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CN103981203A - 5-氨基乙酰丙酸高产菌株及其制备方法和应用 - Google Patents

5-氨基乙酰丙酸高产菌株及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种构建ALA生产菌株的方法，即增强所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中促进草酰乙酸合成的相关酶的活性或导入外源性的促进草酰乙酸合成的相关酶，如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或丙酮酸羧化酶，和/或减弱所述菌株中琥珀酰辅酶A下游代谢途径相关酶，例如琥珀酰辅酶A合成酶或琥珀酸脱氢酶的活性。本发明还公开了利用所述方法构建的ALA高产菌株和利用所述菌株制备ALA的方法。利用本发明的菌株无需添加外源琥珀酸即可高效、低成本、低污染地产生ALA。

Description

5-氨基乙酰丙酸高产菌株及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程和微生物发酵技术领域。具体地说，本发明涉及5-氨基乙酰丙酸的高产菌株及其制备方法和应用。 
背景技术
5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)是生物体合成血红素、叶绿素、维生素B12等四吡咯化合物的前体，四吡咯化合物则是细胞色素、血红蛋白、叶绿体蛋白等的重要组成部分，在生命活动中发挥着重要作用。因具有可降解和无毒无残留等特点，ALA在医药、农业、畜牧业、日用化学品等领域应用前景广阔，是一种重要的高附加值生物基化学品。ALA作为新一代光动力学药物可用于癌症治疗、肿瘤诊断和皮肤病的治疗等；作为植物生长调节剂ALA可以大幅促进花卉、作物和蔬菜的生长，提高作物、果品、蔬菜的品质；作为动物饲料添加剂ALA可以增强动物的新陈代谢和免疫力。近年来，ALA还作为主要添加成分用于化妆品以及保健食品的开发，相关产品已上市销售。 
然而，目前ALA主要通过化学合成方法制备，存在反应步骤多、转化率低、生产成本高、能耗物耗高、制备过程中使用有毒原料、环境污染严重和价格居高不下等缺点。目前国内市场上，ALA盐酸盐的出厂价格大约为1.7-1.9万元/公斤，而进口试剂售价高达2000元/克。制造成本居高不下，已经成为限制ALA推广应用的瓶颈因素。 
随着社会和科学技术的发展，以高效清洁的生物发酵法代替化学合成法生产ALA成为人们研究的重点。目前利用微生物生产ALA的方法主要有两类：一是对光合细菌进行诱变育种，选育高产ALA的突变株并在特定培养基上培养，积累较高浓度的ALA，但该方法发酵周期较长，条件控制复杂，底物和抑制剂的添加也增加了生产成本。二是利用代谢工程技术改造微生物的代谢途径，通过强化ALA的合成实现ALA的过量积累。微生物合成ALA的途径主要有两条，一条是在ALA合成酶的作用下以琥珀酰CoA和甘氨酸为前体合成ALA，称为C4途径，另一条是以谷氨酰tRNA为前体通过两步反应合成ALA，称为C5途径。 Xie等(Xie L,Hall D,Eiteman MA,Altman E,Appl Microbiol Biotechnol,2003,63(3):267-273)利用表达球形红细菌ALA合成酶的野生型大肠杆菌MG1655，经过发酵条件优化，ALA的产量达到5.2g/L。林建平等(CN200710068168.6，CN201210013562.0)将球形红细菌的ALA合成酶基因在大肠杆菌Rosetta2(DE3)中表达，经过发酵工艺优化后ALA产量达到6.6g/L，进一步优化后在15L发酵罐中产量达到了9.4g/L，为目前国内报道的最高产量。以上研究都选用了比较简单的四碳途径，主要是通过在大肠杆菌中表达外源ALA合成酶，并在丰富的LB培养基中添加底物琥珀酸和甘氨酸以及下游代谢途径的抑制剂实现。虽然上述方法的ALA产量已经达到较高的水平，但LB培养基的使用以及底物和抑制剂的添加不但造成发酵工艺控制复杂，而且导致生产成本增加，限制了大规模工业化应用。Shin等(Shin JA,Kwon YD,Kwon OH,Lee HS,Kim P,J Microbiol Biotechnol,2007,17(9):1579-1584)在表达类球红细菌ALA合成酶的大肠杆菌中通过共表达大肠杆菌自身的NADP依赖型的苹果酸酶，其在厌氧条件下，在不添加琥珀酸的丰富培养基中实现ALA产量的提高，但厌氧条件下ALA总体产量很低。Kang等(Kang Z,Wang Y,Gu P,Wang Q,Qi Q,Metab Eng,2011,13(5):492-498)在大肠杆菌中利用优化改造的C5途径及ALA运输蛋白的表达，5L发酵罐上ALA的产量达到4.13g/L，并实现了利用以葡萄糖为主要碳源的合成培养基发酵生产ALA，但发酵周期较长，且葡萄糖转化率比较低，只有0.168g/g（摩尔比约为0.23）。虽然上述研究对ALA合成底物的胞内供应进行了部分尝试，但总体效果不好，因此，目前为止对于ALA合成的底物供应普遍采用的还是直接外源添加的方式，尤其是现在ALA合成中最常用的C4合成途径，尚未见到有利用C4途径的重组工程菌在以廉价的葡萄糖为主要碳源的培养基中发酵生产ALA的报道。 
综上所述，本领域急需开发高效、低成本、低污染的ALA制备方法。 
发明内容
本发明的目的在于提供一种构建高水平的5-氨基乙酰丙酸生产菌株的方法以及相应获得的菌株。 
在第一方面，本发明提供5-氨基乙酰丙酸生产菌株的构建方法，所述方法： 
增强所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中促进草酰乙酸合成的相关酶的活性或导入外源性的促进草酰乙酸合成的相关酶，和/或 
减弱所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中琥珀酰辅酶A下游代谢途径相关酶的 活性。 
在具体的实施方式中，所述促进草酰乙酸合成的相关酶是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或丙酮酸羧化酶，所述琥珀酰辅酶A下游代谢途径相关酶是琥珀酰辅酶A合成酶或琥珀酸脱氢酶。 
在优选的实施方式中，所述增强5-氨基乙酰丙酸生产菌株中促进草酰乙酸合成的相关酶的活性可通过以下方法之一或组合实现：增强磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性，和/或增强丙酮酸羧化酶的活性。 
在另一优选的实施方式中，所述增强磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或丙酮酸羧化酶的活性，可通过以下方法之一或组合实现：表达同源或异源磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或丙酮酸羧化酶的编码基因，和/或增加所述菌株中所述编码基因的拷贝数，和/或改造所述编码基因的启动子以增强转录启动速度，和/或修改携带有所述编码基因的信使RNA的翻译调控区以增强翻译强度。 
在优选的实施方式中，所述减弱包括将所述琥珀酰辅酶A下游代谢途径相关酶缺失。 
在另一优选的实施方式中，所述琥珀酰辅酶A下游代谢途径相关酶是琥珀酰辅酶A合成酶或琥珀酸脱氢酶。 
在优选的实施方式中，所述减弱所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中琥珀酰辅酶A下游代谢途径相关酶可通过以下方法之一或组合实现：部分或全部敲除琥珀酰辅酶A合成酶或琥珀酸脱氢酶的编码基因、基因突变失活、基因启动子或翻译调控区改变令其转录或翻译弱化、改变基因序列使其mRNA稳定性减弱或酶结构不稳定等。 
在另一优选的实施方式中，所述方法还包括增强所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中的5-氨基乙酰丙酸合成途径或导入外源性5-氨基乙酰丙酸合成途径。 
在优选的实施方式中，增强所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中的5-氨基乙酰丙酸合成途径是指增强所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中5-氨基乙酰丙酸合成酶的活性或导入外源性5-氨基乙酰丙酸合成酶。 
在另一具体的实施方式中，所述方法包括在所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中增强5-氨基乙酰丙酸合成酶的活性或导入外源性5-氨基乙酰丙酸合成酶、增强磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性并敲除琥珀酰脱氢酶。 
在另一优选的实施方式中，所述方法还包括测定所得菌株的5-氨基乙酰丙 酸产量。 
在另一优选的实施方式中，所述方法获得的5-氨基乙酰丙酸生产菌株可以无需添加外源琥珀酸而高水平地产生5-氨基乙酰丙酸。 
在另一优选的实施方式中，所述方法获得的5-氨基乙酰丙酸生产菌株可以在好氧条件下，无需添加外源琥珀酸而高水平地产生5-氨基乙酰丙酸。 
在另一具体的实施方式中，所述菌株本身具有5-氨基乙酰丙酸合成能力。 
在第二方面，本发明提供一种5-氨基乙酰丙酸生产菌株，所述菌株中促进草酰乙酸合成的相关酶的活性增强或包含外源性的促进草酰乙酸合成的相关酶，和/或 
所述琥珀酰辅酶A下游代谢途径相关酶的活性减弱。 
在具体的实施方式中，所述促进草酰乙酸合成的相关酶是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或丙酮酸羧化酶，所述琥珀酰辅酶A下游代谢途径相关酶是琥珀酰辅酶A合成酶或琥珀酸脱氢酶。 
在另一具体的实施方式中，所述菌株中5-氨基乙酰丙酸合成途径也得到增强。在优选的实施方式中，所述菌株的5-氨基乙酰丙酸合成酶活性增强或包含外源性的5-氨基乙酰丙酸合成酶。 
在另一具体的实施方式中，所述菌株中5-氨基乙酰丙酸合成酶的活性增强或包含外源性5-氨基乙酰丙酸合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性增强或包含外源性的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶并敲除琥珀酸脱氢酶。 
在另一具体的实施方式中，所述菌株选自大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)等。 
在第三方面，本发明提供一种产生5-氨基乙酰丙酸的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，所述菌株选自下组：以CGMCC No.6588为保藏号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌株或以CGMCC No.6589为保藏号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌株。 
在具体的实施方式中，所述菌株无需外源性添加琥珀酸即可产生5-氨基乙酰丙酸。 
在另一优选的实施方式中，所述菌株产生5-氨基乙酰丙酸的产量高于7g/L。 
在另一优选的实施方式中，所述菌株产生5-氨基乙酰丙酸的葡萄糖转化率高于0.35(摩尔比)，优选高于0.45(摩尔比)，最优选高于0.5(摩尔比)。 
在另一优选的实施方式中，所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株无需添加外源琥珀酸而高水平地产生5-氨基乙酰丙酸。 
在另一优选的实施方式中，所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株在好氧条件下，无需添加外源琥珀酸而高水平地产生5-氨基乙酰丙酸。 
在第四方面，本发明提供一种产生5-氨基乙酰丙酸的方法，所述方法包括： 
1)培养本发明第二或第三方面所述的菌株，从而得到5-氨基乙酰丙酸；和 
2)从1)的发酵培养体系中获得5-氨基乙酰丙酸。 
在优选的实施方式中，所述方法获得的5-氨基乙酰丙酸的产量高于7g/L。 
在另一优选的实施方式中，所述方法可以在不额外添加琥珀酸的情况下也能实现5-氨基乙酰丙酸的高产。 
在第五方面，本发明还提供一种产生5-氨基乙酰丙酸的方法，所述方法包括： 
1)在含有琥珀酰辅酶A下游代谢途径相关酶抑制剂的培养基中培养5-氨基乙酰丙酸的生产菌株，从而得到5-氨基乙酰丙酸；和 
2)从1)的培养体系中获得5-氨基乙酰丙酸。 
在优选的实施方式中，所述琥珀酰辅酶A下游代谢途径相关酶是琥珀酰辅酶A合成酶或琥珀酸脱氢酶。 
在第六方面，本发明提供本发明第二或第三方面所述菌株的用途，所述菌株用于产生5-氨基乙酰丙酸和/或产生以5-氨基乙酰丙酸为前体下游产物。 
在优选的实施方式中，所述下游产物是以ALA为前体的血红素或VB12。 
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一赘述。 
附图说明
图1显示了提高ALA产量的本发明技术方案的示意图。 
图2显示了本发明所用表达载体的遗传图谱。 
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现增强5-氨基乙酰丙酸生产菌株中促进草酰乙酸合成的相关酶的活性可以极大提高所述生产菌株的5-氨基乙酰丙酸的产量；发明人还发现减弱所述生产菌株中琥珀酰辅酶A下游代谢途径相关酶也能够提高所得生产菌株的5-氨基乙酰丙酸的产量；而将两种手段结合起来能够进一步提高所得生产菌株的5-氨基乙酰丙酸的产量。在此基础上完成了本发明。 
术语定义 
本文所用的术语“外源性”是指某体系中包含了原来不存在的物质。例如，通过转化等方式在某菌株中引入该菌株中原本不存在的酶的编码基因，从而在该菌株中表达该酶，则该酶对于该菌株是“外源性”的。 
本文所用的术语“增强”是指增加、提高、增大或升高某种蛋白，例如酶的活性。鉴于本发明的教导和现有技术，本领域技术人员也不难理解本文所用的“增强”还应包括通过表达酶的异源编码基因而增强其活性。在具体的实施方式中，增强酶的活性可以通过表达酶的内源或异源性编码基因，和/或增加所述编码基因的拷贝数，和/或改造所述编码基因的启动子以增强转录启动速度，和/或修改携带有所述编码基因的信使RNA的翻译调控区以增强翻译强度，和/或修改编码基因本身以增强mRNA稳定性、蛋白质稳定性、解除蛋白质的反馈抑制等方法来实现。 
类似地，本文所用的术语“减弱”是指降低、削弱、减小或完全消除某种蛋白，例如酶的活性。在具体的实施方式中，减弱酶的活性可以通过部分或全部敲除酶的编码基因、基因突变失活或部分失活、基因启动子或翻译调控区改变令其转录或翻译弱化、改变基因序列使其mRNA稳定性减弱或酶结构不稳定等方法或其组合来实现。 
本文所用的术语“促进草酰乙酸合成的相关酶”是指与草酰乙酸的合成相关，但对于草酰乙酸的合成量起到促进、提高、增加等正面作用的酶。在具体的实施方式中，本发明中促进草酰乙酸合成的相关酶包括但不限于：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc或丙酮酸羧化酶pyc。此外，鉴于本发明的教导和现有技术，本领域普通技术人员不难理解，本发明可利用各种来源的促进草酰乙酸合成的相关酶，只要所述酶能在菌株中促进、提高或增加草酰乙酸的合成量。在具体的实施方式中，本发明所用的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是大肠杆菌来源的，而丙酮酸羧化酶是根瘤菌来源的。 
本文所用的术语“琥珀酰辅酶A下游代谢途径相关酶”是指利用琥珀酰辅酶A作为底物合成其它物质，从而消耗琥珀酰辅酶A的酶。在具体的实施方式中，所述琥珀酰辅酶A下游代谢途径相关酶包括但不限于：琥珀酰辅酶A合成酶或琥珀酸脱氢酶。 
本文所用的术语“5-氨基乙酰丙酸合成途径”是指微生物中产生5-氨基乙酰丙酸的具体途径，其中包括各种酶，例如5-氨基乙酰丙酸合成酶、谷氨酰-tRNA合成酶、谷氨酰-tRNA还原酶或谷氨酸-1-半醛氨基转移酶，等等。类似地，本文所用的术语“5-氨基乙酰丙酸合成途径增强”是指涉及5-氨基乙酰丙酸合成途径的相关酶，例如5-氨基乙酰丙酸合成酶、谷氨酰-tRNA合成酶、谷氨酰-tRNA还原酶或谷氨酸-1-半醛氨基转移酶的活性增强。在优选的实施方式中，所述酶是来源于沼泽红假单胞菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶。 
本发明的5-氨基乙酰丙酸生产菌株 
本发明提供了一种5-氨基乙酰丙酸生产菌株，所述菌株中促进草酰乙酸合成的相关酶的活性增强或包含外源性的促进草酰乙酸合成的相关酶，和/或所述琥珀酰辅酶A下游代谢途径相关酶的活性减弱。在优选的实施方式中，所述促进草酰乙酸合成的相关酶包括但不限于：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或丙酮酸羧化酶；所述琥珀酰辅酶A下游代谢途径相关酶包括但不限于：琥珀酰辅酶A合成酶或琥珀酸脱氢酶。 
在其它实施方式中，所述菌株中5-氨基乙酰丙酸合成途径也得到增强或含有外源5-氨基乙酰丙酸合成途径。因此，在具体的实施方式中，本发明菌株中5-氨基乙 酰丙酸合成途径增强或含有外源5-氨基乙酰丙酸合成途径、促进草酰乙酸合成的相关酶的活性增强或包含外源性的促进草酰乙酸合成的相关酶，和/或所述琥珀酰辅酶A下游代谢途径相关酶的活性减弱。在优选的实施方式中，本发明菌株中5-氨基乙酰丙酸合成酶的活性增强或包含外源性5-氨基乙酰丙酸合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性增强或包含外源性的丙酮酸羧化酶并敲除琥珀酸脱氢酶。 
本领域技术人员知道许多菌株可以用于产生5-氨基乙酰丙酸。这些菌株虽然不同，但它们合成5-氨基乙酰丙酸的合成体系、途径却是类似的。因此，本领域普通技术人员鉴于本发明的教导和现有技术可以明白，本发明的菌株可以是任何可用于产生5-氨基乙酰丙酸的菌株，包括但不限于：大肠杆菌(E.Coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)等。 
在具体的实施方式中，本发明提供以CGMCC No.6588为保藏号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。在另一具体的实施方式中，本发明提供以CGMCC No.6589为保藏号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。 
本发明菌株无需外源性添加前体琥珀酸即可产生5-氨基乙酰丙酸，5-氨基乙酰丙酸的产量高于7g/L。此外，利用本发明的菌株产生5-氨基乙酰丙酸，葡萄糖转化率高于0.35(摩尔比)，优选高于0.45(摩尔比)，最优选高于0.5(摩尔比)。在优选的实施方式中，本发明的菌株可以高水平地生产5-氨基乙酰丙酸。在另一优选的实施方式中，本发明的菌株可以在好氧条件下高水平地生产5-氨基乙酰丙酸，从而无需对现有技术水平的发酵罐等设备进行改造，便于在工业化水平放大。 
因此，本发明的菌株可以更低的成本、方便地制备5-氨基乙酰丙酸。 
本领域技术人员还应明白，本发明的菌株不仅可用于产生5-氨基乙酰丙酸，还能产生以5-氨基乙酰丙酸为前体的各种下游产物。在具体的实施方式中，所述下游产物是以ALA为前体的血红素或VB12。 
本发明还提供一种5-氨基乙酰丙酸生产菌株的构建方法，所述方法包括：增强所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中促进草酰乙酸合成的相关酶的活性或导入外源性的促进草酰乙酸合成的相关酶，和/或减弱所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中琥珀 酰辅酶A下游代谢途径相关酶。在优选的实施方式中，所述促进草酰乙酸合成的相关酶是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或丙酮酸羧化酶，所述琥珀酰辅酶A下游代谢途径相关酶是琥珀酰辅酶A合成酶或琥珀酸脱氢酶。 
在优选的实施方式中，所述增强5-氨基乙酰丙酸生产菌株中促进草酰乙酸合成的相关酶的活性可通过以下方法之一或组合实现：增强磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性，和/或增强丙酮酸羧化酶的活性。 
在进一步优选的实施方式中，所述增强磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或丙酮酸羧化酶的活性，可通过以下方法之一或组合实现：表达异源磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或丙酮酸羧化酶的编码基因，和/或增加所述菌株中所述编码基因的拷贝数，和/或改造所述编码基因的启动子以增强转录启动速度，和/或修改携带有所述编码基因的信使RNA的翻译调控区以增强翻译强度。 
在另一优选的实施方式中，所述减弱包括将所述琥珀酰辅酶A下游代谢途径相关酶缺失。在进一步优选的实施方式中，所述琥珀酰辅酶A下游代谢途径相关酶是琥珀酰辅酶A合成酶或琥珀酸脱氢酶。 
在优选的实施方式中，所述减弱所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中琥珀酰辅酶A下游代谢途径相关酶可通过以下方法之一或组合实现：部分或全部敲除琥珀酰辅酶A合成酶或琥珀酸脱氢酶的编码基因、基因突变失活或部分失活、基因启动子或翻译调控区改变令其转录或翻译弱化、改变基因序列使其mRNA稳定性减弱或酶结构不稳定等方法。 
在另一优选的实施方式中，所述方法还包括增强所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中5-氨基乙酰丙酸合成途径或引入外源5-氨基乙酰丙酸合成途径。因此，在具体的实施方式中，所述方法包括：增强所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中5-氨基乙酰丙酸合成途径或引入外源5-氨基乙酰丙酸合成途径、增强促进草酰乙酸合成的相关酶的活性或包含外源性的促进草酰乙酸合成的相关酶，和/或减弱所述琥珀酰辅酶A下游代谢途径相关酶的活性。在优选的实施方式中，所述方法包括：增强所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中5-氨基乙酰丙酸合成酶的活性或导入外源性5-氨基乙酰丙酸合成酶、增强磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶并敲除琥珀酰脱氢酶。 
在进一步的优选实施方式中，所述方法还包括测定所得菌株的5-氨基乙酰丙酸产量。 
在另一优选实施方式中，所述方法获得的5-氨基乙酰丙酸生产菌株可以在好氧 条件下，无需添加外源琥珀酸而高水平地产生5-氨基乙酰丙酸。 
鉴于本发明的教导和现有技术，本领域技术人员还应明白本发明是通过增强起始菌株中促进草酰乙酸合成的相关酶的活性或导入外源性的促进草酰乙酸合成的相关酶，和/或减弱起始该菌株中琥珀酰辅酶A下游代谢途径相关酶的活性来提高所述菌株产生5-氨基乙酰丙酸的能力。因此，只要通过以上手段来构建或改造菌株，进而提高5-氨基乙酰丙酸产量的方法或由此得到的菌株均应落在本发明的保护范围内，本发明的保护范围并不限于实施例中采用的具体方法和得到的菌株。 
在本发明方法以及获得的菌株的基础上，本发明进一步提供了产生5-氨基乙酰丙酸的方法，所述方法包括：1)培养本发明的菌株，从而得到5-氨基乙酰丙酸；和2)从1)的发酵培养体系中获得5-氨基乙酰丙酸。在优选的实施方式中，所述方法获得的5-氨基乙酰丙酸的产量高于7g/L。在另一优选的实施方式中，所述方法不额外添加琥珀酸和/或仅仅利用葡萄糖作为碳源。 
鉴于本发明的提示和教导，本领域普通技术人员还可知道，在5-氨基乙酰丙酸的生产菌株的培养体系中添加琥珀酰辅酶A下游代谢途径相关酶抑制剂也可以提高5-氨基乙酰丙酸的产量。在具体的实施方式中，所述琥珀酰辅酶A下游代谢途径相关酶是琥珀酰辅酶A合成酶或琥珀酸脱氢酶。 
本发明的优点： 
1.本发明的菌株提高糖的转化率，增加了ALA合成必需底物之一琥珀酰辅酶A的合成，从而提高了ALA的产量； 
2.利用本发明菌株制备ALA无需外源性添加前体琥珀酸，使得生产过程摆脱了对底物琥珀酸添加的依赖和昂贵LB培养基的使用，大大降低了生产成本。 
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 
材料与方法 
本发明实施例所用的DNA聚合酶购自北京全式金公司的Fastpfu；限制性内切酶及DNA连接酶等均购自Fermentas公司； 
酵母粉和蛋白胨购自英国Oxoid公司产品；甘氨酸和IPTG购自Promega公司；5-ALA和对二甲氨基苯甲醛等购自Sigma公司；琼脂粉和抗生素购自北京索来宝；葡萄糖、冰醋酸、高氯酸、三氯乙酸、乙酰丙酮、氯仿以及其他常用化学试剂均购自国药。 
质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒均购自上海生工，相关操作均严格按照说明书执行； 
质粒构建测序验证由华大基因完成； 
DH5α感受态细胞购自北京全式金公司。 
LB培养基成分：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，固体培养基中添加2%的琼脂粉。 
抗生素浓度为：氨苄青霉素100μg/mL，卡那霉素30μg/mL。 
ALA的检测方法：200μL稀释的发酵液加入100μL pH4.6乙酸钠缓冲液，然后加入5μL乙酰丙酮，100℃水浴温育15min，冷却至室温后加入等体积的Ehrlish’s试剂(42mL冰醋酸，8mL70%高氯酸，1g二甲氨基苯甲醛)混匀，显色10min后测553nm波长下的吸光度。 
葡萄糖分析方法采用山东科学院生产的SBA-40D生物传感分析仪进行检测。 
实施例1.琥珀酰辅酶A合成酶缺失突变株和琥珀酸脱氢酶缺失突变株的构建 
大肠杆菌基因敲除采用经典的Red重组方法，参考相关文献进行，具体操作如下：对于琥珀酰辅酶A合成酶结构基因sucCD基因的敲除，首先根据NCBI公布的大肠杆菌MG1655的基因组序列及辅助载体pKD13的序列设计引物sucCD-1和sucCD-2，具体序列见引物序列表，以pKD13为模板扩增得到带有sucCD基因上下游同源臂的Kan抗性基因片段。PCR扩增参数为94℃2min；94℃20s，64℃20s，72℃1min，循环30次；72℃延伸5min。PCR产物胶回收后电 转化MG1655/pKD46菌株，感受态细胞制备和转化过程参考J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》。转化子利用sucCD-3和sucCD-4引物进行PCR验证，野生型菌株片段大小为2267bp，而sucCD基因缺失的菌株中目的条带大小为1558bp，根据条带大小挑选sucCD缺失突变株并命名为ZPEcA1。 
对于sdhAB的敲除，首先根据NCBI公布的大肠杆菌MG1655的基因组序列及辅助载体pKD13的序列设计引物sdhAB-1和sdhAB-2，以pKD13为模板扩增得到带有sdhAB基因上下游同源臂的Kan抗性基因片段。PCR扩增参数为94℃2min；94℃20s，64℃20s，72℃1min，循环30次；72℃延伸5min。PCR产物胶回收后电转化MG1655/pKD46菌株，感受态细胞制备和转化过程参考J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》。转化子利用sdhAB-3和sdhAB-4引物进行PCR验证，野生型菌株片段大小为2553bp，而sucCD基因缺失的菌株中目的条带大小为1408bp，根据条带大小挑选sdhAB缺失突变株并命名为ZPEcA2。 
实施例2.磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc和ALA合成酶共表达质粒的构建 
根据NCBI公布的大肠杆菌MG1655的基因组序列设计引物ppc-F和ppc-R，以大肠杆菌MG1655基因组为模板PCR扩增得到带有自身启动子的ppc基因片段，PCR扩增参数为94℃2min；94℃20s，60℃20s，72℃1.5min，循环30次；72℃延伸5min。ppc基因片段回收后用HindIII处理，同时将携带有ALA合成酶的质粒pZGA24（pZGA24构建参见参考文献：郭小飞等，利用5-氨基乙酰丙酸脱水酶缺失的重组大肠杆菌合成5-氨基乙酰丙酸，天津科技大学学报，2012,27(4)：1-6）也用该酶处理，载体和片段回收后用T4连接酶连接，转化DH5α感受态细胞，涂布含有Amp的LB平板，挑取阳性克隆提取质粒并进行酶切验证，测序正确的重组质粒命名为pZPA6。 
实施例3.丙酮酸羧化酶pyc和ALA合成酶共表达质粒的构建 
根据BioBrick中启动子BBa_J23105的序列和NCBi公布的根瘤菌CFN42的基因组序列设计引物pyc-1和pyc-2，以根瘤菌CFN42基因组为模板PCR扩增得到 带有组成型启动子序列的pyc基因片段，PCR扩增参数为94℃2min；94℃20s，60℃20s，72℃2min，循环30次；72℃延伸5min。目的片段回收后用磷酸化酶处理，同时将pWSK29载体用限制性内切酶PvuII处理后再用去磷酸化酶处理，将得到的载体片段与磷酸化的pyc基因片段用T4连接酶连接，转化DH5α感受态细胞，涂布含有Amp的LB平板，挑取阳性克隆提取质粒并进行酶切验证，测序正确的重组质粒命名为pSLS33。 
根据上述pSLS33的序列设计引物pyc-F和pyc-R，具体序列见引物序列表，以pSLS33为模版扩增得到带有组成型启动子的pyc基因片段，PCR扩增参数为94℃2min；94℃20s，60℃20s，72℃2min，循环30次；72℃延伸5min。同时根据pZGA24载体的序列设计引物pA-1和pA-2，以pZGA24为模板反向PCR扩增含有ALA合成酶基因的pTrc-hemA载体，PCR扩增参数为94℃2min；94℃20s，60℃20s，72℃3min，循环30次；72℃延伸5min。pyc基因片段回收后用核酸内切酶SmalI消化处理并用T4连接酶连接到反向扩增并纯化的pZGA24载体上，连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布含有Amp的LB平板，挑取阳性克隆提取质粒并进行酶切验证，测序正确的重组质粒命名为pZPA7 
表1引物序列表 
注：斜体加粗部分为同源臂序列，下划线部分为酶切位点 
实施例4.重组菌株的构建及ALA产量的比较 
分别将上述构建的重组质粒pZGA24、pZPA6和pZPA7转化野生型大肠杆菌 MG1655及sucCD缺失突变株ZPEcA1和sdhAB缺失突变株ZPEcA2，涂布Amp抗性LB平板，过夜培养后挑取阳性克隆提取质粒验证，分别获得重组菌株MG1655/pZGA24、ZPEcA1/pZGA24、ZPEcA2/pZGA24、MG1655/pZPA6、ZPEcA1/pZPA6、ZPEcA2/pZPA6、MG1655/pZPA7、ZPEcA1/pZPA7和ZPEcA2/pZPA7。 
将上述重组菌单菌落分别接种5mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃，220rpm培养12h。按照初始OD为0.05转接装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶，37℃，220rpm培养2.5h后加入终浓度为25μM的IPTG，诱导培养19h后收集发酵液，检测ALA的浓度。其中发酵培养基为添加了少量酵母粉的M9培养基，主要成分为：Na2HPO4·12H2O12.8g/L，KH2PO43.0g/L，NaCl0.5g/L，NH4Cl1.0g/L，MgSO42mM，CaCl20.1mM，葡萄糖10g/L，酵母粉2g/L，甘氨酸4g/L，氨苄青霉素浓度为100μg/mL。ALA的检测和葡萄糖分析方法如“材料与方法”部分所述。 
各重组菌ALA产量结果见表2，对照菌株MG1655/pZGA24中ALA的产量仅为1.06g/L，sucCD或sdhAB缺失的ZPEcA1/pZGA24和ZPEcA2/pZGA24菌株中ALA的产量分别为1.33g/L和1.45g/L，分别比出发菌株提高了25%和37%，表明在大肠杆菌中部分或全部缺失琥珀酰辅酶A合成酶或琥珀酸脱氢酶的活性能够提高ALA的产量。表达ppc的MG1655/pZPA6菌株和表达pyc的MG1655/pZPA7菌株中ALA的产量分别达到2.52g/L和2g/L，分别是出发菌株的2.38倍和1.89倍，结果表明增强促进草酰乙酸合成的相关酶能够显著提高ALA的产量。而sucCD或sdhAB缺失且ppc或pyc过量表达的ZPEcA1/pZPA6、ZPEcA2/pZPA6、ZPEcA1/pZPA7和ZPEcA2/pZPA7菌株中ALA的产量分别达到2.43g/L、3.08g/L、2.12g/L和2.66g/L，均高于相应的对照菌株，表明sucCD或sdhAB缺失与ppc或pyc过量表达有一定的叠加效果，能够促进ALA的生物合成。其中，sdhAB缺失且表达ppc的ZPEcA2/pZPA6菌株ALA的产量最高，是对照菌株MG1655/pZGA24的2.91倍，葡萄糖转化率也达到最高的0.47(摩尔比)，是出发菌株的2.57倍。而利用本发明的菌株进行发酵罐发酵时，ALA的产量可以达到7g/L以上，达到了国内的较好水平。上述实验结果表明在大肠杆菌中表达外源ALA合成酶的基础上，部分或全部缺失琥珀酰辅酶A合成酶或琥珀酸脱氢酶的 活性，同时增强促进草酰乙酸合成的相关酶的表达可以大大提高ALA的产量。 
上述重组菌株MG1655/pZPA6和ZPEcA2/pZPA6菌株已于2012年9月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号分别为：CGMCC No.6588和CGMCC No.6589。 
表2不同菌株摇瓶发酵数据 
实施例5.在BW25113菌株中重复验证 
重组菌株的构建：分别将上述质粒pZGA24、pZPA6和pZPA7转化大肠杆菌BW25113(作为对照的菌株BW25113来源于CGSC(美国耶鲁大学大肠杆菌保藏中心))及相应的sucC缺失突变株JW0717(缺失了琥珀酰辅酶A合成酶β亚基(sucC)的JW0717菌株来自Keio Collection大肠杆菌单基因缺失菌株库)和sdhA缺失突变株JW0713(来自Keio Collection大肠杆菌单基因缺失菌株库)，涂布Amp抗性LB平板，过夜培养后挑取阳性克隆提取质粒验证，分别获得重组菌株BW25113/pZGA24、JW0717/pZGA24、JW0713/pZGA24、BW25113/pZPA6、JW0717/pZPA6、JW0713/pZPA6、BW25113/pZPA7、JW0717/pZPA7和JW0713/pZPA7。 
各重组菌摇瓶发酵及ALA和葡萄糖检测方法同上，结果见表3，从表中可以看出各重组菌与相应的MG1655重组菌产量及变化基本一致，产量最高的是sdhA缺失且表达ppc的JW0713/pZPA7菌株，ALA产量达到3.21g/L，葡萄糖转化率更是达到0.56(摩尔比)，表明本发明提供的方法同样适用于大肠杆菌其他菌株。 
表3.不同菌株摇瓶发酵数据 
实验结果表明，利用本发明提供的方法，在以葡萄糖为主要碳源的培养基中摇瓶发酵，重组菌中ALA产量达到3.08g/L，单位菌体ALA的产量达到0.76g/L/OD，分别为出发菌株的2.91倍和2.59倍，葡萄糖的转化率达到0.47(mol/mol)，是出发菌株的2.57倍。利用本发明提供的方法构建的重组菌以及利用其产生ALA的方法摆脱了对琥珀酸添加的依赖和昂贵LB培养基的使用，具有很好工业应用前景和经济价值。 
实施例6.磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶pck的活性增强的重组菌株的构建及ALA产量的比较 
发明人采用与实施例1-5所述类似的方法构建了磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶pck的活性增强的重组菌株并检测了它们的ALA产量。 
结果发现，磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶pck的活性增强并没有产生提高菌株ALA产量的技术效果。 
讨论 
本发明人基于5-氨基乙酰丙酸的合成途径，以产ALA的重组大肠杆菌为目标，通过理性设计改造宿主菌的糖代谢途径，结果表明促进草酰乙酸合成的相关酶的活性能够显著提高葡萄糖的转化率和ALA的产量。具体地说，本发明通过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或丙酮酸羧化酶增强草酰乙酸的回补，大幅提高了ALA的产量和葡萄糖的转化率。 
本发明人还发现降低琥珀酰辅酶A下游代谢途径相关酶，即，琥珀酰辅酶A合成酶和琥珀酸脱氢酶的活性也能提高起到类似的技术效果。而生物学常识 告诉我们，多亚基酶需要各亚基密切配合才能完成完整的生物学功能，任何一个亚基序列或结构变化、表达水平变化都可能影响酶的整体活性。琥珀酰辅酶A合成酶和琥珀酸脱氢酶均是多亚基酶，琥珀酰辅酶A合成酶包括两个亚基，分别由sucC、sucD编码，琥珀酸脱氢酶含有四个亚基，分别由sdhA、sdhB、sdhC和sdhD编码。通过实施例4和5，发明人证实了sucC和sucD、sucC、sdhA和sdhB、sdhA基因缺失造成相应酶失活，进而有利于ALA合成。根据生物学常识可以推理，其他能够引起这两个酶活性弱化的遗传修饰或者通过其它方法，例如添加外源性琥珀酰辅酶A合成酶或琥珀酸脱氢酶的抑制剂来抑制或降低二者的活性，都会有利于ALA的生物合成。 
而将以上两种改造策略整合更是极大提高了葡萄糖的转化率和ALA的产量，与仅表达ALA合成酶的对照菌株相比，改造后的菌株ALA的产量和葡萄糖的转化率分别提高了1.91倍和1.57倍，而利用本发明的菌株进行发酵罐发酵时，ALA的产量可以达到7g/L以上，达到了国内的较好水平。 
因此，本发明提供的菌株和方法能够显著提高ALA的产量和葡萄糖的转化率，摆脱了以往合成ALA时对琥珀酸添加的依赖和昂贵LB培养基的使用，大幅度降低了生产成本，具有很好的工业化前景。 
发明人最初还预计增强磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶pck的活性也可以起到增加草酰乙酸合成，从而增加ALA合成所需的前体量，进而提高ALA的产量的作用。然而，具体实验证明增强磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶pck的活性并未起到预计的技术效果，可能是与实验条件下pck更多的参与糖异生过程有关。 
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 

Claims (10)

1.5-氨基乙酰丙酸生产菌株的构建方法，其特征在于，所述方法：
增强所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中促进草酰乙酸合成的相关酶的活性或导入外源性的促进草酰乙酸合成的相关酶，和/或
减弱所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中琥珀酰辅酶A下游代谢途径相关酶的活性。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述促进草酰乙酸合成的相关酶是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或丙酮酸羧化酶，所述琥珀酰辅酶A下游代谢途径相关酶是琥珀酰辅酶A合成酶或琥珀酸脱氢酶。
3.如权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述方法还包括增强所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中的5-氨基乙酰丙酸合成途径或引入外源5-氨基乙酰丙酸合成途径。
4.一种5-氨基乙酰丙酸生产菌株，其特征在于，所述菌株中促进草酰乙酸合成的相关酶的活性增强或包含外源性的促进草酰乙酸合成的相关酶，和/或
所述琥珀酰辅酶A下游代谢途径相关酶的活性减弱。
5.如权利要求4所述的菌株，其特征在于，所述促进草酰乙酸合成的相关酶是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或丙酮酸羧化酶，所述琥珀酰辅酶A下游代谢途径相关酶是琥珀酰辅酶A合成酶或琥珀酸脱氢酶。
6.如权利要求5所述的菌株，其特征在于，所述菌株中5-氨基乙酰丙酸合成途径增强或含有外源5-氨基乙酰丙酸合成途径。
7.如权利要求4-6中任一项所述的菌株，其特征在于，所述菌株选自大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)等。
8.一种产生5-氨基乙酰丙酸的大肠杆菌菌株，所述菌株选自下组：以CGMCC No.6588为保藏号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌株或以CGMCC No.6589为保藏号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌株。
9.一种产生5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于，所述方法包括：
1)培养权利要求4-7中任一项所述的菌株，从而得到5-氨基乙酰丙酸；和
2)从1)的发酵培养体系中获得5-氨基乙酰丙酸。
10.权利要求4-7中任一项所述菌株的用途，其特征在于，所述菌株用于产生5-氨基乙酰丙酸和/或产生以5-氨基乙酰丙酸为前体的下游产物。
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