CN104017767B - 一种利用组合调控策略提高5-氨基乙酰丙酸产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用组合调控策略提高5-氨基乙酰丙酸产量的方法，属于代谢工程和微生物发酵领域。本发明以EscherichiacoliBL21(DE3)作为出发菌株，使用表达载体pETDuet-1及pRSFDuet-1对ALA合成途径中起正调控作用的关键酶基因hemL，hemA，hemD，及hemF进行组合优化，构建重组菌株。通过发酵验证，采用高拷贝的质粒pRSFDuet-1表达hemA，hemL和hemF，中拷贝质粒pETDuet-1表达hemD，ALA产量产量最高，约3250mg/L。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用组合调控策略提高5-氨基乙酰丙酸产量的方法，属于代谢工程和微生物发酵领域。
背景技术
5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinicacid,ALA)，分子式为C5O3NH9，分子量为131.13，熔点为149-151℃，它是生物体合成叶绿素、血红素、维生素B12等的关键前体物质。ALA作为一种安全、选择、渗透性好的光动力学药物在医学领域逐渐受到重视，已经成功应用于皮肤癌、膀胱癌、消化道癌、肺癌等的诊断和光动力治疗中。另外，ALA作为一种环境相容性及选择性很高的新型光活化农药，在农药领域应用非常广泛，如作为一种无公害的绿色农药、除草剂以及植物生长调节剂等。
目前，ALA合成主要采用化学法合成，最早出现在上世纪50年代，直到20世纪90年代，相关研究才大量开展，并取得了一定的成绩。但是由于化学合成反应步骤繁琐，副产物多，分离提纯困难，ALA的得率也较低，并且环境污染严重等问题，近年来，微生物发酵生产ALA已成为研究的热点。自然界中，ALA的生物合成存在两条途径，一条是C4途径，由5-氨基乙酰丙酸合成酶(ALAS，hemA编码)催化琥珀酰-CoA和甘氨酸生成ALA的一步酶促反应组成，主要存在于一些光合细菌、真菌以及动物体内。另外一条是C5途径，首先谷氨酸在谷氨酰-tRNA合成酶(GluRS，gltX编码)催化下，生成谷氨酰-tRNA，然后，谷氨酰-tRNA在谷氨酰-tRNA还原酶(GluTR，hemA编码)作用下生成谷氨酸-1-半醛(GSA)，最后GSA由谷氨酸-1-半醛-2,1-氨基转移酶(GSA-AM，hemL编码)催化生成ALA。该途径广泛存在于植物、藻类以及细菌(如大肠杆菌)中。
早期，人们筛选到产ALA的光合细菌类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)，通过诱变育种法对其进行诱变，筛选ALA的高产菌株，并通过发酵优化等使得ALA的产量达到7.2g/L。但由于光合细菌的特殊性，其成本较高，不适合大规模的工业化生产。目前以C4途径为基础的生物转化由于添加前体琥珀酸和甘氨酸生产ALA成本相对较高。
本发明在系统阐述分析大肠杆菌中C5途径(图1)调控机制的基础上，将5-氨基乙酰丙酸C5合成途径关键酶基因hemA和hemL以及血红素生物合成途径基因hemD及hemF利用不同拷贝数的质粒进行组合优化，实现了ALA产量的进一步提高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种高产5-氨基乙酰丙酸的大肠杆菌工程菌株，是以高拷贝质粒串联表达ALAC5途径关键基因hemA(编码谷氨酰-tRNA还原酶)、hemL(编码谷氨醛氨基转移酶)，并以中拷贝质粒串联表达hemD(编码尿卟啉原III合酶)、hemF(编码粪卟啉原III氧化酶)；或者以高拷贝质粒串联表达hemA、hemL、hemD，并以中拷贝质粒表达hemF；或者以高拷贝质粒串联表达hemA、hemL、hemF，并以中拷贝质粒表达hemD。
所述大肠杆菌是JM109、DH5α、W3110或BL21(DE3)。
所述hemL的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
所述hemA的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
所述hemD的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。
所述hemF的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。
所述高拷贝质粒是指拷贝数为100的质粒。所述中拷贝质粒是指拷贝数为40的质粒。
所述高拷贝数质粒优选pRSFDuet-1。
所述中拷贝数质粒优选pETDuet-1。
所述大肠杆菌工程菌株优选以pRSFDuet-1串联表达hemA、hemL、hemF，并以pETDuet-1表达hemD。
所述大肠杆菌工程菌株还优选以pRSFDuet-1串联表达hemA、hemL、hemD，并以pETDuet-1表达hemF。
所述大肠杆菌工程菌株还优选以pRSFDuet-1串联表达hemA、hemL，并以pETDuet-1串联表达hemD、hemF。
本发明还提供一种构建所述大肠杆菌工程菌的方法，是以高拷贝质粒串联表达ALAC5途径关键基因hemA、hemL，并以中拷贝质粒串联表达以高hemD、hemF；或者以高拷贝质粒串联表达hemA、hemL、hemD，并以中拷贝质粒表达hemF；或者以高拷贝质粒串联表达hemA、hemL、hemF，并以中拷贝质粒表达hemD。
所述方法优选将来源于伤寒沙门氏菌的hemA基因与大肠杆菌的hemL基因连接表达载体pRSFDuet-1，获得hemA与hemL基因的共表达载体pRSFDuet-1-hemLA；将来源于大肠杆菌的hemD和hemF基因连接表达载体pETDuet-1，获得质粒pETDuet-1-hemD-hemF。将上述质粒转化大肠杆菌，筛选得到阳性转化子。
所述方法还优选将来源于伤寒沙门氏菌的hemA、大肠杆菌的hemL、hemD连接载体pRSFDuet-1获得pRSFDuet-1-hemLA-hemD，将hemF连接载体pETDuet-1。将上述质粒转化大肠杆菌，筛选得到阳性转化子。
所述方法还优选将来源于伤寒沙门氏菌的hemA、大肠杆菌的hemL、hemF连接载体pRSFDuet-1获得pRSFDuet-1-hemLA-hemF，将hemD连接载体pETDuet-1。将上述质粒转化大肠杆菌，筛选得到阳性转化子。
本发明要解决的第三个技术问题是应用所述大肠杆菌工程菌发酵生产ALA。
所述大肠杆菌工程菌优选E.coliBL21(DE3)pRSFDuet-1-hemLApETDuet-1-hemD-hemF或E.coliBL21(DE3)pRSFDuet-1-hemLA-hemDpETDuet-1-hemF或E.coliBL21(DE3)pRSFDuet-1-hemLA-hemFpETDuet-1-hemD。
所述发酵生产ALA涉及的培养基优选：
斜面培养基(g/L)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5.0，琼脂20，pH7.0；
种子培养基(g/L)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5.0，pH7.0，装液量20mL/250mL；
发酵培养基(g/L)：(NH4)2SO415，KH2PO45.0，Na2HPO4·12H2O15，MgSO4·7H2O1.0，酵母提取物(Yeastextract)1.0，葡萄糖20，pH7.0。
所述发酵生产ALA涉及的培养条件优选：
菌种培养：甘油管划线，然后挑取单菌落划线平板37℃培养，作为种子来源；
种子培养：平板挑取菌体，37℃，200r/min，根据要求添加氨苄青霉素100μg/mL，卡那霉素50μg/mL，培养约12h，转接发酵培养基；
发酵培养：以2％接种量转接，0h时添加0.1-0.5mMIPTG诱导基因表达，根据需要添加苄青霉素(100μg/mL)以及卡那霉素(50μg/mL)，30-37℃，200r/min培养，周期28-36h。
本发明在表达C5途径关键基因hemL和hemA的基础上，共表达ALA代谢途径的下游基因hemD和hemF，取得了意料不到的技术效果。此外，本发明还通过对目的基因以及具有不同拷贝数的表达载体进行组合，对ALA代谢途径进行了更细微的调控，所得大肠杆菌工程菌株3L发酵罐能够积累5-氨基乙酰丙酸3250mg/L，有效地利用C5途径促进5-氨基乙酰丙酸的合成，从而实现微生物发酵法直接发酵葡萄糖合成5-氨基乙酰丙酸。
附图说明
图1：大肠杆菌中ALAC5合成途径。
图2：重组质粒构建酶切电泳图
M1：DL5000Marker
M2：DL10000Marker
A：pETDuet-1-hemLA
B：pETDuet-1-hemD
C：pETDuet-1-hemF
D：pRSFDuet-1-hemD
E：pETDuet-1-hemLA-hemD
F：pETDuet-1-hemLA-hemF
G：pETDuet-1-hemD-hemF
H：pRSFDuet-1-hemLA-hemD
I：pRSFDuet-1-hemF
J：pRSFDuet-1-hemD-hemF
K：pRSFDuet-1-hemLA
L：pRSFDuet-1-hemLA-hemF
图3：重组菌摇瓶发酵ALA产量
LADF-1:E.coliBL21(DE3)pETDuet-1-hemLApRSFDuet-1-hemD-hemF
LADF-2:E.coliBL21(DE3)pETDuet-1-hemLA-hemDpRSFDuet-1-hemF
LADF-3:E.coliBL21(DE3)pETDuet-1-hemLA-hemFpRSFDuet-1-hemD
LADF-4:E.coliBL21(DE3)pRSFDuet-1-hemLApETDuet-1-hemD-hemF
LADF-5:E.coliBL21(DE3)pRSFDuet-1-hemLA-hemDpETDuet-1-hemF
LADF-6:E.coliBL21(DE3)pRSFDuet-1-hemLA-hemFpETDuet-1-hemD
图4：重组菌LADF-6发酵过程曲线图
LADF-6:E.coliBL21(DE3)pRSFDuet-1-hemLA-hemFpETDuet-1-hemD
具体实施方式
ALA分析方法：
采用Mauzerall和Granick的分光光度法：将样品稀释至2mL，加入1mL的乙酸盐缓冲液，0.5mL的乙酰丙酮，然后煮沸15min。冷却至室温，取2mL的反应液至新管中，然后加入2mL的改良Ehrlich’s试剂，反应20min，利用分光光度计554nm下检测。
培养基：
斜面培养基(g/L)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5.0，琼脂20，pH7.0；
种子培养基(g/L)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5.0，pH7.0，装液量20mL/250mL；
发酵培养基(g/L)：(NH4)2SO415，KH2PO45.0，Na2HPO4·12H2O15，MgSO4·7H2O1.0，yeastextract1.0，Glucose20，pH7.0。
培养条件：
菌种培养：甘油管划线，然后挑取单菌落划线平板37℃培养，作为种子来源；
种子培养：平板挑取菌体，37℃，200r/min，根据要求添加氨苄青霉素100μg/mL，卡那霉素50μg/mL，培养约12h，转接发酵培养基；
发酵培养：以2％接种量转接，0h时添加0.1-0.5mMIPTG诱导基因表达，根据需要添加苄青霉素(100μg/mL)以及卡那霉素(50μg/mL)，30-37℃，200r/min培养，周期28-36h。
实施例1重组质粒的构建及鉴定
(1)重组质粒的构建
以大肠杆菌基因组为模板获取hemL，hemD，以及hemF，hemA来源于伤寒沙门氏菌，
引物如下(下划线部分为酶切位点)
hemL-hemAF:CGCGGATCCATAAAAGGAGGAAAATATATGAGTAAGTCTGAA
hemL-hemAR:TGCACTGCAGCTACTCCAGCCCGAGGCTG
hemD-F:CGCCATATGAGTATCCTTGTCACCCGCC
hemD-R:CCGCTCGAGTTATTGTAATGCCCGTAAAAGCG
hemF-F:CGCCATATGAAACCCGACGCACACC
hemF-R:CCGCTCGAGTTACACCCAATCCCTGACCTTAAT
hemD(2)-F:CGCGGATCCATAAAAGGAGGAAAATATATGAGTATCCTTGTCACCCG
hemD(2)-R:TGCACTGCAGTTATTGTAATGCCCGTAAAAGCG
反应条件为：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃150s(hemL-hemA)/60s(hemD和hemF)(30个循环)；72℃10min进行PCR反应，并以0.8％琼脂糖凝胶电泳验证并回收PCR扩增产物，用限制性内切酶双酶切并纯化后，用T4DNA连接酶与相应的表达载体于16℃过夜连接，连接产物转化E.coliJM109，挑选阳性克隆子提取质粒并送上海生工测序验证，质粒构建酶切电泳图如图2。
将所得来源于伤寒沙门氏菌的hemA基因与大肠杆菌的hemL通过扩增利用酶切位点BamHI和PstI分别连接表达载体pETDuet-1和pRSFDuet-1中，获得hemA与hemL基因的共表达载体pETDuet-1-hemLA和pRSFDuet-1-hemLA。
将所得来源于大肠杆菌的hemD和hemF基因分别通过扩增和利用酶切位点NdeI和XhoI分别连接表达载体pETDuet-1和pRSFDuet-1中，获得质粒pETDuet-1-hemD和pRSFDuet-1-hemD以及pETDuet-1-hemF和pRSFDuet-1-hemF。
将所得来源于大肠杆菌的hemD基因通过扩增利用酶切位点BamHI和PstI连接载体pETDuet-1-hemF和pRSFDuet-1-hemF中，获得表达载体pETDuet-1-hemD-hemF和pRSFDuet-1-hemD-hemF。
将所得来源于伤寒沙门氏菌的hemA基因与hemL通过扩增利用酶切位点BamHI和PstI分别连接载体pETDuet-1-hemD和pRSFDuet-1-hemD以及pETDuet-1-hemF和pRSFDuet-1-hemF，获得表达载体pETDuet-1-hemLA-hemD和pRSFDuet-1-hemLA-hemD以及pETDuet-1-hemLA-hemF和pRSFDuet-1-hemLA-hemF。
(2)ALA发酵重组菌株的构建
基本方法是将构建的重组质粒pETDuet-1-hemLA和pRSFDuet-1-hemD-hemF共转化E.coliBL21(DE3)，获得重组菌E.coliLADF-1。
将构建的重组质粒pETDuet-1-hemLA-hemD和pRSFDuet-1-hemF共转化E.coliBL21(DE3)，获得重组菌E.coliLADF-2。
将构建的重组质粒pETDuet-1-hemLA-hemF和pRSFDuet-1-hemD共转化E.coliBL21(DE3)，获得重组菌E.coliLADF-3。
将构建的重组质粒pRSFDuet-1-hemLA和pETDuet-1-hemD-hemF共转化E.coliBL21(DE3)，获得重组菌E.coliLADF-4。
将构建的重组质粒pRSFDuet-1-hemLA-hemD和pETDuet-1-hemF共转化E.coliBL21(DE3)，获得重组菌E.coliLADF-5。
将构建的重组质粒pRSFDuet-1-hemLA-hemF和pETDuet-1-hemD共转化E.coliBL21(DE3)，获得重组菌E.coliLADF-6。
实施例2重组菌发酵验证
菌株：
LADF-1:E.coliBL21(DE3)pETDuet-1-hemLApRSFDuet-1-hemD-hemF
LADF-2:E.coliBL21(DE3)pETDuet-1-hemLA-hemDpRSFDuet-1-hemF
LADF-3:E.coliBL21(DE3)pETDuet-1-hemLA-hemFpRSFDuet-1-hemD
LADF-4:E.coliBL21(DE3)pRSFDuet-1-hemLApETDuet-1-hemD-hemF
LADF-5:E.coliBL21(DE3)pRSFDuet-1-hemLA-hemDpETDuet-1-hemF
LADF-6:E.coliBL21(DE3)pRSFDuet-1-hemLA-hemFpETDuet-1-hemD
不同重组大肠杆菌进行发酵实验对比。重组菌LADF-1，LADF-2，LADF-3，LADF-4，LADF-5以及LADF-6进行发酵实验，测定ALA产量如图3所示：通过采用不同拷贝数的载体表达hemL和hemA以及hemD和hemF，可以看出通过采用高拷贝的质粒表达hemL，hemA和hemF，中拷贝的质粒表达hemD，ALA的产量最高，为2100mg/L(图3)。
实施例3重组菌LADF-63L发酵罐发酵验证
菌株：LADF-6:E.coliBL21(DE3)pRSFDuet-1-hemLA-hemFpETDuet-1-hemD。
重组大肠杆菌LADF-6在3L发酵罐中发酵生产，接种量2％，初始葡萄糖浓度为33g/L，0h添加0.1-0.5mMIPTG诱导以及相应的抗生素，随着时间的变化，10h后ALA开始大量积累，在30hALA产量最高，为3250mg/L(图4)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (9)
1.一种高产5-氨基乙酰丙酸的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，是以高拷贝质粒串联表达ALAC5途径关键基因hemA、hemL，并以中拷贝质粒串联表达hemD、hemF；或者以高拷贝质粒串联表达hemA、hemL、hemD，并以中拷贝质粒表达hemF；或者以高拷贝质粒串联表达hemA、hemL、hemF，并以中拷贝质粒表达hemD；所述高拷贝质粒是指拷贝数为100的质粒，所述中拷贝质粒是指拷贝数为40的质粒。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，所述hemL的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述hemA的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
3.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，所述hemD的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述hemF的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。
4.根据权利要求1-3任一所述的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，所述大肠杆菌是JM109、DH5α、W3110或BL21(DE3)。
5.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，所述高拷贝质粒是pRSFDuet-1，所述中拷贝质粒是pETDuet-1。
6.根据权利要求1-3任一所述的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，以pRSFDuet-1串联表达hemA、hemL，并以pETDuet-1串联表达hemD和hemF。
7.根据权利要求1-3任一所述的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，以pRSFDuet-1串联表达hemA、hemL、hemD，并以pETDuet-1表达hemF。
8.根据权利要求1-3任一所述的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，以pRSFDuet-1串联表达hemA、hemL、hemF，并以pETDuet-1表达hemD。
9.一种应用权利要求1所述工程菌株发酵法生产5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于，工程菌株活化后，转接发酵培养基，30-37℃，200r/min培养，发酵周期28-36h。
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| GR01 | Patent grant |