CN105525023A - 艰难梭菌毒素a/b的荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了的艰难梭菌毒素A/B的探针法荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法，其既能检测艰难梭菌又能检测并定量毒素A和毒素B基因。本发明的检测试剂盒主要包括特异性引物和探针，所述特异性引物和探针由检测艰难梭菌的引物对、检测艰难梭菌毒素A的引物对和探针、检测艰难梭菌毒素B的引物对和探针组成。本发明操作简单、报告时间短，能特异、灵敏又准确地首次鉴定艰难梭菌菌株并完成对艰难梭菌关键毒素A和B的检测及其定量。为艰难梭菌感染的早期诊断提供了基础，适用于临床不明原因腹泻病人的病因筛查。

Description

艰难梭菌毒素A/B的荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于生物医学领域，尤其涉及一种艰难梭菌毒素A/B的探针法荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法。

背景技术

艰难梭菌(ClostridiumDifficile，C.difficile)是一种革兰阳性、产毒素或非产毒素的厌氧芽胞杆菌，它广泛分布于自然环境、动物和人的粪便中。艰难梭菌可以寄生在在人类的肠道中，它本身并没有侵袭性，但研究发现，长期使用广谱抗生素，尤其是克林霉素、头孢菌素类、喹诺酮类抗生素后，引起菌群失调，使耐药的艰难梭菌被选择出后大量繁殖，出现艰难梭菌相关性感染，导致C.difficile相关性腹泻，目前已被公认为引起抗菌药物相关性腹泻(antibioticassociateddiarrhea,AAD)和假膜性肠炎(Pseudo-membranecolitis，PMC)的重要致病菌。艰难梭菌感染(CDI)患者临床表现轻者自限性腹泻，重者可出现伪膜性肠炎及中毒性巨结肠。CDI具有复发率高、耐药率高、难治率高、死亡率高、医疗费用高等特点。因此，艰难梭菌的快速鉴定及其毒素检测工作迫在眉睫。

近年来，艰难梭菌的诊断方法有依赖于厌氧条件的细菌培养、依赖于抗体制备的谷氨酸脱氢酶(GDH)ELISA检测法、依赖于基因组DNA提取的分子诊断技术。依赖于菌株培养的毒素测定法鉴定时可获得相应菌株，方便后续研究，但艰难梭菌属于厌氧菌，培养困难，费时费力。谷氨酸脱氢酶(GDH)ELISA检测法需要制备抗体，成本高，过程繁琐耗时长，且其稳定性虽好但特异性差，无法区分C.difficile产毒株与无毒株。目前，检测C.difficile应用最多的是处于研究前沿的分子生物学检测法，该方法可以不经培养直接从样品中提取肠道微生物基因组，利用分子生物学手段进行分离、检测和定量，其结果可以比较准确的反应肠道微生物中高丰度菌种的组成及其含量。

随着核酸技术发展，16SrDNA序列分析已成为鉴定细菌的金标准。利用16SrDNA序列保守区域设计引物，此引物几乎能与所有种属的核糖靶位点结合。能够进行快速鉴定，从而及时给予抗菌治疗。然而，该方法也有局限性，当不同种细菌16SrDNA序列几乎完全相同时，其鉴定能力就受到限制(如葡萄球菌和伯克霍尔德菌的鉴定)。

C.difficile产生的毒素A(tcdA基因编码的产物)又称肠毒素，导致回肠肠壁中性粒细胞浸润，释放淋巴因子，引起液体大量分泌和出血性坏死；毒素B(tcdB基因编码的产物)又称细胞毒素，能使肌动蛋白解聚，损坏细胞骨架，导致细胞固缩坏死，直接损伤肠壁细胞。C.difficile的各菌株根据它们的毒素产生性的不同，大致分为TcdA产生TcdB产生型(A+B+)、TcdA非产生TcdB产生型(A-B+)以及毒素非产生型(A-B-)。有研究表明，A-B+菌株在中国具有发病比例高，隐蔽性强，耐药性高的特点，对临床科室的危害性更为严重。因此，选择tcdA和tcdB作为检测艰难梭菌的目的基因，对艰难梭菌毒性菌株实施简单、灵敏且快速检测，对于临床诊治具有重要意义。

用实时荧光定量PCR的方法来检测外源基因的拷贝数，是近几年迅速发展起来的新方法，它以低成本、快捷、高灵敏度等优点，逐渐取代了价格昂贵、费时费力的Southernblot法。根据荧光信号的来源不同对荧光定量的方法进行划分，主要包括特异性荧光探针(如TaqMan探针)法和非特异性荧光染料(如SYBRGreen染料)法。由于SYBRGreen染料能与所有的dsDNA相结合，因此由引物二聚体、错误的扩增产物引起的假阳性，会增大定量数据的误差。目前针对艰难梭菌的定量检测，已报道比较多的方法是多重实时荧光定量PCR(多重qPCR)。虽然该方法可以一次性检测多个靶标基因，但也存在很多弊端，例如1)引物设计难度大：复杂的多重qPCR引物设计必须依赖于较为大型的数据库和计算机模拟qPCR结果，以及繁琐的后期验证，这个过程不是一般小型实验室可以完成的；2)产物相互抑制：多重qPCR副产物焦磷酸的生成，会抑制qPCR反应的延伸；3)在一个qPCR反应体系里，dNTP原料的量是一定的，所以，每增加一重引物，就会使dNTP原料平分到每个靶标的量减少。

发明内容

一方面，为解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种检测艰难梭菌的引物对，该引物对为用于检测C.difficile的16SrDNA引物，其能特异地筛选出C.difficile。

一种检测艰难梭菌的引物对，所述引物对的上游引物具有如SEQIDNO：1所示的序列，所述引物对的下游引物具有如SEQIDNO：2所示的序列。

另一方面，本发明还提供了一种检测艰难梭菌毒素A的引物对，所述引物对的上游引物具有如SEQIDNO：3所示的序列，所述引物对的下游引物具有如SEQIDNO：4所示的序列。

又一方面，本发明还提供了一种检测艰难梭菌毒素A的寡核苷酸探针，所述探针具有如SEQIDNO：5所示的序列或其互补序列。

优选地，在寡核苷酸的5＇末端结合有荧光物质，在3＇末端结合有淬灭物质。

更优选地，所述荧光物质为FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX中的至少一种；所述淬灭物质为TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL中的至少一种。

再一方面，本发明还提供了一种检测艰难梭菌毒素A的寡核苷酸组，其具有所述的检测艰难梭菌毒素A的引物对和所述的检测艰难梭菌毒素A的寡核苷酸探针。

另一方面，本发明还提供了一种检测艰难梭菌毒素B的引物对，所述引物对的上游引物具有如SEQIDNO：6所示的序列，所述引物对的下游引物具有如SEQIDNO：7所示的序列。

又一方面，本发明还提供了一种检测艰难梭菌毒素B的寡核苷酸探针，所述探针具有如SEQIDNO：8所示的序列或其互补序列。

优选地，在寡核苷酸的5＇末端结合有荧光物质，在3＇末端结合有淬灭物质。

更优选地，所述荧光物质为FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX中的至少一种；所述淬灭物质为TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL中的至少一种。

再一方面，本发明还提供了一种检测艰难梭菌毒素B的寡核苷酸组，其具有所述的检测艰难梭菌毒素B的引物对和所述的检测艰难梭菌毒素B的寡核苷酸探针。

另一方面，本发明还提供了一种特异性扩增艰难梭菌毒素A基因的引物对，其具有外侧引物对和内侧引物对；

所述外侧引物对的上游引物具有如SEQIDNO：9所示的序列，所述引物对的下游引物具有如SEQIDNO：10所示的序列；

所述内侧引物对的上游引物具有如SEQIDNO：11所示的序列，所述引物对的下游引物具有如SEQIDNO：12所示的序列。

另一方面，本发明还提供了一种特异性扩增艰难梭菌毒素B基因的引物对，其具有外侧引物对和内侧引物对；

所述外侧引物对的上游引物具有如SEQIDNO：13所示的序列，所述引物对的下游引物具有如SEQIDNO：14所示的序列；

所述内侧引物对的上游引物具有如SEQIDNO：15所示的序列，所述引物对的下游引物具有如SEQIDNO：16所示的序列。

另一方面，本发明还提供了一种艰难梭菌毒素A/B的探针法荧光定量PCR检测试剂盒，其包括所述的检测艰难梭菌毒素A的寡核苷酸组和所述的检测艰难梭菌毒素B的寡核苷酸组。

优选地，所述艰难梭菌毒素A/B的探针法荧光定量PCR检测试剂盒还包括所述的检测艰难梭菌的引物对。

优选地，所述艰难梭菌毒素A/B的探针法荧光定量PCR检测试剂盒还包括艰难梭菌毒素A和艰难梭菌毒素B的阳性质控品，所述艰难梭菌毒素A的阳性质控品具有如SEQIDNO：17所示的序列，所述艰难梭菌毒素B的阳性质控品具有如SEQIDNO：18所示的序列。

优选地，所述艰难梭菌毒素A的阳性质控品和所述艰难梭菌毒素B的阳性质控品的制备方法为：

A、从艰难梭菌患者的粪便中提取总基因组DNA；

B、以步骤A)中提取的总基因组DNA为模板，使用所述的特异性扩增艰难梭菌毒素A基因的引物对和所述的特异性扩增艰难梭菌毒素B基因的引物对，根据巢式PCR两步循环法来扩增艰难梭菌毒素A基因和艰难梭菌毒素B基因的目的片段；

C、回收步骤B)中得到的目的片段，将所述目的片段连接至即用型蓝白T载体上，随后转化至大肠杆菌中，将转化后长出的白色菌落进行PCR菌落鉴定，提取经鉴定为阳性样品的质粒。

再一方面，本发明还提供了一种艰难梭菌毒素A/B的探针法荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：

1)从人粪便样品中提取总基因组DNA；

2)以步骤1)中提取的总基因组DNA为模板，使用权利要求1所述的引物进行PCR，检测PCR扩增产物即可判断所述样品是否携带艰难梭菌；若所述样品携带艰难梭菌，则进入步骤3)；

3)以步骤1)中提取的总基因组DNA为模板，使用权利要求6所述的检测艰难梭菌毒素A的寡核苷酸组和权利要求11所述的检测艰难梭菌毒素B的寡核苷酸组分别进行qPCR；

4)通过测定DNA的Ct值，根据标准曲线即可获得DNA的拷贝浓度。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)通过艰难梭菌的16SrDNA特异性引物来鉴定待测样品是否为艰难梭菌，此在艰难梭菌检测方法上是首次应用；实验表明优选出来的用于检测C.difficile的16SrDNA引物能特异地筛选出C.difficile；

(2)通过Taqman探针法实时荧光定量PCR完成A/B毒素含量的绝对定量。鉴定为艰难梭菌的样品的毒素检测，可通过绘制A、B毒素质控品的标准曲线，来完成该毒素含量的绝对定量。既特异、灵敏又准确。

(3)本试剂盒所筛选的引物检测结果更为可靠。C.difficile在健康人肠道的菌数水平很低，我们优化了qPCR反应体系和条件,设计了特异性引物和探针，与检测C.difficile毒素基因tcdA和tcdB的其他文献上的引物检测相比，扩增效率值E更符合qPCR扩增效率的标准(90％≦E≦110％)，结果更为可靠。为艰难梭菌感染的早期诊断提供了基础，适用于临床不明原因腹泻病人的病因筛查。

附图说明

图1显示了tcdB基因的全长序列保守性分析后质控品制备所设计的引物位置；

图2显示了tcdB基因的全长序列保守性分析后qPCR引物和探针所在的位置；

图3为细菌16SrDNA通用引物的PCR检测结果；

图4为艰难梭菌质控品的制备过程中tcdA目的片段的扩增图；

图5为艰难梭菌质控品的制备过程中tcdB目的片段的扩增图；

图6为艰难梭菌质控品的制备过程中tcdA转化后的菌落PCR鉴定图；

图7为艰难梭菌质控品的制备过程中tcdB转化后的菌落PCR鉴定图；

图8为艰难梭菌tcdA的灵敏度检测扩增曲线；

图9为艰难梭菌tcdA的灵敏度检测标准曲线；

图10为艰难梭菌tcdB的灵敏度检测扩增曲线；

图11为艰难梭菌tcdB的灵敏度检测标准曲线；

图12为利用其它文献上的引物对艰难梭菌tcdA和tcdB的灵敏度检测。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

实施例1

16SrDNA的特异性引物

艰难梭菌16SrDNA的特异性引物设计方法如下：

当不同种细菌的16SrDNA序列几乎完全相同时，16SrDNA通用引物鉴定细菌种类的能力有限。为了解决这个问题，我们设计出多条引物，经过数10条引物的筛选，最终筛选出仅对C.difficile特异的16SrDNA引物，依此来鉴定C.difficile。

筛选出的用于检测C.difficile最特异的16SrDNA引物序列如下：

C.diff-16s-F：TTGAGCGATTTACTTCGGTAAAGA

C.diff-16s-R：CCATCCTGTACTGGCTCACCT

16SrDNA特异引物检测C.difficile

从234例肠道腹泻临床患者的粪便中提取细菌总基因组DNA，利用筛选出的用于检测C.difficile最特异的16SrDNA引物，通过PCR来检测上述样品是否携带艰难梭菌。

其中，PCR反应体系和条件如下：

PCR反应程序为：预变性98℃30秒，变性98℃10秒，退火60℃15秒，延伸72℃1分钟(变性、退火和延伸共36个循环)，终止72℃5分钟。

将以上234例样品的PCR扩增产物，经琼脂凝胶电泳结果显示，有131例样品携带艰难梭菌，其余103例样品呈阴性。为了验证上述结果是否存在假阳/阴性，我们选用细菌16SrDNA通用引物(引物序列为：16s-27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；16S-1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT)，来扩增所述的234例样品。测序结果经比对，在上述131例阳性样品中，检测出有121例属于艰难梭菌的16SrDNA序列，其余10例属于梭菌属的其它菌株(副腐败梭菌3例，产气夹膜梭菌5例，多枝梭菌1例和丁酸梭菌1例)。另外，在上述103例艰难梭菌检测结果呈阴性的样品中(如图3所示)，检测出有8例属于艰难梭菌的16SrDNA序列。综上，所述用于检测C.difficile的16SrDNA引物的阳性符合率为92.37％，阴性符合率为92.23％，表明该引物的特异性是符合要求的。

实施例2

tcdA与tcdB基因质控品的特异性引物、qPCR检测引物和探针序列的设计方法

通过NCBI数据库和http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi在线比对软件，找出tcdA基因和tcdB基因在不同菌株间的保守序列。tcdB基因在不同菌株间的序列差异性很大，部分序列相似率仅为94.9％。图1所示为不同菌株tcdB基因的全长序列保守性分析，框出来的位置为引物tcdB质控品制备的外、内侧引物序列位置。图2框出来的位置为tcdB的qPCR引物和探针位置，因此借助了DNAStar软件包中的Saqman软件来选出tcdB基因的保守序列。最后用软件PrimerPremier5.0设计引物，分别得到以下用于制备质控品的特异性引物，以及tcdA与tcdB基因的qPCR检测引物和探针序列，具体如下：

tcdA和tcdB质控品制备所用特异性引物序列分别是：

tcdA的外侧引物

tcdA-out-F：5’-TTCAAGCAGAAATAGAGCAC-3’

tcdA-out-R：5’-GTCTTCAGAAAGAGATCCACC-3’

tcdA的内侧引物

tcdA-in-F:5’-ATGGATAGGTGGAGAAGTCAG-3’

tcdA-in-R:5’-GCATAAGCTCCTGGACCAC-3’

tcdB的外侧引物

tcdB-out-F：5’-CGATATGTATGGAGTAATGATG-3’

tcdB-out-R：5’-GTATAGTTTATTGATTCTCCCTC-3’

tcdB的内侧引物

tcdB-in-F:5’-GGTGTATTTAGTACAGAAGATGG-3’

tcdB-in-F:5’-TCATATATCCATCCAGTCTC-3’

tcdA与tcdB基因的qPCR特异性检测引物和探针序列分别是

tcdA-q-F:5’-GCTTTCGCTTTAGGCAGTGT-3’

tcdA-q-R:5’-GAGTTTTCTGCGGTAGCTGA-3’

tcdA-pro:5’-FAM-CCAACACCTTAACCCAGCCATAGAG-TAMRA-3’

tcdB-q-F:5’-GCACCTGCTAATACTGTAAATG-3’

tcdB-q-R:5’-GTCTCAATTGTATATGTTTCTCC-3’

tcdB-pro:5’-FAM-TACGGACAAGCAGTTGAATATAGTGG-TAMRA-3’

其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。所述引物和探针均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

C.difficile毒素基因tcdA和tcdB质控品的制备

1.制备阳性质控品：从C.difficile临床患者的粪便中提取细菌总基因组DNA，以所获得的总基因组DNA为模板，使用本实施例中的tcdA和tcdB质控品制备所用特异性引物，根据巢式PCR两步循环法来扩增tcdA基因和tcdB基因的目的片段；回收得到的目的片段，将所述目的片段连接至即用型蓝白T载体上，随后转化至大肠杆菌中，将转化后长出的白色菌落进行PCR菌落鉴定，提取经鉴定为阳性样品的质粒。

具体步骤为：首先将细菌总基因组DNA浓度稀释至1ng/μL，取1μL为模板，先以tcdA和tcdB的外侧引物进行第一次扩增；接着，以tcdA和tcdB的内侧引物，对第一次扩增获得的PCR产物目的片段，用相同配液体系和反应条件进行第二次扩增，PCR反应体系和条件如下：

PCR反应程序为：预变性94℃5分钟，变性94℃30秒，退火56℃30秒，延伸72℃1分钟(变性、退火和延伸共36个循环)，终止72℃5分钟。

得到的tcdA基因目的片段大小为1122bp，如图4所示。在图4中，A显示了tcdA的外侧引物扩增产物1444bp，M：DNAMarker2000bp；B显示了tcdA的内侧引物扩增产物1122bp，M：DNAMarker2000bp。

tcdB基因目的片段大小为953bp，如图5所示。图中，A显示了tcdB的外侧引物扩增产物1754bp，M：DNAMarker2000bp；B显示了tcdB的内侧引物扩增产物953bp，M：DNAMarker2000bp。

将第二次反应得到的目的片段扩增产物进行回收，将回收片段连接至即用型蓝白T载体(A型)上，连接体系如下(单位：μL)：

反应体系混匀后置于金属恒温浴中22℃孵育30分钟。接着，将连接产物通过热激，转化至大肠杆菌感受态JM109中。将转化后长出的白色菌落进行PCR菌落鉴定。鉴定结果显示，tcdA的转化菌落有9个样品是能扩増出条带的，如图6所示，其中7个菌落鉴定PCR产物大小与目的片段大小一致(即1122bp)；tcdB的转化菌落(见图7)，也有9个样品能扩增出预期产物大小一致的条带(953bp)，从中各选2个经鉴定为阳性的质粒送至生工测序公司进行测序。

测序结果经与C.difficile毒素基因tcdA和tcdB的参考品(KC292122.1和KC292195.1)比对，显示该质控品序列与参考品序列的同源率高达100％，表明所制备的tcdA和tcdB质控品序列是属于tcdA和tcdB基因序列的。所述获得的阳性质控品序列具体如下：

a.tcdA的质控品序列(1122bp)

ATGGATAGGTGGAGAAGTCAGTGATATTGCTCTTGAATACATAAAACAATGGGCTGATATTAATGCAGAATATAATATTAAACTGTGGTATGATAGTGAAGCATTCTTAGTAAATACACTAAAAAAGGCTATAGTTGAATCTTCTACCACTGAAGCATTACAGCTACTAGAGGAAGAGATTCAAAATCCTCAATTTGATAATATGAAATTTTACAAAAAAAGGATGGAATTTATATATGATAGACAAAAAAGGTTTATAAATTATTATAAATCTCAAATCAATAAACCTACAGTACCTACAATAGATGATATTATAAAGTCTCATCTAGTATCTGAATATAATAGAGATGAAACTGTATTAGAATCATATAGAACAAATTCTTTGAGAAAAATAAATAGTAATCATGGGATAGATATCAGGGCTAATAGTTTGTTTACAGAACAAGAGTTATTAAATATTTATAGTCAGGAGTTGTTAAATCGTGGAAATTTAGCTGCAGCATCTGACATAGTAAGATTATTAGCCCTAAAAAATTTTGGCGGAGTATATTTAGATGTTGATATGCTTCCAGGTATTCACTCTGATTTATTTAAAACAATATCTAGACCTAGCTCTATTGGACTAGACCGTTGGGAAATGATAAAATTAGAGGCTATTATGAAGTATAAAAAATATATAAATAATTATACATCAGAAAACTTTGATAAACTTGATCAACAATTAAAAGATAATTTTAAACTCATTATAGAAAGTAAAAGTGAAAAATCTGAGATATTTTCTAAATTAGAAAATTTAAATGTATCTGATCTTGAAATTAAAATAGCTTTCGCTTTAGGCAGTGTTATAAATCAAGCCTTGATATCAAAACAAGGTTCATATCTTACTAACCTAGTAATAGAACAAGTAAAAAATAGATATCAATTTTTAAACCAACACCTTAACCCAGCCATAGAGTCTGATAATAACTTCACAGATACTACTAAAATTTTTCATGATTCATTATTTAATTCAGCTACCGCAGAAAACTCTATGTTTTTAACAAAAATAGCACCATACTTACAAGTAGGTTTTATGCCAGAAGCTCGCTCCACAATAAGTTTAAGTGGTCCAGGAGCTTATGC

b.tcdB的质控品序列(953bp)

GGTGTATTTAGTACAGAAGATGGATTTAAATATTTTGCCCCAGCTAATACACTTGATGAAAACCTAGAAGGAGAAGCAATTGATTTTACTGGAAAATTAATTATTGACGAAAATATTTATTATTTTGATGATAATTATAGAGGAGCTGTAGAATGGAAAGAATTAGATGGTGAAATGCACTATTTTAGCCCAGAAACAGGTAAAGCTTTTAAAGGTCTAAATCAAATAGGTGATTATAAATACTATTTCAATTCTGATGGAGTTATGCAAAAAGGATTTGTTAGTATAAATGATAATAAACACTATTTTGATGATTCTGGTGTTATGAAAGTAGGTTACACTGAAATAGATGGCAAGCATTTCTACTTTGCTGAAAACGGAGAAATGCAAATAGGAGTATTTAATACAGAAGATGGATTTAAATATTTTGCTCATCATAATGAAGATTTAGGAAATGAAGAAGGTGAAGAAATCTCATATTCTGGTATATTAAATTTCAATAATAAAATTTACTATTTTGATGATTCATTTACAGCTGTAGTTGGATGGAAAGATTTAGAGGATGGTTCAAAGTATTATTTTGATGAAGATACAGCAGAAGCATATATAGGTTTGTCATTAATAAATGATGGTCAATATTATTTTAATGATGATGGAATTATGCAAGTTGGATTTGTCACTATAAATGATAAAGTCTTCTACTTCTCTGACTCTGGAATTATAGAATCTGGAGTACAAAACATAGATGACAATTATTTCTATATAGATGATAATGGTATAGTTCAAATTGGTGTATTTGATACTTCAGATGGATATAAATATTTTGCACCTGCTAATACTGTAAATGATAATATTTACGGACAAGCAGTTGAATATAGTGGTTTAGTTAGAGTTGGGGAAGATGTATATTATTTTGGAGAAACATATACAATTGAGACTGGATGGATATATGA

艰难梭菌毒素A/B的探针法荧光定量PCR检测试剂盒

本试剂盒由(1)粪便基因组DNA提取液；(2)16SDNA检测体系；(3)qPCR反应液；(4)阳性质控品；(5)说明书和(6)盒体组成。

其中，(1)粪便基因组DNA提取液用于提取粪便基因组DNA，能实现此功能的所有提取液均适用于本发明，也可选用市场上已有的粪便基因组DNA提取试剂盒中的试剂，如TIANGEN公司的DP328；(2)16SDNA检测体系中包含实施例1中的用于检测C.difficile最特异的16SrDNA引物，还可包含其他进行PCR反应所需试剂；(3)qPCR反应液中包含本实施例中tcdA与tcdB基因的qPCR特异性检测引物和探针，还包含其他进行qPCR反应所需试剂；(4)阳性质控品由本实施例中的制备阳性质控品的方法制得。

艰难梭菌毒素A/B的探针法荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法

利用所述检测试剂盒鉴定艰难梭菌菌株、并对艰难梭菌关键毒素A和B进行检测和定量的方法，所述方法如下：

(1)提取粪便基因组DNA

严格按照粪便基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN公司DP328)操作说明进行粪便总基因组DNA的提取，并针对C.difficile稍微进行了条件优化：将样品预处理的裂解温度调整为95℃孵育5min，能使较难破壁的革兰氏阳性细菌—C.difficile裂解破壁，同时使DNA结构完整性保持最佳状态。

(2)艰难梭菌的检测

从肠道腹泻临床患者的粪便中提取细菌总基因组DNA(gDNA)，利用筛选出的用于检测C.difficile最特异的16srDNA引物来扩增目的片段，通过琼脂糖凝胶电泳来检测样品是否携带艰难梭菌。

(3)探针法荧光定量PCR检测艰难梭菌关键毒素A和B，并进行绝对定量

从肠道腹泻临床患者的粪便中提取细菌总基因组DNA(gDNA)，以提取的DNA为模板，使用tcdA与tcdB基因的qPCR特异性检测引物和探针分别进行qPCR；通过测定Ct值根据标准曲线即可获得待测样品DNA的拷贝浓度。本发明对qPCR反应体系进行了优化，优化后具体的qPCR反应体系和条件如下：

其反应程序为：预变性95℃30秒，变性95℃15秒，退火60℃30秒(变性和退火共40个循环)，在退火时收集荧光信号。

标准曲线的绘制方法如下：

将本实施例中制备好的阳性质控品(经与NCBI数据库比对，同源率高达100％)作为绘制标准曲线的标准品，利用核酸蛋白分析仪测定DNA浓度，根据拷贝数计算公式：

来计算tcdA和tcdB阳性质控品的拷贝数。根据阳性质控品拷贝数梯度浓度的对数值和质控品Ct值的关系绘制标准曲线。测得待测样品DNA的Ct值后，对照标准曲线公式即可获得待测样品DNA的拷贝浓度。

实施例3

本试剂盒与现有艰难梭菌毒素A/B检测试剂盒的灵敏度比较

为了确定实施例2中所述的qPCR具体操作方法灵敏度，我们以质控品初始浓度为2.19×10⁸copies/μL(tcdA)和2.29×10⁸copies/μL(tcdB)的模板浓度用于制备标准曲线的初始浓度，并用EASYDilution绝对定量稀释液按10倍浓度梯度连续稀释，来检测所述qPCR体系的最低检出限。另外，选用检测C.difficile毒素基因tcdA和tcdB的其它文献上的引物，以本方法建立的体系进行qPCR，来比较本引物和其它文献上(TcdCDoesNotSignificantlyRepressToxinExpressioninClostridiumdifficile630DErm)的引物的灵敏度。

结果判断标准：选用肠产毒性大肠杆菌(ATCC35401)为阴性对照，于相同的qPCR检测体系下进行检测。以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测模板荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性。否则，判断为阴性。

检测结果显示，对C.difficile毒素基因tcdA和tcdB的qPCR检测体系，本试剂盒的最低检出限分别为2.19×10³copies/μL(tcdA)(图8、9)和2.29×10³copies/μL(tcdB)(图10、11)，该结果与其他文献引物的灵敏度检测结果一致(图12)。值得一提的是，在同一个检测体系前提下，本试剂盒的引物所得到的标准公式为tcdA:Y＝-3.016×LgX+41.349(R²＝0.939，E＝114.595)和tcdB:Y＝-3.198×LgX+17.66(R²＝0.904，E＝105.45)，其扩增效率值E均比其他文献所用引物的扩增效率均要高，更符合qPCR扩增效率的标准(90％≦E≦110％)，表明针对本试剂盒所筛选的引物检测结果更为可靠。

实施例4

本试剂盒qPCR检测体系的特异性分析

以肠出沙门氏菌(CICC21490)、创伤弧菌(CICC10383)、血性大肠杆菌(ATCC43889)、致病性大肠杆菌(ATCC43887)、肠产毒性大肠杆菌(ATCC35401)、肠侵袭性大肠杆菌(ATCC43893)为模板，按照上述方法和判断标准进行检测，结果均为阴性，说明本试剂盒的检测引物特异性好。

本专利具体的引物信息详见下表。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (18)

1.一种检测艰难梭菌的引物对，其特征在于：所述引物对的上游引物具有如SEQIDNO：1所示的序列，所述引物对的下游引物具有如SEQIDNO：2所示的序列。

2.一种检测艰难梭菌毒素A的引物对，其特征在于：所述引物对的上游引物具有如SEQIDNO：3所示的序列，所述引物对的下游引物具有如SEQIDNO：4所示的序列。

3.一种检测艰难梭菌毒素A的寡核苷酸探针，其特征在于：所述探针具有如SEQIDNO：5所示的序列或其互补序列。

4.根据权利要求3所述的检测艰难梭菌毒素A的寡核苷酸探针，其特征在于：在寡核苷酸的5＇末端结合有荧光物质，在3＇末端结合有淬灭物质。

5.根据权利要求4所述的检测艰难梭菌毒素A的寡核苷酸探针，其特征在于：所述荧光物质为FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX中的至少一种；所述淬灭物质为TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL中的至少一种。

6.一种检测艰难梭菌毒素A的寡核苷酸组，其特征在于：其具有权利要求2所述的检测艰难梭菌毒素A的引物对和权利要求3所述的检测艰难梭菌毒素A的寡核苷酸探针。

7.一种检测艰难梭菌毒素B的引物对，其特征在于：所述引物对的上游引物具有如SEQIDNO：6所示的序列，所述引物对的下游引物具有如SEQIDNO：7所示的序列。

8.一种检测艰难梭菌毒素B的寡核苷酸探针，其特征在于：所述探针具有如SEQIDNO：8所示的序列或其互补序列。

9.根据权利要求8所述的检测艰难梭菌毒素B的寡核苷酸探针，其特征在于：在寡核苷酸的5＇末端结合有荧光物质，在3＇末端结合有淬灭物质。

10.根据权利要求9所述的检测艰难梭菌毒素B的寡核苷酸探针，其特征在于：所述荧光物质为FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX中的至少一种；所述淬灭物质为TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL中的至少一种。

11.一种检测艰难梭菌毒素B的寡核苷酸组，其特征在于：其具有权利要求7所述的检测艰难梭菌毒素B的引物对和权利要求8所述的检测艰难梭菌毒素B的寡核苷酸探针。

12.一种特异性扩增艰难梭菌毒素A基因的引物对，其特征在于：其具有外侧引物对和内侧引物对；

所述外侧引物对的上游引物具有如SEQIDNO：9所示的序列，所述引物对的下游引物具有如SEQIDNO：10所示的序列；

所述内侧引物对的上游引物具有如SEQIDNO：11所示的序列，所述引物对的下游引物具有如SEQIDNO：12所示的序列。

13.一种特异性扩增艰难梭菌毒素B基因的引物对，其特征在于：其具有外侧引物对和内侧引物对；

所述外侧引物对的上游引物具有如SEQIDNO：13所示的序列，所述引物对的下游引物具有如SEQIDNO：14所示的序列；

所述内侧引物对的上游引物具有如SEQIDNO：15所示的序列，所述引物对的下游引物具有如SEQIDNO：16所示的序列。

14.一种艰难梭菌毒素A/B的探针法荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：其包括权利要求6所述的检测艰难梭菌毒素A的寡核苷酸组和权利要求11所述的检测艰难梭菌毒素B的寡核苷酸组。

15.如权利要求14所述的艰难梭菌毒素A/B的探针法荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：其还包括权利要求1所述的检测艰难梭菌的引物对。

16.如权利要求14所述的艰难梭菌毒素A/B的探针法荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：其还包括艰难梭菌毒素A和艰难梭菌毒素B的阳性质控品，所述艰难梭菌毒素A的阳性质控品具有如SEQIDNO：17所示的序列，所述艰难梭菌毒素B的阳性质控品具有如SEQIDNO：18所示的序列。

17.如权利要求16所述的艰难梭菌毒素A/B的探针法荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述艰难梭菌毒素A的阳性质控品和所述艰难梭菌毒素B的阳性质控品的制备方法为：

A、从艰难梭菌患者的粪便中提取总基因组DNA；

B、以步骤A)中提取的总基因组DNA为模板，使用权利要求12所述的特异性扩增艰难梭菌毒素A基因的引物对和权利要求13所述的特异性扩增艰难梭菌毒素B基因的引物对，根据巢式PCR两步循环法来扩增艰难梭菌毒素A基因和艰难梭菌毒素B基因的目的片段；

C、回收步骤B)中得到的目的片段，将所述目的片段连接至即用型蓝白T载体上，随后转化至大肠杆菌中，将转化后长出的白色菌落进行PCR菌落鉴定，提取经鉴定为阳性样品的质粒。

18.一种艰难梭菌毒素A/B的探针法荧光定量PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)从人粪便样品中提取总基因组DNA；

2)以步骤1)中提取的总基因组DNA为模板，使用权利要求1所述的引物进行PCR，检测PCR扩增产物即可判断所述样品是否携带艰难梭菌；若所述样品携带艰难梭菌，则进入步骤3)；

3)以步骤1)中提取的总基因组DNA为模板，使用权利要求6所述的检测艰难梭菌毒素A的寡核苷酸组和权利要求11所述的检测艰难梭菌毒素B的寡核苷酸组分别进行qPCR；

4)通过测定DNA的Ct值，根据标准曲线即可获得DNA的拷贝浓度。