CN114214437A - 一种鉴定产毒型艰难梭菌及其毒素基因分型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鉴定产毒型艰难梭菌及其毒素基因分型的方法。该方法使用特异性引物和探针的组合，利用实时荧光定量PCR技术快速鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型进行甄别。本鉴定方法方便快捷、价格低廉，适于推广应用。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体而言，涉及一种鉴定产毒型艰难梭菌及其毒素基因分型的方法。
背景技术
艰难梭菌(Clostridium difficile)是目前公认的院内感染和抗生素相关性腹泻的重要病原体之一。艰难梭菌感染可引起伪膜性肠炎、中毒型巨结肠、肠穿孔、弥漫性血管内凝血、肾衰竭和脓毒症等严重的并发症。因此有必要建立一种快速鉴定艰难梭菌的试剂方法，对临床艰难梭菌感染的确诊及用药具有重要的指导意义。
目前鉴别艰难梭菌的分子生物方法有ELISA、免疫胶体金等。以上各种方法虽然可能在临床上提供较好的价值，但因操作繁琐、灵敏度低等不同的原因未能在临床上大规模推广使用。
因此有必要寻找新的快速鉴定艰难梭菌的方法。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供一种用于鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的特异性引物和探针的组合。
本发明的另一个目的是提供一种用于鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的试剂盒。
本发明的再一个目的是提供一种鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的方法。该方法使用上述特异性引物和探针的组合，利用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)技术快速鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型进行甄别。本鉴定方法方便快捷、价格低廉，适于推广应用。
一方面，本发明提供了一种用于鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的特异性引物和探针的组合，所述特异性引物和探针的组合包括以下引物和探针：
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其中，tcdB1/2探针T4、tcdB3/4探针T19、tcdB2/4探针T27和通用探针C19各自带有荧光报告基团以实现彼此区分。
本发明中，所述荧光报告基团是指吸收一定波长的光子后发射特定波长光波的一类小分子化合物，其实例包括但不限于，FAM、VIC、ROX、Cy5等常用荧光修饰基团，见下表1：
表1荧光定量PCR常用荧光修饰基团信息
在一个实施方式中，所述tcdB1/2探针T4、tcdB3/4探针T19、tcdB2/4探针T27和通用探针C19的5’端带有荧光报告基团，3’端带有荧光淬灭基团。
在一个实施方式中，所述特异性引物和探针的组合包括以下引物和探针：
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通用探针C19：5’Cy5-TATAAAAAATGCAGCATTTAAAG-BHQ2 3’。
另一方面，本发明提供了一种用于鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的试剂盒，该试剂盒包括：本发明的用于鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的特异性引物和探针的组合。
优选地，本发明试剂盒进一步包括执行实时荧光定量PCR扩增反应所需的试剂，包括但不限于，酶、dNTP、Buffer、正反向引物、探针、阴性对照、阳性对照。
再一方面，本发明提供了一种鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的方法，其包括使用本发明的用于鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的特异性引物和探针的组合进行检测的步骤。
优选地，本发明的方法包括以下步骤：
(1)从待检测的样本中提取DNA；
(2)使用本发明的用于鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的特异性引物和探针的组合，以步骤(1)中DNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增反应；
(3)根据实时荧光定量PCR仪判读各扩增反应的Ct值进行鉴别。
本发明方法步骤(1)中，优选地，所述样本是指疑是艰难梭菌的感染或定植的粪便样本、菌株，其实例包括但不限于，粪便、菌株。
本发明方法步骤(2)中，优选地，所述实时荧光定量PCR扩增反应的扩增程序为：预变性95℃5分钟；变性95℃15秒，延伸55℃45秒，共进行40个循环。
本发明方法步骤(2)中，优选地，所述实时荧光定量PCR扩增反应的反应体系可以是20μl反应体系，其包含：引物混合液6μl，PCR酶反应预混液10μl，模板DNA 2～4μl，用水补齐到20μl，其中，PCR酶反应预混液包含缓冲液、dNTP、热启动DNA聚合酶和MgCl2溶液混合物；优选地，其中，各引物浓度为0.5pmol/μl，各探针浓度为0.25pmol/μl。
其中，所述缓冲液是指用于给DNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件的液体体系，如离子浓度、PH等。
其中，所述热启动DNA聚合酶是指用于催化PCR反应进行的酶反应物。在一个实施方式中，所述热启动DNA 聚合酶可以是TaKaRa公司的热启动DNA 聚合酶。
本发明方法步骤(3)中，优选地，根据探针根据实时荧光定量PCR仪判读扩增反应的Ct值进行鉴别，其中，阴性结果判定：如果样本扩增曲线均不呈S型、Ct值为UNDET或者＞38.00，则结果为阴性；
阳性结果判定：如果样本对应通道扩增曲线呈S型且Ct值≤38，则结果为阳性。
在一个实施方式中，本发明的鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的方法包括以下步骤：
(1)从待检测的样本中提取DNA；
(2)使用本发明的用于鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的特异性引物和探针的组合，以步骤(1)中DNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增反应，
其中，所述引物和探针的组合如下：
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通用探针C19：5’Cy5-TATAAAAAATGCAGCATTTAAAG-BHQ2 3’；
优选地，其中，所述实时荧光定量PCR扩增反应的反应体系如下：引物混合液6μl，PCR酶反应预混液10μl，模板DNA 2～4μl，用灭菌去离子水补齐到20μl，其中，PCR酶反应预混液包含经过优化的缓冲液、dNTP、化学修饰的热启动DNA聚合酶和MgCl2溶液混合物；
优选地，其中，各引物浓度为0.5pmol/μl，各探针浓度为0.25pmol/μl；
(3)结果判断：根据实时荧光定量PCR仪所显示的各反应的Ct值，
阴性结果判定：如果样本扩增曲线均不呈S型、Ct值为UNDET或者＞38.00，则结果为阴性，
阳性结果判定：如果样本对应通道扩增曲线呈S型且Ct值≤38，则结果为阳性。
详情见表2。
表2本方法最终判读结果
本发明方法方便快捷，能在较短的时间内鉴别艰难梭菌并对其毒力型别进行甄别，；灵敏度高，特异性好，本发明根据艰难梭菌tcdB毒力基因的特异性序列设计引物，具有较高的特异性。本发明对于艰难梭菌感染的诊断与临床用药具有较高的参考价值，适于推广应用。
在上文中已经详细地描述了本发明，但是上述实施方式本质上仅是例示性，且并不欲限制本发明。此外，本文并不受前述现有技术或发明内容或以下实施例中所描述的任何理论的限制。
除非另有明确说明，在整个申请文件中的数值范围包括其中的任何子范围和以其中给定值的最小子单位递增的任何数值。除非另有明确说明，在整个申请文件中的数值表示对包括与给定值的微小偏差以及具有大约所提及的值以及具有所提及的精确值的实施方案的范围的近似度量或限制。除了在详细描述最后提供的工作实施例之外，本申请文件(包括所附权利要求)中的参数(例如，数量或条件)的所有数值在所有情况下都应被理解为被术语“大约”修饰，不管“大约”是否实际出现在该数值之前。“大约”表示所述的数值允许稍微不精确(在该值上有一些接近精确；大约或合理地接近该值；近似)。如果“大约”提供的不精确性在本领域中没有以这个普通含义来理解，则本文所用的“大约”至少表示可以通过测量和使用这些参数的普通方法产生的变化。例如，“大约”可以包括小于或等于10％，小于或等于5％，小于或等于4％，小于或等于3％，小于或等于2％，小于或等于1％或者小于或等于0.5％的变化。
附图说明
图1为tcdB1阳性及阴性曲线图。
图2为tcdB2阳性及阴性曲线图。
图3为tcdB3阳性及阴性曲线图。
图4为tcdB4阳性及阴性曲线图。
具体实施方式
在下文中，将通过实施例详细描述本发明。然而，在此提供的实施例仅用于说明目的，并不用于限制本发明。
下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
荧光定量PCR仪购自杭州博日科技股份有限公司，纯水仪购自Millipore；PCR酶、缓冲液(Buffer)购自Takara公司；超纯水由纯水仪制备并高压后使用，0.2mL PCR八连管及管盖购自Axygen公司。
实施例
实施例1：
本实施例中使用根据艰难梭菌tcdB毒力基因的特异性设计的6条特异性引物以及4条特异性探针，利用实时荧光定量PCR扩增技术进行鉴定。
扩增程序为：预变性95℃5分钟；变性95℃15秒，延伸55℃45秒，共进行40个循环。根据PCR仪判读各扩增反应的Ct值进行鉴别。
引物和探针由通用生物系统(安徽)有限公司合成，其序列如下：
引物C5：5’-GATGTTGATATGTTACC-3’
引物C6：5’-CTACTTTGAACTTCTTC-3’
tcdB1/2探针T4：5’FAM-AGTCTATAGAGAAACCTAGTTCAGT-TAMRA3’
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tcdB2/4探针T27：5’ROX-TGTGATGAAGTCAGGATATACTGA-BHQ23’
引物C18：5’-CTATATTTGATACTGTAAATGG-3’
引物C20：5’-GCTACACTTAAATTACTAAGAG-3’
通用探针C19：5’Cy5-TATAAAAAATGCAGCATTTAAAG-BHQ2 3’。快速鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的方法具体包括如下步骤：
(1)模板DNA的提取：使用Qiagen公司的QIAamp DNA Mini Kit(货号：51304)提取菌株DNA；本实例中使用的样本(CD1-CD8)均为艰难梭菌菌株，采用ST分型方法和毒力分型方法对上述艰难梭菌菌株进行鉴定，ST分型方法见Multilocus sequence typing ofClostridium difficile(J.Clin.Microbiol.48,770-778,2010)，毒力分型方法见Subtyping analysis reveals new variants and accelerated evolution ofClostridioides difficile toxin B(Communications Biology 3,347,2020)，鉴定结果详情见表3。
表3本实例测试用菌株信息
(2)实时荧光定量PCR扩增反应：在200μl PCR管配制反应体系：引物混合液6μl，Premix Ex Taq(货号：RR390A)反应预混液10μl，模板DNA2μl，用DEPC(diethylpyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理水补齐到20μl，盖上管盖。
Premix Ex Taq内含TaKaRa Ex Taq HS，dNTP Mixture，Mg2+，Tli RNaseH等。
所述引物混合液含有上述的6条特异性引物和4条特异性探针，其中，各引物浓度为0.5pmol/μl、各探针浓度为0.25pmol/μl。
(3)结果判断：根据实时荧光定量PCR仪所显示的各反应的Ct值，
阴性结果判定：如果样本扩增曲线均不呈S型、Ct值为UNDET或者＞38.00，则结果为阴性。
阳性结果判定：如果样本对应通道扩增曲线呈S型且Ct值≤38，则结果为阳性。
本实施例中，结果见图1-4。判定标准见表4，图1为艰难梭菌阳性，毒力分型TcdB1；图2为艰难梭菌阳性，毒力分型TcdB2，图3为艰难梭菌阳性，毒力分型TcdB3；图4为艰难梭菌阳性，毒力分型TcdB4。
表4艰难梭菌及毒力型别判定表
本实例通过挑选已报道文献中4种常见毒力型别对应的部分ST型菌株进行测试，并与文献方法进行对比，结果显示，本方法tcdB1-tcdB4毒力分型符合率100％。详情见表5。
表5本方法分型结果与文献方法比较结果
SEQUENCE LISTING
<110> 西湖大学
<120> 一种鉴定产毒型艰难梭菌及其毒素基因分型的方法
<130> DI21-2292-XC37
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物C5
<400> 1
gatgttgata tgttacc 17
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物C6
<400> 2
ctactttgaa cttcttc 17
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tcdB1/2探针T4
<400> 3
agtctataga gaaacctagt tcagt 25
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tcdB3/4探针T19
<400> 4
aaagatataa ataagcctga ttca 24
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物C34
<400> 5
atgagcaaaa tatttaaatc 20
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物C32
<400> 6
tattttgatg attctggt 18
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tcdB2/4探针T27
<400> 7
tgtgatgaag tcaggatata ctga 24
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物C18
<400> 8
ctatatttga tactgtaaat gg 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物C20
<400> 9
gctacactta aattactaag ag 22
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 通用探针C19
<400> 10
tataaaaaat gcagcattta aag 23
Claims (10)
1.一种用于鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的特异性引物和探针的组合，所述特异性引物和探针的组合包括以下引物和探针：
引物C5：5’-GATGTTGATATGTTACC-3’
引物C6：5’-CTACTTTGAACTTCTTC-3’
tcdB1/2探针T4：5’-AGTCTATAGAGAAACCTAGTTCAGT-3’
tcdB3/4探针T19：5’-AAAGATATAAATAAGCCTGATTCA-3’
引物C34：5’-ATGAGCAAAATATTTAAATC-3’
引物C32：5’-TATTTTGATGATTCTGGT-3’
tcdB2/4探针T27：5’-TGTGATGAAGTCAGGATATACTGA-3’
引物C18：5’-CTATATTTGATACTGTAAATGG-3’
引物C20：5’-GCTACACTTAAATTACTAAGAG-3’
通用探针C19：5’-TATAAAAAATGCAGCATTTAAAG-3’
其中，tcdB1/2探针T4、tcdB3/4探针T19、tcdB2/4探针T27和通用探针C19各自带有荧光报告基团以实现彼此区分。
2.根据权利要求1所述的用于鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的特异性引物和探针的组合，其中，所述tcdB1/2探针T4、tcdB3/4探针T19、tcdB2/4探针T27和通用探针C19的5’端带有荧光报告基团，3’端带有荧光淬灭基团。
3.根据权利要求1或2所述的用于鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的特异性引物和探针的组合，其中，所述特异性引物和探针的组合包括以下引物和探针：
引物C5：5’-GATGTTGATATGTTACC-3’
引物C6：5’-CTACTTTGAACTTCTTC-3’
tcdB1/2探针T4：5’FAM-AGTCTATAGAGAAACCTAGTTCAGT-TAMRA 3’
tcdB3/4探针T19：5’VIC-AAAGATATAAATAAGCCTGATTCA-BHQ1 3’
引物C34：5’-ATGAGCAAAATATTTAAATC-3’
引物C32：5’-TATTTTGATGATTCTGGT-3’
tcdB2/4探针T27：5’ROX-TGTGATGAAGTCAGGATATACTGA-BHQ2 3’
引物C18：5’-CTATATTTGATACTGTAAATGG-3’
引物C20：5’-GCTACACTTAAATTACTAAGAG-3’
通用探针C19：5’Cy5-TATAAAAAATGCAGCATTTAAAG-BHQ2 3’。
4.一种用于鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的试剂盒，该试剂盒包括：如权利要求1-3中任一项所述的用于鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的特异性引物和探针的组合。
5.根据权利要求4所述的用于鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的试剂盒，其进一步包括执行实时荧光定量PCR扩增反应所需的试剂。
6.一种鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的方法，其包括使用如权利要求1-3中任一项所述的用于鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的特异性引物和探针的组合进行检测的步骤。
7.根据权利要求6所述的鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的方法，包括以下步骤：
(1)从待检测的样本中提取DNA；
(2)使用如权利要求1-3中任一项所述的用于鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的特异性引物和探针的组合，以步骤(1)中DNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增反应；
(3)根据实时荧光定量PCR仪判读各扩增反应的Ct值进行鉴别。
8.根据权利要求6或7所述的鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的方法，其中，步骤(2)中，所述实时荧光定量PCR扩增反应的扩增程序为：预变性95℃5分钟；变性95℃15秒，延伸55℃45秒，共进行40个循环。
9.根据权利要求6或7所述的鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的方法，其中，步骤(2)中，所述实时荧光定量PCR扩增反应的反应体系是20μl反应体系，其包含：引物混合液6μl，PCR酶反应预混液10μl，模板DNA2～4μl，用水补齐到20μl，其中，PCR酶反应预混液包含缓冲液、dNTP、热启动DNA聚合酶和MgCl2溶液混合物；优选地，其中，各引物浓度为0.5pmol/μl，各探针浓度为0.25pmol/μl。
10.根据权利要求6或7所述的鉴定艰难梭菌以及对艰难梭菌毒素分型的方法，其中，根据探针根据实时荧光定量PCR仪判读扩增反应的Ct值进行鉴别，其中，阴性结果判定：如果样本扩增曲线均不呈S型、Ct值为UNDET或者＞38.00，则结果为阴性；阳性结果判定：如果样本对应通道扩增曲线呈S型且Ct值≤38，则结果为阳性。
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- 2021-11-24 CN CN202111405745.2A patent/CN114214437A/zh active Pending
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