI和SalI对启动子3’-末端区域片段（argC-R）进行限制酶切消化。然后将每个断开的PCR产物克隆至也用BamHI和SalI限制酶切消化的pDZ载体，从而生成表达载体pDZ-CJ7(arg)，其中argCJBD的启动子被CJ7启动子代替。

通过电穿孔将以上制备的表达载体pDZ-CJ7(arg)转化至ATCC13032ΔargFΔNCg11221菌株和KCCM-10785PΔargFΔNCg11221菌株中。然后，在CM培养基中振摇培养（30℃，8小时）转化株，将细胞培养物自10^-4连续稀释至10^-10。然后，将稀释的样品置于含有25μg/ml卡那霉素和X-gal的BHIS平板上并进行培养，使菌落生长。

从大部分蓝色菌落中分离出低频率出现的白色菌落，从而仅选择通过双交换CJ7启动子成功代替arg启动子的菌株。通过进行PCR验证了通过被引入的表达载体pDZ-CJ7(arg)成功取代染色体中的argCJBD启动子，其中PCR使用引物（SEQ ID No.13和16）和以上选择的菌株的基因组DNA作为模板来进行（28个循环，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸60秒）。最后，将确认的菌株对应命名为ATCC13032ΔargFΔNCg11221P(CJ7)-argCJBD和KCCM-10785PΔargFΔNCg11221P(CJ7)-argCJBD。

实施例4：引入speC基因的谷氨酸棒状杆菌菌株

在谷氨酸棒状杆菌菌株的染色体上于灭活的生物素合成相关基因内引入一个编码大肠杆菌ODC的speC基因，其中ODC可使用鸟氨酸合成腐胺。

实施例4-1：制备包含一个ODC基因片段的表达载体

为了在谷氨酸棒状杆菌菌株中引入来源于大肠杆菌的speC基因（SEQ ID No.40），将speC基因与SEQ ID No.42的CJ7启动子一起克隆至载体上，从而由CJ7启动子表达speC。

首先，通过使用引物（SEQ ID No.17和18）和p117-CJ7-gfp（韩国专利登记10620092）作为模板进行PCR（30个循环，94℃变性40秒，55℃退火40秒，72℃延伸60秒）来获得CJ7启动子区域的核苷酸序列，并通过使用引物（SEQ ID No.19和20）和野生型大肠杆菌菌株W3110的染色体作为模板在相同PCR条件下进行PCR来获得speC编码区域的核苷酸序列。

表5

获得P(CJ7)-speC基因片段的引物

使用KpnI和XbaI对CJ7启动子区域和speC编码基因区域进行限制酶切消化，并将其克隆至也用KpnI和XbaI处理的pHC139T-gfp载体中，从而生成表达载体pHC139T-P(CJ7)-speC(Ec)，其中包含了CJ7启动子及其下游ODC编码区域的基因。

实施例4-2：制备转化菌株

由于谷氨酸棒状杆菌菌株中部分缺失了生物素合成相关的基因，在此实施例中，将来源于大肠杆菌的speC基因引入至生物素合成基因bioA和bioD之间。

具体来说，使用实施例4-1中制备的表达载体pHC139T-P(CJ7)-speC(Ec)中包含的P(CJ7)-speC(Ec)基因片段的两个末端部位作为谷氨酸棒状杆菌菌株染色体的同源重组部位，对P(CJ7)-speC(Ec)的每个末端部位进行克隆以获得bioA和bioD的核苷酸序列。为此，通过使用引物（SEQ ID No.21和22）和ATCC13032菌株的基因组作为模板进行PCR（28个循环，94℃变性40秒，55℃退火30秒，72℃延伸60秒）来获得bioA基因片段。同样，通过使用不同引物（SEQ ID No.25和26）和相同模板在相同PCR条件下进行PCR来获得bioD基因片段。然后，通过使用引物（SEQ ID No.23和24）和表达载体pHC139T-P(CJ7)-speC(Ec)作为模板在相同PCR条件下进行PCR来获得P(CJ7)-speC(Ec)基因片段。

表6

在染色体（bioA，bioD）内插入P(CJ7)-speC基因片段的引物。

使用BamHI和ScaI对以上制备的bioA基因片段进行限制酶切消化，使用ScaI和EcoRI对P(CJ7)-speC(Ec)基因片段进行限制酶切消化，并使用EcoRI和XbaI对bioD基因片段进行限制酶切消化。然后将这项消化的PCR产物克隆至也用BamHI和XbaI处理的pDZ载体，从而生成表达载体pDZ-bioAD-P(CJ7)-speC(Ec)，用于插入speC基因至染色体。

通过电穿孔将以上制备的表达载体pDZ-bioAD-P(CJ7)-speC(Ec)转化至ATCC13032ΔargFΔNCg11221菌株、ATCC13032ΔargFΔNCg11221P(CJ7)-argCJBD菌株、KCCM-10785PΔargFΔNCg11221菌株和KCCM-10785PΔargFΔNCg11221P(CJ7)-argCJBD菌株，从而获得每种菌株的转化菌株。

这些菌株均在CM培养基中振摇培养（30℃，8小时），将细胞培养物自10^-4连续稀释至10^-10。然后，将稀释的细胞培养物置于含有25μg/ml卡那霉素和X-gal的BHIS平板上铺板并进行培养，使菌落生长。

在大部分蓝色菌落中分离出相对低频率出现的白色菌落。通过选择白色菌落，仅染色体中通过双交换插入了P(CJ7)-speC的菌株可被选出。使用PCR验证了通过表达载体pDZ-bioAD-P(CJ7)-speC(Ec)在染色体中bioA和bioD之间成功插入了P(CJ7)-speC基因，其中PCR使用引物（SEQ ID No.21和26）和每个所选菌株的基因组DNA作为模板来进行（28个循环，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸120秒）。最后，将所选菌株对应命名为ATCC13032ΔargFΔNCg11221bioAD::P(CJ7)-speC(Ec)、ATCC13032ΔargFΔNCg11221P(CJ7)-argCJBD bioAD::P(CJ7)-speC(Ec)、KCCM-10785PΔargFΔNCg11221bioAD::P(CJ7)-speC(Ec)或KCCM-10785PΔargFΔNCg11221P(CJ7)-argCJBDbioAD::P(CJ7)-speC(Ec)。

此外，将实施例3-1中制备的pHC139T-argCJBD(Cgl)载体转化至ATCC13032ΔargFΔNCg11221bioAD::P(CJ7)-speC(Ec)菌株和KCCM-10785PΔargFΔNCg11221bioAD::P(CJ7)-speC(Ec)菌株中。将制备的转化菌株对应命名为ATCC13032ΔargFΔNCg11221bioAD::P(CJ7)-speC(Ec)/pHC139T-argCJBD(Cgl)和KCCM-10785PΔargFΔNCg11221bioAD::P(CJ7)-speC(Ec)/pHC139T-argCJBD(Cgl)。

实施例5：删除argF和NCg11221基因以增强argCJBD表达水平以及插入speC基因以 提高腐胺生产能力的效果

实施例5-1：ATCC13032谷氨酸棒状杆菌中腐胺生产能力的分析

为了确认argF缺失、NCg11221缺失、argCJBD表达水平增加，以及speC基因插入对ATCC13032谷氨酸棒状杆菌菌株腐胺生产能力的影响，对实施例2至4中所获菌株的腐胺生产能力进行比较。

具体来说，将实施例2至4中所获每个菌株（ATCC13032ΔargFΔNCg11221（检测组1）、ATCC13032ΔargFΔNCg11221pHC139T-argCJBD(Cgl)（检测组2）、ATCC13032ΔargFΔNCg11221P(CJ7)-argCJBD（检测组3）、ATCC13032ΔargFΔNCg11221bioAD::P(CJ7)-speC(Ec)（检测组4）、ATCC13032ΔargFΔNCg11221bioAD::P(CJ7)-speC(Ec)pHC139T-argCJBD(Cgl)（检测组5）和ATCC13032ΔargFΔNCg11221P(CJ7)-argCJBD bioAD::P(CJ7)-speC(Ec)（检测组6））铺于含有11.8%（w/v）琼脂的玉米粉琼脂（CMA）并在37℃下培养24小时。随后，将所有培养菌株分别接种在25ml含有1mM精氨酸（2%（w/v）葡萄糖、1%（w/v）多价蛋白胨、0.5%（w/v）酵母提取物、0.5%（w/v）(NH4)2SO4、0.15%（w/v）尿素、0.4%（w/v）KH2PO4、0.8%（w/v）K2HPO4、0.05%（w/v）MgSO4、100μg/l生物素和1mg/l硫胺素）的滴定培养基中并继续在30℃下以200rpm振荡培养72小时。然后测定并比较由此产生的鸟氨酸和腐胺浓度（表7）。此外，使用没有进行基因修饰的菌株ATCC13032作为对照组。

表7

来源于ATCC13032菌株的突变菌株中腐胺生产能力的比较

如表7所示，当argF和NCg11221基因缺失时或当argF和NCg11221基因缺失且argCJBD基因表达水平增高时，在细胞中仅观察到鸟氨酸的生成而没有产生腐胺。这可能是speC基因缺失引起的，该基因编码可在谷氨酸棒状杆菌菌株中自鸟氨酸合成腐胺的ODC。

另一方面，在实施例4-2中制备的插入了大肠杆菌来源speC基因的三种菌株中，细胞中基本不存在鸟氨酸但可观察到腐胺的生产。此结果表明通过插入表达ODC的大肠杆菌来源speC基因，腐胺可通过ODC由鸟氨酸合成。

此外，对检测组1至3的菌株中鸟氨酸的生产水平与检测组4至6的菌株中腐胺的生产水平进行比较，其中检测组4至6的菌株是通过在检测组1至3的菌株中插入speC基因而得到的，很明显腐胺的生产水平与鸟氨酸的生产水平相当。此外，与插入外源argCJBD基因相比，当外源argCJBD基因的表达水平增高时，鸟氨酸和腐胺的生产水平也有所提高。

实施例5-2：生产谷氨酸的谷氨酸棒状杆菌KCCM-10785p菌株的腐胺生产能力检查

为了确认argF缺失、NCg11221缺失，argCJBD表达水平增加以及speC基因插入对过度生产谷氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株KCCM-10785p腐胺生产能力的影响，对实施例2至4中所获菌株的腐胺生产能力进行比较。

具体来说，将实施例2至4中所获每个菌株（KCCM-10785pΔargFΔNCg11221（检测组1）、KCCM-10785pΔargFΔNCg11221/pHC139T-argCJBD(Cgl)（检测组2）、KCCM-10785pΔargFΔNCg11221P(CJ7)-argCJBD（检测组3）、KCCM-10785pΔargFΔNCg11221bioAD::P(CJ7)-speC(Ec)（检测组4）、KCCM-10785pΔargFΔNCg11221bioAD::P(CJ7)-speC(Ec)/pHC139T-argCJBD(Cgl)（检测组5）和KCCM-10785pΔargFΔNCg11221P(CJ7)-argCJBDbioAD::P(CJ7)-speC(Ec)（检测组6））在实施例5-1所述相同条件下接种并在30℃下以200rpm振荡培养48小时。然后测定并比较所有细胞培养物中产生的鸟氨酸浓度（表6）。此外，使用没有进行基因修饰的菌株KCCM-10785p作为对照组。

表8

所有KCCM-10785p来源菌株的腐胺生产能力的比较

如表8所示，即使是在谷氨酸过度生产的菌株中当argF和NCg11221基因缺失时或是当argF和NCg11221基因缺失且argCJBD基因表达水平增高时，在细胞中仅观察到鸟氨酸的生成而没有产生腐胺。

同时，仅可在实施例4-2中制备的插入了大肠杆菌来源speC基因的三种菌株中观察到腐胺的生产。此结果表明通过插入大肠杆菌来源speC基因，由此表达的ODC酶可由鸟氨酸合成腐胺。

当对检测组1至3的菌株中谷氨酸和鸟氨酸的生产水平进行比较时，可以观察到由于谷氨酸的生产量降低，鸟氨酸的生产量相对增高。此外，对检测组1至3的菌株中鸟氨酸的生产水平与检测组4至6的菌株中腐胺的生产水平进行比较，其中检测组4至6的菌株是通过在检测组1至3的菌株中插入speC基因而得到的，腐胺的生产水平与鸟氨酸的生产水平相当。此外，与插入外源argCJBD基因相比，当固有的argCJBD基因的表达水平增高时，鸟氨酸和腐胺的生产水平也有所提高。总之，可以确认由于细胞中谷氨酸的生产水平升高，鸟氨酸量也有所增加，从而最终提高了腐胺的生产水平。

总而言之，本发明人已将经证实具有出色的腐胺生产能力的实施例4-2中制备的菌株命名为“CC01-0064（ATCC13032ΔargFΔNCg11221P(CJ7)-argCJBD bioAD::P(CJ7)-speC(Ec)）”，并按照布达佩斯条约于2010年11月24日将此菌株放置于位于首尔，西大门区，弘济－1－洞的韩国微生物保藏中心（KCCM）保存，登记号为KCCM11138P。

根据以上描述，本领域技术人员应当理解在本发明的实践中可在不偏离以下权利要求规定的本发明技术理念或基本特征下对在此描述的本发明实施方案进行多种修改。在这方面，上述实施例仅用于说明目的，而不对本发明进行限制。应当理解本发明的范围包括来源于以下权利要求的含义和范围或其同等概念的所有变更或改动形式。

国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约

国际表格

致：CJ第一制糖株式会社 由本页下方签章的国际保藏管理机构

韩国，首尔， 根据条约7.1的规定颁发的保藏证明

中区，南大门路5街500号

Claims (10)

1.一种产腐胺的微生物，其中该微生物的鸟氨酸氨甲酰基转移酶和谷氨酸运出相关蛋白与其内源活性相比经修饰活性减弱，且在该微生物中引入了鸟氨酸脱羧酶的活性，

其中所述的谷氨酸运出相关蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO.30，并且

其中所述微生物是谷氨酸棒状杆菌。

2.根据权利要求1所述的产腐胺的微生物，其中所述的鸟氨酸氨甲酰基转移酶的氨基酸序列是SEQ ID NO.28。

3.根据权利要求1所述的产腐胺的微生物，其中所述的鸟氨酸氨甲酰基转移酶和谷氨酸运出相关蛋白的活性通过选自以下组的方法减弱，该组包括(1)部分或完全删除编码所述蛋白质的基因，(2)修改表达调控序列以抑制所述基因的表达，(3)修改染色体的所述基因序列以降低所述蛋白质的活性，和(4)以上的组合。

4.根据权利要求1所述的产腐胺的微生物，其中所述的鸟氨酸脱羧酶的氨基酸序列是SEQ ID NO.41。

5.根据权利要求1所述的产腐胺的微生物，其中鸟氨酸脱羧酶的活性通过选自以下组的方法来诱导，所述的组包括在染色体上插入包含编码鸟氨酸脱羧酶的核苷酸序列的多核苷酸，在引入微生物的载体系统上插入所述的多核苷酸，在编码鸟氨酸脱羧酶的核苷酸序列的上游插入活性提高的启动子或插入带有改良启动子的鸟氨酸脱羧酶编码基因，以及插入编码鸟氨酸脱羧酶的核苷酸序列的变异体。

6.根据权利要求1所述的产腐胺的微生物，其中鸟氨酸生物合成中涉及的N-乙酰基-γ-谷氨酰磷酸还原酶、N-乙酰谷氨酸合成酶或鸟氨酸乙酰转移酶、乙酰谷氨酸激酶和乙酰鸟氨酸氨基转移酶的活性与其内源活性相比进一步增强。

7.根据权利要求6所述的产腐胺的微生物，其中N-乙酰基-γ-谷氨酰磷酸还原酶、N-乙酰谷氨酸合成酶或鸟氨酸乙酰转移酶、乙酰谷氨酸激酶和乙酰鸟氨酸氨基转移酶的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.33、35、37和39。

8.根据权利要求6所述的产腐胺的微生物，其中N-乙酰基-γ-谷氨酰磷酸还原酶、N-乙酰谷氨酸合成酶或鸟氨酸乙酰转移酶、乙酰谷氨酸激酶和乙酰鸟氨酸氨基转移酶的活性通过选自以下组中的方法得到增强，该组包括(1)增加编码所述蛋白质的多核苷酸的拷贝数，(2)修改表达调控序列以增加多核苷酸的表达，(3)修改染色体上的多核苷酸序列以增强所述酶的活性，和(4)以上方法的组合。

9.根据权利要求1所述的产腐胺的微生物，其中所述微生物是谷氨酸棒状杆菌KCCM11138P。

10.一种生产腐胺的方法，包括以下步骤：(i)通过培养产腐胺的微生物获得细胞培养物，其中该微生物的鸟氨酸氨甲酰基转移酶和谷氨酸运出相关蛋白的活性与其内源活性相比经修饰减弱并且该微生物中引入了鸟氨酸脱羧酶的活性；和(ii)从所培养的微生物或细胞培养物中回收腐胺，

其中所述的谷氨酸运出相关蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO.30，并且

其中所述微生物是谷氨酸棒状杆菌。