Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

CN110029155A - 一种基于荧光定量pcr组合式肠道细菌检测方法 - Google Patents

一种基于荧光定量pcr组合式肠道细菌检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110029155A
CN110029155A CN201910447138.9A CN201910447138A CN110029155A CN 110029155 A CN110029155 A CN 110029155A CN 201910447138 A CN201910447138 A CN 201910447138A CN 110029155 A CN110029155 A CN 110029155A
Authority
CN
China
Prior art keywords
strain
enteric bacteria
combined type
standard curve
detection method
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910447138.9A
Other languages
English (en)
Inventor
李佩铷
边高瑞
贾长生
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianyi Health Science Research Institute (zhenjiang) Co Ltd
Original Assignee
Tianyi Health Science Research Institute (zhenjiang) Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianyi Health Science Research Institute (zhenjiang) Co Ltd filed Critical Tianyi Health Science Research Institute (zhenjiang) Co Ltd
Priority to CN201910447138.9A priority Critical patent/CN110029155A/zh
Publication of CN110029155A publication Critical patent/CN110029155A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种基于荧光定量PCR组合式肠道细菌检测方法，包括前期准备、PCR产物纯化且定量、对各菌种定量采用荧光定量PCR法进行标准曲线的绘制、样本中各菌种含量测定的步骤。本发明的荧光定量PCR组合式检测方法，对肠道细菌进行检测，操作简便、耗时短、灵敏度高，极大的提高了检测效率同时，增加了检测的精准度，是一种值得推广且经得住考验的方法。

Description

一种基于荧光定量PCR组合式肠道细菌检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种基于荧光定量PCR组合式肠道细菌检测方法。
背景技术
肠道细菌，并非每一种细菌都是"凶神恶煞"，肠道细菌能提高人的认知能力。同时肠道细菌总数庞大，且过于复杂，对肠道细菌的研究目前还不能研究的足够充分，生物领域中并不缺乏对肠道细菌的研究和检测。但是如何快速、准确地检测肠道细菌中的含量及菌种仍有极高的挑战和技术难题。
发明内容
为了快速、准确地检测肠道细菌的含量，本发明提供了一种基于荧光定量PCR组合式肠道细菌检测方法，具体步骤为：
(1)前期准备：
选取肠道内混合发酵液提取gDNA为模板，利用各菌种特异性引物扩增目的条带，纯化后进行琼脂糖凝胶电泳检测实验，其中孔道内获得物依次为：罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、、细菌通用阴性对照、DNA Marker2000；
(2)PCR产物纯化且定量：
对步骤(一)中获得孔道内菌株，进行PCR产物纯化且定量；
(3)对各菌种定量采用荧光定量PCR法进行标准曲线的绘制：
各菌株PCR产物10倍梯度稀释至10-8，取10-2-10-8梯度作为标准曲线各梯度下模板浓度的对数值为横坐标，以Ct值为纵坐标绘制标准曲线，其中每个梯度设置三个重复周期，一个周期为：第一温度(90-95)℃下(20-30)s、第二温度(90-95)℃下(5-10)s、第三温度(60-63)℃下(0.8-1.5)min，设置第二、第三温度下循环30-40次；
(4)样本中各菌种含量测定
将样本中各菌种的Ct值与步骤(3)获得标准曲线对比，进行线性拟合，获得混合发酵液中肠道细菌各菌种的组成比例。
作为改进，步骤(一)中的反应体系为：总体积为40-65μl，包括Taq酶：0.15-0.45μl、Buffer：2-7μl、dNTP：3-6μl、F(10μM)：2-3.5μl、R(10μM):1.5-3μl、Template：0.1-0.9μl、ddH2O：30-50μl。
作为改进，步骤(三)中反应体系为：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix：8-13μl、F(10μM)：0.2-0.6μl、R(10μM):0.2-0.6μl、50×ROX ReferenceDye 1：0.2-0.6μl、TemplateDNA：0.5-1.5μl、ddH2O：15-25μl。
有益效果：本发明提供的荧光定量PCR组合式检测方法，对肠道细菌进行检测，操作简便、耗时短、灵敏度高，极大的提高了检测效率同时，增加了检测的精准度，是一种值得推广且经得住考验的方法。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1为本发明琼脂糖凝胶电泳检测图。
图2为本发明罗伊氏乳杆菌荧光定量PCR法标准曲线图。
图3为本发明鼠李糖乳杆菌荧光定量PCR法标准曲线图。
图4为本发明乳双歧杆菌荧光定量PCR法标准曲线图。
图5为本发明嗜酸乳杆菌荧光定量PCR法标准曲线图。
图6为本发明干酪乳杆菌荧光定量PCR法标准曲线图。
图7为本发明细菌通用荧光定量PCR法标准曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明中F、R为引物，选自：
实施例1
选取混合发酵液提取gDNA为模板，利用各菌种特异性引物扩增目的条带，纯化后进行琼脂糖凝胶电泳检测实验，进行纯化后PCR产物定量获得如表1所示：
表1PCR产物定量后浓度(ng.μl-1)
对各菌种进行荧光定量PCR法标准曲线的绘制获得表2-8。
表2各菌种荧光定量PCR法标准曲线数据
表3罗伊氏乳杆菌荧光定量PCR法标准曲线数据
表4鼠李糖乳杆菌荧光定量PCR法标准曲线数据
表5乳双歧杆菌荧光定量PCR法标准曲线数据
表6嗜酸乳杆菌荧光定量PCR法标准曲线数据
表7干酪乳杆菌荧光定量PCR法标准曲线数据
表8细菌通用荧光定量PCR法标准曲线数据
将样本中各菌种的Ct值与获得标准曲线对比，进行线性拟合，获得数据见表9所示。
表9各菌种Ct值与标准值比对数据
进而获得混合发酵液中肠道细菌各菌种的组成比例。由此得知，本发明的测量方法精准度高且可操作性强。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (3)

1.一种基于荧光定量PCR组合式肠道细菌检测方法，其特征在于：具体步骤为：
(1)前期准备：
选取肠道内混合发酵液提取gDNA为模板，利用各菌种特异性引物扩增目的条带，纯化后进行琼脂糖凝胶电泳检测实验，其中孔道内获得物依次为：罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、细菌通用、细菌通用阴性对照、DNA Marker2000；
(2)PCR产物纯化且定量：
对步骤(一)中获得孔道内菌株，进行PCR产物纯化且定量；
(3)对各菌种定量采用荧光定量PCR法进行标准曲线的绘制：
各菌株PCR产物10倍梯度稀释至10-8，取10-2-10-8梯度作为标准曲线各梯度下模板浓度的对数值为横坐标，以Ct值为纵坐标绘制标准曲线，其中每个梯度设置三个重复周期，一个周期为：第一温度(90-95)℃下(20-30)s、第二温度(90-95)℃下(5-10)s、第三温度(60-63)℃下(0.8-1.5)min，设置第二、第三温度下循环30-40次；
(4)样本中各菌种含量测定：
将样本中各菌种的Ct值与步骤(3)获得标准曲线对比，进行线性拟合，获得混合发酵液中肠道细菌各菌种的组成比例。
2.根据权利要求1所述的一种基于荧光定量PCR组合式肠道细菌检测方法，其特征在于：步骤(一)中的反应体系为：总体积为40-65μl，包括Taq酶：0.15-0.45μl、Buffer：2-7μl、dNTP：3-6μl、F(10μM)：2-3.5μl、R(10μM):1.5-3μl、Template：0.1-0.9μl、ddH2O：30-50μl。
3.根据权利要求1所述的一种基于荧光定量PCR组合式肠道细菌检测方法，其特征在于：步骤(三)中反应体系为：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix：8-13μl、F(10μM)：0.2-0.6μl、R(10μM):0.2-0.6μl、50×ROX ReferenceDye1：0.2-0.6μl、Template DNA：0.5-1.5μl、ddH2O：15-25μl。
CN201910447138.9A 2019-05-27 2019-05-27 一种基于荧光定量pcr组合式肠道细菌检测方法 Pending CN110029155A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910447138.9A CN110029155A (zh) 2019-05-27 2019-05-27 一种基于荧光定量pcr组合式肠道细菌检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910447138.9A CN110029155A (zh) 2019-05-27 2019-05-27 一种基于荧光定量pcr组合式肠道细菌检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110029155A true CN110029155A (zh) 2019-07-19

Family

ID=67243409

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910447138.9A Pending CN110029155A (zh) 2019-05-27 2019-05-27 一种基于荧光定量pcr组合式肠道细菌检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110029155A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110904250A (zh) * 2019-10-29 2020-03-24 知几未来（成都）临床医学检验有限公司 用于检测多种菌的多重荧光定量pcr引物、试剂盒及检测方法
WO2021102731A1 (zh) * 2019-11-27 2021-06-03 特安康股份有限公司 一种分析有益菌菌种的方法及其应用在益生菌菌种的筛选

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101111596A (zh) * 2005-01-31 2008-01-23 株式会社益力多本社 以rRNA为标的的微生物定量分析方法
CN101818147A (zh) * 2010-05-07 2010-09-01 中国农业科学院饲料研究所 辅助鉴定乳杆菌属菌株的专用引物及其应用
CN103695540A (zh) * 2013-12-13 2014-04-02 常熟理工学院 一种基于荧光定量pcr与核酸酶gr-5相结合的铅离子检测方法
CN104284666A (zh) * 2012-04-26 2015-01-14 J-制油株式会社 肠内环境改善剂
CN105378102A (zh) * 2013-07-18 2016-03-02 雀巢产品技术援助有限公司 作为高甘油三酯血症标记物的大肠杆菌
CN105492628A (zh) * 2013-05-29 2016-04-13 因姆内克斯普雷斯私人有限公司 微生物标志物及其用途
CN105518150A (zh) * 2013-09-06 2016-04-20 索发股份公司 用于评价包含微生物的组合物对肠道微生物群的作用的方法
CN105525023A (zh) * 2016-02-04 2016-04-27 广州赛哲生物科技股份有限公司 艰难梭菌毒素a/b的荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法
CN108350510A (zh) * 2015-09-09 2018-07-31 优比欧迈公司 用于胃肠健康相关病症的源自微生物群系的诊断及治疗方法和系统
CN109749960A (zh) * 2019-01-31 2019-05-14 上海宝藤生物医药科技股份有限公司 基于多种肠道细菌含量评估便秘风险及便秘程度的方法及装置
CN109797190A (zh) * 2019-03-11 2019-05-24 上海宝藤生物医药科技股份有限公司 一种用于评估ii型糖尿病风险的微生物标志物及其应用

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101111596A (zh) * 2005-01-31 2008-01-23 株式会社益力多本社 以rRNA为标的的微生物定量分析方法
CN101818147A (zh) * 2010-05-07 2010-09-01 中国农业科学院饲料研究所 辅助鉴定乳杆菌属菌株的专用引物及其应用
CN104284666A (zh) * 2012-04-26 2015-01-14 J-制油株式会社 肠内环境改善剂
CN105492628A (zh) * 2013-05-29 2016-04-13 因姆内克斯普雷斯私人有限公司 微生物标志物及其用途
CN105378102A (zh) * 2013-07-18 2016-03-02 雀巢产品技术援助有限公司 作为高甘油三酯血症标记物的大肠杆菌
CN105518150A (zh) * 2013-09-06 2016-04-20 索发股份公司 用于评价包含微生物的组合物对肠道微生物群的作用的方法
CN103695540A (zh) * 2013-12-13 2014-04-02 常熟理工学院 一种基于荧光定量pcr与核酸酶gr-5相结合的铅离子检测方法
CN108350510A (zh) * 2015-09-09 2018-07-31 优比欧迈公司 用于胃肠健康相关病症的源自微生物群系的诊断及治疗方法和系统
CN105525023A (zh) * 2016-02-04 2016-04-27 广州赛哲生物科技股份有限公司 艰难梭菌毒素a/b的荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法
CN109749960A (zh) * 2019-01-31 2019-05-14 上海宝藤生物医药科技股份有限公司 基于多种肠道细菌含量评估便秘风险及便秘程度的方法及装置
CN109797190A (zh) * 2019-03-11 2019-05-24 上海宝藤生物医药科技股份有限公司 一种用于评估ii型糖尿病风险的微生物标志物及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
T. RINTTILA等: "Development of an extensive set of 16S rDNA-targeted primers for quantification of pathogenic and indigenous bacteria in faecal samples by real-time PCR", 《JOURNAL OF APPLIED MICROBIOLOGY》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110904250A (zh) * 2019-10-29 2020-03-24 知几未来（成都）临床医学检验有限公司 用于检测多种菌的多重荧光定量pcr引物、试剂盒及检测方法
CN110904250B (zh) * 2019-10-29 2023-08-08 知几未来（成都）临床医学检验有限公司 用于检测多种菌的多重荧光定量pcr引物、试剂盒及检测方法
WO2021102731A1 (zh) * 2019-11-27 2021-06-03 特安康股份有限公司 一种分析有益菌菌种的方法及其应用在益生菌菌种的筛选

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Baele et al. The Gram‐positive tonsillar and nasal flora of piglets before and after weaning
CN111304133B (zh) 一种培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养基及其使用方法和应用
CN103014160B (zh) 检测食品中乳酸菌的方法及检测用引物
CN110029155A (zh) 一种基于荧光定量pcr组合式肠道细菌检测方法
CN111676286B (zh) 肺癌血浆游离dna甲基化检测用的多重pcr引物系统、检测方法及应用
Summanen et al. Porphyromonas somerae sp. nov., a pathogen isolated from humans and distinct from Porphyromonas levii
CN109971871A (zh) 一种筛选和/或鉴定乳杆菌的方法及其应用
CN114134218B (zh) 一种基于CRISPR-Cas12a的荧光检测方法
CN109825617B (zh) 一种筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的方法及其应用
CN106755470A (zh) 一种利用q‑pcr检测混合益生菌中益生菌种类和含量的方法
CN110218803A (zh) 针对人鼠共患病病原微生物的pcr引物对、试剂盒及其用途
CN108315451A (zh) 用于检测产气荚膜梭菌的引物和探针及其应用
CN101550443B (zh) 无柄灵芝126菌株或其子实体分子标记及其获得方法与应用
CN116121415A (zh) 一种同时检测三种双歧杆菌的多重荧光定量pcr试剂盒、应用及检测方法
CN108624658A (zh) 快速检测金黄色葡萄球菌MRSA的qPCR方法及试剂
CN110317891B (zh) 用于检测鼠李糖乳杆菌lv108的引物组、试剂、试剂盒、应用和检测方法
CN108315401A (zh) 检测猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的三重pcr引物、方法及试剂盒
CN107299062A (zh) 一株产不饱和脂肪酸的变红镰孢菌(Fusarium incarnatum)A17
CN107287338A (zh) 多重荧光定量检测新生隐球菌和曲霉菌的试剂盒和方法
CN109666750B (zh) 一种鉴别猪链球菌和猪多杀性巴氏杆菌的多重实时荧光pcr检测引物探针组及检测方法
CN112553118A (zh) 一种利用益生元富集有益菌的方法
Estrov et al. Heterogeneity in lineage derivation of Philadelphia-positive acute lymphoblastic leukemia expressing p190BCR-ABL or p210BCR-ABL: Determination by analysis of individual colonies with the polymerase chain reaction
CN104278086A (zh) 一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法
CN105255879A (zh) 基于dpo引物的实时荧光pcr检测鼠李糖乳杆菌的方法、引物及试剂盒
Woo et al. Bacteremia in a patient with colonic carcinoma caused by a novel Sedimentibacter species: Sedimentibacter hongkongensis sp. nov

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190719

RJ01 Rejection of invention patent application after publication